Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морской зоопланктон и методические проблемы его изучения

ВАК РФ 03.02.10, Гидробиология

Автореферат диссертации по теме "Морской зоопланктон и методические проблемы его изучения"

На правах рукописи (

/щлм

Литвинюк Дарья Анатольевна

МОРСКОЙ ЗООПЛАНКТОН И МЕТОДИЧЕСКИЕ ПРОБЛЕМЫ ЕГО ИЗУЧЕНИЯ

03.02.10 - гидробиология

2 2 АПР 2015

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

МОСКВА-2015

005567609

Работа выполнена в Институте биологии южных морей им. А.О. Ковалевского, г. Севастополь

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Самышев Эрнест Зайнуллинович Официальные оппоненты:

Ольга Петровна Дубовская, доктор биологических наук,

ФГБУН Институт биофизики Сибирского отделения Российской академии наук,

вед. научн. сотрудник лаборатории экспериментальной гидроэкологии

Елена Александровна Мнацаканова, кандидат биологических наук, ФГБОУ ВО Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, ст. научн. сотрудник кафедры гидробиологии биологического факультета

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт океанологии им. П.П. Ширшова Российской академии наук

Защита диссертации состоится «21» мая 2015 г. в «13» часов на заседании диссертационного совета Д.501.001.55 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, дом 1, МГУ, корп.12, Биологический факультет, ауд. 389. Тел. +7 (495) 939-25-73, эл. почта: dissovet 00155(ci)mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГУ и на сайте биологического факультета МГУ http://www.bio.msu.ru/

Автореферат разослан «¿.» 2015 г.

/

Ученый секретарь диссертационного совета

Карташева Наталия Васильевна

Актуальность темы. Рациональное использование и сохранение биологических ресурсов Мирового океана требует глубокого понимания процессов функционирования морских экосистем и закономерностей формирования их продуктивности.

Зоопланктон является важнейшим звеном водных пищевых цепей, изучение функциональных характеристик которого до настоящего момента остается одной из ключевых задач гидробиологии. Оценивая состояние и обилие зоопланктона, исследователи сталкиваются с проблемой получения достоверных данных о количестве живых и мёртвых организмов. С одной стороны, такие данные необходимы для точного расчета численности и биомассы отдельных групп зоопланктона. С другой стороны, они могут быть использованы для решения целого ряда задач, связанных с оценкой: состояния отдельных видов зоопланктона и всего сообщества в целом; условий формирования, динамики и распределения некрозоопланктона; хода сукцессии в планктонном сообществе и развития кормовой базы планктоядных рыб; масштабов элиминации зоопланктона, связанных с естественными и антропогенными причинами; многолетних трендов изменения смертности зоопланктона; загрязнения и процессов самоочищения вод (Кастальская-Карзинкина, 1937; Киселёв, 1969).

Несмотря на очевидную актуальность и длительную историю этих исследований, до сих пор сохраняется острый дефицит полевых данных о соотношении живых и мертвых организмов в планктоне. Причина этого -несовершенство и трудоёмкость существующих методов исследований, а также высокая степень субъективности получаемых с их помощью результатов. Можно выделить два основных методических подхода, применяемых в настоящее время для разделения живых и мертвых организмов планктона - 1) классический метод визуальной оценки наличия/отсутствия постмортальных изменений и 2) более современные методы маркирования живых или мёртвых особей с помощью специальных красителей различной химической природы. В нашем исследовании мы использовали оба эти подхода и сопоставляли результаты, полученные на их основе. Решение методических проблем было основано на поиске новых маркеров состояния организмов, улучшении качества их визуализации и разработке основ полуавтоматической классификации организмов на живые и мёртвые, позволяющей исключить субъективность получаемых оценок.

Цель и задачи диссертационной работы. Усовершенствовать методические подходы к оценке соотношения живых и мертвых организмов в планктоне, исследовать с их помощью сообщество зоопланктона морских акваторий с различным гидролого-гидрохимическим режимом вод.

Поставленная цель определила следующие задачи исследования:

• разработать новый метод витальной окраски организмов зоопланктона диацетатом флуоресцеина и апробировать его на модельной культуре и природном сообществе копепод.

• усовершенствовать процедуру классификации окрашенных организмов на живые и мёртвые путем оцифровки их изображений и последующего статистического анализа их цветовых характеристик.

• оценить эффективность окраски разных таксономических групп черноморского зоопланктона с помощью диацетата флуоресцеина (ДФ) и нейтрального красного (НК).

• исследовать сезонную динамику доли живых Сорероёа в Севастопольской бухте и сопредельных водах.

• сравнить акватории, отличающиеся гидролого-гидрохимическим режимом (воды Севастопольской бухты и прилегающей акватории) по соотношению живой и мёртвой компонент в сообществе зоопланктона, исследовать возможные причины выявленных отличий.

Методы исследования. Для отбора и обработки проб мезозоопланктона использовали стандартные методы. Данные о доле живого зоопланктона получали методом окраски свежесобранных проб витальными красителями (НК и ДФ). Классификацию организмов на живые и мёртвые проводили по их цифровым изображениям с помощью статистических методов анализа (оригинальный, запатентованный метод). Проводили сопоставление методов окраски с визуальным методом обработки фиксированной формальдегидом пробы.

Научная новизна полученных результатов. Впервые для дифференцирования морского зоопланктона на живую и мёртвую компоненту использовали маркер ферментативной активности ДФ, позволивший получить достоверные и воспроизводимые результаты.

Внедрены современные репрезентативные методы окрашивания проб зоопланктона для визуальной идентификации живых и мертвых особей.

Разработаны достоверные количественные критерии распознавания живых и мертвых особей в пробах зоопланктона, окрашенных витальными красителями, которые основаны на оцифровке изображений и анализе их цветовых и яркостных характеристик (патент на изобретение № 99008, зарегистрирован в Госрестре патентов Украины 10.07.2012).

Впервые для исследованного района были получены сравнительные данные о доли живых организмов (ДЖО) в водах с различным гидрологическим и гидрохимическим режимом в разные сезоны.

Впервые выделены таксономические группы сетного зоопланктона, окраска которых витальными маркерами - НК и ДФ, позволяет эффективно оценивать

доли живых и мертвых организмов в их природных популяциях или сообществах.

Практическое значение полученных результатов. Предложенный метод оценки ДЖО зоопланктона может быть использован для: (а) оперативной интегральной оценки состояния морской среды в условиях загрязнения; (б) ретроспективной оценки и прогнозирования масштабов элиминации зоопланктона в связи с естественными и антропогенными причинами; (в) балансовых расчетов функционирования исследуемых экосистем (потоков вещества и энергии).

Личный вклад соискателя. Диссертанту принадлежит положенная в основу патента (№ 99008) идея оцифровки изображений организмов и последующего анализа их цветовых характеристик для классификации на живые и мертвые. Автором были поставлены научные задачи исследования, разработаны планы их выполнения. Он самостоятельно проводил отбор и обработку проб (47 проб сетного зоопланктона). Им лично поставлено 54 эксперимента по разработке оригинальной методики определения ДЖО на культуре копепод и на естественном сообществе, в которых сфотографировано и оцифровано 17 410 особей.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на отечественных и международных конференциях и семинарах: VI международная научно-практическая конференция молодых учёных «Понт Эвксинский 2009», посвящённая экологическим проблемам водных экосистем (Севастополь, 21-24 сентября 2009 г.); межотдельский семинар «Методические подходы к оценке доли живых организмов зоопланктона» (Севастополь, 6 октября 2010 г.); II всеукраинская научно-практическая конференция студентов и молодых ученых: «Актуальные проблемы и перспективы развития природных наук» Запорожский национальный университет министерства образования и науки Украины, биологический факультет (Запорожье, 20 мая 2011 г.); VII международная научно-практическая конференция молодых учёных «Понт Эвксинский 2011» по проблемам водных экосистем, посвящённая 140-летию ИнБЮМ НАЛ Украины (Севастополь, 24 - 27 мая 2011 г.); II международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых: «Фундаментальные и прикладные исследования в биологии» Донецкий Национальный университет, биологический факультет (Донецк, 19-22 сентября 2011 г.); международный научно-технический семинар «Системы контроля окружающей среды - 2012» (24 - 28 сентября 2012 г., г. Севастополь, МГИ НАНУ); World Conference on Marine Biodiversity 2011 (Aberdeen, Scotland (UK), 26 - 30 September 2011); VIII международная научно-практическая конференция молодых ученых «Pontus Euxinus 2013» по проблемам водных экосистем, посвященная 50-летию образованию Института биологии южных морей Национальной академии наук

Украины (Севастополь, 1 - 4 октября 2013 г.);УН школа-семинар для молодых учёных и специалистов «Актуальные проблемы экологической безопасности Азово-Черноморского региона - 2014», посвящённая 85-летию со дня рождения академика Г.Г. Поликарпова (Севастополь, 2-6 сентября 2014 года).

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 11 научных работ, в том числе 4 статьи (из них 2 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК), 1 патент на изобретение и 6 тезисов докладов в материалах конференций. В работах, опубликованных в соавторстве, личным вкладом соискателя являлось непосредственный отбор и обработка проб, анализ данных по соотношению живых и мёртвых организмов зоопланктона. Анализ и интерпретация полученных результатов были выполнены с соавторами на паритетных началах. Остальные соавторы внесли в опубликованные работы консультативный или технический вклад. При написании диссертации права соавторов публикаций не нарушены.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 7 разделов, выводов и списка использованных источников (74 отечественных изданий и 56 иностранных). Работа изложена на 147 страницах машинописного текста, иллюстрирована 7 таблицами и 45 рисунками.

Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю, доктору биологических наук, профессору Самышеву Эрнесту Зайнуллиновичу за постановку задачи исследования, за ценные советы и рекомендации на всех этапах работы, а также редакционную правку и терпение.

Автор глубоко благодарен своим учителям - [Мельник Т.А.|, Павловой Е.В., а

также Минкиной Н.И., Поповой Е.В., Губановой А.Д., Алтухову Д.А., всему коллективу отдела функционирования морских экосистем и особо лаборатории микропланктона отдела планктона ИнБЮМ. Отдельную признательность автор выражает кандидату биологических наук, заведующему лабораторией микропланктона ИнБЮМ Муханову Владимиру Сергеевичу за мудрое руководство, тактичность, всестороннюю помощь и поддержку при выполнении работы. Автор благодарен коллективу кафедры гидробиологии Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова за отзывчивость и доброе отношение.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы. В разделе рассмотрены история изучения и методологические аспекты исследования смертности зоопланктона, приводятся данные о соотношении живых и мёртвых организмов зоопланктона в разных районах Мирового океана, включая Чёрное море и Севастопольскую бухту.

Материал и методы исследования. Для отработки разных методик окраски зоопланктона использовали модельную культуру типичной солоноватоводной копеподы Са1итрес1а адиаес1и1с1>ч КгксЬа§т, 1873, предоставленную сотрудниками лаборатории культивирования камбалы калкан ИнБЮМ Аганесовой Л.О., Ельниковым Д.А. В экспериментах использовали заведомо живые и заведомо мертвые организмы. Последние получали фиксацией формальдегидом или тепловым шоком. Подвижность организмов контролировали под микроскопом.

Рис. 1. Схема расположения станций отбора проб сетного зоопланктона

Полевую апробацию нового метода витальной окраски зоопланктона и исследование сезонной динамики ДЖО зоопланктона проводили на трёх станциях в Севастопольской бухте и прибрежье с августа 2009 по октябрь 2011 г. Пробы отбирали большой сетью Джеди тотальным ловом с горизонтов 40-0 м на станции «2 мили» (ст. 1), 9-0 м на станции «Сухарная балка» (ст. 3.), 7-6-0 м - в бухте Южная (ст. 2) (рис. 1). Материалы по общей численности сетного зоопланктона (с октября 2010 г. по октябрь 2011 г.) были любезно предоставлены сотрудниками отдела планктона ИнБЮМ Алтуховым Д.А., Поповой Е.В., Губановой А.Д.

В качестве маркеров состояния организмов применяли два витальных красителя - ставший классическим нейтральный красный (НК) и новый, впервые нами предложенный к применению в исследованиях зоопланктона диацетат флуорсеина (ДФ). ДФ является маркером активности ферментов группы эстераз в живых клетках. Он широко применялся в исследованиях бактерий и фитопланктона (Огу1 е! а1., 2000), и лишь раз - для определения живых эмбрионов копепод в биотехнологических процессах (Вийто й а1., 2004).

Для сравнения разных методов определения ДЖО готовили три аликвоты одной и той же пробы зоопланктона для их анализа визуальным методом (фиксировали формальдегидом 2 - 4%) и после окраски ДФ и НК. Окраску проб НК проводили по (Tang et al., 2006). Окрашивание ДФ проводили в соответствии с методом, широко применяемым в исследованиях морского фитопланктона (Brookes et al., 2000). Визуальный метод дифференцирования живых/мёртвых организмов основывался на анализе сохранности их тел и внешних покровов. Подсчёт зоопланктёров и анализ степени их окраски маркерами осуществляли в камере Богорова с помощью микроскопа Nikon Eclipse TS100-F, оборудованного фото- и видеокамерой Ikegami ICD-848P, при увеличении 4х, 10х, 40х в световом (светлое и тёмное поле для НК) и люминесцентном режимах (набор светофильтров для возбуждения в синей области спектра для ДФ) минимум в двух повторностях. Независимо от метода подготовки проб в каждой из них анализировали от 200 до 800 особей.

Микрофотосъёмку каждой отдельной окрашенной особи проводили в цветном режиме. При визуальной оценке интенсивности окраски особей в поле зрения микроскопа каждую особь относили к одному из двух классов - L (окрашенные) или D (неокрашенные). Если это было затруднительно или невозможно, особь относили к классу Q («сомнительные» - со слабо выраженной окраской).

Для уменьшения размерности данных, построения классификации объектов и отнесения каждого из организмов класса Q к классам L или D применяли дискриминантный анализ (ДА) в программном пакете Statistica 6.0 (StatSoft, Inc.).

Определены особенности окраски витальными маркерами (ДФ и НК) представителей 16 таксонов черноморского зоопланктона. Было отснято и проанализировано более 1500 цифровых изображений представителей различных групп и таксонов зоопланктона в размерном диапазоне от 60 мкм (велигеры Bivalvia) до 2,2 мм (Parasagitía setosá).

Измерение цветовых характеристик организмов на их цифровых изображениях проводили с помощью графического редактора Adobe Photoshop (Adobe Systems Inc.) и оригинальной программы ImageRegionColor 1.6, написанной специально для поставленных задач (Дзицкий, 2011). Для оценки достоверности отличий между выборками данных использовали /-критерий Стьюдента в программе Microsoft Excel 2003.

Новый метод витальной окраски организмов зоопланктона диацетатом флуоресцеина (ДФ). Эксперименты по определению ДЖО в культуре копеподы С. aquaedulcis после окраски НК и ДФ показали, что оба красителя позволяли достоверно дифференцировать живые и мёртвые особи независимо от их возрастной стадии и пола. Тем не менее, при обработке природных проб зоопланктона, идентификация живых/мёртвых организмов с помощью этих маркеров была затруднена вследствие неспецифической или недостаточной окраски (рис. 2, среднее фото).

9

Рис. 2. Субъективность визуальной оценки степени окрашенности организмов. L - живая, хорошо окрашенная особь, D - мёртвая, неокрашенная особь, Q - сложно классифицировать

В этих случаях исследователь принимал субъективное решение, к какой категории отнести организм.

В настоящей работе было предложено решение этой методической проблемы, которое заключалось, во-первых, в получении цифровых изображений каждого отдельного организма, и, во-вторых, в измерении и осреднении его цветовых и яркостных характеристик с помощью графического редактора Adobe Photoshop. Цвет наиболее окрашенной области (у копепод -цефалоторакса), осредняли и получали значения HSB (Н - цветовой тон, S - насыщенность, В - яркость) и RGB (R - красный, G - зелёный, В - синий) (рис. 3).

"Н И000037.Ьт... (!T|fBjfx| | Палитра um too

Выберите основной цвет:

□ Топько Web-цвета

EL

®Н | Э45 ¡* OS: g> ■ OB: i 93 %

I OR: ша

B Or« (92J

I °B ^

»afiteo

огмбиа

1 ыбшотаи цветов 1

OL: [«□■

О* И

ОЬ:[п i

С: | 1 %

«ПЙГ %

Y: 124 %

К: [о_ %

Рис. 3. Измерение осреднённого цвета (RGB, HSB)

Для упрощения этой процедуры было разработано специализированное программное обеспечение ImageRegionColor 1.6 с интерфейсом (Дзицкий, 2011). Программа позволяет быстро провести измерения, получить таблицу с данными о цветовых характеристиках каждой из исследованных особей и экспортировать

их в любой удобный табличный редактор, включая Microsoft Excel или пакет Statistica.

Усовершенствованная процедура классификации организмов зоопланктона на живые и мёртвые после их окраски витальными красителями. Результаты анализа цветовых характеристик копепод в живой и заведомо мёртвой культурах С. aquaedulcis после их окраски обоими красителями представлены на рис. 4.

250-1

200-

<L>

CQ

150-

100

100

L

ч,

ÄV

& -и*

,+ / ЙК

V

150 200

Green

--'о>. D о

250

150-1

100-

-о

<и

ai

50-

150 п

100

-а

и

ai

50

50 100 150 200 250 300 Green

Л Л

Л CVx-v- «. о» SR/&

D

■ I 1 20

40

Blue

60

so

Рис. 4. Кластеры окрашенных НК (верхние графики) и ДФ (нижние графики) живых (Ь) и мёртвых (Б) особей С. aquaedulcis на разных стадиях развития (И - науплии, С — копеподиты, А — половозрелые особи) в координатах цветовых компонент. Пунктирные линии обозначают условные границы кластеров

На 2-параметрических графиках живые и мертвые особи образовывали хорошо различимые скопления точек (каждая из которых представляла отдельную особь). Обособленность кластеров живых (L) и мёртвых (D) организмов в пространстве цветовых переменных позволяла проводить их достоверную классификацию, причем процедура классификации не требовала применения статистических методов анализа, поскольку в анализируемых выборках отсутствовали особи со «спорной» окраской. Присутствие в пробах разных возрастных групп не снижало качество оценок, что указывало на возможности успешного применения нового маркера в исследованиях природных популяций зоопланктёров со сложной возрастной структурой (рис.4).

В пробах прибрежного зоопланктона доля особей со спорной окраской (Q) составляла от 14 до 18 %. На графиках эти особи образовывали «облако» точек между кластерами L и D (рис. 5.). Чтобы избежать субъективности в их классификации на живые или мёртвые, нами впервые было предложено применять методы статистического анализа, а именно - дискриминантный анализ (ДА). ДА цветовых переменных позволил выявить переменные, обладающие наибольшими дискриминантными способностями в определении живых/мёртвых копепод.

Дискриминационная модель, полученная на основе обучающих выборок L и D, позволяла классифицировать выборку Q, относя каждую из составляющих её особей к одному из классов - L или D, в соответствии с апостериорными вероятностями. В среднем, величины апостериорных вероятностей в обеих пробах составляли около 95 %, что указывало на высокое качество проведенной классификации (рис.5).

Таким образом, новый подход, основанный на измерении цветовых переменных отдельных особей и последующем дискриминантном анализе данных, позволял оценить статистическую достоверность результатов определения долей живых и мертвых особей в пробе, избежать какой-либо субъективности в измерениях. Применение такого подхода в перспективе позволит вывести исследования некрозоопланктона на качественно новый уровень.

Алгоритм обработки пробы, разработанный на основе полученных результатов, включал: Этап I. Отбор пробы мезозоопланктона и её окраска для идентификации живых/мёртвых организмов. Этап II. Исследование репрезентативной выборки организмов под микроскопом для: а) сортировки особей по классам «Живые» (L), «Мёртвые» (D), «Сомнительные» (Q) по визуальным признакам (интенсивности окраски); б) получение цифровых изображений каждой особи. Этап III. Измерение средних для каждой особи цветовых и яркостных характеристик (цветовые модели HSB, RGB) в графическом редакторе. Этап IV. Сведение полученных данных в таблицу в формате, пригодном для дискриминантного анализа. Этап V. Применение дискриминантного анализа для: а) уменьшения размерности данных (пошаговый анализ с включением переменных); б) построения классификации объектов,

используя классы Ь и Б в качестве обучающей выборки; в) выделения в соответствии с дискриминантной моделью классов Ь или Б среди организмов класса р.

Green

Рис. 5. Копеподы из окрашенных НК (верхние графики) и ДФ (нижние графики) проб морского зоопланктона, классифицированные по визуальным признакам как живые (L), мёртвые (D) и сомнительные (Q) в координатах цветовых компонент. Справа: результаты дискриминантного анализа -«сомнительные» особи отнесены к одному из классов - L или D (символы с чёрной заливкой).

Динамика доли живых Copepoda в планктоне Севастопольской бухты и открытого прибрежья в 2010 - 2011 гг. Предложенный подход апробировали в полевом исследовании доли живого и мертвого зоопланктона Севастопольской бухты и прибрежья. За период наблюдений с октября 2010 г. по октябрь 2011 г. средняя численность мезозоопланктона в бухте (ст. 3) была существенно выше, чем в открытом прибрежье (ст. 1) - соответственно, 35360,5 и 9780 экз. м~3 (рис. 6, верхние графики). Наиболее массовой группой зоопланктонных организмов на обеих станциях были копеподы (рис. 6). На ст. 1 их вклад в общую численность мезозоопланктона составлял меньше 60 % только в мае - июне 2011 г., когда происходило массовое развитие гетеротрофной динофлагеляты Noctiluca scintillans. На ст. 3 копеподы доминировали в течение всего периода исследований (за исключением весенних месяцев 2011 г.), нередко составляя более 90 % общей численности мезозоопланктона.

Копеподы были представлены каляноидами Acartia clausi, A. torna, Calanus euximis, Centropages ponticus, Paracalanus parvus, Pseudocalanus elongatus, циклопоидами Oithona davisae и O. similis. Структура сообщества копепод в открытом прибрежье и кутовой части бухты существенно отличалась. Численность вселенца О. davisae за пределами бухты не превышала нескольких тысяч экз. в м3 с октября 2010 по январь 2011 гг. и нескольких сотен экз. в м3 с февраля по октябрь 2011 г. (рис. 7, верхние графики).

2010 2011

2010 2011

Рис. 6. Сезонная динамика численности (верхние графики) и ДЖО (нижние графики) сообщества копепод

Вид отсутствовал в пробе в мае 2011 г. В кутовой части бухты численность вселенца была очень высокой, начиная с осени и до середины зимы 2010 г. (в декабре - 46556 экз. м-3). В июне 2011 г. наблюдали её максимум за весь период наблюдений - 72600 экз. м-3 (рис. 7). Соответственно, и вклад О. с1а\ч$ае в общую численность копепод на ст. 1 оставался ниже 50 %, тогда как в пробах, собранных на ст. 3, превышал 90 %.

Величинам ДЖО, полученным на обеих станциях, была свойственна высокая вариабельность - значения менялись в диапазоне от 15 до 98 % (рис. 6, нижние графики). В открытых водах на ст. 1 выявлен сезонный тренд с хорошо заметной тенденцией снижения ДЖО в сообществе копепод от холодных (около 70 %) к тёплым месяцам (около 15%) с отдельными эпизодами их роста до 80 - 90 % в феврале и апреле 2011 г. (рис. 6). С конца лета к осенним месяцам вновь наблюдали увеличение ДЖО.

Ч 20-

2011

2010

2011

Рис. 7. Сезонная динамика численности (верхние графики) и ДЖО (нижние графики) ОШюпа с!аьчхае

Эти результаты хорошо согласуются с полученными в районе Одессы (19631965 гг.) данными Л.М. Зелезинской, которая отмечала, что общее количество

осевших в планктонный осадкомер трупов планктёров возрастает от весны к лету и убывает от лета к осени (Зелезинская, 1966). При этом общая численность копепод на станции 1 изменялась в небольшом диапазоне (до 10 тыс. экз. м-3), а сезонный тренд был выражен слабо. Корреляционный анализ не выявил достоверной связи ДЖО с численностью копепод.

На ст. 3 подобного сезонного тренда ДЖО не выявлено, однако анализ основывается на неполной серии данных (рис. 6). В марте и апреле 2011 г., когда общая численность копепод и их вклад в сообщество мезозоопланктона были минимальны, ДФ показывал низкие значения ДЖО (около 40 - 60 %). Однако в мае 2011 г. при массовом развитии N. scintillans и Р. polyphemoides в мезозоопланктоне ДЖО копепод оставалась высокой (рис. 6).

Результаты анализа ДЖО в популяции О. davisae, в целом, согласуются с описанными выше, но снижение величин в весенний период на ст. 1 было менее выражено (рис. 7).

Поскольку для ст. 3 были получены лишь фрагментарные данные, сравнительный анализ прибрежья (ст. 1) и вод бухты (ст. 3) по величинам ДЖО оказался возможным лишь для выборочных промежутков времени — октября 2010 г., с февраля по апрель, и с июня по октябрь 2011 г. В этой серии данных значения ДЖО были ниже в открытых водах (55 ± 22 против 73 ± 18 % по ДФ и 54 ± 27 против 77 ± 11 % по НК, указаны станд. откл.). Парный /-тесг показал, что эти различия достоверны (р = 0,025 для ДФ и 0,005 для НК).

Для всей совокупности данных корреляция между оценками ДЖО,

полученными с помощью НК и ДФ, была велика и составляла 0,77 (статистически значима, р<0,05). Характер связи между этими величинами хорошо иллюстрирует рис. 8 - множитель при аргументе в регрессионном уравнении близок в единице. Вместе с тем, разброс точек велик, а расхождения в результатах применения разных маркеров существенны: в некоторых случаях они достигали 36 % ДЖО (в среднем 11,72 ± 9,57%, станд. откл.). Можно предположить, что наблюдаемые

() 20 40 60 80 100 1

джо по ДО) % расхождения между результатами

окраски НК и ДФ могли быть Рис. 8. Соотношение оценок ДЖО, связаны с разной природой полученных с помощью НК и ДФ действия красителей.

Сравнение величин ДЖО, полученных для морского зоопланктона в нашем исследовании, с аналогичными данными из разных районов Мирового океана затруднено вследствие

т 1 I 1 I ' I 1 I

исключительно высокой вариабельности этого показателя - от 10 до 100 % (см. обзор (Elliott, 2011)). Диапазон изменений наших данных (15 - 98 %) оказался столь же широк, несмотря на то, что они были получены для ограниченного района и периода исследований.

Соотношение живой и мёртвой компоненты сообщества зоопланктона в водах с разным уровнем антропогенного воздействия. В соответствии с результатами многолетнего (1998 — 2006 гг.) исследования некрозоопланктона севастопольских бухт (Павлова, 2011), среднегодовые величины ДЖО зоопланктона составляли от 51 до 93%, причём в сильно загрязнённой Южной бухте значения были ниже, чем на более благополучной в этом отношении станции на выходе из Севастопольской бухты. Средние значения ДЖО, рассчитанные для всего периода данного исследования, оказались в пределах указанного диапазона (ст. 1: 55,5 ± 12 % ДФ, п=13 , 54 ± 14 % НК, п =14; ст. 3: 72 ± 11% ДФ, 77 ± 7% НК, п = 10, указ. дов. инт.) и, что достаточно неожиданно, были достоверно выше в бухте (рис. 9). Интерпретация этого результата требует понимания того, что пул мертвых организмов формируется в результате их естественной смертности вследствие достаточно широкого круга причин -возраста, нарушений в развитии, инфекций, воздействия токсикантов, количества и качества пищи и др. (Дубовская, 2009).

t-test, р < 0,05

1,6 1,2 0,8 -0,4 0

СТ. 1

Ст. 3

о Z

Рис. 9. Средние значения ДЖО и численности бактериопланктона (Ncp.r.) в 2010 - 2011 гг. на станциях 1 (2 мили) и 3 (Сухарная балка) (Литвинюк, Муханов, неопубл.)

Статья «расхода» пула формируется за счет изъятия мертвых организмов из столба воды в результате процессов седиментации (Зелезинская, Коваль, 1984, Черепанов, 2008; Hirst 2002), а также вследствие процессов разложения и разрушения мертвых организмов (Elliott, 2011; Tang, 2009, 2012). В свою очередь, скорость разложения мертвого зоопланктона определяется

интенсивностью микробной активности в пелагиали, которая зависит, в первую очередь, от численности гетеротрофного бактериопланктона и температурных условий.

Хотя скорости седиментации органической взвеси достаточно хорошо изучены в Чёрном море (Гулин, 1995; Самышев, 2009; ОгИэку, 2012) интерпретировать эти данные на Севастопольскую бухту (ст.З) и открытые воды за ее пределами сложно. Можно лишь предположить, что в открытых водах (ст.1) в условиях более интенсивного турбулентного перемешивания скорость седиментации детрита была ниже, чем в бухте. Следствием этого могли бы быть более высокие ДЖО в водах бухты, однако подобные предположения требуют экспериментальной проверки.

В период исследований среднегодовые численности бактериопланктона (Муханов, неопубл.) были значительно (в 2,5 раза) выше в бухте (рис. 9; достоверное отличие от величин в открытых водах — р < 0,05, ¿-тест). Хотя среднегодовые температуры воды на станциях 1 и 3 отличались незначительно, столь выраженные отличия в бактериальной численности могли служить одним из объяснений высоких значений ДЖО в водах бухты. Действительно, при одной и той же удельной скорости естественной смертности организмов (т) и прочих равных условиях (скоростей воспроизводства, выедания, седиментации) доля мертвых организмов будет тем ниже (а ДЖО - тем выше), чем выше скорость бактериального разложения мертвых организмов.

Рис. 10. Стадии разложения копепод (1-У) (фото сверху), начальные численности бактерий в эксперименте (Ы„) (график слева) и соотношение численностей разных стадий разложения копепод на четвертые сутки (график справа)

Чтобы проверить эту гипотезу, сравнивали скорости разложения мертвых копепод (из одной и той же культуры) в морской воде, отобранной в на ст. 1 и 3 (рис. 10). Начальные численности бактерий в пробах отличались в 3 раза и

составляли, соответственно, 0,4 (ст. 1) и 1,3 х 106 кл. мл-1 (ст. 3). К 4-м суткам экспозиции проб in situ произошло полное разложение рачков (до последней стадии V, рис. 10), соответственно, 19,3% (ст. 1) и 43,4% (ст. 3) трупов копепод. Характер распределения численности копепод по стадиям разложения представлен на рис. 10. Рассчитанные по этим данным удельные скорости разложения мертвого зоопланктона составили, соответственно, 0,05 (ст. 1) и 0,14 сут"1 (ст. 3), т.е. соотносились 1:3, как и бактериальные численности. Наличие прямой связи между скоростью разложения мертвого зоопланктона и бактериальной численностью в эксперименте свидетельствовало о том, что обилие и активность бактерий в столбе воды могут рассматриваться в качестве одного из факторов, контролирующих размеры пула мертвых организмов in situ.

100- ♦

80- ♦

geo- 4 40- t ♦ ♦♦ ♦

20- ♦

0- 1 —

*

А

А

к

\ ■ А А Л

♦ Ст. 1 О Ст. 3

1 2 N, 10е кл мл"1

3 0 20 40 60 80 100 FL1 х N, отн. ед.

Рис. 11. Зависимость ДЖО в сообществе зоопланктона Севастопольской бухты (ст. 3) и открытого прибрежья (ст. 1) от численности (Ы) и интегральной активности (Р1Л*1Ч) бактериопланктона

Таким образом, результаты эксперимента и микробиологические данные позволили предположить, что повышенные среднегодовые значения ДЖО зоопланктона в бухте могли быть, по крайней мере отчасти, обусловлены высокой численностью и активностью бактериопланктона и, соответственно, высокой скоростью разложения некрозоопланктона. Зависимости между этими переменными, полученные на основе полевых данных, представлены на рис. 11.

При высоких бактериальных численностях доля живого зоопланктона всегда была велика, при низких - наблюдали широкий диапазон изменчивости ДЖО, что могло быть связано с действием иных факторов - седиментации, выеданием детритофагами и др.

Упрощенная математическая модель динамики численности живых и мёртвых организмов в зоопланктоне, которую мы использовали в нашем исследовании (рис. 12, А), не учитывала процессы выедания и седиментации:

<№Ш( = (ц- т) х Ж, йАЮМе = т х Ж - с1 х М),

где Ж - численность живых организмов, N0 - численность мертвых организмов, // - удельная скорость роста, т — естественная смертность, с/ -скорость разложения трупов. Величина Ж сохранялась неизменной во времени при условии /V = т (потери в результате естественной смертности полностью покрывались воспроизводством), что соответствовало некоторому стационарному состоянию сообщества (на исследуемых станциях - это среднегодовые, т.е. «равновесные» численности зоопланктона). При любых начальных значениях параметров Ж, т и с/, величина ДЖО (Ж/(NL+ND)) зависела только от соотношения скоростей т и (рис. 12, Б). Эта зависимость была использована для того, чтобы по средним значениям ДЖО, полученным на каждой из станций, определить соответствующие им величины с1/т (рис. 12, Б).

%

100,0 80,0 О 60,0 се 40,0 20,0 0,0

с/ - скорость разложения

т - смертность

Рис. 12. А - Процессы, определяющие величину пула мертвого зоопланктона (смертность т и элиминация сГ), и факторы, контролирующие элиминацию трупов. Б - зависимость ДЖО от соотношения скоростей элиминации трупов и естественной смертности с1/т в соответствии с упрощенной моделью

Последние оказались равны 1,2 и 3, соответственно, на ст. 1 и 3. Таким образом, на станции в открытых водах скорость разложения мертвых организмов была равна смертности живых организмов, тогда как в бухте она в 3 раза превышала смертность. Соотношение величин с1/т на станциях 1 и 3 составляло около 1:3, как и в случае с численностями бактерий и скоростями разложения мертвых копепод.

По экспериментальным оценкам скорости разложения копепод с/ и модельным значениям с//т рассчитали средние величины естественной смертности зоопланктона в водах бухты и за её пределами. Они составили, соответственно, 0,045 (ст. 1) и 0,047 сут-1 (ст. 3). Полученные расчетным путем величины естественной смертности копепод были в пределах диапазона типичных значений (0,01-0,1 сут-1), определяемых экспериментально другими

авторами для взрослых коиепод. Поскольку в данной работе не рассматривались процессы седиментации, скорость элиминации трупов (переменная d в модели) могла быть в той или иной степени недооценена.

Необходимо принимать во внимание и тот факт, что на станциях 1 и 3 облавливались разные слои - соответственно, 40-0 и 8-0 м. При равных скоростях седиментации время пребывания мёртвых организмов в столбе 0-40 м должно было превышать таковое в столбе 0-8 м, следствием чего могли быть завышение оценок ДЖО (в полевых данных) и недооценка скорости элиминации трупов (в модели) на мелководной станции в бухте.

В основу второй гипотезы, объясняющей высокие значения ДЖО в бухте, было положено токсическое действие поллютантов, присутствующих в сопредельных с бухтой водах. Современный характер распределения некрозоопланктона в Севастопольской бухте и в прилегающих акваториях подтверждает вывод о существенном возрастании в последние годы загрязнения вод тяжелыми металлами и мышьяком. Источник этого загрязнения - введенная в эксплуатацию в марте 2001 г. первая очередь полигона ТБО (городская свалка) в Первомайской балке в Инкермане (Самышев и др. 2012, рукописи.; Подбельцева, 2011, эл. ресурс). Сопредельные воды загрязняются при выносе вод из бухты через ее жерло глубиной 15-20 м при преобладающих северных и северо-восточных ветрах (повторяемость 36%) (Иванов и др., 2006). За пределами бухты происходит аккумуляция загрязнителей. Высокие значения концентраций Си, Cd, Zn, Cr, Со и As, обнаруженные вне бухты на глубинах до 40 м (Копытов и др., 2010), могут служить причиной поступления этих поллютантов в воду (в результате ветрового волнения) в концентрациях, которые являются токсичными для гидробионтов (Литвинюк, Минкина, 2012, рукописи.). Действительно, сезонная динамика ДЖО копепод на прилегающей к бухте акватории («2 мили» с глубиной 40 м) отвечала сезонной повторяемости ветров северного и северо-восточного направления. Однако проверка этой гипотезы требует проведения отдельного комплексного исследования, которое бы включало гидролого-гидрохимические измерения и токсикологические эксперименты.

Условия окраски и хранения проб, сравнение с другими красителями.

Сравнение визуального метода определения ДЖО с методами окраски витальными красителями показало статистически достоверную разницу между завышенными результатами оценки постмортальных изменений и анализом цветовых характеристик. Это связано с трудностями в визуальной идентификации ранних стадий разложения мертвых организмов и, как следствие, приводящих к недоучету количества последних (рис.13.).

Ряд экспериментов по сохранению окрашенных НЬС проб на культуре копепод и на представителях природного сообщества показал невозможность качественного и длительного хранения проб в щелочной среде, что противоречит литературным данным (Tang et al., 2006). Положительные результаты были

получены в экспериментах по сохранению окраски методом заморозки на фильтре и восстановлению цвета кислотой в течение 2 недель (рис. 14).

Концентрирование организмов на фильтре и сохранение их в замороженном состоянии оказалось наиболее эффективным подходом, обеспечивающим наилучшую сохранность особей и их флуоресценции также после окраски пробы ДФ. При этом яркость и цвет флуоресценции значительной доли особей после их размораживания и перевода в жидкую среду соответствовали контролю даже при

11.08.2011. И

12.04.2011.

15.06.2011.

Рис. 13. Сравнение методов определения ДЖО по визуальным признакам (бежевые столбики) и после окрашивания витальными красителями (ДФ — зелёные столбики, НК - красные). Результаты обработки 3 проб, отобранных на ст. 1 «2 мили» в апреле, июне и августе 2011 г. Отмечены (*) статистически достоверные отличия (/-тест, р < 0,05) окрашенных проб от визуального метода

длительном хранении - до 2 недель. Вклад хорошо окрашенных особей, определяемых как «живые» (L), снижался с 98% спустя 1 сутки хранения до 84% на 16 сутки. Апостериорные вероятности классификации «спорных» особей были не ниже 98% на 8-е сутки хранения проб и 80% - на 16-е сутки (рис.15). Вклад красной компоненты (Red) и оттенка (Hue) являлись главными переменными, которые позволяли производить дискриминацию между классами L и D.

Рис. 14. Восстановление окраски копепод при заморозке и хранении на фильтре: контроль (слева) и на 13 сутки (справа)

Результат одновременного применения двух маркеров — НК и ДФ на культуре копеподы показал невозможность окраски одной и той же пробы. При комбинировании красителей вклад зелёной компоненты был выше, что может косвенно указывать на маскирующий эффект ДФ, проявляющийся не только в люминесцентном, но и в световом режиме микроскопирования.

Вместе с тем, не исключено химическое взаимодействие красителей или какие-либо физиологические эффекты, затрагивающие механизмы окраски НК в присутствии ДФ.

100

1 8 16 1 8 16 Время хранения пробы, сут

Рис. 15. Изменение доли хорошо окрашенных или живых (Ь), неокрашенных или мёртвых (Б) и «спорных» организмов при сохранении проб культуры Са1атрес!а aquaedulcis на фильтре после их окраски ДФ. ДА — дискриминантный анализ

Эффективность окраски разных таксономических групп черноморского зоопланктона с помощью ДФ и НК. Возможность применения нового метода на представителях разных таксонов и групп черноморского зоопланктона исследовали по цифровым изображениям. Сложность анализа полученных данных состояла в недостаточном размере выборок у некоторых таксонов, что, в ряде случаев, не позволило сделать однозначные выводы. Однако попытка выделить пригодные виды для разделения на живую и мёртвую составляющую методом окраски ДФ и НК интересна с точки зрения дальнейших исследований. Данные о количестве проанализированных особей сведены в таблицу 1.

Таблица 1.

Количество исследованных особей различных таксонов зоопланктона после окраски ДФ и НК. Б - ярко окрашенные организмы, N8 - неокрашенные (бесцветные), С> - организмы с неявной окраской. В скобках указаны подвижные

организмы

Таксоны ДФ HK Общее кол-во исследованн ых особей

s NS 0 s NS 0 ДФ НК

ГОЛОПЛАНКТОН

Evadne spinifera P.E. Müller, 1867 5 0 8(1) 0 26(1) 0 13 26

Penilia avirostris Dana, 1849 2 14 10(2) 0 85 (2) 0 26 85

Pleopis polyphemoides (Leuckart, 1859) 9 20 (2) 11(1) 13 59 17 40 89

Psendevadne tergestina Claus, 1877 1 3 0 0 28(1) 0 4 28

Noctiluca scintillans (Macartney) Kofoid & Swezy, 1921 2 17 0 0 1 0 19 1

Oikopleura dioica Fol, 1872 6 0 1 5 3 6 7 14

Parasagitta setosa Müller, 1847 0 2 1 3 2 3 3 8

Rotifera 428 43 87 14 17 107 558 138

МЕРОПЛАНКТОН

Bivalvia larvae 0 5 0 1 58 2 5 61

Cirripedia nauplius 9 23 31 154 16 41 63 211

Decapoda larvae 3 1 0 0 3 0 4 3

Gastropoda larvae 1 3 2(2) 13 3 4 6 20

Hydromedusae 0 HO 0 1 0 6 0 7

Pisces larvae 0 0 0 2 0 0 0 2

Pisces ova 3 0 0 2 0 0 3 2

Polychaeta larvae 9 6 6 15 2 3 21 20

Проблему наличия значительного количества спорноокрашенных организмов, возможно, поможет решить оцифровка цифровых изображений с последующим применением дискриминантного анализа.

ВЫВОДЫ

1. Разработан и успешно апробирован в экспериментах с модельной культурой копепод и в полевом исследовании сообщества черноморского зоопланктона метод прижизненной окраски организмов зоопланктона диацетатом флуоресцеина (ДФ), который имеет ряд преимуществ перед традиционными витальными красителями - повышенную яркость и контрастность окраски, возможность применения современных методов микроскопирования (эпифлуоресцентной микроскопии), проточной цитометрии и визуализации.

2. Разработан и запатентован оригинальный метод измерения и статистического анализа цветовых характеристик организмов, окрашенных любым из витальных красителей, который унифицирует процедуру классификации организмов на живые и мёртвые и освобождает исследователя от необходимости принимать субъективные решения при проведении классификации. Совместное применение этого метода с ДФ в качестве витального красителя открывает перспективы автоматизации исследований жизнеспособности организмов зоопланктона и может быть востребовано не только в полевых исследованиях, но и биотехнологических разработках.

3. Оба красителя, ДФ и НК, могут успешно применяться в исследованиях следующих таксономических групп и таксонов зоопланктона: larvae Polychaeta, larvae Gastropoda, Rotifera, Pisces ova, Oikopleitra dioica, Parasagitta setosa и larvae Cirripedia. Отрицательный результат получен для larvae Bivalvia. НК не может применяться для окраски ветвистоусых ракообразных видов Penilia avirostris, Evadne spinifera, Pseudevadne tergestina, но его альтернативой в этих случаях может служить ДФ.

4. Сохранность проб зоопланктона, окрашенных ДФ, сроком до 2 недель достигается посредством «сухой» заморозки окрашенных организмов после их осаждения на фильтр. Этот метод может быть использован в условиях морской экспедиции.

5. В соответствии с результатами годовой съёмки зоопланктона Севастопольской бухты и сопредельных вод доля живых организмов (ДЖО) в сообществе копепод была достоверно выше (ст. 1: 55,5±12 % ДФ, 54±14 % НК; ст. 3: 72±11% ДФ, 77±7% НК, указ. дов. инт) в подверженных загрязнению водах бухты. Выдвинуто предположение, что, по крайней мере, одной из причин этого

феномена могли быть высокая численность и активность бактериопланктона и, соответственно, более высокая скорость разложения мертвых организмов. Получено экспериментальное подтверждение этой гипотезы.

6. На основе экспериментальных данных и результатов имитационного моделирования выдвинуто предположение, что высокие величины ДЖО, наблюдаемые в подверженных загрязнению водах бухты, не означали при этом, что смертность зоопланктона в этом районе была ниже, чем в более благополучных с экологической точки зрения сопредельных прибрежных водах.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

РАБОТЫ В ИЗДАНИЯХ, РЕКОМЕНДОВАННЫХ ВАК:

1. Динамика доли живых Copepoda в планктоне Севастопольской бухты и открытого прибрежья в 2010 - 2011 гг. / Д.А. Литвишок, Д.А. Алтухов, B.C. Муханов, Е.В. Попова // Морск. экол. журн. - 2011. - Отд. вып., № 2.-С. 56-65.

2. Литвишок Д. А. Усовершенствованный метод определения доли живых организмов в морском зоопланктоне после окраски нейтральным красным и диацетатом флуоресцеина / Д.А. Литвишок, B.C. Муханов // Морск. экол. журн. - 2012. - 11, № 4. - С. 45 - 54.

ПАТЕНТЫ:

3. Пат. 99008 Украина, МПК G 01 N 33/483, G 01 N 1/30. Способ идентификации живых и мёртвых организмов мезозоопланктона в морских пробах / Муханов B.C., Литвинюк Д.А.; заявитель и патентообладатель Ин-т биологии южных морей. - № а 2010 12023 ; заяв. 11.10.10.; опубл. 25.04.12, Бюл. № 8.

РАБОТЫ В ДРУГИХ НАУЧНЫХ ИЗДАНИЯХ:

4. Литвишок Д. А. Определение доли живых организмов в культуре копепод Calanipeda aquae dulcís после их окраски нейтральным красным и диацетатом флуоресцеина / Д.А. Литвинюк, Л.О. Аганесова, B.C. Муханов // Экология моря: сб. науч. трудов. - К., 2009. - Вып. 78. - С. 65 -69.

5. Чмыр В. Д. Структурно-функциональные параметры планктона черноморского прибрежья / В.Д. Чмыр, М.И. Сеничева, Д.А. Литвинюк, В.А. Латушко // Системы контроля окружающей среды. Средства и мониторинг. - Сборник науч. трудов МГИ НАНУ. - Севастополь :

ЭКОСИ-Гидрофизика, 2007. - С. 335 - 339.

МАТЕРИАЛЫ КОНФЕРЕНЦИЙ:

6. Литвинюк Д. А. Сравнение методов определения доли живых особей в культуре копеподы Calanipeda aquae dulcis / Д.А. Литвинюк, Л.О. Аганесова // Понт Эвксинский: Тез. докл.VI Межд. науч. - прак. конф. мол. уч. (Севастополь, 21-24 сент. 2009 г.). - Севастополь, 2009. - С. 70 -72.

7. Litvinyuk D. Novel methodology for identifying alive versus dead copepods in marine environments / D. Litvinyuk // Понт Эвксинский: Тез. докл.VII Межд. науч. - прак. конф. мол. уч. (Севастополь, 24 - 27 мая 2011 г.). -Севастополь, 2011. - С. 264 - 265.

8. Литвинюк Д.А. Сравнение методов дифференцирования живого/мёртвого зоопланктона при анализе естественного сообщества / Д.А. Литвинюк // Тез. докл. II Всеукр. науч. - практ. конф. студ. и мол. уч. (Запорожье, 20 мая 2011 г.). - Запорожье, 2011. - С. 97 - 99.

9. Литвинюк Д.А. Определение доли живых Copepoda в планктоне Севастопольской бухты / Д.А. Литвинюк, B.C. Муханов // Тез. докл. II Межд. науч. конф. студ., асп. и мол. уч. (Донецк, 19-22 сентября 2011 г.).-Донецк, 2011.-С. 151-152.

10. Mukhanov V. Novel methodology for identifying alive versus dead copepods in marine environments / V. Mukhanov, D. Litvinuk // Abst. of World Conf. on Mar. Biodiver. (26 - 30 September 2011, Aberdeen, Scotland (UK)). -Aberdeen, 2011.-P. 159.

http://www.marine-biodiversitv.otv/uploads/files/lVCMB-2Q]].pdf

11. Литвинюк Д.А., Муханов B.C. Соотношение живой и мёртвой компонент сообщества зоопланктона в водах с разным уровнем антропогенного воздействия // Понт Эвксинский 2013: Тезисы 8-ой Междунар. науч.-практ. конф. молодых учёных по проблемам водных экосистем, посвящ. 50 летию образования ИнБЮМ НАН Украины / НАН Украины, ин-т биологии южных морей им. А. Ковалевского (Севастополь, 01-04 окт. 2013 г.) - Севастополь, 2013. - с. 90 - 92.

Подписано в печать 19.03.2015 Объем: 1,0 п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 7 Отпечатано в типографии И.П. Бондаренко Н.Ю. г. Севастополь, тел. +7(978)0677476