Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Мутагенез у самок Drosophila melanogaster, содержащих делецию MS2-10

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Мутагенез у самок Drosophila melanogaster, содержащих делецию MS2-10"

••••• * Л !

, I ,! 0.1

На правах рукописи УДК 575.116.12:595.773.4

АРТЕМОВ А ЕЛЕНА ВИКТОРОВНА

МУТАГЕНЕЗ У САМОК 1Уго5орЫ1а те1апо§аИег, СОДЕРЖАЩИХ ДЕЛЕЦИЮ М82-10 Генетика - 03.00.15

Автореф ер ат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 1997

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО РАН,

г. Новосибирск

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Чадов Б.Ф.

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

доктор биологических наук, Васильева Л.А.

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

кандидат биологических наук, Шарахов И.В. Томский государственный университет, г. Томск

Ведущее учреждение: Московский государственный

университет, г. Москва

Защита диссертации состоится _ /У 1997 г.

на ^/-/У- заседании диссертационного сбвета по защите

диссе^ащй на соискание ученой степени доктора наук

(Д - 002.11.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН,

в конференц-зале Института по адресу:

630090, г. Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН

Автореферат разослан_//

Ученый секретарь

диссертационного совета, г4—

доктор биологических наук г АД. Груздев

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Конечному этапу мутагенеза изменению первичной последовательности ДНК - предшествует длинная цепь событий, связанная с образованием повреждения и его репарацией (Дубинин, 1978). Мутацию следует рассматривать "как биологический процесс, который является неотъемлемой частью живой клетки с ее ферментами, мембранами, ростом и метаболизмом" (Ауэрбах, 1978). Поэтому мутагенез оказывается зависимым от структурно-функционального состояния хромосомного аппарата на момент повреждающего действия мутагенного фактора. Для точковых, а в особенности для структурных мутаций приобретают значение стадия клеточного цикла, упаковка хромосомного материала, расположение хромосом относительно друг друга и в пространстве клетки (Монахова, 1990). Особенности организации ядра у про- и эукариот обуславливают специфику мутагенеза в этих группах организмов и делают актуальным ее исследование. Несмотря на теоретическое осознание важности физиологического состояния клетки и хромосомного аппарата для мутагенеза, по этим вопросам немного экспериментальных данных. Поэтому углубленное исследование отдельных примеров влияния на мутагенез физиологических параметров является актуальным.

В процессе исследования у дрозофилы делеций околоцентромерного гетерохроматина на их способность нарушать сегрегацию хромосом в мейозе было обнаружено мутагенное действие делеции М82-10. Помимо влияния на нерасхождение, делеция М82-10 вызывала мутационные события, которые можно было расценивать как следствие разрывов хромосомы 2 в области околоцентромерного гетерохроматина. В данной работе подробно исследован мутагенный эффект делеции М82-10. Обнаруженный в работе материнский характер эффекта, т.е. высокая частота аномального потомства у дочерей М82-10 самок, но не самцов, столкнуло работу с явлением гибридного дисгенеза. Невозможность объяснить наблюдаемые явления характерным проявлением гибридного дисгенеза связало исследование с совершенно иным пластом проблем - с интерфазной организацией ядра, ее функциональным значением. Немногочисленность данных о мутационных последствиях изменений в пространственной организации хромосом придает интерес и актуальность рассмотрению описываемого мутагеннного эффекта делеции М82-10 в свете нарушения пространственной структуры интерфазного ядра.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы являлось изучение у ОгоБорЬПа те1аш^а81ег мутагенного эффекта МБ2-10 -делеции околоцентромерного гетерохроматина правого плеча аутосомы 2. Были поставлены следующие первоочередные задачи:

1. Определить частоту нерасхождения, потери аутосом 2 и частоту образования плечевых компаундов аутосомы 2 у самок, гетерозиготных по делеции М82-10.

2. Определить частоту образования акроцентрических фрагментов аутосомы 2 у самок, гетерозиготных по делеции М82-10.

3. Выяснить зависимость мутагенного эффекта хромосомы, содержащей делецию М82-10, от оппозитной ей хромосомы.

4. Исследовать распространение мутагенного эффекта М82-10 на другие хромосомы. Для этого определить частоту нерасхождения, потери аутосом 3 и частоту образования плечевых компаундов аутосомы 3 у гетерозиготных по М82-10 самок, а также частоту нерасхождения и потери у них Х-хромосом.

Задачи обусловленные полученными результатами:

5. Определить частоту нерасхождения, потери аутосом 2 и частоту образования компаундов аутосомы 2 в системе Р-М гибридного дисгенеза.

6. Проверить у гетерозиготных по М82-10 самок наличие других свойств, характерных для гибридного дисгенеза:

а) образование доминантных леталей;

б) стерильность гетерозиготных по М82-10 самок и самцов;

в) ОО-стерильность;

г) образование хромосомных перестроек.

Научная новизна. В настоящей работе обнаружен и описан мутагенный эффект у самок 1>гозорЫ1а те1апо§а&ег, содержащих хромосому с делецней околоцентромерного гетерохроматина М82-10. Было показано, что три составляющие эффекта - высокая частота потери аутосом, образования аутосомных компаундов и образования акроцентрических фрагментов - являются следствием разрывов в околоцентромерной области.

Предложена гипотеза, объясняющая мутагенный эффект хромосомы М82-10 с точки зрения пространственной организации ядра.

Для выявления хромосомных перестроек разработан

принципиально новый метод, основанный на нерасхождении хромосом.

Практическая ценность. Результаты имеют значение для определения роли пространственной организации ядра в генетических процессах.

Апробация результатов. Материалы диссертации бьши представлены на Ш Всесоюзной конференции по генетике и цитологии мейоза, на отчетных сессиях ИЦиГ.

Работа была поддержана программой "Приоритетные направления генетики".

Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов, изложение собственных экспериментальных данных, обсуждение результатов исследования. Работа изложена на 136 страницах, включает 14 таблиц и 22 рисунка. Обзор литературы состоит из двух частей. В нем представлены данные о явлении гибридного дисгенеза и о пространственной организации интерфазного ядра.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проводили на линиях Drosophila melanogaster. Исследовали самок, содержащих протяженную делецию околоцентромерного гетерохроматина правого плеча MS2-10. Для анализа использовали ряд линий из коллекции лаборатории деления клетки ИЦиГ СО РАН. Для исследоваия системы гибридного дисгенеза использовали линию я2, любезно предоставленную Герасимовой.Т.И. (ИОГЕН, Москва).

Определение частоты нерасхождения, потери аутосом 2 и образования плечевых компаундов аутосомы 2. Исследуемых самок скрещивали с самцами C(2L)RM4, Ъ; C(2R)RM4, рх, содержащими компаунды аутосом второй пары. Компаунды аутосом представляют собой хромосомы, состоящие из генетически идентичных плеч, соединенных в области центромеры. В мейозе таких самцов компаунды распределяются к полюсам случайно, образуя с равной вероятностью 4 типа спермиев: 1) C(2L)+C(2R) с диплоидным набором аутосом 2; 2) О2, не содержащие аутосом 2; 3) C(2L), имеющие "левый" компаунд; 4) C(2R), имеющие "правый" компаунд (Holm et al., 1967; McClosky, 1968). Все 4 типа спермиев являются анеуплоидными по аутосомам второй пары. Спермин О2 и C(2L)+C(2R) (иначе 2-2) являются комплементарными соответственно яйцеклеткам 2-2 (дипло-2) и О2 (нулло-2), образующимся при нерасхождении аутосом второй пары у самок. Потомок с материнскими аутосомами второй пары имеет фенотип Ь+ рх+, а с отцовскими компаундами - фенотип b рх. Спермии C(2L) комплементируют яйцеклетки с вновь возникшим компаундом C(2R), а спермии C(2R) - яйцеклетки с компаундом C(2L). Фенотип потомства в первом случае Ь, а во втором - рх. В скрещивании с

компаундными самцами все потомство состоит только из особей, возникших из анеуплоидных яйцеклеток. Основная масса зигот не сбалансирована по аутосомам второй пары и дает доминантные летали. Для определения частоты разных типов яйцеклеток часть взятых в опыт самок скрещивали с нормальными самцами. По количеству потомства, полученного на одну самку в скрещивании с самцами дикого типа, и числу самок, взятых в скрещивание с компаундными самцами, вычисляли количество "мнимого" потомства, которое могло бы возникнуть в скрещивании с компаундными самцами, если бы эуплоидные по аутосомам второй пары яйца не погибали. Скрещивания самок - сестер с самцами обеих линий ставили одновремнно и в одинаковых условиях. При подсчете частоты количество ооцитов учетверяли, так как у самцов, содержащих компаунды аутосом, при образовании 4 типов спермиев вероятность образования каждого комплементарного сочетания яйцеклетка - спермин равна 1/4.

Определение частоты нерасхождения, потери аутосом 3 и образования плечевых компаундов аутосомы 3 проводили аналогично, скрещивая исследуемых самок с самцами С(ЗЬ)РЗ, п; С(2К), е, содержащими компауцды аутосом третьей пары. Опыт также сопровождали определением "мнимого" потомства.

Определение частоты нерасхождения и потери Х-хромосом проводили, скрещивая исследуемых самок с самцами Ваг. Частоты дипло-Х и нулло-Х ооцитов определяли как отношение количества исключительного потомства ко всему потомству. Количество исключительного потомства при подсчете удваивали, т.к. вероятность появления жизнеспособной зиготы из дипло-Х и нулло-Х яиц - 1/2.

Определение частоты образования акроцентрических фрагментов хромосомы 2. Исследуемых самок скрещивали с самцами Р(2Ь), рг; 0(211), сп и с самцами С(2Ь), Ь; Р(21*), сп с яр. Самцы первого генотипа дают спермин двух типов: "левый акроцентрик + правый компаунд" и "левый акроцентрик". Они могут комплементировать ооциты с вновь образованным акроцентриком Р(2Ь) и ооциты, содержащие метацентрическую хромосому и акроцентрический фрагмент Р(2Я). Самцы генотипа С(2Ь), Ъ; Р(2И.), сп с ер дают спермин "правый акроцентрик + левый компаунд" и "правый акроцентрик". Они подходят для комплементации ооцитов с вновь образованным правым акроцентриком Р(2Я) и ооцитов, содержащих метацентрическую хромосому и акроцентрический фрагмент Р(2Ь). Опыт сопровождали определением "мнимого" потомства.

Выделение хромосомных мутаций в левом плече аутосомы 2 с помощью теста на нерасхождение. Метод, основан на свойстве

большинства хромосомных мутаций нарушать конъюгацию гомологов. Тестируемых самок скрещивали с самцами, содержащими акроцентрические аутосомы Р(2Ь) и Р(2Я). В комбинации метацентрика с акроцентриками (МАК-2) центромерный район аутосомы находится в тройной дозе, что приводит к нерасхождению того или другого акроцентрика с метацентриком (Рис.1).

1. Получение МАК-2 самок

(самка МАК-2)

2. Индивидуальное скрещивание МАК-2 самок с тестерными самцами

Ф

(жизнеспособные

-оо -'о- зиготы)

3. Отбор культур с большим количеством потомства

Рис. 1. Выделение хромосомных перестроек в левом плече аутосомы 2. Исследуемых особей скрещивают с линией, содержащей мстацентрик 2 и два акроцентрика. Отбирают самок, содержащих метацентршс и два акроцентрика (МАК-2 самок). Для обнаружения перестроек в левом плече метацентрика самок индивидуально скрещивают с самцами С(2Ь); Р(2Я). Потомство в скрещивании будет состоять только из особей, образовавшихся из яйцеклеток 2/Г(7Ь) и Р(2Я) (нерасхождение 2 - Р(2Ц). Из множества поставленных пробирок отбирают те, в которых численность потомства намного выше, чем в среднем по выборке. Отобранные культуры анализируют цитологически. Жирной линией обозначены хромосомы тестерного самца.

Если метацентрик структурно нормален, то анеуплоидные яйцеклетки 2Щ2Ь) и Р(2Я) составляют не более 15% всех яйцеклеток. В скрещивании МАК-2 самок с самцами С(2Ь); Р(2И)/Р(2Я) можно оценить частоту нерасхождения метацентрика 2 с акроцентриком Р(2Ь) по количеству появившегося потомства. Наличие хромосомной мутации в левом плече (разрыв в левом плече)

приводит к резкому возрастанию нерасхождения 2-¥{1Ц и, следовательно, к аномально высокому количеству потомства в скрещивании с самцами С(2Ь); Р(2Я)/Р(2Я). Визуальная оценка количества потомства каждой МАК-2 самки позволяет выделить те культуры, которые содержат хромосомные мутации. Введение парацентрической инверсии правого плеча в акроцентрик тестерной линии С(2Ь); Р(2Я)/Р(2Я) резко увеличивает частоту нерасхождения Р(2И.), что позволяет снизить фон контрольного 2 - Р(2Ь) нерасхождения. Визуальная оценка культур по числу особей облегчается. Исследуемых самок скрещивали с самцами Р(2Ь), рг; Р(211), 1п(2Я), сп с ер/ СуО. Отбирали мух Су , несущих комбинацию с двумя акроцентриками метацентрической хромосомы, потенциально содержащей перестройку. Скрещивали их индивидуально с самцами С(2Ь)ЯМ, Ь рг; Р(2И.)1, сп с эр. Отбирали культуры для цитологического анализа с числом особей 7 + Зл/Х, где X - среднее количество потомства одной самки, не содержащей перестройки.

Определение частоты доминантных леталсй проводили у самок, выращенных при 3-х температурах: 19, 24 и 28°С, используя для яйцекладки бутылки с разъемным дном. Частоту доминантных леталей определяли как отношение числа невылупившихся яиц к числу отложенных яиц.

Стерильность самок и самцов определяли в индивидуальных скрещиваниях по двум выводкам, полученным за 6 суток яйцекладки. Если в обоих выводках не было ни одного развившегося яйца, особей считали стерильными.

Определение гонадной ЮР-) стерильности. Тестируемых самок вскрывали для исследования яичников. Частоту ОО-стерильности считали как отношение числа рудиментарных яичников к общему числу исследованных яичников.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Три составляющие мутагеного эффекта делении М82-10.

Потомство самок, гетерозиготных по делеции М82-10, в скрещивании с самцами, содержащими компаунды по аутосоме 2, оказалось необычным. Около 71% потомков составили особи, возникшие из ооцитов нулло-2. Почти пятикратное превышение количества ооцитов нулло-2 над ооцитами дипло-2 показывает, что первые произошли в основном в результате потери аутосомы 2, а не в результате нерасхождения аутосом. Около 15% потомства составили особи, развившиеся из яиц с вновь образованными компаундами аутосомы 2. Необычный спектр потомства воспроизвелся в

повторном скрещивании. У контрольных самок +/+ (№ 61) и +/+ ri/ri не обнаружили ни резкого преобладания нулло-2 яиц над дипло-2 яйцами, ни образования компаундных аутосом 2 (Табл.1).

Таблица 1. Потеря аутосомы 2 и образование аутосоыных компаундов у самок с делецией околоцопромерного гетеро хроматина MS2-10.

Генотип самки Число ооцитов

дипло-2 нулло-2 компаунды аутосомы 2

Dfl2R)MS2-10/+ 32 145 30

Df(2R)MS2-10/+ 21 105 20

+/+ 53 35 0

+/+; ri/rî 53 30 4

Спонтанное образование компаундных аутосом, обнаруженное в опыте, нельзя себе представить иначе, как следствие разрыва метацентрика или метацентриков в околоцентромерном гетерохроматнне с последующим объединением двух одноименных плечевых фрагментов в новую метацентрическую хромосому. Было предположено, что часть фрагментов остается невоссоединенными, и было поставлено скрещивание для обнаружения таких акроцентриков. У контрольных самок было найдено 2 случая образования акроцентрической аутосомы 2, а у самок с делецией - 11 (в опыте, вдвое меньшем по объему). Из них в 7 случаях разрыв произошел в структурно нормальном метацентрике, в 4 - в хромосоме с делецией. В 8 случаях разрыв локализовался в околоцентромерном гетерохроматнне левого плеча, а в 3 - правого.

Исходя из полученных результатов, можно выделить три составляющие мутагенного эффекта MS2-10: потерю аутосомы 2; образование компаундов аутосомы 2; образование плечевых акроцентриков по аутосоме 2. Такой спектр мутационных событий наводит на мысль, что исходным событием является разрыв в районе околоцентромерного гетерохроматина аутосомы 2. В дальнейшем такой разрыв может трансформироваться в одно из трех мутационных проявлений. Первое потеря центрического хромосомного фрагмента вследствие отсутствия тело меры на месте разрыва. По нашим данным это самое частое событие. В случае образования теломеры de novo центрический фрагмент может стать стабильным акроцентриком. Это вторая возможность трансформации разрыва. Возможно, что

повторяющиеся последовательности ДНК в околоцентромерном гетерохроматине хромосом могут служить материалом для

формирования теломер de novo. Третья возможность трансформации разрыва - это латеральное слияние хроматид с образованием компауцдной аутосомы.

Из данных опыта следовало, что мутационные события имеют мейотическую природу. Полагая, что причиной мутагенеза является нарушение мейотического спаривания центромерного района, проверили другие делеции околоцентромерного гетерохроматина аутосомы 2, а также две парацентрические инверсии, в ожидании получить у них аналогичный мутагенный эффект. Одна из делеции (С;) локализуется в гетерохроматине левого плеча, остальные (А, А", В и MS2-8) - в гетерохроматине правого плеча. Делеция MS2-8 захватывает часть проксимального гетерохроматина. Все делеции менее протяженные, чем делеция MS2-10. Инверсии С92 и В208 имеют проксимальную границу в околоцентромерном гетерохроматине правого плеча. Во всех этих экспериментах не было обнаружено потери аутосомы 2 и образования компаундов.

Материнский эффект хромосомы, содержащей делению MS2-10. Материнский эффект MS2-10 зависел от оппозитной хромосомы. MS2-10 в сочетании с хромосомами, полученными из линий рг рк сп и Canton-S, не дали высокой частоты потери вторых хромосом и образования аутосомных компаундов. Для возникновения мутагенного эффекта делеции MS2-10 нужна была определенная оппозитная аутосома 2 - хромосома линии дикого типа № 61. Эффект наблюдали в том случае, когда хромосома MS2-10 шла со стороны матери, а оппозитная хромосома - со стороны отца, и он отсутствовал в обратном скрещивании (Табл.2).

Материнский эффект MS2-10 сохранялся и при образовании акроцентрических фрагментов у самок, гетерозиготных по делеции. У самок, получивших хромосому MS2-10 от матери и оппозитную хромосому 2 от самца линии № 61, частота образования акроцентриков F(2L) и F(2R) была в 5-13 раз выше, чем у таких же по генотипу самок, но полученных в обратном скрещивании (Табл.4).

Мутагенный и материнский эффекты делеции MS2-10 распространялись на хромосому 3 и Х-хромосому. У самок, получивших хромосому MS2-10 от матери резко возросли частоты ооцитов с потерей аутосом 3 и ооцитов с образованием аутосомных компаундов. Частота нулло-3 яиц превысила частоту дипло-3 яиц в 11,8 раз, что позволяет говорить о высокой частоте потери аутосом 3. Частота спонтанного образования компаундов составила 0,12% (Табл.3).

Таблица 2. Потеря аутосомы 2 н образование аутосомных компаундов у самок с делецией Ш2-10 (материнский эффект).

Генотип самки (хромосома Количество Число ооцитов Частота ооцитов, %

матери/ хромосома отца) «мнимого» дипло-2 нулло-2 компаунды дипло-2 нулло-2 компаунды

потомства аутосомы 2 аутосомы 2

l.Df(2R)№2-10/ + (61) 48720 21 180 36 0,17 1,47» 0,29**

2. +(61)/Df(2R)MS2-10 86620 23 19 4 0,10 0,09* 0,02**

3.Df(2R)MS2-10/prpkœ 84040 90 40 7 0,46 0,21 0,04

4. pr pk сп/ Df(2R)MS2-10 81168 59 22 2 0,32 0,12 0,01

5. Df(2R)MS2-10/ + (Canton S) 61375 26 25 4 0,20 0,20 0,03

6. + (Canton S)/Df(2R)MS2-10 66230 30 7 1 0,18 0,04 0,01

7. + (М-цитотип)/ + (Р-элемент) 25285 32 28 0 0,32 0,39 0,00

8. + (Р-элементУ + (М-цитотип) 79972 20 8 0 0,10 0,04 0,00

* - достоверность различия частот нулло-2 ооцитов Р&0.999

** - достоверность различия частот ооцитов, содержащих компаунды аутосом 2 Рг0,999

VO

Таблица 3. Потеря аутосомы 3 и образование аутосомных компаундов у самок разных генотипов

Генотип самки (хромосома матери/ хромосома отца количество «мнимого» потомства Число ооцитов Частота ооцитов

дшшо-3 нулло-3 компаунды аутосомы 3 дшшо-3 нулло-3 компаунды аутосомы 3

1.ЩЖ)Ш2-10/ + (б1) 120735 14 158 34 0,05 0,59* 0,12**

2. +(61)/Щ211)Ш2-10 113775 8 2 3 0,03 0,001* 0,01**

3. 8М1, Су/ + (61) 145310 27 10 1 0,07 0,03 0,00

4. + (61)/8М1,Су 132005 24 7 0 0,07 0,02 0,00

* . достоверность различия частот нулло-3 ооцитов РгЮ,999

** - достоверность различия частот ооцитов, содержащих компаунды аутосомы 3 Р^О.999.

Таблица 4. Спонтанное образование акроцентрических аутосом у самок с дслецией М32-10 (материнский эффект).

Генотип самки Тестер F(2L), pr. C(2R). сп

(хромосома матери/ .левый правый количество частота

хромосома отца) акроцентрик акроцентрик «мнимого» акроцентриков,

потомства %

1.ЩЖ)Ш2-10/ + (61) 5 3 17349 0,092*

2.+(б1).'Щ2К)Ш2-10 0 3 27299 0,022»

З.Щ2ВДШ2-10/

+ (Сап1оп£!) 1 1 9873 0,041

4. + (Сап1оп Б)/

ОД2Я)М32-10 0 0 21190 0,000

Генотип самки Tecrtp C(2L\ dp. F(2R\ bw

(хромосома левый правый количество частота

матери/ хромосома акроцентрик акроцентрик «мнимого» акроцентриков,

отца потомства

1. Df(2R)MS2-10/ + (61) 3 5 14041 0,113"

2. + (61)/Df(2R)MS2-10 1 0 23940 0,008**

3. Df(2R)MS2-10/

+ (CantonS) 1 1 12S4S 0,031

4.+(Carton S)/

Df[2R)MS2-10 0 0 23580 0.000

* - достоверность различия частот акроцентриков Рг 0,99; ** - достоверность различия частот акроцентриков Рг 0,999.

Сашси, получившие хромосому М82-10 от матери, дали 12 исключительных по Х-хромосоме особей. Самки, полуившие хромосому МБ2-10 от отца - 2. Частота ооцитов с потерей X-хромосомы превысила частоту ооцитов с нерасхождением X-хромосом в 5 раз.

Исследование картины дисгенеза. По наличию материнского эффекта обнаруженный нами случай мутагенеза похож на гибридный дисгенез. Ооциты с потерей хромосомы и ооциты с компаундами возникали с высокой частотой у самок только в том случае, когда самки получали хромосому М82-10 от матери, а оппозитную хромосому от отца из линии дикого типа №61. Исследование потери, нерасхождения аутосом 2 и образования аутосомных компаундов в системе Р-М гибридного дисгенеза показало, что мутагенный эффект М82-10 отличен от Р-М гибридного дисгенеза. Самки, получившие цитоплазму от линии У2 ^ , имеющей М-цитотип, и Р-элемент от самца я2 линии, проявляли признаки дисгенеза и отличались высоким уровнем дипло- и нулло-2 гамет по сравнению с дочерьми того же генотипа, но полученными из обратного

скрещивания. (Эти частоты были у них на порядок величин выше). Однако, у дочерей с проявлением признаков гибридного дисгенеза не было признаков, характерных для наблюдаемого нами мутагенного эффекта делеции: не было обнаружено ни высокой частоты потери аутосом 2 (преобладание нулло-2 гамет над дипло-2), ни высоких частот образования аутосомных компаундов (Табл.3). Результаты тестирования не подтвердили принадлежности линии № 61 к Р-семейству.

У самок, гетерозиготных по MS2-I0, было проверено наличие других свойств, характерных для гибридного дисгенеза. Здесь не было четкой картины. С одной стороны, для Р-М гибридного дисгенеза характерна температурная зависимость образования доминантных леталей (частота доминантных деталей увеличивается с повышением температуры содержания дисгенных самок). Мы обнаружили у дочерей MS2-10 самок 90% доминантных летелей при 28°С и 35% - при 25°С против 16% и 4% доминантных леталей у потомков реципрокного скрещивания. С другой стороны, для Р-М гибридного дисгенеза при низкой температуре различие между реципрокными скрещиваниями не характерно (Engels, 1989). В нашем же случае у самок, развившихся при 19°С и получивших хромосому MS2-10 от матери, частота ооцитов с доминантными леталями составила 50%, что в несколько раз выше, чем у самок, получивших при той же температуре хромосому MS2-10 от отца (8%).

С I-R дисгенезом больше общих черт. Действительно, не было обнаружено различия в стерильности самцов - потомков реципрокных скрещиваний. Частота стерильных дочерей у самок MS2-1Ö достоверно превысила соответствующую частоту у самок линии №61. Для I-R дисгенеза, однако, не характерна температурная зависимость стерильности самок.

I-R дисгенные самки обладают развитыми яичниками и откладывают нормальное число яиц (Finnegan, 1989) в отличие от Р-М и Н-Е гибридных самок, яичники которых часто рудиментарны, особенно при повышенных температурах, (Ashbumer, 1989). У гибридов MS2-10 матерей, развивавшихся при 29° С, не было обнаружено ни одного случая рудиментарного яичника.

Отсутствие достаточной согласованности с литературными данными по гибридному дисгенезу позволяет сделать предположение, что мы имеем дело с иной дисгенной системой.

Для всех систем гибридного дисгенеза характерна высокая частота хромосомных разрывов с последующим образованием перестроек (Engels, Preston, 1984; Finnegan, 1989). Метод выделения хромосомных мутаций с помощью теста на нерасхождение позволяет

регистрировать пара- и перицентрические инверсии аутосомы 2, а также транслокации, имеющие одну из точек разрыва в избранном плече. При анализе образования акроценгриков выяснили, что разрывы происходят как в хромосоме MS2-10, так и в оппозитной хромосоме; чаще в левом плече. Ожидали заметного образования хромосомных перестроек с одной из точек разрыва в левом плече второй аутосомы. Однако, перестроек не нашли среди 333 проанализированных культур - потомков скрещивания самок MS2-10 и самцов линии № 61, и 336 культур - потомков обратного скрещивания. Можно сделать вывод, что перестройки не образуются. В то же время, нельзя исключить того, что они специфически локализуются в центромерном районе, поскольку примененный метод не позволяет выделять транслокации с двумя точками разрыва в околоцентромерной области.

Как для Р-М, так и для I-R гибридного дисгенеза характерно предмейотическое происхождение индуцированных мутаций, которое регистрируется по появлению пучков особей с мутационным признаком (Ashburner, 1989). Мы не обнаружили ни одного пучка с образованием аутосомных компаундов.

Мутагенное действие вызывает хромосом», несуща» делению MS2-10. У самок, получивших от матери не хромосому MS2-10, а оппозитную хромосому с комплексной инверсией SM1, не обнаружили ни потери хромосомы 3, ни образования компаундов по хромосоме 3. Частота дипло-3 яиц в данном случае была близка к частоте дипло-3 яиц в присутствии хромосомы MS2-10. Частота нулло-3 яиц снизилась в 20 раз, образование аутосомного компаунда было зарегистрировано в единственном случае (Табл.3).

Имеет ли значение деления MS2-10 или она является лишь маркером хромосомы? В последнем случае мутагенный эффект должен бьгть обусловлен находящимися в ней генами, деструктивное проявление которых зависит от родительского происхождения. Несмотря на существование в литературе рада примеров подобных геномных взаимодействий (Sved, 1976), кажется более вероятным, что одним из решающих факторов обнаруженного нами мутагенеза является делеция MS2-10. Показано, что хромосомы псевдопитающих клеток Drosophila melanogaster контактируют с ядерной оболочкой прицентромерным районом (Шарахов, 1995). При этом хромосома 2 прикрепляется к ядерной мембране фибриллами, отходящими от гетерохроматина правого плеча. Делеция MS2-10, как делеция околоцентромерного гетерохроматина правого плеча, может нарушать связь аутосомы 2 с ядерной оболочкой, приводя к изменению пространственной структуры всего ядра. Последствием изменения пространственной организации могут быть: 1) изменение

активности мобильных элементов; 2) нарушение спаривания гомологичных хромосом.

Итак, у гибридных самок, содержащих хромосому с делецией МБ2-10 и набор отцовских хромосом из линии № 61 была обнаружена картина генерализованного структурного мутагенеза, захватывающая хромосомы X, 2 и 3. Общехромосомный характер мутагенеза и материнский эффект делают картину мутагенеза похожей на гибридный дисгенез. Однако, по многим существенным параметрам эти картины различны. В настоящий момент мы считаем, что мутагенез данного вида обусловлен тремя факторами:

1) нарушением пространственного расположения хромосом 2 в ядре ооцита, вызванным делецией М82-10;

2) нарушением спаривания хромосом 2, вызванным делецией М82-10;

3) наличием мобильных элементов, привносимых с отцовским набором хромосом из линии дикого типа №61.

ВЫВОДЫ.

1.Описан мутагенный эффект делеции околоцентромерного гетерохроматина М82-10 у гетерозиготных по делеции самок Е)го5орЫ1а те1аш^а&ег. Мутагенный эффект заключается в возрастании частоты ооцитов:

а) не содержащих аутосом 2;

б) имеющих вновь образование плечевые компаунды аутосомы 2;

в) содержащих вновь образованные акроцентрики аутосомы 2.

2. Мутагенный эффект делеции М82-10 распространяется и на другие хромосомы: возрастают частоты ооцитов с потерей аутосомы 3, с вновь образованными компаундами аутосом 3, а также увеличивается частота ооцитов с потерей Х-хромосомы.

3. Обнаруженный эффект вызывается не просто хромосомой, несущей делецию, а комбинацией определенных хромосом. Этот эффект выявляется только у гетерозигот, получивших хромосому МЭ2-10 от самки, а оппозитную ей аутосому от самца линии дикого типа № 61. Это делает описанное явление похожим на гибридный дисгенез.

4. Мутагенный эффект М82-10, однако, отличается от гибридного дисгенеза:

а) дочери М82-10 матери и отца линии № 61, получившие хромосому, оппозитную делегированной хромосоме М82-10, не обнаруживают повышенного мутагенеза;

б) Р-М дисгенные особи не показывают ни резкого возрастания частоты ооцитов с потерей аутосом 2, ни образования ооцитов с компаундами аутосом 2;

в) картина образования доминантных леталей, хромосомных перестроек, стерильности самок и самцов, гетерозиготных по MS2-10, отличается от таковой, характерной для гибридного дисгенеза.

5. Предложена гипотеза, объясняющая обнаруженное явление нарушением пространственной организации ядра у самок с делецией околоцентромерного гетерохроматина.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Чадов Б.Ф., Иванов Ю.Н., Артемсва Е.В. Выделение хромосомных мутаций у Drosophila melanogaster с помощью теста на нерасхождение // Генетика. 1985. Т. 21. С. 1143-1150.

2. Чадов Б.Ф., Артемова Е.В., Бузыканова Г.Н., Чадова Е.В., Подоплелова МЛ. Нарушение мейотического спаривания приводит кразрыву хромосом //Докл. Акад. Наук. 1991. Т.316. С .991-996.

3. Artyomova E.V. New mutants // Dros. Inf. Serv. 1991. V. 70. P.

265.

4. Artyomova E.V., Buzykanova O.N. New mutants // Dros. Inf. Serv. 1991. V. 70. P. 265-266.

5. Chadov B.F., Artyomova E.V., Buzykanova G.N., Chadova E.V., Podoplelova M.L. Disturbed centromeric meiotic pairing leads to chromosome breaks // Mutet. Res. 1994. V. 323. P. 1-5.

6. Артемова E.B,, Чадов Б.Ф. Возникновение хромосомных аберраций у самок, гетерозиготных по делеции MS2-10: материнский эффект// Генетика. 1995. Т. 31. С. 30-34.