Мультифункциональные полиэлектролитные микрочастицы для пероральной доставки рекомбинантных инсулинов

Печенкин, Михаил Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Мультифункциональные полиэлектролитные микрочастицы для пероральной доставки рекомбинантных инсулинов
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Мультифункциональные полиэлектролитные микрочастицы для пероральной доставки рекомбинантных инсулинов"

На правах рукописи

Печепкпн Михаил Алсксапдропич

МУЛЬТИФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫЕ МИКРОЧАСТИЦЫ ДЛЯ ПЕРОРАЛЫЮЙ ДОСТАВКИ РЕКОМГЛШАНТНЫХ 1ШСУЛИНОВ

03.01.06 — Биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 02.00.06 - Высокомолекулярные соединения

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва -2012 005047918

005047918

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научпые руководители:

доктор химических наук, профессор Изумрудов Владимир Алексеевич

кандидат химических наук, доцент Балабушевич Надежда Георгиевпа

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Лозинский Владимир Иосифович

Институт элементоорганических соединений им. А Н. Несмеянова РАН

доктор химических наук, профессор Варламов Валерий Петрович Центр «Биоинженерия» РАН

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита состоится « ноября 2012 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета

Д 501.001.59 по химическим наукам в Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991 Москва, Ленинские Горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ имени М.В. Ломоносова, Фундаментальная библиотека (Ломоносовский просп. 27).

Автореферат разослан « октября 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук Сакодынская И.К.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Сахарным диабетом в мире болеют более 300 миллионов человек, причем 10 - 15 % из них страдают диабетом первого типа, при котором инсулин в поджелудочной железе не синтезируется совсем или вырабатывается, но в недостаточном количестве. Больные вынуждены строго контролировать уровень глюкозы в крови путем постоянных инъекций инсулина, что, в свою очередь, может привести к таким нежелательным последствиям, как гиперинсулинемия и липоатрофия.

Пероральная доставка является наиболее естественным и удобным способом введения инсулина, а ключевым доводом в пользу такой схемы является явное предпочтение большинством пациентов таблеток перед инъекциями. Пероральное введение обладает еще одним важным преимуществом. В норме секретируемый в поджелудочной железе инсулин попадает в печень, которая контролирует количество гормона, достигающего остальных органов и тканей. При пероральном введении инсулин из тонкого кишечника через брыжеечную и воротную вены также в первую очередь попадает в печень. Иными словами, и в этом случае осуществляется контроль количества инсулина, отсутствующий при инвазивном введении или при доставке гормона другими путями.

Однако, несмотря на множество предложенных систем пероральной доставки и даже наличия препаратов, проходящих различные фазы клинических испытаний, в настоящее время на рынке имеется лишь одна клиническая форма неинвазивного инсулина - буккальная (т.е. вводимая через внутреннюю сторону щеки). Серьезным тормозом на пути создания лекарственных средств является крайне незначительная биодоступность белков, вводимых перорально, которая не превышает 1 — 2 %. Это обусловлено гидролизом белка при экстремальных значениях рН желудочного сока, расщеплением белка под действием протеолитических ферментов желудка и тонкого кишечника и, наконец, плохой проницаемостью эпителия кишечника для больших белковых молекул. В связи с этим особенно актуальна разработка пероральной системы доставки, обеспечивающей относительно высокую биодоступность гормона. Перспективным развитием этого направления является использование полиэлектролитных микро- и наночастиц, позволяющих осуществлять направленную доставку гормона в тонкий кишечник с последующим его высвобождением при минимуме побочных эффектов. В целях обеспечения безопасности при пероральном введении следует применять биосовместимые и биодеградируемые полимеры, среди которых важное место занимает катионный полисахарид хитозан, обладающий мукоадгезивными свойствами, усиливающими абсорбцию веществ эпителием кишечника.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось получение полиэлектролитных микрочастиц, обеспечивающих повышенную биодоступность рекомбинантных инсулинов при пероральном применении.

Микрокапсулирование инсулина осуществляли последовательной адсорбцией разноименно заряженных полисахаридов на микроагрегатах нерастворимого комплекса белок-полианион [Балабушевич Н.Г. и др., 2010]. Подход не требует сложного аппаратурного оформления и осуществляется в мягких условиях, способствующих сохранению биологической активности белков [Балабушевич Н.Г. и др. 2004; Balabushevich N.G. et al., 2005]. В основе метода лежит электростатическое взаимодействие молекул белка с противоположно заряженным полиэлектролитом и полиэлектролитов друг с другом. В работе были поставлены следующие задачи:

• Получить и охарактеризовать полиэлектролитные микрочастицы, содержащие рекомбинаптные инсулины.

• Выявить свойства микрочастиц, обеспечивающие увеличение биодоступности инсулина при пероральном введении.

• Включить в полиэлектролитные микрочастицы белковые ингибиторы протеолитических ферментов для защиты микрокапсулированного инсулина от воздействия протеаз желудочно-кишечного тракта.

• Оценить in vivo биологическое действие препарата микрокапсулированного инсулина.

Научная повизна работы.

Впервые постадийной адсорбцией анионного полисахарида декстрансульфата и катионного полисахарида хитозана на микроагрегатах нерастворимого комплекса инсулип-декстрансульфат получены микрочастицы, содержащие рекомбинантные инсулины (инсулин человека и его быстродействующие аналоги аспарт и лизпро). Изучено изменение характеристик микрочастиц в условиях прохождения желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), а именно, рН-чувствительности, мукоадгезивных свойств и эффективности связывания частицами ионов кальция. Продемонстрировано сочетанное воздействие мультифункциональных полиэлектролитных микрочастиц с четырьмя стадиями сорбции полиэлектролитов (на последней стадии сорбции нанесен хитозан) на основные факторы, повышающие биодоступность инсулина при пероральной доставке.

Разработаны способы включения белковых ингибиторов протеаз в полиэлектролитные микрочастицы. Исследовано одновременное воздействие микрохапсулирования и введения белковых ингибиторов протеаз в низких дозах на предотвращение протеолиза рекомбинантных инсулинов.

Практическая зпачпмость работы.

Микрочастицы, полученные четырьмя стадиями сорбции полиэлектролитов, обладали мукоадгезивными свойствами и защищали микрокапсулированный инсулин от действия пепсина, трипсина и химотрипсина. Наличие в микрочастицах белковых ингибиторов протеаз, в частности соевого ингибитора типа Баумана-Бирк в концентрациях, не превышающих 2 - 3 % от массы препарата, полностью предотвращало протеолиз инсулина человека протеазами ЖКТ.

In rivo показано сохранение активности инсулина в процессе инкапсулирования белка. После перорального введения микрокапсулированного гормона крысам со стрептозотоцин-индуцированным диабетом продемонстрировано наличие инсулина человека в крови и гипогликемическое действие в низких дозах 10 и 25 МЕ/кг.

Для характеристики микрочастиц разработана простая спектрофотометрическая методика определения концентрации хитозана в смесях с белками и декстрансульфатом. Показана применимость методики для определения хитозана в смесях при условии независимого определения концентрации белка.

Аппобаппя работы. Основные результаты работы представлены на Пятой и Шестой Курчатовских молодежных научных школах (Москва, 2007, 2008), XV и ХУП Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2008; 2010), 9, 10 и 11 Международных конференциях «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (Ставрополь, 2008; Нижний Новгород, 2010; Мурманск, 2012), V и VI Московских международных конгрессах «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009; 2011), выставке инновационных проектов Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (Москва, 2009), 2nd PharmSciFair (Ницца, Франция, 2009), Young pharmaceutical scientists meet in Nice (Ницца, Франция, 2009), International conference "Biocatalysis-2009: Fundamentals & Applications" (Архангельск, 2009), Первом и Втором Международных симпозиумах «Биофарма: от науки к промышленности» (Анталия, Турция, 2009; Ереван, Армения, 2010), the 7th World Meeting on Pharmaceutics, Biopharmaceutics and Pharmaceutical Technology (Валетга, Мальта, 2010), the 1st Russian-Hellenic Symposium with International Participation and Young Scientist's School "Biomaterials and Bionanomaterials: Recent Advances Safety and Toxicology Issues" (Ираклион, Греция, 2010), Московской международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии» (Москва, 2012).

По результатам конкурса Российского хитинового общества в 2010 г. работа была удостоена премии имени академика П.П. Шорыгина.

Связь работы с научными программами и проектами. Представленные результаты получены в ходе исследований, проводившихся в рамках Грантов РФФИ № 05-04-48747-а и №09-04-01431-а, участником которых был соискатель.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 23 печатные работы, из них 3 статьи и 20 тезисов докладов на конференциях.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из списка сокращений, введения, обзора литературы (главы 1 - 3), постановки задачи, экспериментальной части (глава 4), результатов и обсуждения (главы 5 - 7), заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 244 ссылки. Работа изложена на 157 страницах и содержит 54 рисунка и 27 таблиц.

Список использованных сокращений приведен на странице 20 автореферата.

***

Автор выражает благодарность своему первому научному руководителю, ныне покойной профессору, доктору химических наук Ларионовой Наталье Ивановне.

1. Разработка метода определения хитозана в смеси с белком н декстрансульфатом Поскольку при получении полиэлектролитных микрочастиц планировалось использовать катионный полисахарид хятозая (Хит), со всей остротой встала проблема определения его содержания в препаратах, содержащих белки и полианионы. В основе разработанной методики лежит известный способ определения первичных аминогрупп, основанный на их взаимодействии с ортофталевым альдегидом (о-ФА) и тиольным реагентом Ы-ацетил цистеином (АЦЦ) с образованием хромофорных соединений, поглощающих при 340 нм (рис. 1) [Гуранда Д.Т. и др.,

X = 340 нм

Рис. 1. Схема фотометрической реакции, лежащей в основе методики определения первичных аминогрупп.

Так как молекулы инсулина (Инс) и хитозана содержат первичные аминогруппы, оба компонента участвуют в фотометрической реакции. Предварительно установив концентрацию белка независимым методом и рассчитав спектрофотометрически суммарное содержание инсулина и хитозана в анализируемом образце, определяли концентрацию хитозапа в системе. При проведении реакции в 0,2 М боратном буферном растворе, рН 9,6, и одинаковой молярной концентрации аминогрупп оптическая плотность хромофорного соединения с инсулином была втрое выше, чем с хитозаном. При рН 8,9 чувствительность метода к аминогруппам понижалась,

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

2004].

НБ-Я

а вклад инсулина в значение оптической плотности хромофорных соединений уменьшался

О-глюкозамина по спектрофотометрической методике. 0,2 М боратный буфер, рН 8,9, [о-ФА] = 4-10"3 М, [АЦЦ] - 2,6-10'3 М, 0,25 М №С1, время инкубации I ч.

Введение в реакционную смесь анионного полисахарида декстрансульфата (ДС) сопровождалось понижением оптической плотности, причем рассчитанное содержание хитозана оказывалось в 2,5 - 3 раза меньше ожидаемого. Для подавления электростатических взаимодействий декстрансульфата с хитозаном и белком анализ проводили в 0,25 М №С1. Нижний предел определения хитозаиа составил около 10 мкг/мл.

Концентрацию хитозана в модельной смеси, состоявшей из инсулина и декстрансульфата, рассчитывали по формуле:

[Хит] = ЧИ"с|х'!:и"' мг/мл,

J Чхп

где: 12п„с и 1!>хнт - тангенс угла наклона градуировочного графика соответственно для инсулина и хитозана, [Инс] - концентрация инсулина, мг/мл; А4МССи - значение оптической плотности модельной смеси за вычетом оптической плотности реагента при 340 нм после 1 ч инкубации.

Таблица 1, Результаты определения концентрации хитозана в модельных смесях по разработанной методике.

Состав смеси, мг/мл Определенное содержание хитозана, мг/мл Погрешность

Инс ДС Хит

0,460 0,170 0,085 0,090 +6%

0,125 0,040 0,080 0,086 +7%

0,125 0,040 0,040 0,038 -5%

Рассчитанная таким образом концентрация хитозана отличалась от реальной не более чем на 7 % в трех модельных смесях (табл. !). Метод использовали для определения содержания хитозана в полиэлектролитных микрочастицах, после их разрушения при рН 12.

2. Полиэлектролитные микрочастицы с рскомбппантными инсулппамн

В полиэлектролитные микрочастицы включали рекомбинантный инсулин человека и его быстродействующие аналоги аспарт и лизпро, имеющие различия в 28 и 29 положениях В-цепи и менее склонные к образованию гексамеров (табл. 2). Препараты белков предоставлены опытно-биотехнологическим производством Института биоорганической химии им. академиков М М Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Таблица 2. Характеристики рекомбинантных инсулинов, использованных для микрокапсулирования.

Характеристика Инсулин

Человека Аспарт Лизпро

Аминокислотные изменения РгоВ28, ЬуяВ29 АярВ28, ЬузВ29 ЬузВ28, РгоВ29

Молекулярная масса, Да 5808 5826 5808

Р1 5,35 5,10 5,35

Микрокапсулирование осуществляли при рН 3,0 в 0,15 М №С1 в два этапа (рис. 3). Вначале смешением растворов инсулина и полианиона готовили микроагрегаты нерастворимого полиэлектролитного комплекса (белок-полианион), на который затем последовательно адсорбировали поликатион и полианион, получая микрочастицы с заданным числом стадий сорбции полиэлектролитов (з).

Раствор Инс Микрочастицы

в=2 э=4

(Инс-ПА)

Рис. 3. Схема получения инсулинсодержащих полиэлектролитных микрочастиц. ПА - полианион, ПК - поликатион, я - число стадий сорбции полнэлектролитов.

Использовали поликатион хитозан (400 кДа, степень деацетилирования 85%, «Р1ика», Швейцария) и декстрансульфат (500 кДа, 2,3 сульфатных группы на звено, «Р1ика», Швейцария), выбранный в качестве полианиона по сравнению с альгинатом средЕ1ей вязкости из-за образования микрочастиц меньшего размера, сохраняющих целостность при рН 6,0.

Па первом этапе готовили нерастворимые микроагрегаты (Инс-ДС) при различных соотношениях белок:полианион (табл. 5).

Таблица 3. Характеристика микроагрегатов нерастворимого полиэлектролитного комплекса (инсулин-декстрансульфат).

Инс:ДС Эффективность ^-потенциал, Средний размер

в смеси (вес.) включения Инс, % мВ частиц, мкм

7:1 38±1 19±2 3±1

5:1 94±2 7±1 3±2

4:1 98±3 -29±3 5±2

Инверсия знака заряда частиц наступала вблизи соотношения 5:1, а дальнейшее введение декстрансульфата приводило к существенному возрастанию отрицательного заряда. При соотношении 4:1 эффективность включения обоих компонентов была максимальной, средний размер частиц составил 5 мкм, а отрицалельный ^-потенциал поверхности позволял проводить дальнейшую адсорбцию полиэлектролитов. В среднем, с одной молекулой декстрансульфата связывалось около 60 гексамеров инсулина человека.

На втором этапе микроагрегаты нерастворимого комплекса, приготовленные при оптимальном соотношении Инс:ДС = 4:1, обрабатывали растворами полиэлектролитов до достижения числа стадий сорбции от 2 до 4 (табл. 4).

Таблица 4. Характеристика полиэлектролитных микрочастиц с инсулином.

Микрочастицы Число стадий сорбции (э) Эффективность включения Инс, % Содержание, % масс. Размер, мкм ¡¡-потенциал, мВ

Инс ДС Хит

[Инс-ДС) 1 97±3 81±4 17±5 - 5±2 -29±3

[Инс-ДС)-Хит 2 67±2 63±3 21±3 19±2 6±2 22±2

(Инс-ДС)-Хит-ДС 3 65±3 57±2 28±5 15±2 5±3 -39±4

(Инс-ДС)-Хит-ДС-Хит 4 65±3 57±4 26±3 17±2 6±3 29±3

Вторая стадия характеризовалась значительными потерями белка из-за конкурентного воздействия вводимого хитозана. Будучи более сильным полиэлектролитом, хитозан частично вытеснял инсулин из его комплекса с декстрансульфатом, образуя более стабильный полиэлектролитный комплекс (ДС-Хит). Последующие стадии обработки микрочастиц

полиэлектролитами практически не оказывали влияния на эффективность включения белка. Содержание полиэлектролитов в комплексах возрастало с каждой стадиен сорбции, а ¡¡-потенциал микрочастиц менял знак в зависимости от того, какой полиэлектролит использовали последним.

По данным конфокальной и растровой электронной микроскопий (рис. 4) микрочастицы представляли собой образования неправильной формы среднего размера 2-10 мкм. Размер и вид частиц мало зависели от числа стадий сорбции полиэлектролитов, и они повторяли форм}' микроагрегатов (Инс-ДС), на которых были сформированы.

Рис. 4. Конфокальная (А) и растровая электронная (Б) микрофотографии инсулинсодержащих полиэлектролитных микрочастиц (б = 4), образованных с использованием декстрансульфата и хитозана.

По величине и знаку ¡¡-потенциала можно судить о полноте сорбции полнэлсктролитов и проявлении мукоадгезивных свойств микрочастиц. Благодаря концевым остаткам сиаловых кислот мукополисахаридов слизистая тонкого кишечника заряжена отрицательно. Соответственно, положительный заряд микрочастиц, покрытых хитозаном (з = 2, 4), должен способствовать проявлению их мукоадгезивных свойств. Поскольку микрочастицы, полученные на второй стадии сорбции (э = 2), частично высвобождали белок в кислых средах, для дальнейших исследований отобрали более стабильные частицы с четырьмя стадиями сорбции (з = 4), в которых соотношение Инс:ДС:Хит составляло 3,5:1,5:1. Суспензия микрочастиц оставалась стабильной во время хранения при 4° С, а после лиофильного высушивания микрочастицы легко ресуспендировались в 0,15 М КаС1 при рН 3,0, восстанавливая первоначальные форму и размер.

Аналогичным образом готовили полиэлектролитные микрочастицы, содержащие лизпро и аспарт. Несмотря на более кислое значение р1 аспарта (табл. 2), различия инсулинов не привели к заметным изменениям состава, ¡¡-потенциала и размера микрочастиц (табл. 5).

Таблица 5. Характеристики полиэлектролитных микрочастиц (5 = 4) из декстрансульфата и хитозана с включенными рекомбинантными инсулинами.

Инсулин Эффективность включения, % Содержание, % масс. ^-потенциал, мВ Средний размер частиц, мкм

Белок ДС Хит

Человека 65±3 57±4 26±3 17±2 29±3 6±3

Аспарт 68±8 5б±2 27±1 16±3 33±3 5±2

Лизпро 64±3 57±1 26±2 17±3 30±3 5±2

3. Включение ингибиторов протеаз в полнэлектролнтные микрочастицы

Для зашиты доставляемого инсулина от действия протеаз тонкого кишечника использовали хорошо известные белковые ингибиторы протеаз (ИП), к которым относятся апротинин (Апр), ингибитор типа Баумана-Бирк (ИББ) и овомукоид (Овм) (табл. б). Ингибиторы различались значением изоэлектрической точки (щелочной апротинин, кислые ИББ и овомукоид), молекулярной массой (ИББ и апротинин по размеру примерно соответствуют мономеру инсулина, а овомукоид - гексамеру), количеством активных центров (соответственно, 1, 2 и 3) и эффективностью подавления активности основных протеаз сока поджелудочной железы (трипсина, химотрипсина, эластазы).

Таблица 6. Физико-химические свойства ингибиторов протеаз, использованных для микрокапсулирования.

Белок м„, кДа Р1 К!, М"1

Трипсин а-Химотрипсин Эластаза

Апротинин [в легких быка (Апр) 6,5 10,5 6'10"14 1,5-10"® 3,5-Ю-6

Овомукоид из утиных яиц (Овм) 28 3,8 6,1-10"' 2,210-' 2,4-10"9

Ингибитор из сои типа Баумана-Бирк (ИББ) 8 4,2 9-10"' 6,4-10"' 210-'

Исследовали два способа включения ИП в поли эле ктрол итн ые микрочастицы, а именно, их использование вместо хитозана на второй стадии сорбции или включение в момент образования нерастворимого комплекса (белок-декстрансульфат).

При первом способе, который изучали на примере апротинина, эффективность включения ингибитора была невысока и составляла всего 10±2 %. Относительно малая по сравнению с инсулином эффективность иммобилизации может бьпъ вызвана разницей в расположении белков в микрочастице. Количество инсулина, включаемого в комплекс с декстрансульфатом, в среднем пропорционально объему частиц (кубу диаметра), а количество ингибитора,

адсорбированного на поверхности уже сформировавшихся частиц, пропорционально площади (квадрату диаметра). По-видимому, по той же причине затруднен контроль соотношения Инс:ИП в частицах, различающихся по размеру.

Включение овомукоида в комплекс с декстрансульфатом при соотношении Инс:Овм = 20:1 составило лишь 24±2%, что вчетверо уступает эффективности включения инсулина. Относительно низкое значение р1 = 3,8 этого гликопротеина, которое лишь незначительно отличается от рН = 3,0 среды приготовления микрочастиц, обуславливает сравнительно небольшой положительный заряд белка и, как следствие, слабое взаимодействие с полианионом. Из-за низкой эффективности включения овомукоид в дальнейших экспериментах не использовали.

Ингибиторы апротинин и ИББ с более высокими значениями р1 формировали комплексы при весовых соотношениях Инс:ИП от 40:1 до 10:1. При этом эффективность включения ингибиторов в комплекс составила 97 - 99 %, что близко к эффективности включения инсулина (табл. 4).

Таблица 7. Характеристика полиэлектролитных микрочастиц (б = 4) с инсулином и ингибиторами протеаз, включенными на стадии образования нерастворимого комплекса (белок-декстрансульфат).

Инс:ИП Эффективность Содержание,

Ингибитор (масс.) включения, % % от массы

протеаз При получении В частицах Инс ИП Инс ИП ДС Хит

- - - 65±3 - 57±4 - 26±3 17±2

Апр 20:1 25,4:1 64±4 50±5 54±5 2,2±0,2 24±4 20±5

10:1 13,4:1 62±5 46±5 52±4 3,9±0,4 27±6 №6

ИББ 40:1 37,9:1 62±4 65±7 56±5 1,5±0,2 25±5 18±6

20:1 19,6:1 60±6 61±6 52±6 2,7±0,3 30±5 15±5

Микрочастицы 5 = 4 (табл. 7), полученные адсорбцией полиэлектролитов на комплекс декстрансульфата с инсулином и ингибиторами протеаз, обладали положительным ^-потенциалом (около +30 мВ) и размером 1 - 10 мкм, что соответствовало тем же характеристикам частиц с инсулином (табл. 4). Как и ранее, основные потери наблюдались на стадии сорбции хитозана на комплекс в результате конкурентного вытеснения белка, причем апротинин вытеснялся сильнее, чем ИББ или инсулин. Эффективность включения в микрочастицы инсулина и ИББ практически совпадала, составляя величину порядка 60 %, тогда как для апротинина она была несколько ниже. Состав компонентов в микрочастицах практически не менялся и составлял 52 - 58 % инсулина, 24 - 30 % декстрансульфата и 14-20 % хитозана.

Содержание апротинина и ИББ варьировалось от 1,5 до 4 %, возрастая с увеличением количества ингибитора, использованного при образовании комплекса.

4. Высвобождение белков из полизлектролитвых микрочастиц

Кинетику высвобождения рекомбинантных инсулинов из микрочастиц (я = 4) изучали в условиях, имитирующих прохождение ЖКТ человека натощак (рис. 5А). Частицы выдерживали 2 ч при рН 1,1, соответствующем кислой среде желудка, 2 ч при рН 6,0, имитирующем верхние отделы тонкого кишечника, и, наконец, 4 ч при рН 7,4, характерном для средних и нижних отделов тонкого кишечника. Кривые высвобождения обоих аналогов инсулина оказались практически идентичными кривой высвобождения инсулина человека. Инсулины не выделялись из частиц при рН 1,1, оставаясь защищенными от агрессивной среды желудка. При рН 6,0 наблюдалось весьма незначительное (не более 2 %) высвобождение белка, тогда как при рН 7,4 оно протекало интенсивно, составляя 90 % за 1 ч с постепенным высвобождением остатков гормона в течение последующих 3 ч.

100 | во а из в 60 I Й- г40 о из г го о 3 ш ОС рН1,1 г ^ 1*1 16,0 1 рН 7.4 40 30 < т 20 с" 10 п 1 0 рН 1,1 \ р Б Н6.0 рН 7,4

1 Вре 7 .1 —•— Инс у —•—Аспарт 1 -О'Лизпро 1---,----, е 8 ля, ч л Время, ч

¡-10 £-20 -30 -40 и 6 8 \ » » »

Рве. 5. Кинетика высвобождения рекомбинантных инсулинов (А) и изменение ¡¡-потенциала полиэлектролитных микрочастиц (Б) в условиях, моделирующих прохождение желудочно-кишечного тракта человека.

Параллельно изучению высвобождения инсулина измеряли ¡¡-потенциал поверхности микрочастиц (рис. 5Б], который оставался практически неизменным и равным +30 мВ при рН 1,1 и менял знак заряда на противоположный при рН 6,0 (-20 мВ). В слабокислых средах при значениях рН близких рКа хитозана и р1 инсулина, основной вклад в заряд частиц вносит полианион декстрансульфат. При рН7,4, когда инсулин приобретал более высокий отрицательный заряд и выделялся в раствор, ¡¡-потенциал остатков полиэлектролитных микрочастиц становился сильно отрицательным (-40 мВ), что должно способствовать их удалению с отрицательно заряженной поверхности слизистой тонкого кишечника.

Инсулин из микрочастиц с ингибиторами протеаз при моделировании прохождения ЖКТ (рис. 6) высвобождался так же, как и из частиц без ингибиторов (рис. 5А). Ингибиторы не высвобождались при рН 6,0, т.е. в условиях, соответствующих кислотности верхних отделов

кишечника, где концентрация протеолитических ферментов, выделяемых поджелудочной железой, наиболее высока. При значении рН 7,4 скорости высвобождение инсулина и ИББ совпадали, а апротинин выделялся медленнее.

Рис. 6. Кинетика высвобождения белков из полиэлектролитных микрочастиц, содержащих инсулин и апротинин (А) или ингибитор типа Баумана-Бирк (Б) в условиях, моделирующих прохождение желудочно-кишечного тракта человека.

С помощью гель-фильтрации исследовали форму высвобождения белков из полиэлектролитных микрочастиц при рН 7,4, соответствующем нижним отделам тонкого кишечника (рис. 7А). Все рекомбинантные инсулины, высвободившиеся из микрочастиц, удерживались в колонке одинаковое время с соответствующими нативными гормонами, то есть выделялись из микрочастиц в несвязанном с полиэлектролитами виде. По сравнению с инсулином человека время удерживания в колонке инсулинов лизпро и аспарт было меньше, что указывает на их присутствие в виде мономеров. Из результатов анализа ингибиторов протеаз, высвободившихся из микрочастиц (рис. 7Б) следует, что ИББ, аналогично инсулину, выделяется как свободный белок, а апротинин - в виде высокомолекулярного полиэлектролитного комплекса с декстрансульфатом.

Рис. 7. Данные гель-фильтрации белков и декстрансульфата в растворе и после высвобождения из полиэлектролитных микрочастиц с рекомбинантными инсулинами (А) и с ингибиторами протеаз (Б). Сефадекс 0-50зГ, рН 7,4. М/ч - микрочастицы

5, Мукоадгезивпые свойства полиэлектролитных микрочастиц

Мукоадгезивпые свойства оценивали по способности микрочастиц сорбировать муцин, представляющий собой высокомолекулярный гликопротеин (до 2*103 кДа), богатый сиаловыми кислотами (р12,0 - 3,0) и являющийся основным компонентом слизистой кишечника (табл. 8). С возрастанием количества муцина до 200 мкг/мг частиц его связывание возрастало, а затем оставалось практически неизменным. Насыщение поверхности микрочастиц муцином подтверждалось изменением ^-потенциала частиц на отрицательный (около -40 мВ).

Таблица 8. Адсорбция муцина полиэлектролитными микрочастицами с инсулином человека при рН 6,0.

Число стадий сорбции (s) Количество добавленного муцина, мкг/мг частиц

100 200 300 400

Адсорбция муцина, мкг/мг частиц

3 18±1 24±8 22±7 22±1

4 45±1 50±6 48±4 53±6

Микрочастицы s = 3, поверхность которых имеет отрицательный заряд, связывали вдвое меньшее количество муцина по сравнению с микрочастицами s = 4, покрытыми катионным хитозаном. Адсорбция муцина микрочастицами s = 4, содержащими инсулины человека, аспарт и лизпро, составила соответственно 50±6, 36±6 и 4б±1 мкг/мг высушенных частиц. Следует отметить, что мукоадгезивность полиэлектролитных микрочастиц была практически идентична мукоадгезивности частиц схожих размеров (~ 50 мкг/мг частиц, 3-12 мкм), полученных распылительной сушкой и состоящих полностью из хитозана [Не Р. et al., 1998].

Установлено, что присутствие муцина (80 мкг/мл) во всех растворах, использованных для моделирования прохождения ЖКТ (условия аналогичны рис. 5А), лишь незначительно увеличило высвобождение белка при pH 1,1 и 6,0 (до 10 % за первые 4 ч).

6. Са,+-связывающая способность полиэлектролитных микрочастиц

Известно, что уменьшение концентрации ионов Ca2t вблизи эпителия кишечника приводит к раскрытию плотных клеточных контактов (epithelial cell tight junctions, ПКК) и увеличению проницаемости эпителия для лекарственных веществ [LangguthP. et al., 1994]. Полиэлектролитные микрочастицы, покрытые хитозаном (s = 4), были способны связывать 4,4 мкг Са2+/мг частиц, что в 2,5 раза меньше по сравнению с микрочастицами, покрытыми декстрансульфатом (s = 3). Разница объяснима тем, что связывание Са2+ хитозаном осуществляется за счет свободной электронной пары на атоме азота, тогда как связывание декстрансульфатом происходит за счет сильных электростатических взаимодействий двухзарядного катиона Са2+ с отрицательно заряженными сульфатными группами полианиона.

После иикубации микрочастиц в условиях, моделирующих прохождение ЖКТ, количество Са24", сорбированного частицами s = 4, возросло от 4,4 мкг до 10,6 мкг/мг, т.е. достигло аналогичной величины для частиц с s = 3. Как уже отмечалось, многоступенчатая инкубация влияла на ¡¡-потенциал микрочастиц (рис. б). Вероятно, на конечной стадии при рН 7,4 часть отрицательно заряженных молекул декстрапсульфата выходит на поверхность частиц, внося свой вклад в их Са2+-связывающую способность.

Раскрытие ПЮС эпителия тонкого кишечника происходит при снижении концентрации Са2+ на 4 мкг/мл [Kassab F. Jr et al., 2002]. Микрочастицы s = 4 массой 1 мг при прохождении ЖКТ могут связать 10,6 мкг Са2+и понизить концентрацию Са2+ на 4 мкг/мл в объеме 2,5 мл, что в 100 раз превышает объем самих частиц в набухшем состоянии ( - 25 мкл).

7. Защитное действие полиэлектролитных макрочастиц от протеолитпческих ферментов

В работе показано, что благодаря составу и строению полиэлектролитиые микрочастицы способны уменьшать активность основных протеолитических ферментов тонкого кишечника (трипсина, химотрипсина) одновременно за счет следующих воздействий: связывания протеаз на поверхности микрочастиц, ингибирования протеаз декстрансульфатом, высвобождающимся из микрочастиц, и уменьшения активности трипсина за счет связывания Сап.

Способность микрочастиц защищать инсулин человека от протеолиза исследовали в трех средах, моделирующих соки желудка, поджелудочной железы и средних отделов тонкого кишечника при концентрации гормона 0,5 мг/мл (табл. 9). Анализ расщепления белка проводили совместно с сотрудником Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, к.х.н. ЗоровымИ.Н. методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке С 18 (4><250 мм) с детекцией при 210 нм по модифицированной методике [Sarmentó В. et al., 2006]. Остальные компоненты микрочастиц анализу не мешали, так как имели сравнительно низкую концентрацию и отличались по времени удержания в колонке. Деградацию инсулина оценивали, сравнивая площади пика белка до и после инкубации.

Таблица 9. Модельные среды различных отделов желудочно-кишечного тракта человека.

Моделируемая среда Условия

Сок желудка Пепсин 2,88 ед./мл, рН 1,2,37°С

Сок поджелудочной железы Трипсин, 700 БАЭЭ ед./мл, химотрипсин, 4 БТЭЭ ед./мл, рН7,1,37°С

Просвет нижних отделов тонкого кишечника Трипсин, 140 БТЭЭ-ед./мл, рН 7,8,37°С

В условиях, соответствующих желудочному соку, пепсин расщеплял инсулин человека в растворе на 99 % за 1 ч, тогда как микрокапсулированный инсулин не высвобождался из микрочастиц. После разрушения микрочастиц установлено, что только 2 % гормона подверглось деградации. В условиях сока поджелудочной железы, содержащего трипсин и химотрипсин в высоких концентрациях, за 1 ч происходил полный гидролиз инсулина человека в растворе и 60 % микрокапсулированного гормона (рис. 8А). Следует учитывать, что из-за разбавления и переваривания высокие концентрации протеаз сохраняются в тонком кишечнике только короткое время. В условиях просвета нижних отделов тонкого кишечника гидролиз инсулина в растворе за 4 ч составил 63 %, тогда как микрокапсулированный инсулин сохранился более чем наполовину (рис. 8Б).

Рис. 8. Влияние ингибиторов протеаз на расщепление инсулина человека в растворе и в полиэлектролитных микрочастицах (0,5 мг/мл) в условиях сока поджелудочной железы, 1 ч (А) и просвета нижних отделов тонкого кишечника, 4 ч (Б). Подробные характеристики сред приведены в табл. 9.

Микрокапсулирование инсулина человека позволило значительно сократить, но не предотвратить полностью протеолиз гормона в тонком кишечнике. Поэтому в тех же средах исследовали деградацию микрочастиц с инсулином, содержащих ингибиторы протеаз при весовом соотношении Инс:ИП = 10:1 и 20:1 для апротинина и 40:1 для ИББ. Для контроля использовали растворы инсулина и ингибиторов, приготовленные при тех же соотношениях. В условиях сока поджелудочной железы в микрочастицах ИББ при соотношении Инс:ИП = 40:1 более эффективно предотвращал деградацию гормона, чем апротинин при соотношении 10:1 (рас. 8А). Находясь в растворе в тех же соотношениях, апротинин за счет большего количества оказывал более выраженное защитное действие. По-видимому, при высокой концентрации протеаз и относительно коротком периоде инкубации определяющую роль играет различие в кинетике высвобождения инсулина и ингибитора протеаз из микрочастиц. Апротинин выделялся

из микрочастиц медленнее инсулина, тогда как выделение ИББ происходило одновременно с инсулином (рис. б), делая действие ИББ более эффективным. Уменьшение соотношения Инс:ИББ в микрочастицах от 40:1 до 20:1 приводило к росту количества недеградированного гормона от 72 до 99 % (рис. 8А, 9).

В условиях длительного воздействия трипсина в нижних отделах тонкого кишечника, наличие ингибиторов протеаз в растворе ослабило протеолиз инсулина человека на 40 - 45 %, а включение аналогичных количеств ингибиторов в микрочастицы полностью защитило гормон от протеолиза (рис. <?£}.

Человека Аспарт Лизпро

□ Микрочастицы без ингибитора ■ Микрочастицы с ИББ (20:1)

Ряс. 9. Протеолиз микрокапсулированных рекомбинантных инсулинов в условиях сока поджелудочной железы, 1 ч. Подробно условия см. табл. 9.

Быстродействующие аналоги инсулина, высвобождающиеся из микрочастиц в виде мономеров (рис. 7А), были подвержены гидролизу под действием протеаз в большей степени по сравнению с инсулином человека. В условиях, соответствующих соку поджелудочной железы, инсулины аспарт и лизпро в растворе были гидролизованы практически полностью, тогда как наличие в микрочастицах ИББ в соотношении Инс:ИББ = 20:1 ослабило действие протеаз соответственно на 48 и 43 % (рис. 9) по сравнению с микрочастицами без ингибитора.

8. Исследование биологического действия микрокапсулироваиного инсулина

Эксперименты гп vivo проводили совместно с сотрудником НИИ Физико-химической медицины, д.б.н. Михапьчик Е.В. и сотрудником Эндокринологического научного центра, проф., д.б.н. Старосельцевой JLK.

Для оценки сохранности биологической активности инсулина, включенного в полиэлектролитные частицы, здоровым кроликам шиншилла (самцы, 2,5 - 3,0 кг) подкожно вводили препараты инсулина (частицы s = 4 или раствор гормона в 0,15 М NaCl, рН 3,0) в дозе 4 МЕ/кг (рис. 10). В обоих случаях через 1 ч после инъекции наблюдали снижение уровня

глюкозы б крови животных на 40 %. Сопоставление уровней снижения глюкозы инсулином в составе микрочастиц и инсулином в растворе показало сохранение биологической активности гормона в процессе микрокапсулирования

1'нс. 10. Гипогликемическое действие Рис. 11. Изменение уровня инсулина человека в

препаратов инсулина при подкожном крови крыс с диабетом после перорального

введении здоровым кроликам в дозе 4 ME/кг введения микрокапсулированного инсулина в

(п > 4). Контроль - раствор 0,15 М NaCI, дозе 100 ME/кг (п = б). Контроль - раствор

рНЗ.О. 0,15 MNaCl.pH 3,0.

Эффективность действия микрокапсулированного инсулина при пероральном введении изучали на модели стрептозотоцин-индуцированного диабета у крыс Вистар (самцы, 250-350 г). Экспериментальные группы включали в себя животных с подтвержденным диабетом (уровень глюкозы в крови натощак составлял не менее 13 мМ через 7 и 14 дней после введения стептозотоцина в дозе 50 мг/кг веса животного).

При свободном доступе животных к еде, т.е. в условиях, когда перорально введенный в дозе 100 ME/кг инсулин подвергался действию всех протеолитических ферментов ЖКТ, определяли концентрацию инсулина человека в крови крыс методом иммуноферментного анализа. С использованием набора Insulin ELISA Monobind был зарегистрирован рост содержания инсулина в плазме животных через 1 и 6 ч на 1,5 и 2,9 нг/мл соответственно (рис. II) При этом показатели уровня содержания инсулина в крови животных контрольной группы колебались в пределах случайного разброса. Это свидетельствует о проникновении микрокапсулированного инсулина в кровоток при пероральном введении

Использованная при пероральном введении доза инсулина 100 ME/кг соответствовала 3,5 мг/кг, т.е. около 100 нг/мл плазмы крови (средний объем крови у крыс 60±10 мл/кг, процентное содержание плазмы в крови 55 %). Таким образом, обнаруженное в крови через 6 ч после введения количество свободного инсулина (2,9 нг/мл) составляет 3 % от введенной дозы. Эта величина была относительно высока, поскольку часть инсулина могла быть уже утилизирована, другая часть еще не поступила из ЖКТ животного, а еще часть белка связана с рецепторами в организме крысы.

Гипогликемическое действие инсулина в модели диабета у крыс было исследовано при введении натощак микрокапсулированного препарата в дозах 10 и 25 МЕ/кг (рис. 12). Обе дозы вызывали заметное снижение уровня глюкозы в крови через 2 и 4 ч после введения препарата. Для дозы 25 Ед/кг в этих точках отличие от контрольной группы было достоверным (по критерию Манна-Уитни). При этом максимальное снижение наблюдали через 2 ч (при дозе 25 МЕ/кг уровень глюкозы падал на 50 %), а в течение последующих 10 ч показатели опытных групп постепенно приближались к показателям контрольной группы животных, получавших перорально 0,15 М раствор NaCl (рН 3,0). Максимальное снижение уровня глюкозы в крови при дозе 10 МЕ/кг составляло 38 %.

Для оценки биодоступности микрокапсулированного инсулина крысам в группе сравнения подкожно вводили раствор инсулина в дозе 2,5 МЕ/кг. Биодоступность перорально введенного микрокапсулированного инсулина, рассчитанная как отношение площадей над кривыми уровня глюкозы в плазме крови после перорального введения препарата и подкожного введения раствора инсулина с учетом различия в дозах, составила 10,7 %. Данное значение относительно велико и сравнимо с биодоступностью коммерческого препарата ингаляционного пульмонарного инсулина Exúbera, равной 10 % [Cefalu T.W. et al, 2001].

Контроль - раствор 0,15 М КаС1, рН 3,0.

* — статистически значимое отличие группы, получившей перорально 25 МЕ/кг микрокапсулированного инсулина, от контрольной (р < 0,05).

9. Принцип действия мультифуикциональных полиэлектролитных микрочастиц с инсулином при пероральном применении

Обобщая полученные результаты, можно сформулировать принцип действия полученных микрочастиц, содержащих инсулин и ингибиторы протеаз (б = 4) (рис. 13). Микрочастицы защищают капсулированный белок от воздействия кислой среды желудка, содержащей пепсин. В

среде тонкого кишечника положительный ¿¡-потенциал микрочастиц усиливает их адгезию к отрицательно заряженной поверхности эпителия.

С увеличением рН по мере продвижения по кишечнику происходит одновременное высвобождение из микрочастиц ингибитора и инсулина. Локальное выделение ингибитора защищает белок от воздействия протеаз сока поджелудочной железы, не нарушая процесса пищеварения в целом. Поскольку мукоадгезивность микрочастиц обеспечивает их прочный и продолжительный контакт со слизистой, инсулин высвобождается в непосредственной близости от места сорбции, обеспечивая высокий градиент концентрации благодаря его большому содержанию в частицах.

™ • Инсулин

- 3 Протеаза

1 1 '

3 ' ° Ингибитор

Рис. 13. Схема действия мультифункциональных полиэлектролитных микрочастиц, содержащих инсулин и ингибитор протеаз.

Как известно, в месте контакта с эпителием хитозан за счет специфических взаимодействий с белками ПКК (окклюдином, актином и ZO-1) способен обратимо повысить межклеточную проницаемость [Dodane V et al., 1999]. Са2+-Связывающее действие микрочастиц усиливает раскрытие ПКК [Kriwet В. et al., 1996] и ослабляет адгезионные контакты, обеспеченные кадгерином [Avdeef А., 2001]. Одновременное действие этих факторов должно способствовать эффективному транспорту белка.

Размеры межклеточного пространства в эпителии кишечника в норме составляют от 1 до S нм [Salama N.N. et al, 2006], а ослабление плотных клеточных контактов должно их увеличить. Поэтом)' вероятность парацеллюлярного транспорта мономерных аналогов инсулина, имеющих средний размер 2,3 нм, выше, чем у гексамера инсулина человека размером 5 нм. Мономерные формы инсулина более подвержены протеолизу, однако использование ингибиторов позволяет в значительной мере их защитить.

При высвобождении белков поверхностный заряд остатков микрочастиц, содержащих хитозан и декстрансульфат, меняется с положительного на отрицательный. Это должно способствовать их удалению с поверхности слизистой и дальнейшем}' выведению из кишечника.

Список использованных сокращений:

5 - стадия сорбции полиэлектролитов, Аир - апротинин, АЦЦ - Ы-ацетил-Ь-цистеин, ДС - декстрансульфат натрия, ЖКТ - желудочно-кишечный тракт, ИББ - ингибитор трипсина и химотрипсина из сои типа Баумана-Бирк, Инс - инсулин человека, 1Ш — ингибитор протеаз, Овм - овомукоид из утиных яиц, о-ФА - ортофталевый альдегид, ПКК - плотные контакты клеток эпителия, Хит — хитозан.

выводы

1. Разработан и оптимизирован метод получения микрочастиц с рекомбинантными инсулинами (человека, аспарт и лизпро) путем последовательной адсорбции хитозана и декстрансульфата на микроагрегатах нерастворимого полиэлектролитного комплекса. Частицы характеризуются небольшими размерами 3-9 мкм, высокой эффективностью включения (62 - 68 %) и значительным содержанием (57 - 63 %) инсулина.

2. Выявлено мультифункциональное действие микрочастиц с четырьмя стадиями сорбции полиэлектролитов на факторы, повышающие биодоступность микрокапсулированного белка при пероральной доставке. Действие состоит в защите от агрессивной среды желудочного сока, проявлении мукоадгезивных свойств, высвобождении микрокапсулированных инсулинов в условиях тонкого кишечника, связывании ионов кальция и уменьшении протеолиза белков под действием ферментов желудочно-кишечного тракта человека.

3. Впервые в состав полиэлектролитных микрочастиц одновременно включены мономерные инсулины и различные белковые ингибиторы протеаз. Наличие в микрочастицах 2 - 3 % соевого ингибитора типа Баумана-Бирк полностью предотвращает деградацию инсулина человека протсазами тонкого кишечника человека и значительно ослабляет деградацию мономерных инсулинов аспарт и лизпро, которые являются более перспективными для пероральной доставки.

4. В биологических экспериментах подтверждено сохранение активности инсулина при его включении в микрочастицы. По гипогликемическому действию при подкожном введении кроликам микрокапсулированный инсулин не отличался от инсулина в растворе в той же дозе (4 МЕ/кг). Однократное пероралыгое введение микрокапсулированного инсулина в низких дозах (10 и 25 МЕ/кг) крысам со стрептозотоцин-индуцированным диабетом вызывало пролонгированный (до 12 ч) гипогликемический эффект. При этом биодоступность микрокапсулированного инсулина составила 10,7 %. Иммуноферментный анализ показал рост содержания инсулина в крови крыс при пероральной введении микрокапсулированного инсулина.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Pechenkin М.А.. Balabushevich N.G., Zorov I.N., Staroseltseva L.K.., Mikhalchik E.V., Izumrudov V.A , Larionova N.I. Design, in vitro and in vivo characterization of chitosan - dextran sulfate microparticles for oral delivery of insulin // Journal of Bioequivalence & Bioavailability. 2011. V. 3.No 10. P. 244-250.

2. Балабушевич Н.Г., Печенкин MA.. Зоров И.Н., Шибанова Е.Д., Ларионова НИ. Мукоадгезивные полиэлектролитные микрочастицы, содержащие рекомбинантный инсулин человекам его аналоги Аспарти Лизпро//Биохимия. 2011. Т. 76. № 3. С. 400-405.

3. Larionova N.I., Zubaerova D.K., Guranda D.T., Pechvonkin MA.. Balabushevich N.G. Colorimetric assay of chitosan in presence of proteins and polyelectrolytes by using o-phthalaldehyde // Carbohydrate Polymers. 2009. V. 75. No 4. P. 724 - 727.

4. Балабушевич Н.Г., Печенкин M.A.. Старосельцева Л.К., Михальчик Е.В., Ларионова Н.И. Хитозан-содержащие наноструктурированные микрочастицы для пероральной доставки инсулина // Материалы 11-ой Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана», Мурманск, 25 - 29 июня 2012. С. 261 -265.

5. Печенкин М.А.. Балабушевич Н.Г., Зоров И.Н., Изумрудов В.А., Клячко Н.Л., Кабанов A.B., Ларионова Н.И. Защитное действие полиэлектролитных микрочастиц с ингибиторами протеаз при пероральной доставке белков // Материалы Московской международной научно - практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии», Москва, 20-22 марта, 2012. С. 55-56.

6. Балабушевич Н.Г., Печенкин М.А.. Зоров И.Н., Шибанова Е.Д., Михальчик Е.В., Ларионова Н.И. Мукоадгезивные полиэлектролитные микрочастицы, содержащие рекомбинантный инсулин человека и его аналоги // Материалы VI Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развитию), Москва, 21 -25 марта, 2011. Ч. 1. С. 46-47.

7. Балабушевич Н.Г., Печенкин М.А.. Вихорева Г.А., Ларионова Н.И. Хитозан - содержащие наноструктурированные микрочастицы с инсулином // Материалы 10-ой Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана», Нижний Новгород, 29 июня - 2 июля, 2010. С. 162 -165.

8. Балабушевич Н.Г., Печенкин М.А.. Михальчик Е.В., Шибанова Е.Д., Ларионова Н.И. Перспективы использования мукоадгезивных полиэлектролитпых микрочастиц с инсулином // Сборник тезисов второго Международного симпозиума «Биофарма - 2010: от науки к промышленности», Ереван, Армения, 17 — 20 мая, 2010. С. 7.

9. Pechenkin M A.. Balabushevich N.G., Mikhalchik E.V., Larionova N.I. Polyelectrolyte complex microparticles for oral drug delivery // Proceedings of the 1st Russian - Hellenic Symposium with International Participation and Young Scientist's School "Biomaterials and Bionanomaterials: Recent Advances Safety and Toxicology Issues", Heraklion, Crete - Greece, May 3-9, 2010. P. 40.

10. Печенкин M A.. Решетнях Б.С. Мукоадгезивные полиэлектролитные микрочастицы для пероралыгай доставки инсулина // Материалы XVII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», Химия, Москва, 12 - 15 апреля, 2010. / Отв. ред. И.А. Алешковский, ГШ. Костылев, А.И. Андреев, А.В. Андрианов. [Электронный ресурс] — М.: МАКС Пресс, 2010. — 1 электрон, опт. диск (CD-ROM); 12 см.

11. Larionova N., Pechenkin М.. Balabushevich N., Mikhalchik E. Multifunctional polyelectrolyte complex microparticles for oral protein delivery // Proceedings of the 7th World Meeting on Pharmaceutics, Biopharmaceutics and Pharmaceutical Technology, Valletta, Malta, March 8-11, 2010. # 105.

12. Ларионова Н.И., Балабушевич Н.Г., Печенкин M.A. Многофункциональные стимул -чувствительные микро- и наноматериалы для фармации и биотехнологии // Сборник тезисов. Химический факультет. Выставка инновационных проектов, Москва, 24 ноября, 2009. С. 73-75.

13. Larionova N.I., Balabushcvich N.G., Pechenkin MA.. Borzenkova N.V. Nanostructured mucoadhesive multilayer microparticles with pH-triggered protein release as potential oral delivery systems // International conference "Biocatalysis - 2009: Fundamentals & Applications", Arkhangelsk, Russia, June 19 - 24,2009. P. 44.

14. Reshetniak B.S., Pechenkin M.A. // Comparison of different multilayer chitosan - dextran sulfate microparticles containing insulin. Composition, Z-potential & Ca2+ binding // International conference "Biocatalysis - 2009: Fundamentals & Applications", Arkhangelsk, Russia, June 19 -24,2009. P. 84.

15. Pechenkin M.A.. Balabushevich N.G., Mikhalchik E.V., Larionova N.I. Development, characterization and in vivo evaluation of polyelectrolyte microparticles for oral insulin delivery // International conference "Biocatalysis - 2009: Fundamentals & Applications", Arkhangelsk, Russia, June 19 - 24,2009. P. 133.

16. Pechenkin M.A.. Balabushevich N.G., Mikhalchik E.V., Larionova N.I. Dextran sulfate - chitosan microparticles as an oral insulin delivery system: characterization and in vivo evaluation // Book of Abstracts. 2nd PharmSciFair, Nice, France, June 8 - 12,2009. P. 180.

17. Pechenkin M.A- Balabushevich N.G., Larionova N.I. The use of protease inhibitors to improve enzymatic resistance of insulin-loaded pH-sensitive polyelectrolyte microparticles // Young pharmaceutical scientists meet in Nice, Nice, France, June 7 — 8,2009. P. 31.

18. Ларионова Н.И., Балабушевич Н.Г., Печенкин М.А.. Борзенкова Н.В. Мукоадгезивные полиэлектролитные частицы для пероралыюй доставки белков // Сборник тезисов Международного симпозиума «Биофарма - 2009: от науки к промышленности», Анталия, Турция, 25 - 27 мая, 2009. С. 23 - 24.

19. Балабушевич Н.Г., Печенкин М.А.. Ларионова Н.И. Биоадгезивные ипсулин-содержащие микрочастицы для перорального применения II Материалы пятого Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 16-20 марта, 2009. Ч. 1,С.54.

20. Балабушевич Н.Г., Ларионова Н.И., Михальчик Е.В., Печенкин М.А. Исследование биологического действия полиэлектролитной системы доставки инсулина // 6-я Курчатовская молодежная научная школа, Сборник аннотаций, Москва, 17 - 19 ноября, 2008. С. 221.

21. Балабушевич Н.Г., Печенкин М.А.. Зоров И.Н., Ларионова Н.И. Перспективы использования хитозан-содежащих микрочастиц для пероральной доставки белков // Материалы 9-ой Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана», Ставрополь, 13-17 октября, 2008. С. 135 - 138.

22. Печенкин М.А. Получение и свойства полиэлектролитпых микрочастиц, содержащих инсулин и соевый ингибитор протеиназ типа Баумана — Бирк // Материалы XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов — 2008», Химия, Москва, 8-11 апреля, 2008. С. 287.

23. Аверин П.С., Балабушевич Н.Г., Ларионова Н.И., Печенкин М.А. Наноструктурированные пероральные системы доставки белка, содержащие ингибиторы протеиназ // 5-я Курчатовская молодежная научная школа, Сборник аннотаций, Москва, 19 - 21 ноября, 2007. С. 137.

Подписано в печать:

19.10.2012

Заказ № 7738 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Печенкин, Михаил Александрович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Инсулин. Общие сведения.

1.1. Структура и физико-химические свойства.

1.2. Биологическая активность инсулина.

1.3. Биосинтез и регуляция секреции инсулина.

1.4. Механизм действия инсулина.

Глава 2. Способы доставки инсулина.

2.1. Традиционные методы введения инсулина.

2.2. Альтернативные методы введения инсулина.

2.2.1. Доставка через слизистую ротовой полости.

2.2.2. Пульмонарная доставка.

2.2.3. Назальная доставка.

2.2.4. Трансдермальная доставка.

2.2.5. Окулярная доставка.

Глава 3. Пероральная доставка инсулина.

3.1. Полиэлектролитные системы доставки.

3.2. Защита инсулина от протеолиза.

3.2.1. Действие носителя.

3.2.2. Ингибиторы протеолитических ферментов.

3.2.2.1. Небелковые ингибиторы.

3.2.2.2. Белковые ингибиторы.

3.3. Транспорт инсулина через эпителий кишечника.

3.3.1. Мукоадгезия.

3.3.2. Захват М-клетками.

3.3.3. Трансцеллюлярный путь.

3.3.4. Парацеллюлярный путь.

ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Глава 4. Материалы и методы.

4.1. Материалы и реактивы.

4.2. Оборудование.

4.3. Методы исследования.

4.3.1. Получение микрочастиц с использованием альгината и хитозана.

4.3.2. Получение микрочастиц с использованием декстрансульфата и хитозана.

4.3.2.1. Турбидиметрическое титрование инсулина декстрансульфатом.

4.3.2.2. Получение микроагрегатов комплекса (инсулин-декстрансульфат).

4.3.2.3. Постадийная адсорбция полиэлектролитов.

4.3.3. Включение ингибиторов протеаз в полиэлектролитные микрочастицы.

4.3.3.1. Включение на стадии образования комплекса (белок-декстрансульфат).

4.3.3.2. Включение на стадии сорбции поликатиона.

4.3.4. Характеристика полиэлектролитных микрочастиц.

4.3.4.1. Растровая электронная микроскопия.

4.3.4.2. Конфокальная флуоресцентная сканирующая микроскопия.

4.3.4.3. Оптическая микроскопия.

4.3.4.4. Определение ^-потенциала микрочастиц.

4.3.4.5. Определение белка.

4.3.4.6. Определение декстрансульфата.

4.3.4.7. Определение хитозана.

4.3.4.8. Определение содержания активного ингибитора протеаз с использованием трипсина.

4.3.4.9. Определение содержания активного ингибитора протеаз с использованием химотрипсина.

4.3.4.10. Определение содержания активного овомукоида.

4.3.5. Высвобождение белков и декстрансульфата из микрочастиц.

4.3.5.1. рН-зависимое высвобождение.

4.3.5.2. Кинетика высвобождения инсулина в модельных средах.

4.3.6. Определение формы высвобождения белков из микрочастиц.

4.3.6.1. Гель-хроматография.

4.3.6.2. Высокоэффективная жидкостная хроматография.

4.3.7. Изучение факторов, влияющих на активность протеаз.

4.3.7.1. Влияние Са2+, ЭДТА и декстрансульфата.

4.3.7.2. Влияние микрочастиц.

4.3.8. Изучение протеолитической деградации инсулина.

4.3.8.1. Определение активности трипсина.

4.3.8.2. Определение активности а-химотрипсина.

4.3.8.3. Деградация белка в модельных средах.

4.3.8.4. Анализ количества недеградированного белка.

4.3.9. Определение связывания микрочастицами ионов кальция.

4.3.10. Определение связывания микрочастицами муцина.

4.3.11. Изучение действия микрокапсулированного инсулина in vivo.

4.3.11.1. Определение содержания глюкозы в плазме крови.

4.3.11.2. Определение содержания инсулина в плазме крови.

4.3.11.3. Изучение на здоровых кроликах.

4.3.11.4. Изучение на крысах с диабетом.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава 5. Разработка методов анализа полиэлектролитных микрочастиц.

5.1. Определение хитозана при наличии белка и полианионов в смеси.

5.2. Определение активности протеаз при наличии полиэлектролитов в смеси.

Глава 6. Инсулинсодержащие полиэлектролитные микрочастицы.

6.1. Исследование микрочастиц из альгината и хитозана.

6.1.1. Получение микрочастиц из альгината и хитозана.

6.1.2. Высвобождение белка из альгинат-хитозановых микрочастиц.

6.2. Исследование микрочастиц из декстрансульфата и хитозана.

6.2.1. Получение микрочастиц из декстрансульфата и хитозана с инсулином человека

6.2.2. Включение быстродействующих аналогов инсулина.

6.2.3. Включение ингибиторов протеаз.

6.2.4. Высвобождение белка и декстрансульфата из полиэлектролитных микрочастиц.

6.2.5. Исследование формы высвобождения белков из полиэлектролитных микрочастиц.

6.2.6. Мукоадгезивные свойства полиэлектролитных микрочастиц.

6.2.7. Са2+-связывающая способность полиэлектролитных микрочастиц.

6.2.8. Защитное действие полиэлектролитных микрочастиц от протеолитических ферментов.

Глава 7. Исследование биологического действия микрокапсулироваииого инсулина.

7.1. Исследование сохранения активности инсулина.

7.2. Исследование гипогликемического действия инсулина при пероральном введении здоровым кроликам.

7.3. Исследование фармакологического действия инсулина при пероральном введении крысам с диабетом.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Мультифункциональные полиэлектролитные микрочастицы для пероральной доставки рекомбинантных инсулинов"

Сахарный диабет занимает третье место в мире по распространенности после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний. Сахарным диабетом в мире болеют более 300 миллионов человек, при этом около 10 - 15 % из них болеют диабетом первого типа — в их поджелудочной железе инсулин не синтезируется совсем или производится в недостаточном количестве. Больные вынуждены строго контролировать уровень глюкозы в крови путём постоянных инъекций инсулина, что, в свою очередь, может повлечь за собой такие нежелательные последствия, как гиперинсулинемию и липоатрофию.

Были исследованы альтернативные пути доставки инсулина, тем не менее, на настоящий момент существует лишь одна доступная на рынке форма неинвазивного инсулина, хотя было предложено множество идей, разработок и препаратов, проходящих различные фазы клинических испытаний. Большое внимание учёных уделяется созданию пульмонарной, интраназальной и трансдермальной форм доставки гормона. Однако наиболее естественным и удобным способом введения инсулина была бы пер оральная доставка. Это связано с тем, что в норме секретируемый инсулин из поджелудочной железы попадает в печень через кровеносные сосуды, а печень, в свою очередь, контролирует количество инсулина, достигающего другие органы и ткани. При пероральном введении инсулин из тонкого кишечника через брыжеечную и воротную вену также попал бы в печень. Таким образом, при пероральной доставке был бы возможен контроль секреции инсулина, который отсутствует при инвазивном введении и других альтернативных путях его доставки. Ключевой довод в пользу разработки такой системы состоит в том, что большинство пациентов предпочтет таблетки инъекциям и ингаляторам.

Однако, биодоступность белков, введённых перорально, не превышает 1 - 2 %. Связано это с тремя основными причинами. Во-первых, это гидролиз белка при экстремальных значениях рН желудочного сока; во-вторых, расщепление белка под действием протеолитических ферментов желудка и тонкого кишечника; и, в-третьих, низкая проницаемость мембран клеток кишечника для больших белковых молекул.

Разрабатываются специальные системы доставки белковых препаратов, направленные на преодоление выш перечисленных проблем. Однако многие методы микрокапсулирования (получение липосом, смешанных мицелл, множественных эмульсий, микроэмульсий и др.) не лишены серьёзных недостатков, среди которых использование органических растворителей и жёстких условий капсулирования, что в случае инсулина может привести к значительной потере активности. На основе полиэлектролитов созданы системы доставки, способные с различной специфичностью высвобождать белки в заданных отделах желудочно-кишечного тракта. К ним относятся 5 включение белка в различные гидрогели, образование наночастиц ионотропным гелеобразованием и адсорбцией усиливающих биодоступность агентов на агрегатах белка.

В работе для микрокапсулирования инсулина выбрана последовательная адсорбция противоположно заряженных природных полиэлектролитов на микроагрегатах комплекса белок-полианион. Способ характеризуется простотой методики и возможностью проведения в мягких водных условиях при комнатной температуре. Полиэлектролитные микрочастицы являются стабильными и рН-чув твительными.

Целью настоящей работы являлось получение полиэлектролитных микрочастиц, обеспечивающих повышенную биодоступность рекомбинантных инсулинов при пероральном применении.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

• Получить и охарактеризовать полиэлектролитные микрочастицы, содержащие рекомбинантные инсулины.

• Оценить in vivo биологическое действие препарата микрокапсулированного инсулина.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Печенкин, Михаил Александрович

выводы

3. Впервые в состав полиэлектролитных микрочастиц одновременно включены мономерные инсулины и различные белковые ингибиторы протеаз. Наличие в микрочастицах 2 — 3 % соевого ингибитора типа Баумана-Бирк полностью предотвращает деградацию инсулина человека протеазами тонкого кишечника человека и значительно ослабляет деградацию мономерных инсулинов аспарт и лизпро, которые являются более перспективными для пероральной доставки.

4. В биологических экспериментах подтверждено сохранение активности инсулина при его включении в микрочастицы. По гипогликемическому действию при подкожном введении кроликам микрокапсулированный инсулин не отличался от инсулина в растворе в той же дозе (4 МЕ/кг). Однократное пероральное введение микрокапсулированного инсулина в низких дозах (10 и 25 МЕ/кг) крысам со стрептозотоцин-индуцированным диабетом вызывало пролонгированный (до 12 ч) гипогликемический эффект. При этом биодоступность микрокапсулированного инсулина составила 10,7 %. Иммуноферментный анализ показал рост содержания инсулина в крови крыс при пероральном введении микрокапсулированного инсулина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе были подобраны условия для получения мультифункциональных микрочастиц с рекомбинантными инсулинами (человека, аспарт, лизпро) из биосовместимых и биодеградируемых полиэлектролитов. Микрочастицы были охарактеризованы по составу и физико-химическим свойствам. Микрочастицы с четырьмя стадиями сорбции полиэлектролитов связывали кальций, уменьшали деградацию микрокапсулированного инсулина под действием протеаз желудочно-кишечного тракта человека и проявляли мукоадгезивные свойства. Для дополнительной защиты инсулина от протеолиза изучено включение ингибиторов протеаз в микрочастицы. Наилучшую эффективность показал метод включения ингибиторов протеаз на стадии образования нерастворимого полиэлектролитного комплекса с полианионом. Ингибитор типа Баумана-Бирк высвобождался из микрочастиц одновременно с инсулином и наиболее эффективно защищал белок от протеолиза в модельных средах. In vivo показано сохранение биологической активности инсулина в процессе получения микрочастиц, а также повышение концентрации инсулина в крови крыс с диабетом после перорального введения. На основании оценки гипогликемического эффекта рассчитана биодоступность микрокапсулированного инсулина при пероралыюм введении.

Обобщая полученные результаты, общий принцип действия при пероральном применении полиэлектролитных инсулинсодержащих микрочастиц из декстрансульфата и хитозана, содержащих ингибитор протеаз, можно представить следующим образом (рис. 53).

• Инсулин ¡J Протеаза о Ингибитор

Слизистая оболочка Эпителий кишечника

Рис. 53. Схема предполагаемого действия в тонком кишечнике мультифункциональных полиэлектролитных микрочастиц, содержащих инсулин и ингибитор протеаз.

Полиэлектролитные микрочастицы в = 4 защищают капсулированный белок при воздействии кислой среды желудка, содержащей пепсин. Положительный ^-потенциал усиливает прилипание микрочастиц к отрицательно заряженной поверхности эпителия тонкого кишечника, а их мукоадгезивные свойства обеспечивают прочный и продолжительный контакт частиц со слизистой эпителия.

С увеличением рН по мере продвижения по кишечнику из микрочастиц происходит одновременное и постепенное высвобождение инсулина и ингибитора протеаз. Инсулин высвобождается в высокой концентрации в непосредственной близости от места абсорбции. Локальное выделение ингибитора в низких дозах не нарушая пищеварения должно защитить белок от воздействия протеаз поджелудочной железы, что особенно важно для более подверженных протеолизу мономерных форм инсулина. Таким образом, белок высвободится вблизи поверхности слизистой тонкого кишечника в активном состоянии.

Как известно, в месте контакта с эпителием хитозан за счет специфических взаимодействий с белками плотных контактов клеток эпителия (окклюдином, актином и ZO-\) способен обратимо повысить межклеточную проницаемость [191, 192, 194]. Са2+-Связывающее действие микрочастиц усиливает раскрытие ПКК [233, 234] и ослабляет адгезионные контакты, обеспеченные кадгерином [244] (рис. 54). Одновременное задействование обоих механизмов должно способствовать более эффективному транспорту белка в кровоток.

Инсулин человека высвобождается из микрочастиц в виде гексамера, в то время как быстродействующие аналоги инсулины аспарт и лизпро — в виде мономеров. Размер межклеточного пространства между клетками эпителия кишечника в нормальном состоянии составляет от 1 до 5 нм [199], а ослабление плотных контактов клеток эпителия должно его дополнительно увеличить. В связи с этим вероятность парацеллюлярного транспорта мономерных аналогов инсулина, имеющих средний размер 2,3 нм, больше, чем у гексамера инсулина размером 5 нм.

Рис. 54. Схематическое изображение апикального билипидного слоя эпителиальных клеток тонкого кишечника и основных компонентов контактов эпителиальных клеток с указанием пути трансцеллюлярной пассивной диффузии [244].

Изменение положительного поверхностного заряда микрочастиц на отрицательный после высвобождения инсулина должно способствовать выведению из кишечника их остатков, состоящих из хитозана и декстрансульфата. Полиэлектролиты благодаря высокой молекулярной массе не должны абсорбироваться в ЖКТ и, следовательно, не должны вызывать нежелательных системных эффектов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Печенкин, Михаил Александрович, Москва

1. Кнунянц И.Л. Химическая энциклопедия. М.: Советская энциклопедия. 1990. Т. 2, 673 с.

2. Балаболкин М.И. Эндокринология М.: Universum Publishing. 1998, 632 с.

3. Информационный бюллетень № 312, Август 2011 г // ВОЗ. URL: http://\vww.who.int/mediacentre/factsheets/fs312/ru/index.html.

4. Социальный отчет 2007 // Ново Нордиск Россия. URL: http:/Novo-nordisk.ru/media/pdf/Socialreport2007.pdf.

5. Corbett J.A. Insulin biosynthesis: The IREny of it all // Cell. Metab. 2006. V. 4. № 3. P. 175-176.

6. Балаболкин М.И., Клебанова E.M., Креминская B.M. Лечение сахарного диабета и его осложнений-М.: Медицина. 2005, 512 с.

7. Stare А.А., Heinemann L., Hohmann A., Berger M. The action profile of human NPH insulin preparations // Diabet. Med. 1989. V. 6. № 3. P. 239 244.

8. Байрамишвили Д.И., Беликова E.M., Кудлай Д.А. Анализ отечественного рынка лекарственных препаратов инсулина человека // Биофарм. журнал. 2010. Т. 2. № 1. С. 3-13.

9. Gómez-Pérez F.J., Rull J.A. Insulin therapy: current alternatives // Arch. Med. Res. 2005. V. 36. № 3. P. 258-272.

10. Peppas N.A., Kavimandan N.J. Nanoscale analysis of protein and peptide absorption: insulin absorption using complexation and pH-sensitive hydrogels as delivery vehicles // Eur. J. Pharm. Sci. 2006. V. 29. № 3 4. P. 183 - 197.

11. Insulin Pump // American Diabetes Association. URL: http://www.diabetes.org/living-with-diabetes/treatment-and-care/medication/insulin/insulin-pumps.html.

12. Pillai O., Panchagnula R. Insulin therapies past, present and future // Drug Discov. Today. 2001. V. 6. №20. P. 1056- 1061.

13. Yip C.M., Brader M.L., Frank B.H., DeFelippis M.R., Ward M.D. Structural studies of a crystalline insulin analog complex with protamine by atomic force microscopy // Biophys. J. 2000. V. 78. № 1. P. 466 473.

14. Trehan A., Ali A. Recent approaches in insulin delivery // Drug Dev. Ind. Pharm. 1998. V. 24. № 7. p. 589 597.18. §enel S. Potential applications of chitosan in oral mucosal delivery // J. Drug Del. Sci. Tech. 2010. V. 20. № l.P. 23-32.

15. Pather S.I., Rathbone M.J., Senel S. Current status and the future of buccal drug delivery systems // Expert Opin. Drug Deliv. 2008. V. 5. № 5. P. 531 542.

16. Sudhakar Y., Kuotsu K., Bandyopadhyay A.K. Buccal bioadhesive drug delivery a promising option for orally less efficient drugs // J. Control. Release. 2006. V. 114. № 1. P. 15-40.

17. Patel V.F., Liu F., Brown M.B. Advances in oral transmucosal drug delivery // J. Control. Release. 201 l.V. 153. №2. P. 106-116.

18. Consuelo I.D., Jacques Y., Pizzolato G., Guy R.H., Falson F. Comparison of the lipid composition of porcine buccal and esophageal permeability barriers // Arch. Oral Biol. 2005. V. 50. № 12. P. 981 -987.

19. Squier C.A., Senel S., Wertz P. Oral (buccal) mucosal drug delivery, promises and probabilities // STP Pharma Prat. 2000. V. 10. P. 47 54.

20. Collins L.M.C., Dawes C. The surface area of the adult human mouth and thickness of the salivary film covering teeth and oral mucosa // J. Dent. Res. 1987. V. 66. P. 1300 1302.

21. Pozzilli P., Manfrini S., Costanza F., Coppolino G., Cavallo M.G., Fioriti E., Modi P. Biokinetics of buccal spray insulin in patients with type 1 diabetes // Metabol. Clin. Exp. 2005. V. 54. № 7. P. 930 934.

22. Xu H., Huang K., Zhu Y., Gao Q., Wu Q., Tian W., Sheng X., Chen Z., Gao Z. Hypoglycaemic effect of a novel insulin buccal formulation on rabbits // Pharmacol. Res. 2002. V. 46. № 5. P. 459 467.

23. RapidMist™ // Generex Biotechnology Corporation. URL: http://www.generex.com/index.php/id/261.

24. Makhlof A., Werle M., Takeuchi H. Mucoadhesive drug carriers and polymers for effective drug delivery // J. Drug Del. Sci. Tech. 2008. V. 18. № 6. P. 375 386.

25. Patton J.S. Mechanisms of macromolecule absorption by the lungs // Adv. Drug Deliv. Rev. 1996. V. 19. № 1. p. 3-36.

26. Schulz H. Mechanisms and factors affecting intrapulmonary particle deposition: implications for efficient inhalation therapies // Pharm. Sci. Technol. Today 1998. V. 1. № 8. P. 326 334.

27. Diabetes (type 1 and 2), Inhaled Insulin Appraisal Consultation Document (second) // National Institute for Health and Clinical Excellence. URL: http://wAvw.nice.org.uk/guidance/index.jsp?action=article&r=true&o=33783.

28. Lima I.S., Airoldi C. A thermodynamic investigation on chitosan-divalent cation interactions // Thermochimica Acta. 2004. V. 421. № 1 2. P. 133 - 139.

29. Stock Exchange no 2 / 2008 // Novo Nordisk A/S. URL: http://www.novonordisk.com/include/asp/exenewsattachment.asp?sAttachmentGUID=15 31cc83-f75c-4368-995e-f0667112304f.

30. Ilium L. Nasal delivery of peptides, factors affecting nasal absorption // Topics in Pharmaceutical Sciences eds. Crommelin D.J.A., Midha K.K.. Stuttgart : Medpharm Scientific. 1992. P. 71-82.

31. Hinchcliffe M., Ilium L. Intranasal insulin delivery and therapy // Adv. Drug Deliv. Rev. 1999. V. 35. № 2 3. P. 199 - 234.

32. Soane R.J., Frier M., Perkins A.C., Jones N.S., Davis S.S., Ilium L. Evaluation of the clearance characteristics of bioadhesive systems in humans // Int. J. Pharm. 1999. V. 178. № l.P. 55-65.

33. O'Hagan D.T., Ilium L. Absorption of peptides and proteins from the respiratory tract and the potential for development of locally administered vaccine // Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 1990. V. 7. № 1. P. 35 97.

34. Schipper N.G.M., Olsson S., Hoogstraate J.A., deBoer A.G., Varum K.M., Artursson P. Chitosans as absorption enhancers for poorly absorbable drugs. 2: Mechanism of absorption enhancement // Pharm. Res. 1997. V. 14. № 7. P. 923 929.

35. Hirai S., Yashiki T., Mima H. Mechanisms for the enhancement of the nasal absorption of insulin by surfactants // Int. J. Pharm. 1981. V. 9. № 2. P. 173 184.141

36. Barry B.W. Novel mechanisms and devices to enable successful transdermal drug delivery // Eur. J. Pharm. Sci. 2001. V. 14. №2. P. 101-114.

37. Prausnitz M.R., Mitragotri S., Langer R. Current status and future potential of transdermal drug delivery//Nat. Rev. Drug Discov. 2004. V. 3. № 2. P. 115 124.

38. Kanikkannan N., Kandimalla K., Lamba S.S., Singh M. Structure-activity relationship of chemical penetration enhancers in transdermal drug delivery // Curr. Med. Chem. 2000. V. 7. № 6. P. 593 608.

39. Cevc G. Transdermal drug delivery of insulin with ultradeformable carriers // Clin. Pharmacokinet. 2003. V. 42. № 5. P. 461 474.

40. Curdy C., Kalia Y.N., Guy R.H. Non-invasive assessment of the effects of iontophoresis on human skin in-vivo // J. Pharmacol. 2001. V. 53. № 6. P. 769 777.

41. Kanikkannan N. Iontophoresis-based transdermal delivery systems // BioDrugs. 2002. V. 16. №5. P. 339-347.

42. Machet L., Boucaud A. Phonophoresis: efficiency, mechanisms and skin tolerance // Int. J. Pharm. 2002. V. 243. № 1 2. P. 1 - 15.

43. Mitragotri S., Kost J. Low-frequency sonophoresis. A review // Adv. Drug Deliv. Rev. 2004. V. 56. №5. P. 589-601.

44. Transdermal & Microneedle Technologies // 3M Drug Delivery Systems. URL: http://solutions.3m.com/wps/portal/3M/enWW/3M-DDSD/Drug-Delivery-Systems/Transdermal-Microneedle-Directory.

45. Shivanand P. Non-invasive insulin delivery systems: challenges and needs for improvement // Int. J. PharmTech Res. 2010. V. 2. № 1. P. 603 614.

46. Xuan B., McClellan D.A., Moore R., Chiou G.C. Alternative delivery of insulin via eye drops // Diabetes Technol. Ther. 2005. V. 7. № 5. P. 695 698.

47. Muzzarelli R.A.A., Muzzarelli C. Chitosan chemistry: relevance to the biomedical sciences //Adv. Polym. Sci. 2005. V. 186. P. 151 -209.

48. Lassmann-Vague V., Raccah D. Alternatives routes of insulin delivery // Diabetes Metab. 2006. V. 32. № 5 Pt. 2. P. 513 522.

49. Carino G.P., Mathiowitz E. Oral insulin delivery // Adv. Drug Deliv. Rev. 1999. V. 35. №2-3. P. 249-257.

50. Schilling R.J., Mitra A.K. Intestinal mucosal transport of insulin // Int. J. Pharm. 1990. V. 62. № LP. 53-64.

51. Michel C., Aprahamian M., Defontaine L., Couvreur P., Damge C. The effect of site of administration in the gastrointestinal tract on the absorption of insulin from nanocapsules in diabetic rats // J. Pharm. Pharmacol. 1991. V. 43. № 1. P. 1 5.

52. Damge С., Hillaire-Buys D., Puech R., Hoeltzel A., Michel C., Ribes G. Effects of orally administered insulin nanocapsules in normal and diabetic dogs // Diab. Nutr. Metab. 1995. V. 8. P. 3 9.

53. Шмидт P., Тевс Г. Физиология человека M.: Мир. 1996. Т. 3, 198 с.

54. Haverstick D.M., Dickemper D., Gold A.H. Cycloheximide inhibition of insulin control of liver glycogen synthase b into a conversion // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1979. V. 87. № 1. P. 177-183.

55. Blackard W.G., Nelson N.C. Portal and peripheral vein immunoreactive insulin concentrations before and after glucose infusion // Diabetes. 1970. V. 19. № 5. P. 302 306.

56. Hamman, J.H., Enslin, G.M., Kotze, A.F. Oral delivery of peptide drugs: barriers and developments //BioDrugs. 2005. V. 1. № 3. P. 165 177.

57. Chen M.C., Sonaje K., Chen K.J., Sung H.W. A review of the prospects for polymeric nanoparticle platforms in oral insulin delivery // Biomaterials. 2011. V. 32. № 36. P. 9826 -9838.

58. Werle M., Takeuchi H. Strategies to overcome the enzymatic barrier // Oral delivery of macromolecular drugs: barriers, strategies and future trends, ed. Bernkop-Schnurch A.. -New York : Springer Science + Business Media. 2009. P. 65-83.

59. Damge C., Reis C.P., Maincent P. Nanoparticle strategies for the oral delivery of insulin // Expert Opin. Drug Deliv. 2008. V. 5. № 1. P. 1 24.

60. Zaghloul A., Taha E., Afouna M., Khattab I., Nazzal S. Ex vivo mucoadhesion and in vivo bioavailability assessment and correlation of ketoprofen tablet dosage forms containing bioadhesives // Pharmazie. 2007. V. 62. № 5. P. 346 350.

61. Платэ H.A., Старосельцева JI.K., Валуев Л.И., Сытов Г.А., Ульянова М.В., Валуев И.Л., Ванчугова Л.В. Раствор инсулина для перорального введения // Хим. -фарм. журн. 2006. Т. 40. № 4. С. 47 50.

62. Valuev L.I., Sytov G.A., Starosel'tseva L.K., Valuev I.L., Vanchugova L.V., Valueva T.A., Ul'yanova M.V., Plate N.A. Oral insulin preparation for regulation of the blood glucose level//Biomed. Khim. 2010. V. 4. № i.p. 112-115.

63. Изумрудов B.A. Явления самосборки и молекулярного "узнавания" в растворах (био)полиэлектролитных комплексов //Успехи химии. 2008. Т. 77. № 4. С. 401 -415.

64. EUDRAGIT® // American Association of Pharmaceutical Scientists (AAPS). URL: http://abstracts.aapspharmaceutica.com/ExpoAAPS09/Data/EC/Event/Exhibitors/33/product Brochurel.pdf.

65. Park K., Kwon I.C., Park K. Oral protein delivery: Current status and future prospect // React. Funct. Polym. 2011. V. 71. № 3. P. 280 287.

66. Smart J.D. The basics and underlying mechanisms of mucoadhesion // Adv. Drug Deliv. Rev. 2005. V. 57. №11. P. 1556- 1568.

67. Валуев И.Л., Сытов Г.А., Валуев Л.И., Валуева Т.А., Ульянова М.В., Плате Н.А. Ингибиторы протеолитических ферментов в терапии сахарного диабета // Вопр. мед. химии. 2001. Т. 47. № 1.С. 132-139.

68. Plate N.A., Valuev I.L., Sytov G.A., Valuev L.I. Mucoadhesive polymers with immobilized proteinase inhibitors for oral administration of protein drugs // Biomaterials. 2002. V. 23. №7. P. 1673-1677.

69. Besheer A., Wood K.M., Peppas N.A., Mader K. Loading and mobility of spin-labeled insulin in physiologically responsive complexation hydrogels intended for oral administration // J. Control. Release. 2006. V. 111. № 1 2. P. 73 - 80.

70. Martins S., Sarmento В., Souto E.B., Ferreira D.C. Insulin-loaded alginate microspheres for oral delivery Effect of polysaccharide reinforcement on physicochemical properties and release profile // Carbohydr. Polym. 2007. V. 69. № 4. P. 725 - 731.

71. Sarmento В., Ribeiro A.J., Veiga F., Ferreira D.C., Neufeld R.J. Insulin-loaded nanoparticles are prepared by alginate ionotropic pre-gelation followed by chitosan polyelectrolyte complexation // J. Nanosci. Nanotechnol. 2007. V. 7. № 8. P. 2833-2841.

72. Sarmento В., Ribeiro A., Veiga F., Sampaio P., Neufeld R., Ferreira D. Alginate/chitosan nanoparticles are effective for oral insulin delivery // Pharm. Res. 2007. V. 24. № 12. P. 2198-2206.

73. Zhang N., Li J., Jiang W., Ren C., Li J., Xin J., Li K. Effective protection and controlled release of insulin by cationic beta-cyclodextrin polymers from alginate/chitosan nanoparticles // Int. J. Pharm. 2010. V. 393. № 1 2. P. 212-218.

74. Sarmento В., Ribeiro A., Veiga F., Ferreira D. Development and characterization of new insulin containing polysaccharide nanoparticles // Colloids Surf. B: Bio interfaces. 2006. V. 53. №2. P. 193-202.

75. Sarmento В., Ribeiro A., Veiga F., Ferreira D., Neufeld R. Oral bioavailability of insulin contained in polysaccharide nanoparticles // Biomacromolecules. 2007. V. 8. № 10. P. 3054-3060.

76. Cui F., Zhang L., Zheng J., Kawashima Y. A study of insulin-chitosan complex nanoparticles used for oral administration // J. Drug Del. Sci. Tech. 2004. V. 14. № 6. P. 435-439.

77. Sonaje K., Lin Y.H., Juang J.H., Wey S.P., Chen C.T., Sung H.W. In vivo evaluation of safety and efficacy of self-assembled nanoparticles for oral insulin delivery // Biomaterials. 2009. V. 30. № 12. P. 2329-2339.

78. Dai Z., Heilig A., Zastrow H., Donath E., Môhwald H. Novel formulations of vitamins and insulin by nanoengineering of polyelectrolyte multilayers around microcrystals // Chemistry. 2004. V. 10. № 24. P. 6369 6374.

79. Балабушевич Н.Г., Ларионова Н.И. Получение и характеристика полиэлектролитных микрочастиц с белком //Биохимия. 2004. Т. 69. № 7. С. 930 936.

80. Балабушевич Н.Г., Вихорева Г.А., Михальчик Е.В., Ларионова Н.И. Получение и свойства рН-чувствительных наноструктурированных полиэлектролитных микрочастиц с инсулином // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия. 2010. Т. 51. № 3. С. 178-184.

81. Zheng J., Yue X., Dai Z., Wang Y., Liu S., Yan X. Novel iron-polysaccharide multilayered microcapsules for controlled insulin release // Acta Biomater. 2009. V. 5. № 5. P. 1499 -1507.

82. Балабушевич Н.Г., Изумрудов B.A., Зоров И.Н., Ларионова Н.И. Создание хитозан-содержащих полиэлектролитных микрочастиц для пероральной доставки белков // Биофарм. журнал. 2010. Т. 2. № 1. С. 35 -41.

83. Fan Y.F., Wang Y.N., Fan Y.G., Ma J.B. Preparation of insulin nanoparticles and their encapsulation with biodegradable polyelectrolytes via the layer-by-layer adsorption // Int. J. Pharm. 2006. V. 324. № 2. P. 158 167.

84. Fernândez-Urrusuno R., Calvo P., Remunân-Lôpez C., Vila-Jato J.L., Alonso M.J. Enhancement of nasal absorption of insulin using chitosan nanoparticles // Pharm. Res. 1999. V. 16. № 10. P. 1576- 1581.

85. Балабушевич Н.Г., Изумрудов B.A., Ларионова Н.И. Белковые микрочастицы с контролируемой стабильностью, полученные послойной адсорбцией биополиэлектролитов // Высокомолек. соед. С. 2012. V. 54. № 4. Р. 1 14.145

86. Iler R.K. Multilayers of colloidal particles // J. Colloid Interface Sci. 1966. V. 21. № 6. P. 569-594.

87. Decher G. Fuzzy Nanoassemblies: Toward Layered Polymeric Multicomposites // Science. 1997. V. 277. № 5330. P. 1232 1237.

88. Zhao J., Cui Y., Wang A., Fei J., Yang Y., Li J. Side effect reduction of encapsulated hydrocortisone crystals by insulin/alginate shells // Langmuir. 2011. V. 27. № 4.-P. 1499 -1504.

89. Kamiya N., Klibanov A.M. Controling the rate of protein release from polyelectrolyte complexes // Biotechnol. Bioeng. 2003. V. 82. № 5. P. 590 594.

90. Balabushevich N.G, Lebedeva O.V., Vinogradova O.I., Larionova N.I. Polyelectrolyte assembling for protein microencapsulation // J. Drug Del. Sci. Tech. 2006. V. 16. № 4. P. 315 — 319.

91. Ю2.Балабушевич Н.Г., Сухорукое Г.В., Ларионова Н.И. Включение белков в полиэлектролитные микрокапсулы из декстран сульфата, протамина и меламинформальдегида // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия. 2002. V. 43. № 6. Р. 370-376.

92. Qi W., Duan L., Li J. Fabrication of glucose-sensitive protein microcapsules and their applications // Soft Matter. 2011. V. 7. № 5. P. 1571 1576.

93. Lee H., Jeong Y., Park T.G. Shell cross-linked hyaluronic acid/polylysine layer-by-layer polyelectrolyte microcapsules prepared by removal of reducible hyaluronic acid microgel cores // Biomacromolecules. 2007. V. 8. № 12. P. 3705 3711.

94. Rivera-Gil P., De Koker S., De Geest B.G., Parak W.J. Intracellular processing of proteins mediated by biodegradable polyelectrolyte capsules // Nano Lett. 2009. V. 9. № 12. P. 4398-4402.

95. Langguth P., Bohner V., Heizman J., Merkle H.P., Wolfram S., Amidon G.L., Yamashita S. The challenge of proteolytic enzymes in intestinal peptide delivery // Int. J. Pharm. 1997. V. 46. № 1-2. P. 39-57.

96. Liu F.Y.,Mitra A.K. Insulin aggregation in aqueous media and its effect on alpha-chymotrypsin-mediated proteolytic degradation // Pharm. Res. 1991. V. 8. № 7. P. 925 -929.

97. Bohe M., Borgstrom A., Genell S., Ohlsson K. Determination of immunoreactive trypsin, pancreatic elastase and chymotrypsin in extracts of human feces and ileostomy drainage // Digestion. 1983. V. 27. № 1. P. 8 15.

98. Takeuchi H., Yamamoto H., Niwa T., Hino T., Kawashima Y. Enteral absorption of insulin in rats from mucoadhesive chitosan-coated liposomes // Pharm. Res. 1996. V. 13. № 6. P. 896-901.

99. Sajeesh S., Vauthier C., Gueutin C., Ponchel G., Sharma C.P. Thiol functionalized polymethacrylic acid-based hydrogel microparticles for oral insulin delivery // Acta Biomater. 2010. V. 6. № 8. P. 3072 3080.

100. Dorkoosh F.A., Verhoef J.C., Borchard G., Rafiee-Tehrani M., Junginger H.E. Development and characterization of a novel peroral peptide drug delivery system // J. Control. Release. 2001. V. 71. №3. P. 307-318.

101. Reis C.P., Veiga F.J., Ribeiro A.J., Neufeld R.J., Damge C. Nanoparticulate biopolymers deliver insulin orally eliciting pharmacological response // J. Pharm. Sei. 2008. V. 97. № 12. P. 5290-5305.

102. Woitiski C.B., Neufeld R.J., Veiga F., Carvalho R.A., Figueiredo I.V. Pharmacological effect of orally delivered insulin facilitated by multilayered stable nanoparticles // Eur. J. Pharm. Sei. 2010. V. 41. № 3 4. P. 556 - 563.

103. Bernkop-Schnürch A., Marschütz M.K. Development and in vitro evaluation of systems to protect peptide drugs from aminopeptidase N//Pharm. Res. 1997. V. 14.№2. P. 181 185.

104. Wu Z.H., Ping Q.N., Song Y.M., Lei X.M., Li J.Y., Cai P. Studies on the insulin-liposomes double-coated by chitosan and chitosan-EDTA conjugates // Yao Xue Xue Bao. 2004. V. 39. № 11. P. 933-938.

105. Loretz B., Föger F., Werle M., Bernkop-Schnürch A. Oral gene delivery: Strategies to improve stability of pDNA towards intestinal digestion // J. Drug Targ. 2006. V. 14. № 5. P. 311 -319.

106. Biruss B., Valenta C. Skin permeation of different steroid hormones from polymeric coated liposomal formulations // Eur. J. Pharm. Biopharm. 2006. V. 62. № 2. P. 210-219.

107. Bernkop-Schnürch A., Gockel N.C. Development and analysis of a polymer protecting from luminal enzymatic degradation caused by a-chymotrypsin // Drug Dev. Ind. Pharm. 1997. V. 23. №8. P. 733-740.

108. Madsen F., Peppas N.A. Complexation graft copolymer networks: swelling properties, calcium binding and proteolytic enzyme inhibition // Biomaterials. 1999. V. 20. № 18. P. 1701- 1708.

109. Akiyama Y., LueBen H.L., de Boer A.G., Verhoef J.C., Junginger H.E. Design of fast dissolving poly(acrylate) and controlled drug releasing capsule formulations with trypsin inhibiting properties // Int. J. Pharm. 1996. V. 138. № 1. P. 13 23.

110. Fujii S., Yokoyama T., Ikegaya K., Sato F., Yokoo N. Promoting effect of the new chymotrypsin inhibitor FK-448 on the intestinal absorption of insulin in rats and dogs // J. Pharm. Pharmacol. 1985. V. 37. № 8. P. 545 549.

111. Yamamoto A., Taniguchi T., Rikyuu K., Tsuji T., Fujita T., Murakami M., Muranishi S. Effects of various protease inhibitors on the intestinal absorption and degradation of insulin in rats // Pharm. Res. 1994. V. 11. № 10. P. 1496 1500.

112. Werle M., Loretz B., Entstrasser D., Foger F. Design and evaluation of a chitosan-aprotinin conjugate for the peroral delivery of therapeutic eptides and proteins susceptible to enzymatic degradation // J. Drug Targ. 2007. V. 15. № 5. P. 327 333.

113. Drapeau G., Petitclerc E., Toulouse A., Marceau F. Dissociation of the antimicrobial activity of bacitracin USP from its renovascular effects // Antimicrob. Agents Chemother. 1992. V. 36. № 5. P. 955-961.

114. Watanabe S., Takeuchi T., Chey W.Y. Mediation of trypsin inhibitor-induced pancreatic hypersecretion by secretin and cholecystokinin in rats // Gastroenterology. 1992. V. 102. №2. P. 621 -628.

115. Bernkop-Schnurch A., Scerbe-Saiko A. Synthesis and in vitro evaluation of chitosan-EDTA-protease inhibitor conjugates which might be useful in oral delivery of peptides and proteins //Pharm. Res. 1998. V. 15. №2. P. 263-269.

116. Bernkop-Schnurch A., Bratengeyer I., Valenta C. Development and in vitro evaluation of a drug delivery system protecting from trypsinic degradation // Int. J. Pharm. 1997. V. 157. № 1. P. 17-25.

117. McClellan J.B.Jr, Garner C.W. Purification and properties of human intestine alanine aminopeptidase // Biochim. Biophys. Acta. 1980. V. 613. № 1. P. 160 167.

118. Langguth P., Bohner V., Biber J., Merkle H.P. Metabolism and transport of the pentapeptide metkephamid by brush-border membrane vesicles of rat intestine // J. Pharm. Pharmacol. 1994. V. 46. № i.p. 34-40.

119. Kimura T., Sato K., Sugimoto K., Tao R., Murakami T., Kurosaki Y., Nakayama T. Oral administration of insulin as polyvinyl alcohol)-gel spheres in diabetic rats // Biol. Pharm. Bull. 1996. V. 19. №6. P. 897-900.

120. Larionova N.V., Ponchel G., Duchene D., Larionova N.I. Biodegradable cross-linked starch/protein microcapsules containing proteinase inhibitor for oral protein administration // Int. J. Pharm. 1999. V. 189. №2. P. 171-178.

121. Esposito E., Cortesi R., Bortolotti F., Menegatti E., Nastruzzi C. Production and characterisation of biodegradable microparticles for the controlled delivery of protease inhibitors // Int. J. Pharm. 1996. V. 129. № 1 2. P. 263 - 273.

122. Krauland A.H., Guggi D., Bernkop-Schnurch A. Oral insulin delivery: the potential of thiolated chitosan-insulin tablets on non-diabetic rats // J. Control. Release. 2004. V. 95. № 3. P. 547-555.

123. Marschtitz M.K., Bernkop-Schnurch A. Oral peptide drug delivery: polymer-inhibitor conjugates protecting insulin from enzymatic degradation in vitro // Biomaterials. 2000. V. 21. № 14. P. 1499-1507.

124. Nagai T., Morishita M., Maitani Y. Trials of enteral delivery of peptide drugs // Recent Adv. in Peptide and Protein Delivery, 8th Int. Pharm. Tech. Symp., Ankara. 1996. P. 45 57.

125. Kidron M., Krausz M.M., Raz I., Bar-On H., Ziv E. The absorption of insulin // Tenside Surf. Det. 1989. V. 26. № 3. P. 352 354.

126. Veuillez F., Kalia Y.N., Jacques Y., Deshusses J., Buri P. Factors and strategies for improving buccal absorption of peptides // Eur. J. Pharm. Biopharm. 2001. V. 51. № 2. P. 93-109.

127. Caramella C., Ferrari F., Bonferoni M.C., Rossi S., Sandri G. Chitosan and its derivatives as drug penetration enhancers // J. Drug Del. Sci. Tech. 2010. V. 20. № 1. P. 5 13.

128. Gordon Still J. Development of oral insulin: progress and current status // Diabetes Metab. Res. Rev. 2002. V. 18. № 1. P. S29 S37.

129. Norris D.A., Puri N., Sinko P.J. The effect of physical barriers and properties on the oral absorption of particulates // Adv. Drug Deliv. Rev. 1998. V. 34. № 2 3. P. 135 - 154.

130. Slomiany B.L., Murty V.L., Piotrowski J., Slomiany A. Salivary mucins in oral mucosal defense // Gen. Pharmac. 1996. V. 27. № 5. P. 761 771.

131. Attivi D., Wehrle P., Ubrich N., Damge C., Hoffman M., Maincent P. Formulation of insulin-loaded polymeric nanoparticles using response surface methodology // Drug Dev. Ind. Pharm. 2005. V. 31. № 2. P. 179 89.150

132. Bures P., Huang Y., Oral E., Peppas N.A. Surface modifications and molecular imprinting of polymers in medical and pharmaceutical applications // J. Control. Release. 2001. V. 72. №1-3. P. 25-33.

133. Ludwig A. The use of mucoadhesive polymers in ocular drug delivery // Adv. Drug Deliv. Rev. 2005. V. 57. № 11. P. 1595- 1639.

134. Fefelova N., Nurkeeva Z., Mun G., Khutoryanskiy V. Mucoadhesive interactions of amphiphilic cationic copolymers based on 2-(methacryloyloxy) ethyl. trimethyl ammonium chloride // Int. J. Pharm. 2007. V. 339. № 1 2. P. 25 - 32.

135. He P., Davis S., Ilium L. In vitro evaluation of the mucoadhesive properties of chitosan microspheres // Int. J. Pharm. 1998. V. 166. № 1. P. 75 88.

136. Needleman I.G., Smales F.C. In vitro assessment of bioadhesion for periodontal and buccal drug delivery // Biomaterials. 1995. V. 16. № 8. P. 617 624.

137. Snyman D., Hamman J.H., Kotze A.F. Evaluation of the mucoadhesive properties of N-trimethyl chitosan chloride // Drug Dev. Ind. Pharm. 2003. V. 29. № 1. P. 61 69.

138. Thirawong N., Nunthanid J., Puttipipatkhachorn S., Sriamornsak P. Mucoadhesive properties of various pectins on gastrointestinal mucosa: an in vitro evaluation using texture analyzer // Eur. J. Pharm. Biopharm. 2007. V. 67. № 1. P. 132 140.

139. Gu J.M., Robinson J.R., Leung S.H. Binding of acrylic polymers to mucin/epithelial surfaces: structure-property relationships // Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 1988. V. 5. № LP. 21-67.

140. Ch'ng H.S., Park H., Kelly P., Robinson J.R. Bioadhesive polymers as platforms for oral controlled drug delivery II: synthesis and evaluation of some swelling, water-insoluble bioadhesive polymers // J. Pharm. Sci. 1985. V. 74. № 4. P. 399 405.

141. Arya R.K.K., Singh R., Juyal V. Mucoadhesive microspheres of famotidine: preparation characterization and in vitro evaluation // Int. J. Eng. Sci. Tech. 2010. V. 2. № 6. P. 1575 -1580.

142. Shimoda J., Onishi H., Machida Y. Bioadhesive characteristics of chitosan microspheres to the mucosa of rat small intestine // Drug Dev. Ind. Pharm. 2001. V. 27. № 6. P. 567 576.151

143. Takishima J., Onishi H., Machida Y. Prolonged intestinal absorption of cephradine with chitosan-coated ethylcellulose microparticles in rats // Biol. Pharm. Bull. 2002. V. 25. №11. P. 1498- 1502.

144. Desai M.P., Labhasetwar V., Amidon G.L., Levy R.J. Gastrointestinal uptake of biodegradable microparticles: effect of particle size // Pharm. Res. 1996. V. 13. № 12. P. 1838- 1845.

145. Billings P.C., Brandon D.L., Habres J.M. Internalisation of the Bowman-Birk protease inhibitor by intestinal epithelial cells // Eur. J. Cancer. 1991. V. 7. № 27. P. 903 908.

146. Swaan P.W. Recent advances in intestinal macromolecular drug delivery via receptor-mediated transport pathways // Pharm. Res. 1998. V. 15. № 6. P. 826 834.

147. Bai J.P., Chang L.L. Transepithelial transport of insulin: I. Insulin degradation by insulin-degrading enzyme in small intestinal epithelium // Pharm. Res. 1995. V. 12. № 8. P. 1171 -1175.

148. Javelow J., Scott C.B., Mayer T.C. Fluorescent visualization of binding and internalization of the anticarcinogenic Bowman-Birk type protease inhibitors in transformed fibroblasts // Cancer Res. 1987. V. 47. № 6. P. 1602 1607.

149. Chalasani K.B., Russell-Jones G.J., Yandrapu S.K., Diwan P.V., Jain S.K. A novel vitamin B12-nanosphere conjugate carrier system for peroral delivery of insulin // J. Control. Release. 2007. V. 117. № 3. P. 421 -429.

150. Chiba H., Osanai M., Murata M., Kojima M., Sawada N. Transmembrane proteins of tight junctions // Biochim. Biophys. Acta. 2008. V. 1778. № 3. P. 588 600.

151. Deli M.A. Potential use of tight junction modulators to reversibly open membranous barriers and improve drug delivery // Biochim. Biophys. eta. 2009. V. 1788. № 4. P. 892 910.

152. Smith J.M., Dornish M., Wood E.J. Involvement of protein kinase C in chitosan glutamate-mediated tight junction disruption // Biomaterials. 2005. V. 26. № 16. P. 3269 3276.

153. Ilium L. Nanoparticulate systems for nasal delivery of drugs: a real improvement over simple systems? // J. Pharm. Sci. 2007. V. 96. № 3. P. 473 483.

154. Kriwet B., Kissel T. Poly(acrylic acid) microparticles widen the intercellular spaces of Caco-2 cell monolayers: An examination by confocal laser scanning microscopy // Eur. J. Pharm. Biopharm. 1996. V. 42. № 4. p. 233-240.

155. Kassab F.Jr, Marques R.P., Lacaz-Vieira F. Modeling tight junction dynamics and oscillations // J. Gen. Physiol. 2002. V. 120. № 2. P. 237 247.

156. Bravo-Osuna I., Millotti G., Vauthier C., Ponchel G. In vitro evaluation of calcium binding capacity of chitosan and thiolated chitosan poly(isobutyl cyanoacrylate) core-shell nanoparticles // Int. J. Pharm. 2007. V. 338. №1-2. P. 284 290.

157. Artursson P., Lindmark T., Davis S.S., Ilium L. Effect of chitosan on the permeability of monolayers of intestinal epithelial cells (Caco-2) // Pharm. Res. 1994. V. 11. № 9. P. 1358 -1361.

158. Thanou M., Verhoef J.C., Junginger H.E. Oral drug absorption enhancement by chitosan and its derivatives//Adv. DrugDeliv. Rev. 2001. V. 52. №2. P. 117- 126.

159. Dodane V., Amin Khan M., Merwin J.R. Effect of chitosan on epithelial permeability and structure// Int. J. Pharm. 1999. V. 182. № 1. P. 21 -32.

160. Smith J., Wood E., Dornish M. Effect of chitosan on epithelial cell tight junctions // Pharm. Res. 2004. V. 21. № 1. P. 43 49.

161. Amersham Biosciences. Dextran sulfate sodium salt // GE Healthcare Life Sciences. URL: https://www.gelifesciences.com/gehclsimages/GELS/Related%20Content/Files/131472311 6657/litdoc 18115175 AA20110830202529.pdf.

162. Tiyaboonchai W., Woiszwillo J., Sims R.C., Middaugh C.R. Insulin containing polyethylenimine-dextran sulfate nanoparticles // Int. J. Pharm. 2003. V. 255. № 1 2. P. 139-151.

163. Brems D.N., Alter L.A., Beckage M.J., Chance R.E., DiMarchi R.D., Green L.K., Long H.B., Pekar A.H., Shields J.E., Frank B.H. Altering the association properties of insulin by amino acid replacement // Protein Engineering. 1992. V. 5. № 6. P. 527 533.

164. Salama N.N., Eddington N.D., Fasano A. Tight junction modulation and its relationship to drug delivery // Adv. Drug Deliv. Rev. 2006. V. 58. № 1. P. 15 28.

165. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent//J. Biol. Chem. 1951. V. 193. № 1. p. 265-275.

166. Rick W. Chymotrypsin // Methods of enzymatic analysis ed. Bergmeyer H.V.. New York : Academic. 1992. V. 2. P. 1013 - 1018.

167. Kakade M.L., Simons N., Liener I.E. An evaluation of natural vs. synthetic substrates for measuring the antitryptic activity of soybean samples. // Cereal Chem. 1969. V. 46. № 5. P. 518-526.

168. Mantle M., Allen A. A colorimetric assay for glycoproteins based on the periodic acid/Schiff stain // Biochem. Soc. Trans. 1978. V. 6. № 3. P. 607 609.

169. Schwert G.W., Takenaka Y.A. A spectrophotometric determination of trypsin and chymotrypsin // Biochim. Biophys. Acta. 1965. V. 16. P. 570 576.

170. European Pharmacopoeia, 7th Edition Strasbourg: Council of Europe. 2011, 1000 p.

171. Bernkop-Schniirch A. Mucoadhesive systems in oral drug delivery. // Drug Discov. Today. 2005. V. 2. № LP. 83-87.

172. Sarmento В., Ribeiro A., Veiga F., Ferreira D. Development and validation of a rapid reversed-phase HPLC method for the determination of insulin from nanoparticulate systems // Biomed. Chromatogr. 2006. V. 20. № 9. P. 898 903.

173. Purvinis G., Cameron B.D., Altrogge D.M. Noninvasive polarimetric-based glucose monitoring: an in vivo study // J. Diabetes Sci. Technol. 2011. V. 5. № 2. P. 380 387.

174. Hauschke D., Steinijans V., Pigeot I. Bioequivalence Studies in Drug Development: Methods and Applications Chichester, UK : John Wiley and Sons. 2007, 328 p.154

175. Spector T. Refinement of the coomassie blue method of protein quantitation. A simple and linear spectrophotometry assay for less than or equal to 0.5 to 50 microgram of protein // Anal. Biochem. 1978. V. 86. № 1. P. 142 146.

176. Muzzarelli R.A.A. Colorimetric determination of chitosan // Anal. Biochem. 1998. V. 260. №2. P. 255-257.

177. Wischke C., Borchert H.-H. Increased sensitivity of chitosan determination by a dye binding method // Carbohydr. Res. 2006. V. 341. № 18. P. 2978 2979.

178. Prochazkova S., Varum K.M., 0stgaard K. Quantitative determination of chitosans by ninhydrin // Carbohydr. Polym. 1999. V. 38. № 2. P. 115 -122.

179. Svedas V.-J.K., Galaev I.J., Borisov I.L., Berezin I.V. The interaction of amino acids with o-phthaldialdehyde: a kinetic study and spectrophotometric assay of the reaction product // Anal. Biochem. 1980. V. 101. № 1. P. 188 195.

180. Blundell T., Dodson G., Hodgkin D., Mercola D. Insulin: the structure in the crystal and its reflection in chemistry and biology // Adv. Protein Chem. 1972. V. 26. P. 279 402.

181. Tanford C., Kirkwood J.G. Theory of protein titration curves. I. General equations for impenetrable spheres // J. Am. Chem. Soc. 1957. V. 79. № 20. P. 5333 5339.

182. Tanford C., Roxby R. Interpretation of protein titration curves. Application to lysozyme // Biochemistry. 1972. V. 11. № 11. P. 2192-2198.

183. Peppas N.A., Sahlin J.J. Hydrogels as mucoadhesive and bioadhesive materials: a review // Biomaterials. 1996. V. 17. № 16. P. 1553 1561.

184. Березин И.В., Казанская Н.Ф., Ларионова Н.И. Взаимодействие четырех активных форм трипсина со специфическим субстратом и панкреатическим ингибитором // Биохимия. 1970. V. 35. № 5. Р. 983 988.

185. Ascenzi P., Bocedi A., Bolognesi M., Spallarossa A., Coletta M., De Cristofaro R., Menegatti E. The bovine basic pancreatic trypsin inhibitor (Kunitz inhibitor): a milestone protein // Curr. Protein Pept. Sci. 2003. V. 4. № 3. P. 231 251.

186. Ларионова Н.И., Гладышева И.П., Тихонова T.B., Казанская Н.Ф. Ингибирование катепсина G и эластазы гранулоцитов человека множественными формами соевого ингибитора типа Баумана-Бирк // Биохимия. 1993. V. 58. № 9. Р. 1437 1444.

187. B6sterling В., Quast U. Soybean trypsin inhibitor (Kunitz) is doubleheaded. Kinetics of the interaction of alpha-chymotrypsin with each side // Biochim. Biophys. Acta. 1981. V. 657. № 1. P. 58-72.

188. Matsushima A., Ashida Y., Watanabe J., Hirata T. Characterization of recombinant p20 trypsin inhibitor, a new protein from Glicine max // Plant Biotechnol. 2003. V. 20. № 1. P. 93-96.

189. Izumrudov V.A., Volkova I.F., Gorshkova M.Yu. Chitosan-based polyelectrolyte complexes soluble in enzyme-friendly pH range // Macromol. Chem. Phys. 2010. V. 211. № 4. P. 453 -460.

190. González-Mariscal L., Tapia R., Chamorro D. Crosstalk of tight junction components with signalling pathways // Biochim. Biophys. Acta. 2008. V. 1778. № 3. P. 729 756.

191. Krizbai I.A., Deli M.A. Signalling pathways regulating the tight junction permeability in the blood-brain barrier // Cell. Mol. Biol. 2003. V. 49. № 1. P. 23 31.

192. Lima I.S., Airoldi C. Interaction of copper with chitosan and succinic anhydride derivative -a factorial design evaluation of the chemisorption process // Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects. 2003. V. 229. № 1 3. P. 129 - 136.

193. Enzyme Explorer Pepsin // Sigma-Aldrich Co. LLC. URL: http://www.sigmaaldrich.com/life-science/metabolomics/enzyme-explorer/analytical-enzymes/pepsin.html.

194. SI Units for Clinical Data // The University of North Carolina at Chapel Hill. URL: http://www.unc.edu/~rowlett/units/scales/clinicaldata.html.

195. Marschütz M.K., Calceti P., Bernkop-Schniirch A. Design and in vivo evaluation of an oral delivery system for insulin // Pharm. Res. 2000. V. 17. № 12. P. 1468 1474.

196. Kararli T.T. Comparison of the gastrointestinal anatomy, physiology, and biochemistry of humans and commonly used laboratory animals // Biopharm. Drug. Dispos. 1995. V. 16. №5. P. 351 -380.

197. Sun S., Cui F., Kawashima Y., Liang N., Zhang L., Shi K., Yu Y. A novel insulin-sodium oleate complex for oral administration: preparation, characterization and in vivo evaluation // J. Drug Del. Sci. Tech. 2008. V. 18. № 4. P. 239 243.

198. Schwartz M.S., Chadha A. Type 2 diabetes mellitus in childhood: obesity and insulin resistance // J. Am. Osteopath. Assoc. 2008. V. 108. № 9. P. 518-524.

199. Damge C., Michel C., Aprahamian M., Couvreur P., Devissaguet J.P. Nanocapsules as carriers for oral peptide delivery // J. Control. Release. 1990. V. 13. № 2 3. P. 233 - 239.

200. First report of the BVA/FRAME/RSPCA/UFAW Joint Working Group on Refinement. Removal of blood from laboratory mammals and birds // Lab. Anim. 1993. V. 27. № 1.

201. Avdeef A. Physicochemical profiling (solubility, permeability and charge state) // Curr. Top. Med. Chem. 2001. V. 1. № 4. P. 277 351.1. P. 1-22.

Информация о работе

Печенкин, Михаил Александрович
кандидата химических наук
Москва, 2012
ВАК 03.01.06

Диссертация

Мультифункциональные полиэлектролитные микрочастицы для пероральной доставки рекомбинантных инсулинов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы