Научные основы биотестирования с использованием инфузорий

Виноходов, Дмитрий Олегович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Научные основы биотестирования с использованием инфузорий
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Научные основы биотестирования с использованием инфузорий"

На правах рукописи

НАУЧНЫЕ ОСНОВЫ БИОТЕСТИРОВАНИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИНФУЗОРИЙ

03 00 23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург - 2007

003066240

Работа выполнена в государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Санкт-Петербургском Государственном технологическом институте (техническом университете)

Ведущая организация Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия

Защита диссертации состоится 19 октября 2007 г в 13-00 в аудитории №61 на заседании Диссертационного Совета Д 212 230 04 при Санкт-Петербургском Государственном технологическом институте (техническом университете)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского Государственного технологического института (технического университета)

Замечания и отзывы по данной работе в 1 экземпляре, заверенном печатью, просим направлять по адресу

190013, С -Петербург, Московский пр, 26, Санкт-Петербургский Государственный технологический институт (технический университет), Ученый Совет

Автореферат разослан 3 сентября 2007 г

Ученый секретарь Диссертационного Совета

Научный консультант доктор химических наук, профессор

Гинак Анатолий Иосифович Официальные оппоненты доктор биологических наук

Михайлова Наталья Павловна доктор биологических наук Сухинин Александр Александрович доктор химических наук Орлов Антон Иосифович

Д 212 230 04, к т н , доцент

Т Б Лисицкая

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одним из важных направлений прикладной биотехнологии является разработка эффективных биологических методов оценки состояния разнообразных объектов внешней среды, загрязнение которых токсичными веществами в настоящее время приобрело комплексный характер Даже если бы было возможно определить содержание всех ксенобиотиков в объекте исследования, такая информация была бы недостаточна для каких-либо прогнозов, так как токсикометрические параметры установлены лишь для незначительной части этих веществ Кроме того, результат комбинированного действия двух и более токсичных веществ, имеющихся в исследуемом образце в небольших количествах, предсказать достаточно сложно Соединения нетоксичные при изолированном действии могут вызывать значительный патологические эффект при комбинированном влиянии Поэтому для оценки токсичности природных вод, промышленных сбросов, почвы, кормов и прочих объектов окружающей среды, а также новых химических веществ и внутренних сред организма человека и животных используют тесты на различных живых организмах Предоставляя мало информации о природе поллютанта, биотестирование дает возможность с большой степенью достоверности определить степень интегральной токсичности объекта исследования.

В числе организмов, на которых проводят биотестирование, присутствуют представители подцарства простейших История применения Protozoa в качестве тест-организмов насчитывает не одно десятилетие В то же время, развитие иных методов токсикологического анализа, таких как химические, физико-химические, иммунологические, а также использование биологической оценки на организмах из других систематических групп не снижают актуальности биотестов на простейших Об этом говорит значительное число методических разработок, рекомендаций и публикаций, постоянно появляющихся в специализированных изданиях, а также их широкое использование на практике Эти методы обладают высокой чувствительностью, экспрессностью, надежностью, универсальностью и малой себестоимостью Они просты в проведении, поддаются инструментализа-

ции и автоматизации, а их результаты легко интерпретируемы В отличие от химических и физико-химических методов анализа, биотестирование на инфузориях позволяет прогнозировать интегральное воздействие изучаемого объекта на живые организмы, поскольку реакция биологической тест-системы зависит не только от отдельных токсичных соединений, содержащихся в объекте исследования, но и от их взаимодействия между собой, а также от присутствия веществ, обладающих ярко выраженным влиянием на токсичность указанных соединений А по сравнению с биотестами на высших животных оно обладает значительными преимуществами в экономической, методической и этической сферах

Хотя в рассматриваемой области накоплен богатый фактический материал, в биологической науке до сих пор отсутствует единая концепция, описывающая биотестирование на инфузориях Определения основных используемых терминов не получили точных и исчерпывающих формулировок, недостаточно изучена культура инфузорий, как система, по реакции которой производится оценка объекта внешней среды, не выявлены закономерности ее реакции на неблагоприятные воздействия, не сформулированы принципы выбора тест-организмов Как следствие, отсутствуют единые методы подготовки проб и культуры инфузорий как тест-системы к проведению анализа

Недостаточность теоретического описания биотестирования на инфузориях влечет за собой разнообразные проблемы в практическом воплощении конкретных методик Тест-организмы зачастую подбираются без учета их биологических особенностей, инфузории культивируют на нестандартных средах и в произвольных условиях, во многих методиках процесс подготовки тест-системы к анализу отсутствует как таковой, уровень чувствительности наблюдаемых, тест-реакций далеко не всегда соответствует поставленным задачам, используемые для оценки степени проявления тест-реакции критерии в ряде случаев имеют малую информативность по сравнению с альтернативными Все это приводит к огрублению результатов, неверной их интерпретации, снижению объективности выводов, а зачастую и к дискредитации биотестирования, как метода научного исследования По этим причинам в настоящее время особую важность приобретает вопрос о комплексном подходе к биотестированию В первую очередь необходим глубо-

кий теоретический анализ этой группы методов Создание единой концепции оценки свойств объектов окружающей среды по реакции культуры инфузорий должно способствовать развитию, стандартизации и унификации уже разработанных методов, а также созданию новых, более совершенных

Таким образом, можно заключить, что исследования в указанной области являются актуальными и имеют важное теоретическое и прикладное значение

Цель и задачи исследования. С учетом вышеизложенного в работе ставилась цель на основе теоретического осмысления и критического анализа литературных данных и результатов собственных исследований сформировать научные основы биотестирования на инфузориях как метода научного исследования

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи

1 Обобщить и систематизировать накопленный опыт в области оценки свойств различных объектов по реакции организмов группы Protozoa,

2 Сформулировать определения основных терминов, используемых в биотестировании,

3 Сформировать научное представление о культуре инфузорий как диагностической тест-системе и выявить основные закономерности процесса ее взаимодействия с объектами исследования,

4 Разработать принципы выбора тест-организмов и методы подготовки культуры инфузорий к проведению биотеста применительно к конкретным задачам биотестирования различных объектов окружающей среды,

5 Сформировать комплекс мер для стандартизации процесса биотестирования и управления основными параметрами тест-систем,

6 Разработать эффективный, экспрессный, недорогой биотест с использованием инфузорий, отвечающий сформулированным требованиям, опробировать его в производственных условиях и внедрить в практику

Научная новизна. Обобщены и систематизированы исследования в области изучения реакций инфузорий на экстремальные химические воздействия, а также по их использованию в биотестировании.

Разработана система терминов, используемых в области биотестирования На основе комплексного представления о процессе биотестирования составлена его схема и рассмотрены основные факторы, влияющие на него

Проведено систематическое исследование процесса взаимодействия токсичных веществ и их смесей с культурой инфузорий на модели тест-реакций гибели и хемотаксиса Выведены универсальные зависимости, описывающие этот процесс, получены параметры, численно характеризующие токсические свойства химических веществ и их смесей, а также состояние тест-системы

Показаны пути для оптимизации биотестирования и сформирован комплекс мер для его стандартизации и для управления основными характеристиками культуры инфузорий, как тест-системы

Предложены принципы выбора тест-организмов В соответствии с ними выделен и предложен для научно-исследовательских работ и для практического использования штамм инфузории Со1рос1а ¡1етп Разработан и внедрен препарат для исследования кормов в сельском хозяйстве на основе данного штамма Разработана технология приготовления и налажено производство препарата

Все это позволило создать целостную концепцию биотестирования как метода научного исследования

Практическая ценность. Выделен, всесторонне охарактеризован и депонирован в коллекции микроорганизмов НИИ Особо чистых биопрепаратов производственный штамм инфузории Со!роЛа &еггт П-1

Разработана и утверждена на уровне Министерства сельского хозяйства и продовольствия РФ, а также на уровне Министерства аграрной политики Украины научно-техническая документация на препарат "Культура Со1ройа ягехпп сухая для эколого-токсикологических исследований" технические условия и наставление по применению

Разработанный метод оценки токсичности зернопродуктов включен в Межгосударственный стандарт ГОСТ 13496 7-97 "Зерно фуражное, продукты его переработки, комбикорма Методы определения токсичности", Государственный стандарт Украины ДСТУ 3570-97 "Зерно фуражне, продукта його переробки, комбисорми Метода визначення токсичност!" и в Национальный стандарт Рос-

сийской Федерации ГОСТ Р 52337-2005 "Корма, комбикорма, комбикормовое сырье Методы определения общей токсичности" в качестве экспресс-метода

Совместно с редакцией журнала "Архив ветеринарных наук", Всероссийским обществом протозоологов при РАН, Санкт-Петербургским государственным университетом и Международной академией информатизации организована и проведена Международная заочная научно-практическая конференция "Инфузории в биотестировании", Санкт-Петербург, 1998 г В конференции приняли участие свыше ста специалистов из семи стран мира

Результаты исследований и теоретические обобщения, приведенные в диссертации, могут быть использованы в учебном процессе по учебным курсам, связанным с биотехнологией, экологией, зоологией беспозвоночных, протозоологией, производством сельскохозяйственных кормопродуктов и санитарией кормов

Апробация работы. Материалы работы доложены на следующих съездах, конференциях и заседаниях

- заседания Ветеринарного фармакологического совета при Главном управлении ветеринарии Министерства сельского хозяйства и продовольствия Российской Федерации, Москва, в 1992 и 1999 гг ,

- Всероссийская конференция по совершенствованию мер профилактики и борьбы с микотоксикозами птиц, Ломоносов, Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт птицеводства, 1992 г ,

- Международная конференция "Биотехнология-94", Санкт-Петербург, 1994 г,

- заседание Всероссийского общества протозоологов, Санкт-Петербург, 1998 г,

- Международная заочная научно-практическая конференция "Инфузории в биотестировании", Санкт-Петербург, 1УУ8 г,

- заседание Международной молодежной научной школы "Биоиндикация-98", Петрозаводск, 1998 г,

-1 съезд токсикологов России, Москва, 1998 г,

- Заочная научно-практическая конференция "Биотехнология в Федеральной целевой программе «Интеграция»", Санкт-Петербург, 1999 г,

- семинар "Контроль качества кормов" в Ленинградской областной ветеринарной лаборатории, Санкт-Петербург, 2000 г,

- III научно-техническая конференция аспирантов СПбГТИ(ТУ), Санкт-Петербург, 2000 г,

- Всероссийская научная конференция, посвященная 45-летию науч-но-исследовательской лаборатории питания и водоснабжения Военно-медицинской академии, Санкт-Петербург, 2001 г ,

- Международная конференция молодых ученых "Химия и биотехно-логия биологически активных веществ, пищеваых продуктов и добавок Экологически безопасные технологии", Тверь, 2002 г,

- Межвузовская конференция "Микотоксины в экосистемах Санкт-Петербурга и Ленинградской области", Санкт-Петербург, 2002 г,

- Всероссийская научно-практическая конференция "Гигиенические проблемы водоснабжения населения и войск", Санкт-Петербург, 200"? г,

- VII Вишняковские чтения Стратегия и тактика вузовской науки в регионе, Бок-ситогорск, 2004 г,

- Всероссийская научно-техническая конференция "Успехи в специ-альной химии и химической технологии", Москва, 2005 г,

- IV съезд Общества биотехнологов России имени Ю А Овчинникова, Пущино, 2006 г

По пезультатам работы подготовлена и утверждена следующая научно-техническая документация

- Временное наставление к экспресс-методу определения токсичности кормов, кормовыхдобавок, воды и органов павших и убитых животных с использованием культуры Colpoda steimi Утверждено Государственным департаментом ветеринарии МСХиП РФ

- Настанова по застосуванню культури Colpoda steinn (колпода) cyxoi для еколого-токсиколопчних дослщжень об'ектш зовшшнього середовтца тварин та птищ Утверждена Гос департаментом ветеринарной медицины МАП Украины.

- Культура Colpoda steinn сухая для зколого-токсикологичсских исследований Технические условия, ТУ 9388-001-885-95 Утверждены Государственным департаментом ветеринарии МСХиП РФ

- Культура Colpoda steinn суха для еколого-токсиколопчних дослщжень об'ектт 8

зовншшього середовища тварин та птищ Техшчш умови ТУ У 46 15 243 -97 Утверждены Гос департаментом ветеринарной медицины МСХиП Украины

Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в тридцати девяти работах, в том числе, монографии и четырнадцати статьях По материалам работы получено четыре патента РФ

На основе оригинального метода биотестирования разработано три государственных стандарта ГОСТ 13496 7-97, ДСТУ 3570-97 и ГОСТ Р 52337-2005

Объем и структура работы. Материалы диссертации изложены на 262 страницах машинописного текста и включают в себя введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований, обсуждение, выводы и практические предложения Материал иллюстрирован 20 таблицами и 41 рисунком Список основной использованной литературы содержит 319 наименование работ отечественных и зарубежных авторов

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Понятия в определения

Существенная часть нашей работы состоит в обсуждении вопросов терминологии, используемой в области биотестирования Мы придаем этой проблеме особое значение, поскольку любая область науки, завершающая стадию формирования, должна получить связную и внутренне непротиворечивую систему понятий и определений

Биотестирование как метод исследования используют специалисты различных областей науки в экологической токсикологии для анализа вод и почв, в гуманитарной и вегеринарной медицине для исследования свойств внутренних сред высших организмов, в сельском хозяйстве для экспресс-тестирования кормов на общую токсичность, в химии для первичной оценки свойств новых веществ и так далее При этом само понятие "биотестирование" зачастую истолковывают по-разному. приспосабливая этот термин к тому или иному узкому кругу задач и объектов, тем самым, обедняя его содержание и даже вкладывая в него различный смысл Еще сложнее обстоит дело с производными терминами в этой области знания - они не только не имеют устоявшихся определений, но зачастую даже не

являются общепринятыми Комплексное рассмотрение биологических тестов позволило нам вычленить их общие черты и составить универсальную формулировку определения, в котором преодолены проблемы узости сферы использования биотестирования и адекватности описания биологической основы, на которой проводится тест Итак, биотестирование - это оценка свойств изучаемого объекта по его воздействию на биологическую тест-систему (далее - тест-систему) в стандартных условиях Данная формулировка включает в сферу рассмотрения любые методы, в которых для изучения какого-либо явления используются биологические объекты Это позволяет анализировать и сопоставлять биологические тесты, применяемые в разных областях, с единой точки зрения

Введение в данное определение понятия "тест-система" не является случайным Как правило, для обозначения живого элемента, на котором производится постановка биологического теста используют иные понятия, такие как "тест-организм" и "тест-объект" Между тем в общем случае мы имеем дело не просто с отдельными организмами, а с биологической системой, имеющей внутреннюю структуру, определяемую связями между ее биологическими элементами и средой, в которой они находятся Эта система может состоять из группы организмов одного вида, сообщества нескольких видов, целой экосистемы, или же может включать отдельные органы и ткани организма, культуру клеток, изолированные органеллы, ферменты и т д Эти биологические элементы распределены в среде и заключены в определенном объеме Именно тест-система, а не просто отдельные живые организмы, является центральным элементом процесса биотестирования, и уяснение сути этого термина дает ключ к научному пониманию процесса биотес-1ирования, как ыкового, а следовательно, и к целенаправленному управлению им Тест-система - это пространственно ограниченная совокупность чувствительных биологических элементов и среды, в которой они находятся

Из этой формулировки следует, что понятие "тест-объект" является составной частью понятия "тест-система" и органично включается в нее Мы определяем этот термин следующим образом Тест-объекты - это чувствительные элементы, входящие в тест-систему Они могут находиться в одном или различных физиологических состояниях, их пространственное распределение может быть

равномерным, или же они могут концентрироваться в каких-либо областях (на дне сосуда, на его стенках, на твердом носителе, у скоплений пищи ит д)

Под термином же "тест-организм", который также достаточно часто используют специалисты, мы подразумеваем систематическое наименование тест-объекта вплоть до вида, штамма или клона

Принцип, лежащий в основе биотестирования как процесса преобразования материального потока в информационный, мы представляем в виде схемы, показанной на рис 1

Рисунок 1 - Принципиальная схема биотестирования

Процесс постановки биологического теста начинается с того, что исследуемый образец переводят в состояние, удобное для проведения эксперимента, т е получают действующую форму, после чего осуществляют ее контакт с тест-системой На тест-систему действует три группы факторов Первая группа объединяет факторы исследуемого образца К ним, например, относятся токсичные вещества, которые содержатся в исследуемом объекте Воздействие факторов этой группы и подлежит оценке в процессе биотестирования, то есть является целевым Вторая группа факторов объединяет различные посторонние воздействия и "шумовые" помехи Это могут быть изменения температуры, освещения и прочих условий, которые сказываются на состоянии тест-системы Эти факторы не всегда удается учитывать и устранять, тем не менее необходимо стремиться к минимиза-

ции их воздействия К третьей группе факторов относятся разнообразные воздействия, которые наносят на тест-систему намеренно с целью регулирования ее чувствительности Эти воздействия играют роль физиологической нагрузки и их применение может повысить чувствительность тест-систем на один-два порядка

В результате действия всех этих факторов тест-объекты и вся тест-система в целом претерпевают некоторую деформацию, что проявляется в изменении состояния тест-системы и появлении ряда реакций на различных уровнях ее функционирования Эти реакции различаются по чувствительности, скорости проявления, легкости наблюдения и другим параметрам Одну или несколько из этих реакций выбирают в качестве тест-реакции Этот термин мы определяем следующим образом Тест-реакция - это одна из закономерно возникающих ответных реакций тест-системы на воздействие комплекса внешних факторов, выбранная для анализа состояния этой тест-системы

По степени проявления тест-реакции судят о свойствах исследуемого образца Определение степени проявления тест-реакции производится по некоторому критерию При этом одной реакции может соответствовать несколько различных критериев Например, исследуя тест-реакцию гибели организмов, можно регистрировать либо количество погибших особей за определенный промежуток времени, либо время, за которое погибает определенная часть задействованных в опыте животных Тест-критерий - это показатель, на основании которого проводят оценку изменения состояния тест-системы, находящейся под воздействием комплекса внешних факторов

Таким образом, основной результат биотестирования, оценка свойств исследуемого объекта, зависит от ряда факторов способа донесения дежлвующею начала до тест-системы, характеристик самой тест-системы (вида тест-организмов, из которых состоит тест-система, их количества, состояния в момент тестирования и состава среды, в которой они находятся), комплекса посторонних воздействий, выбранной тест-реакции и способа ее наблюдения тест-критерия и, наконец, от квалификации исследователя Проведенные исследования позволили проанализировать эти факторы, а также составить рекомендации по стандартизации биологических тестов и целенаправленному управлению ими Рассмотрим эти

вопросы подробнее

Тест-система

Для корректной постановки и адекватной интерпретации результатов биологического теста необходимо создавать тест-системы определенного состава и перед использованием приводить их в строго нормированное начальное состояние

Говоря о составе тест-системы, в первую очередь необходимо упомянуть ее небиологическую составляющую - среду, в которой распределены тест-объекты Ее химический состав оказывает заметное влияние на чувствительность организмов к внешним воздействиям Одни вещества, такие как белки, антиоксиданты, гумины и некоторые микроэлементы могут оказывать протекторное действие на клетки в процессе интоксикации Другие, например, поверхностно-активные вещества и некоторые органические растворители даже в незначительных концентрациях, напротив, способны многократно усиливать воздействие токсичных веществ на живые объекты По этой причине мы считаем, что тест-системы должны включать лишь те среды, которые готовят на основе растворов с известным и постоянным химическим составом В наших экспериментах хорошо зарекомендовал себя минеральный раствор Лозина-Лозинского, он пригоден для работы со всеми инфузориями, которые были использованы в наших опытах

Правильный подбор тест-организма является не менее важным, чем использование стандартной питательной среды В наших экспериментах мы использовали инфузорий четырех видов Colpoda steimi, Paramecium caudatum, Tetrahymena pyriformis и Stylonychia mytilus Существенные морфологические и физиологические различия этих организмов обуславливают разнообразие сфер их использования в биологической практике И хотя до настоящего времени не сделано обоснованного выбора универсального тест-объекта, идеально пригодного для любых методик биотестирования, более того, существует мнение, что таковой не может быть найден в принципе, анализ индивидуальных особенностей перечисленных инфузорий, а также сравнение их чувствительности к ряду токсичных веществ позволили нам сформулировать общие требования, которым должны отвечать инфузории, рассматриваемые в качестве кандидатов на роль тест-организмов Они таковы идентификация вплоть до вида и штамма (клона), возможность обеснече-

ния постоянства генетических и физиологических характеристик штамма (клона), простота культивирования, высокая чувствительность к основным поллютантам, наличие легко наблюдаемых тест-реакций

При подборе вида инфузории для каких-либо специфических биологических тестов могут быть составлены и другие дополнительные требования, но указанные выше сохраняют свое значение

Помимо вопроса о составе тест-системы, существенное значение имеет проблема нормирования ее начального состояния, которое зависит от физиологического состояния тест-объектов, входящих в нее, то есть от фазы роста культуры и стадии жизненного цикла каждой отдельной инфузории Эти два параметра должны подвергаться стандартизации В наших экспериментах было показано, что чувствительность культуры Со1ро(1а яетп, находящейся на постцистной стадии развития, к мертиолату почти вдвое выше, чем в фазе экспоненциального роста В то же время, по данным ряда авторов, чувствительность инфузорий ТеШЬутепа руп/огти, не имеющих в жизненном цикле стадии цисты покоя, в экспоненциальной фазе роста выше, чем в стационарной Таким образом, можно заключить, что оптимальным для постановки биологического теста состоянием культуры инфузорий, с точки зрения чувствительности ответной реакции, является постцистная стадия жизненного цикла у цистобразующих видов и фаза экспоненциального роста у инфузорий, которые не имеют стадии цисты покоя

Нормирование тест-системы по стадии жизненного цикла, входящих в ее состав инфузорий, может быть осуществлено с использованием разнообразных методов синхронизации Как правило, применяют синхронизацию с помощью серии температурных шоков Э101 метод имеет высокую эффективность, но его практическое использование затруднено вследствие трудоемкости и значительных временных затрат на его проведение Поэтому, хотя в ряде специальных биологических тестов шоковую синхронизацию продолжают применять, при проведении масштабного биотестирования от нее рекомендуют воздерживаться В своих исследованиях мы использовали иной метод синхронизации Он относится к группе механических или селективных методов и заключается в том, что заранее подготовленные цисты покоя инфузории Со1ройа Яети подвергают индуцированному

эксцистированию Данный способ достаточно эффективен и весьма прост в использовании, его пригодность в практическом применении служит весомым аргументом при выборе тест-организма для постановки биологического теста

В результате мы получали синхронизированную культуру инфузорий, но оценку степени ее синхронизированности проводили не по общепринятому методу, который заключается в наблюдении за процессом единовременного деления клеток культуры, а исходя из той физиологической характеристики, которая интересует нас в первую очередь - чувствительности клеток к токсичным веществам Полученный нами индекс синхронизированности показывает, во сколько раз время гибели 100% клеток инфузорий превышает время гибели 50% клеток, и может служить характеристикой генетической и физиологической однородности тест-системы Его вид будет обсуждаться ниже, сейчас лишь укажем, что на постцист-ной стадии жизненного цикла культуры Со1рос1а ¡¡ети его величина составляла 1,07 Это означает, что время, в течение которого погибают все клетки в культуре, превышает время гибели половины из них на 7% Столь низкую величину индекса синхронизированности можно объяснить тем, что мы использовали специально выделенный штамм данного вида инфузории, а также тем, что макронуклеус Со1ро(1а Пети на постцистной стадии жизненного цикла тетраплоиден, как и у только что разделившейся клетки Индекс синхронизированности культуры инфузорий в экспоненциальной фазе роста составлял 1,24 То есть однородность такой культуры была значительно ниже, чем в синхронизированной культуре на постцистной стадии жизненного цикла Соответственно, и ответная реакция тест-системы, в состав которой входят инфузории, взятые из культуры, находящейся в

ЗКСПСЕбШЦ'иЛЬиСЙ фо^А ррС73> Н2 ЗСЗДбЙСТВИб Т0КСИ15Н0Г"0 Е21Д£СТ2и СКиЗЫ^ЯЗГСЯ

растянутой во времени, менее однозначной и труднее интерпретируемой

Таким образом, проблема нормирования первоначального состояния тест-систем, используемых в биотестировании, может быть решена с помощью регулирования двух параметров - фазы роста культуры и стадии жизненного цикла клеток, входящих в ее состав

Тест-реакция и тест-критерий

В зависимости от природы и интенсивности возмущающего воздействия реакции тест-системы могут проявиться на различных уровнях ее функционирования Например, катионы кадмия в концентрации порядка 10"^% вызывают гибель клеток инфузорий В концентрации на порядок ниже этот агент уже не приводит клетки к гибели, но вызывает хемотаксическую реакцию По данным многочисленных исследователей, наблюдение более тонких реакций, таких как угнетение роста, ингибирование ферментных систем, изменение частоты конъюгации и других, позволяет регистрировать еще меньшие концентрации токсичных веществ

Кроме чувствительности, ответные реакции тест-систем характеризуются различной скоростью проявления и легкостью наблюдения Существенное значение имеет и проблема адекватности тест-реакции моделируемому процессу воздействия внешнего фактора на биологические объекты, тесно связанная с уровнем организации тест-системы и интегральностью тест-реакции

Таким образом, одним из важных вопросов биотестирования является выбор одной из ответных реакций тест-системы в качестве тест-реакции Он может быть решен лишь с учетом специфических особенностей задач, стоящих перед исследователем в каждом отдельном случав Но можно сформулировать общие требования, которым должна отвечать тест-реакция По нашему мнению, они таковы достаточная чувствительность к изучаемому фактору, высокая экспрессность, соответствие уровня организации тест-системы уровню моделируемого процесса, интегральность, нетребовательность к специальному оборудованию, нетребовательность к квалификации персонала

Выбор тест-критерия ряд авторов также предлагают осуществлять согласно определенным требованиям По нашему мнению, наиболее целесообразно использовать следующие эффективность, универсальность, количественность и возможность выражения одним числом, наличие биологического смысла, простота и легкость интерпретации и вычисления, сопоставимость при получении в разные сроки наблюдения

В наших исследованиях мы изучали две тест-реакции Первая из них, тест-реакция гибели, была подробно исследована на модели инфузории Со1рос1а яШгт

В качестве тест-критерия для оценки степени проявления этой тест-реакции можно регистрировать либо количество погибших особей за определенный промежуток времени, либо время, за которое погибает определенная часть задействованных в опыте животных Поскольку при работе с инфузориями Со1ройа з1ети используют весьма значительное количество клеток, а также вследствие высокой степени синхронизированное™ культуры этой инфузории на постцистной стадии жизненного цикла, мы применяли второй из этих тест-критериев

1 - кривая для ЛЭ50,2 - кривая для ЛЭцдо Рисунок 2 - Обобщенные кривые "концентрация - время"

Была исследована реакция инфузорий на мертиолат, бутанол, глутаровый альдегид, фенол, о-толуидин, фенилгидразин сульфат, 2,4-Д, гексахлоран, хлорофос, метафос, этафос, а также на неорганические соли, содержащие катионы Сс£+, Си2+, РЬ2+ и 7х?+ Во всех изученных случаях зависимость времени гибели клеток инфузории от концентрации вызывающего эту гибель токсичного вещества ("концентрация - время") имела характерный вид Обобщенные кривые, описывающие этот процесс, показаны на рис 2 Уравнение регрессии для этих кривых представляет собою степенную функцию

т = А Сь

где т - время гибели некоторой доли организмов в популяции, С - концентрация токсичного вещества в растворе, А - нормирующий коэффициент, зависящий от

регистрируемой доли гибнущих организмов, b - коэффициент в показателе степени, биологический смысл которого указан ниже

Так как тест-система в общем случае представляет собой неоднородную совокупность клеток, их гибель происходит не одномоментно, а с некоторым временным разбросом Поэтому графическое описание процесса взаимодействия токсичного вещества с популяцией живых организмов в координатах "концентрация - время' представляет собой семейство изоэффективных кривых, описываемых приведенной выше формулой, которые отличаются между собой только коэффициентом А Вид полученных кривых "концентрация - время" для Colpoda steinn соответствует описанному в литературе для ракообразных Daphma magna, что позволяет говорить об универсальности данной зависимости для живих систем Использование изоэффективных уровней воздействия предполагает использование такой величины, как летальная экспозиция для 50% и 100% клеток (LE50 и LEjoo) вместо летальной концентрации (летальной дозы) этого вещества, вызывающей гибель 50% или 100% тест-объектов в течение фиксированного промежутка времени Анализ зависимости "концентрация - время" позволяет получить единую систему параметров, характеризующих тест-систему, процесс ее взаимодействия с токсичным веществом и само исследуемое токсичное вещество Использование этих кривых дает в руки токсикологов важный инструмент для сравнения различных тест-систем по их чувствительности и однородности Величина временного разброса гибели клеток (а следовательно, и разница между нормирующими коэффициентами А| и Xj и графиками на рис 2) будет тем меньше, чем клетки ближе друг к другу генетически и по физиологическому состоянию, то есть, чем однороднее тест-система Поэтому генетическая и физиологическая однородность тест-системы, как было сказано ранее, может быть охарактеризована при помощи индекса синхронизированности - отношения нормирующих коэффициентов А2 и Ai

Токсичное вещество характеризуется уже двумя параметрами пределом обнару-18

жения, который показывает, в какой концентрации вещество вызывает гибель 50% клеток инфузорий в течение 3 часов

чЬ

Спр=

А1

180

и коэффициентом Ь, который определяет вероятность возникновения неблагоприятного эффекта при повышении концентрации токсичного вещества, иными словами, токсикологическую широту действия вещества

Необходимо отметить, что уравнение "концентрация - время" удачно описывает экспериментальные данные в области больших и средних концентраций токсичных веществ В области же малых концентраций могут наблюдаться отклонения экспериментальных данных от теоретической кривой Мы склонны объяснять этот факт проявлением различных адаптационных механизмов клеток инфузорий, частично компенсирующих воздействие повреждающего фактора Кроме того, при большом времени экспозиции (несколько часов и более) может возникать эффект десинхронизации культуры Вследствие этого кривые, которые должны ассимптотически приближаться к оси ординат, на самом деле не пересекают некоторую вертикальную линию, за которой концентрация токсичного вещества настолько мала, что не вызывает гибели клеток

Сравнение чувствительности к токсичным веществам тест-реакции гибели Со1ройа ¡¡етп и высших животных показывает, что инфузории реагируют на концентрации на один-два порядка ниже, чем теплокровные Об этом наглядно свидетельствуют материалы таблицы 1 В последней графе указана концентрация токсичного вещества в экстракте исследуемого корма при соотношении экстра-гента и навески пробы корма 5 1, полноте экстракции 100% и содержании токсина в пробе в количестве, приводящем к гибели 50% подопытных теплокровных животных, считая условно, что животное съедает в сутки количество корма, эквивалентное 10% своего веса

Из материалов таблицы видно, что чувствительность данного тест-объекта к изученным токсичным веществам выше, чем у теплокровных животных Таким образом, тест-реакция гибели инфузории Со1рос1а &етп может быть использована для анализа объектов внешней среды в области острой токсичности

Таблица 1 - Оценка чувствительности тест-реакции гибели инфузории Colpoda

steinu к токсичным веществам в сравнении с теплокровными животными

Вещество Предел обнаружения, % ЛД50, мг/кг веса тела Содержание в экстракте, %

Си2+ 1,56 10-3 248,5 49,7 Ю-3

Cd2+ 1,39 Ю-3 53,9 10,77 10-3

Hg2+ 1,52 10"4 12,9 25,86 10"4

Мертиолат 4,93 10"4 75,0 150,0 10"4

2,4-Д 8,96 Ю-3 100,0 20,0 10-3

Этафос 1,81 10-3 250,0 50,0 10-3

Вторая тест-реакция, которую мы использовали в экспериментах, это тест-реакция хемотаксиса В качестве тест-критерия нами было выбрано отношение показания прибора "Биотестер" в опыте к его показанию в контроле, выраженное в процентах Данный тест-критерий характеризует относительное количество клеток инфузорий, перешедших в верхнюю фазу оптической кюветы, содержащую анализируемый образец, по сравнению с контролем

Показано, что количество клеток инфузорий, перешедших в верхнюю фазу кюветы, содержащую токсичное вещество, за определенный промежуток времени находится в зависимости от концентрации этого вещества (зависимость "концентрация - эффект") В области, в которой тест-критерий находится в пределах 1070%, данная зависимость может быть описана уравнением прямой линии За пределами этой области наблюдаются отклонения экспериментальных данных от линии регрессии В качестве характеристики токсичности вещества мы выбрали концентрацию этого вещества, при которой величина тест-критерия составляет 50%

Сопоставление чувствительности тест-реакции хемотаксиса инфузории Paramecium caudatum со стандартными характеристиками токсичных веществ (таблица 2) показывает, что данная тест-реакция может быть использована для оценки объектов окружающей среды при работе с концентрациями некоторых токсичных веществ, приближающихся к области предельно допустимых концентраций

Таблица 2 - Оценка чувствительности тест-реакции хемотаксиса инфузории Paramecium caudatum к токсичным веществам в сравнении с гигиеническими параметрами

Токсичное [ вещество Cd2+ Си2+ Zn2+ Фенол

ПДК, % 6,0 10"7 2,6 10-6 4,8 10-5 1,0 10-7

С50,% 8,0 Ю-5 6,6 10-5 8,3 10-5 7,1 Ю-3

В процессе экспериментов обе тест-реакции показали постоянные уровни чувствительности к изученным токсичным веществам, высокую экспрессность, информативность и удобство в использовании, что дает основания к рекомендации их для практического применения

Воздействия на тест-систему

В общем случае ответные реакции формируются в тест-системе, как результат целого комплекса внешних воздействий Основным из них, интересующим исследователя в первую очередь, является фактор исследуемого образца Как правило, практические работники имеют дело с комплексным загрязнением исследуемых объектов окружающей среды И ценность биотестирования во многом обусловлена возможностью проводить оценку интегральной токсичности объекта исследования Однако проблема действия смесей токсичных веществ на живые организмы и, в частности, на инфузорий все еще остается недостаточно изученной Поэтому важной частью нашей работы явилось исследование комбинированного воздействия различных токсичных веществ на используемые тест-системы Были изучены бинарные смеси веществ с единым предполагаемым механизмом действия (катионы кадмия - катионы цинка, катионы кадмия - катионы меди) и смеси соединений, относящихся к различным группам токсичных веществ (катионы кадмия в сочетании с 2,4-Д, метафосом, фенолом, а также глутаровым альдегидом) В каждой серии опытов одно из двух веществ пребывало в постоянной концентрации и служило фоном, а концентрацию второго вещества мы меняли в некоторых пределах Кривые "концентрация - время", построенные по материа-

лам исследований, позволили провести оценку характера комбинированного воздействия изученных бинарных смесей

При этом удалось выявить два различных характера взаимовлияния токсичных веществ при их взаимодействии с тест-системой Аддитивный тип взаимовлияния веществ наиболее ярко может быть продемонстрирован на примере раствора, содержащего катионы цинка и кадмия (рис 3), а также катионы меди и кадмия Токсический эффект, вызываемый смесью, складывается из токсических эффектов, вызываемых каждым компонентом такой смеси при их изолированном воздействии

Фоновая концентрация катионов цинка 1 - 0%, 2 - 0,8 10"3%, 3-1,25 10"3%, 4-1,7 10-3%

Рисунок 3 - Комбинированное влияние катионов кадмия и цинка на клетки Со1рос1а ¡¡етп

Происходит это, вероятно, по причине того, что механизм действия этих веществ на тест-систему един При изменении концентрации фонового компонента кривая "концентрация - время" смещается вдоль оси абсцисс на величину, пропорцио-

нальную данному изменению (рисунок 4) При низких концентрациях фонового компонента данный процесс может быть описан формулой

лЬ

лэ50 = А

1 с ■<

пр2

где А - нормирующий коэффициент, Ь - коэффициент, определяющий токсикологическую широту действия основного компонента смеси, С-[ - молярная концентрация основного компонента смеси, С2 - молярная концентрация фонового компонента смеси, СПр] - предел обнаружения основного компонента смеси [моль/л], СПр2 - предел обнаружения фонового компонента смеси [моль/л]

ЛЭ50, мин.

0,30 СС()», 10"' моль/л

0,2« 0,25

1 - кривая "концентрация - время" при отсутствии Хт?+,

2 - кривая "концентрация - время" при фоновой концентрации 2п2+ 0,8 10"3%, Г - отображение профиля кривой 1, иллюстрирующее аддитивный характер взаимодействия катионов двух металлов

Рисунок 4 - Характер комбинированного воздействия катионов С(А+ и

При повышении концентрации фонового компонента до величин, близких к пределу обнаружения, эффект действия смеси был несколько ниже суммы эффектов влияния компонентов при их изолированном применении, что говорит об отклонении характера действия смеси катионов тяжелых металлов от аддитивности в сторону антагонизма При этом изменялась токсикологическая широта действия смеси, что сопровождалось изменением абсолютного значения коэффициента "Ь"

в показателе степени уравнения По нашему мнению, это обусловлено повышением вклада фонового компонента в суммарный эффект действия смеси, а также конкуренцией катионов тяжелых металлов, возникающей в процессе их взаимодействия с молекулами-мишенями

Характер взаимовлияния токсичных компонентов близкий к аддитивному был выявлен также при исследовании смесей метафоса с катионами кадмия, а также фенола с катионами кадмия Токсикологическая широта действия смеси метафоса и катионов кадмия при введении метафоса, как фонового компонента, расширялась О смеси фенола и катионов кадмия подобного заключения сделать не удалось ввиду того, что кривые "концентрация - эффект" при комбинированном действии этих двух веществ не соответствуют виду степенной функции

Антагонистический тип взаимовлияния токсичных компонентов смеси был выявлен при исследовании смесей 2,4-Д с катионами кадмия, а также глутарового альдегида с катионами кадмия Хотя результат действия смесей этих веществ и превышал эффекты от их изолированного влияния, он был меньше суммы этих эффектов При этом токсикологическая широта действия смеси при изменении соотношения ее компонентов либо не изменялась, как в случае с 2,4-Д и катионами кадмия, либо уменьшалась (смесь глутарового альдегида и катионов кадмия)

Помимо токсичных соединений, присутствующих в исследуемом образце изначально, в процессе постановки биологического теста могут участвовать и иные вещества, так как хотя одни объекты окружающей среды, такие как природные и сточные воды, удается исследовать непосредственно, другие предварительно приходится переводить в действующую форму, которая может представлять собой экстракт, эмульсию либо суспензию В связи с использованием в этих целях органических растворителей и ПАВ встает вопрос об их воздействии на тест-систему Нами была изучена чувствительность инфузорий к органическим растворителям - этанолу, ацетону, ДМСО и поверхностно-активным веществам - твину-80, тритону Х-305, додешшсульфату натрия, неонолу П-6 и неонолу П-9-12 Полученные данные позволяют говорить о том, что для суспензирования не растворимых в воде токсичных веществ целесообразно применять этанол, ДМСО, ацетон, тритон Х-305 и твин-80, так как эти вещества не обладают высокой токсич-

ностью по отношению к инфузориям Токсическое действие ДСН и поверхностно-активных веществ группы неонолов, напротив, ярко выражено Но при использовании указанных растворителей и ПАВ для подготовки действующих форм необходимо учитывать их влияние на чувствительность тест-систем к токсичным веществам

Таблица 3 - Комбинированное действие органических растворителей и токсич-

ных веществ (Со1ро<1а Шгтг, тест-реакция гибели)

Растворитель Токсичное вещество

Наимен Конц-ия, % Сс12+ СПр> %> ь Си2+ СПр. %> ь гп2+ Сцр.%, ъ фенол Сцр, %, Ь

- - 1,39 10-3, -3,24 1,56 10-3, -2,79 2,05 Ю-3, -1,79 38,5 Ю-3, -1,90

ДМСО 2,5 Ю-3 0,65 10-3, -2,26 1,28 10-3, -2,49 1,09 10-3, -1,64 30,3 ю-з, -1,89

50 Ю-3 0,49 10-3, -2,15 1,19 10-3, -2,47 0,95 10-3, -1,59 28,0 Ю-3, -1,88

ацетон 0,5 0,45 Ю-3, -1,85 1,07 10-3, -2,37 0,65 Ю-3, -1,53 36,7 Ю-3, -1,90

2,5 0,32 10-3, -1,67 1,05 10-3, -2,36 0,48 Ю-3, -1,45 35,1 Ю-3, -1,90

этанол 0,96 - 1,34 Ю-3, -2,79 - -

1,90 0,58 10-3, -1,78 - 0,93 Ю-3, -1,61 26,9 10-3, -1,92

3,20 0,51 Ю-3, 1 П1 -А , ! - - 24,2 10-3, 1 ги

Нами изучены комбинации растворов, содержащих фенол и катионы тяжелых металлов (кадмия, меди и цинка) в сочетании с ДМСО, ацетоном, этанолом, тви-ном-80, ДСН и тритоном Х-305, использованными в качестве фонового компонента в концентрациях, которые при изолированном действии не вызывали заметного эффекта Для каждой пары веществ были построены серии кривых "концентрация - время", по этим кривым была проведена оценка характера комбинированного воздействия веществ Во всех изученных сочетаниях токсичных ве-

ществ с органическими растворителями наблюдался эффект потенцирования, то есть эффект действия смеси значительно превышал сумму эффектов ее компонентов при их изолированном воздействии При этом предел обнаружения токсичного вещества снижался в 1,5 - 4 раза Токсикологическая широта действия при добавлении органического растворителя повышалась лишь у катионов тяжелых металлов, а у фенола статистически достоверных изменений не претерпевала (таблица 3)

Таблица 4 - Комбинированное действие ПАВ и токсичных веществ (Со1рос1а

¡¡ети, тест-реакция гибели)

! ПАВ Токсичное вещество |

■ Наимен Конц-ия, % Сс12+ Ь 7^2+ , Спр,%, Ь фенол 1 спр> %> 1 Ь |

- - 1,39 Ю-3, -3,24 2,05 Ю-3,' - -1,79 38,5 Ю-3, 1 -1,90

Твин-80 210-3 0,45 10-3, -1,57 0,57 Ю-3, -1,43 18,3 10-3, -1,91

20 10-3 0,28 Ю-3, -1,54 - -

ДСН 0,2 10-3 1,06 ю-з, -3,23 - -

2 10-3 0,56 10-3, -3,19 0,55 Ю-3, -1,45 25,8 10-3, -1,88

20 10-3 - - 18,0 Ю-3, -1,89

Тритон Х-305 2 10"3 1,11 10-3, -3,23 0,59 Ю-3, 1 л с - 19,7 Ю-3, -1,65

20 10-3 0,99 Ю-3, -3,24 0,41 Ю-3, -1,41 17,7 Ю-3, -1,63

Влияние поверхностно-активных веществ было во многом подобно действию органических растворителей Во всех изученных смесях наблюдали эффект потенцирования При этом предел обраружения изученных токсичных веществ снижался в 2-5 раз Однако токсикологическая широта действия изменялась не во всех случаях Так, тритон Х-305 и додецилсульфат натрия не снижали коэффщщ-26

ент "Ь" для катионов кадмия, а твин-80 и додецилсульфат натрия не снижали этот коэффициент для фенола (таблица 4)

Влияние органических растворителей и поверхностно-активных веществ на чувствительность хемотаксической реакции инфузорий к изученным токсичным веществам также оказалось ярко выраженным

Таблица 5 - Комбинированное действие органических растворителей, ПАВ и токсичных веществ (Paramecium caudatum, тест-реакция хемотаксиса)

Растворитель Токсичное вещество

Наимен Конц-ия, % Cd2+ Cu2+ Zn2+ фенол

С50, % С50, % С50,% С50, %

- - 8,0 10-5 6,6 Ю-5 8,3 10-5 7,1 Ю-3

Твин-80 0,1 - - - 1,8 10-3

1,0 1,8 Ю-5 2,8 Ю-5 6,8 Ю-5 -

ДСН 0,001 5,5 10-5 5,5 10-5 5,8 Ю-5 6,2 10-3

0,002 2,2 Ю-5 1,0 10-5 3,8 10-5 2,7 10-3

ДМСО 0,01 3,4 10-5 6,1 Ю-5 5,1 Ю-5 6,9 10-3

0,1 - 4,3 Ю-5 3,0 Ю-5 4,3 10-3

Так, в присутствии твина-80, додецилсульфата натрия или ДМСО концентрация изученных токсичных веществ, которая создавала уровень относительной токсичности равный 50% (С50), снижалась в 2-6 раз (таблица 5), при этом чувствительность тест-реакции возрастала настолько, что вплотную приближалась к показателям ПДК катионов цинка и меди

Исходя из вышеизложенного можно заключить, что токсичность при комбинированном воздействии нескольких различных веществ в общем случае не является аддитивной величиной Некоторые токсичные вещества способны снижать эффект воздействия в сочетании с другими веществами, а иные, не являясь сами по себе токсичными, могут увеличивать токсический эффект действия токсикантов По этой причине мы полагаем, что термин "суммарная токсичность", часто используемый в литературе, не адекватно отражает описываемое явление Более правильно применять термин "интегральная токсичность" Кроме того, результаты экспериментов говорят о том, что только методы биотестирования могут

дать адекватное представление о воздействии смесей различных химических веществ на живые системы

Изучение влияния органических растворителей и ПАВ на чувствительность тест-систем к токсичным веществам имеет и другой важный аспект Практическое использование биологических тестов часто ставит перед исследователями задачу целенаправленного искусственного изменения порога реагирования тест-системы на внешние воздействия Для этого могут быть использованы так называемые физиологические (функциональные) нагрузки Их роль заключается в искусственном изменении состояния тест-системы путем того или иного стрессового воздействия Механизмы подобных воздействий на живую клетку могут быть достаточно разнообразными В одних случаях клетка вынуждена компенсировать влияние нагрузки путем перестройки метаболизма и расходовать на это часть своих внутренних ресурсов При этом снижаются возможности клетки для противодействия влиянию исследуемого токсичного вещества и, соответственно, увеличивается чувствительность к нему Другие факторы, изменяя транспортные возможности поверхностных структур клетки, облегчают проникновение токсичных веществ в цитоплазму, тем самым усиливая их влияние на клетку В числе последних факторов особый интерес вызывают органические растворители и ПАВ

В качестве характеристики влияния вещества, выбранного в качестве функциональной нагрузки, мы использовали коэффициенты потенцирования, которые представляют собой отношения пределов обнаружения токсичного вещества при изолированном действии и в присутствии фонового компонента

с с

"Р к = 50

"ö С ' "t С,п ' пр.к 50 к

где K(j и Kt - коэффициенты потенцирования для тест-реакций гибели и хемотаксиса соответственно, СПр и Сщ,к - пределы обнаружения вещества по тест-реакции гибели при изолированном действии и в присутствии фонового компонента, С50 и С50К - пределы обнаружения вещества по тест-реакции хемотаксиса при изолированном действии и в присутствии фонового компонента

Таблица 6 - Коэффициенты потенцирования при комбинированном действии

ПАВ и органических растворителей с токсичными веществами на тест-системы

ПАВ или растворитель Конц-ия, % Токсичное вещество

са2+ Си2+ гп2+ фенол

Ка (вне скобок) и К[ (в скобках)

ДМСО 2,5 10-3 2,1 1,2 1,9 1,3

ю ю-з (2,4) (1,1) (1,6) (1,0)

50 Ю-3 2,8 1,3 2,2 1,4

юо ю-з - (1,5) (2,8) (1,7)

Ацетон 0,5 3,1 1,5 3,2 1,1

2,5 4,3 1,5 4,3 1,1

Этанол 0,96 - 1,2 - -

1,90 2,4 - 2,2 1,4

3,20 2,7 - - 1,6

Твин-80 210-3 3,1 - 3,6 2,1

20 10-3 5,0 - - -

юо ю-з - - - (3,9)

1,0 (4,4) (2,4) (1,2) -

ДСН 0,2 10-3 1,3 - - -

1 ю-з (1,5) (1,2) (1,4) (1,2)

2 Ю-3 2,5(3,6) (6,6) 3,7 (2,2) 1,5 (2,6)

20 10-3 - - - 2,1

Тритон Х-305 2 Ю-3 1,3 - 3,5 2,0

20 Ю-3 1,4 - 5,0 2,2

Из представленных в таблице б данных можно заключить, что тест-система поддается внешнему целенаправленному регулированию Порог ее чувствительности ко внешним воздействиям может быть искусственно изменен путем применения функциональной нагрузки Для повышения чувствительности тест-реакции гибели клеток наиболее целесообразно использовать диметилсульфоксид в концентрации 50 10*3%, а из поверхностно-активных веществ - твин-80 в концентрациях от 2 10-3% до 20'10*3% Для повышения чувствительности тест-реакции хемотаксиса более эффективным оказался додецилсульфат натрия в концентрации от 1 10-3% до 2 10-3%

Третью группу внешних воздействий на тест-систему составляют "шумовые" факторы Как правило, их воздействие обусловлено теми манипуляциями, которые производят с тест-системой в процессе осуществления ее контакта с исследуемым образцом К ним относятся колебания температуры, изменения кислотности среды, осмотические воздействия и так называемый "ударный" эффект Воздействие этих факторов на тест-систему обычно не приводит к значительному искажению результатов, однако определенный вклад в погрешность при определении тест-критерия они вносят Поэтому, хотя эти факторы не всегда удается учитывать и устранять в процессе постановки биологического теста, следует принимать меры для их минимизации

Разработка теоретической концепции биотестирования как метода научного исследования дала нам возможность перейти к ее практическому воплощению

Практическая реализация научных основ биотестирования

- Одной из задач, стоявших перед нами, явилась разработка нового, эффективного, экспрессного и недорогого биологического теста, с помощью которого можно было бы исследовать объекты внешней среды сельскохозяйственных птиц, такие как корма, вода и другие, а также внутренние среды организма птиц в условиях промышленного птицеводства Поскольку новый биотогический тест планировали использовать в условиях лабораторий птицефабрик и иных сельскохозяйственных предприятий, не приспособленных для осуществления ряда мероприятий по систематическому поддержанию культур инфузорий и не имеющих возможности использовать специальное дорогостоящее оборудование для наблюдения за некоторыми специфическими тест-реакциями, то такой биологический тест должен был иметь вид стандартного набора, содержащего готовую к применению тест-систему, а используемая тест-реакция доступна для наблюдения с помощью стандартных технических средств, имеющихся в любой лаборатории

Эти условия дали нам ориентиры в поиске тест-организма В первую очередь наше внимание привлекли те виды свободноживущих инфузорий, которые имеют в своем жизненном цикле стадию покоя и способны образовывать цисты покоя. Особый интерес в этом отношении представляют почвенные виды инфузо-

рий Один из них, Colpoda stemu, был выбран нами в качестве тест-организма Среди признаков, присущих прочим инфузориям, данный вид обладает рядом уникальных свойств Способность образовывать цисты покоя, устойчивые к высушиванию, и быстрый переход от стадии покоя к активной жизнедеятельности позволяют получать на основе культуры Colpoda Steina удобный в использовании сухой препарат-диагностикум с длительным сроком годности А отсутствие стадии конъюгации в жизненном цикле и фазы старения в клональном цикле, специфика процесса деления макронуклеуса, в результате которого генетический материал, в отличие от большинства инфузорий, точно распределяется между дочерними вегетативными ядрами, а также тетраплоидность макронуклеуса на постци-стной стадии жизненного цикла определяют относительное генетическое постоянство лабораторных штаммов данной инфузории и однородность ее культуры, полученной путем индуцированного проращивания цист покоя

В ходе работ с данным видом выделен и депонирован в коллекции культур микроорганизмов Государственного НИИ ОЧБ штамм инфузории Colpoda steinn П-1. Изучены его морфологические и физиологические характеристики, жизненный цикл, охарактеризована чувствительность к токсичным веществам Результаты этих исследований дали основания для разработки на основе культуры инфузории Colpoda steinn П-1 токсикологического диагностикума Форма приготовления этого препарата предложена в виде так называемого токскита, сухого стандартного набора, содержащего живую тест-систему, предназначенную для токсикологических исследований

Необходимым этапом разработки технологии приготовления препарата явилось изучение КйНсшки pocid смешанной кулыуры инфузории Colpoda sieimi и бактерии Bacillus subtilis, представляющей собой систему типа "субстрат - жертва - хищник" Для математического описания этого процесса была выбрана система трех дифференциальных уравнений

dS - о -hmlv dt ~ °Kg + S 1'

dXl - HmS у - ^2mXl x dt Ks + S 1 ]Kxl + Xj

dX2- ^2mXl x

dx Kxl + Xj 2 где S - концентрация лимитирующего субстрата, Xj - концентрация жертвы, Х2 -концентрация хищника, х - время, щт - максимальная удельная скорость роста жертвы, Ц2щ - максимальная удельная скорость роста хищника, Kg - константа полунасыщения по лимитирующему субстрату, Kxi - константа полунасыщения по жертве, ео=1/ад " усвояемость лимитирующего субстрата жертвой, ei=l/axi -коэффициент хищничества (усвояемость жертвы хищником)

Константы модели были определены в острых опытах, что позволило, задавая начальные условия и интегрируя систему в численном виде явным методом Рунге-Кутта четвертого порядка, предсказывать поведение смешанной культуры и управлять ее развитием Эксперименты показали, что математическая модель достаточно точно описывает процесс культивирования смешанной культуры Colpoda steinn и Bacillus subtilis при температуре 22°С Значительные отклонения экспериментальных данных от теоретических наблюдали лишь в последние часы эксперимента Так, реальные концентрации глюкозы и клеток Bacillus subtilis не достигали нуля, а концентрация трофонтов Colpoda stemn по достижении максимума начинала быстро убывать за счет формирования цист покоя Но следует отметить, что максимальные концентрации организмов смешанной культуры получешюй системой уравнений предсказываются верно, как и время достижения этих концентраций, что является ключевым моментом в практическом использовании модели Отклонения экспериментальных данных от теоретических кривых мы склонны объяснять погрешностями при определении констант математической модели, измерении параметров процесса и некоторыми допущениями, принятыми при составлении модели К последним относятся предположение о постоянстве экономических коэффициентов (коэффициентов хищничества и усвояемости суб-

страта) и пренебрежение влиянием первого трофического звена на третье Кроме того, модель не учитывает нелинейный характер зависимости скорости фагоцитоза инфузорий-седиментаторов от концентрации бактерий, особенности процесса палинтомического деления Со1роЛа нШпп и ее способность образовывать цисты покоя Приняв во внимание все эти моменты, можно сделать вывод, что полученная математическая модель позволяет предсказать поведение системы и целенаправленно управлять ею и, следовательно, вполне применима на практике.

Проведенные исследования позволили отработать производственные режимы выращивания больших количеств культуры Со1ро(1а Мети для приготовления препарата Результаты экспериментов нашли отражение в технической документации на препарат и в патентной документации

Еще одним важным звеном в разработке диагностического препарата явилось исследование процесса его хранения и создание комплекса мер по увеличению срока его годности Полученные кривые выживания цист покоя Со1рос1а йетп в сухом состоянии показывают, что значительная доля инцистировавшихся инфузорий в изученных условиях погибала в течение лервых 20 суток хранения Причем доля погибших цист зависела от вида носителя (33% на ацетилцеллюлоз-ной пленке и 71% на стекле) В дальнейшем кинетика гибели цист менялась Скорость гибели цист была невелика и зависела от материала носителя Из изученных вариантов условий хранения наилучшим является хранение цист покоя, сорбированных на ацетилцеллюлозной пленке, в герметично закрытых флаконах в темном месте В таком виде срок годности препарата составляет 24 месяца, что делает возможным его промышленное производство и коммерческое использование

Разработанный препарат призван решить проблему экспрессной оценки интегральной токсичности кормопродуктов и воды, поступающих на птицефабрики, непосредственно в лаборатории предприятия-потребителя Препарат прошел широкую проверку и внедрен в практику работы лабораторий ряда сельскохозяйственных предприятий России, Украины и Грузии Результаты производственных испытаний подтвердили данные камеральных опытов и позволили сделать вывод о его пригодности для оценки кормов сельскохозяйственных животных на общую токсичность. Такой же вывод был сделан при независимой проверке препарата в

Институте ветеринарной медицины УААН (г Киев) и в НПЦ "Корм" (г Санкт-Петербург)

Другой перспективной сферой применения биотестирования с использованием инфузорий является диагностика и мониторинг состояния организмов высших животных, а также их популяций путем исследования токсических свойств их внутренних сред Применение разработанного нами препарата в этой специфической области позволило провести изучение динамики токсичности сыворотки крови кур в зависимости от их возраста в нормальных условиях, а также при различных заболеваниях и специальных технологических мероприятиях Результаты исследования показали, что токсические свойства сыворотки крови кур находятся в зависимости от возраста, причем, возрастные изменения носят закономерный характер Экстремальные внешние воздействия изменяют свойства сыворотки крови кур Так, при профилактической вакцинации цыплят против болезни Гам-боро и инфекционного ларинготрахеита токсичность сыворотки крови птиц увеличивалась в 3-4 раза уже на следующие сутки Подобное явление наблюдали и при инфекционном процессе, вызванном мезогенным вирусом ньюкаслской болезни Среднее значение регистрируемого параметра изменялось в 1,7 раза по сравнению с нормой Таким образом, уровень токсичности крови птиц, а также статистический разброс этого параметра могут служить критерием для экспрессной диагностики общего состояния поголовья птиц в условиях промышленного птицеводства

ВЫВОДЫ

1 Сформированы научные основы биотестирования, как метода анализа объектов окружающей среды Они включают в себя

- связную систему оригинальных определений основных терминов, используемых в биотестировании,

- схему постановки биологического теста, как процесса превращения материального потока, представленного исследуемым образцом и его действующей формой, в информационный, результатом которого является оценка исследуемого образца,

- описание внутренней структуры тест-системы, как центрального звена

процесса биотестирования, и трех групп факторов внешних воздействий на тест-систему,

- пути оптимизации, стандартизации и управления тест-системой и процессом биотестирования в целом

2 Даны обоснования к использованию инфузорий в качестве тест-объектов в биологических тестах, разработаны системы требований для отбора тест-организмов, тест-реакций и тест-критериев, наиболее пригодных для практического применения

3 Выведена универсальная зависимость, описывающая процесс взаимодействия культуры клеток инфузорий с токсичным веществом на модели тест-реакции гибели, и на ее основе получены характеристики токсичных веществ -предел обнаружения, определяемый как концентрация данного вещества в растворе, вызывающая гибель 50% клеток Colpoda stemn в течение 3 часов, и токсикологическая широта действия, характеризуемая коэффициентом в показателе степени уравнения "концентрация - время", а также самой тест-системы - индекс синхронизированности, представляющий собой отношение нормирующих коэффициентов в уравнениях "концентрация - время" для 100% и 50% гибели инфузорий Чувствительность тест-реакции гибели Colpoda steinи к изученным токсичным веществам на 1-2 порядка выше таковой для теплокровных животных Кривые "концентрация - время", характеризующие процесс взаимодействия тест-системы с токсичным веществом, описываются уравнением степенной функции, а морфологические изменения, происходящие в клетках во время интоксикации, носят специфический характер

4 Выведена зависимость, описывающая процесс взаимодействия культуры клеток инфузорий с токсичным веществом на модели тест-реакции хемотаксиса Показано, что применение этой тест-реакции дает возможность исследовать интегральную токсичность объектов внешней среды с содержанием поллютантов на уровне, сравнимом с ПДК

лы, описывающие процесс взаимодействия смеси токсичных веществ с тест-системой при аддитивном типе взаимовлияния

6 В результате исследования процесса комбинированного воздействия смеси токсичного вещества с органическими растворителями, а также с поверхностно-активными веществами на культуру клеток инфузорий выявлен эффект потенцирования Показана принципиальная возможность использования органических растворителей и ПАВ в качестве функциональной нагрузки с целью управления тест-системой и процессом биотестирования в целом

" 7 Сформирован комплекс мер для стандартизации процесса биотестирования и управления основными параметрами тест-систем Он включает использование депонированных штаммов инфузорий, обладающих стабильными генетическими и физиологическими характеристиками, синхронизацию тест-систем перел применением, регулирование чувствительности тест-системы с помощью функциональных нагрузок

8 В результате практической реализации теоретических основ использования инфузорий в биотестировании выбран вид инфузории, обладающий рядом специфических свойств, обуславливающих его преимущества перед иными тест-организмами, выделен, всесторонне охарактеризован и депонирован штамм Со1ро<1а Пети П-1

9 На основе культуры инфузории Со1рос1а Пети П-1 создана тест-система, обладающая по сравнению с существующими важными преимуществами - высокой чувствительностью к токсичным веществам, высокой степенью синхронизи-рованности и постоянством генетических и физиологических характеристик

10 Для управления процессом культивирования моноксеничной культуры инфузории Со1рос1а Пети использована математическая модель типа "субстрат -жертва - хищник", получены значения коэффициентов этой модели

11В результате изучения процесса хранения цист покоя Со1рос1а петп в высушенном состоянии определены оптимальные условия их хранения и срок годности

12 Разработан первый отечественный токскит на основе культуры инфузории Со1рос1а пета, штамм П-1, со сроком годности более 2 лет Препарат прошел

широкие испытания и внедрен в практику работы лабораторий сельскохозяйственных предприятий России, Украины и Грузии Метод оценки интегральной токсичности фуражного зерна и комбикормов с использованием препарата включен в Межгосударственный стандарт ГОСТ 13496 7-97, в Государственный стандарт Украины ДСТУ 3570-97 и в Национальный стандарт Российской Федерации ГОСТ Р 52337-2005 Применение препарата в исследованиях внутренних сред организмов в промышленном птицеводстве является перспективным и может быть использовано при решении вопросов, связанных с регулированием условий содержания животных, проведением профилактических мероприятий, а также при создании различных систем прогнозирования экономических показателей сельскохозяйственных предприятий

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Виноходов Д О , Виноходов В О Препарат токсикологической диагностики кормов // Ростовский ЦНТИ - 1993 - № 97-93 - 2 с

2 Патент № 2001951 Российской Федерации, МКИ5 С 12 N 5/00 Штамм инфузории Colpoda steimi для приготовления токсикологического диагностикума/ Виноходов Д О, Виноходов В О -М НПО "Поиск" Роспатента, 1993 -8 с

3 Патент № 2002263 Российской Федерации, МКИ5 G 01 N 33/18 Способ получения препарата для токсикологических исследований объектов внешней среды/ Виноходов Д О, Виноходов В О - М НПО "Поиск" Роспатента, 1993 -Юс

4 Vmochodov D, Vmochodov V Preparation for toxicological estimation of poultry fodder // International conference "Biotechnology St Petersburg'94" St Petersburg, Russia, September 21-23, 1994 Program and abstracts - SPb, 1994 - P 97-98

5 Виноходов Д О Токсикологические исследования кормов с использованием инфузорий -СПб АВН, 1995 - 80 с

6 Патент № 2039825 Российской Федерации, МКИ6 С 12 О 1/02, G 01 N 33/18 Способ определения токсичности объектов внешней среды/ Виноходов Д О, Виноходов В О - М НПО "Поиск" Роспатента, 1995 - 6 с

7 Виноходов Д О , Виноходов В О, Гинак А И Биотестирование как метод научного исследования // Инфузории в биотестировании Тезисы докладов международной заочной научно-практической конференции -СПб, 1998 - С 40-43

8 Виноходов Д О , Виноходов В О , Гинак А И, Ананченко И В Зависимость "концентрация - время" в острых опытах // Инфузории в биотестировании Тезисы докладов международной заочной научно-практической конференции -СПб, 1998 - С 73-78

9 Виноходов Д О, Виноходов В О Со1рос1а ¡¡етп как тест-организм // Инфузории в биотестировании Тезисы докладов международной заочной научно-практической конференции - СПб, 1998 - С 85-87

10 Виноходов Д О, Виноходов В О , Гинак А И Исследование токсичности зернопродуктов новая редакция ГОСТ // Биоиндикация-98 Материалы Международной молодежной научной школы 21-28 сентября 1998 - Петрозаводск, 1998 -Т 1 -С 164-167

11 Виноходов Д О Математическое моделирование кинетики роста культуры инфузории Со1рос1а з1еши в периодических условиях // Архив ветеринарных наук - 1998 -Т 1(48) - С 121-134

12 Виноходов Д О, Виноходов В О , Гинак А И Определение общей токсичности зернопродуктов // 1-ый съезд токсикологов России 17-20 ноября 1998 Тезисы докладов -М 1998 -С 271

13 Земляникина Т А, Олемской В В, Виноходов Д О Исследование свойств сыворотки крови кур с использованием культуры простейших // Инфузории в биотестировании Тезисы докладов международной заочной научно-практической конференции - СПб, 1998 - С 275-278

14 Казаченок Е Н, Виноходов Д О Влияние органических растворителей на чувствительность инфузорий к тяжелым металлам // Инфузории в биотестировании, Тезисы докладов международной заочной научно-практической конференции - СПб, 1998 - С 229-232

15 Кривицкая О Г, Виноходов Д О Влияние поверхностно-активных веществ на чувствительность инфузорий к тяжелым металлам // Инфузории в биотестировании Тезисы докладов международной заочной научно-практической конференции - СПб, 1998 - С 225-228

16 Соболева Л С , Виноходов Д О Выявление токсигенных грибов, конта-минирующих корма, при помощи инфузорий // Инфузории в биотестировании Тезисы докладов международной заочной научно-практической конференции -СПб, 1998 - С 266-269

17 Виноходов Д О Временное наставление к экспресс-методу определения токсичности кормов, кормовых добавок, воды и органов павших и убитых животных с использованием культуры Со1ройа ¡1ети // Ветеринарная газета - 1999 - № 2 (153) - С 5

18 Виноходов Д О, Виноходов В О, Гинак А И, Земляникина Т А Использование инфузорий в исследованиях внутренних сред высших организмов // Архив ветеринарных наук - 1999 -Т 1(48), ч 3 -С 551-577"

" 19 Зерно фуражне, продукта його переробки, комбжорми Метода визна-чення токсичносп ДСТУ 3570-97 (ГОСТ 13496 7-97) Державний стандарт Украши Кит Держставдарт Украши - 1999. - 15 с

20 Зерно фуражное, продукты его переработки, комбикорма Методы определения токсичности ГОСТ 134967-97 Межгосударственный стандарт -МГСпо стандартизации, метрологии и сертификации - 1999 - 15 с

21 Зубанов П А, Кривицкая О Г, Пожаров А В , Виноходов Д О, Ивакина А В Влияние поверхностно-активных веществ на тест-реакции инфузорий // Биотехнология в ФЦП "Интеграция" Тезисы докладов заочной научно-практической конференции -СПб Изд-воСПбГЩТУ), 1999 - С 107-109

22 Патент № 2136152 Российской Федерации, МКИ6 А 01 К 67/02, А 61 В

10/00, С 12 Q 1/02 Способ определения естественной резистентности организма птиц/ Олемской В В , Виноходов О В , Виноходов Д О - М ФИПС, 1999 - 6 с

23 Зубанов П А , Виноходов Д О Влияние поверхностно-активных веществ на тест-реакцию хемотаксиса Paramecium caudatum // Концептуальные вопросы питания населения и военнослужащих Сборник трудов по материалам Всероссийской научной конференции, посвященной 45-летию научно-исследовательской лаборатории питания и водоснабжения (25 мая 2001 год) - Санкт-Петербург, 2001, с 46-49

24 Зубанов П А, Виноходов Д О Перспективы применения поверхностно-активных веществ в биотестах // Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок Экологически безопасные технологии Материалы международной конференции молодых ученых (15 ноября 2002 г), выпуск второй - Тверь, 2002 - с 20

25 Виноходов Д О , Гинак А И Исследование токсичности зернопродук-тов новая редакция ГОСТ // Ветеринария в птицеводстве - 2002 - №1 - С 9

26 Ковбасенко В М, Горобей А М, Ляшкевич А А , Полежаев Ф И , Гри-горашева И Н, Виноходов Д О , Виноходов В О Экспресс-метод определения токсичности пищевых продуктов с использованием инфузории Colpoda steimi // Ветеринария в птицеводстве - 2002 - №3 - С 26-29

27 Виноходов Д О , Поляков Н Л Биотестирование в птицеводстве и ветеринарии Введение в биотестирование // Ветеринария в птицеводстве - 2003 - №56 - С 41-46

28 Виноходов Д О Методические рекомендации по определению токсичности продуктов животноводства и кормов (микробиологический экс-пресс-метод) // Ветеринария в птицеводстве - 2003 - №5-6 - С 49-54

29 Виноходов Д О , Поляков Н Л Определение микотоксинов методами биотестирования // Ветеринария в птицеводстве - 2003 - №5-6 - С 47-48

30 Храпунова Н М, Рачеева Ю А, Илюшин М А, Зубанов П А, Виноходов Д О Оценка биологической активности новых веществ экспрессными методами (на примере перхлоратных аммиакатов кобальта (III)) И Гигиенические проблемы водоснабжения населения и войск Материалы Всероссийской научно-практической конференции (20-21 ноября 2003 года) - СПб ВМедА, 2003 - С 184-185

31 Конюшенко Е Н, Никитина Ю А, Виноходов Д О, Дубяго Н П, Илюшин М А , Шугалей И В , Целинский И В , Жилин А Ю , Козлов А С , Илюшина Т М Генерация, реакционная способность активных форм кислорода и их деструктивная роль в процессах жизнедеятельности // VII Вишняковские чтения Стратегия и тактика вузовской науки в регионе Материалы международной научной конференции (Бокситогорск, 2 апреля 2004 г) - СПб - 2004 - С 100110

32 Конюшенко Е Н, Никитина Ю А , Дубяго Н П, Илюшин М А , Виноходов Д О , Шугалей И В , Целинский И В , Жилин А Ю, Козлов А С , Илюшина Т М Влияние комплексообразования на свойства коразола // Химия и технология синтетических биологически активных веществ Сборник трудов Всероссийской научно-технической конференции «Успехи в специальной химии и химической технологии» - М, 2005 - С 58-62

33 Виноходов Д О , Поляков Н JI Профилактика ассоциированных токсикозов методами биотестирования // Международный вестник ветеринарии - 2005 - №1/ - С 91-95

34 Корма, комбикорма, комбикормовое сырье Методы определения общей токсичности Национальный стандарт Российской Федерации ГОСТ Р 523372005 - М Стандартинформ, 2005 - 16 с

35 Виноходов Д О Биотестирование на культурах инфузорий в диагностической профилактике пищевых отравлений животных (обзор) // Ветеринарная патология -2006 -№1 -С 90-96

36 Зубанов П А , Виноходов Д О, Филимон Е В Зависимость чувствительности Paramecium caudatum к токсичным веществам от условий обитания // Материалы IV съезда Общества биотехнологов России им Ю А Овчинникова (6-7 декабря 2006 г) - М МАКС Пресс, 2006 - 321 с

37 Виноходов В О , Виноходов Д О , Поляков Н JI Новый экспресс-метод определения токсичности мясопродуктов//Практик -2006 -№2 - С 26-31

38 Виноходов Д О, Пожаров А В Методологические особенности токсикологических тестов с инфузориями // Известия СПбГЭ-ТУ «ЛЭТИ» Серия «Биотехнические системы в медицине и экологии» - 2006 - Вып 3 - С 60-67

39 Поляков Н Л , Виноходов Д О , Виноходов В О Новый экспресс-метод определения токсичности мясопродуктов // Ученые записки Казанской академии ветеринарной медицины -2006 -Т 180 - С 210-219

04 07 07 г Зак 152-100 РТП ИК «Синтез» Московский пр, 26

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Виноходов, Дмитрий Олегович

ВВЕДЕНИЕ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 История развития биотестирования как метода научного исследования

1.2 Методология биотестирования

1.3 Инфузории, как тест-объекты в биотестировании

1.3.1 Морфология и физиология инфузорий

1.3.2 Применение инфузорий в биотестировании

1.3.3 Особенности инфузорий как элементов тест-системы

1.3.4 Культивирование инфузорий

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1 Аппаратура, материалы, реактивы

2.2 Измерения

2.3 Культуры и штаммы микроорганизмов

2.4 Питательные среды

2.5 Определение констант роста культуры Bacillus subtilis

2.6 Определение констант роста культуры Colpoda steinii

2.7 Культивирование смешанной культуры Colpoda steinii и Bacillus 95 subtilis в периодическом режиме

2.8 Определение способности инфузорий к выживанию в изолиро- 96 ванной системе

2.9 Определение чувствительности инфузорий к химическим веще- 97 ствам

2.9.1 Исследование тест-реакции гибели клеток

2.9.2 Исследование тест-реакции хемотаксиса

2.10 Исследование токсичности кормов

2.11 Исследование сыворотки крови кур

2.12 Производственные испытания препарата "Культура Colpoda 102 steinii сухая для эколого-токсикологических исследований"

3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Культуры и штаммы микроорганизмов

3.2 Аппаратное культивирование Colpoda steinii и математическое 110 моделирование этого процесса

3.3 Способность инфузорий к выживанию в изолированной системе

3.4 Чувствительность инфузорий к химическим веществам

3.4.1 Сравнение чувствительности инфузорий Colpoda steinii,

Paramecium caudatum, Tetrahymena pyriformis и Stylonychia mytilus к токсичным веществам

3.4.2 Исследование чувствительности инфузории Colpoda 128 steinii к токсичным веществам на разных стадиях развития

3.4.3 Исследование чувствительности Colpoda steinii к токсич- 131 ным веществам на постцистной стадии жизненного цикла

3.4.4 Изучение комбинированного влияния токсичных веществ 137 на Colpoda steinii на постцистной стадии развития

3.4.5 Изучение влияния органических растворителей и поверх- 147 ностно-активных веществ на Colpoda steinii на постцистной стадии развития

3.4.6 Изучение комбинированного влияния токсичных веществ 151 в сочетании с органическими растворителями и поверхностно-активными веществами на тест-реакцию гибели Colpoda steinii и на тест-реакцию хемотаксиса Paramecium caudatum

3.5 Практическое использование препарата

3.5.1 Тестирование общей токсичности кормов

3.5.2 Исследование токсических свойств сыворотки крови птиц

4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

4.1 Биотестирование как метод токсикологического анализа

4.1.1 Тест-система - инструмент биотестирования

4.1.2 Тест-реакция и тест-критерий

4.1.3 Воздействие исследуемого образца

4.1.4 Реакция тест-систем на комбинированное воздействие ток- 195 сичных веществ

4.1.5 Шумовые факторы, воздействующие на тест-систему

4.1.6 Регулирование чувствительности тест-системы

4.2 Практическая реализация научных основ биотестирования с ис- 205 пользованием инфузорий

4.2.1 Разработка биологического теста

4.2.2 Культивирование Colpoda steinii

4.2.3 Способность инфузорий к выживанию в изолированной сре- 211 де

4.2.4 Исследование объектов внешней среды сельскохозяйствен- 213 ных птиц в промышленном птицеводстве

4.2.5 Исследование внутренних сред птиц в промышленном пти- 215 цеводстве

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Научные основы биотестирования с использованием инфузорий"

Актуальность проблемы

В последние десятилетия биотехнология ярко демонстрирует человечеству свои возможности. Обладая новейшими методами исследования, как в области биологии, так и химии, она дает возможность решать самые разнообразные задачи, стоящие перед человечеством, что позволяет говорить об этой области знания, как об одном из пяти приоритетных направлений научно-технического прогресса начала XXI вв. [131].

Одним из важных направлений прикладной биотехнологии является разработка эффективных биологических методов оценки состояния разнообразных объектов внешней среды, загрязнение которых токсичными веществами в настоящее время приобрело комплексный характер. Даже если бы было возможно определить содержание всех ксенобиотиков в объекте исследования, такая информация была бы недостаточна для каких-либо прогнозов, так как токсикометрические параметры установлены лишь для небольшой части этих веществ. Кроме того, результат комбинированного действия двух и более токсичных веществ, имеющихся в исследуемом образце даже в небольших количествах, предсказать достаточно сложно. Соединения нетоксичные при изолированном действии могут вызывать значительный патологический эффект при комбинированном влиянии. Поэтому для оценки токсичности природных вод, промышленных сбросов, почвы, кормов и прочих объектов окружающей среды, а также новых химических веществ и внутренних сред организма человека и животных используют тесты на различных организмах. Предоставляя мало информации о природе поллютанта, биотестирование дает возможность с большой степенью достоверности определить степень общей токсичности объекта исследования.

В числе организмов, на которых проводят биотестирование, присутствуют представители подцарства простейших. История применения Protozoa в качестве тест-организмов насчитывает не одно десятилетие. В то же время, развитие иных методов токсикологического анализа, таких как химические, физико-химические, иммунологические, а также использование биологической оценки на организмах из других систематических групп не снижают актуальности биотестов на простейших. Об этом говорит значительное число методических разработок, рекомендаций и публикаций, постоянно появляющихся в специализированных изданиях, а также их широкое использование на практике. Эти методы обладают высокой чувствительностью, экспрессностью, надежностью, универсальностью и малой себестоимостью. Они просты в проведении, поддаются инструмен-тализации и автоматизации, а их результаты легко интерпретируемы. В отличие от химических и физико-химических методов анализа, биотестирование на инфузориях позволяет прогнозировать интегральное воздействие изучаемого объекта на живые организмы, поскольку реакция биологической тест-системы зависит не только от отдельных токсичных соединений, содержащихся в объекте исследования, но и от их взаимодействия между собой, а также от присутствия веществ, обладающих ярко выраженным влиянием на токсичность указанных соединений. А по сравнению с биотестами на высших животных оно обладает значительными преимуществами в экономической, методической и этической сферах.

Несмотря на то, что в рассматриваемой области накоплен богатый фактический материал, в биологической науке до сих пор отсутствует единая концепция, описывающая биотестирование на инфузориях. Определения основных используемых терминов не получили точных и исчерпывающих формулировок, недостаточно изучена культура инфузорий, как система, по реакции которой производится оценка объекта внешней среды, не выявлены закономерности ее реакции на неблагоприятные воздействия, не сформулированы принципы выбора тест-организмов. Как следствие, отсутствуют единые методы подготовки проб и культуры инфузорий как тест-системы к проведению анализа.

Недостаточность теоретического описания биотестирования на инфузориях как метода научного исследования влечет за собой разнообразные проблемы в практическом воплощении конкретных методик. Тест-организмы зачастую подбираются без учета их биологических особенностей, инфузории культивируют на нестандартных средах и в произвольных условиях, во многих методиках процесс подготовки тест-системы к анализу отсутствует как таковой, уровень чувствительности наблюдаемых тест-реакций далеко не всегда соответствует поставленным задачам, используемые для оценки степени проявления тест-реакции критерии в ряде случаев имеют малую информативность по сравнению с альтернативными. Все это приводит к огрублению результатов, неверной их интерпретации, снижению объективности выводов, а зачастую и к дискредитации биотестирования, как метода научного исследования.

По этим причинам в настоящее время особую важность приобретает вопрос о комплексном подходе к биотестированию. В первую очередь необходим глубокий теоретический анализ этой группы методов. Создание единой концепции оценки свойств объектов окружающей среды по реакции культуры инфузорий должно способствовать развитию, стандартизации и унификации уже разработанных методов, а также созданию новых, более совершенных.

Таким образом, можно заключить, что исследования в указанной области являются актуальными и имеют важное теоретическое и прикладное значение.

Цель и задачи научных исследований

С учетом вышеизложенного в настоящей работе ставилась цель: на основе теоретического осмысления и критического анализа литературных данных и результатов собственных исследований сформировать научные основы биотестирования на инфузориях как метода научного исследования.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1 Обобщить и систематизировать накопленный опыт в области оценки свойств различных объектов по реакции организмов группы Protozoa;

2 Сформулировать определения основных терминов, используемых в биотестировании;

5 Сформировать комплекс мер для стандартизации процесса биотестирования и управления основными параметрами тест-систем;

Научная новизна

Обобщены и систематизированы исследования в области изучения реакций инфузорий на экстремальные химические воздействия, а также по их использованию в биотестировании.

Разработана система терминов, используемых в области биотестирования. На основе комплексного представления о процессе биотестирования составлена его схема и рассмотрены основные факторы, влияющие на него.

Проведено систематическое исследование процесса взаимодействия токсичных веществ и их смесей с культурой инфузорий на модели тест-реакций гибели и хемотаксиса. Выведены универсальные зависимости, описывающие этот процесс, получены параметры, численно характеризующие токсические свойства химических веществ и их смесей, а также состояние тест-системы.

Предложены принципы выбора тест-организмов. В соответствии с ними выделен и предложен для научно-исследовательских работ и для практического использования штамм инфузории Colpoda steinii. Разработан, всесторонне организован и внедрен препарат для исследования кормов в сельском хозяйстве на основе данного штамма. Разработана технология приготовления и налажено производство препарата.

Все это позволило создать целостную концепцию биотестирования как метода научного исследования.

Практическая ценность

Выделен, всесторонне охарактеризован и депонирован в коллекции микроорганизмов Государственного НИИ Особо чистых биопрепаратов производственный штамм инфузории Colpoda steinii П-1.

Разработана и утверждена на уровне Министерства сельского хозяйства и продовольствия РФ, а также на уровне Министерства аграрной политики Украины научно-техническая документация на препарат "Культура Colpoda steinii сухая для эколого-токсикологических исследований": технические условия и наставление по применению.

Разработанный метод оценки токсичности зернопродуктов включен в Межгосударственный стандарт ГОСТ 13496.7-97 "Зерно фуражное, продукты его переработки, комбикорма: Методы определения токсичности", Государственный стандарт Украины ДСТУ 3570-97 "Зерно фуражне, продукта його переробки, комбшорми: Методи визначення токсичностГ и в Национальный стандарт Российской Федерации ГОСТ Р 52337-2005 "Корма, комбикорма, комбикормовое сырье: Методы определения общей токсичности" в качестве экспресс-метода.

Совместно с редакцией журнала "Архив ветеринарных наук", Всероссийским обществом протозоологов при РАН, Санкт-Петербургским государственным университетом и Международной академией информатизации организована и проведена Международная заочная научнопрактическая конференция "Инфузории в биотестировании", Санкт-Петербург, 1998 г. В конференции приняли участие свыше ста специалистов из семи стран мира.

Результаты исследований и теоретические обобщения, приведенные в диссертации, могут быть использованы в учебном процессе при чтении лекций и проведении лабораторных работ по учебным курсам, связанным с экологией, биологией, зоологией беспозвоночных, протозоологией, производством сельскохозяйственных кормопродуктов и санитарией кормов.

Апробация работы

Материалы работы доложены на следующих съездах, конференциях и заседаниях:

- Заседания Ветеринарного фармакологического совета при Главном управлении ветеринарии Министерства сельского хозяйства и продовольствия Российской Федерации, Москва, в 1992 и 1999 гг.;

- Международная конференция "Биотехнология-94", Санкт-Петербург, 1994 г.;

- Заседание Всероссийского общества протозоологов, Санкт-Петербург, 1998 г.;

- Международная заочная научно-практическая конференция "Инфузории в биотестировании", Санкт-Петербург, 1998 г.;

- Заседание Международной молодежной научной школы "Биоинди-кация-98", Петрозаводск, 1998 г.;

-1 съезд токсикологов России, Москва, 1998 г.;

- Заочная научно-практическая конференция "Биотехнология в Федеральной целевой программе «Интеграция»", Санкт-Петербург, 1999 г.;

- Семинар "Контроль качества кормов" в Ленинградской областной ветеринарной лаборатории, Санкт-Петербург, 2000 г.;

- III научно-техническая конференция аспирантов СПбГТИ(ТУ), Санкт-Петербург, 2000 г.;

- Всероссийская научная конференция, посвященная 45-летию научно-исследовательской лаборатории питания и водоснабжения Военно-медицинской академии, Санкт-Петербург, 2001 г.;

- Международная конференция молодых ученых "Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищеваых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии", Тверь, 2002 г.;

- Межвузовская конференция "Микотоксины в экосистемах Санкт-Петербурга и Ленинградской области", Санкт-Петербург, 2002 г.;

- Всероссийская научно-практическая конференция "Гигиенические проблемы водоснабжения населения и войск", Санкт-Петербург, 2003 г.;

- VII Вишняковские чтения. Стратегия и тактика вузовской науки в регионе, Бокситогорск, 2004 г.;

- Всероссийская научно-техническая конференция "Успехи в специальной химии и химической технологии", Москва, 2005 г.;

- IV съезд Общества биотехнологов России имени Ю.А. Овчинникова, Пущино, 2006 г.

Публикации

Основное содержание диссертации опубликовано в монографии и четырнадцати статьях.

По материалам работы получено четыре патента РФ.

Описание разработанного метода биотестирования опубликовано в ГОСТ 13496.7-97, ДСТУ 3570-97 и ГОСТ Р 52337-2005.

Объем и структура работы

Материалы диссертации изложены на 262 страницах и включают в себя введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований, обсуждение, выводы и практические предложения. Материал иллюстрирован 20 таблицами и 41 рисунком. Список основной использованной литературы содержит 319 наименование работ отечественных и зарубежных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Виноходов, Дмитрий Олегович

выводы

1 Сформированы научные основы биотестирования, как метода анализа объектов окружающей среды. Они включают в себя:

- связную систему оригинальных определений основных терминов, используемых в биотестировании;

- описание внутренней структуры тест-системы, как центрального звена процесса биотестирования, и трех групп факторов внешних воздействий на тест-систему;

- пути оптимизации, стандартизации и управления тест-системой и процессом биотестирования в целом.

3 Выведена универсальная зависимость, описывающая процесс взаимодействия культуры клеток инфузорий с токсичным веществом на модели тест-реакции гибели, и на ее основе получены характеристики токсичных веществ - предел обнаружения, определяемый как концентрация данного вещества в растворе, вызывающая гибель 50% клеток Colpoda steinii в течение 3 часов, и токсикологическая широта действия, характеризуемая коэффициентом в показателе степени уравнения "концентрация - время", а также самой тест-системы - индекс синхронизированности, представляющий собой отношение нормирующих коэффициентов в уравнениях "концентрация - время" для 100% и 50% гибели инфузорий. Чувствительность тест-реакции гибели Colpoda steinii к изученным токсичным веществам на 1-2 порядка выше таковой для теплокровных животных. Кривые "концентрация - время", характеризующие процесс взаимодействия тест-системы с токсичным веществом, описываются уравнением степенной функции, а морфологические изменения, происходящие в клетках во время интоксикации, носят специфический характер.

4 Выведена зависимость, описывающая процесс взаимодействия культуры клеток инфузорий с токсичным веществом на модели тест-реакции хемотаксиса. Показано, что применение этой тест-реакции дает возможность исследовать интегральную токсичность объектов внешней среды с содержанием поллютантов на уровне, сравнимом с ПДК.

5 В результате изучения процесса комбинированного воздействия смеси токсичных веществ на культуру клеток инфузорий выявлены аддитивный и антагонистический типы взаимовлияния различных ксенобиотиков, выведены формулы, описывающие процесс взаимодействия смеси токсичных веществ с тест-системой при аддитивном типе взаимовлияния.

6 В результате исследования процесса комбинированного воздействия смеси токсичного вещества с органическими растворителями, а также с поверхностно-активными веществами на культуру клеток инфузорий выявлен эффект потенцирования. Показана принципиальная возможность использования органических растворителей и ПАВ в качестве функциональной нагрузки с целью управления тест-системой и процессом биотестирования в целом.

7 Сформирован комплекс мер для стандартизации процесса биотестирования и управления основными параметрами тест-систем. Он включает использование депонированных штаммов инфузорий, обладающих стабильными генетическими и физиологическими характеристиками, синхронизацию тест-систем перед применением, регулирование чувствительности тест-системы с помощью функциональных нагрузок.

9 На основе культуры инфузории Colpoda steinii П-1 создана тест-система, обладающая по сравнению с существующими важными преимуществами - высокой чувствительностью к токсичным веществам, высокой степенью синхронизированности и постоянством генетических и физиологических характеристик.

10 Для управления процессом культивирования моноксеничной культуры инфузории Colpoda steinii использована математическая модель типа "субстрат - жертва - хищник", получены значения коэффициентов этой модели.

11В результате изучения процесса хранения цист покоя Colpoda steinii в высушенном состоянии определены оптимальные условия их хранения и срок годности.

12 Разработан первый отечественный токскит на основе культуры инфузории Colpoda steinii, штамм П-1, со сроком годности более 2 лет. Препарат прошел широкие испытания и внедрен в практику работы лабораторий сельскохозяйственных предприятий России, Украины и Грузии. Метод оценки интегральной токсичности фуражного зерна и комбикормов с использованием препарата включен в Межгосударственный стандарт ГОСТ 13496.7-97, в Государственный стандарт Украины ДСТУ 3570-97 и в Национальный стандарт Российской Федерации ГОСТ Р 52337-2005 "Корма, комбикорма, комбикормовое сырье: Методы определения общей токсичности". Применение препарата в исследованиях внутренних сред организмов в промышленном птицеводстве является перспективным и может быть использовано при решении вопросов, связанных с регулированием условий содержания животных, проведением профилактических мероприятий, а также при создании различных систем прогнозирования экономических показателей сельскохозяйственных предприятий.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1 Патент РФ № 2001951 "Штамм инфузории Colpoda steinii для приготовления токсикологического диагностикума".

2 Патент РФ № 2039825" "Способ определения токсичности объектов внешней среды".

3 Патент РФ № 2002263 "Способ получения препарата для токсикологических исследований объектов внешней среды".

4 Патент РФ № 2136152 "Способ определения естественной резистентности организма птиц".

5 Временное наставление к экспресс-методу определения токсичности кормов, кормовых добавок, воды и органов павших и убитых животных с использованием культуры Colpoda steinii. Утверждено Государственным департаментом ветеринарии МСХиП РФ.

6 Настанова по застосуванню культури Colpoda steinii (колпода) cyxoi для еколого-токсиколопчних досладжень облект1в зовнппнього середови-ща тварин та птищ. Утверждена Государственным департаментом ветеринарной медицины МАП Украины.

7 Культура Colpoda steinii сухая для эколого-токсикологических исследований: Технические условия. ТУ 9388-001-885-95. Утверждены Государственным департаментом ветеринарии МСХиП РФ.

8 Культура Colpoda steinii суха для еколого-токсиколопчних дослщжень обчею1в зовшшнього середовища тварин та птицк Техшчш умови. ТУ У 46.15.243.-97. Утверждены Государственным департаментом ветеринарной медицины МСХиП Украины.

9 Межгосударственный стандарт ГОСТ 13496.7-97 "Зерно фуражное, продукты его переработки, комбикорма: Методы определения токсичности".

10 Державний стандарт Украши ДСТУ 3570-97 "Зерно фуражне, продукта його переробки, комбжорми: Методи визначення токсичноси".

11 Национальный стандарт Российской Федерации ГОСТ Р 523372005 "Корма, комбикорма, комбикормовое сырье: Методы определения общей токсичности".

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Виноходов, Дмитрий Олегович, Санкт-Петербург

1. Авторское свидетельство № 1165993. Способ определения токсичности аминокислот/Байбаков В. И., Безуглов С. Г.//Бюллетень изобретений. 1985.-№ 25. - С. 157.

2. Авторское свидетельство № 1364305. Способ диагностики токсе-мии/Нифантьев О. Е., Малигловка Ю. А., Кокова В. Е., Новохацкий С. Г.//Бюллетень изобретений. 1988. - № 1.-С. 15.

3. Авторское свидетельство № 1554849. Способ оценки качества кор-ма/Цвылев О. П., Гроздов А. О., Харенко Е. Н., Белоусов А. Н.//Бюллетень изобретений. 1990. - № 13. - С. 16.

4. Авторское свидетельство № 1597722. Способ определения токсичности водных сред/Карасев С. Г., Новосадова Т. Г., Стручкова Н. JI.//Открытия, изобретения. 1990. - № 37. - С. 122.

5. Агеев В., Долторнязов И. Определение токсичности кор-ма//Птицеводство. 1988. - № 8. - С. 41-42.

6. Айвазова JI. Е. и др. Метод биотестирования водной среды с использованием инфузорий/Айвазова JI. Е., Гроздов А. О., Соколова С. А., Новосадова Т. Г., Трофимова М. ГУ/Методы биотестирования вод. Черноголовка, 1988. - С. 37-42.

7. Александров В. Я. Методика измерения скорости движения парамеции/Зоологический журнал. 1948 - Т. 27, № 5. - С. 461-464.

8. Алексеев А. А. и др. Применение парамецийного теста для выявления токсических свойств центральной лимфы/Алексеев А. А., Недошивина Р. В., Кайфаджян М. Л., Клецкина И. 0.//Лабораторное дело. 1981. - № 9. -С. 563-565.

9. Афонькин С. Ю., Юдин А. Л. Использование микрокамер для иммунологических реакций с целью клонирования свободноживущих про-стейших//Цитология. 1985. - Т. XXVII, № 10. - С. 1207-1209.

10. Ахтамов М. А., Ахмедов А. А., Насриддинов Н. К. Количественная оценка степени токсичности сывороток при острой бактериальной дизен-терии//Лабораторное дело. 1981. - № 9. - С. 560-561.

11. Багирбекова К. X. Биологическая реакция кровяной сыворотки раковых больных на инфузории//Азербайджанский медицинский журнал. -1940.-№5-6.-С. 87-89.

12. Балаян А. Э., Стом Д. И. Метод биотестирования по обездвиживанию клеток водоросли дюналиэллы//Методы биотестирования вод. -Черноголовка, 1988. С. 21-23.

13. Баренбойм Г. М., Маленков А. Г. Биологически активные вещества: Новые принципы поиска. М.: Наука, 1986. - 364 с.

14. Баркалова Л. М. Токсичность сыворотки крови при раке и других заболеваниях как основа для дифференциальной диагностики//Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1951. - № 4. - С. 291-294.

15. Баснакьян И. А. Культивирование микроорганизмов с заданными свойствами. М.: Медицина, 1992. - 192 с.

16. Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии. Т. 2. -М.: Мир, 1989. - 590 с.

17. Беспамятнов Г. П., Кротов Ю. А. Предельно допустимые концентрации химических веществ в окружающей среде: Справочник. Л.: Химия, 1985. 528 с.

18. Богомолова Н. А. Экспериментальные исследования над сво-бодноживущими и паразитическими инфузориями: Автореф. дис. канд. биол. наук. Л., 1952. - 16 с.

19. Божков А. И. Интенсивность экспрессии генома инфузорий как функциональный тест в биотестировании//Инфузории в биотестировании: Тезисы докладов международной заочной научно-практической конференции. СПб: Архив ветеринарных наук, 1998. - С. 91-92.

20. Бойкова Э. Е. Применение простейших в токсикологических ис-следованиях//Экспериментальная водная токсикология. Рига: Зинатне. -1991. - Вып. 15. - С. 155-164.

21. Болдырева Н. М. Оценка качества природных и сточных вод по биологическим показателям//Комплексный глобальный мониторинг состояния биосферы: 3-й Международный симпозиум, Ташкент, 13-20 октября 1985: Тезисы докладов. М.: 1985. - С. 106-107.

22. Болдырева Н. М. Метод биотестирования сточных и природных вод на культуре инфузорий//Методы биотестирования вод. Черноголовка, 1988.-С. 42-43.

23. Брагинский Л. П., Щербань Э. П. Острая токсичность тяжелых металлов для водных беспозвоночных при различных температурных усло-виях//Гидробиологический журнал. 1978. - Т. 14, № 6. - С. 86-92.

24. Бурковский И. В. Экология свободноживущих инфузорий. М.: МГУ, 1984. - 208 с.

25. Быченкова В. Н. Действие высушивания и замораживания на Colpoda таи/?£ш'//Реакция клеток и их белковых компонентов на экстремальные воздействия. М.-Л.: Наука, 1966. - С. 92-100.

26. Быченкова В. Н., Лозина-Лозинский Л. К. Устойчивость инфузории Colpoda maupasi к низкому давлению, аноксии и глубокому охлаж-дению//Жизнь вне Земли и методы ее обнаружения. М.: Наука, 1970. - С. 81-97.

27. Варфоломеев С. Д., Калюжный С. В. Биотехнология: Кинетические основы микробиологических процессов. М.: Высшая школа, 1990. - 296 с.

28. Васильев И. Р., Маторин Д. Н., Венедиктов И. С. Метод биотестирования природных вод по замедлению флуоресценции микрово-дорослей//Методы биотестирования вод. Черноголовка, 1988. С. 23-26.

29. Виноходов Д. О., Виноходов В. О. Препарат токсикологической диагностики кормов//Информационный листок Ростовского ЦНТИ. 1993. -№97-93.-2 с.

30. Виноходов Д. О. Токсикологические исследования кормов с использованием инфузорий. СПб, 1995. - 80 с.

31. Виноходов Д. О., Виноходов В. О., Гинак А. И. Биотестирование как метод научного исследования//Инфузории в биотестировании: Тезисы докладов международной заочной научно-практической конференции. -СПб: Архив ветеринарных наук, 1998. С. 40-43.

32. Виноходов Д. О., Виноходов В. О., Гинак А. И. Исследование токсичности зернопродуктов: новая редакция ГОСТ//Биоиндикация-98: Материалы Международной молодежной научной школы 21-28 сентября 1998. Петрозаводск, 1998. - Т. 1. - С. 164-167.

33. Виноходов Д. О., Виноходов В. О. Colpoda steinii как тест-организм//Инфузории в биотестировании: Тезисы докладов международной заочной научно-практической конференции. СПб: Архив ветеринарных наук, 1998. - С. 85-87.

34. Виноходов Д. О., Виноходов В. О., Гинак А. И. Определение общей токсичности зернопродуктов//1-ый съезд токсикологов России 17-20 ноября 1998: Тезисы докладов. М.: 1998. - С. 271.

35. Виноходов Д. О. Математическое моделирование кинетики роста культуры инфузории Colpoda steinii в периодических условиях//Архив ветеринарных наук. 1998. - Т. 1(48). - С. 121-134.

36. Виноходов Д. О., Виноходов В. О., Гинак А. И., Земляникина Т. А. Использование инфузорий в исследованиях внутренних сред высших организмов//Архив ветеринарных наук. 1999. - Т. 1(48), ч. 3. - С. 551-577.

37. Виноходов Д. О., Гинак А. И. Исследование токсичности зерно-продуктов: новая редакция ГОСТ// Ветеринария в птицеводстве. 2002. -№1. - С. 9.

38. Виноходов Д. О., Поляков Н. JI. Биотестирование в птицеводстве и ветеринарии: Введение в биотестирование// Ветеринария в птицеводстве. -2003.-№5-6.-С. 41-46.

39. Виноходов Д. О., Поляков Н. J1. Определение микотоксинов методами биотестирования.// Ветеринария в птицеводстве. 2003. - №5-6. - С. 47-48.

40. Виноходов Д. О., Поляков Н. JI. Профилактика ассоциированных токсикозов методами биотестирования// Международный вестник ветеринарии. 2005. - №1. - С. 91-95.

41. Виноходов Д. О. Биотестирование на культурах инфузорий в диагностической профилактике пищевых отравлений животных (обзор)// Ветеринарная патология. 2006. - №1. - С. 90-96.

42. Виноходов В. О., Виноходов Д. О., Поляков Н. JI. Новый экспресс-метод определения токсичности мясопродуктов// Практик. 2006. - №2. -С. 26-31.

43. Виноходов Д. О., Пожаров А. В. Методологические особенности токсикологических тестов с инфузориями// Известия СПбГЭТУ «ЛЭТИ». Серия «Биотехнические системы в медицине и экологии». 2006. - Вып. 3. - С. 60-67.

44. Воденичаров Д. Г., Атавина Т. Г., Стом Д. И. Метод биотестирования по остановке движения зооспор хлорококковых//Методы биотестирования вод. Черноголовка, 1988. - С. 83-84.

45. Волков И. В. и др. Региональные особенности токсикорезистент-ности гидробионтов/Волков И. В., Заличева И. Н., Каймина Н. В., Ганина В. С., Мовчан Г. В.//Гидробиологический журнал. 1992. - Т. 28, № 3. - С. 69-71.

46. Волков Н. В. Определение токсичности фуражного зерна и продуктов его переработки//Ветеринария. 1991. - № 7. - С. 68.

47. Виноходов Д. О. Временное наставление к экспресс-методу определения токсичности кормов, кормовых добавок, воды и органов павших и убитых животных с использованием культуры Colpoda steiniill Ветеринарная газета. 1999 - № 2 (153). - С. 5.

48. Тапочка Л. Д. и др. Популяционные аспекты адаптации гидробион-тов к токсическим воздействиям/Тапочка Л. Д., Баттах М., Дрожжина Т.

49. С., Карауш Г. А., Шапырина О. Б., Белая Т. И.//Вестник МГУ: Серия 16. -1991. -№ 4. С. 34-41.

50. Гельцер Ю. Г. Почвенные простейшие как тест для изучения биологически активных веществ//Вестник Московского университета. 1967. -№2.-С. 31-39.

51. Гельцер Ю. Г., Гептнер В. А. Влияние пестицидов на почвенных простейших/ЯТочвенные простейшие (Протозоология, вып. 5). Л.: Наука, Лен. отд., 1980/-С. 143-153.

52. Генес В. С., Арнаутов А. К., Джафаров Г. К. Определение токсичности плазмы крови при острой лучевой болезни по парамецийной реакции/Действие ионизирующих излучений на животный организм. Киев, 1958.-С. 21.

53. Гиль Т. А., Балаян А. Э., Стом Д. И. Метод биотестирования по гашению люминесценции светящихся бактерий//Методы биотестирования вод. Черноголовка, 1988. - С. 15-17.

54. Голубкова Э. Г. Paramecium caudatum Ehrenberg, как токсический тест-объект//Гидробиологический журнал. 1978. - Т. 14, № 2. - С. 95-99.

55. Горошко О. Г. Использование инфузории Tetrahymena pyriformis в токсикологических исследованиях//Бюллетень Всесоюзного ордена Ленина НИИ экспериментальной ветеринарии им. Я. Р. Коваленко. 1987. -Вып. 61.-С. 76-78.

56. Гроздов А. О., Патин С. А., Соколова С. А. Биотестирование природных и сточных вод с помощью культуры простейших//Гидро-биологический журнал. 1981. - Т. 17, вып. 4. - С. 69-71.

57. Гроздов А. О., Соколова С. А. Исследование влияния различных факторов среды на инфузорий в токсикологических экспериментах// Биогеохимические и токсикологические исследования загрязненных водоемов.-М.: 1984.-С. 52-67.

58. Гроздов А., Цвылев О. Комбикорма: новый ГОСТ новые воз-можности/Штицеводство. - 1994. - № 2. - С. 12-14.

59. Гроздов А. Определение общей токсичности комбикормов и сырья на инфузориях//Комбикорма. 2001. - №3. - С. 39-40.

60. Гуревич Ф. А., Левинсон М. С., Комолова Г. С. Действие озвученной воды на инфузорий//Ученые записки Красноярского государственного педагогического института. 1959. - Т. 15. - С. 253-255.

61. Данильченко О. П., Тушмалова Н. А., Бресткина М. Д. Экспресс-методы оценки качества природной и сточной воды по функциональному состоянию инфузорий спиростом//Методы биотестирования качества водной среды. М., 1989. - С. 40-46.

62. Драбкин Б. С., Иоффе А. 3. Действие экстрактов из токсических перезимовавших злаков на парамеций {Paramecium caudatum)//Труды Оренбургского медицинского института. 1950. - Вып. 2. - С. 92-98.

63. Елизарова О. Н., Рязанова Р. А. Клеточные культуры как биологическая модель в токсикологических исследованиях: Научный об-зор//Серия "Гигиена". М., 1982. - 60 с.

64. Еськов А. П. и др. Экспериментальная биотехническая система для определения индекса токсичности/Еськов А. П., Гурилев О. М., Филатов А. В., Каюмов Р. И.//Медицинская техника. 1988. - № 4. - С. 49-51.

65. Ждан-Пушкина С. М., Хасанова JI. А. Некоторые аспекты роста культур микроорганизмов. Уфа, 1991. - 126 с.

66. Зализняк JI. А., Кокова В. Е. Культивирование парамеций как тест-объекта на отваре дрожжей/ЛДитология. 1992. - Т. 34, № 4. - С. 62.

67. Захаров И. С. Методологические особенности биотестирова-ния//Инфузории в биотестировании: Тезисы докладов международной заочной научно-практической конференции. СПб: Архив ветеринарных наук, 1998. - С. 37-39.

68. Зерно фуражне, продукта його переробки, комбкорми. Методи ви-значення токсичность Державний стандарт Украши: ДСТУ 3570-97 (ГОСТ 13496.7-97). Кшв: Держстандарт Украши, 1999. - 15 с.

69. Зерно фуражное, продукты его переработки, комбикорма. Методы определения токсичности: ГОСТ 13496.7-87. М.: Издательство стандартов, 1988. - 6 с.

70. Зерно фуражное, продукты его переработки, комбикорма. Методы определения токсичности: ГОСТ 13496.7-92. М.: Издательство стандартов, 1992,-9 с.

71. Зерно фуражное, продукты его переработки, комбикорма: Методы определения токсичности. Межгосударственный стандарт: ГОСТ 13496.797. Кшв: МГС по стандартизации, метрологии и сертификации, 1999. - 15 с.

72. Золотарев В. А. Перспективы использования модельных сообществ в биотестировании/УИнфузории в биотестировании: Тезисы докладов международной заочной научно-практической конференции. СПб: Архив ветеринарных наук, 1998. - С. 59-60.

73. Зубанов П. А., Виноходов Д. О., Филимон Е. В. Зависимость чувствительности Paramecium caudatum к токсичным веществам от условий обитания// IV съезд Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (17-19 октября 2006 г.), Пущино, 2006.

74. Ивакина А. В. Исследование системы контроля высокоминерализованных водных сред на основе биологических преобразователей: Дисс. канд. техн. наук. СПб, 2000. - 113 с.

75. Иванов В. Г. Как предупредить микотоксикозы/УВетеринария. -1981.-№ 1.-С. 24-28.

76. Израильский В. П., Алпатов В. В. Материалы по применению па-рамецийного способа обнаружения злокачественных новообразова-ний//Бюллетень Московского общества испытателей природы, отд. биологии. 1951. - Т. 56, № 1. - С. 49-52.

77. Изюмов Г. И. Пищеварительные процессы у Stylonychia myti-W/Зоологический журнал. 1948. - Т. 27, № 4. - С. 305-312.

78. Ирлина И. С., Меркулова Н. А. Выращивание больших масс Tetrahymena pyriformis, пригодных для биохимических исследований, и синхронизация делений инфузорий//Цитология. 1975. - Т. 17, № 10. - С. 1208-1215.

79. Ирлина И. С. Неспецифическая устойчивость тетрахимен в стационарной фазе роста культуры//Современные проблемы протозоологии:

80. Тезисы докладов и сообщений Четвертого съезда Всесоюзного общества протозоологов, Ленинград, февраль 1987 г. Л.: Наука, Лен. отд., 1987. -263 с.

81. Караваев О. Ю. Действие Т-2 токсина на куриные эмбрио-ны//Ветеринария. 1986. - № 8. - С. 72-74.

82. Карелина В. Отношение Paramecium caudatum к ядам на различных этапах ее онтогении//Доклады Академии наук СССР. 1948. - Т. 61, № 1. - С. 165-168.

83. Катульский Ю. Н. Интегральная оценка состояния организма животных в токсиколого-гигиенических экспериментах/ТГигиена и санитария. 1986. - № 9. - С. 47-49.

84. Кобатов А. И. и др. Способы повышения биологической активности дрожжей Saccharomyces cerevisiae при их сублимационном высушива-нии/Кобатов А. И., Никонов Б. А., Свентицкий Е. Н., Афанасьева О. В.//Биотехнология. 1991. - № 1. - С. 42-46.

85. Коваленок А. Чувствительность Paramecium caudatum к токсическим агентам на различных этапах ее онтогении//Доклады Академии наук СССР. 1945. - Т. 48, вып. 6. - С. 464-466.

86. Кокина И. Я. Чувствительность Paramecium caudatum к действию летальных концентраций 2,4-0-Ка//Экспериментальная водная токсикология. Рига, 1971. - Вып. 2. - С. 43-48.

87. Кокова В. Е. Непрерывное культивирование беспозвоночных. -Новосибирск: Наука, Сиб. отд., 1982. 168 с.

88. Кокова В. Е. Непрерывное культивирование простейших//Про-стейшие новые объекты биотехнологии (Протозоология, вып. 12). - Л.: Наука, Лен. отд., 1989.-С. 113-141.

89. Кокова В. Е., Любчик Я. Г., Шелемотов С. А. Методика непрерывного культивирования парамеций как тест-объекта для индикации загрязнения воды на приборе "Биотестер". Красноярск, 1991. - 20 с.

90. Кокова В. Е., Пролубников А. М. Пути стандартизации пара-мецийного теста//Цитология. 1992. - Т. 34, № 4. - С. 79.

91. Корма, комбикорма, комбикормовое сырье: Методы определения общей токсичности. Национальный стандарт Российской Федерации. ГОСТ Р 52337-2005. М.: Стандартинформ. 2005. - 16 с.

92. Конюхов А. Ф. Определение пестицидов в комбикормах//Вете-ринария. 1974. - № 6. - С. 101-102.

93. Котик А. Н., Труфанова В. А. Биоавтографический метод определения трихотеценовых микотоксинов в зерне и продуктах его пе-реработки//Гигиена и санитария. 1989. - № 9. - С. 53-54.

94. Курманов И. А., Таланов Г. А. Определение токсичности комбикормов, пораженных микроскопическими грибами/ХВетеринария. 1977. -№ 10.-С. 98-99.

95. Ладыгина В. П. Изучение взаимодействия популяций хищника и жертвы в проточных системах//Динамика малых микробных экосистем и их звеньев. Новосибирск: Наука, Сиб. отд., 1981. - С. 20-60.

96. Лакин Г. Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1990. - 352 с.

97. Лахонина Г. М., Ирлина И. С., Этлин С. Н. Особенности применения культуры инфузорий в токсикологических исследованиях/ТГигиена и санитария. 1991. - № 3. - С. 81-82.

98. Леткевич И. Ф., Плященко С. И., Бондаренко Т. В. Токсикологическая оценка материалов для полов//Ветеринария. 1991. - №1. - С. 17-20.

99. Лифшиц Р. И., Лазовская А. Я., Марков Р. М. Гемосорбция экспериментальной ожоговой токсемии//Вестник хирургии. 1983. - № 130 (6). -С. 109-113.

100. Лозина-Лозинский Л. К., Успенская 3. И. Действие ультрафиолетового излучения на почвенные инфузории//Ультрафиолетовое излучение. М.: Медицина, 1971. - Сборник 5. - С. 104-110.

101. Лозина-Лозинский Л. К., Быченкова В. Н. Реакции инфузорий Colpoda maupasi на двуокись углерода//Вопросы экологии простейших (Протозоология, вып. 3). Л.: Наука, Лен. отд., 1978. - С. 76-90.

102. Локоть Л. И. Экология ресничных простейших в озерах Центрального Забайкалья. Новосибирск: Наука, Сиб. отд., 1987. - 152 с.

103. Лукашенко Н. П., Рыбакова 3. И. Генетика инфузорий Tetrahymena и Paramecium. М.: Наука, 1986.- 167с.

104. Лунц А. М. О применении парамеций для диагностики ра-ка//Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1951. - № 6. -С. 466-471.

105. Мавлянова М. И. О некоторых особенностях дыхания у почвенных простейших/УУспехи протозоологии: Тезисы докладов и сообщений. III международный конгресс протозоологов, Ленинград, 2-10 июля 1969 г. Л.: Наука, Лен. отд., 1969. - С. 209.

106. Манаков М. Н. Перспективы прикладной биотехноло-гии//Современные достижения биотехнологии: Материалы всероссийской конференции. Ставрополь, 1996. - С. 3-5.

107. Маслов А. П. и др. Использование экспресс-теста на токсичность при очистке сточных вод производства органического синтеза/Маслов А. П., Асадуллин А. 3., Пеньковцева И. Г., Габутдинов М. С.//Химия и технология воды. 1979. - Т. 9, № 3. - С. 263-265.

108. Маслов А. П. и др. Метод биотестирования сточных вод, поступающих на биологическую очистку/Маслов А. П., Петров А. М., Гиниа-туллин И. М., Наумова Р. П.//Методы биотестирования вод. Черноголовка, 1988. - С. 97-99.

109. Межевикина Ю. В., Хазова Т. Г. Изучение сукцессии лабораторных экосистем в присутствии загрязнителей//Динамика малых микробных экосистем и их звеньев. Новосибирск: Наука, Сиб. отд., 1981. - С. 149-156.

110. Методика микробиологического определения токсичности культур грибов//Лабораторные исследования в ветеринарии: биохимические и микологические: Справочник. М.: Агропромиздат, 1991. - С. 115-116.

111. Методика определения токсичности комбикормов на куриных эмбрионах//Лабораторные исследования в ветеринарии: биохимические и микологические: Справочник. М.: Агропромиздат, 1991. - С. 112-114.

112. Методика определения токсичности кормов микробиологического синтеза//Лабораторные исследования в ветеринарии: биохимические и микологические: Справочник. М.: Агропромиздат, 1991. - С. 114-115.

113. Методика определения токсичности кормовой муки, сырья и гранулированных комбикормов с использованием инфузорий стилонихий. -М.: ВНИРО, 1989.- Юс.

114. Методика определения токсичности фуражного зерна, продуктов его переработки и комбикормов. М.: ГУВ МСХ СССР, 1982. - 5 с.

115. Методика определения токсичности шротов, жмыхов и кормовых дрожжей//Лабораторные исследования в ветеринарии: биохимические и микологические: Справочник. М.: Агропромиздат, 1991. - С. 111-112.

116. Методические рекомендации по биологической оценке продуктов животноводства и кормов с использованием тест-организма Тетрахимена пириформис. М.: Б. и., 1977. - 16 с.

117. Методические рекомендации по использованию инфузории Тетрахимена пириформис для токсико-биологической оценки сельскохозяйственных продуктов. Киев: УкрНИВИ, 1983. - 16 с.

118. Методические рекомендации по определению безвредности продуктов животноводства и кормов на культуре клеток. М.: ВАСХНИЛ, 1977.- 8 с.

119. Методические рекомендации по определению биологической ценности сельскохозяйственных продуктов. Киев: Б. и., 1981. - 88 с.

120. Методические рекомендации по определению токсичности продуктов животноводства и кормов (микробиологический экспресс-метод).// Ветеринария в птицеводстве. 2003 - №5-6. - С. 49-54.

121. Методические указания по санитарно-микологической оценке и улучшению качества кормов. М.: ГУВ МСХ СССР, 1985. - 70 с.

122. Методы общей бактериологии. М.: Мир, 1983. - Т. 1. - 536 с.

123. Можаев Е. А. и др. Гигиеническая оценка новых поверхностно активных веществ как фактора загрязнения водоемов/Можаев Е. А., Линьков Ю. В., Капырина Л. М., Моисейчева М. М.//Гигиенические аспекты охраны окружающей среды. М., 1977. - Вып. 5. - С. 77-78.

124. Моравцева В. Простейшие как тест-объекты и индикаторные организмы для оценки качества вод//Гидробиологический журнал. 1988. -Т. 24, №5.-С. 29-33.

125. Мука кормовая из рыбы, морских млекопитающих, ракообразных и беспозвоночных. Метод определения токсичности: ГОСТ 29136-91. М.: Издательство стандартов, 1992. - 9 с.

126. Настюкова О. К. Токсические факторы в сыворотке крови при экспериментальном раке//Рефераты работ учреждений отдела биологии АН СССР. -М, 1941.-С. 379.

127. Настюкова О. К. Токсическое действие сыворотки животных с злокачественными опухолями на парамеций//Зоологический журнал. -1942. Т. 21, №3.- С. 94-101.

128. Никитина J1. И. Особенности циклов индивидуального развития инфузорий рода Colpoda, выделенных из почв разных географических зон//Индивидуальное развитие и трофические связи животных. JL, 1981. -С. 78-83.

129. Никитина JI. И. Эколого-фаунистическая характеристика инфузорий рода Colpoda некоторых географических зон//ВИНИТИ, № 6663-84 Деп. 12.10.1984 г. 17 с.

130. Никитина J1. И. Морфофизиологические особенности инфузорий Colpoda cucullus, выделенных из почв разных географических зон: Авто-реф. дис. канд. биол. наук. Л., 1985. - 16 с.

131. Никитина JI. И. Инфузории (Ciliophora, Ciliata) почв Среднего Приамурья: Автореф. дис. докт. биол. наук. СПб, 1998. - 32 с.

132. Новосадова Т. Г., Стручкова Н. JI. Токсичность биоцида "Ду-бицид-14" для гидробионтов//Экспериментальная водная токсикология. -Рига: Зинатне, 1990. Вып. 15. - С. 144-154.

133. Овсянников Н. А. Специальная фотография. М.: Недра, 1966. -292 с.

134. Олексив И. Т. Мембранный потенциал инфузорий как биотест на токсичность воды//Инфузории в биотестировании: Тезисы докладов международной заочной научно-практической конференции. СПб: Архив ветеринарных наук, 1998. - С. 88-90.

135. Определитель пресноводных беспозвоночных Европейской части СССР (Планктон и бентос). Л.: Гидрометеоиздат, 1977. - 511 с.

136. Определитель Protozoa почв Европейской части СССР. Вильнюс: Минтис, 1973.- 172 с.

137. Осипов Д. В., Подлипаев С. А. Теоретические и практические аспекты изучения взаимоотношений простейших с микроорганиз-мами//Взаимоотношения простейших с вирусами (Протозоология, вып. 6). Л.: Наука, Лен. отд., 1981. - С. 5-30.

138. Осипов Д. В. Проблемы гетероморфизма ядер у одноклеточных организмов. Л.: Наука, Лен. отд., 1981. - 167 с.

139. Основные биохимические методы исследования кормов и крови животных и птиц: Оперативно-информационные материалы. Петрозаводск: Карельский филиал АН СССР, 1979. - 100 с.

140. Остроумов С. А., Самойленко Л. С. Оценка эффективности биотехнологического разрушения анионных ПАВ с помощью биотес-тов//Вестник Московского университета. Сер. 16, биология. 1990. - № 3. -С. 74-78.

141. Пастушенко Т. В. и др. К методике вероятностной оценки средне-эффективного времени гибели животных от среднесмертельной до-зы/Пастушенко Т. В., Пилипенко Ю. А., Жуков А. А., Перейма Ф. А.//Гигиена и санитария. 1983. - № 11. - С. 66-68.

142. Патент № 2001951 Российской Федерации, МКИ5 С 12 N 5/00. Штамм инфузории Colpoda steinii для приготовления токсикологического диагностикума/Виноходов Д. О., Виноходов В. О. М.: НПО "Поиск" Роспатента, 1993. - 8 с.

143. Патент № 2002263 Российской Федерации, МКИ5 G 01 N 33/18. Способ получения препарата для токсикологических исследований объектов внешней среды/ Виноходов Д. О., Виноходов В. О. М.: НПО "Поиск" Роспатента, 1993. - 10 с.

144. Патент № 2039825 Российской Федерации, МКИб С 12 О 1/02, G 01 N 33/18. Способ определения токсичности объектов внешней среды/ Виноходов Д. О., Виноходов В. О. М.: НПО "Поиск" Роспатента, 1995. - 6 с.

145. Патент № 2136152 Российской Федерации, МКИб А 01 К 67/02, А 61В 10/00, С 12 Q 1/02. Способ определения естественной резистентности организма птиц/Олемской В. В., Виноходов О. В., Виноходов Д. О. М.: ФИПС, 1999. - 6 с.

146. Пафомов Г. А., Бурдыга Ф. А., Ширинова М. Н. Экспресс-метод определения токсических свойств крови и лимфы с помощью парамеций при экзо- и эндотоксикозах//Советская медицина. 1980. - № 1. - С. 42-45.

147. Печуркин Н. С., Терсков И. А. Анализ кинетики роста и эволюции микробных популяций (в управляемых условиях). Новосибирск: Наука, Сиб. отд., 1975.-216 с.

148. Печуркин Н. С., Брильков А. В., Марченкова Т. В. Популяцион-ные аспекты биотехнологии. Новосибирск: Наука, Сиб. отд., 1990. - 173 с.

149. Пинигин М. А., Щербаков Б. Д., Тепикина JL А. О математической оценке зависимости "концентрация время"//Методические итеоретические вопросы гигиены атмосферного воздуха. М., 1976. - С. 6370.

150. Пинигин М. А. Зависимость "концентрация время" как теоретическая основа токсикометрии химических соединений//Гигиенические аспекты охраны окружающей среды. - М., 1977. - Вып. 5. - С. 8-11.

151. Пинигин М. А. О понятии "характер комбинированного действия" как основе гигиенической оценки//Гигиена и санитария. 1986. - № 1.-С. 45-48.

152. Писарева Т. А. Влияние крови раковых больных на Paramaecium сш^я?гш//Експериментальна медицина. 1936. - № 12. - С. 66-67.

153. Пожаров А. В. и др. Метод биотестирования по хемотаксической реакции парамеций/Пожаров А. В., Папутская Н. И., Титаренко Ю. Н., Лебедев В. Ф., Захаров И. С.//Методы биотестирования вод. Черноголовка, 1988.-С. 99-103.

154. Поляков Н. Л., Виноходов Д. О., Виноходов В. О. Новый экспресс-метод определения токсичности мясопродуктов// Ученые записки Казанской академии ветеринарной медицины. 2006. - т. 180. - С. 210-219.

155. Полянский Ю. И. Формы фенотипической изменчивости простейших, их адаптивное значение и биологические механизмы//Вопросыэкологии простейших (Протозоология, вып. 3). JL: Наука, Лен. отд., 1978. - С. 5-25.

156. Раилкин А. И. Выбор пищи у инфузорий-седиментаторов// Движение и поведение одноклеточных животных (Протозоология, вып. 2). -Л.: Наука, Лен. отд., 1978. С. 101-116.

157. Раилкин А. И. Сообщества микрообрастания в оценивании токсичности воды//Инфузории в биотестировании: Тезисы докладов международной заочной научно-практической конференции. СПб: Архив ветеринарных наук, 1998. - С. 61-62.

158. Райков И. Б. Ядро простейших: Морфология и эволюция. Л.: Наука, Лен. отд., 1978. - 327 с.

159. Рокицкий П. Ф. Биологическая статистика. Минск: Вышейшая школа, 1973. - 320 с.

160. Ромейс Б. Микроскопическая техника. М.: Издательство иностранной литературы, 1954. - 718 с.

161. Роскин Г. И., Настюкова О. К. Токсичность сыворотки при злокачественных опухолях и определение ее у раковых больных как диагностический метод//Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -1943.-Т. 16, №6.-С. 5-8.

162. Роскин Г. И. Парамецийная реакция и ее теоретическое и диагностическое значение в онкологии//Вестник Московского универститета. -1954, №8.-С. 19-29.

163. Роскин Г. И., Левинсон Л. Б. Микроскопическая техника. М.: Советская наука, 1957. - 486 с.

164. Руднева И. И. Артемия: Перспективы использования в народном хозяйстве. Киев: Наукова думка, 1991. - 144 с.

165. Самойлова К. А. Изменение чувствительности инфузорий Paramecium caudatum к ингибиторам дыхания и гликолиза в связи с возрастом культуры//Доклады Академии наук СССР. 1964. - Т. 155, № 3. - С. 670-672.

166. Саутин С. Н., Пунин А. Е. Методы интегрирования жестких систем дифференциальных уравнений. Л., 1987. - 77 с.

167. Сахновская Г. К. Изменения токсиченских для парамеций свойств сыворотки крови при экспериментальной ожоговой болез-ни//Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 1965. - Т. 9, № 1.-С. 56-59.

168. Серавин Л. Н. Влияние химических агентов на подвижность Paramecium caudatum//Зоопот^ческтш журнал. 1959. - Т. 38, № 4. - С. 626630.

169. Серавин Л. Н. Двигательные системы простейших. Л.: Наука, Лен. отд., 1967. - 332 с.

170. Серавин Л. Н. Простейшие. что это такое? Л.: Наука, 1984. -174 с.

171. Сетко Н. П. Защитный эффект антиоксидантов при экспериментальной интоксикации организма//Гигиена и санитария. 1986. - № 2. -С. 16-18.

172. Симонян К. С., Гутионова К. П., Пуринова Е. Г. Посмертная кровь в аспекте трансфузиологии. М.: Медицина, 1975. - 272 с.

173. Скибенко В. В. Методы и устройства для определения подвижности микрообъектов при оценке активности химических соединений. М., 1982. - 44 с.

174. Соснин Н. О. Апробация приборных экспресс-методов оценки качества воды//Гигиена, ветсанитария и экология животноводства: Материалы Всероссийской научно-производственной конференции (22-24 сентября 1994 г., Чебоксары). Чебоксары, 1994. - С. 403-404.

175. Спесивцева Н. А. Микозы и микотоксикозы животных. М.: Сельхозгиз, 1960. - 456 с.

176. Спесивцева Н. А. Лабораторная диагностика микотоксикозов сельскохозяйственных животных: Методическое руководство по микологическим исследованиям кормов в ветеринарных лабораториях. М.: Сельхозиздат, 1961. - 49 с.

177. Спесивцева Н. А. Микозы и микотоксикозы. М.: Колос, 1964. -520 с.

178. Спесивцева Н. А., Хмелевский Б. Н. Санитария кормов. М.: Колос, 1975. - 335 с.

179. Справочник ветеринарного врача птицеводческого предприятия. -СПб: ВНИВИП, 1995. Т. 1. - 160 с.

180. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. М.: Медицина, 1973. - 456 с.

181. Старосельский Д. В. и др. Методика определения суммарной токсичности сыворотки крови у больных вирусным гепатитом/Старосельский Д. В., Гранитов В. М., Бобровский Е. А., Гуляева Н. С.//Лабораторное дело. 1982.-№7.-С. 46-49.

182. Суханова К. М. Температурные адаптации у простейших. Л.: Наука, Лен. отд., 1968. - 276 с.

183. Таланов Г. А., Хмелевский Б. Н. Санитария кормов: Справочник. -М.: Агропромиздат, 1991. 303 с.

184. Ткачук С. М. и др. Оценка токсичности поллюантов водной среды с помощью тест-организма Tetrahymena ругiformw/Ткачук С. М., Ирлина И. С., Куценко С. А., Терентьев Л. П.//Цитология. 1992. - Т. 34, № 4. - С. 153.

185. Тотвен-Новаковская И. Регенерация двойников Stylonychia mytilus//Успехи протозоологии: Тезисы докладов и сообщений, представленные III международному конгрессу протозоологов, Ленинград, 2-10 июля 1969 г. Л.: Наука, Лен. отд., 1969. - С. 105.

186. Туманов А. А. и др. Метод ускоренного определения фосфорор-ганических пестицидов в воде/Туманов А. А., Постнов И. Е., Осипова Н. И., Зимин А. Б., Филимонова И. А.//Методы биотестирования вод. Черноголовка, 1988.-С. 106-111.

187. Тушмалова Н. А., Данильченко О. П., Бресткина М. Д. Метод биотестирования природных и сточных вод по уровню двигательной активности инфузории спиростомы//Методы биотестирования вод. Черноголовка, 1988.-С. 44-46.

188. Успенская 3. И. Действие коротковолновой УФ радиации на цисты покоя инфузории Colpoda maupasi при низких температу-рах//Цитология. 1971. - Т. 13, № 12. - С. 1506-1513.

189. Феоктистов В. М., Морозов А. К., Заличева И. Н. Влияние гу-миновых веществ на токсичность меди и цинка для Daphnia magna!'/Биологические науки. 1991. - № 10. - С. 130-135.

190. Филенко О. Ф. Задачи и приемы биотестирования токсичности водной среды//Методы биотестирования качества водной среды. М., 1989.-С. 3-9.

191. Филенко О. Ф. Область применения методов биотестирова-ния//Методы биотестирования качества водной среды. М., 1989. - С. 119122.

192. Флеров Б. А. Эколого-физиологические аспекты токсикологии пресноводных животных. Л.: Наука, 1989. - 141 с.

193. Фокин С. И. Морфология и жизнеспособность клеток амикро-нуклеусных клонов инфузории Paramecium caudatum!/Цитология. 1983. -Т. 25, №7.-С. 811-817.

194. Френкель М. А. Исследование ядер при палинтомическом делении у инфузорий семейства Colpodidae (Holotricha): Автореф. дис. канд. биол. наук. Л., 1973. - 24 с.

195. Френкель М. А., Кудрявцев Б. Н., Кудрявцева М. В. Содержание ДНК в макро- и микронуклеусах Colpoda steinii до и после деления в цистах размножения/Щитология. 1973. - Т. XV, № 3. - С. 353-357.

196. Френкель М. А. Деление макронуклеуса и регуляция уровня ДНК в нем у инфузорий семейства Colpodidae!!Современные проблемы протозоологии: Материалы к третьему съезду Всесоюзного общества протозоо-логов. Вильнюс, 1982. - 499 с.

197. Френкель М. А. Тонкое строение цист покоя инфузории Colpoda steinii!/Цртопотил. 1987. - Т. 29, № 2. - С. 131-136.

198. Хареньо М. А., Алонсо П., Перес-Сильва X. Аутогамия у Sty-lonychial/Успехи протозоологии. Д., 1969. - с. 43.

199. Хаусман К. Протозоология. М.: Мир, 1988. - 336 с.

200. Хлебович Т. В. Значение инфузорий в оценке степени загрязнения вод//Методы биологического анализа пресных вод. JL, 1976. - С. 59-68.

201. Хмельницкий Г. А., Локтионов В. Н., Полоз Д. Д. Ветеринарная токсикология. М.: Агропромиздат, 1987. - 319 с.

202. Хоружая Т. А. Методы оценки экологической опасности. М.: "Экспертное бюро-М", 1998. - 224 с.

203. Чорик Ф. П. Свободноживущие инфузории водоемов Молдавии. -Кишинев, 1968.-251 с.

204. Чорик Ф. П. Место инфузорий в сапробной системе водных орга-низмов//Охрана рыбных запасов и увеличение продуктивности водоемовюжной зоны СССР: Материалы межвузовского совещания, Кишинев, октябрь 1969 г. Кишинев, 1970. - С. 217-219.

205. Чорик Ф. П., Викол М. М. Использование полунепрерывного метода для культивирования инфузорий/ТБиологические основы культивирования водных организмов. Кишинев, 1983. - С. 35-44.

206. Штрапов А. А. Эндогенная интоксикация и методы сорбционной детоксикации при разлитом перитоните: Автореф. дисс. канд. мед. наук. -Л.: 1986.-21 с.

207. Штрапов А. А., Ханевич М. Д., Ирлина И. С. Использование инфузорий Tetrahymena pyriformis для определения уровня токсемии у больных//Лабораторное дело. 1990. - № 8. - С. 72-74.

208. Яковлев А. С. Почвообитающие простейшие как индикатор состояния почвенного раствора//Цитология. 1992. - Т. 34, № 4. - С. 170.

209. Al-Rasheid Khaled A. S., Sleigh М. A. The effects of heavy metals on the feeding rate of Euplotes mutabilis (Tuffrau, 1960)//European journal of protistology. 1994. - V. 30, № 3. - P. 270-279.

210. Ammermann D. Cell development and differentation in the Ciliate Stylonychia mytilus//QqW cycle in development and differentiation. -Cambridge, 1973. P. 51-60.

211. Bergquist L., Bovee E. C. Cadmium: Quantitative methodology and study of its effect upon the locomotor rate of Tetrahymena pyriformis//Acta protozoologica. 1976. - V. 15, № 4. - P. 471-484.

212. Bijl J., Dive D., Van Peteghem C. Comparison of some bioassay methods for mycotoxin studies//Environmental pollution (Series A). 1981. - № 26. - P. 173-182.

213. Bodine J. H. Excystation of Colpoda cucullus/ZThe journal of experimental zoology. 1923. - V. 37, № 1. - P. 115-125.

214. Bovee E. С., O'Brien Т. L. Some effects of selenium, vanadium and zirconium on the swimming rate of Tetrahymena pyriformis: a bioassay study//University of Kansas scientific bulletin. 1982. - V. 52, № 4. - P. 39-44.

215. Brown M. G. The blocking of excystment reactions of Colpoda duodenaria by absence of oxygen//The biological bulletin. 1939. - V. 77. - P. 382-390.

216. Burbanck W. D., Spoon D. M. The use of sessile ciliates collected in plastic Petri dishes for rapid assessment of water pollution//The journal of protozoology. 1967. - V. 14, № 4. - P. 739-744.

217. Burt R. L. Narcosis and cell division in Colpoda steinii!/The biological bulletin. 1945. - № 88. - P. 12-29.

218. Butzel H. M., Jr., Brown L. H., Martin W. В., Jr. Effects of detergents upon electromigration of Paramecium aMre/z'a//Physiological zoology. 1960. -V. 33, № l.-P. 39-41.

219. Cairns J. J. The myth of the most sensitive species/ZBioscience. 1986. -V. 36, № 10.-P. 670-672.

220. Committee on cultures, Society of protozoologists: A catalogue of free-living and parasitic Protozoa//The journal of protozoology. 1958. - V. 5, № l.-P. 1-38.

221. Corliss J. O. An illustrated key to the higer groups of the Ciliated Protozoa with definition of terms//The journal of protozoology. 1959. - V. 6, №3.-P. 265-281.

222. Corliss J. O. The comparative systematics of species comprising the Hymenostome Ciliate genus Tetrahymena//The journal of protozoology. 1970. - V. 17, №2. - P. 198-209.

223. Dive D., Moreau S., Cacan M. Use of a Ciliate Protozoan for fungal toxins studies//Bulletin of environmental contamination & toxicology. 1978. -P. 490-495.

224. Dryl S. Photographic registration of movement of Protozoa//Bulletin de L'Academie Polonaise des sciences, CI. II, Serie des sciences biologiques. -1958. V. 6, № 10. - P. 429-430.

225. Dryl S. The velocity of forward movement of Paramecium caudatum in relation to pH of medium//Bulletin de L'Academie Polonaise des sciences, CI. II, Serie des sciences biologiques. 1961. - V. 9, № 2. - P. 71-74.

226. Dryl S., Mehr K. Cytopathological effects of detergents on Paramecium caudatum/'/Transaction of the American microscopical society. -1976. V. 95, № 4. - P. 545-553.

227. Dryl S., Mehr K. Physiological and toxic effects of detergents on Paramecium caudatum//Acta protozoologica. 1976. - V. 15, № 4. - P. 501514.

228. Elliott A. M. Biology of Tetrahymena. Stroudsburg, 1973. - 508 p.

229. Epstein S. S., Saporoschets I. В., Hunter S. H. Toxicity of antioxidants to Tetrahymena pyriformis//The journal of protozoology. 1967. - V. 14, № 2. -P. 238-244.

230. Fiedler G. Exakta macro- und micro-fotografle. Halle, 1956. - 181 p.

231. Foissner W. Klassification und phylogenie der Colpodida {Protozoa, Ciliophora)//Arhiv fur protistenkunde. 1985. - V. 129, h. 1-4. - P. 239-290.

232. Frenkel M. A. Fine structure of the macronucleus of the active and encysted (dividing) forms of ciliate Colpoda steinii//Protistologica. 1980. - V. XVI, fasc. 2. - P. 339-351.

233. Giese С. A., Alden R. H. Cannabalism and giant formation in Stylonychia!/Journal of experimental zoology. 1938. - V. 78. - P. 117-138.

234. Grebecki A., Kuznicki L. The influence of external pH on the toxicity of inorganic ions for Paramecium caudatum!7'Acta protozoologica. 1963. - V.1,f. 18.-P. 157-164.

235. Groliere C. A., Sefrioui S., Dupy-Blanc J. Bioconversion of thiram (TMTD) by Tetrahymena pyriformis!!Archiv fur protistenkunde. 1992. - V. 141, № 1-2. - P. 135-140.

236. Hayes A., Wallace. Effect of the mycotoxin, penicillic acid, on TetrahymenapyriformisHToxlcon. 1977. - V. 15, № 6. - P. 497-504.

237. Hill D. L. The biochemistry and physiology of Tetrahymena. -London, 1972.-230 p.

238. Jant T. L., Jahn F. F. How to know the protozoa. Dubuque/Iowa, Brown, 1979.-234 p.

239. Kaul N., Sapra G. R. Feeding behaviour and digestion pattern in Stylonychia mytilus Ehrenberg//Archiv fur protistenkunde. 1983. - V. 127, №2. P. 167-180.

240. Kimball K. D., Levin S. A. Limitations of laboratory bioassays: the need for ecosystem-level testing//Bioscience. 1985. - V. 35. - P. 165-171.

241. Komala Z. The effect of some pesticides on Paramecium aurelia!/Folia biologica. 1975. - V. 23, № 3. - P. 231-243.

242. Lanno R. P., Hickie В. E., Dixon D. G. Feeding and nutritional considerations in aquatic toxicology//Hydrobiologia. 1989. - № 188-189. - P. 525-531.

243. Larsen J. The influence of growth phase and culture conditions of Tetrahymena on effects of cadmium//Toxicology. 1989. - V. 58. - P. 211-223.

244. Lynn D. H. Comparative ultrastructure and systematics of the Colpodida: Structural conservatism hypothesis and a description of Colpoda steinii Maupas//The journal of protozoology. 1976. - V. 23, № 2. - P. 302-314.

245. Lynn D. H., Malkolm J. R. A multivariate study of morphometric variation in species of the ciliate genus Colpoda (Ciliophora: Colpodiday/Can&dian journal of zoology. 1983. - V. 61, № 2. - P. 307-316.

246. Maguire В., Jr. Temperature toleration of Colpoda cucullusllPhysiological zoology. 1960. - V. 33, № 1. - P. 29-38.

247. Marquardt W. C., Wang G.-T., Fennel D. I. Preservation of Colpoda steinii and Vahlkampfia sp. from an ice tunnel in Greenland//Transactions of the American microscopical society. 1966. - V. 85, № 1. - P. 152-156.

248. Nilsson J. R. Tetrahymena in cytotoxicology: with special reference to effects of heavy metals and selected drugs//European journal of protistology. -1989.-V. 25, № 1. P. 2-25.

249. Pauli W., Berger S. Sensory mechanisms of a ciliated protozoan as a tool in pollution monitoring/1st Eur. Congr. Protozool., Reading, Apr. 5Й2-10Й2, 1992//European journal of protistology. 1992. - V. 28, № 3. - P. 352-353.

250. Persoone G. Cyst-based toxicity tests VI: Toxkits and fluotox tests as cost-effective tools for routine toxicity screening//Biologische testverfahren. -Stuttgart: Gustav-Fisher Verlag, 1992. P. 563-55.

251. Piccini E., Albergoni V. Effects of heavy metals on Protozoa/1st Eur. Congr. Protozool., Reading, Apr. 5ЙИ0Й1, 1992//European journal of protistology. 1992. - V. 28, № 3. - P. 353.

252. Prater A. N., Haagen-Smit A. J. The excystment of protozoa: Isolation of crystalline excystment factors for Colpoda duodenaria//The journal of cellular and comparative physiology. 1940. - V. 15. - P. 95-101.

253. Proper G., Garver J. C. Mass culture of the Protozoa Colpoda stezmzV/Biotechnology and bioengineering. 1966. - V. VIII. - P. 287-296.

254. Rajini P. S., Krishnakumari M. K., Majumder S. K. Cytotoxicity of certain organic solvents and organophosphorus insecticides to the ciliated protozoan Paramecium caudatum//Wiioiobios. 1989. - V. 59. - P. 157-163.

255. Rebandel H., Dryl S. Dependence of toxic effects of detergents in Paramecium caudatum on ionic composition of external medium//Acta protozoologica. 1980. - V. 19, № 3. - P. 261-268.

256. Russel W. M. S., Birch R. L. The principles of humane experimental technique. London, Methuen, 1959.

257. Ruthmann A., Kuck A. Formation of the cyst wall of the ciliate Colpoda steinii//The journal of protozoology. 1985. - V. 32, № 4. - P. 677682.

258. Smith H. G. The temperature relations and bi-polar biogeography of the ciliate genus Colpoda/fBritish antarctic survey bulletin. 1973. - № 37. - P. 7-13.

259. Stout J. D. Environmental factors affecting the live history of three soil species of Colpoda (Ciliata)//Transaction Royal society of New Zealand. -1955.-V. 82, p. 5. P. 1165-1188.

260. Strickland A. G. R., Haagen-Smit A. J. Chemical substances inducing excystment of the resting cysts of Colpoda duodenarial/Journal of cellular and comparative physiology. 1947. - V. 30, № 3. - P. 381-390.

261. Strickland A. G. R., Haagen-Smit A. J. The excystment of Colpoda duodenarial/Science. 1948. - V. 107, febr. 20. - P. 204-205.

262. Szeto C., Nyberg D. The effect of temperature on copper tolerance of Paramecium//Bulletin of environmental contamination and toxicology. 1979. -№21.-P. 131-135.

263. Taylor С. V., Strickland A. G. R. Factor influencing the formation of resting cysts//Physiological zoology. 1939. - V. 12, № 3. - P. 219-231.

264. Tibbs J. Fine structure of Colpoda steinii during encystment and excystment//The journal of protozoology. 1968. - V. 15, № 4. - P. 725-732.

265. Tibbs J., Marshall B. J. Cyst wall protein synthesis and some enzyme changes on starvation and encystment in Colpoda steinii//The journal of protozoology. 1970. - V. 17, № 1. - P. 125-128.

266. Totwen-Nowakovska I. Doublets in a clone of Stylonychia mytilus (O.F.M.)//Acta protozoologica. 1964. - V. 2. - P. 137-146.

267. Van Houten J. Two mechanisms of chemotaxis in Paramecium//Journal of comparative physiology. 1978. - V. A127, № 2. - P. 167-174.

268. Vinochodov D., Vinochodov V. Preparation for toxicological estimation of poultry fodder//International conference "Biotechnology St.Petersburg'94". St.Petersburg, Russia, September 21-23, 1994: Program and abstracts. SPb, 1994. - P. 97-98.

269. Walker G. K., Maugel Т. K., Goode D. Some ultrastructural observations on encystment in Stylonychia mytilus (Ciliophora: Hypo-?nc/z/<ia)//Transactions of the American microscopical society. 1975. - V. 94, № 1.-P. 147-154.

270. Wichterman R. The biology of Paramecium. N.Y., 1953. - 527 p.

271. Wiseman M. O. et al. Toxicity of aflatoxin Bj to penaeid shrimp/Wiseman M. O., Price R. L., Lightner D. V., Williams R. R.//Applied and environmental microbiology. 1982. - V. 44, № 6. - P. 1479-1481.

272. Zou S. F., Ng S. F. Anomalous cases of conjugation and spontaneous autogamy in Stylonychia mytilus: a note on the asexuality of early conjugants//The journal of protozoology. 1991. - V. 38., № 3. - P. 201-210.

Информация о работе

Виноходов, Дмитрий Олегович
доктора биологических наук
Санкт-Петербург, 2007
ВАК 03.00.23

Диссертация

Научные основы биотестирования с использованием инфузорий - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы