Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Мультилокусное исследование ДНК-микросателлитов в характеристике генофонда свиней различной породной принадлежности и происхождения

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Мультилокусное исследование ДНК-микросателлитов в характеристике генофонда свиней различной породной принадлежности и происхождения"

На правах рукописи

Тихомирова Татьяна Ивановна

МУЛЬТИЛОКУСНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ДНК-МИКРОСАТЕЛЛИТОВ В ХАРАКТЕРИСТИКЕ ГЕНОФОНДА СВИНЕЙ РАЗЛИЧНОЙ ПОРОДНОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ И ПРОИСХОЖДЕНИЯ

03 00 23 - БИОТЕХНОЛОГИЯ

Автореферат

Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

п Дубровицы, Московская о£

ииу171142

2008 г

003171142

Работа выполнена в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики животных Государственного научного учреждения Всероссийского научно-исследовательского института животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор, член-корреспондент РАСХН Зиновьева Наталия Анатольевна Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Фомичев Юрий Павлович доктор биологических наук, профессор Калашникова Любовь Александровна

Ведущее учреждение — Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К И Скрябина

Защита состоится ¿¿ июня 2008 года, в 10 часов, на заседании диссертационного совета Д 006 013 01 при ГНУ Всероссийском научно-исследовательском институте животноводства Россельхозакадемии

Адрес института 142132 Московская область, Подольский район, пос Дубровицы, ВНИИЖ т/факс (4967) 65-11-01

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ВНИИЖ Автореферат разослан « /J» мая 2008 года

Ученый секретарь диссертационного кандидат биологических ВП Губанова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Генетические программы совершенствования свиней в странах с развитым свиноводством базируются на использовании ВШР-индексов, учитывающих продуктивные показатели, как самого животного, так и его родственников [Чинаров Ю И и др., 2006] В этой связи, достоверное происхождение животных является одним из важных факторов, обуславливающих эффективность селекционно-племенной работы Проведение генетической экспертизы на достоверность происхождения племенных животных является обязательным требованием для аккредитации племенных заводов, генофондных хозяйств и селекционно-гибридных центров [Приказ МСХ РФ № 402 от 19 октября 2006 года] Начиная с 2006 г, разрешено использование для этой цели методов ДНК-диагностики в лабораториях молекулярно-генетической экспертизы, аккредитованных МСХ РФ Одной из таких лабораторий является ГНУ ВНИИЖ (свидетельство о регистрации в госплемрегистре № 502504803000 от 29 ноября 2007 г) Таким образом, актуальным является разработка аналитических систем для проведения ДНК-экспертизы происхождения животных [Калашникова Л А , 2002, Сулимова Г Е, 2004] С другой стороны, интенсивное использование мирового генофонда в отечественных селекционных программах обуславливает необходимость оценки аллелофонда свиней различной породной принадлежности и происхождения, разводимых в сельскохозяйственных предприятиях России [Калашникова Л А и др , 2000] Перспективным приемом в этой связи, является анализ ДНК-микросателлитов (ДНК-МС), высоко полиморфный характер и менделевский тип наследования которых, делает их идеальными ДНК-маркерами в геноме сельскохозяйственных животных [ТаШг В, 1989]

Цель и задачи исследований. Целью диссертационной работы явилось мультилокусное исследование ДНК-микросателлитов для характеристики генофонда свиней различной породной принадлежности и происхождения, разводимых в сельхозпредприятиях России

Для достижения цели работы были поставлены следующие задачи

1 Изучить спектр микросателлитных маркеров свиней, выполнить теоретическое и экспериментальное моделирование мультилокусной системы анализа ДНК-МС

2 Изучить аллелофонд свиней различных пород по ДНК-МС, оценить информативность разработанной мультилокусной системы анализа

3 Выполнить оценку прикладной значимости системы в выявлении генетических различий между группами свиней различных пород

4 Оценить информативность системы в характеристике генофонда и в выявлении генетических различий между внутрипородными группами свиней различного происхождения на примере крупной белой породы

5 Дать оценку результативности системы в контроле достоверности происхождения племенных свиней в сравнении с данными тестирования по эритроцитарным антигенам

6 Выполнить анализ материальных и временных затрат на проведение мультилокусного исследования ДНК-МС

Научная новизна исследований. Разработана мультилокусная система анализа свиней по ДНК-МС, включающая 6 маркеров Выполнена экспериментальная апробация системы для характеристики генофонда и установления генетических различий между группами свиней пород ландрас, дюрок, йоркшир и крупная белая различного происхождения, установлены генеалогические связи между ними Дана оценка результативности разработанной системы анализа ДНК-МС в проведении генетической экспертизы происхождения свиней

Практическая значимость. Доказана высокая информативность разработанной мультилокусной системы генетического анализа свиней по ДНК-МС для характеристики генофонда свиней пород дюрок, ландрас, йоркшир и крупная белая различного происхождения и установления генетических различий между ними Показана прикладная значимость системы как инструмента генетического контроля происхождения свиней выявлено 100% совпадение результатов тестирования свиней с использованием ДНК-МС и эритроцитарных антигенов Использование разработанной системы анализа ДНК-МС позволит автоматизировать проведение генетической экспертизы происхождения свиней, дать характеристику генетической и генеалогической структуры пород, типов и линий свиней, разводимых в Российской Федерации

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на. 6-й международной научной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», ВИЖ, п Дубровицы, 2006 г, международной научной конференции «Современные методы генетики и селекции в животноводстве», ВНИИГРЖ, Санкт-Петербург, 2007 г, IV международной научно-практической конференции «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности», Санкт-Петербург, 2007 г, международной конференции «Вычислительная филогенетика и геносистематика, ВФГС' 2007», посвященной 50-летию становления отечественной филогенетики и геносистематики, МГУ, Москва, 2007 г

Основные положения, выносимые на защиту:

1 Мультилокусная система генетического анализа свиней, включающая 6 локусов ДНК-МС

2 Характеристика аллелофонда и генеалогические связи между группами свиней пород крупная белая, йоркшир, ландрас и дюрок различного происхождения, выявленные на основе анализа ДНК-МС

3 Мультилокусное исследование ДНК-МС как критерий для выявления генетических различий между внутрипородными группами свиней различного происхождения на примере крупной белой породы

4 Мультилокусное исследование ДНК-МС как метод для проведения молекулярно-генетической экспертизы происхождения свиней

Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ «Сельскохозяйственная биология» и «Доклады РАСХН»

Структура и объем работы. Диссертация написана на 160 страницах, состоит из следующих разделов введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, выводы, практические предложения, список литературы Диссертационная работа содержит 53 таблицы и 21 рисунок Список литературы включает 164 источника, в том числе 80 источников на иностранном языке

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Экспериментальные исследования проводились в период с 2005 по 2008 гг в лаборатории молекулярной генетики и цитогенетики животных ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Россельхозакадемии» по схеме, представленной на рисунке 1

Анализ информативности разработанной системы генетического анализа свиней проводили на 531 голове свиней пород крупная белая (7 популяций), йоркшир (3 популяции), ландрас (2 популяции) и дюрок (2 популяции)

Оценку прикладной значимости системы в выявлении генетических различий между группами свиней различной породной принадлежности проводили на племенных свиньях отечественной и зарубежной селекции Выборка свиней отечественной селекции была представлена животными пород крупная белая (п=52) и дюрок (п=33) из ПЗ «Талдом» Московской области, ландрас из ПЗ «Нива» Московской области (п=53) Выборка свиней зарубежной селекции была представлена 118 свиньями пород йоркшир (п=56), ландрас (п=26) и дюрок (п=36), завезенными в ООО «Троснянский бекон» Орловской области из 3-х независимых ферм Канады

Для характеристики системы в выявлении генетических различий между внутрипородными группами различного происхождения были исследованы 290 голов свиней крупной белой породы отечественной селекции из ПЗ «Ачинский» Красноярского края (КБ1, п=40), ЗАО «Агрофирма Дороничи» Кировской области (КБ2, п=14), ОАО «Камский бекон» Республики Татарстан (КБЗ, п=30), ЗАО ПЗ «Константиново» Московской области (КБ4, п=65), ГПЗ «Талдом» Московской области (КБ5, п=52), белорусской селекции из СГЦ «Заднепровский» Республики Беларусь (КББ, п=53) и французской селекции (КБФ, п=36)

Оценку системы в проведении генетической экспертизы происхождения проводили на 12 триадах (отец - мать - потомки) свиней крупной белой породы из ЗАО ПЗ «Заволжское» Тверской области, достоверность происхождения которых была предварительно подтверждена тестированием по эритроцитарным антигенам в лицензированной лаборатории хозяйства Последующую практическую апробацию системы для генетической

(4) Оценка мультилокусной системы анализа ДНК-МС как инструмента генетической экспертизы происхождения свиней

Сравнительное тестирование 12 триад (мать-отец-потомки)

Анализ по эритроцитарным антигенам

Мультилокусный анализ по ДНК-МС

Практическая апробация разработанной мультилокусной системы в проведении генетической экспертизы происхождения свиней

Крупная белая (5 гнезд)

Йоркшир (5 гнезд)

X

Дюрок (5 гнезд")

Рис 1 Схема исследований

экспертизы происхождения осуществляли на свиньях пород крупная белая (5 гнезд, п=35), дюрок (5 гнезд, п=43) и йоркшир (5 гнезд, п=51)

Материалом для анализа служили пробы ткани свиней (ушной выщип) Выделение ДНК из проб ткани проводили с помощью колонок фирмы Nexttec (Германия) и с использованием набора реагентов для выделения ДНК DIAtom™ DNA PreplOO [Шайхаев Г 0 , 2006] Анализ ДНК и постановку ПЦР проводили согласно «Методическим рекомендациям по использованию метода полимеразной цепной реакции в животноводстве» [Зиновьева Н А и др , 1998] Генотипирование животных проводили с помощью прибора для капиллярного электрофореза с лазерным анализатором MegaBace 500 фирмы Amersham Bioscience (США) В исследованиях использовали 6 ДНК-МС, рекомендованных Международным обществом генетики животных (ISAG), сформированных в мультилокусную панель

Статистическую обработку результатов осуществляли с применением программ MSA_WIN, Phylip, GenAIEx 6 1 и TreeView

3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Разработка системы анализа полиморфизма ДНК-МС свиней

Разработку системы генетического анализа свиней с использованием ДНК-МС проводили в два этапа На первом этапе осуществляли выбор локусов для включения в систему, а так же теоретическое моделирование системы, на втором этапе проводили ее экспериментальное моделирование

Выбор локусов проводили на основании анализа литературных данных о степени полиморфизма и распределении частот встречаемости аллелей в популяциях свиней, а так же исходя из длин образующихся фрагментов амплификации участков локусов При выборе красителя для мечения фрагментов учитывали, чтобы область одного микросателлитного маркера не пересекалась с областью другого маркера, меченного тем же красителем Смоделированная мультилокусная система схематично показана на рисунке 2

1 96-1 21 1 50-1 66 п □ Si ¥ 3= о со со 300

— со Оч1 '-О со £>■ ££ со Э г О in САЗ СО ппп 100-116 1 56-174 по 1 25. 33по П 0 LO Ю со О СО п 243-277 п 0.

Рис 2 Смоделированная система генетического анализа свиней на основе мультилокусного анализа 6-и ДНК-МС

Локусы, амплифицируемые с использованием праймеров, меченных ГАМ, показаны вверху, а меченных ЯбО — внизу. Минимальная и максимальная длина фрагментов соответствующих локусов показана в парах оснований (п. о.).

Таким образом, предложенная нами мультилокусная система генетического анализа свиней на основе ДНК-МС включала 6 локусов: 80155, 8\У72, 8\У951, 80386 и 80355. Амплификацию фрагментов всех шести изучаемых локусов проводили в одной реакции. С этой целью был подобран и оптимизирован темлературно-временной режим: 96°С, 10 мин; 96°С, 30 сек., 60°С, 30 сек., 72°С, 90 сек. (27 циклов); 72"С, 30 мин., а так же экспериментальным путем определены рабочие концентрации праймеров, которые в зависимости от праймера варьировали от 1,0 до 4,5 пмоль.

3.2 Оценка информативности разработанной системы генетического анализа свиней на основе ДНК-МС

В качестве критериев оценки информативности системы использовали следующие показатели: среднее число аллелей на локус; распределение частот встречаемости аллелей ДНК-МС; вероятность совпадения генотипов в зависимости от исследуемого числа локусов.

Проведенные исследования показали полиморфность всех изучаемых ДНК-микросателлитов (рис. 3).

Рис. 3 Распределение групп свиней по степени полиморфизма шести ДНК-МС (в порядке возрастания среднего числа аллелей на локус)

Среднее число аллелей на локус составило 5,15±0,33 и варьировало от 3,86±0,21 в локусе 80155 до 7,55±1,04 в локусе SW24. Наибольшим

разнообразием характеризовались группы свиней породы йоркшир канадской селекции и крупной белой породы белорусской селекции (КББ), при разведении которых активно применялся прием «освежения крови» за счет использования йоркширов, главным образом, французской селекции (в первом случае), а так же английской и канадской селекции (во втором случае)

Наименьшим генетическим разнообразием характеризовались две группы свиней крупной белой породы отечественной и французской селекции (КБ2, КБФ), что было обусловлено их узкой специализацией и, как следствие, более низким уровнем гетерозиготности (см табл 1)

Анализ распределения аллелей ДНК-МС показал, что в подавляющем большинстве исследованных групп свиней выявлеио не менее трех аллелей в локусе с частотой встречаемости более 5%, лишь у дюроков канадской и отечественной селекции по некоторым локусам отмечено наличие 2-х аллелей, что объясняется более высоким уровнем гомозиготности в группах

Анализ вероятности идентичности генотипов свиней показал, что с увеличением числа локусов снижается вероятность совпадения генотипов животных, как при случайном спаривании, так и для сибсов Так, вероятность появления индивидуумов с одинаковым генотипом по 4-м локусам ДНК-МС составляет 0,01% (то есть в одном случае из 10 тысяч исследований), по 5-и локусам - 0,001% (в одном случае из 100 тысяч исследований), а по всем 6-и анализируемым локусам - лишь 0,0002% (в двух случаях из 1 млн исследований) Вероятность совпадения генотипов у сибсов по всем 6-и локусам составляет 0,5% (в одном случае из 200) Учитывая, что число сибсов » свиноводстве, как правило, ограничивается несколькими десятками голов, наличие индивидуумов с одинаковым генотипом практически исключается

Таким образом, полученные данные позволяют рассматривать предложенную нами мультилокусную систему генетического анализа в качестве информативной для характеристики генофонда и выявления различий между группами свиней различной породной принадлежности и происхождения

3.3 Характеристика генофонда и выявление генетических различий мевду группами свиней различной породной принадлежности и происхождения

Следующим этапом исследований явилась оценка прикладной значимости системы в характеристике генофонда и выявление генеалогических связей между группами свиней различной породной принадлежности (крупная белая, йоркшир, ландрас и дюрок) и происхождения (отечественной и канадской селекции)

3.3.1 Анализ аллелофонда по шести локусам ДНК-МС у исследуемых групп свиней

Достоверных различий в степени полиморфизма свиней пород ландрас и дюрок отечественного и зарубежного (канадского) происхождения выявлено не было Среднее число аллелей на локус у свиней отечественной и канадской селекции породы дюрок составило, соответственно, 4,40±0,51 и 5,33±0,99, породы ландрас, соответственно, - 5,83±0,65 и 5,67±0,80 Существенно более высокое среднее число аллелей на локус у свиней породы йоркшир канадской селекции (7,50±1,18) по сравнению со свиньями крупной белой породы отечественной селекции (4,67±0,49) обусловлено, как уже отмечалось выше, активно практикуемым канадскими генетиками приемом «освежения» крови

Обобщая данные, мы выделили аллели, встречающиеся, хотя бы в одной из исследованных групп свиней, с относительно высокой (более 25%) частотой При относительно низких частотах встречаемости таких аллелей в других популяциях, они могут рассматриваться в качестве специфических маркеров данной популяции (или нескольких, объединенных по какому-либо признаку (например, общности происхождения или направления продуктивности популяций) Результаты такого анализа (рис 4) позволяют выделить следующие типичные для каждой из исследованных групп аллели

по локусу SO 155 аллель 158 для групп свиней породы дюрок вне зависимости от происхождения (43,5%, 58,4%), аллель 162 для групп свиней пород крупная белая, йоркшир и ландрас канадской селекции (40,4%, 38,4%, 32,7%),

по локусу S0355 аллель 249 у свиней пород ландрас и дюрок различного происхождения (68,3%, 52%, 84,3%, 69,4%), аллель 251 для свиней всех изучаемых пород канадского происхождения (21,4%, 26,9%, 27,8%),

по локусу S0386 аллель 172 для ландрасов канадской селекции (36,5%), аллель 178 для свиней отечественной селекции с максимальной частотой встречаемости у ландраса (24%, 66,4%, 27,4%), аллель 182 у канадского йоркшира и дюрока (38,3%, 62,4%), аллель 188 у свиней крупной белой породы (26%),

по локусу SW24' аллель 97 для свиней пород крупная белая и ландрас отечественной и канадской селекции (21,2%, 23,5%, 24%), аллель 113 для свиней крупной белой породы (26,9%), аллель 117 у свиней пород крупная белая, йоркшир и ландрас различной селекции (30,7%, 48,1%, 20,6%, 38%), и аллель 121 для канадского дюрока (25,9%);

по локусу SW72 аллель 117, выявленный у свиней породы крупная белая (25%) и отсутствующий в группах свиней породы ландрас,

по локусу SW951 аллель 128 у свиней пород крупная белая и йоркшир (33,7%, 42%), аллель 134 у свиней крупной белой породы (37,5%)

Крупная белая 1!И»1121 Йоркшир канадский Г I Ландрас

I ЕЕЕНПЗИ Ландрас канадский НИЩИМ Дюрок 1 Дюрок канадский -•- В среднем

Рис. 4 Распределение частот встречаемости наиболее часто встречающихся аллелей шести локусов ДНК-МС в группах свиней

! Бесспорно, на основании анализа только отдельных групп свиней

' изучаемых пород нельзя делать однозначных выводов об аллелях, типичных для конкретной породы, группы пород и т.п. Однако, полученные данные уже сейчас можно рассматривать в качестве первого вклада в характеристику аллелофонда свиней, разводимых в племенных предприятиях России.

3.3.2 Анализ степени гстерозиготности и показателей Р-статистики

Оценка степени гетерозиготности, рассчитанная по шести локусам ДНК-МС (табл 1) показала, что фактическая степень гетерозиготности варьировала от 0,315 у евшей породы дюрок отечественной селекции до 0,641 у свиней крупной белой породы и в среднем составляла 0,517

Таблица 1

Фактическая и ожидаемая степени гетерозиготности в _ исследованных породах свиней_

Группа свиней Степень гетерозиготности Разница Но-Не «+ / -» - избыток / дефицит гетерозигот

Фактическая, Но Ожидаемая, Не

Крупная белая 0,641+0,104 0,701+0,062 -0,060

Йоркшир канадский 0,605+0,107 0,703+0,093 -0,098

Ландрас 0,541+0,233 0,553+0,148 -0,012

Ландрас канадский _0,544+0,249 0,702+0,066 -0,158

Дюрок 0,315+0,184 0,554+0,151 -0,239

Дюрок канадский 0,455+0,230 0,590+0,115 -0,135

В среднем 0,517+0,048 0,634+0,031 -0,117

Сравнение фактической и ожидаемой степени гетерозиготности выявило дефицит гетерозигот от 1,2 до 23,9%, что указывает на использование в селекции свиней исследуемых групп умеренного инбридинга и служит косвенным указанием на специализацию исследованных групп свиней

Расчет индекса фиксации Fis показал, что в каждой из шести групп данный индекс имеет положительное значение, что указывает на нехватку (дефицит) гетерозигот Максимальным дефицитом гетерозигот характеризуются свиньи породы дюрок отечественной селекции (+45,6%), минимальным - свиньи породы ландрас отечественной селекции (+4,2%) По всей выборке в целом значение индекса фиксации Fis составило +0,185 (табл 2)

Таблица 2

Значения индексов F-статистики, рассчитанные по шести локусам

ДНК-МС в группах свиней исследованных пород

Маркер F-is Р F-it F-st

S0155 -0,0115 0,0001 0,1508 0,1634

S0355 0,5125 0,0001 0,5294 0,1925

S0386 0,2292 0,0001 0,3841 0,2176

SW24 0,0046 0,0001 0,1203 0,1015

SW72 0,0233 0,0001 0,0993 0,0879

SW951 0,3538 0,0001 0,4243 0,1509

все 6 маркеров +0,1853 0,0001 +0,2847 0,1523

Положительные значения индексов Fis и Fit можно расценивать как указание на несбалансированность исследуемых групп животных по числу гетерозигот. С другой стороны, эти значения далеки от единицы, поэтому можно утверждать, что в данных группах имеется достаточный резерв гетерозиготности для избегания тесного инбридинга. Анализ индекса Fst показывает, что 15,2% всей изменчивости обусловлено межпородным разнообразием, в то время как 84,8% изменчивости приходится на межпородное разнообразие.

3.3.3 Анализ генетической принадлежности индивидуумов Определение генетической принадлежности особи к собственной популяции (по Peatkau), или вероятность идентификации популяции, показывает, насколько далеко находится друг от друга каждая из популяций, при условии независимого наследования локусов (рис. 5).

^канадский дюрок ▲ канадский ланд pat + отеч, крупная белая (Талдом)

□ канадский йоркшир Хотеч.дюрок (Талдом) ®отсч. ландрас (Талдом)

Рис. 5 Анализ генетической принадлежности особи к группе

Анализ, проведенный по шести локусам ДНК-МС, показал высокую идентичность особей в популяциях (в среднем 84%). Наиболее консолидированными оказались популяции отечественных пород: ландрас (91%), крупная белая (87%) и дюрок (85%). Полученные данные свидетельствуют о высокой степени типичности каждой особи внутри группы, что позволяет сделать вывод о возможности использования системы в качестве инструмента для определения породной принадлежности особи на основании результатов анализа ДНК-МС.

3.3.4 Оценка генетических различий между группами свиней исследуемых пород

В качестве критерия оценки прикладной значимости системы в выявлении генеалогических связей между группами свиней использовали значения генетических дистанций, рассчитанные по Нею [1983]. Результаты обобщены в таблице 3 и в виде генеалогического дерева представлены на рисунке 6.

Таблица 3

Генетические расстояния между исследуемыми группами свиней, _ рассчитанные по Нею |1983|___

эЯ «8

3 & й 8 о ^ й «

Группы К м э ° Сц ^ о 5 « * & X аЗ Ч о. О 1 з а 3 Ч § и о о. £ Сч Дюрок канадс

Крупная белая * 0,298 тр*"

Йоркшир канадский * 0,293 0,149 0,329

Ландрас * 0,199 0,223 0,342

Ландрас канадский * 0,215 0,270

Дюрок * 0,213

Дюрок канадский *

Формирование кластеров и ветвей генеалогического дерева носит ярко выраженный породный характер Группы свиней, имеющие общие корни (крупная белая, йоркшир), формируют единую ветвь, что согласуется с их историческим происхождением

Рис 6 Дендрограмма филогенетического родства групп свиней различной породной принадлежности и происхождения по N61М. [1983]

Близкое генеалогическое родство между группами свиней пород йоркшир и ландрас канадской селекции (0,149) связано, по всей видимости, с единым направлением в селекционно-племенной работе (в Канаде свиньи этих пород используются как материнские формы и селектируются по аналогичным критериям) Тем не менее, на генеалогическом дереве эти две группы отображаются в виде отдельных ветвей, что указывает на различия в их

Ландрас

-Ландрас канадский

Йоркшир канадский

Крушшбаш

Дюрок канадский

0,1 ■ ■■ Дюрок

происхождении Близкое родство групп свиней породы ландрас (0,199) указывает на общность их происхождения, а отнесение к различным ветвям, по всей видимости, связано с различиями в направлениях селекции в Канаде ландрас используется в качестве материнской формы, в то время как в России, как правило, в качестве отцовской формы Наиболее генетически удаленными являются группы свиней пород дюрок - крупная белая (61,9%), что полностью согласуется с историческим происхождением животных

Таким образом, предложенная нами система генетического анализа свиней может служить инструментом характеристики аллелофонда и генетических различий между группами свиней различной породной принадлежности и происхождения Выявленные на основании анализа шести локусов ДНК-МС закономерности полностью согласуются с данными исторического происхождения свиней и системами ведения племенной работы

3 4 Характеристика генофонда и выявление генетических различий между внутрипородными группами свиней крупной белой породы различного происхождения

Прикладную оценку системы в характеристике аллелофонда и выявление генетических различий между внутрипородными группами проводили на 7-и группах свиней крупной белой породы различного происхождения

3.4.1 Анализ аллелофонда свиней крупной белой породы Среднее число аллелей ДНК-МС на локус в группах варьировало от 3,83 до 7,33 и в среднем составило 5,01±0,50 (рис 7)

5.83 5.6°

-- и. 4,67 в среднем 5,01

3,83 ы ш л/и ш 4,00 Ы 3,83

ш ш ш Щ- „т (А '^¿Руу гЛ Щ

ш '41 щ

КБ1 КБ2 КБЗ КБ4 КБ5 КББ КБФ

Рис 7 Среднее число аллелей на локус шести ДНК-МС в группах свиней крупной белой породы

Анализ данных племенного учета показал связь степени полиморфизма ДНК-МС с системой ведения селекционной работы в тех стадах, в которых активно использовались приемы «освежения крови» и «прилития крови», как, например, в группе свиней белорусской селекции, наблюдалась более высокая степень полиморфизма ДНК-МС.

3.4.2 Оценка степени гетерозиготности и показателей Р-статистики Расчет степени гетерозиготности, рассчитанная по шести локусам ДНК-МС (табл 4) показал, что в шести из семи исследованных групп наблюдался дефицит гетерозигот (4,1%), при этом наибольшим дефицитом гетерозигот характеризовались свиньи белорусской селекции (12,1%)

Таблица 4

Фактическая и ожидаемая степени гетерозиготности в исследованных группах свиней крупной белой породы_

Группа свиней Степень гетерозиготности Разница Но-Не

Фактическая, Ожидаемая, «+ / -» - избыток /

Но Не дефицит гетерозигот

КБ1 0,663±0,177 0,713±0,115 -0,050

КБ2 0,631±0,070 0,674±0,047 -0,043

КБЗ 0,697±0,134 0,665±0,105 0,032

КБ4 0,551±0,043 0,591±0,045 -0,040

КБ5 0,641±0,104 0,701±0,062 -0,060

КББ 0,603±0,051 0,724±0,102 -0,121

КБФ 0,585±0,169 0,587±0,098 -0,002

В среднем 0,624±0,019 0,665±0,021 -0,041

Причиной дефицита гетерозигот у свиней белорусской селекции является использование умеренного инбридинга для закрепления лучших мясных и откормочных качеств, вносимых в породу за счет использования хряков породы йоркшир английской и канадской селекции

Расчет значений индексов фиксации (табл 5), подтверждая дефицит гетерозигот (Fis =+5%, Fit =+ 18,8%), указывает на достаточное генетическое разнообразие для избегания тесного инбридинга Анализ значения индекса

Таблица 5

Значения индексов F-статистики, рассчитанные по шести локусам

ДНК-МС в группах свиней исследованных пород

Маркер F-is Р F-it F-st

S0155 0,020 0,0001 0,080 0,076

S0355 0,062 0,0001 0,115 0,164

S0386 0,107 0,0001 0,218 0,132

SW24 0,076 0,0001 0,463 0,416

SW72 0,024 0,0001 0,096 0,076

SW951 0,032 0,0001 0,156 0,132

все 6 маркеров 0,050 0,0001 0,188 0,166

Рэ^ показывает, что 16,6% приходится на межгрупповое генетическое разнообразие, в то время как 83,4% всей изменчивости обусловлено внутригрупповым разнообразием

3.4.3 Анализ генетической принадлежности индивидуумов к группе Проведенный анализ определения групповой принадлежности

индивидуумов на основании анализа генотипа по шести ДНК-МС (по Реайсаи) показал, что групповая принадлежность особи в среднем была определена в 69,5% случаев

Анализ результатов в групповом аспекте указывает на большую консолидированность групп свиней КБФ (88,9%), КБ1 (87,5%) и КБЗ (80%) Относительно низкое значение данного показателя в группе КБ2 (28,6%), указывает, что она находится в процессе формирования, что согласуется с используемой стратегией селекционно-племенной работы в предприятии

3.4.4 Характеристика генетических различий между группами Генетические расстояния между исследуемыми группами свиней,

рассчитанные по Нею [1983], в числовом выражении суммированы в таблице бив виде генеалогического дерева представлены на рисунке 8

Значения генетических дистанций (табл 6) и анализ кластерной структуры генеалогического дерева (рис 8) показывают, что исследуемые группы свиней крупной белой породы характеризуются относительно высоким размахом изменчивости аллелофонда, выражающейся в наличии или отсутствии определенных аллелей, различий в частотах встречаемости аллелей Наибольшие генетические различия отмечены между группами КБ1 - КБФ (0,418), наименьшие - КБ2 - КБ5 (0,032)

Таблица 6

Генетические расстояния между исследуемыми группами свиней крупной белой породы, рассчитанные по Нею [1983]_

Маркер Генетические расстояния по N61 [1983]

КБ1 КБ2 КБЗ КБ4 КБ5 КББ КБФ

КБ1 * 0,296 0,181 0,360 , 0,277 0,273 0,418

КБ2 * 0,203 0,109 - 0,032 ' 0,082 0,143

КБЗ * 0,257 0,194 0,156 0,280

КБ4 * 0,065 0,218 0,242

КБ5 * 0,162 0,172

КББ * 0,186

КБФ *

Рис 8 Дендрограм-ма филогенетического родства групп свиней крупной белой породы

В целом следует отметить наибольшую генетическую удаленность групп свиней французской селекции (КБФ) и КБ1 из Красноярского края, что связано с их географической изолированностью от других исследуемых групп свиней, а так же отличным от других групп направлением селекционно-племенной работы в группе КБФ Относительно большая удаленность группы свиней белорусской селекции (КББ) обусловлена использованием в ее разведении хряков породы йоркшир английской и канадской селекции. Наиболее генетически близки группы свиней КБ2, КБ4 и КБ5, связанные географической близостью и практикующие обмен племенным материалом Таким образом, выявленные на основе анализа ДНК-МС закономерности полностью согласуются с данными анализа систем разведения свиней в изучаемых группах

3.5 Применение системы генетического анализа свиней на основе ДНК-МС в контроле достоверности происхождения

Оценка результативности системы в оценке достоверности индивидуального происхождения свиней проводилась на 12 гнездах свиней, достоверность происхождения которых была предварительно подтверждена исследованием по 20 эритроцитариым антигенам 10-и систем групп крови Во всех случаях была доказана передача аллелей ДНК-МС от родителей потомству Таким образом, данные микросателлитного анализа полностью совпали с данными племенного учета и тестирования по группам крови

Последующая экспериментальная апробация системы на 15 гнездах свиней пород крупная белая, йоркшир и дюрок показала формирование кластеров генеалогического дерева по гнездовому принципу Как показано на рисунке 9 на примере свиней крупной белой породы, родственные животные формируют отдельные ветви, каждая из которых представлена отдельным

гнездом (отец, мать и потомки) Сопоставление генетических характеристик хряка, свиноматки и поросенка не выявило потомков с ложной родословной среди исследованного поголовья

Рис 9 Деидрограмма 5-и гнезд (отец, мать, потомки) свииеи крупной белой породы свиней

Важным аспектом прикладной значимости системы, в частности в качестве метода контроля происхождения свиней являются материальные затраты на проведение исследований Нами были выполнены расчеты затрат на реактивы и расходные материалы при проведении исследований свиней по шести локусам ДНК-МС Расчеты показали, что стоимость реактивов на исследование одной головы свиней с учетом 25% повторов, включающая выделение ДНК, постановку ПЦР и генотипирование, в ценах на 1 января 2008 г составили 108 руб Необходимо отметить, что полученные затраты сопоставимы с затратами на приобретение иммуноспецифических сывороток, которые по данным ВНИИплем составляют 140 руб на голову

Полученные данные убедительно показывают, что предложенная мультилокусная система анализа шести ДНК-МС наряду с тестированием по эритроцитарным антигенам может быть использована в проведении генетической экспертизы достоверности происхождения племенных свиней

4 ВЫВОДЫ

1 Разработана и предложена мультилокусная система генетического анализа свиней по ДНК-микросателлитам, включающая 6 маркеров S0155, S0386, SW24, SW72, S0355 и SW951 Оценка системы, выполненная на 11 группах свиней пород крупная белая, йоркшир, ландрас и дюрок различного происхождения (п=531), показала ее высокую информативность среднее число аллелей на локус составило 5,15±0,33 (варьировало от 3,86±0,21 в локусе S0155 до 7,55±1,04 в локусе SW24), в 9-и из 11-и исследованных групп выявлено не менее 3-х аллелей в каждом из локусов, вероятность совпадения генотипов животных по всем изучаемым локусам при случайном спаривании составляет лишь 0,0002%, у сибсов - 0,5%

2 Показана прикладная значимость предложенной системы в характеристике генофонда свиней различных пород крупная белая (йоркшир), ландрас и дюрок отечественной и канадской селекции Изучено влияние породной принадлежности и происхождения свиней на распределение частот встречаемости аллелей ДНК-МС, наличие приватных аллелей, степень полиморфизма, уровень гетерозиготности Во всех исследованных группах выявлен дефицит гетерозигот (Fis=+19,8, Fit=+28,2) Установлено, что 15,2% генетических различий обусловлено межгрупповым разнообразием, в то время как 84,8% изменчивости приходится на внутригрупповое разнообразие

3 Установлен породный принцип формирования кластерной структуры генеалогического дерева, построенного на основании анализа ДНК-МС Наиболее генетически удаленными являются группы свиней пород дюрок канадской селекции - крупная белая (0,619) Выявлено близкое родство свиней пород йоркшир и ландрас канадской селекции (0,149), используются в качестве материнских форм Показано, что структура генеалогического дерева полностью согласуется с историческим и географическим происхождением групп свиней изучаемых пород и направлениями селекционно-племенной работы

4 Изучена роль ДНК-МС в характеристике генофонда свиней крупной белой породы Исследование 7-и групп свиней различного происхождения показало высокий уровень полиморфизма ДНК-МС Среднее число аллелей на локус варьировало от 3,83 до 7,33 и в среднем составило 5,01±0,50. Выявлен дефицит гетерозигот (Fis =+5%, Fit =+ 18,8%) при сохранении достаточного генетического разнообразия в группах для избегания тесного инбридинга 16,6% приходится на межгрупповое генетическое разнообразие, в то время как 83,4% всей изменчивости обусловлено внутригрупповым разнообразием

5 Выявлен относительно высокий размах изменчивости аллелофонда свиней крупной белой породы различного происхождения в 4-х из 7-и исследованных групп показано наличие приватных аллелей (всего 17),

степень генетических различий, рассчитанная по Нею [1983], составляет от 0,032 до 0,418 Показано влияние географической изолированности (группы свиней из Красноярского края и Франции) и системы селекционно-племенной работы (использование приемов «освежения» и «прилития» крови) на формирование кластерной структуры генеалогического дерева, построенного на основании мультилокусного исследования ДНК-МС

6 Доказана результативность разработанной мультилокусной системы анализа ДНК-МС в контроле достоверности происхождения свиней данные микросателлитного анализа 12 триад свиней (мать - отец — потомки) крупной белой породы полностью совпали с данными племенного учета и тестирования по эритроцитарным антигенам Экспериментальная апробация системы для проведения генетической экспертизы происхождения на 15 гнездах свиней пород крупная белая, йоркшир и дюрок показала, что формирование кластеров генеалогического дерева происходит по гнездовому принципу

7 Выполнен расчет затрат реактивов и расходных материалов на проведение исследований свиней с использованием разработанной мультилокусной системы анализа ДНК-МС в ценах на 1 января 2008 года затраты на исследование одной головы составляют 108 руб, что сопоставимо с материальными затратами на проведение тестирования по группам крови

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Лабораториям молекулярно-генетической экспертизы, племенным свиноводческим предприятиям РФ рекомендуем использовать разработанную мультилокусную систему генетического анализа свиней по ДНК-МС для характеристики генофонда и выявления степени генетических различий между породами и породными группами свиней различного происхождения, а так же для проведения генетической экспертизы достоверности происхождения свиней

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Проскурина, Н В Анализ генетической структуры стада свиней пород ландрас, дюрок и йоркшир канадской селекции на основе анализа ДНК-микросателлитов / НВ Проскурина, Т.Н. Тихомирова, ПВ Ларионова, К М Шавырина, Н А Зиновьева // Международная научная конференция «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», 19-20 декабря, 2006 г. - Дубровицы, 2006 -С. 155-158

2 Тихомирова, Т.Н. Исторические аспекты идентификации происхождения животных / Т.Н. Тихомирова // Материалы международной научной конференции ВНИИГРЖ «Современные методы генетики и селекции в животноводстве», 26-28 июня, 2007 г - Санкт-Петербург, 2007. -С 222 - 227

3 Проскурина, Н В Фенотипический эффект различной гетерогенности родительских пар, оцененной с использованием ДНК-микросателлитов / Н В Проскурина, Т.И. Тихомирова, НА Зиновьева // Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования, образование Сб тр четвертой международной научно-практической конференции «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности», 2-5 октября, 2007 г Т 10 - Санкт-Петербург Политех ун-т,2007,- 10т.-С 223 - 225

4 Тихомирова, Т.Н., Разработка системы контроля происхождения свиней с использованием ДНК-микросателлитов / Т.И. Тихомирова, П В Ларионова, НА Зиновьева // Материалы международной конференции «Вычислительная филогенетика и геносистематика ВФГС' 2007» к 50-лешю становления отечественной филогенетики и геносистематики, 16-19 ноября, 2007г -Москва,2007 -С 327-330

5 Проскурина, НВ Сравнительный анализ информативности эритроцитарных антигенов и ДНК-микросателлитов в селекционно-племенной работе со свиньями канадской селекции / Н В Проскурина, Т.И. Тихомирова, ЕА Гладырь, ПВ. Ларионова, НА Зиновьева // С-х биология.-2007 -№6 - С 41-47.

6 Зиновьева Н А , Генетическая характеристика свиней пород крупная белая и йоркшир различного происхождения с использованием ДНК-маркеров /НА Зиновьева, П В Ларионова, Т.И. Тихомирова, Е А. Гладырь, КМ Шавырина//Доклады РАСХН -2008 - № 2 - С 33-36

Издательство РУЦ ЭБТЖ 142132, Московская обл, Подольский р-н, п Дубровицы Тел (8 - 27) 65-14-24, (8 - 27) 65-14-07

Сдано в набор 20 05 2008 Подписано в печать 21 05 2008 Заказ № 10 Печ л 1,0 Тираж 100 экз

Отпечатано в типографии РУЭЦ

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Тихомирова, Татьяна Ивановна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Методы оценки происхождения сельскохозяйственных животных

1.2 Оценка происхождения сельскохозяйственных животных по родословным

1.3 Иммуногенетическая экспертиза происхождения свиней

1.4 Использование генетических маркеров в селекции свиней

1.4.1 ДНК - микросателлиты, их характеристика и структура

1.4.2 Анализ микросателлитных локусов

1.4.3 Исследование сельскохозяйственных животных по микросателлитным маркерам

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Материалы

2.1.1 Животные

2.1.2 Реактивы и расходные материалы

2.1.3 Оборудование

2.2 Методика исследований

3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Разработка системы анализа полиморфизма ДНК-МС свиней

3.1.1 Выбор локусов и теоретическое моделирование системы генетического анализа свиней на основе ДНК-МС

3.1.2 Экспериментальное моделирование системы генетического анализа свиней на основе ДНК-МС

3.2 Оценка информативности разработанной системы генетического анализа свиней на основе ДНК-МС

3.2.1 Определение среднего числа аллелей ДНК-МС у исследуемых пород свиней

3.2.2 Распределение частот встречаемости аллелей

ДНК-МС у исследуемых пород свиней

3.2.3 Вероятность совпадения генотипов в зависимости от исследуемого числа локусов

3.3 Характеристика генофонда и выявление генетических различий между группами свиней различной породной принадлежности (пород крупная белая, йоркшир, ландрас и дюрок) и происхождения (российской и канадской селекции)

3.3.1 Анализ аллелофонда по шести локусам ДНК-МС у исследуемых групп свиней

3.3.2 Анализ степени гетерозиготности

3.3.3 Анализ показателей F-статистики

3.3.4 Анализ генетической принадлежности индивидуумов к своей популяции

3.3.5 Анализ генетических различий между группами свиней исследуемых пород

3.4 Характеристика генофонда и выявление генетических различий между группами свиней крупной белой породы различного происхождения

3.4.1 Анализ аллелофонда шести локусов ДНК-МС у исследуемых групп свиней

3.4.2 Анализ степени гетерозиготности

3.4.3 Анализ показателей F-статистики

3.4.4 Анализ генетической принадлежности индивидуумов к своей породе

3.4.5 Анализ генетических различий между группами свиней крупной белой породы

3.5 Оценка системы генетического анализа свиней на основе ДНК-МС в контроле достоверности происхождения свиней

3.5.1 Сравнительное тестирование достоверности происхождения свиней с использованием групп крови и ДНК-МС

3.5.2 Экспериментальная апробация системы для генетической экспертизы происхождения свиней различных пород 133 3.6. Экономическая эффективность проведения генетической экспертизы свиней

4 ВЫВОДЫ

5 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 143 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ДНК-МС - ДНК-микросателлиты п.о. - пар оснований

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПДРФ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов праймеры - короткие последовательности нуклеотидов (чаще 20-25), комплементарные концевым участкам изучаемого гена

BLUP - (лучший линейный неискаженный прогноз) - селекционный индекс, в котором для расчета отклонений в продуктивности используются истинные значения сравнения.

EBV - индексы племенной ценности свиней

Fis - индекс фиксации, позволяет установить связь между индивидуумами отдельной популяции и популяцией в целом.

Fit - индекс фиксации, устанавливает связь между отдельными индивидуумами и общим массивом исследованных животных.

Fst - индекс фиксации, служит критерием генетических различий между популяциями.

GenBank, EMBL - Международный генный банк

MAS - (Marker-Assisted Selection) - маркерная селекция, программа генетического усовершенствования животных

QTL - (quantitative trait loci) - локусы количественных признаков

SNP - (Single Nucleotide Polymorphism) - точковая мутация

SSR - («simple sequence repeats») - простые повторы последовательности

STR - («short tandem repeats») - короткие тандемные повторы

ISAG - Международное общество по изучению генетики

LINEs - длинные интерсперсионные элементы, длиной более 1000 п.о.

PI - вероятность совпадения генотипов свиней при случайном спаривании внутри популяции

PIC - показатель уровня средней полиморфности, используется для оценки информативности локусов.

SINEs - короткие интерсперсионные элементы, длиной менее 500 п.о. VNTR - (variable number of tandem repeats) тандемные повторы с изменяющимся числом копий.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Мультилокусное исследование ДНК-микросателлитов в характеристике генофонда свиней различной породной принадлежности и происхождения"

Актуальность темы. Важная роль в обеспечении населения Российской Федерации полноценными продуктами питания отводится свиноводству. Успех в увеличении производства свинины во многом определяется интенсификацией отрасли, совершенствованием животных, улучшением селекционно-племенной работы, использованием достижений в области биотехнологии [Программа развития свиноводства РФ на 2005-2010 гг. и на период до 2015 года].

Интенсивное развитие свиноводства на современном этапе предъявляет повышенные требования к контролю происхождения племенного материала. Селекционные программы совершенствования свиней во всех странах с развитым свиноводством базируются на использовании индексов племенной ценности (EBV) отдельных признаков и комплексных BLUP-индексов, при расчете которых учитываются продуктивные показатели не только самого животного, но и всех его родственников [Чинаров Ю.И., Зиновьева Н.А., Эрнст Л.К., 2006; Амерханов Х.А., Зиновьева Н.А., 2008]. В этой связи, достоверность происхождения животных является одним из основополагающих факторов, обуславливающих . эффективность селекционно-племенной работы.

Принимая во внимание большое значение достоверности происхождения племенных животных, Министерство сельского хозяйства РФ в качестве одного из обязательных требований для аккредитации племенных заводов, генофондных хозяйств и селекционно-гибридных центров ввело проведение генетической экспертизы происхождения ремонтного молодняка [Приказ Минсельхоза РФ № 402 от 19 октября 2006 года].

Следует отметить, что начиная с 2006 г., Министерством сельского хозяйства России разрешен контроль достоверности происхождения племенных животных с использованием молекулярно-генетических методов в лабораториях молекулярно-генетической экспертизы, аккредитованных Министерством сельского хозяйства РФ [Приказ Минсельхоза РФ № 402 от 19 октября 2006 года]. Одной из таких лабораторий является ГНУ ВНИИЖ Россельхозакадемии (Регистрационный код в государственном племенном регистре № 502504803000).

Таким образом, возникает необходимость в разработке аналитических систем для проведения молекулярно-генетической экспертизы происхождения животных. Перспективным приемом в этой связи является использование ДНК-микросателлитов. Под термином «микросателлиты» понимаются короткие тандемные повторы - один из наиболее распространенных типов повторяющейся ДНК [Tautz D., 1989]. Эти последовательности составляют основу высокого. полиморфизма микросателлитов у всех эукариот, имеющих определенную локализацию для каждого вида. Вместе с тем, функциональное значение их практически неизвестно, хотя, как предполагают, роль и значение их в организме достаточно велика. Доказательство тому — обязательное присутствие микросателлитных последовательностей в областях рекомбинаций, регуляции генной активности, конденсации и упаковке ДНК и хромосом. Большая часть микросателлитов является анонимной, то есть ген, его нуклеотидная последовательность еще до конца не изучены и в этом направлении требуются дальнейшие исследования. Тем не менее, другая часть представляет собой известные гены, у которых определена не только нуклеотидная последовательность, но и функция самих генов [Марзанов Н.С. и др., 2005]. Высоко полиморфный характер и менделевский тип наследования микросателлитов делает их идеальными ДНК-маркерами в геноме сельскохозяйственных животных.

По мнению Сулимовой Г.Е. [2004] основным ограничением широкого практического применения ДНК-МС в качестве генетических маркеров является высокая стоимость оборудования и реагентов. Так, при использовании наборов для проведения генетического анализа свиней на основе использования ДНК-МС, предлагаемых компанией ABI - одним из мировых лидеров в области разработки и производства оборудования и наборов для молекулярно-генетических исследований составляет около 500 руб., что делает использование ДНК-МС в сельскохозяйственной практике экономически нецелесообразным. Вместе с тем, при разработке более совершенных и дешевых технологий анализа ДНК-МС этот подход может стать преобладающим.

Наряду с использованием в качестве инструмента контроля происхождения животных, ДНК-микросателлиты находят практическое применение в выявлении степени генетических различий между различными породами, типами, стадами и генеалогическими группами животных, в характеристике линейной и внутрилинейной структуры стад [Проскурина Н.В. и др., 2006]. Калашникова JI.A. с соавторами [2000] отмечают, что в настоящее время практически отсутствуют характеристики генофонда сельскохозяйственных животных России по полиморфизму генома, ДНК-маркерам - аллельным вариантам генов, связанных с продуктивностью, адаптационными качествами, устойчивостью к болезням, оценке генетического разнообразия. Такие характеристики являются необходимыми для принятия решений по вопросам сохранения и рационального использования генофонда сельскохозяйственных животных.

Цель и задачи исследований. Целью диссертационной работы явилось мультилокусное исследование ДНК-микросателлитов для характеристики генофонда свиней различной породной принадлежности и происхождения, разводимых в сельхозпредприятиях России.

Для достижения цели работы были поставлены следующие задачи:

1. Изучить спектр микросателлитных маркеров свиней, выполнить теоретическое и экспериментальное моделирование мультилокусной системы анализа ДНК-МС.

2. Изучить аллелофоид свиней различных пород по ДНК-МС, оценить информативность разработанной мультилокусной системы анализа.

3. Выполнить оценку прикладной значимости системы в выявлении генетических различий между группами свиней различных пород.

4. Оценить информативность системы в характеристике генофонда и в выявлении генетических различий между внутрипородными группами свиней различного происхождения на примере крупной белой породы.

5. Дать оценку результативности системы в контроле достоверности происхождения племенных свиней в сравнении с данными тестирования по эритроцитарным антигенам.

6. Выполнить анализ материальных и временных затрат на проведение мультилокусного исследования ДНК-МС.

Научная новизна исследований. Разработана мультилокусная система анализа свиней по ДНК-МС, включающая 6 маркеров. Выполнена экспериментальная апробация системы для характеристики генофонда и установления генетических различий между группами свиней пород ландрас, дюрок, йоркшир и крупная белая различного происхождения, установлены генеалогические связи между ними. Дана оценка результативности разработанной системы анализа ДНК-МС в проведении генетической экспертизы происхождения свиней.

Практическая значимость. Доказана высокая информативность разработанной мультилокусной системы генетического анализа свиней по ДНК-МС для характеристики генофонда свиней пород дюрок, ландрас, йоркшир и крупная белая различного происхождения и установления генетических различий между ними. Показана прикладная значимость системы как инструмента генетического контроля происхождения свиней: выявлено 100% совпадение результатов тестирования свиней с использованием ДНК-МС и эритроцитарных антигенов. Использование разработанной системы анализа ДНК-МС позволит автоматизировать проведение генетической экспертизы происхождения свиней, дать характеристику генетической и генеалогической структуры пород, типов и линий свиней, разводимых в Российской Федерации.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Мультилокусная система генетического анализа свиней, включающая 6 локусов ДНК-МС.

2. Характеристика аллелофонда и генеалогические связи между группами свиней пород крупная белая, йоркшир, ландрас и дюрок различного происхождения, выявленные на основе анализа ДНК-МС.

3. Мультилокусное исследование ДНК-МС как критерий для выявления генетических различий между внутрипородными группами свиней различного происхождения на примере крупной белой породы.

4. Мультилокусное исследование ДНК-МС как метод для проведения молекулярно-генетической экспертизы происхождения свиней.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены:

• на 6 международной научной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», Дубровицы: ВИЖ, 19-20 декабря 2006 г;

• на международной научной конференции ВНИИГРЖ «Современные методы генетики и селекции в животноводстве», Санкт-Петербург, 26-28 июня, 2007 г;

• на четвертой международной научно-практической конференции «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности», Санкт-Петербург: Политех, ун-т, 2-5 октября, 2007 г;

• на международной конференции «Вычислительная филогенетика и геносистематика, ВФГС' 2007», посвященной 50-летию становления отечественной филогенетики и геносистематики, Москва, 16-19 ноября, 2007 г

Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ «Сельскохозяйственная биология» и «Доклады РАСХН».

Структура и объем работы. Диссертация написана на 160 страницах, состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты и обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы. Работа содержит 53 таблицы и 21 рисунок. Список литературы включает 164 источника, в том числе 80 на иностранном языке.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Тихомирова, Татьяна Ивановна

4 ВЫВОДЫ

1. Разработана и предложена мультнлокусная система генетического анализа свиней по ДНК-микросателлитам, включающая 6 маркеров: S0155, S0386, SW24, SW72, S0355 и SW951. Оценка системы, выполненная на 11 группах свиней пород крупная белая, йоркшир, ландрас и дюрок различного происхождения (п=531), показала ее высокую информативность: среднее число аллелей на локус составило 5,15±0,33 (варьировало от 3,86±0,21 в локусе S0155 до 7,55±1,04 в локусе SW24); в 9-и из 11-и исследованных групп выявлено не менее 3-х аллелей в каждом из локусов; вероятность совпадения генотипов животных по всем изучаемым локусам при случайном спаривании составляет лишь 0,0002%, у сибсов - 0,5%.

2. Показана прикладная значимость предложенной системы в характеристике генофонда свиней различных пород: крупная белая (йоркшир), ландрас и дюрок отечественной и канадской селекции. Изучено влияние породной принадлежности и происхождения свиней на распределение частот встречаемости аллелей ДНК-МС, наличие приватных аллелей, степень полиморфизма, уровень гетерозиготности. Во всех исследованных группах выявлен дефицит гетерозигот (Fis=+19,8, Fit=+28,2). Установлено, что 15,2% генетических различий обусловлено межгрупповым разнообразием, в то время как 84,8% изменчивости приходится на внутригрупповое разнообразие.

3. Установлен породный принцип формирования кластерной структуры генеалогического дерева, построенного на основании анализа ДНК-МС, Наиболее генетически удаленными являются группы свиней пород дюрок канадской селекции - крупная белая (0,619). Выявлено близкое родство свиней пород йоркшир и ландрас канадской селекции (0,149), используются в качестве материнских форм. Показано, что структура генеалогического дерева полностью согласуется с историческим и географическим происхождением групп свиней изучаемых пород и направлениями селекционно-племенной работы.

4. Изучена роль ДНК-МС в характеристике генофонда свиней крупной белой породы. Исследование 7-и групп свиней различного происхождения показало высокий уровень полиморфизма ДНК-МС. Среднее число аллелей на локус варьировало от 3,83 до 7,33 и в среднем составило 5,01±0,50. Выявлен дефицит гетерозигот (Fis =+5%, Fit =+ 18,8%) при сохранении достаточного генетического разнообразия в группах для избегания тесного инбридинга: 16,6% приходится на межгрупповое генетическое разнообразие, в то время как 83,4% всей изменчивости обусловлено внутригрупповым разнообразием.

5. Выявлен относительно высокий размах изменчивости аллелофонда свиней крупной белой породы различного происхождения: в 4-х из 7-и исследованных групп показано наличие приватных аллелей (всего 17); степень генетических различий, рассчитанная по Нею [1983], составляет от 0,032 до 0,418. Показано влияние географической изолированности (группы свиней из Красноярского края и Франции) и системы селекционно-племенной работы (использование приемов «освежения» и «прилития» крови) на формирование кластерной структуры генеалогического дерева, построенного на основании мультилокусного исследования ДНК-МС.

6. Доказана результативность разработанной мультилокусной системы анализа ДНК-МС в контроле достоверности происхождения свиней: данные микросателлитного анализа 12 триад свиней (мать - отец - потомки) крупной белой породы полностью совпали с данными племенного учета и тестирования по эритроцитарным антигенам. Экспериментальная апробация системы для проведения генетической экспертизы происхождения на 15 гнездах свиней пород крупная белая, йоркшир и дюрок показала, что формирование кластеров генеалогического дерева происходит по гнездовому принципу.

7. Выполнен расчет затрат реактивов и расходных материалов на проведение исследований свиней с использованием разработанной мультилокусной системы анализа ДНК-МС: в ценах на 1 января 2008 года затраты на исследование одной головы составляют 108 руб., что сопоставимо с материальными затратами на проведение тестирования по группам крови.

5 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Лабораториям молекулярно-генетической экспертизы, племенным свиноводческим предприятиям РФ рекомендуем использовать разработанную мультилокусную систему генетического анализа свиней по ДНК-МС для характеристики генофонда и выявления степени генетических различий между породами и породными группами свиней различного происхождения, а так же для проведения генетической экспертизы достоверности происхождения свиней.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тихомирова, Татьяна Ивановна, Дубровицы

1. Амерханов, Х.А. Анализ национальных регистрационных сертификатов и введение в систему генетической оценки свиней США. Методические рекомендации / Х.А. Амерханов, Н.А. Зиновьева // М.: МСХ РФ, 2008. 62 с.

2. Айла, Ф Введение в популяционную и эволюционную генетику / Ф Айла. — М.: Мир, 1984. 232. Пер. с англ. канд. физ.-мат.наук А.Д. Базыкина

3. Бакай, А.В., Генетика / А.В. Бакай, И.И. Кочиш, Г.Г. Скрипниченко. -М.: КолосС, 2006. 448 с.

4. Банникова, А.А. Молекулярные маркеры и современная филогенетика млекопитающих / А.А. Банникова // Журнал общей биологии, 2004, т.65, № 4, С.278 305.

5. Безенко, С.П. Группы крови у животных и применение их в селекционно-племенной работе / С.П. Безенко, П.Ф. Сороковой // Отчет ВИЖа о научной работе в Либеховской лаборатории АН Чехословакии. -1963.-99 с.

6. Блинов, Н.И. Кровяные группы у животных / Н.И. Блинов. Природа, т 2, 1937.

7. Борисенко, Е.Я. Разведение сельскохозяйственных животных / Е.Я. Борисенко. М.: Колос, 1967.-415 с.

8. Вартапетян, А.Б. ПЦР / А.Б. Вартапетян // Молекулярная биология, -1991. Том 25. - №4. - С 926-936.

9. Ведомственная целевая программа «Развитие свиноводства в Российской Федерации на период 2006 2010 г. г. и до 2015 года» /

10. Программа подготовлена по заданию Министерства сельского хозяйства РФ. 2005 // Режим доступа: (http://gosniti.ru/forms/vedomstvo.doc).

11. Вейр, Б. Анализ генетических данных / Б. Вейр. М.: Мир, 1995. -400 с. Пер. с англ. Д.В. Зайкина, к.б.н. А.И. Пудовкина, А.Н. Татаренкова.

12. Генетическая экспертиза происхождения ремонтного молодняка. Федеральная программа. Приказ Минсельхоза РФ № 402 от 19 октября 2006г.

13. Гладырь, Е.А., Анализ овец с использованием ДНК-микросателлитов / Е.А. Гладырь // Методы исследований в биотехнологии сельскохозяйственных животных: школа-практикум. Дубровицы. 2003. Вып 2. С. 12-21.

14. Гладырь, Е.А., Микросателлитный анализ коз зааненской породы / Е.А. Гладырь // Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных: 3-я международная научная конференция, 18-19 нояб. 2003. /ВИЖ. Дубровицы, 2003. - 156 с.

15. Гладырь, Е.А. Методические рекомендации по молекулярно-генетическому анализу овец с использованием микросателлитных маркеров / Е.А. Гладырь, Н.А. Зиновьева, Л.И. Каплинская, Г. Брем, М. Мюллер. М.: Россельхозакадемия, 2004. - 30 с.

16. Глазко, В.И. Введение в ДНК-технологии / В.И. Глазко, И.М. Дунин, Г.В. Глазко, JI.A. Калашникова. М.: ФГНУ «Росинформагротех», 2001. -436 с.

17. Глик, Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение./ Б. Глик, Дж. Пастернак. М.: Мир, 2002. - 589 с.

18. Жебровский, JI.C. Селекция животных / JI.C. Жебровский. СПб.: Издательство «Лань», 2002. - 256 с.

19. Животовский, Л.А. Микросателлитная изменчивость в популяциях человека и методы ее изучения / Л.А. Животовский // Вестник ВОГиС, 2006. -Том 10, №1. 96с.

20. Животовский, Л.А. Популяционная биометрия / Л.А. Животовский. -М.: Наука, 1991.-271 с.

21. Жимулев И.Ф. Общая и молекулярная генетика / И.Ф. Жимулев. -Новосибирск: Изд-во Новосиб. Ун-та: Сиб. унив. изд-во. 2002. 459 с.

22. Завадовский, Н.Н. Племенное свиноводство / Н.Н. Завадовский. М., Сельхозгиз, 1932. С. 63 - 68.

23. Зайцева, М.А. Использование микросателлитных маркеров ДНК в контроле происхождения лошадей / М.А. Зайцева Электронный ресурс., 2001 / Режим доступа: (http://www. ruhorses. ru / genetic /articles, html 78 k ).

24. Зиновьева, H.A. Методические рекомендации по использованию метода полимеразной цепной реакции в животноводстве / Н.А. Зиновьева, А.П. Попов, Л.К. Эрнст, Н.С. Марзанов, В.В. Бочкарев, Н.И. Стрекозов, Г. Брем. Дубровицы: ВИЖ, 1998. - 47 с.

25. Зиновьева, Н.А. Введение в молекулярную генную диагностику сельскохозяйственных животных / Н.А. Зиновьева, Е. А. Гладырь, Л.К. Эрнст, Г. Брем. Дубровицы, 2002. - 112 с.

26. Зиновьева, Н.А. Введение в ДНК-диагностику / Н.А. Зиновьева // Методы исследований в биотехнологии сельскохозяйственных животных: школа-практикум. Дубровицы. 2005. Вып 4. С.38-41.

27. Зиновьева, Н.А. Проблемы биотехнологии и селекции сельскохозяйственных животных / Н.А. Зиновьева, JI.K. Эрнст. Дубровицы, ВИЖ, 2006. - 344 с.

28. Кабанов, В.Д. Породы свиней / В.Д. Кабанов, А.С. Терентьева. М.: Агропромиздат, 1985. - 336 с.

29. Кабанов, В.Д. Интенсивное производство свинины / В.Д. Кабанов. -М., 2003.-400 с.

30. Кайлачакова, О.Н. Использование молекулярно-генетических маркеров при оценке репродуктивных качеств свиней: дисс. канд. биол. наук: 03.00.23: защищена: 21.06.05 / Кайлачакова Оксана Николаевна. Москва, 2005. - 120 с. -Библиогр.: с. 104-120.

31. Калашникова, Л.А. ДНК технологии оценки сельскохозяйственных животных. / Л.А. Калашникова, И.М. Дунин, В.И. Глазко, Н.В. Рыжова, Е.П. Голубина. // ВНИИплем, 1999. - 148 с.

32. Калашникова, Л.А. Селекция XXI века: использование ДНК-технологий / Л.А. Калашникова, И.М. Дунин, В.И. Глазко. Московская обл, Лесные Поляны, ВНИИплем, 2000. - 31 с.

33. Капкова, B.C. Опыты по изучению групп крови у свиней / B.C. Капкова Труды ВНИИС, вып. IX-X, Полтава, 1934.

34. Клаг, Уильям С. Основы генетики / Уильям С. Клаг, Майкл Р. Каммингс. М.: Техносфера, 2007. - 896 с. Перевод с англ А.А. Лушникова, С.М. Мусаткина.

35. Кленовицкий, П.М. Современные проблемы зоотехнии / ПМ Кленовицкий., В.А. Багиров, В. А. Иванов,Б.С. Иолчиев. Дубровицы, 2005.-116 с.

36. Коновалова, Е.Н. Характеристика симментальского скота различного происхождения с использованием ДНК-микросателлитов / Е.Н. Коновалова, В.И. Сельцов, Н.А. Зиновьева // Зоотехния, № 8 , 2006. С. 6-9.

37. Кравченко, Н.А. Разведение сельскохозяйственных животных / Н.А. Кравченко. М., «Колос», 1973. - 486с.

38. Красота, В.Ф. Разведение сельскохозяйственных животных / В.Ф. Красота, В.Т Лобанов. М.: «Колос», 1976 - 416 с.

39. Красота, В.Ф. Разведение сельскохозяйственных животных / В.Ф. Красота, В.Т Лобанов, Т.Г. Джапаридзе. М.: Агропромиздат, 1990.- 463 с.

40. Левонтин, Р. Генетические основы эволюции / Р. Левонтин. М.: Мир, 1978.-351 с.

41. Лингарт, И. Использование групп крови свиней в племенной работе / Й. Лингарт, Я. Павлик // Международный сельскохозяйственный журнал, -1987.-№1.-С. 91-94.

42. Макаров, М.А. Кровяные группы животных и их значение для ветеринарии и животноводства / М.А. Макаров. — Труды Кировск. вет. ин-та, т 1, вып 2, 1934.- С. 45-49.

43. Марзанов, Н.С. Аллелофонд у различных пород овец по микросателлитам / Н.С. Марзанов, М.Г. Насибов, М.Ю. Озеров, Ю. Кантанен. Дубровицы, 2004. - 120 с.

44. Марзанов, Н.С. Микросателлиты и их использование для оценки генетического разнообразия животных / Н.С. Марзанов, М.Ю. Озеров, М.Г. Насибов, J1.K Марзанова // Сельскохозяйственная биология, 2004. №2. - С. 104-111 с.

45. Марзанов, Н.С. Генетические маркеры в селекции свиней / Н.С. Марзанов, А. Филатов, Ф. Данилин, J1. Попкова, Хуан Лу Шен // Племенное дело и генетика, 2005. - №2. - С. 2-4.

46. Машуров, A.M. Генетические маркеры в селекции животных/ A.M. Машуров. М.: Наука, 1980. - 315 с.

47. Новиков, А.А., Генетическая экспертиза племенного материала / А.А. Новиков, Н.И. Романенко // Зоотехния, 2001. - № 7. - С. 14-18.

48. Озеров, М.Ю. Генетический профиль у различных пород овец по микросателлитам / М.Ю. Озеров, Н.С. Марзанов, М.Г. Насибов, Ю. Кантанен, М. Тапио // Вестник РАСХН, 2003. №5. - С.72-75.

49. Озеров, М.Ю. Использование микросателлитных локусов для определения достоверности происхождения потомства овец / М.Ю. Озеров, Н.С. Марзанов, М. Тапио, Л.К. Марзанова, С.Н. Петров, Ю. Кантанен // Доклады РАСХН, 2007. № 2. - С. 32 - 36.

50. Омельченко, П.И. Группы крови у свиней и способ их определения / П.И. Омельченко. Труды Укр. ин-та животн., вып 20, Харьков, 1949.

51. Павличенко, В.П. Использование полиморфизма групп крови для повышения жизнеспособности поросят / В.П. Павличенко // Вестник с.-х. науки, 1975. №11. - С. 68 - 72.

52. Принцип метода ПЦР (молекулярно-биологическая основа) / ЗАО Лабораторная диагностика Электронный ресурс. // Режим доступа к ресурсу: http: // www.lytech.ru / Inform / pcrmethod.htm/ 2006. свободный.

53. Сердюк, Г.Н. Иммуногенетика свиней: теория и практика / Г.Н. Сердюк. Санкт-Пербург, Лекс-Стар, 2002. - 390 с.

54. Сердюк, Г.Н. Использование иммуногенетических маркеров в селекции животных / Г.Н. Сердюк // Современные методы генетики и селекции в животноводстве: международная научная конференция, 26-28 июня, 2007. Санкт-Петербург, С. 240 245.

55. Серебровский, А.С. Генетические основы селекции / А.С. Серебровский // Племенное дело в крестьянском хозяйстве. М., 1928. С. 46 -49.

56. Сулимова, В.В. Методическое пособие: Анализ полиморфизма ДНК с использованием метода полимеразной цепной реакции / В.В. Сулимова М., 1999.- 43 с.

57. Терлецкий, В.П. Микросателлитные маркеры в изучении популяций животных / В.П. Терлецкий, Л.В. Козикова, Киселева Т.Ю. // Материалы международной научно-практической конференции «Разведение и генетика тварин», Киев, Вып. 31-32, 1999. С. 242-243.

58. Тихонов, В.Н. Генетические системы групп крови животных / В.Н. Тихонов. Новосибирск, Наука, 1965. - 116 с.

59. Тихонов, В.Н. Использование групп крови при селекции животных / В.Н. Тихонов. М.: Колос, 1967. - 391 с.

60. Тихонов, В.Н. Иммуногенетика и биохимический полиморфизм домашних и диких свиней / В.Н. Тихонов. Новосибирск, Наука, 1991. - 301 с.

61. Удина, И.Г. Оценка генетического разнообразия отечественных пород лошадей с помощью молекулярно-генетических методов / И.Г. Удина, М.В. Костюченко // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук, 2004, № 2, С. 32-35.

62. Храброва, Л.А. Маркер-вспомогательная селекция в коневодстве./ Л.А. Храброва // ВНИИ коневодства, 2002. 1-4 с.Электронный ресурс. // Режим доступа: (http://www.ruhorses.ru). 2002 - свободный.

63. Хуан, Лу Шен Биохимические и иммунологические маркеры крови и перспективы их использования в разведении свиней Китая и России: докт.канд. биол. наук: 03.00.23: защищена: 29.11.94 / Хуан, Jly Шеен. п. Дубровицы, Моск. обл., 1994. - 32 с.

64. Чинаров, Ю. Метод племенной оценки свиней на основе BLUP / Ю. Чинаров, Н.А. Зиновьева, Л.К. Эрнст // Животноводство России, 2007, № 2, С. 45-47.

65. Шавырина, К.М. Тестирование свиней по эритроцитарным антигенам / К.М. Шавырина, А.А. Новгородов // Методы исследований в биотехнологии сельскохозяйственных животных: школа-практикум. Дубровицы. 2002. Вып 1. С.72-78.

66. Шавырина, К.М. Иммуногенетическое тестирование свиней / К.М. Шавырина // Методы исследований в биотехнологии сельскохозяйственных животных: школа-практикум. Дубровицы. 2003. Вып 2. С.53-59.

67. Шавырина, К.М. Использование иммуногенетического маркирования в совершенствовании свиней / Шавырина К.М., И.В. Гусев, А.Ю. Филимонов // Методы исследований в биотехнологии сельскохозяйственных животных: школа-практикум. Дубровицы. 2004. Вып 3. С.53-59.

68. Шайхаев, Г.О. Набор реагентов Diatom™ DNA Prep 100 для выделения ДНК из различного биологического материала. / Г.О. Шайхаев. -ООО «Лаборатория Изоген», 2006. 4 с.

69. Шибата, Д.К. ПЦР и молекулярно-генетический анализ биоптатов / Д.К. Шибата // Молекулярная клиническая диагностика. -М.: Мир. 1999. - С 395 - 428.

70. Эйдригевич, Е.В. Интерьер сельскохозяйственных животных / Е.В. Эйдригевич, Раевская В.В. М., Колос, 1978. - 88 с.

71. Эрнст, Л.К. Проблемы селекции и биотехнологии сельскохозяйственных животных / Л.К. Эрнст. М.: РАСХН, 1995. - 359 с.

72. Юрасов, Н.А. Основы и методы селекции лошадей / Н.А. Юрасов // Племенное дело в крестьянском хозяйстве. — М., Книгосоюз, 1928.

73. Alford, R.B. Rapid and efficient resolution of parentage by amplification of short tandem repeats / R.B. Alford, H.A. Hammond, I. Coto, C.T. Caskey // Am. J. Hum Genet. 1994. - 55, 190 - 195.

74. Andersen, E., Blood groups in pigs. // Ann. N. Y. Acad. Sci., 1962. V. 97, P. 205-225.

75. Arranz, J.J. Genetic relationships among Spanish sheep using microsatellites / J.J. Arranz Y. Bayon., F. San Primitivo // Anim. Genet. 1998. -29(6). - 435-440.

76. Balloux, F. The estimation of population differentiation with microsatellite markers / F. Balloux, N. Lugon Moulin // J. Molec. Ecol., 2002. -11, 155-165.

77. Barker, J.S.F. Genetic variation within and relationships among populations of Asian goats (Capra hircus) / J.S.F. Barker, S.G. Tan, S.S. Moore, Т.К. Mukherjee, J.-L. Matheson, O.S. Selvarai // J. Anim. Breed. Genet. 2001. -Vol. 118.-P. 213-233.

78. Beridze, T. Satellite DNA / T. Beridze. Springer Verlag. Berlin, Heidelberg, 1986.

79. Britten, R.J. Repeated segments of DNA / R.J. Britten, D.E. Kohne // Sci. Am. (Apr.). 1970. - 222: 24 - 31.

80. Bruford, M.W. Microsatellites and their application to population genetic studies / M.W. Bruford, R.K. Waine // Curr. Opin. Develop, 1993.-3: 939-943.

81. Buchanan, F.C. Microsatellites and associated repetitive elements in the sheep genome / F.C. Buchanan, R.P. Littlejohn, S.M. Galloway, A.M. Crawford // Mamm Genome. 1993. 4. - 258 - 264.

82. Canon, J. The genetic structure of Spanish Celtic horse breeds inferred from microsatellite data / J. Canon, M.L. Checa, C. Carleos, J.l. Vega-Pla, M. Vallejo, S. Dunner // J. Animal Genetics. 2000. 31, 39 - 44.

83. Coppieters, W. Characterization of porcine polymorphic loci / W. Coppieters, S.-J. Li, A. Van de Weghe, L. Peelman, A. Depicker, A. Van Zeveren, Y. Bouquet // J. Animal Genetics. 1993. - V. 24. - 163 - 170.

84. Dib, С. A comprehensive genetic map of the human genome based on 5264 microsatellites / C. Dib, S. Faure, C. Fisanes et al. // Nature. 1996. - Vol. 380.- P. 152- 154.

85. Diehl S.R., Ziegle J., Buck G.A., Reynolds T.R., Weber J.L. // Amer. J. Hum. Genet. 1990. - V. 47. - P. A177.

86. Diez-Tascon, C. Genetic variation within the Merino sheep breed: analysis of closely related populations using microsatellites / C. Diez-Tascon, R.P. Littlejohn, P.A.R. Ameida, A.M. Crawford//J. Animal Genetics. 2000.- 31: 243 -251.

87. Dimsoski, P. Microsatellite variation in yorkshire and large white pigs / P. Dimsoski, H.C. Hines, K.M. Irvin // J. Animal Science. 1996. - 343-345.

88. Dinklage, H. Results of the 3rd pig blood grouping comparison test. // H.tb

89. Dinklage. In: Y 1 Ruropean Conf. Anim. Blood Grpo & Biohem. Polimorph.; Polish Scientific publishers, Warsaw, 1970. - pp. 359 - 361.

90. Erlich, H. A. Resent advances in the polymerase chain reaction / H. A. Erlich, D. Gelfand, J.J. Sninsky // Sc. 1989. -P.1643 - 1650.

91. Fischbein, M. Isoagglutination in main and lower animals / M. Fischbein. J. Infect. Diseases, 1913. - V. 12. - 133 - 139.

92. Fredholm, M. Efficient resolution of parentage in dogs by amplification of microsatellites / M. Fredholm, A.K. Wintero// J. Animal Genetic. 1996. 27. -19-23.

93. Gahne, В Immunogenetics and biochemical genetics as a tool in pig breeding programmes. / Gahne В // Acta agric. scand., 1979. suppl. 21: 185 — 197.

94. Georges, M. Microsatellite mapping of the gene causing weaver disease in cattle will allow the study of an associated quantitative trait locus / M. Georges, A.B. Dietz, A. Mishra // Proc. Natl. Acad. Sci. 1993a. USA, 90: 1058-1062.

95. Goldstein, D. An evaluation of genetic distances for use with microsatellite loci // D. Goldstein, A. Linares., L. Cavalli-Sforza L, M. Foldman // Genetics. 1995/- Vol. 139. -P.463-471.

96. Glowatski Mullis, M.L. Microsatellite based parentage control in cattle / M.L. Glowatski - Mullis, C. Gaillard, G. Wigger, R. Fries // J. Animal Genetics. -1995.-26.-7-12.

97. Hohenhorst, J. Use microsatellites for parentage control in pigs. / J. Hohenhorst, R. Fries, P. Vogeli, G. Stranzinger. // J. Animal Genetics. 1994. -25 (2). - 33.

98. Innis, M. A. Optimisation of PCR. PCR protocols: A guide to methods and applications / M. A. Innis, D.N. Gelfand, J J. Sninsky, T .J. White // Academic Press, San Diego. 1990. P. 3 - 12.

99. Jeffrey, A J. Individual specific fingerprints of human DNA / A.J. Jeffrey, V. Wilson, S.L. Thein//Nature. 1985.-316, 76-79.

100. Jeffreys, A. J. Hypervariable minisatelite regions in human DNA / A. J. Jeffreys, V. Wilson, S.L. Thein // Nature. 1985. - 314: 66 - 73.

101. Johansson, M. Cloning and characterization of highly polymorphic porcine microsatellites / M. Johansson, H. Ellegren, L. Andersson // J. Hered. 1992.-83: 196-198.

102. Jorde, L.B. The distribution of human genetic diversity: a comparison of mitochondrial, autosomal, and Y-chromosome data / L.B. Jorde, W.S. Watkins, MJ. Bamshad et al. // Am. J. Hum. Genet. 2000. - V. 66. P. 979 - 988.

103. Kacirek, S.L. Variation at microsatellite loci in the large white, Yorkshire and Hampshire breeds of swine / S.L. Kacirek, K.M. Irvin., P.I. Dimsoski., M.E. Davis, H.C. Hines // J. Research and reviews. 1998. - 41- 43.

104. Kaempffer, A. Uber ein zweites Isoagglutinogen Agglutininpaar В in Schweineblut./ Kaempffer A. - Z. Rassenphysiol., 1932. - Bd. 5, 53-58.

105. Kantanen, J. Genetic diversity of domestic cattle (B. Taurus) in North Europe. Joensuu / J. Kantanen, 1999. - 100р.

106. Korenberg, J.R. Human genome organization: Alu, Lines, and the molecular organization of metaphase chromosome bands / J.R. Korenberg, M.C. Rykowski // Cell. 1988. - 53: 391 - 400.

107. Laval, G. Genetic diversity of eleven European pig breeds / G. Laval, N. Iannuccelli, C. Legault // Gen. Sel. Evol. (Paris). 2000. 32: 187 - 203.

108. Lenstra, J. A. Short interspersed nuclear element (SINE) sequences of the Bovidae / J.A. Lenstra, J. A. Van Boxtel, K.A. Swaagstra, M. Schwerin // Animal Genetic. -1993. 24, 33-39.

109. Levinson, G. Slipped-strand mispairing: a major mechanism for DNA sequence evolution / G. Levinson, G. A. Gutman. // Mol. Biol. Evol. 1987. -4(3).-203-221.

110. Li, К. Analisis of diversity and genetic relationships between four Chinese indigenous pig breeds and one Australian commercial pig breed / K. Li, B. Fan, S. Zhao, Z. Peng, K. Li, Y. Chen, C. Moran. // J. Animal Genetics. 2000. -V. 31.-322-325.

111. Li, X. The genetic diversity of seven pig breeds in China, estimaited by means of microsatellites. Asian-Australas. // X. Li, K. Li, B. Fan, Y. Gong, S. Zhao, Z. Peng, B. Liu // J. Animal Science. 2000. 13: 1193 - 1195.

112. Li, S.-J. Genetic diversity analyses of 10 indigenous Chinese pig populations based on 20 microsatellites / S.-J Li, S-H. Yang, S.-H. Zhao, B. Fan, M. Yu, H.-S. Wang, M.-H. Li, B. Liu, T.-A Xiong, K. Li // J. Animal Science. -2004.-82: 368-374.

113. Litt, M. A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene / M. Litt, J.A. Luty // Am. J Hum. Genet. 1989. - 44(3) -397-401.

114. Luca, L. The DNA revolution in population genetics. / L. Luca, L.L. Cavali Sforza // Trends Genet. - 1998. - 14: 60-65.

115. Luikart, G. Power of 22 microsatellite markers in fluorescent multiplexes for parentate testing in goats (Capra hircus) / G. Luikart, MP Biju-Duval, O. Ertugrul, Y. Zagdsuren, C. Maudet, P. Taberlet //J. Animal Genetic. 1999. - 30: 431-438.

116. MacHugh, D.E. Genetic structure of seven European cattle breeds assessed using 20 microsatellite markers / D.E. MacHugh, R.T Loftus., P. Cunningham., D.G. Bradley. // Anim. Genet. 1998. - 29 (5): 333-340.

117. Marklund, S. Parentage testing and linkage analysis in the horse using a set of highly polymorphic microsatellite / H. Ellegren, S. Erikson, K. Sandberg, L. Anderson // J. Animal Genetic. -1994. 25.- 19-23.

118. Martinez, A.M. Genetic structure of the Iberian pig breed using microsatellites / A.M. Martinez, J.V. Delgado, A. Rodero, J.L. Vega-Pla // J. Animal Genetics. 2000. - V. 31. - 295 - 301.

119. Milan D, Groenen MAM (1998): Panel of markers for diversity studies. Электронный' ресурс. / Режим доступа: http: // www.toulouse.inra.fr/lgc/pig/panel.htm.- свободный

120. Moran, С. Microsatellite repeats in pigs and chicken genomes / C. Moran // J. Hered.- 1993. 84, 274-280.

121. Nechtelberger, D DNA microsatellite analisis for parentage control in Austrian pigs / D. Nechtelberger, C. Kaltwasser, I. Stur, J-N. Meyer, G. Brem, M. Muller, S. Muller // J. Animal Biotechnology. 2001. - 12(2): 141-144.

122. Nei, M. Genetic polymorphism and the role of mutation in evolution / M. Nei, R. Koehn // Evolution Genes and Proteins. 1983. pp. 165 - 90. Sunderland.

123. Paetkau, D. Genetic assignment methods for the direct, real-time estimation of migration rate: a simulation-based exploration of accuracy and power / D. Paetkau, R. Slade, M. Burdens, A. Estoup // Molecular Ecology. 2004. - 13, 55-65.

124. Pazrec, A.A. Livestock variation of linked microsatellite markers in diverse swine breeds. / A.A. Pazrec, G.H. Flickinger, L. Fontanezi, G.A. Rohner, L. Alexander, C.W. Beatie, L.B. Schook // J. Animal Biotechnology. 1998b. 9, 55-66.

125. Perez, E, Preliminary genetic characterization of Cuban Creole PIG using microsatellites. / E. Perez, A.M. Martinez, J. L. Vega, J.V. Delgado, F. Velazquez, C.J. Barba // J. Arch. Zootec, 2004. V. 53. - 349-352.

126. Pritchard, J.K. Inference of population structure usingmultilocus genotype data / J.K. Pritchard, M. Stephens, P. Donelly // Genetics. 2000. - Vol. 155.-P. 945-959.

127. Putnova, L. A novel porcine microsatellite panel for the identification of individuals and parentage control in the Czech Republic / L. Putnova, A. Knoli, V. Dvorak, J. Dvorak // Czech J. Anim Sci., 48, 2003 (8): 307-314.

128. Rasad, S.D. Abstammungs — und Identitatskontrolle beim Schwein mettels Microsatellitenanalyse / Gottingen, Cuviller, 2001 -XTV, 125 c.

129. Robic, A. Isolation of 28 new porcine microsatellites revealing polymorphism. / A. Robic, M. Dalens, N. Wolossyn, D. Milan, J. Riquet, J. Gellin // J. Mamm Genome, 1994. 5: 580-583.

130. Saiki, R.K. Enzymatic amplification of fi-globulin genomic sequences and restriction site analisis for diagnosis of sickle cell anemia / R.K. Saiki., S.J. Scharf, F. Faloona et al. // Science. 1985. - V. 230. - P.1350 - 1354.

131. Saison, R. Report of a blood group system in swine / R. Saison J. Immunol. 1958. - V. 80, № 6, 463-467.

132. Saitbekova, N. Genetic diversity in swiss goat breeds on microsatellite analisis / N. Saitbekova, C. Gaillard, G. Obexer-Ruff, G. Dolf // Anim. Genet. -1999.-30.-36-41.

133. Schlotter, C. Microsatellites. Molecular Genetic Analysis of Population. / A. Practical Approach. Second Editior. 1998. pp. 238-261.

134. Singer, M.R. SINE and LINEs: Highly repeated short and long interspersed sequences in mammalian genomes / M.R. Singer // Cell. 1982. - 28: 433-34.

135. Smith, C.A.B. A note on genetic distance / C.A.B. Smith. Ann. Human Genet. - 1977. -21:254-276.

136. Stallings, R. L, Evolution and distribution of (GN)„ repectitive sequences in mammalian genomes. / R. Ford, O. Nelson // Genomics. 1991, 10: 807-815.

137. Szymanowski, L. Les groupes serologiques dans le sang du pore et leur relation avec les groupes du sang human / L. Szymanowski, S. Stetkiewicz, B. Wachler. C. r. soc. boil., 1926. - V. - 94.

138. Takezaki, N. Genetic distances and reconstruction of phylogenetic trees from microsatellite DNA. / N. Takezaki, M. Neim // Genetics, 1996. 144 (1): 389-399.

139. Tautz, D. Simple sequences are ubiquitous repetitive components of eukaryotic genomes / D. Tautz, M. Renz // Nucl Acids Res. 1984. 12, 389 - 399.

140. Tautz, D. Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers / D. Tautz 1989. Vol.17. - P. 6463-6471

141. Vaiman, D., Conservation of a synthenic group of microsatellite loci between cattle and sheep / D. Vaiman, M. Immam-Chali, K. Moazami-Goudarzi, G. Guerin, M. Nocart, C. Grobs, H. Leveziel, N. Saidi-Mehtar // Mammalian Genome. 1996. - P. 676-683.

142. Van Zeveren, A. A genetic study of four Belgian pig population by mean of seven microsatellite loci // A. Van Zeveren, A. Peelman, A. Van de Weghe, A. Boughe, Y. Bouquet. // J. Anim. Breed Genet. 1995. - 112: 191-204.

143. Vogt, P. Potential genetic function of tandem repeated DNA sequence blocks in human genome are based on highly conserved chromatine folding code / P. Vogt. Human Genetics. - 1990. - Vol. 84. P. 301-336.

144. Weber, J.L. Abundant class of human DNA polymorphism which can be typed using the polymerase chain reaction / J.L. Weber, P.E. May // Am. J. Hum. Genet. 1989. -V. 44. - P. 388-396.

145. Weber, J.L. Informativeness of human (dC-dA)n(dG-dT)n polymorphisms / J.L. Weber. Genomics. - 1990. - Vol.7. - P. 524-530.

146. Wintero, A. K. Variable (dG dT)n(dC - dA)n sequences in the porcine genome. / A. K. Wintero, M. Fredholm, P. D. Thomsen // Genomics. - 1992, 12: 281-288.

147. Ziegle, J.S. Application of automated DNA sizing technology for genotyping microsatellite loci / J.S. Ziegle, Y. Su., K.P. Corcoran, L. Nie, P.E. Mayrand, L.B. Hoff, L.J. Mcbride, M.N. Kronic., S.R. Diehl. // Genomics. 1992. -V. 14.-P. 1026-1031.

148. Zhou, H. Genetic characterization of biodiversity in highly inbred chicken by microsatellite markers / H. Zhou, S.J. Lamont // J. Animal Genetic. — 1999.-30:256-264.