Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки жировой ткани и использование их в создании трехмерных трансплантатов хрящевой ткани

Шарифуллина, Светлана Загировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки жировой ткани и использование их в создании трехмерных трансплантатов хрящевой ткани
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки жировой ткани и использование их в создании трехмерных трансплантатов хрящевой ткани"

На правах рукописи

□03064082

ШАРИФУЛЛИНА Светлана Загировна

Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки жировой ткани и использование их в создании трехмерных трансплантатов хрящевой ткани

03.00.23 - биотехнология 16.00 03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2007

003064082

Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» (ФГОУ ВПО МГАВМиБ) и ООО «Институт стволовой клетки»

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор,

член-корреспондент РАСХН Девришов Давудай Абдулсемедович, доктор медицинских наук Тепляшин Александр Сергеевич.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Тихонов Игорь Владимирович, доктор биологических наук, профессор, Заслуженый деятель науки РФ Дьконов Лев Петрович.

Ведущая организация - Государственное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» (ГНУ ВНИТИБП)

Защита состоится « » ¿¿¿ом 2007 года в часов на заседании диссертационного совета Д 220 042 01 в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К И. Скрябина» (109472, Москва, ул Академика Скрябина, 23. Тел (495) 377-93-83).

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ФГОУ ВПО МГАВМиБ.

Автореферат разослан « » 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета, профессор

Грязнева Т Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Открытие стволовых клеток и изучение их биологии позволило получить новые перспективы для глубокого исследования биологических процессов и лечения наследственных и дегенеративных заболеваний. Среди популяций этих клеток выделяют мультипотент-ные мезенхимные стромальные клетки (ММСК). Впервые они были выделены из костного мозга (KM) [Fridenshtein А. 1976]. В настоящее время показано, что ММСК можно получить и из других тканей взрослого организма - мышц, сердца, печени, кожи, жировой ткани (ЖТ) и др. [Young H. 2001; Zuk P. 2002; Aust L. 2004]. В широком применении для получения ММСК производят аспирацию КМ, эта процедура достаточно болезненна и затруднительна. В связи с этим, является актуальным использование альтернативного источника для получения ММСК, например, ЖТ

Известно, что на поверхности ММСК отсутствует экспрессия белков 11-го класса комплекса гистосовместимости и присутствует экспрессия целого ряда иммуносупрессорных белков [Le Blanc К. 2003; Rasmusson I 2003]. Эти уникальные свойства ММСК позволяют использовать их в разработке схем лечения многих дегенеративных заболеваний, в регуляции иммунной системы, а также в протезировании с использованием биоматериалов, содержащих ММСК.

Наиболее актуальным на сегодняшний день является восстановление тканей опорно-двигательного аппарата, в частности, хрящевой ткани (XT) При этом известно, что трансплантация собственной и донорской ткани ограничена возможностями получения и сохранения здоровой и жизнеспособной XT, возможна реакция иммуноотгоржения аллотрансплантата и др. Трансплантация алло- и аутохондроцитов ограничена свойствами высокоспециализированных клеток XT, приводящая к образованию фиброзной XT. В связи с этим разрабатываются технологии получения ткани гиалинового хряща с применением трехмерных носителей в сочетании с

ммск.

В связи с этим, является актуальным получение ММСК из альтернативного и легкодоступного источника - ЖТ, а также использование их в биотехнологических разработках с целью получения XT для заместительной терапии при лечении заболеваний опорно-двигательного аппарата человека и животных.

Цель и задачи исследований. Цель настоящих исследований - выделение и характеристика мультипотентных мезенхимных стромальных клеток из жировой ткани и использование их в создании трехмерных трансплантатов хрящевой ткани.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изолировать ММСК из ЖТ человека и изучить их иммунобиологические и морфо-функциональные особенности.

2. Провести иммунофенотипирование полученных ММСК ЖТ

3. Изучить влияние различных факторов на потенции клеток к цито-дифференцировке в системе in vitro.

4. Провести исследования по созданию трехмерных структур XT на основе различных биоматриксов.

5 Провести экспериментальные и доклинические исследования полученных трехмерных тканевых структур в системе т vitro и т vivo.

Научная новизна. Впервые в России разработан простой, недорогой и эффективный метод выделения ММСК из ЖТ человека и их очистки от других клеточных типов, заключающийся в ферментативной обработке ЖТ раствором коллагеназы в среде Игла в модификации Дюльбекко с последующей градиентной фильтрацией полученной суспензии.

Впервые разработан метод получения ММСК из ЖТ человека с эффективностью 106 клеток/1 г ЖТ с жизнеспособностью 96% Охарактеризованы иммунобиологические и морфо-функциональные особенности полученных популяций клеток in vitro. Установлено, что ММСК ЖТ характе-

ризуются высокой адгезивной способностью и культивируются в питательной среде с низким содержанием глюкозы

Впервые проведен сравнительный анализ клеточных популяций ММСК ЖТ, полученных от различных доноров. Показано, что качество получаемой клеточной популяции может зависеть от возраста доноров.

Проведен молекулярный анализ распределения ММСК ЖТ в организме экспериментальных животных и установлено, что клетки локализуются в основном в легких, селезенке, печени и КМ.

Впервые разработан эффективный способ загрузки трехмерного мат-рикса ММСК ЖТ и созданы трехмерные трансплантаты хрящевой ткани (ТТХТ) на основе трехмерных носителей и ММСК ЖТ

Впервые созданы ТТХТ на основе различных биоматриксов и ММСК ЖТ и проведены доклинические испытания полученных ТТХТ в организме мышей Balb/C nude. Изучено влияние матриксов на основе коллагена I-го типа и 00,-1Х-полимолочной кислоты (OPLA) на формирование структуры XT Показано, что оптимальным матриксом для получения ТТХТ является OPLA In vivo тесты показали, что полученные ТТХТ не токсичны и не туморогенны.

Практическая значимость. Экспериментальны данные по получению популяции ММСК ЖТ представляют практический интерес для медицины и ветеринарии, что обусловлено невысокой стоимостью разработанного метода в сочетании с высокой эффективностью. На базе ООО «Бьюти Плаза» создана технологическая линия выделения ММСК из ЖТ.

Разработаны и утверждены Федеральной службой (ФС) по надзору в сфере здравоохранения и социального развития методические рекомендации «Способ выделения мезенхимальных стволовых клеток из подкожно-жировой клетчатки человека» (per. № ФС-2006/268-У), в которых изложены условия, позволяющие рационализировать метод выделения данных клеток.

Разработан метод эффективной загрузки трехмерных матриксов ММСК

ЖТ для получения хрящевой ткани с эффективностью 68%.

Подобран оптимальный индуктор хондрогенеза - TGF-beta3.

В опытах на экспериментальных животных показано, что полученные ТТХТ не обладают свойством туморогенности и не оказывают токсического влияния на организм животных.

Апробация результатов диссертации. Основные результаты диссертационной работы апробированы на: Международном симпозиуме «Herbsttagung der Gesellschaft für Biochemie und Molekularbiologie» (Германия, 2004); Международном симпозиуме «Стволовые клетки, регенерация и клеточная терапия» (Санкт-Петербург, 2004); VII-ом Международном конгрессе по клеточной трансплантологии (США, 2004); Российском симпозиуме «Лазерная медицина» (Москва, 2004); И-ом Московском международном биотехнологическом конгрессе (Москва, 2005); Всемирной конференции по тканевой инженерии (Китай, 2005); III-ем Московском международном биотехнологическом конгрессе (Москва, 2006); VI-om Съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Москва, 2006); XI-ом съезде международного общества тканевой инженерии (Нидерланды, 2006); IV-ом Московском международном биотехнологическом конгрессе (Москва, 2007), XI-ом международном форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2007).

На защиту выносятся следующие положения и результаты:

1. Метод выделения ММСК ЖТ, их иммунобиологическая и морфо-функциональная характеристика.

2. Метод создания трехмерной структуры хрящевой ткани и результаты сравнительного анализа различных биоматриксов.

3. Результаты доклинических исследований полученных ТТХТ.

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 16 печатных

работ, в том числе 5 статей в научных журналах, 11 тезисов в сборниках конференций

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены

на 180 страницах машинописного текста и включают введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждения, выводы, данные о практическом использовании научных результатов, рекомендации по использованию научных выводов, список использованной литературы (273 источника, из которых 4 отечественных и 269 иностранных). Работа содержит 7 таблиц, 22 рисунка, 10 страниц приложений

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы исследований

Работа выполнена в период с 2003 по 2007 год на кафедре иммунологии ФГОУ ВПО МГАВМиБ и лаборатории тканевой инженерии ООО «Института стволовой клетки», а также на базе ГУ Российского Онкологического Научного Центра им Н И. Блохина РАМН (ГУ РОНЦ), в ИБХ им. Ю.А Овчинникова и М.М. Шемякина РАН и НИИ вирусологии им. Д И. Ивановского РАМН.

Жировая ткань от 30-ти здоровых доноров была предоставлена для исследований Клиникой «Бьюти Плаза» ММСК ЖТ были получены обработкой ткани раствором коллагеназы 1-го типа (0,075%), очисткой от эритроцитов с помощью лизирующего раствора, градиентной фильтрации клеточной суспензии (100 и 40 мкм). Для выделения и культивирования ММСК ЖТ использовали стандартные и модифицированные питательные среды и буферные системы, с применением инкубаторов фирмы Sanyo (Япония). Анализ клеток проводили с помощью фазово-контрастной микроскопии.

Кариологический анализ проводили с помощью «G-banding» окрашивания по 5-ти образцам с применением 0,1 мг/мл колхицина, визуализацию проводили окраской по Гимза на фосфатном буфере pH 6,8.

Анализ клеточного цикла клеток проводили на лазерном проточном цитофлуориметре Cytomics® FC500 (Beckman Coulter). Иммунофенотипи-рование проводили методом, описанным Zeile G. (1980) на цитофлуори-

метре Cytomics® FC500. Подготовлено и исследовано 298 проб (от 10 доноров по 28 маркерам). Дифференцировку исследовали на 5-ти образцах в присутствии индукторов в течение 4 нед по стандартным (Muraglia А. 2000; Reyes А. 2001) и разработанным нами методам

Анализ локализации ММСК ЖТ после ксенотрансплантации проводили на 20 самках мышей линии Balb/C nude. Распределение клеток изучали с помощью ПЦР-анализа по Y-хромосоме.

В экспериментах по получению ТТХТ использовали биодеградируемые матриксы фирмы BD Biosciences (Германия). Для индукции хондрогенеза использовали TGF-betal и TGF-beta3 в концентрации 10 нг/мл. Анализ проведен на 117 гистосрезах органов/тканей животных и полученных ТТХТ с применением DAB-хромогена и гематоксилин-эозина.

Для оценки токсичности и туморогенности проведены доклинические исследования на 46 мышах линии Balb/C nude в течение 8 недель

Экспериментальные данные обрабатывали методом среднестатистического анализа и с помощью программ СХР v.2.1 (Beckman-Coulter) и MultiCycle (Phoenix Flow Systems).

В выполнении отдельных этапов работы принимали участие д.б.н., проф. Савченкова И П., к.б.н. Коржикова C.B., Чупикова Н.И. (ООО «Институт стволовой клетки») и сотрудники ГУ РОНЦ, ИБХ РАН, за что автор им искренне благодарен.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Получение ММСК жировой ткани, их иммунобиологические и морфо-функциональные особенности

Жировая ткань пупочной области подвергалась ферментативной обработке и проводили градиентную фильтрацию, полученную суспензию высевали в культуральные флаконы 150 см2. В полученных клеточных популяциях было выделено три субпопуляции. Первый тип клеток представлял собой субпопуляцию малых веретеновидных клеток диаметром 10-15 мкм, четко выделенным ядром и гомогенной цитоплазмой. Второй тип-

клетки до 40 мкм округлой формы, вытянутым выростом цитоплазмы, темным ядром, смещенным к одному краю, гетерогенной цитоплазмой и повышенной гранулярностью в ядерной области. Доминирующее положение занимали крупные клетки до 80 мкм, с большим количеством вакуолей и гранул. Было выявлено, что эти клетки обладают высокой адгезив-ностью, клоногенностью и способны пролиферировать в культуре более 72 генераций (рис.1).

Рисунок 1. Морфология ММСК ЖТ (а) и клонообразование (б)

С помощью кар коти пирован и я было показано отсутствие нарушений генома клеток на хромосомном уровне на различных этапах культивирования. В фазе логарифмического роста клеток был произведен подсчет митотического индекса (34%о) и времени цитогенерации - 54-62 часа. Анализ клеточного цикла ММСК ЖТ показал, что отношение количества ДНК для всех линий клегок, находящихся в 02 фазе к количеству ДНК в С ( фазе клеточного цикла (02/01) равно 1,96 (табл. I).

Таблица 1. Оценка клеточных популяций но фазам клеточного цикла

Линии клеток Количество делящихся клеток (в+ог+м) Индекс ДНК (02/01) Количество живых клеток (%) Количество клеток в апоп-тозе (%)

Ра! ¡4 8,2% 1,96 88,7 8,4

Га128 ! 1,7% 1,959 67,8 34.5

6,7% 1,96 87,1 8,7

По результатам проведенных исследований также было показано от-

сутствие изменений в количественном содержании ДНК в клетках в процессе культивирования, т е от пассажа к пассажу количество генетического материала в клетках не изменяется. Коэффициент распределения ОI. для клеток на 2-ом и 10-ом пассажах составил 1,36. Полученные данные характерны для нормально развивающихся клеточных культур

Поскольку не существует уникального маркера для ММСК, иммунофе-нотип их определяется набором антигенов (Аг), принятый во всем мире, который согласуется с полученными нами данными (табл.2).

Таблица 2. Иммунофенотипирование ММСК жировой ткани

Антиген Кол-во поз клеток (%) Антиген Кол-во поз клеток (%)

CDIO 73,2 ± 3,5 CD90 99,1 ±0,6

CD13 99,3+0,5 CD 105 98,7 ±1,1

CD29 98,9 ± 1,1 CD 106 5,0 ±0,12

CD31 2,4 + 0,1 CD117 2,1 ± 0,07

CD34 2,6 ±0,15 CD 120а 4,7 ± 0,4

CD44 98,9 ± 1,0 CD 124 3,1 ± 0,2

CD45 0,9 ± 0,02 CD133 2,8 ±0,1

CD49a 87,7 ± 2,9 CD 166 98,9 ± 1,0

CD49b 96,2 ± 1,5 HLA - А,В,С 99,6 ± 0,3

CD49d 88,0 ± 2,7 HLA - DP 3,8 ± 0,07

CD49f 40,7 ± 1,2 HLA-DQ 2,2 + 0,03

CD54 69,0 ± 1,0 HLA - DR 3,4 ±0,1

CD71 84,0 ±2,9 Flk-1 4,0 ±0,12

CD73 99,2 ± 0,7 Stro-1 2,9 ±0,1

Результаты иммунофенотипирования свидетельствуют о наличии поверхностных СО-кластеров, характерных для ММСК. В то же время имеется некоторая специфичность для ММСК ЖТ по СЭ49<1 и СО 106 по сравнению с ММСК КМ. В результате проведенных исследований также были выявлены некоторые различия в экспрессии поверхностных антигенов ММСК ЖТ у пациентов различных возрастных категорий. В таблице 3 представлены результаты иммунофенотипирования по нескольким антигенам ММСК ЖТ, полученных от 6-ти доноров.

Таблица 3. Иммунофенотип ММСК ЖТ у разных возрастов

Антиген /возраст донора Количество положительных клеток (%)

№1-19 л №2-60 л №3-32 г №4-52 г №5-39 л №6-45 л

CD10 89,4 40,2 63,2 62,8 68,9 84,0

CD13 98,5 97,4 96Д 93,6 95,8 97,7

CD31 13,7 1,8 5,9 1,1 5,4 0,1

CD34 0,1 3,9 8,0 8,8 0,3 5,2

CD44 97,7 92,4 94,2 85,8 91,3 97,1

CD45 4,6 4,1 4,2 2,0 0,1 4,7

CD90 99,2 98,1 99,0 98,9 97,8 97,2

CD105 99,0 94,6 80,8 79,9 89,1 97,7

CD117 4,7 0,1 6,1 2,0 0,6 0,3

Таким образом, было выявлено, что профиль экспрессии поверхностных Аг ММСК ЖТ, может также зависеть от возраста доноров.

Дифференцировочный потенциал ММСК ЖТ in vitro Для ММСК существует три основных направления дифференцировки в клетки тканей мезенхимного происхождения - адипо-, остео- и хондро-дифференцировка При культивировании ММСК ЖТ в присутствии индо-метацина, изобутилметилксантина и дексаметазона приводит к формированию липидных вакуолей, накоплению нейтральных жиров и образованию кластеров адипоцитов, что подтверждается положительной окраской Oil Red О. Эффективность адиподифференцировки - 75%.

При моделировании 20-хондроструктур на основе ММСК ЖТ «в осадке» было показано образование клеточных агрегатов, изменение морфологии клеток и наличие экспрессии основных маркеров хондрогенеза - коллаген Н-го типа и аггрекан

Сравнительный анализ влияния индукторов TGF-betal и TGF-beta3 на хондродифференцировку ММСК ЖТ выявил, что TGF-beta3 является более эффективным индуктором хондрогенеза - отмечена значительная вакуолизация клеток и образование большего количества двойных клеток со смещенным ядром, подобных клеткам гиалинового хряща (рис.3).

а) б)

Рисунок 2. Хондрогенная днфференцнровка ММСК ЖТ. Окраска То-луидиновым синим: а - индукция - 4 нед.; б - в стандартной среде

Проведен ПЦР-анализ с применением стадии обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) индуцированных образцов (табл. 3).

Таблица 3. Экспрессия генов в процессе хондродифференцировки

ММСК жировой ткани при культивировании их в течение 4 недель

Маркер Последовательности праймеров ММСК жировой ткан и

Дни культивировании

Опыт (дни) Контроль (дни) |

14 21 28 14 21 28

коллаген 11 тип прямой 5' tttcccagg¡caagatggtcУ обратный 5'сиса^сасс1^1с1сассаЗ^ размер продукт! - 377 п.н ■ в □ В в

аггрекан примой 5' ' обратный У размер и роду кт я - 350 п.н. в в &3 в в

коллаген X тип прямой 5,coccaggcattccaggattcc31 обратный aggШgtíggtctgaШgc!c 3' | риигр продукта - 825 п.н. ■ в ■ в в ■

ОАРЦМ прямо* 5'gggclcctt ttaactctgg! 3' обратный 5' tggcaggu У размер продукта - 702 пл. в п п

По результатам ОТ-ПЦР-анализа было выявлено наличие стойкой экспрессии апрекана и коллагена [1-го типа на 3-й и 4-й нед. индукции. Экспрессия коллагена Х-го типа не обнаружена.

Внесение в среду р-глицерофосфата, ас ко р б ат-2-фосфата и деке а мета-зона приводит к запуску ОСТеодифференцировки ММСК ЖТ, что подтверждается положительной окраской на щелочную фосфатазу на ]4-с

стуки. При индукции в течение 4 нед. формируются минеральные комплексы, образуются костные пластинки, окрашивающиеся красителем ализариновым красным; поздняя дифференцировка в остеоциты подтверждается окраской von Kossa. Эффективность остеодифференцировки -68%. ОТ-ПЦР-анализ остеоиндуцированных образцов ММСК ЖТ выявил наличие экспрессии основных маркеров остеогенеза - остеопонтин, остео-кальцин и костный сиалопротеин.

Молекулярный анализ физиологического распределения н локализации ММСК ЖТ в организме мышей (по Y-хромосоме)

Распределение ММСК ЖТ (J1) в организме мышей BaJb/C nude (£) проводили с помощью ПЦР-анализа по Y-хромосоме (рис.3).

М 1 2 3456789 Рисунок 3. ПЦР-анализ эффективности ксенотрансилантации ММСК ЖТ человека, полученных от мужчины-донора, в организм мышей

На рис.3.: М - маркер (100 и.о.); 1 - положит, контроль (ДНКммск жт донора, 100 нг); 2 - отрицат. контроль (ДНКлепиго цыи1И, 2мкг); 3 - положит, контроль (ДНКЛСГЮГО НЬ1ШИ, 2 мкг) + (ДНКммск ЖТ донора 5,3 нг) - дорожка показывает чувствительность метода; 4, 5, 6, 7, 8 и 9 - ДНК из тканей легкого, почек, печени, ЖТ, КМ и селезенки мыши-реципиента. Метод выявляет донорскую ДНК на 21 сутки после ксенотрансплантации ММСК ЖТ в тканях мыши-реципиента (печень, легкие, костный мозг, селезенка)

Создание трехмерных трансплантатов хрящевой ткани (Т'ГХТ) на основе различных биоматриксо»

Руководствуясь данными литературы и мирового опыта исследований для создания ТТХТ использовали биодеградируемые матриксы на основе коллагена 1-го типа и ОРЬЛ. При формировании трехмерной структуры,

подобной ХТ, было выявлено, что основной проблемой является низкая эффективность заселения носителя клетками. Гистологический анализ выявил, что только 1% клеток от общего количества ММСК ЖТ были с морфологией, подобной клеткам ХТ. Были разработаны условия загрузки клетками биоматрикса, заключающиеся в предварительном насыщении носителя ММСК ЖТ в течение 2 ч. с последующим центрифугированием, что позволило добиться 68% загрузки (табл 5).

Таблица 5. Загрузка ЗР-матриксов ММСК ЖТ

Показатели Насыщение Осаждение

Количество клеток на матрикс 5,0 х 106 5,0 х 106

Количество клеток вне матрикса через 24ч. 2,0 х 106 1,6x10"

Вес ЗО матрикса с клетками (перед загрузкой) 45 ± 0,2 мг 45 ± 0,2 мг

Вес полученной трехмерной структуры после культивирования в хондрогенной среде 28дн. 88 ± 0,2 мг 100 ± 0,4 мг

Эффективность загрузки, % 60% 68%

При культивировании матриксов заполненных насыщением с последующим уплотнением наблюдали более равномерное распределение клеточного материала и наличие клеток с морфологией, подобной ХТ.

Культивирование ММСК ЖТ, заключенных в трехмерный носитель (OPLA и коллаген I типа), в среде, содержащей TGF-beta3, приводило к формированию в пробирке ТТХТ. Известно, что биосинтез клетками коллагена Н-го типа может рассматриваться как достоверный маркер хондро-генной дифференцировки. Иммуногистохимический анализ срезов полученных образцов выявил наличие аггрекана и коллагена II типа.

Следует заметить, что большой проблемой при моделировании XT in vitro является гипертрофия хряща, при этом происходит изменение морфологии клеток, предшествующее минерализации хряща, их усиленный апоптоз и избыточная продукция коллагена Х-го типа. В эксперименте в исследуемых образцах коллаген Х-го типа не был обнаружен, что свидетельствует об отсутствии признаков гипертрофии дифференцированных клеток.

Доклинические испытания ТТХТ на основе различных носителей и ММСК ЖТ

Анализ результатов доклинических исследований показал, что из 46 мышей Balb/C nude, которым были вшиты трансплантаты, выжили 34 особи (74 %). Другие 12 мышей погибли на разных сроках после трансплантации ТТХТ. В норме естественная гибель иммунодефицитных мышей составляет 30%. Тест на туморогенность показал, что при эктопическом помещении полученных ТТХТ в организм экспериментальных животных, не приводит к возникновению новообразований. Согласно полученным результатам можно заключить, что полученные ТТХТ не токсичны и не туморогенны.

Иммуногистохимический анализ извлеченных ТТХТ показал, что их трехмерная структура не нарушается и сохраняется морфология ММСК, дифференцированных в клетки хондрогенной линии, и экспрессия основных маркеров клеток ХТ - аггрекан, коллаген II тип. Экспрессия коллагена Х-го типа не детектировалась

Известно, что выбор биоматрикса существенно влияет на дифференци-ровку ММСК ЖТ и функциональные свойства сконструированного фрагмента ткани. Сравнительный анализ трехмерных носителей для создания ХТ и трансплантации полученных ТТХТ выявил существенные различия. В ТТХТ на основе коллагена 1-го типа после т vivo теста были выявлены сосудистые образования, в то время как в ТТХТ на основе OPLA таких признаков не было выявлено, в обоих случаях сохранялась экспрессия основных маркеров хондрогенеза. Важной особенностью ХТ является то, что в ней отсутствует васкуляризация, иннервация и низкий уровень метаболизма. В связи с этим, можно заключить, что OPLA является наиболее оптимальным матриксом для получения ХТ, которая может быть использована в качестве прототипов для реконструкции суставного хряща животных и человека.

выводы

1. Разработан метод выделения ММСК из жировой ткани человека, основанный на применении коллагеназы тип I и градиентной фильтрации, что позволяет получить гомогенную популяцию ММСК

2. ММСК ЖТ характеризуются фибробластоподобной морфологией, адгезивностью, клоногенностью. Культивирование ММСК ЖТ в среде с низким содержанием глюкозы позволяет получить чистую популяцию ММСК из ЖТ человека и освободиться от других клеточных типов

3. ММСК ЖТ характеризуются наличием высокой экспрессии специфических антигенов (СОЮ, СО 13, С044, СВ49а,ЬД£ С071, С090, СО 105, СО 166) и отсутствием экспрессии маркеров гемопоэтических стволовых клеток (С034, С045, С0117, С0133) и др. клеточных типов.

4. ММСК ЖТ обладают свойством мультипотентности и в присутствии специфических индукторов дифференцируются в клетки тканей мезен-химного происхождения - остео-, адипо- и хондрогенной линий

5. Для дифференцировки ММСК ЖТ в клетки хрящевой ткани оптимальным основным индуктором хондрогенеза является ТОР-Ье1аЗ.

6 Получены ЗО-структуры, подобные хрящевой ткани, на основе коллагена I типа и 00,-ЬЬ-полимолочной кислоты (ОРЬА) и разработан метод эффективной загрузки ЗО-матриксов, основанный на насыщении мат-рикса клетками с последующим центрифугированием

7. Оптимальным носителем для получения трехмерной структуры хрящевой ткани является биодеградируемый матрикс ОРЬА.

8 Полученные трехмерные трансплантаты хрящевой ткани не оказывают токсического влияния на организм экспериментальных животных и не туморогенны

ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

1. Разработаны и утверждены Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития методические рекомендации «Способ выделения мезенхимальных стволовых клеток из подкожно-жировой клетчатки человека» (per. № ФС-2006/268-У).

2. Разработаны и утверждены методические рекомендации «Использование метода выделения ММСК из жировой ткани» и «Способ эффективной загрузки трехмерного носителя ММСК ЖТ» для Клиники «Бьюти Плаза» (Лицензия №77-01-000343 от 11.08.2005 г. «На применение новых клеточных технологий в здравоохранении»),

3. На базе Клиники «Бьюти Плаза» созданы аппаратурно-технологические линии получения ММСК из жировой ткани

4. На базе ГУ РОНЦ им. Н.И. Блохина РАМН (договор №01.01/2005 от 25 01.2005 г. и №10/2005 от 15.07 2005 г.) проведены с положительным эффектом доклинические испытания ТТХТ на иммунодефицитных экспериментальных животных.

5. Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе в ФГУ ВПО МГАВМиБ для студентов факультета медицинской ветеринарии

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. Экспериментальные данные по получению чистой популяции ММСК ЖТ человека имеют научно-практическое значение, что обусловлено невысокой стоимостью разработанного метода в сочетании с высокой эффективностью и рекомендуются использовать специалистам в клеточной биологии, тканевой инженерии, иммунологии, а также специалистам, владеющих основами клеточной биологии, для получения гомогенной популяции ММСК с целью дальнейшего применения их в биотехнологических разработках и изучению свойств других клеточных типов, в частности

клеток крови

2. Разработанный метод эффективного насыщения трехмерных носителей клетками рекомендуется для получения трехмерной структуры хрящевой ткани на основе других биодеградируемых матриксов.

3. Результаты исследований по созданию ТТХТ после проведения клинических испытаний могут быть использованы в клинической практике по восстановлению повреждений XT человека и животных.

4. Результаты исследований по получению ММСК из жировой ткани и созданию ТТХТ могут быть использованы в высших учебных заведениях РФ при изучении дисциплин «Биотехнология» и «Иммунология»

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Teplyashin A.S. Characterization of human MSC-like cells isolated from bone marrow, adipose tissue, skm and placenta /A.S. Teplyashin, N.I Tchupik-ova, S.Z Sharifullina et al. //Herbsttagung der Gesellschaft fur Biochemie und Molekularbiologie - Munster. GBM.- 2004 - P 24.

2. Шарифуллина С 3. Выделение мезенхимальных стволовых клеток из жировой ткани человека и их характеристика /С.З. Шарифуллина, Н.И Чупикова, М С. Ростовская и др. //Цитология,- 2004.- Т. 46.- № 10.- С. 947.

3. Teplyashin A.S. CD34+ and CD34" MSC-like cells, derived from adipose tissue of human /А S Teplyashin, N.I. Tchyupikova, S Z. Sharifullina et al. //7th International Congress of the Cell Transplant Society.- Boston- CellTx -2004,- P. 76.

4 Тепляшин A.C Возможности применения мезенхимальных стволовых клеток при лазерной дермабразии /А.С Тепляшин, С А. Петрин, В.С Еременко, С.З. Шарифуллина и др. //Лазерная медицина.- 2004.-Т. 8.- № З.-С 48.

5 Тепляшин А.С. Характеристика мезенхимальных стволовых клеток человека, выделенных из костного мозга и жировой ткани /А.С. Тепляшин, С.В. Коржикова, С.З. Шарифуллина и др. //Цитология - 2005,- Т. 47.- № 2,-

C. 130-135.

6. Тепляшин A.C. Создание трехмерных трансплантатов хрящевой ткани человека /A.C. Тепляшин, С.В Коржикова, С 3. Шарифуллина и др //Биотехнология: состояние и перспективы развития сб. научн тр - М.: Экспо-Биохим-технологии - 2005.-Ч. 1.-С. 104.

7. Тепляшин A.C. Сравнительный анализ двух клеточных популяций с фенотипом, подобным мезенхимным стволовым клеткам, выделенных из разных участков подкожно-жировой клетчатки /А.С Тепляшин, Н И. Чупикова, С.В. Коржикова, С.З. Шарифуллина и др. //Цитология.- 2005.- Т 47.- № 7 - С. 637-643.

8. Teplyashin A.S Engineering cartilage-like tissue using adipose-derived adult stem cells and Collagen scaffolds /A.S. Teplyashin, S.V Koijikova, S.Z. Sharifullina et al. //Tissue Engineering.- 2006.- V. 12.- № 4.- P. 1117

9. Teplyashin A.S In vitro cartilage formation by bone marrow-derived mesenchymal stem cells m OPLA scaffolds /A.S. Teplyashin, S.V Korjikova, N.I. Chupikova, S.Z. Sharifullina et al. //Tissue Engineering.- 2006,- V.12.- № 4,- P. 1090.

10. Тепляшин A.C. Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки человека - перспективный материал для моделирования остео- и хонд-рогенеза in vitro /А С Тепляшин, Н.И. Чупикова, С.З. Шарифуллина и др //Биотехнология и медицина, сб. научн. тр - М.: Экспо-Биохим-технологии.- 2006 - Ч. 1.- С 294.

11. Тепляшин A.C. Перспективы использования мультипотентных ме-зенхимных стромальных клеток костного мозга и жировой ткани в регуляции регенерации опорных тканей /A.C. Тепляшин, С.З Шарифуллина, Н.И Чупикова и др //Аллергология и иммунология.- 2006.- Т. 7.- № 2,- С. 189-198.

12. Шарифуллина С.З. Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки жировой ткани - перспективный материал при моделировании хон-дрогенеза в трехмерных матриксах /С.З. Шарифуллина //Аллергология и

иммунология.- 2006 - Т. 7.- № 3.- С. 248.

13. Тимофеев С.В. О возможностях применения стволовых клеток в ветеринарии. Часть 1 /С.В. Тимофеев, P.P. Мамашева, А.В. Кузнецов, С Ю. Концевая, Н.И. Чупикова, С.З. Шарифуллина //Ветеринарная клиника-2006.- № 9 (52).- С. 21-23.

14. Тимофеев С.В. О возможностях применения стволовых клеток в ветеринарии. Часть 2 /С.В. Тимофеев, Р Р. Мамашева, А.В. Кузнецов, С Ю. Концевая, Н.И. Чупикова, С.З Шарифуллина //Ветеринарная клиника.-2006.- № 10 (53).- С. 5-8

15. Teplyashin A.S A comparison of bone marrow-derived and adipose tissue-derived multipotent mesenchymal stromal cells as perspective material for engineering osteo- and chondrogenesis in vitro /A.S. Teplyashm, N.I. Chupik-ova, S.Z. Shanfullina et al. //Tissue engineering and regenerative medicine.-2006 - № 95,- P. 80

16. Тепляшин A.C. Влияние изоформ TGF-бета на эффективность хон-дродифференцировки ММСК, выделенных из жировой ткани человека /А С. Тепляшин, С.В. Коржикова, С 3. Шарифуллина и др. //Биотехнология- состояние и перспективы развития: сб научн. тр.- М: Экспо-Биохим-технологии.- 2007 - Ч. 1.- С. 52

Отпечатано в ООО «Компания Спутник+» ПД № 1-00007 от 25.09.2000 г. Подписано в печать 25.05.07. Тираж 100 экз Усл. п л. 1 Печать авторефератов (495) 730-47-74, 778-45-60

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шарифуллина, Светлана Загировна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.,.

1.1. Стволовые клетки человека.

1.2. Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки жировой ткани.

1.2.1. Жировая ткань.

1.2.2. Фенотипическая характеристика ММСК жировой ткани, CD - маркерный профиль.

1.2.3. Потенциал дифференцировки ММСК жировой ткани.

1. Адипогенез.

2. Остеогенез.

3. Хондрогенез.

1.3. Иммуномодуляторный эффект ММСК жировой ткани.

1.4. Перспективы применения ММСК жировой ткани.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки жировой ткани и использование их в создании трехмерных трансплантатов хрящевой ткани"

Многие годы ученые проводят исследования по изучению механизмов поддержания гомеостаза и процессов восстановления поврежденных органов и тканей в организме человека. Результатом данных исследований явилось понимание основ регуляции различных процессов в организме, а также были открыты различные типы клеток, обладающих свойством самовоспроизведения и широким спектром дифференцировки, названные «стволовыми клетками» (СК). Открытие стволовых клеток и изучение их биологии позволило получить новые перспективы для глубокого исследования процессов развития, дифференцировки, регенерации и лечения наследственных и дегенеративных заболеваний. Было выявлено, что эти клетки посредством секреции различных цитокинов и факторов роста, а также участием в ответной реакции на подобную экспрессию регуляторных белков другими клетками участвуют в поддержании гомеостаза и регуляции репаративных процессов в поврежденных органах и тканях, в том числе в процессах обновления клеток крови.

В настоящее время выделяют эмбриональные стволовые (тотипотент-ные) клетки (ЭСК); гемопоэтические и эпидермальные стволовые клетки (ГСК и ЭпСК), а также мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (ММСК) взрослого организма. Среди популяций этих клеток выделяют ММСК. Впервые они были выделены в 1974 году из костного мозга русским ученым А. Фриденштейном. Было показано, что в костном мозге присутствует определенный тип клеток (колониеобразующая единица, КОЕ), принципиально отличных от ГСК, различающихся по размерам, морфологии, пролиферативной способности, экспрессии щелочной фосфатазы и различной способности к остеодифференцировке in vivo, обеспечивающие защитное микроокружение другим клеткам и составляющие основу костного мозга. Эти клетки были названы «стромальными клетками костного мозга» (СК КМ) [89-92]. В дальнейшем различные группы исследователей продемонстрировали, что эти клетки обладают способностью к дифферен-цировке in vitro в различные типы клеток [35, 42, 59, 62, 76, 89-92, 104, 119, 133,148,166,196-198,218,236,277].

Интенсивные исследования в данном направлении продемонстрировали, что популяцию ММСК можно получить и из других тканей взрослого организма - синовиальной оболочки [69, 228], надкостницы [93, 182], скелетных мышц [52,132], жировой ткани [290,291], ткани костного мозга [33,131, 132, 89-92, 218, 236], пуповинной крови [36, 82, 100, 144], периферической крови [150, 293], эпителия [58] и кожи [257], роговицы и сетчатки глаза [240, 258], пульпы зубов, головного и спинного мозга [37,60,132,220,240], стенок кровеносных сосудов [229], печени [8, 51, 270], селезенки и тимуса [89], желудочно-кишечного тракта [8,270], поджелудочной железы [209,292] и др.

Показано, что ММСК обладают свойством пластичности [199, 270] и широким спектром дифференцировки. К их свойствам относят также отсутствие экспрессии на их поверхности белков П-го класса комплекса гистосов-местимости и наличие экспрессии целого ряда иммуносупрессорных белков [155, 156, 211]. Эти особенности ММСК позволяют использовать их в разработке схем лечения многих дегенеративных заболеваний человека, в том числе в протезировании с использованием биоматериалов, содержащих ММСК.

Наиболее актуальным на сегодняшний день является восстановление тканей опорно-двигательного аппарата, в частности, хрящевой ткани. При этом известно, что трансплантация собственной и донорской ткани - ограничена возможностями получения и сохранения здоровой и жизнеспособной хрящевой ткани, возможна реакция иммуноотторжения аллотрансплантата, недостаточное обеспечение инфекционной безопасности материала и др. Также известно, что трансплантация алло- и аутохондроцитов ограничена свойствами высокоспециализированных клеток хрящевой ткани, в том числе и ограниченными возможностями хондроцитов к делению, с особенностями пациента и донора, связанные с наличием дегенеративных процессов и отсутствием здоровой хрящевой ткани для получения хондроцитов, а также с низкой эффективностью применения в лечении повреждений хряща высокоспециализированных клеток, приводящие к образованию не функциональной фиброзной хрящевой ткани. В связи с этим разрабатываются различные технологии получения функциональной хрящевой ткани с применением трехмерных носителей в сочетании с ММСК взрослого человека.

В широком применении забор ткани для получения и исследований ММСК производят в основном из костного мозга. Процедура забора костномозговой ткани достаточно болезненна и затруднительна. В связи с этим, является актуальным использование альтернативного и легкодоступного источника для получения ММСК, например, жировая ткань (ЖТ).

В связи с этим, является актуальным получение ММСК из альтернативного и легкодоступного источника - жировой ткани, а также использование их в биотехнологических разработках с целью получения хрящевой ткани для заместительной терапии при лечении заболеваний опорно-двигательного аппарата человека и животных.

В соответствии с вышеизложенным, определились цель и задачи исследований.

Цель диссертационной работы: выделение и характеристика мульти-потентных мезенхимных стромальных клеток из жировой ткани и использование их в создании трехмерных трансплантатов хрящевой ткани.

Для достижения намеченной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать и оптимизировать способ выделения из жировой ткани клеток с фенотипом подобным ММСК и охарактеризовать их;

2. Провести анализ потенций ММСК ЖТ к направленной дифференци-ровке in vitro;

3. Изучить влияние двух индукторов (TGF-pl и TGF- (33) на дифферен-цировку ММСК ЖТ в клетки хрящевой ткани;

4. Оптимизировать существующий способ загрузки клеток в порооб-разный цилиндрический матрикс для создания трёхмерных трансплантатов хрящевой ткани человека in vitro и охарактеризовать их;

5. Провести доклиническое изучение ТТХТ человека в организме им-мунодефицитных мышей (Balb/C nude).

Научная новизна.

Впервые в России разработан простой, недорогой и эффективный метод выделения ММСК из ЖТ человека и их очистки от других клеточных типов, заключающийся в ферментативной обработке ЖТ раствором коллагена-зы в среде Игла в модификации Дюльбекко с последующей градиентной фильтрацией полученной суспензии. Новизна подтверждена патентом РФ №2252252 от 20.05.2005 г.

Впервые разработан метод получения ММСК из ЖТ человека с эффективностью 10б клеток/1 г ЖТ с жизнеспособностью 96%. Охарактеризованы иммунобиологические и морфо-функциональные особенности полученных популяций клеток in vitro. Установлено, что ММСК ЖТ характеризуются высокой адгезивной и клонообразующей способностями и культивируются в питательной среде с низким содержанием глюкозы.

Впервые разработан эффективный способ загрузки трехмерного мат-рикса ММСК ЖТ и подобран оптимальный основной индуктор хондрогенеза TGF-P3.

Впервые созданы ТТХТ на основе различных биоматриксов и ММСК ЖТ и проведены доклинические испытания полученных ТТХТ в организме мышей Balb/C nude. Изучено влияние матриксов на основе коллагена и DD,-LL-полимолочной кислоты (OPLA) на формирование структуры XT. Выявлено, что для получения ТТХТ значительное преимущество имеет пористый матрикс OPLA. In vivo тесты показали, что полученные ТТХТ не токсичны и не туморогенны.

Практическая значимость.

Экспериментальные данные по получению популяции ММСК ЖТ представляют практический интерес для биотехнологии, медицины и ветеринарии, что обусловлено невысокой стоимостью разработанного метода в сочетании с высокой эффективностью. На базе ООО «Бьюти Плаза» создана технологическая линия выделения ММСК из ЖТ.

Разработан метод эффективной загрузки трехмерных матриксов ММСК ЖТ для получения хрящевой ткани с эффективностью 68%.

Подобран эффективный индуктор хондрогенеза - TGF-J33.

Апробация результатов диссертации. Основные результаты диссертационной работы апробированы на: Международном симпозиуме «Herbsttagung der Gesellschaft fixr Biochemie und Molekularbiologie» (Германия, 2004); Международном симпозиуме «Стволовые клетки, регенерация и клеточная терапия» (Санкт-Петербург, 2004); VII-ом Международном конгрессе по клеточной трансплантологии (США, 2004); Российском симпозиуме «Лазерная медицина» (Москва, 2004); П-ом Московском международном биотехнологическом конгрессе (Москва, 2005); Всемирной конференции по тканевой инженерии (Китай, 2005); Ш-ем Московском международном биотехнологическом конгрессе (Москва, 2006); VI-ом Съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Москва, 2006); XI-ом съезде международного общества тканевой инженерии (Нидерланды, 2006); IV-ом Московском международном биотехнологическом конгрессе (Москва, 2007); XI-ом международном форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2007).

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Способ выделения ММСК из жировой ткани, их иммунобиологическая и морфо-функциональная характеристика;

2. Зависимость эффективности дифференцировки ММСК ЖТ в клетки хрящевой ткани от индукторов, представленных трансформирующими факторами роста (TGF-pi и TGF- РЗ);

3. Способ загрузки клеток в порообразный цилиндрический матрикс для создания ТТХТ человека in vitro;

4. Результаты доклинических исследований полученных ТТХТ;

5. Влияние матрицы-носителя на эффективность создания трехмерных структур хрящевой ткани.

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 16 печатных работ, в том числе 5 статей в научных журналах, 11 тезисов в сборниках конференций.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 174 страницах машинописного текста и включают введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждения, выводы, данные о практическом использовании научных результатов, рекомендации по использованию научных выводов, список использованной литературы (293 источника, из которых 4 отечественных и 289 иностранных). Работа содержит 10 таблиц, 21 рисунок, 10 страниц приложений.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Шарифуллина, Светлана Загировна

4. ВЫВОДЫ

1. Разработан способ выделения из жировой ткани человека клеток с фенотипом ММСК. Суть метода заключается в обработке жировой ткани раствором коллагеназы 1-го типа и последовательной градиентной фильтрации. Предложенный способ позволяет получить из 1 г жировой ткани 106 клеток, которые обладают свойствами и признаками сходными с ММСК костного мозга.

2. Установлено, что ММСК ЖТ имеют фибробластоподобную морфологию, обладают высокой адгезивной и клонообразующей способностями. Клетки имеют диплоидный кариотип, который сохраняется на протяжении длительного культивирования (72 генерации), что было подтверждено отсутствием изменений в количественном содержании ДНК в клетках в процессе культивирования.

3. Выявлено, что ММСК ЖТ, как и ММСК КМ, положительно окрашивались антителами к CD44 - 98,9%, CD54 - 89,1%, CD71 - 84,0%, CD73 -99,2%, CD90 - 99,1%, CD105 - 98,7%, CD166 - 98,9%, HLA-ABC - 99,6%. Они были умеренно позитивны по аб-интегрину (CD49f - 40,7%), но высоко позитивны по другим интегринам, таким как pi-интегрин (CD29 - 98,9%), al,2,4-интегринам (CD49a - 87,7%, CD49b - 96,2%, CD49d - 88,0%). Клетки были отрицательны по маркерам, свойственным ранним гемопоэтическим стволовым клеткам - по сиаломуцину (CD34 - 2,6%) и АС133-2 (CD133 - 2,8%), и маркеру более поздних форм этих клеток - общему для лейкоцитов антигену (CD45 - 0,9%), маркеру эндотелиальных клеток CD31 - 2,4%%, а также CD117 - 2,1%, CD 106 - 5,0%, HLA-DR - 3,4%, HLA-DP - 3,8%, HLA-DQ -2,2%.

4. При индукции к дифференцировке in vitro в направлении адипо-, ос-тео-, и хондрогенеза ММСК ЖТ продемонстрировали мультипотентность и дифференцировались в клетки жировой, костной и хрящевой тканей с эффективностью 75%, 68% и 92%, соответственно.

5. Сравнительный анализ эффективности дифференцировки ММСК в клетки хрящевой ткани под действием двух индукторов: TGF-|31 и TGF- |33 показал, что TGF-J33 увеличивает количество клеток положительно окрашенных по аггрекану и коллагену П-го типа на 31% и является более эффективным индуктором хондрогенеза.

6. Разработан способ загрузки клеток в порообразный цилиндрический матрикс. Предложенный способ основан на насыщении матрикса клетками с последующим осаждением, посредством высокоскоростного центрифугирования (300 g), что позволяет добиться не только увеличения эффективности загрузки клеток в матрикс (68%), но и создать плотные межклеточные контакты необходимые для индукции хондрогенеза.

7. Культивирование ММСК в порообразных матрицах-носителях, представленных коллагеном и синтетическим полимером OPLA в хондрогенной среде позволило создать in vitro трехмерные тканевые структуры с активной областью хондрогенеза. Предклинические исследования полученных биотрансплантатов в организме бестимусных мышей Balb/C nude выявили значительное преимущество полимера OPLA.

5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

2. Разработаны и утверждены методические рекомендации «Использование метода выделения ММСК из жировой ткани» и «Способ эффективной загрузки трехмерного носителя ММСК ЖТ» для Клиники «Бьюти Плаза» (Лицензия № 77-01-000343 от 11.08.2005 г. «На применение новых клеточных технологий в здравоохранении»).

3. На базе Клиники «Бьюти Плаза» созданы аппаратурно-технологические линии получения ММСК из жировой ткани.

4. На базе ГУ РОНЦ им. Н.И. Блохина РАМН (договор № 01.01/2005 от 25.01.2005 г. и №10/2005 от 15.07.2005 г.) проведены с положительным эффектом доклинические испытания ТТХТ на иммунодефицитных экспериментальных животных.

5. Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе в ФГУ ВПО МГАВМиБ для студентов факультета медицинской ветеринарии.

6. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. Экспериментальные данные по получению чистой популяции ММСК ЖТ человека имеют научно-практическое значение, что обусловлено невысокой стоимостью разработанного метода в сочетании с высокой эффективностью и рекомендуются использовать специалистам в клеточной биологии, тканевой инженерии, иммунологии, а также специалистам, владеющих основами клеточной биологии, для получения популяции ММСК из ЖТ с целью дальнейшего применения их в биотехнологических разработках и изучению свойств других клеточных типов, в частности клеток крови.

1.5. Заключение

Таким образом, альтернативным и легкодоступным источником ММСК является жировая ткань. Получение жировой ткани, как источника ММСК значительно проще и менее травматично, по сравнению с получением костного мозга. Известно, что ММСК в жировой ткани количественно больше, чем в костном мозге, также можно получить большее количество ткани для выделения ММСК, а качественный анализ этих клеток подтверждает значительное сходство их с ММСК КМ. Особенностями ММСК ЖТ является способность дифференцироваться в клетки тканей мезенхимного происхождения, включая адипо-, остео-, хондро-, мио- и эндотелиоциты [70, 77, 78, 83, 108,178,183, 255, 275,277, 290, 291]. Кроме того, ММСК ЖТ способны также к трансдифференцировке в клетки эктодермального происхождения, такие как нервные клетки [И, 134, 135, 225, 291]. Помимо того, ММСК ЖТ могут быть с высокой эффективностью трансдуцированы с помощью вирусных векторов с целью применения их в генной терапии [77, 78, 88, 98, 180,189, 195]. ММСК ЖТ, также как и ММСК КМ, обладают иммуномодуляторными свойствами, не отторгаются при трансплантации их в организм реципиента и участвуют в регуляции физиологических процессов в организме [80, 141, 158, 207, 222, 259]. Трансплантация ММСК ЖТ приводит к реконструкции гемопоэза, и способствуют приживлению трансплантированных ГСК и различных органов и тканей в организме [26, 64, 111,143], а также к восстановлению кровоснабжения ишемизированных участков тканей [53, 175, 199]. Таким образом, можно заключить, что эти клетки, мультипотентны и могут быть использованы для дальнейших исследований в области физиологии, клеточной биологии, тканевой инженерии и регенерадионной медицины, а также представляют собой клинически полезный источник клеток для клеточной терапии и применения их для доставки определенных терапевтических молекул и генов in vivo. Следовательно, жировая ткань, наряду с костным мозгом, может рассматриваться как еще один источник ММСК и, несомненно, необходимо дальнейшее изучение их особенностей и терапевтический потенциал этих клеток в системе in vitro и in vivo.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена в период с 2003 по 2007 год на кафедре иммунологии ФГОУ ВПО МГАВМиБ и лаборатории тканевой инженерии ООО «Института стволовой клетки», а также на базе ГУ Российского Онкологического Научного Центра им. Н.И. Блохина РАМН (ГУ РОНЦ), в ИБХ им. Ю.А. Овчинникова и М.М. Шемякина РАН и НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.

2.1.1. Оборудование

СОг-инкубатор (Sanyo, Япония), центрифуга с терморегулированием (Eppendorf, Германия), инвертированный микроскоп с флуоресцентной насадкой и подогреваемым предметным столом (Leica, Германия), цифровая фотокамера (Leica, Германия), инвертированный микроскоп (Olympus, Германия), ламинарный бокс II класс защиты (HetoHolten, Дания), сенсорная установка подачи газа (Integra Biosciences, США); автоматические дозаторы 0,5-2 мкл, 2-20 мкл, 20-200 мкл, 200-1000 мкл, 500-5000 мкл (Eppendorf, Германия), автоматический дозатор жидкости (Eppendorf, Германия).

Шейкер (Heidolph, Германия), вортекс (Heidolph, Германия), водяная баня (Precision, Jouan Inc., США), холодильник +4°С/-20°С (Sanyo, Japan), холодильник -70°С (New Brunswick, Англия), весы (Mettler Toledo, Германия), рН-метр (Mettler Toledo, Германия), вытяжной шкаф (Labconco, США), установка для получения дистиллированной и апирогенной воды (MilliPore, Германия), цитофлуориметр FC500 (Beckman Coulter, США), установка для проводки и парафинизации гистологических образцов (Leica, Германия), установка для депарафинизации и автоматической покраски гистологических срезов (Leica, Германия), программируемый микротом (Leica, Германия), микроскоп для гистологии (Zeiss, Германия) и др.

2.1.2. Реактивы и расходные материалы

Химические реагенты и буферные растворы: DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline, фосфатно-солевой буфер в модификации Дюльбекко) (Gibco, США), HBSS (Hank's buffered salt solution, буферный раствор на солях Хэнкса) (Gibco, США), коллагеназа тип I (Gibco, США), DMEM-LG (Dulbecco's modified essential medium low glucose, питательная среда в модификации Дюльбекко с низким содержанием глюкозы) (Gibco, США), DMEM-HG (Dulbecco's modified essential medium high glucose, питательная среда в модификации Дюльбекко с высоким содержанием глюкозы). 1% антибио-тик/антимикотик (penicillin/streptomycin/amphotericinB - 100 МЕ/мл/100 мкг/мл/0,25 мкг/мл) (Gibco, США), 1% антибиотик (penicillin/streptomycin 100МЕ/мл/1 ООмкг/мл) (Gibco, США), 10% FBS (Fetal Bovine Serum, сыворотка плода коров) (HyClone, США), 1% MEM (Non - essential amino acids, раствор заменимых аминокислот) (Gibco, США). Буфер, лизирующий эритроциты (155 мМ NH4CI, 10 мМ КНСОз, 0,1 мМ Na2EDTA), HSA (Human serum albumin, сывороточный альбумин из крови человека) (BioMed, Россия), TGF-pl (Transforming growth factor - beta-1, Трансформирующий фактор роста бета-1) (BD Biosciences, Германия), TGF-J33 (Transforming growth factor - beta-3, Трансформирующий фактор роста бета-3) (R&D Systems, Германия), дексаметазон (KRKA, Словения), аскорбат-2-фосфат (Sigma, США), ITS - комплекс инсулин-трансферрин-селен (1 г/л insulin, 0,67 мг/л sodium selenite, 0,55 г/л transferrin) (Gibco, США), линолевая кислота (Sigma, США), IGF-1 (Insulin-like growth factor - 1, инсулиноподобный фактор роста - 1) (BD Biosciences, Германия). Набор реактивов для окраски с применением DAB-chromogen (Novostain universal detection kit, DAB-kit) (Novocastra Laboratories, Германия), 1% раствор параформальдегида (Sigma, CILIA) в 0,85% NaCl (Baxter, Германия) и др.

Биоматриксы• 3D Collagen Scaffold, 3D OPLA Scaffold (D,D-L,L,-polylactic acid) (BD Biosciences, Германия).

Антитела: первичные - мышиные антитела (mouse anti-human) CD 10, CD13, CD29, CD31, CD34, CD44, CD49a, CD49b, CD49d, CD49f, CD54, CD71, CD73, CD90, CD105, CD106, CD117, CD120a, CD124, CD133, CD166, HLA-ABC, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR-II, Flk-1, Stro-1 (BD Biosciences, Германия), вторичные - козьи антитела, конъюгированные с фикоэритрином (goat anti-mouse PE-conjugated) (BD Biosciences, Германия)

Расходные материалы: фильтры с размером пор 100 и 40 мкм Cell Strainer (BD Biosciences, Германия), флаконы 75 см2 и 150 см2, пробирки для центрифугирования 50 мл и 15 мл, криопробирки 2 мл и 5 мл, 6-ти луночные планшеты, чашки Петри 60 мм и 100 мм, пастеровские пипетки на 2, 5,10, 25 и 50 мл (Costar-Corning, США), салфетки, перчатки и др. Все расходные материалы одноразового использования.

2.1.3. Метод получения ММСК жировой ткани

ММСК выделяли из жировой ткани человека, полученной в условиях операционной в процессе проведения процедуры липоаспирации пациентов с применением местного введения анестезирующего препарата (забор ткани проводили согласно информированному согласию пациента). Жировая ткань от 30-ти здоровых доноров была предоставлена для исследований Клиникой «Бьюти Плаза».

Дальнейшая работа проводилась в лаборатории в стерильном боксе II класса защиты. ММСК ЖТ выделяли согласно методу, описанному P.Zuk [27]. Жировую ткань промывали с помощью буферного раствора DPBS, содержащий 1% антибиотик/антимикотик, затем последовательно механически фрагментировали в присутствии DMEM-LG и обрабатывали ферментативно коллагеназой 1-го типа в конечной концентрации 0,075% в течение 30 минут, при +37°С. Далее проводили осаждение клеток в режиме 1200 g, 10 минут.

Осадок ресуспендировали в буфере, лизирующем эритроциты (160 мМ NH4CI), инкубировали в течение 10 минут и повторяли центрифугирование. Полученную клеточную суспензию ресуспендировали в среде DMEM-LG, дополненной 1% антибиотик/антимикотиком, и пропускали через фильтры 100 мкм для удаления клеточного дебриса. Далее клетки центрифугировали в прежнем режиме, осадок ресуспендировали в среде DMEM-LG, содержащей 1% антибиотик/антимикотик, 10% FBS и 1% MEM и сеяли во флаконы площадью 75 см или 150 см . Смену питательной среды проводили через каждые 3-4 дня.

2.1.4. Морфологический анализ

1. Микроскопия

Морфологическую характеристику ММСК проводили визуально. Анализ прикрепленных клеток проводили с помощью фазово-контрастной микроскопии на инвертированном микроскопе Leica DMIRB. Морфологическую оценку ММСК ЖТ человека проводили визуально с использованием таких критериев, как размер и форма клеток, ядерно-цитоплазматическое соотношение, гомогенность цитоплазмы и наличие ядрышек в ядре. Оценку проводили как в нативных препаратах, так и окрашенных по Гимза.

2. Анализ митотического индекса

Клетки в концентрации 5 х 10 кл/см высевали в культуральную ч.Петри (0=3 0мм) с нанесенной сеткой для подсчета (Costar-Corning, США). Митотический индекс для каждой популяции клеток рассчитывали в фазе логарифмического роста минимум на 3-х образцах как отношение числа митозов к общему количеству клеток (не менее 1 х 106), умноженное на 1000 (в %о) по формуле: п (количество митозов) митотический индекс (%•) =-х 1000

N (общее количество клеток)

3. Время цитогенерации

С "J

Клетки в концентрации 5 х 10 кл/см высевали в культуральную ч.Петри (0=3 0мм) с нанесенной сеткой для подсчета (Costar-Corning, США). Подсчет времени цитогенерации проводилось на 3-х образцах через 24ч. после посева клеток с временным интервалом в 12 часов в течение 3-х суток.

4. Оценка жизнеспособности

Тест на жизнеспособность проводили после ферментативного снятия клеток с культурального флакона. Клетки суспендировали в физиологическом растворе, помещали в ч.Петри для окраски, добавляли эквивалентный объем 4% раствора трипанового синего, экспозиция 5 минут. Полученную клеточную суспензию после окраски переносили в камеру Горяева и производили оценку сразу после ферментативной обработки клеток, далее с интервалом 1-2 часа и 10 ч. в течение суток. В пяти больших квадратах камеры подсчитывали количество окрашенных (погибших) клеток путем прямого микроскопического наблюдения. Процент жизнеспособности клеток в суспензии определяли по стандартной формуле: п (кол-во окраш. клеток в 5-ти кв.) витальность (%) =-ж 100%

N (общее кол-во клеток в 5-ти кв.)

2.1.5. Иммунофенотипирование

Полученные клетки окрашивали первичными антителами (мышиные, mouse anti-human) к поверхностным антигенам: CD 10 (CALLA), CD 13 (APN), CD29 (pi-интегрин), CD31 (РЕСАМ), CD34 (sialomucin), CD44 (hyaluronic acid receptor), CD49a (al-интегрин), CD49b (а2-интегрин), CD49d (a4-интегрин), CD49f (аб-интегрин), CD54, CD71 (Transferrin receptor), CD73 (5'-terminal nucleotidase), CD90 (Thy-1), CD105 (endoglin), CD106 (VCAM-1), CD117 (c-kit), CD 120a, CD124, CD133 (AC133), CD166, HLA-ABC (Major His-tocompability Complex I), HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR (Major Histocompability

Complex II), Stro-1; вторичные антитела - анти-мышиные IgG, полученные в организме козы, конъюгированные с фикоэритрином (goat anti-mouse РЕ-conjugated), анализ проводили с помощью метода проточной цитофлуори-метрии. Окраску проводили по методам, описанных Ziele G. и Colotta F. [292, 293]. Цитофлуориметрический анализ окрашенных клеток проводили на базе Института биорганической химии им. Ю.А. Овчинникова и М.М. Шемякина РАН на приборе Cytomics® FC500 (Beckman Coulter, США).

2.1.6. Кариотипирование

Клеточную культуру высеяли во флакон 150 см2, клетки использовали в стадии логарифмического роста, когда в культуре происходило максимальное количество митозов. Приготовили матричный раствор колхицина (0,1 мг/мл), растворив 0,5 мг в 5 мл стерильной дистиллированной воды (хранить при +4°С). За 2 часа до фиксации добавили во флакон 120-150 мкл матричного раствора колхицина, перемешали, поместили в СОг-инкубатор, инкубировали в течение 2ч. Удалили среду из флакона, осторожно промыли клетки питательной средой (DMEM-LG) без сыворотки, добавили 3-4 мл 0,05% раствора трипсина, инкубировали при покачивании 3-4 минуты сняли в минимальном объеме, залили клеточную суспензию 20 мл 0,56% раствора КС1 (гипотонический раствор), перемешали, поместили в С02-инкубатор, инкубировали в течение 10-15 минут. Разделили клеточную суспензию на 3 алик-воты в 15 мл пробирки для центрифугирования, осадили клетки в режиме 100 g в течение 5 минут. Удалили надосадочную жидкость, добавили 5 мл холодного фиксатора (метанол : ледяная уксусная кислота = 3:1), инкубировали 10 минут при температуре -20°С. Клетки осадили в прежнем режиме, отобрали надосадочную жидкость и добавили дополнительно 5 мл фиксатора, перемешали, инкубировали в течение 30 минут при температуре -20°С. Клетки осадили в прежнем режиме, отобрали надосадочную жидкость и снова добавили фиксатор 5 мл, перемешали пипетированием, хранили при температуре

20°С. Перед приготовлением препарата клетки осадили в прежнем режиме и добавляли свежий раствор фиксатора. Предметные стекла поместили в стакан с водой и охладили при +4°С, 60-70 мкл клеточной суспензии наносили по каплям на влажное холодное стекло, поджигали в пламени горелки, затем досушивали в верхней части пламени.

G-бэндинг: на стекло наносили 0,25% раствор трипсина, выдерживали 30 секунд, промывали дистиллированной водой. Далее проводили окраску по Гимза на фосфатном буфере рН 6,8 в течение 10-15 минут, промывали дистиллированной водой. Кариологический анализ готовых образцов проводили на базе НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.

2.1.7. Анализ клеточного цикла

Фиксация клеток. От культуральной среды клетки были трижды отмыты центрифугированием (7 мин, 450 g) в 3 мл холодного K+/Na+-фосфатного буфера рН7,2, содержащего 0,15М NaCl (DPBS). Далее осадок был зафиксирован холодным 70% этанолом в течение 2 часов при +4°С.

Окрашивание клеток. Зафиксированные клетки были трижды отмыты от фиксатива центрифугированием (7 мин, 450 g) в 3 мл холодного DPBS. После этой процедуры осадок был ресуспендирован в 1,0 мл DPBS, содержащий 40 мкг/мл иодида пропидия (Calbiochem, США) и 0,5 мг/мл рибонук-леазы (Sigma, США), экспозиция - 60 мин. Далее клетки анализировали методом проточной цитометрии.

Цшпометрический анализ. Анализ клеточного цикла диплоидных клеток проводили на лазерном проточном цитофлуориметре Cytomics® FC500 (Beckman Coulter, США), оборудованном аргоновым лазером CYONICS (Uniphase, США) с длинной волны возбуждения 488 нм и мощностью луча 15 мВт. Распределение ДНК по фазам клеточного цикла определяли путем анализа клеток, окрашенных иодидом пропидия, в интегральном канале флуоресценции с использованием барьерных фильтров 488ВК, 488ВР и 625ВР. Для удаления из анализа агрегатов клеток в программу вводили логические ограничения.

Количество клеток находящихся в состоянии спонтанного апоптоза определяли по распределению клеток, окрашенных иодидом пропидия, в логарифмическом канале флуоресценции с использованием барьерных фильтров 488ВК, 488ВР и 625ВР. Полученные гистограммы подвергали математической обработке с использованием программ СХР v. 2.1 (Beckman-Coulter, США) и MultiCycle (Phoenix Flow Systems, США). Анализ клеточного цикла проводили на базе Института биорганической химии им. Ю.А. Овчинникова и М.М. Шемякина РАН на приборе Cytomics® FC500.

2.1.8. Дифференцировка ММСК жировой ткани

1. Адипогенная дифференцировка

Клетки высевали в 6-ти луночный планшет в концентрации 5x10 /см . Через 24ч. проводили смену рабочей среды на дифференцировочную. Состав среды для дифференцировки: DMEM-LG, 10% FBS, 1% антибиотик, 50 мкМ индометацин, 1 мкМ дексаметазон, 0,5 мМ IBMX. Смены среды проводилась через каждые 3 дня, в течение 28 дней.

2. Остеогенная дифференцировка

Посев клеток производили в 6-ти луночный планшет в концентрации 5 А х 10 /см . Через 24 ч. проводили смену рабочей среды на дифференцировочную. Состав среды для дифференцировки: DMEM-LG, 10% FBS, 1% антибиотик, 0,1 мкМ дексаметазон, 10 мМ Р-глицерофосфат, 100 нМ аскорбат-2-фосфат. Смены среды проводилась через каждые 3 дня, в течение 4-х недель.

3. Хондрогенная дифференцировка

2Р-дифференцировка: 1 мл суспензии клеток в концентрации 5 х 106/мл центрифугировали в 15 мл пробирке для центрифугирования при 300 g в течение 7 минут, снимали надосадочную жидкость. Добавляли к сформированному осадку дифференцировочную среду, ресуспендировали, повторяли центрифугирование в том же режиме и помещали на культивирование в С02-инкубатор при +37°С.

ЗР-дифФеренцировка: 1 мл суспензии клеток в концентрации 5 х 106/мл центрифугировали в 50 мл пробирке для центрифугирования при 300 g в течение 7 минут, снимали надосадочную жидкость. В полученный осадок помещали трехмерный матрикс. Добавляли к сформированному осадку дифференцировочную среду и помещали на культивирование в СОг-инкубатор при +37°С.

Состав дифференпировочной среды: DMEM-HG, 1% HSA, 0,1 нМ дексаметазон, 0,2 мМ аскорбат-2-фосфат, 1 х ITS, 10 нг/мл линолевая кислота, 10 нг/мл TGF-J31 или TGF-03, 1% антибиотик. Смена среды проводилась через каждые 3 дня, в течение 4-х недель.

2.1.9. Молекулярный анализ полученных двухмерных структур, при направленной остео- и хондродифференцировке

Направленную дифференцировку in vitro проводили при двумерном культивировании ММСК ЖТ (на пластике - для остеодифференцировки и в осадке - для хондродифференцировки). В качестве контроля были использованы клетки, культивированные в отсутствие индукторов. В процессе диф-ференцировки клетки были проанализированы на экспрессию генов, специфичных для клеток костной и хрящевой тканей методом ПЦР-анализа с применением стадии обратной транскрипции на 14, 21 и 28 сутки после начала индукции.

В качестве маркеров, специфичных для клеток костной ткани были выбраны остеопонтин (osteopontin, OP), костный сиалопротеин (bone sialoprotein И, BSP) и остеокальцин (osteocalcin, ОС), а для клеток хрящевой ткани - коллаген И-го типа (Collagen И), коллаген Х-го типа (Collagen X) и агтрекан (Aggrecan).

Выделение РНК:

Выделение РНК из клеток проводили с использованием набора SV Total RNA Isolation System (Promega, США), согласно рекомендациям производителя. Клетки трипсинизировали и дважды промывали DPBS. К клеточному осадку добавляли 175 мкл лизирующего раствора. К лизату добавляли 350 мкл буфера для разведения (SV Dilution Buffer), аккуратно смешивали и инкубировали 3 мин. при -70°С. Смесь центрифугировали со скоростью 13000 g в течение 10 мин. Супернатант переносили в чистую пробирку и добавляли 200 мкл 95% этанола. Раствор переносили в колонку (spin column assembly) и центрифугировали со скоростью 13000 g в течение 1 мин. Колонку промывали 600 мкл раствора для промывки (SV RNA wash solution), и наносили 50 мкл инкубационной смеси, содержащей ДНКазу I. После 15 мин. инкубации при комнатной температуре, добавляли 200 мкл стоп-раствора (SV DNAse stop solution), центрифугировали со скоростью 13000 g в течение 1 мин., и дважды промывали раствором (SV RNA wash solution) как было описано выше. РНК элюировали в 100 мкл воды свободной от нуклеаз и хранили при -20°С.

Концентрацию выделенной РНК определяли путем измерения оптической плотности при длине волны 260 нм по формуле 10.D. = 40 мкг РНК/мл.

ОТ-ПЦР:

Реакцию обратной транскрипции проводили в объеме 10 мкл. 1 мкг РНК в объеме 6,5 мкл вносили в тонкостенную пластиковую пробирку объемом 0,2 мл, добавляли 250 нг праймера олиго-(17)с1Т (Promega, США), денатурировали при +90°С в течение 2 минут, после чего быстро переносили в лед. К денатурированной РНК вносили 3 мкл реакционной смеси содержащей следующие компоненты: Mo-MuLV буфер (100 мМ трис-HCl (рН 8,3), 30 мМ MgCl2, 750 мМ КС1,100 мМ DTT), по 0,5 мМ каждого из дНТФ, 5 ед. ак. ингибитора РНКаз (Promega, США) и 15 ед. ак. Mo-MuLV обратной транскриптазы (Promega, США). Смесь инкубировали 45 минут при +42°С, затем 10 минут при +94°С.

ПЦР проводили в тонкостенных пластиковых пробирках объемом 0,2 мл. Общий объем реакционной смеси составлял 25 мкл. В реакционную смесь входили следующие компоненты: ПЦР - буфер (85 мМ ацетата калия, 25 мМ трицина (рН 8,7), 8% глицерина, 1 % диметилсульфоксида), 1,5 мМ AcMg, по 0,4 мМ каждого из дНТФ, по 10 пМ прямого и обратного прайме-ров, 2,5 мкл ДНК (продукт обратной транскрипции) и 5 ед. ак. Taq-ДНК по-лимеразы.

Инкубацию реакционной смеси проводили при следующих условиях: предварительная денатурация при +94°С - 3 мин; далее 35 циклов по схеме: 1) денатурация +94°С - 20 сек; 2) отжиг праймеров +55°С - 20 сек; 3) элонгация +72°С - 40 сек. После окончания циклов проводили заключительную элонгацию при +72°С в течение 5 мин.

Электрофорез препаратов ДНК проводили в 2% агарозном геле в трис -ацетатном буфере (ТАЕ) следующего состава: 0,04 М трис - ацетат, 0,002 М ЭДТА рН 8,0 в течение 1 - 2 ч. при 100 В. Перед нанесением пробы на гель к ней добавляли 0,1 объем буфера для нанесения, содержащего 50% глицерина и 0,1% бромфенолового синего.

Для визуализации ДНК гель прокрашивали в течение 10-20 минут в растворе бромистого этидия (5 мкг/мл в ТАЕ). Визуализацию результатов проводили в ультрафиолетовом свете при длине волны 254 нм. Размер фрагментов ДНК определяли с помощью ДНК маркера (Promega, США).

2.1.10. Иммуноцитохимия и иммуногистохнмия

1. Иммуноцитохимия с использованием Novostain Universal Detection Kit(DAB-kit)

Окраску образцов проводили согласно рекомендациям производителя набора «Novostain Universal Detection Kit» (Novocastra Laboratories).

2. Иммуногистохимия

Тканевые трансплантаты, полученные in vitro, трижды промыли в HBSS, добавили 10% нейтральный забуференный раствор формалина, экспозиция - 24 часа при комнатной температуре; промыли от формалина водой и поместили в камеру для проводки и парафинизации образца.

Проводку и парафинизацию провели в следующем режиме: №1-формалин -1 ч., +37°С, № 2 - формалин - 2 ч., +37°С, № 3 - этиловый спирт 70% - Зч., №4 - этиловый спирт 95% - 2 ч., № 5 - этиловый спирт 95% - 2 ч., № 6 - абсолютный этиловый спирт -1 ч., № 7 - ксилол - 1 ч., № 8 - ксилол - 2 ч., № 9 - парафин 50% -1,5 ч., +60°С, № 10 - парафин 50% -1,5 ч., +60°С, № 11 - парафин 50% - 2,5 ч., +60°С. Выполнили срезы и поместили на предметное стекло, выдержали срезы в термостате при +65°С, 12 -18 ч.

Провели депарафинизацию образцов в режиме: № 1 - ксилол - 7 мин., № 2 - ксилол / абсолютный этиловый спирт (1:1) - 5 мин., № 3 - абсолютный этиловый спирт -1-2 мин., № 4 - этиловый спирт 96% -1-2 мин., № 5 - этиловый спирт 95% - 1-2 мин., № 6 - этиловый спирт 70% - 1-2 мин., № 6 - дистиллированная вода - 5 мин.; промыли срезы раствором DPBS.

Окраска антителами с помощью Novostain Universal Detection Kit: добавили раствор DPBS+5%NCL-H-SERUM, инкубировали 10-20 - мин. при комнатной температуре, далее окрашивали по рекомендациям производителя набора «Novostain Universal Detection Kit».

Окраска гематоксилин-эозином: после депарафинизации предметные стекла со срезами поместили в раствор красителя гематоксилин-эозин, инкубировали 10 минут, промыли дистиллированной водой и заключили под покровное стекло с использованием смолы (Novocastra Laboratories).

3. Специфическая окраска клеток

Окраска Oil Red О: клетки в ч.Петри промыли раствором DPBS, зафиксировали ледяным метанолом - 5 минут, добавили 60% изопропанол - инкубировали 5 минут, добавили свежеприготовленный раствор красителя Oil

Red О (0,5% Oil Red в 100% изопропаноле:Н20; в соотношении 3:2, фильтр 0,22 мкм), инкубировали 10 минут, промыли 60% изопропанолом, затем промыли дистиллированной водой, окрасили гематоксилином по Майеру в течение 1 минуты, промыли дистиллированной водой.

Окраска von Kossa: клетки в ч.Петри промыли раствором DPBS, зафиксировали ледяным метанолом - 5-10 минут, промыли дистиллированной водой, добавили 2% водный раствор AgN03, инкубировали 1час под лампой (60 Вт); промыли дистиллированной водой, добавили 2,5% раствор тиосульфата натрия, инкубировали 5 минут при комнатной температуре; промыли дистиллированной водой, окрасили раствором 1% раствор нейтрального красного в течение 1 минуты при комнатной температуре, промыли дистиллированной водой.

Окраска Alizarin Red S: клетки в ч.Петри промыли раствором DPBS, зафиксировали ледяным метанолом - 5-10 минут, добавили 1 мл 40 мМ раствора красителя ализаринового красного (Alizarin Red S) (рН 4,1), инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут, промыли дистиллированной водой.

2.1.11. Доклинические испытания с применением ММСК ЖТ

Доклинические испытания проводились на экспериментальных животных, где опытные группы состояли из 10 мышей (9, самки) Balb/C nude, контрольная группа - из 3 мышей самки) Balb/C nude, возраст экспериментальных животных - 5-6 недель. Введение ММСК ЖТ проводили в хвостовую вену животных. Вводили клеточную суспензию в количестве 2 х 105 клеток в физиологическом растворе. Анализ физиологического распределения и локализации введенных ММСК ЖТ проводили с помощью ПЦР-анализа по Y-хромосоме на 21 сутки после ксенотрансплантации.

2.1.12. Молекулярный анализ локализации ММСК ЖТ в организме экспериментальных животных (по Y-хромосоме)

Молекулярный анализ проводили по ДНК-образцам, выделенных стандартным методом с применением стадии осаждения смесью фенол :хлороформ из тканей экспериментальных животных после ксенотранс-плантации ММСК ЖТ на 21 сутки.

Условия ПЦР (из расчёта на одну пробу): 1.10 х ПЦР-буфер с (NH4)2S04 (MBI Fermentas, кат. номер В37).

2. Раствор MgCb («MBI Fermentas») до конечной концентрации 2 мМ.

3. Фосфаты dNTPs mix (MBI Fermentas), конечная конц. 160 мкМ.

4. Праймеры Ml и М2 (Литех), из раствора с концентрацией 1 О.Е./мл (по 5 мкл)

5. Taq-ДНК полимераза (MBI Fermentas), по 2 ед.

6. Вода из ампул (чистая) до конечного объёма 25 мкл.

Программа ПЦР:

94°С -1 минута, далее 37 циклов амплификации по программе: +94°С -10 секунд, +57°С -12 секунд, +72°С - 5 секунд. После окончания циклов проводили заключительную элонгацию при +72°С в течение 5 минут. Концентрацию выделенной тотальной ДНК определяли путем измерения оптической плотности при длине волны 260 нм по формуле 10.D. = 50 мкг ДНК/мл.

2.1.13. Метод получения трехмерных трансплантатов хрящевой ткани

Трехмерные трансплантаты хрящевой ткани получали методом, рекомендованным производителем биоматриксов - BD Biosciences (Германия). Трехмерный матрикс на основе полимолочной кислоты (OPLA) или коллагена (Collagen) помещали в 15 мл пробирку, 150 мкл клеточной суспензии в концентрации 5 х 104/мл наносили на матрикс и инкубировали при орбитальном покачивании, при +37°С в течение 2 часов. Затем добавляли дифферен-цировочную среду и помещали для культивирования в С02-инкубатор. Состав дифференцировочной среды: DMEM-HG, 1% альбумин (HSA), 0,1 нМ дексаметазон, 0,2 мМ аскорбат-2-фосфат, 1 х ITS, 10 нг/мл TGF-J31, 1% антибиотик. Смена среды проводилась через каждые 3 дня, в течение 4-х недель.

2.1.14. Доклинические испытания - трансплантация ТТХТ на основе ММСК жировой ткани в организм иммунодефицитных мышей

Доклинические испытания проводились на экспериментальных животных, предоставленных ГУ Российским Онкологическим Научным Центром им. Н.И. Блохина РАМН в рамках совместного научного договора. Трехмерные трансплантаты хрящевой ткани, полученные in vitro, эктопически вшивали в область спины иммунодефицитным мышам (Balb/C nude) на срок 8 недель для оценки токсичности и туморогенности. После завершения эксперимента животных усыпили и извлекли трансплантаты. В постановке эксперимента руководствовались требованиями Всемирного общества защиты животных (WSPA) и Европейской конвенции по защите экспериментальных животных.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шарифуллина, Светлана Загировна, Москва

1. Кузнецов С.Л. Гистология, цитология и эмбриология /С.Л. Кузнецов, Н.Н. Мушкамбаров.- М: МИА.- 2005.- С. 544.

2. Пальцев М.А. Межклеточные взаимодействия /М.А. Пальцев, А.А. Иванов. М.: Москва.-1995.- С. 1-224.

3. Тепляшин А.С. Характеристика мезенхимальных стволовых клеток человека, выделенных из костного мозга и жировой ткани /А.С. Тепляшин, С.В. Коржикова, С.З. Шарифуллина и др. // Цитология.- 2005.- Т. 47.- № 2.-С. 130-135.

4. Abe К. Endoderm-specific gene expression in embryonic stem cells differentiated to embryoid bodies /К. Abe, H. Niwa, K. Iwase et al. //Exp. Cell Res.-1996.- V. 229.-P. 27-34.

5. Aggarwal S. Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses /S. Aggarwal, M. Pittenger //Blood.- 2005.- V. 105.- P. 18151822.

6. Amit M. Clonally derived human embryonic stem cell lines maintain pluripotency and proliferative potential for prolonged periods of culture /М. Amit, M. Carpenter, M. Inokuma et al. //Developmental Biology.- 2000.- V. 227.- P. 271-278.

7. Arinzeh T.L. A comparative study of biphasic calcium phosphate ceramics for human mesenchymal stem-cell-induced bone formation /T.L. Arinzeh, T. Tran, J. McAlary et al. //Biomaterials.- 2005.- V. 26.- № 17.- P. 3631-3638.

8. O.Armstrong L. mTert expression correlates with telomerase activity during the differentiation of murine embryonic stem cells /L. Armstrong, M. Lako, J. Lincoln et al. //Mech. Dev.- 2000.- V. 97.- P. 109-116.

9. Ashjian P.H. In vitro differentiation of human processed lipoaspirate cells into early neural progenitors /Р.Н. Ashjian, A.S. Elbarbary, B. Edmonds et al. Plast. Recontstr. Surg.-2003.- V. 111.- P. 1922-1931.

10. Assady S. Insulin production by human embryonic stem cells. /S. As-sady, G. Maor, M. Amit et al. //Diabetes.- 2001.- V. 50.- P. 1691-1697.

11. Aust L. Yield of human adipose-derived adult stem cells from liposuction aspirates /L. Aust, B. Devlin, S. Foster et al. //Cytotherapy.- 2004.- V. 6.- № 1.- P. 7-14.

12. Awad H.A. Chondrogenic differentiation of adipose-derived adult stem cells in agarose, alginate, and gelatin scaffolds. /Н.А. Awad, M.Q. Wickham, H.A. Leddy et al. //Biomaterials.- 2004.- V. 25.- P. 3211-3222.

13. Awad H.A. Effects of transforming growth factor betal and dexa-methasone on the growth and chondrogenic differentiation of adipose-derived stromal cells /Н.А. Awad, Y.D. Halvorsen, J.M. Gimble et al. //Tissue Engineering.-2003.-V. 9.-№ 6.-P. 1301-1312.

14. Awad H.A. Functional properties of biomaterials for cartilage tissue engineering using adipose derived adult stem cells. /Н.А. Awad, M.Q. Wickham, H.A. Leddy et al. //Summer Bioengineering Conference.- 2003.- P. 273-274.

15. Aydelotte M.B. Differences between sub-populations of cultured bovine articular chondrocytes. II. Proteoglycan metabolism /М. Aydelotte, R. Greenhill, K. Kuettner. //Connect. Tissue Res.- 1988.- V. 18.- P. 223-234.

16. Aydelotte M.B. Differences between sub-populations of cultured bovine articular chondrocytes. I. Morphology and cartilage matrix production /М. Ay-delotte, K. Kuettner//Connect. Tissue Res.- 1988.- V. 18.- P. 205-222.

17. Bacou F. Transplantation of adipose tissue-derived stromal cells increases mass and functional capacity of damaged skeletal muscle. /F. Bacou, R.B. Andalousi, P.A. Daussin et al. // Cell Transplant.- 2004.- V. 13.- P. 103— 111.

18. Badylak S. F. The extracellular matrix as a scaffold, for tissue reconstruction /S.F. Badylak //. Cell & Developmental Biology.- 2002.- V. 13.- P. 377-383.

19. Bain G. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro /G. Bain, D. Kitchens, M. Yao et al. //Dev. Biol.-1995.- V. 168.- P. 342-357.

20. Baker R.K. Embryonic stem cells and in vitro muscle development /R.K. Baker, G.E. Lyons //Curr. Top. Dev. Biol.- 1996,- V. 33.- P. 263-279.

21. Baron F. Nonmyeloablative allogeneic hematopoietic stem cell transplantation /F. Baron, Y. Beguin. // Journal of hematotherapy & stem cell research.-2002.- V. 11.-P. 243-263.

22. Bartholomew A. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo /А. Bartholomew, C. Sturgeon, M. Siatskas et al. //Exp. Hematol.- 2002.- V. 30.- P. 42-48.

23. Bennett J. Adipocytic cells cultured from marrow have osteogenic potential /J. Bennett, C. Joyner, J. TrifFitt et al. //J. Cell Sci.- 1991.- V. 99.- № 1.- P. 131-139.

24. Benson M.D. Identification of a homeodomain binding element in the bone sialoprotein gene promoter that required for its osteoblasts-selective expression /М. Benson, J. Bargeon, G. Xiao et al. //J. Biol. Chem.- 2000.- V. 275.- P. 13907-13917.

25. Benya P.D. Dedifferentiated chondrocytes reexpress the differentiated collagen phenotype when cultured in agarose gels /Р. Benya, J. Shaffer //Cell.-1982.- V. 30.- P. 215-224.

26. Benya P.D. Independent regulation of collagen types by chondrocytes during the loss of differentiation function in culture /Р. Benya, S. Padilla, M. Nimni //Cell.- 1978.-V. 15.-P. 1313-1321.

27. Beresford J.N. 1,25-Dihydroxyvitamin D3 and human bone-derived cells in vitro: effects on alkaline phosphotase, type I collagen and proliferation /J. Beres-ford, J. Galagher, R. Russel // Endocrinology.- 1986.- V. 119.- P. 1776-1785.

28. Beresford J.N. Osteogenic stem cells and the stromal system of bone and marrow /J.N. Beresford //Clin. Orthop. Res.- 1989.- V. 240.- P. 270-280.

29. Betrea H. Chondrocyte differentiation of human adipose-derived adult stem cells in elastin-like polypeptide. /Н. Betrea, S.R. Onga, F. Guilaka et al. //Biomaterials.- 2006.- V. 27.- P. 91-99.

30. Bianco P. Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential applications /Р. Bianco, M. Riminucci, S. Gronthos et al. //Stem cells.- 2001.- V. 19.- P. 180-192.

31. Bieback К. Critical parameters for the isolation of mesenchymal stem cells from umbilical cord blood /К. Bieback, S. Kern, H. Kliiter et al. //Stem Cells.- 2004.- V. 22.- P. 625-634.

32. Bjornson C.R. Turning brain into blood: a hematopoietic fate adopted by adult neural stem cells in vivo /C.R. Bjornson, R.L. Rietze, B.A. Reunolds et al. //Science.- 1999.- V. 283.- P. 534-537.

33. Bonaventure J. Reexpression of cartilage-specific genes by dedifferentiated human articular chondrocytes cultured in alginate beads /J. Bonaventure, N. Kadhom, L. Cohen-Solal et al. // Exp. Cell Res.- 1994.- V. 212.- P. 97-104.

34. Bosch X. Ethics group advises caution before EC issues stem-cell line patents /X. Bosch //The Lancet.- 2002.- V. 359.- P. 1839.

35. Boschert M.T. Analysis of lipocyte viability after liposuction /М.Т. Boschert, B. Beckert, C. Puckett et al. //Plast. Reconstr. Surg.- 2002.- V. 109.- № 2.- P. 761-767.

36. Bradley A. Stem cell medicine encounters the immune system /А. Bradley, E.M. Bolton, R.A. Pedersen //Nature Reviews Immunology.- 2002.- V. 2.- P. 859-872.

37. Braselton T.R. From marrow to brain: expression of neuronal pheno-types in adult mice /T.R. Braselton, F.M. Rossi, G.I. Keshet et al. //Science.-2000.-V. 290.-P. 1775-1779.

38. Breinan H.A. Autologous chondrocyte implantation in a canine model: change in composition of reparative tissue with time /Н. Breinan, T. Minas, H. Hsu et al. //J. Orthop. Res.- 2001.- V. 19.- P. 482-492.

39. Breinan H.A. Effect of cultured autologous chondrocytes on repair of chondral defects in a canine model /Н. Breinan, T. Minas, H. Hsu et al. //J. Bone Joint Surg. Am.-1997.- V. 79.- P. 1439-1451.

40. Brivanlou A. Stem cells. Setting standards for human embryonic stem cells /А. Brivanlou, F. Gage, R. Jaenisch et al. //Science.- 2003.- V. 300.- № 5621.-P. 913-916.

41. Bruder S.P. Bone regeneration by implantation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells /S.P. Bruder, A.A. Kurth, M. Shea et al. //J Orthop Res.-1998.- V. 16.- № 2.- P. 155-162.

42. Brzoska M. Epithelial differentiation of human adipose tissue-derived adult stem cells /М. Brzoska, H. Geiger, S. Gauer et al. //Biochem. Biophys. Res. Commun.- 2005.- V. 330.- P. 142-150.

43. Buckwalter J.A. Articular cartilage: tissue design and chondrocyte-matrix interactions /J. Buckwalter, H. Mankin //Instr. Course Lect.- 1998.- V. 47.-P. 477-486.

44. Campagnoli C. Identification of mesenchymal stem/progenitor cells in human first-trimester fetal blood, liver, and bone marrow /С. Campagnoli, I. Roberts, S. Kumar et al. //Blood.- 2001.- V. 98.- P. 2396-2402.

45. Cao B. Muscle stem cells differentiate into hematopoietic lineage but retain myogenic potential /В. Cao, B. Zheng, R. Jankowski et al. //Nat. Cell Biol.-2003.- V. 5.-P. 640-646.

46. Cao Y. Human adipose tissue-derived stem cells differentiate into endothelial cells in vitro and improve postnatal neovascularization in vivo /Y. Cao, Z. Sun, L. Liao et al. //Bioch. Biophys. Res. Commun.- 2005.- V. 332.- P. 370—379.

47. Caplan A.I. Mesenchymal stem cells: building blocks for molecular medicine in the 21st century /А.1. Caplan, S.P. Bruder//Trends. Mol. Med.- 2001.-V. 7.-P. 259-264.

48. Caplan A.I. Principles of cartilage repair and regeneration /А.1. Caplan, M. Elyaderani, Y. Mochizuki et al. //Clin. Orthop.- 1997.- V. 342.- P. 254-269.

49. Carpenter M. Enrichment of neurons and neural precursors from human embryonic stem cells /М. Carpenter, M. Inokuma, J. Denham et al. //Exp. Neurol.-2001.-V. 172.-P. 383-397.

50. Choia Yu S. Adipose tissue engineering using mesenchymal stem cells attached to injectable PLGA spheres /Yu S. Choia, Si-N. Parka, H. Suh // Biomate-rials.- 2005.- V. 26.- P. 5855-5863.

51. Clack J.M. Stem cells in epithelial tissues /J.M. Clack //Science.- 2000.-V. 287.-P. 1431-1433.

52. Clarce D. Differentiation potential of adult stem cells ID. Clarce, J. Frisen //Current Opin. in Genet, and Develop.- 2001.- V. 11.- P. 575-580.

53. Clarke D.L. Generalized potential of adult neural stem cells /D.L. Clarke, C.B. Johansson, J. Wibertz et al. //Science.- 2000.- V. 288.- P. 1660-1663.

54. Colotta F. Rapid killing of actinomycin D-treated tumor cells by human mononuclear cells. Effectors belong to the monocyte-macrophage lineage /F. Colotta, G. Pery, A. Villa et al. //J. Immunol.- 1984.- V. 132.- № 2.- P. 936-944.

55. Colter D.C. Identification of a subpopulation of rapidly self-renewing and multipotential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells /D.C. Colter, I. Sekiya, D.J. Prockop //Proc. Natl. Acad. Sci.- 2001.- V. 98.- P. 7841-7845.

56. Compton C.C. /С. Compton, J. Gill et al. //Lab. Invest.- 1989.- V. 60.-P. 600-612.

57. Cousin B. Reconstitution of lethally irradiated mice by cells isolated from adipose tissue /В. Cousin, M. Andre, E. Arnaud et al. //Biochemical and Biophysical Research Communications.- 2003.- V. 301.- P. 1016-1022.

58. Cowan C.M. Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects /С. Cowan, Y. Shi, O. Aalami et al. //Nat. Biotechnol.- 2004.-V. 22.- P. 560-567.

59. Daley G.Q. Ethics. The ISSCR guidelines for human embryonic stem cell research /G.Q. Daley, R.L. Ahrlund, J.M. Auerbach et al. //Science.- 2007,- V. 315.-№5812.- P. 603-604.

60. Green R.M. Determining moral status. In the human embryo research debate /R.M. Green //Oxford University Press.- 2001.- Chap. 2.

61. De Bari C. Multipotent mesenchymal stem cells from adult human synovial membrane /С. De Bari, F. Dell'Accio, P. Tylzanowski et al. //Arthritis & Rheumatism.- 2001.- V. 44.- № 8.- P. 1928-1942.

62. De Ugarte D. Comparison of Multilineage cells from human adipose tissue and bone marrow /D. De Ugarte, K. Morizono, A. Elbarbaiy et al. //Cells Tissues Organs.- 2003.- V. 174.- P. 101-109.

63. Di Berardino M. Animal cloning the route to new genomics in agriculture and medicine /М. Di Berardino //Differentiation.- 2001.- V. 68.- P. 67-83.

64. Di Nicola M. Human bone marrow stromal cells suppress T-lymphocyte proliferation induced by cellular or nonspecific mitogenic stimuli /М. Di Nicola, C. Carlo-Stella, M. Magni et al. //Blood.- 2002.- V. 99.- P. 3838-3843.

65. Djouad F. Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cells favors tumor growth in allogeneic animals /F. Djouad, P. Plence, C. Bony et al. //Blood.-2003.-V. 102.-P. 3837-3844.

66. Domm C. RedifFerentiation of dedifferentiated bovine articular chondrocytes in alginate culture under low oxygen tension /С. Domm, M. Schiinke, K. Christesen et al. //Osteoarthritis Cartilage.- 2002.- V. 10.- P. 13-22.

67. Donovan P.J. The end of the beginning for pluripotent stem cells /P.J. Donovan, J. Gearhart //Nature.- 2001.- V. 414.- P. 92-97.

68. Dorheim M.A. Osteoblastic gene expression during adipogenesis in hematopoietic supporting murine bone marrow stromal cells /М.А. Dorheim, M. Sullivan, V. Dandapani et al.//J. Cell Physiol.- 1993.-V. 154.-P. 317-328.

69. Dragoo J. Bone induction by BMP-2 transduced stem cells derived from human fat /J. Dragoo, J. Choi, J. Lieberman et al. //J. Orthop. Res.- 2003.- V. 21.-P. 622-629.

70. Dragoo J. Tissue-engineered cartilage and bone using stem cells from human infrapatellar fat pads. /J. Dragoo, B. Samimi, M. Zhu et al. //J. Bone Joint Surg. Br.- 2003.- V. 85.- P. 740-747.

71. Dusy P. R. Osf-2/CBFA-l: a transcriptional activator of osteoblasts differentiation /Р. Dusy, V. Zhang, A. Geoffroy et al. /Cell.- 1997.- V. 89.- P. 747754.

72. E1-Badri N.S. Mesenchymal stem cells in autoimmune disease /N.S. El-Badri, A. Maheshwari, P.R. Sanberg //Stem Cells & Development.- 2004.- V. 13.-P. 463-472.

73. Erices A. Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood /А. Erices, J. Minguell, P. Conget et al. //Br. J. Haematol.- 2000.- V. 109.- P. 235242.

74. Erickson G. Chondrogenic potential of adipose tissue-derived stromal cells in vitro and in vivo /G. Erickson, J.M. Gimble, D.M Franklin et al. //Biochem. Biophys. Res. Commun.- 2002,- V. 290.- P. 763-769.

75. Ethics committee of American fertility society. Ethical considerations of the new reproductive technologies /Fertil. Steril.- 1986.- V. 46.- № 3.- P. 1S-94S.

76. Evans M. J. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos /M.J. Evans, M.H. Kaufman //Nature.-1981.- V. 292,- P. 154-156.

77. Fassas A. Hematopoietic stem cell transplantation for multiple sclerosis. A retrospective multicenter study /А. Fassas, J. Passweg, A. Anagnostopoulos et al. //J. Neurol.- 2002.- V. 249.- P. 1088-1097.

78. Fibbe W. Mesenchymal stem cells and Hematopoietic stem cell transplantation /W. Fibbe, W. Noort //Ann. N.Y. Acad. Sci.- 2003.- V. 996- P. 235-244.

79. Forsyth N.R. Telomerase and differentiation in multicellular organisms: turn it off, turn it on, and turn it off again /N.R. Forsyth, W.E. Wright, J.W. Shay //Differentiation.- 2002.- V. 69.- P. 188-197.

80. Friedenstein A.J. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs. /А. Friedenstein, J. Gorskaja, N. Kulagina //Exp. Hematol.-1976,- V. 4.-№5.- P. 267-274.

81. Friedenstein A. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues /А. Friedenstein, K. Petrakova, A. Ku-rolesova et al. //Transplantation.- 1968.- V. 6.- P. 230.

82. Friedenstein A. Precursor cells of mechanocytes /A.J. Friedenstein //Int. Rev. Cytol.- 1976.- V. 47.- P. 327-359.

83. Friedenstein A. Stromal cells responsible for transferring the microenvi-ronment of the hemopoietic tissues. Cloning in vitro and retransplantation in vivo /А. Friedenstein, R. Chaliakhyan, N.V. Latsinik et al. //Transplantation.- 1974.- V. 17.-P. 331.

84. Gadzag A.R. Alternative to autogenous bone graft: efficacy and indications /A.R Gadzag, J.M. Lane, D. Glaser et al. //J. Am. Acad. Orthop. Surg.-1995.- V.3.-P. 1-8.

85. Gallico G.G. Permanent coverage of large burn wounds with autologous cultured human epithelium /G. Gallico, N. O'Connor, C. Compton et al. //N. Engl. J.Med.-1984.- V.311.-P. 448-451.

86. Gaustad K.G. Differentiation of human adipose tissue stem cells using extracts of rat cardiomyocytes /K.G. Gaustad, A.C. Boquest, B.E. Anderson et al. //Biochem. Biophys. Res. Commun.- 2004,- V. 314.- P. 420-427.

87. Ghadially F.N. Long-term results of superficial defects in articular cartilage. A scanning electron microscope study /F.N. Ghadially, I. Thomas, A.F. Ory-schak et al. //J. Pathol.-1977.- V. 121.- 213-217.

88. Gimble J. Adipose-derived adult stem cells: isolation, characterization, and differentiation potential /J. Gimble, F. Guilak //Cytotherapy.- 2003.- V. 5.- P. 362-369.

89. Godbey W.T. A novel use centrifugal force for cell seeding into porous scaffolds /W.T. Godbey, B.S. Hindy, M.E. Sherman et al. //Biomaterials.- 2004.-V. 25.- P. 2799-2805.

90. Goodwin H. Multilineage differentiation activity by cells isolated from umbilical cord blood: expression of bone, fat, and neural markers /Н. Goodwin, A. Bicknese, S. Chien et al. //Biol. Blood Marrow Transplant.- 2001.- V. 7.- P. 581588.

91. Greider C.W. Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts /C.W. Greider, E.H. Blackburn //Cell.- 1985.- V. 43.-P. 405-413.

92. Gronthos S. Molecular and cellular characterisation of highly purified stromal stem cells derived from human bone marrow /S. Gronthos, A.C Zannet-tino., S.J. Hay et al. //J. Cell Sci.- 2003.- V. 116.- P. 1827-1835.

93. Gronthos S. Surface protein characterization of human adipose tissue-derived stromal cells /S. Gronthos, D. Franklin, H. Leddy et al. //J. Cell Physiol.-2001.- V. 189.-P. 54-63.

94. Gronthos S. The STRO-1+ fraction of adult human bone marrow contains the osteogenic precursors /S. Gronthos, S. Graves, S. Ohta et al. //Blood.-1994.-V. 84.- P. 4164-4173.

95. Guilak F. Adipose-derived adult stem cells for cartilage tissue engineering /F. Guilak, H.A Awad., B. Fermor et al. //Biorheology.- 2004.- V. 41.- P. 389-399.

96. Halberstadt C. A hydrogel material for plastic and reconstructive applications injected into the subcutaneous space of a sheep /С. Halberstadt, C. Austin, J. Rowley et al. //Tissue Eng.- 2002.- V. 8.- P. 309-319.

97. Halvorsen Y. Extracellular matrix mineralization and osteoblast gene expression by human adipose tissue-derived stromal cells /Y. Halvorsen, D. Franklin, A. Bond et al. //Tissue Eng.- 2001.- V. 7.- P. 729-741.

98. Halvorsen Y.-D. /Adipose-derived stromal cells their utility and potential in bone formation. /Y.-D. Halvorsen, W. Wilkison, J. Gimble //Int. J. Obes. Rel. Metab. Dis.- 2000.- V. 24.- P. S 41-44.

99. Han Q. Allogeneic adult stem cells establish long-term residence in recipient tissues and facilitate skin transplantation /Q. Han, W. Deng, C. Li et al. // Exp. Hematol.- 2003.- V. 31.- P. 158.

100. Hauner H. Promoting effect of glucocorticoids on the differentiation of human adipocyte precursor cells cultured in a chemical defined medium /Н. Hauner, G. Entenmann, M. Wabitsch et al. //J. Clin. Invest.- 1989.- V. 84.- P. 16631670.

101. Hayflick L. The limited in vitro lifetime of human diploid cell strains /L. Hayflick //Exp. Cell Res.- 1965.- V. 37.- P. 614-636.

102. Hayflick L. The serial cultivation of human diploid cell strains /L. Hayflick, P. Moorhead //Exp. Cell Res.-1961.- V. 25.- P. 585-621.

103. Haynesworth S. Cell surface antigens on human marrow-derived mesenchymal cells are detected by monoclonal antibodies /S.E. Haynesworth, M.A. Baber, A.L. Caplan //Bone.- 1992.- V. 13.- P. 69-80.

104. Helg C. Renal transplantation without immunosuppression in a host with tolerance induced by allogeneic bone marrow transplantation /С. Helg, B. Chapuis, J.F. Bolle et al. //Transplantation.- 1994.- V. 58.- P. 1420-1422.

105. Hicok K. Development and characterization of conditionally immortalized osteoblast precursor cell lines from human bone marrow stroma /К. Hicok, T. Thomas, F. Gori et al. //J. Bone Miner. Res.- 1998.- V. 13.- P. 205-217.

106. Hicok K.C. Human adipose derived adult stem cells produce osteoid in vivo /К. Hicok, T. du Laney, Y. Zhou et al. //Tissue Engineering.- 2004.- V. 10.-P. 371-380.

107. Holtzer H. Cell lineages, stem cells and the quantal cell cycle concept /Н. Holtzer //Stem cells and tissue homeostasis.- 1978.- V. 1.- P. 28.

108. Holy C.E. Optimizing the sterilization of PLGA scaffolds for use in tissue engineering /С.Е. Holy, C. Cheng, J.E. Davies et al. //Biomaterials.- 2001.- V. 22,- P. 25-31.

109. Hong L. Ex vivo adipose tissue engineering by human marrow stromal cell seeded gelatin sponge /L. Hong, I. Peptan, P. Clark et al. //Annals of Biomedical Engineering.- 2005.- V. 33.- № 4.- P. 511-517.

110. Horwitz E.M. Clarification of the nomenclature for MSC: the International Society for Cellular Therapy position statement /Е.М. Horwitz, K. Le Blanc, M. Dominici et al. //Cytotherapy.- 2005.- V. 7.- № 5.- P. 393-395.

111. Huang J. Chondrogenic potential of progenitor cells derived from human bone marrow and adipose tissue: a patient-matched comparison /J. Huang, N. Kazrni, M. Durbhakula et al. //Journal of Orthopaedic Research.- 2005.- V. 23,- P. 1383-1389.

112. Im G. Do adipose tissue-derived mesenchymal stem cells have the same osteogenic and chondrogenic potential as bone marrow-derived cells? /G. Im, Y. Shin, K. Lee //Osteoarthritis and cartilage.- 2005.- V. 13.- № 10.- P. 845-853.

113. Ishaug S.L. Bone formation by three-dimensional stromal osteoblast culture in biodegradable polymer scaffolds /S.L. Ishaug, G.M. Crane, M. Miller et al. //J. Biomed. Mater. Res.- 1997.- V. 36.- P. 17-28.

114. Ishaug S.L. Osteoblast function on synthetic biodegradable polymers /S.L. Ishaug, M.J. Yaszemski, R. Bizios et al. //J. Biomed. Mater. Res.- 1994.- V. 28.- P. 1445-1453.

115. Jadlowiec J.A. Bone tissue engineering: Recent advances and promising therapeutic agents /J.A. Jadlowiec, A.B. Celil, J.O. Hollinger //Expert Opin. Biol. Ther.- 2003.- V. 3.- P. 409-423.

116. Jahoda C.A.B. Hair follicle dermal sheath cells: unsung participants in wound healing. /С.А.В. Jahoda, A.J. Reynolds //Lancet.- 2001.- V. 358.- P. 14451448.

117. Janes S.M. Epidermal Stem Cells /S.M. Janes, S. Lowell, C. Hutter //J. Pathol.- 2002.- V. 197.- P. 479-491.

118. Jiang B.N. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow /Y. Jiang, B.N. Jahagirdar, R.L. Reinhardt et al. //Nature.- 2002.- V. 418.-P. 41-49.

119. Jiang Y. Multipotent progenitor cells can be isolated from postnatal murine bone marrow, muscle, and brain /Y. Jiang, B. Vaessen, T. Lenvik et al. //Exp. Hematol.- 2002.- V. 30.- P. 896-904.

120. Jiang Y. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow /Y. Jiang, B. Jahagirdar, R. Reinhardt et al. //Nature.- 2002.- V. 418.- P. 41-49.

121. Kang S.K. Improvement of neurological deficits by intracerebral transplantation of human adipose tissue-derived stromal cells after cerebral ischemia in rats /S.K. Kang, D.H. Lee, Y.C. Bae et al. //Exp. Neurol.- 2003.- V. 183.- P. 355366.

122. Kang S.K. Interactions between human adipose stromal cells and mouse neural stem cells in vitro /S.K. Kang, E.S. Jun, Y.C. Bae et al. //Brain Res. Dev. Brain. Res.- 2003.- V. 145.- P. 141-149.

123. Katz A. Cell surface and transcriptional characterization of human adipose-derived adherent stromal (hADAS) cells /А. Katz, A. Tholpady, S. Tholpady et al. //Stem Cells.- 2005.- V. 23.- P. 412-423.

124. Katz B.-Z. Physical state of the extracellular matrix regulates the structure and molecular composition of cell-matrix adhesions /В.-Z. Katz, E. Zamir, A. Bershadsky et al. //Molecular Biology of the Cell.- 2000.- V. 11.- P. 1047-1060.

125. Kawada H. Bone marrow origin of hematopoietic progenitors and stem cells in murine muscle /Н. Kawada, M. Ogawa //Blood.- 2001.- V. 98.- P. 20082013.

126. Kim J. Dopamine neurons derived from embryonic stem cells function in an animal model of Parkinson's disease /J. Kim, J. Auerbach, J. Rodriguez-Gomez et al. //Nature.- 2002.- V. 418.- P. 50-56.

127. Kim Т.К. Alternative splicing of type II procollagen gene in the dedif-ferentiation of rat epiphyseal chondrocytes serially cultured in monolayer /Т. Kim, J. Park, M. Lee et al. //Connect. Tissue Res.- 2002.- V. 43.- P. 56-62.

128. Klyshnenkova E. Human mesenchymal stem cells induce unresponsiveness in preactivated but not naive alloantigen specific T-cells /Е. Klyshnenkova, V. Shustova, J. Mosca et al. //Exp. Hematol.- 1999.- V. 27.- P. 122.

129. Knudson C.B. Cartilage proteoglycans /С.В. Knudson, W. Knudson //Cell and Develop. Biol.- 2001.- V. 12.- P. 69-78.

130. Kogler G. A new human somatic stem cells from placental cord blood with intrinsic pluripotent differentiation potential /G. Kogler, S. Sensken, J. Airey et al. //J. Exp. Med.- 2004.- V. 200.- P. 123-135.

131. Коп E. Autologous bone marrow stromal cells loaded onto porous hy-droxyapatite ceramic accelerate bone repair in critical-size defects of sheep long bones /Е. Kon, A. Muraglia, A. Corsi et al. //J Biomed Mater Res.- 2000,- V. 49.-№3.-P. 328-337.

132. Krai J. Development of a human adipocyte synthetic polymer scaffold. /J. Krai, D. Crandall //Plast. Reconstr. Surg.- 1999.- V. 104.- P. 1732-1738.

133. Krampera M. Bone marrow mesenchymal stem cells inhibit the response of nai've and memory antigen-specific T cells to their cognate peptide /М. Krampera, S. Glennie, J. Dyson et al. //Blood.- 2003.- V. 101.- P. 3722-3729.

134. Krause D.S. Multi-organ, multi-lineage engraftment by a single bone marrow-derived stem cell /D.S. Krause, N.D. Theise, M.I. Collector et al. //Cell.-2001.-V. 105.-P. 369-377.

135. Kuriwaka M. Optimum combination of monolayer and three-dimensional cultures for cartilage-like tissue engineering /М. Kuriwaka, M. Ochi, Y. Uchio et al. /tissue Eng.- 2003.- V. 9.- P. 41-49.

136. Kuznetsov S. Circulating skeletal stem cells IS. Kuznetsov, M. Mankani, S. Gronthos et al.//J. Cell Biol.-2001.-V. 153.-P. 1133-1140.

137. Langer R. Tissue engineering /R. Langer, J.P. Vacanti //Science.-1993.- V. 260.- P. 920-926.

138. Laurencin C.T. Tissue engineering: orthopedic application /С.Т. Laur-encin, A. Ambrosio, M.D. Borden. //Annu. Rev. Biomed. Eng.- 1999.- V. 1.- P. 19-46.

139. Lavker M.V. Epidermal stem cell: properties, markers and location /M.V. Lavker, T.T. Sang //Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2000.- V. 97.- № 25.- P. 13473-13475.

140. Le Blanc K. HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells /К. Le Blanc, C. Tammik, K. Rosendahl et al. //Exp. Hematol.- 2003.- V. 31.- P. 890-896.

141. Le Blanc K. Immunomodulatory effects of fetal and adult mesenchymal stem cells /К. Le Blanc //Cytotherapy.- 2003.- V. 6.- P. 485-489.

142. Le Blanc K. Mesenchymal stem cells: progress toward promise /К. Le Blanc, M.F. Pittenger //Cytotherapy.- 2005.- V. 7.- № 1.- P. 36-45.

143. Leboy P.S. Dexamethasone induction in osteoblasts in mRNAs in rat marrow stromal cell culture /Р. Leboy, J. Beresford, C. Devlin et al. //J. Cell Physiol.-1991.-V. 146.-P. 370-378.

144. Leddy H.A. Molecular diffusion in articular cartilage and tissue engineered cartilage contructs /Н.А. Leddy, H.A. Awad, M.Q. Wickham et al. //Trans. Orthop. Res. Soc.- 2003.- V. 28.- P. 289.

145. Lendeckel S. Autologous stem cells (adipose) and fibrin glue used to treat widespread traumatic calvarial defects: case report /S. Lendeckel, A. Jodicke, P. Christophis et al. //J. Craniomaxillofac. Surg.- 2004.- V. 32.- P. 370-373.

146. Lennon D.P. Cultivation of rat marrow-derived mesenchymal stem cells in reduced oxygen tension: effects on in vitro and in vivo osteochondrogene-sis /D.P. Lennon, J.M. Edmison, A.I. Caplan //J. Cell Physiol.- 2001.- V. 187.- P. 345-355.

147. Li A. Identification and isolation of candidate human keratinocyte stem cells based on cell surface phenotype /А. Li, P.G. Simmons, P. Kaur //Proc. Natl. Acad. Sci. US.-1998.- V. 95.- P. 3902-3907.

148. Li W.J. Multilineage differentiation of human mesenchymal stem cells in a three-dimensional nanofibrous scaffold /W.J. Li, R. Tuli, X. Huang et al. //Biomaterials. 2005.- V. 26.- P. 5158-5166.

149. Lo B. Medicine. Consent from donors for embryo and stem cell research /В. Lo, V. Chou, M. Cedars et al. //Science.- 2003.- V. 301.- P. 921.

150. Lodie T.A. Systematic analysis of reportedly distinct populations of multipotent bone marrow-derived stem cells reveals a lack of distinction /Т.А. Lodie, C.E. Blickarz, T.J. Devarakonda et al. //Tissue Engineering.- 2002.- V. 8.- P. 739-751.

151. Ma D.R. The location, molecular characterisationcharacterization and multipotency of hair follicle epidermal stem cell. /D.R. Ma, E.N. Yang, S.T. Lee // Ann. Acad. Med. Singapore.- 2004.- V. 33.- P. 784-788.

152. Mankin H.J. The response of articular cartilage to mechanical injury /H.J. Mankin. //J.Bone Joint Surg. Am.- 1982.- V. 64,- P. 460-466.

153. Marmont A.M. Immunoablation followed or not by hematopoietic stem cells as an intense therapy for severe autoimmune diseases: new perspectives, new problems. /А. Marmont//Haematologica.- 2001.- V. 86.- P. 337-345.

154. Martin G.R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. /G. Martin // Proc Natl Acad Sci U S A.-1981.- V. 78.- P. 7634-7638.

155. McKinnell R.G. The biology of cloning: history and rationale / R.G. McKinnell, M.A. Di Berardino //Bioscience.- 1999.- V. 49.- P. 875-885.

156. McKinney-Freeman S. Muscle-derived hematopoietic stem cells are hematopoietic in origin. /S. McKinney-Freeman, K. Jackson, F. Camargo et al. //Proc. Natl. Acad. Sci.- USA. 2002.- V. 99.- P. 1341-1346.

157. Medawar P.R. The cultivation of adult mammalian skin epithelium in vitro /Р. Medawar//Quart. J. Microsc. Sci.- 1948.- V. 89,- P. 187-196.

158. Meinel L. Engineering cartilage-like tissue using human mesenchymal stem cells and silk protein scaffolds /L. Meinel, S. Hofman, V. Karageorgiou et al. //Biotechnology and Bioengineering.- 2004.- V. 88.- P. 379-391.

159. Miranville A. Improvement of postnatal neovascularization by human adipose tissue-derived stem cells /А. Miranville, C. Heeschen, C. Sengenes et al. //Circulation.- 2004.-P. 110.-P. 349-355.

160. Mitchell J. The immunophenotype of human adipose derived cells: temporal changes in stromal- and stem cell-associated markers. /J. Mitchell, K. Mcintosh, S. Zvonic et al. //Stem Cells.- 2005.- V. 1.- P. 1-31.

161. Mitchell J.B. Immunophenotype oh human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated markers /J.B. Mitchell, K. Mcintosh, S. Zvonic et al. //Stem Cells.- 2006.- V. 24.- P. 376-385.

162. Mizuno H. Myogenic differentiation by human processed lipoaspirate cells /Н. Mizuno, P. Zuk, M. Zhu et al. //Plast. Reconstr. Surg.- 2002.- V. 109.- P. 199-209.

163. Monroy A. Tissue engineered cartilage "bioshell" protective layer for subcutaneous implants /А. Monroy, K. Kojima, M. Ghanem et al. //Int J Pediatr Otorhinolaryngol.- 2007.- V. 71.- № 4.- P. 547-552.

164. Morizono К. Multilineage cells from adipose tissue as gene delivery vehicles /К. Morizono, D.A. De Ugarte, Zhu M. et al. //Hum. Gene Ther.- 2003.-V. 14.-P. 59-66.

165. Murphy C.L. Effect of oxygen tension and alginate encapsulation on restoration of the differentiated phenotype of passaged chondrocytes /С.L. Murphy, A. Sambanis //Tissue Eng.- 2001.- V. 7.- P. 791-803.

166. Nakahara H. In vitro differentiation of bone and hypertrophic cartilage from periosteal-derived cells /Н. Nakahara, J. Dennis, S. Bruder et al. //Exp. Cell. Res.-1991.- V. 195.- P. 492-503.

167. Nathan S. Cell based therapy in the repair of osteochondral defects: a novel use for adipose tissue /S. Nathan, D. Das, A. Thambyah et al. //Tissue Eng.-2003.-V. 9.- P. 733-744.

168. Nevo Z. Slowing down aging of cultured embryonal chick chondrocytes by maintenance under lowered oxygen tension /Z. Nevo, A. Beit-Or, Y. Eilam //Mech. Ageing Dev.- 1988.- V. 45.- P. 157-165.

169. Noth U. In vitro engineered cartilage constructs produced by press-coating biodegradable polymer with human mesenchymal stem cells /U. Noth, R. Tuli, A.M. Osyczka et al. //Tissue Eng.- 2002.- V. 8.- P. 131-144.

170. Nuttall M. Human trabecular bone cells are able to express both osteoblastic and adipocytic phenotype: implications for osteopenic disorders. /М. Nuttall, A. Patton, D. Olivera et al. //J. Bone Miner. Res.- 1998.- V. 13.- P. 371382.

171. Odorico J.S. Multilineage differentiation from human embryonic stem cell lines /J.S. Odorico, D.S. Kaufinan, J.A. Thomson //Stem Cells.- 2001.- V. 19.-P. 193-204.

172. Ogawa R. Osteogenic and chondrogenic differentiation by adipose-derived stem cells harvested from GFP transgenic mice /R. Ogawa, H. Mizuno, A. Watanabe et al. //Biochem. Biophys. Res. Commun.- 2004.- V. 313.- P. 871-877.

173. Owen M. Marrow stromal stem cells /М. Owen. //J. Cell Sci. Suppl.-1988.-V. 10.-P. 63-76.

174. Patrick C. Jr. Adipose tissue engineering: the future of breast and soft tissue reconstruction following tumor resection /C.Jr. Patrick //Semin. Surg. Oncol.- 2000.- V. 19.- P. 302-311.

175. Patrick C. Jr. Long-term implantation of preadipocyte-seeded PLGA scaffolds /С.Jr. Patrick, B. Zheng, C. Johnston et al. //Tissue Eng.- 2002.- V. 8.-P. 283-293.

176. Patrick C. Jr. Preadipocyte seeded PLGA scaffolds for adipose tissue engineering /C.Jr. Patrick, P. Chauvin, G. Reece //Tissue Eng.- 1999.- V. 5,- P. 139 -151.

177. Pei M. Growth factors for sequential cellular de- and re-differentiation in tissue engineering /М. Pei, J. Seidel, G. Vunjak-Novakovic et al. //Biochem. Biophys. Res. Commun.- 2002.- V. 294.- P. 149-154.

178. Peterson B. Healing of critically sized femoral defects, using genetically modified mesenchymal stem cells from human adipose tissue /В. Peterson, J. Zhang, R. Iglesias et al. tissue Eng.- 2005.- V. 11.- № 1/2.- P. 120-159.

179. Pittenger M.F. Human mesenchymal stem cells can be directed into chondrocytes, adipocytes and osteocytes /M.F. Pittenger, A.M. Mackay, F.P. Back //Mol. Biol. Cell.- 1996.- V. 7.- P. 305a.

180. Pittenger M.F. Mesenchymal stem cells of human adult bone marrow /M.F. Pittenger, D.R. Marshak//Cold Spring Harbor, NY.- 2001.- P. 349-374.

181. Pittenger M.F. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells /M.F. Pittenger, A.M. Mackay, S.C. Beck et al. //Science.- 1999.- V. 284.-P. 143-147.

182. Planat-Benard V. Plasticity of human adipose lineage cells toward endothelial cells, physiological and therapeutic perspectives /V. Planat-Benard, J.S. Silvestre, B. Cousin et al. //Circulation.- 2004.- V. 109.- P. 656-663.

183. Planat-Benard V. Spontaneous cardiomyocyte differentiation from adipose tissue stroma cells. N. Planat-Benard, C. Menard, M. Andre et al. //Circ. Res.- 2004.- V. 94.- P. 223-229.

184. Ponta H. CD44: from adhesion molecules to signaling regulators. / H. Ponta, L. Sherman, P.A. Herrlich //Nat. Rev. Mol. Cell Biol.- 2003.- V. 4.- P. 3345.

185. Potocnik A. In vitro generation of lymphoid precursors from embryonic stem cells /А. Potocnik, P. Nielsen, K. Eichmann //J. EMBO.- 1994.- V. 13.-P. 5274-5283.

186. Potten C.S. Clonogenic cells and stem cells in epidermis. /С. Potten, J. Hendry //Int. J. Radiat. Biol. Relat. Stud. Phys. Chem. Med.- 1973.- V. 24.- № 5.-P. 537-540.

187. Potten C.F. Keratinocyte stem cells: a commentary /C.F. Potten, C. Booth //J. Invest. Dermatol.- 2002.- V. 119.- P. 888-899.

188. Potten C.S. Stem cells: attributes, cycles, spirals, pitfalls and uncertainties /C.S. Potten, M. Loeffler //Lessons for and from the crypt. Development.-1990.-V. 110.-P. 1001-1020.

189. Prockop D. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues ID. Prockop //Science.-1997.- V. 276.- P. 71-74.

190. Puissant B. Immunomodulatory effect of human adipose tissue-derived adult stem cells: comparison with bone marrow mesenchymal stem cells /В. Puissant, C. Barreau, P. Bourin et al. //British Journal of Haematology.- 2005.- V. 129.- P. 118-129.

191. Quarto R. Bone progenitor cell deficits and the age-associated decline in bone repair capacity /R. Quarto, D. Thomas, T. Liang //Calcif. Tissue Int.-1995.-V. 56.-P. 123-129.

192. Ramiya V.K. Reversal of insulin-dependent diabetes using islets generated in vitro from pancreatic stem cells /V. Ramiya, M. Maraist, K. Arfors et al. //Nat. Med.- 2000.- V. 6.- P. 278-282.

193. Rangappa S. Transformation of adult mesenchymal stem cells isolated from the fatty tissue into cardiomyocytes /S. Rangappa, C. Fen, E. Lee et al. . //Ann. Thorac. Surg.- 2003.- V. 75.- P. 775-779.

194. Rasmusson I. Mesenchymal stem cells inhibit the formation of cytotoxic T lymphocytes, but not activated cytotoxic T-lymphocytes or natural killer cells /I. Rasmusson, O. Ringden, B. Sundberg et al. //Transplantation.- 2003.- V. 76.- P. 1208-1213.

195. Ravindranath N. Loss of telomerase activity during male germ cell differentiation /N. Ravindranath, R. Dalai, B. Solomon et al. //Endocrinology.- 1997.-V. 138.-P. 4026-4029.

196. Rehman J. Secretion of angiogenic and antiapoptotic factors by human adipose stromal cells /J. Rehman, D. Traktuev, B. Jingling et al. //Circulation.-2004.-V. 109.-P. 1292-1298.

197. Report and Recommendations //National bioethics advisory commission. Ethical issues in stem cell research. NBAC.-. 1999.- P.l.

198. Reubinoff B. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro /В. Reubinoff, M. Pera, C-Y. Fong et al. //Nat. Biotech.- 2000.- V. 18.- P. 399-404.

199. Reubinoff B. Neural progenitors from human embryonic stem cells /В. Reubinoff, P. Itsykson, T. Turetsky et al. //Nat. Biotechnol.- 2001.-.V. 19.- P. 1134-1140.

200. Reyes M. Characterization of multipotent adult progenitor cells, a sub-population of mesenchymal stem cells /М. Reyes, C. Verfaillie //Ann. NY Acad. Sci.- 2001.- V. 938.- V. 231-233.

201. Reyes M. Purification and ex vivo expansion of postnatal human marrow mesodermal progenitor cells /М. Reyes, T. Lund, T. Lenvik et al. //Blood.-2001.- V. 98.- P. 2615-2625.

202. Reynolds B. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system /В.А. Reynolds, S. Weiss //Science.- 1992.- V. 255.- P. 1707-1710.

203. Rideout W. Correction of a genetic defect by nuclear transplantation and combined cell and gene therapy /W. Rideout, K. Hochedlinger, M. Kyba et al. //Cell.- 2002.- V. 109.- P. 17-27.

204. Rubio D. Spontaneous human adult stem cell transformation /D. Rubio, J. Garcia-Castro, M.C. Martin et al. //Cancer Res.- 2005.- V. 65.- № 8.- P. 30353039.

205. Safford K. Characterization of neuronal/glial differentiation of murine adipose-derived adult stromal cells /К. Safford, S. Safford, J. Gimble et al. //Exp. Neurol.- 2004.- V. 187.- P. 319-328.

206. Hicok K. Neurogenic differentiation of murine and human adipose-derived stromal cells / K. Hicok, K. Safford, S. Safford et al. //Biochem. Biophys. Res. Commun.- 2002.- V. 294.- P. 371-379.

207. Safford K.M. Neurogenic differentiation of human adipose-derived stromal cells /К.М. Safford, K.C. Hicok, S.D. Safford et al. //Biochem. Biophys. Res. Commun.- 2002.- V. 295.- P. 415-418.

208. Sakaguchi Y. Comparison of human stem cells derived from various mesenchymal tissues, superiority of synovium as a cell source /Y. Sakaguchi, I. Sekiya, K. Yagishita et al. //Arthritis & Rheumatism.- 2005.- V. 52.- № 8.- P. 2521-2529.

209. Sakaguchi Y. Comparison of human stem cells derived from various mesenchymal tissues /Y. Sakaguchi, I. Sekiya, K. Yagishita et al. //Arthritis & Rheumatism.- 2005.- V. 52.- № 8.- P. 2521-2529.

210. Sampaolesi M. Cell therapy of alpha-sarcoglycan null dystrophic mice through intra-arterial delivery of mesoangioblasts /М. Sampaolesi, Y. Torrente, A. Innocenzi et al. //Science.- 2003.- V. 301.- P. 487-492.

211. Schieker M. The use of four-colour immunofluorescence techniques to identify mesenchymal stem cells /М. Schieker, C. Pautke, K. Reitz et al. //J. Anat.-2004.-V. 204.-P. 133-139.

212. Schmid T.M. Assembly of type X collagen by hypertrophic chondrocytes /Т.М. Schmid, A.A. Cole, Q. Chen //Extracellular Matrix Assembly and Structure.- San Diego, CA: Academic Press. 1994.- P. 171-206.

213. Schnabel M. Dedifferentiation-associated changes in morphology and gene expression in primary human articular chondrocytes in cell culture /М. Schnabel, S. Marlovits, G. Eckhoff et al. //Osteoarthritis Cartilage.- 2002.- V. 10.-P. 62-70.

214. Schuldiner M. From the cover: effects of eight growth factors on the differentiation of cells derived from human embryonic stem cells /М. Schuldiner, O. Yanuka, J. Itskovitz-Eldor et al. //Proc. Natl. Acad. Sci.- USA. 2000.- V. 97.- P. 11307-11312.

215. Schuldiner M. Induced neuronal differentiation of human embryonic stem cells /М. Schuldiner, R. Eiges, A. Eden et al. //Brain Res.- 2001.- V. 913.- P. 201-205.

216. Schwartz R. Multipotent adult progenitor cells from bone marrow differentiate into functional hepatocyte-like cells /R. Schwartz, M. Reyes, L. Koodie et al. //J. Clin. Invest.- 2002.- V. 109.- P. 1291-1302.

217. Sen A. Adipogenic potential of human adipose derived stromal cells from multiple donors is heterogenous /А. Sen, Y. Lea-Currie, D. Sujkowska et al. //J. Cell Biochem.- 2001.- V. 81.- P. 312-319.

218. Seoa M.J. Differentiation of human adipose stromal cells into hepatic lineage in vitro and in vivo /MJ. Seoa, Su Y. Suhb, Y.C. Baec et al. //Bioch. Bio-phys. Res. Commun.- 2005.- V. 328.- P. 258-264.

219. Sharma B. Engineering structurally organized cartilage and bone tissues. /В. Sharma, J. Elisseeff //Annals of biomedical engineering.- 2004.- V. 32.-№ l.-P. 148-159.

220. Shatos M. Multipotent stem cells from the brain and retina of green mice /М. Shatos, K. Mizumoto, H. Mizumoto et al. //The Journal of Regenerative Medicine.- 2001.- V. 2.- № 16.- P. 13-15.

221. Shin H. In vivo bone and soft tissue response to injectable, biodegradable oligo(poly(ethylene glycol) fumarate) hydrogels /Н. Shin, P. Quinten Ruhe, A. Mikos et al. //Biomaterials.- 2003.- V. 24.- P. 3201-3211.

222. Solter D. Putting stem cells to work ID. Solter, S. Gearhart //Science.-1999.-V. 283.-P. 1468-1470.

223. Sorof J.M. Renal transplantation without chronic immunosuppression after T cell-depleted, HLA-mismatched bone marrow transplantation /J.M. Sorof, M.A. Koerper, A.A. Portale et al. //Transplantation.- 1995.- V. 59.- P. 1633-1635.

224. Sotiropoulou P.A. Interactions between human mesenchymal stem cells and natural killer cells /Р. Sotiropoulou, S. Perez, A. Gritzapis et al. //Stem Cells.- 2005.-V. 11.-P. 1-38.

225. Strem В. Multipotential differentiation of adipose tissue-derived stem cells /В. Strem, K. Hicok, M. Zhu et al. //Keio J. Med.- 2005.- V. 54.- № 3.- P. 132-141.

226. Suva D. Non-hematopoietic human bone marrow contains long-lasting, pluripotential mesenchymal stem cells /D. Suva, G. Garavaglia, J. Menetrey et al. //J. Cell Physiol.- 2004. V. 198.- P. 110-118.

227. Tabata Y. De novo formation of adipose tissue by controlled release of basic fibroblast growth factor /Y. Tabata, M. Miyao, T. Inamoto et al. //Tissue Engineering.- 2000.- V. 6.- № 3.- P. 279-289.

228. Tabuchi C. Bone deficit in ovariectomized rats /С. Tabuchi, D.J. Simmon, A. Fausto et al. //J. Clin. Invest.- 1986.- V. 78.- P. 637-642.

229. Temenoff J.S. Tissue engineering for regeneration of articular cartilage /J. Temenoff, A. Mikos //Biomaterials.- 2000.- V. 21.- P. 431-440.

230. Temenoff J.S. Injectable biodegradable materials for orthopedic tissue engineering /J.S. Temenoff, A.G. Mikos //Biomaterials.- 2000.- V. 21.- P. 24052412.

231. Tepper O.M. Endothelial progenitor cells: promise of vascular stem cell for plastic surgery /О.М. Tepper, R.D. Galiano, S. Kalka et al. //Plastic and Reconstructive Surgery.- 2003.- V. 111.- P. 846-852.

232. The stem cell //NIH Collection. Hematopoiesis.- 2002.- V. 1,- P. 1-4.

233. Tholpady S. /Mesenchymal stem cells from rat visceral fat exhibit multipotential differentiation in vitro /S. Tholpady, A. Katz, R. Ogle //Anat. Rec.-2003.- V. 272A.- P. 398-402.

234. Thomson J.A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts /J. Thomson, J. Itskovitz-Eldor, S. Shapiro et al. //Science.- 1998.- V. 282.-P. 1145-1147.

235. Thomson J.A. Isolation of a primate embryonic stem cell line /J.A. Thomson, J. Kalishman, T.G. Golos, et al. //Proc Natl Acad Sci U S A.- 1995.- V. 92.-P. 7844-7848.

236. Timper К. Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells differentiate into insulin, somatostatin, and glucagons expressing cells IK. Timper, D. Seboek, M. Eberhardt et al. //Bioch. Biophys. Res. Commun.- 2006.- V. 341.- P. 1135-1140.

237. Toma J. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin /J. Toma, M. Akhavan, K. Fernandes et al. //Nat. Cell Biol.-2001.-V.3.-P. 778-784.

238. Tropepe V. Retinal stem cells in the adult mammalian eye /V. Tropepe, B. Coles, B. Chiasson et al. //Science.- 2000.- V. 287.- P. 2032-2036.

239. Tse W.T. Suppression of allogeneic T-cell proliferation by human marrow stromal cells: implications in transplantation /W.T. Tse, J.D. Pendleton, W. Beyer et al. //Transplantation.- 2003.- V. 75.- P. 389-397.

240. Wagnera W. Comparative characteristics of mesenchymal stem cells from human bone marrow, adipose tissue, and umbilical cord blood /W. Wagnera, F. Wein, A. Seckinger et al. //Experimental Hematology.- 2005.- V. 33.- P. 14021416.

241. Wang D.W. Effects of hypoxia on the proliferation and chondrogenic potential of human adipose-derived stromal cells /D.W. Wang, B. Fermor, J.M. Gimble et al. //Trans. Orthop. Res. Soc.- 2003.- V. 28.- P. 875.

242. Wang D.W. Influence of oxygen on the proliferation and metabolism of adipose derived adult stem cells /D.W. Wang, B. Fermor, J.M. Gimble et al. //J. Cell Physiol.- 2005.- V. 204.- P. 184-191.

243. Wang Y. Outgrowth of a transformed cell population derived from normal human BM mesenchymal stem cell culture /Y Wang, D.L. Huso, J. Harrington et al.//Cytotherapy.- 2005.-Vol. 7,- №6.-P. 509-519.

244. Weissman I.L. Stem and progenitor cells: origins, phenotypes, lineage commitments, and transdifferentiations Л. Weissman, D. Anderson, F. Gage //Annu. Rev. Cell Dev. Biol.- 2001.- V. 17.- P. 387-403.

245. Weissman I.L. Self-renewal, differentiation or death: regulation and manipulation of hematopoietic stem cell rate /I.L. Weissman, J. Domen //Mol. Med. Today.- 1999.- V. 5.- P. 201-208.

246. Weng, Y. Tissue-engineered composites of bone and cartilage for mandible condylar reconstruction /Y. Weng, Y. Cao, C. Silva et al. /J. Oral. Maxil-lofac. Surg.- 2001.- V. 59.- P. 185-190.

247. Werntz J.R. Qualitative and quantitative analysis of orthotopic bone regeneration by marrow /J.R. Werntz, J.M. Lane, A.H. Burstein et al. //J. Orthop. Res.- 1996.-V. 14.-P. 85-93.

248. Westin S. Interactions controlling the assembly of nuclear-receptor geterodimers and co-activators /S. Westin, R. Kurakawa //Nature.- 1988.- V. 395.-P. 199-202.

249. Wickham M.Q. Multipotent stromal cells derived from the infrapatellar fat pad of the knee /M.Q. Wickham, G.R. Erickson, J.M. Gimble et al. //Clin. Or-thop.- 2003.- P. 196-212.

250. Williams S. Liposuction derived human fat used for vascular sodding contains endothelial cells and not mesothelial cells as the major cell type /S. Williams, D. Rose, B. Jarrell //J. Vase. Surg.- 1994.- V. 19.- P. 916-923.

251. Wirth C.J. Techniques of cartilage growth enhancement: a review of the literature /C.J. Wirth, M. Rudert //Arthroscopy.- 1996.- V. 12.- P. 300-308.

252. Wolff D. Histomorphometric analysis of the repair of a segmental diaphyseal defect with ceramic and titanium fibermetal implants: effects of bone marrow /D. Wolff, V.M. Goldberg, S. Stevenson //J. Orthop. Res.- 1994.- V. 12.-P. 439-446.

253. Yoon Y.S. Clonally expanded novel multipotent stem cells from human bone marrow regenerate myocardium after myocardial infarction /Y.S. Yoon, A. Wecker, L. Heyd et al. //J. Clin. Invest.- 2005.- V. 115.- P. 326-338.

254. Youn W. Cellular senescence induced loss of stem cell proportion in the skin in vitro /W. Youn, D.S. Kim, H.J. Cho //Journal of Dermatological Science.- 2004,- V. 35.- P. 113-123.

255. Young С. /А porcine model for adipose tissue-derived endothelial cell transplantation /С. Young, B. Jarrell, J. Hoying et al. //Cell Transplant.- 1992.- V. 1.- P. 293-298.

256. Zeile G. Intracytoplasmic immunofluorescence in multiple myeloma /G. Zeile //Cytomethry.- 1980.- V. 1.- № 1.- P. 37-41.

257. Zerhouni E. Stem cell programs /Е. Zerhouni II. Science.- 2003.- V. 300;.-P. 911-912.

258. Zhang S.C. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells IS. Zhang M. Wernig, I. Duncan et al. //Nat Bio-technol.- 2001.- V. 19.-P. 1129-1133.

259. Zhang S. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells IS. Zhang, M. Wernig, I. Duncan et al. //Nat. Biotechnol. 2001.- V. 19.-P. 1129-1133.

260. Zimmermann S. Lack of telomerase activity in human mesenchymal stem cells /S. Zimmermann, M. Voss, S. Kaiser et al. //Leukemia.- 2003.- V. 17.-P. 1146-1149.

261. Zuk P.A. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells /Р.А. Zuk, M. Zhu, P. Ashjian et al. //Molecular Biology of Cell.- 2002.- V. 13.- P. 4279-4295.

262. Zuk P.A. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies /Р.А. Zuk, M. Zhu, H. Mizuno, J. Huang et al. //Tissue Engineering.- 2001.- V. 7.- № 2.- P. 211-228.

263. Zvaifler N. Mesenchymal precursor cells in the blood of normal individuals /N. Zvaifler, L. Marinova-Mutafchieva, G. Adams et al. //Arthritis Res.-2000.-V. 2.- P. 477-488.

Информация о работе

Шарифуллина, Светлана Загировна
кандидата биологических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.23

Диссертация

Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки жировой ткани и использование их в создании трехмерных трансплантатов хрящевой ткани - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы