Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфолого-биохимические изменения культуры Pseudomonas aeruginosa - деструктора АПАВ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Морфолого-биохимические изменения культуры Pseudomonas aeruginosa - деструктора АПАВ"

АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

На правах рукописи УД< 579.22:695

Ш1СТОЯЩАЯ Нина Ивановна

ШРФОЛОГО-БИОХКДТЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ¡ШЬТУРЫ РБЕишашл^ ¿ЕГООПЮЭА - ДЕСТРУКТОРА АПАВ

Специальность 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических каук

Минск - 1992

Работа выполнена в Институте коллоидной химии и химии воды им.А.В.Думанского АН Украины

Научный руководитель: доктор биологических наук С.С.Ставская

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Г.Г.Жарикова

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Г.А.Салохкна

Ведущая организация: ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии

Защита состоится _1992 г. в 13-00 час.

на заседании специализированного совета К 006.09.01в Институте микробиологии АН Беларуси по адресу: 220067, г.Минск, ул.Жодинская, 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института, Автореферат разослан "_"___199- г.

Ученый секретарь • • Н.В.ОБРАЗЦОВА

специалиэирг чанного совета 1

кандидат биологических наук 17

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы, Создание экологически безвредных спо-обов защиты еодных баос .'шов является вашЛш! проблемой оовре-юнности. Серьезную опасность для водоемов и водотоков цредставля-iT синтетические поверхностно-активные вещества (.ПАЗ;, ранее но стречаемке в природе и поэтому трудкоразлягаемие в естественных словилх. Широкое применение ПАВ в разнообразных отраслях народ-ого хозяйства привело к накоплению этих опасных загрязнителей в идросфере. В связи с stem в настоящее время все большее значение риойрзтает очистка сточных вод, содержащих ПАВ.

Традиционные физико-химические методы очистки промышленных точных вод от ПАВ требуют значительных материальных и энергетичес-йх затрат. Биологические методы, основанные на использовании ак-квиого яла или биопленки, предусматривают подачу стоков, содер-ащих не более 10-20 мг/л ПАВ. Поэтому внсокононпентрированшге роизводственные сточные воды нельзя очищать общепринятыми бяоло-вческими методами. В этой связи весьма перспективным предотавля-гоя микробиологический метод очистки сточных вод, который базиру-гся на применении специально селекционированных бактерий - дест-ркторсв ПАВ. Бактерии разрушают ПАВ до простых продуктов, без-эедных для окружающей среды. По сравнению с известными физяко-шическими методами, микробиологический прост в эксплуатации, ; требует применения реагентов, е результате очистки не образуйся шлаш, исключается процесс регенерации, экономятся площади >д очистку. В настоящее время получены высокоактивные штаммы-¡структорн, изучены пути бактериального разрушения многих ПАВ, ¡.нако мало изучен механизм взаимодействия микроорганизмов и IIAB, шяние этих веществ на бактерии-деструкторы. Для успепного осу-ютвления микробиологического метода важное значение имеет созда-ie штаммов бактерий с повышенной деструктивной активностью, пользование их в one- пально разработанных для этой цели биотехно ■ (гических процессах очистки производственных сточных вод, С этих зиииЕ представляет интерес и является актуальным исследование ьвнепоЯ ¡^цзиолого-биохшшческих и морфолого-культуральных . :пойств бактерий при контакта с ПАВ.

Ц§£&.и задачи доследования. Цель настоящей работы - изучить шиеивя характерна бколохичзоких свойств клегок активного

деструктора алкилоульйатов P-^udoconaO aeruginosa 1С при взакюдзЕсгвйи с IIAB,

В задачи работы входило:

- изучение диссоциации штамма - деструктора адкилсульфятов Р.аег ginosa тс на морфологические варианты при контакте о дода-

цилоульфатом натрия;

- исследование деструктивной активности и устойчивости к логическому двйотвяю додешшзульфата натрия клеток штамма-деструктора ?.aeruginosa тс и его морфологических вариантов;

- изучение сео1';ств клеточной поверхности бактерий штамма-деструктора и его морфологических вариантов;

- исследование особенностей липидного состава клеток штампа-деструктора p.aeruginosa ю , различающихся по устойчивости к до-децилсулыЪату натрия;

- изучение жирнокислотиого состава клеток штамма-деструктора

p.aeruginosa ic в состоянии стресса под влиянием додешшгул: фата натрия;

- разработка рекомендаций по.контролю культури баятерий-деструкт! ров в очистных установках.

Научная новизна. Впервно изучена диссоциация штамма-деструктора P. aeruginosa ic при взаимодействии с ПАВ. Установлено что исходный штамм-деструктор P. aeruginosa 1С при росте на синтетических средах с додмилсульфатом натрия расщепляется на три типа вариантов, различающихся по морфологии меток, пигманто-образовашю,-деструктивной активности и устойчивости к литическо-му действию ПАВ. Изучение деструктивной активности показало, что ею обладают исходник штамп, шероховатый и нитчатый варианты, а .клетки гладкого варианта пе способны разрушать додепилсульфат. При исследовании электрокинетических свойств и гидрофильности-гидрофобности бактерий исходного штамма и его морфологических вариантов установлены различия в строений клеточной поверхности, Впервые выявлено, что клетки, отличающиеся различной чувствительностью к лодеиилоульйату, имеют неодинаковый яирнокиолотннй cocti Установлено, что у резистентных к додешмсульФату натрия клеток поведано содержание мононенасыввнных жирных кислот, особенно олтадеиеноео!! (Cjg.j). и уменьшено количество пиклопропановых ки< Впервш? доследована реакция состава жирных кислот клеток р.зеги-:7i'no:"i гс в ответ на импульсное внесение в среду ПАЗ. Обнару-

яаао резкое азвзиевае ооотяопзкая содергапая пзсвденной в яеигсн-вдапоЯ кислот о 16'углеродными атомами.

Практическая неняооть. На основании полученных результатов разработай маяробЕологическаг кзтод контроля за состоянием популярна бпиторгЛ'.-дзогр:,т:торов, который реяомэяловэя прп эксплуатации очзохвт сооругонзй.' Предлог»« хройатографпчвский гатод контроля зсогаза жфиаг кколот, харамгарЕэувдай степень устойчивости бао-шооа яэогруетора з ШВ. Сделано зоялвчвнае, что на этапе иуока опхзгпих установок технологйчзскз пригодной является биомасса бах- ■ ?эра2-деструаторсэ, аогерал содержат 68йй> 40 % оятадецэяовой хво-лс2и Щ сумма асог'зирпнх- кислой •

Дпообацтш работа. Материала дассортанвз доложепп па следую-'Езя.вояфереютях э'.съездах: I Всеоовзпой коиСврвшши "Квкройволо-гзя очиоткн зодн" (Кпез, К32), Л съезда Украинского мякробаоло-гэтгсотго общества (Донецк, 1984), И научной конгперетшя Мнстяту-та аоллоаляой »».-аа а химаа эода им, А»В. Дунайского АН УССР (Киев, 1535), УП еьозхз-Украавсаого йякообгологачввкого обззоша'СЗэряов-

га, юеэ). '■

Публтаапзл результатов исследований. Но тскэ диссертации опуб-лззозсво 5 работ. ■ -,.

Структура п объем йзботи, Двссортацзоявач работа оостозт аз ззодзйпя, обзора дпгерагурз (I глава), экспариментальной чаетя, гяишагсаЗ материала я метода, результата исследований и ах обсуг-дзнпэ {5 глав), _в13одов, спзсяа литература и прияогоная.

Обзда работ:.! йоставляэт 265 «транш, з том число 12б"страпвд газета, 20 рпзунгоа, I» таблиц, описок литература, включаящай ■ 205 асточапаов, яэ поторнх 115 оврубеяпах.

■'Ооноааке положения. поторь^ впносятоя иа зптату.

I) Активный ггтаим.- д-эотруятор плкилсуль$атов р. аегидалоэа ю

под маяпяеи. зодеямсулвйота дяссоцяпрует на морфологические оарданта, различающиеся Двотрунтввиоя активность» и чувствительность?) к данному веедству.

' 2) Кяэтки исходного втаьгаа-др.отруктора и его вариантов, от лачгаяяеоя паодияакозоЯ. чувствительностью п доделилсульфату натрия, содер:*ат разное количество общих лздгядой.

3) Уого^чявозгь клеток десз-рукгора к дояагалйулз4н*унтсдоозд«»-на о количеством октадеиенонпи киодоси и содержание« цчклпщкйт'й!'?-ы.(м КВОЛО*.

4) У клеток штамма-деструктора, выросших v. присутствии долчцил-оуль^ата натрия, при импульсном внесении ПАВ н культуральпуй среду отрессоьоэ состояние и адаптация сопровождайся количественным

ь качзст".-,ешш;.: взмзненшиа состава шпнш: квело®.

содар^ш/ii' РАБОТЫ

Обзор лъюраетры. излоззенний на 31 странице, включав® четыре Раздела,-в которые обобщены сведения, касающиеся изменения культу-рал1,ао-1.юр;,,олог1;чезк:1х и фазкодого-баохимаческих свойств микроорганизмов под влшшен поверхностно-активных веществ. Проанализированы' ьэзздкн:» ¡iixaiiii'di.'.u действия 1Ш на мдкробнш клетки, связанные с пзглзьвьлз;.; хлшчзского состава клеточной станки, активности ыембра-ноовязанных ^сриекгов, а гака® развитием устойчивости к данным ве-езднваи. Црз.чогавлзны также немногочисленные данные ой изменчивости дактзрщ-дзавд'кторов при контакте с ПАВ, о перестройках, происходящих при взаимодействии с веществом.

иатеоцалы и методы исследования

Объектом исследования служил активный апаш - деструктор ал-кллаульийтоБ p.aeruginosa ic В качестве субстрата использовали додзцилсулы.ат натрия (ДОН) производства Шосткинского завода хппрзактивов.

• ' Для культшпронания бактерий-деструкторов были взяты следующие среди: сарнатт а инг-рэм /Дж.Майнелл, Э.Мейнелл, 1967/ общего минерального состава {т/я) - (HH4)2so.-i,o» К2НР04-0,7;

Я12ро4 - 0,3; MSSO4 н20 - 0,1 с 0,4-1,0 г/л додедилсульфага (среда I) али 10 г/л глюкозы (среда П) в качестве источника углерода, модифицированная среда с глицерином / Метода общей бактериологии, 1983/ - дрожжевой экстракт - 3 г/л, пептон - 5 г/л, глицерин 20 г/л, агар-агар - 20 г/л (среда Ш); мясо-пептонный агар (¿¡ДА) я шео-непгошшй бульон (Ш1Б), ,

Культивирование осуществляли.в колбах ка качалке (150 об/мин) при температуре 28-32 °<3.

Ыорф'олого-биохимичёские свойства бактерий изучала общеприняты;,'ir, способами /Методы общей бактериологии, 1983/. Деструктивную активность изучали на среде I, определяя убыль ДОН колориметрическим методом с метиленовым'синим /Лурье, Рыбников, 19В4/. О • чувс1'вит?льности клеток к ДОН судили по степени их солюбшшзашш,

< < ч ' 1 ' • " т.* оптячаской плотности баятэрнальшс: ; ■> ' » "'< V 1 • "пчтактс с 0,2 % додоиплсудь^зтод: /Уднло-1 ц ¡.<- , ч » гольпссть йсхггрзВ к ДСП вкэазялп п щт-Г1. • ,1 . ят« шюгпвогя клвхочт« оуспензяП за юрвиз

0 1 Р," " • ло5»кйлоуль,тятоа затрия. Ус^Глишм-л " 1 » , \сс вадг«;;с огклчзско" плотности за ука-

■> сип ' ирс"| 10 Клетки вырааишали в пзрполячвсккл • •сдаторях куяюязщювшшд па качалка при тшзротура 30-38 °С в юолахзимя ах в логар:к]««пчеокой а стационарной фазах роста.

йсвладоватю одвктпонтоютячвопях свойств клеток бактерий ас -•.одного аташд ?.оегпз1п»яя тс ц его кор$одвгачсс»их вариантов доводили «згояоа дакроолзктрофороза* / иш , 1963/. Гвдрододь-остъ-гэдрофсбиооть поверхности исходного штамма-деструктора и го морфологических вариантов оцсшшалп путем определения сорбц:',:; деток к пяти жидким углеводородам - октану, додохапу, толуолу, вокалу, циклогексану / ПозопЬегг , 1980/. Гпдрофяльность-ядрофобность бактерий такяо проверял;! методом преципитации кле- ■ о» растворами сульфата аммония / ье1Изт,1?81/.

0пределеы:з липздного состава клеток проводили обш:п п раз-эдителышми мзгодака анализа. Легкоэкстрагаруемие лшгоди ,Л£Л) звлскедв из влаянше бактериальных клеток по методике БлаПя и айэра, которая •является ущюазннга вариантом классического мето-з Фолча /Кейтс, 1375/,. Кпслотоэкстрагируемые (связанные) лшшдн элучали из клеток, оставшихся после двухкратного экстрагирова-№ хлороформом о метанолом /Кейтс, 1875/. Содержание йюсфолигш-зв-в оактериях определяли модпфииароваиннм никрокетодом ьартде-

1 /Кейтс, 1975/ и,рассчитывали по количеству мпкромолей фосфора I мг легкоэкстрагируемых ллпидов.

■Образцы метиловых эфиров кмрных кислот лпладов клетки получа-1 из влаявнх бактериальных клеток р.аеги^поэа 1С путем их щролнэа в 1,5 $ серкой кислоте в метаноле /Даипленяо, 1973/, тиливые эфиры ирных .кислот лелсоэкстрагпруемнх липидов получа-I аналогичным путем из высушенных с токе азота образцов лпть-

1В. •

Исследования проведены совместно со старшим няучнш, сотрудни-м К/иЗ АН УС^Р. кандидатам технических наук А.ОД'оодпеето

6 ..... ' Газохроматографаческий анализ проводили на хроматографе "Цбот-110" с Еопользова1шем алакешо-ио1№зацЕо;шого Еетектора.Е стеклянной колонки длиной 3 м е внутренним диакзгром 3 tai, ва-подаенной I % s Е-30 на хромосорбе w - aví - roes 8Q-I00 изш. Чувствительность детектора - 2'Ю10; скорость ггза носителя езоха -2 л/час; скорость подачи водорода 2 л/чао в воздуха - 20 л/чао. ' Температуру колонка программировали от 120 до 240 °С со скорое®:® ■ нагрева 3°С/шш.

■ Идентификацию ыгоних кислот- осуществляли суток сравнения юс ; . относительного времени удерживания на колонка о временем удерживания вводшшх стандартов. Обнаругагше ненасщвиних гирнше кислот осуществляли путем проведения реакции гидрирования, а циглопросп-. новые группировки идентифицировали о помощью реакции бромирова-ная Дейте, 1975/.

Диссоциация штамма-деструктора р.nerpgjqnwaTn под влиянием ПАВ. При выравдшани» штакиа-деструкгора на синтетической кидкой среде с додецреульфатом натрия в качестве единственного источника углерода было обнаружено расщепление культуры на морфологичаские варианты. Морфологические особенности вариантов стабильно, проявлялись при рассеве культуры из жидкой среди о додецилсульйатом на среде Ш, откуда нами получены три основных варианта иташа-деотруктора^-аегие1поаа ic , р которыми в дальнейшем проводились вое исследования. Крупные колонии диаметрои 10-14 мм о шероховатой поверхностью отнесены к а-варианту. Вариант, колонии которого имеют вид переплетенных, запутанных тяазй/а клетки образую? длинные нити с раздутыми утолщениями колбовидной бормы, назван нктча-'тыы, Один из вариантов (s-вариант) не синтезировал типичного для P.aerusinosa дс оине-зеленого пигмента, шел мелкие колоши о 'гладкой поверхностью а проявлял тенденцию к диссоциации. Определение биохимических свойств морфологических вариантов показало, , что гладкий s -вариант не способен усваивать ацетат, в отличие от'исходного штамма, нитчатого и шероховатого вариантов. Нитчатый и r-варианты не угнеталась бмшюгликозедными антибиотиками -стрептомицином, нэоыиннном, кангшшцшом, а гладкий я-вариант был чувствителен к шцл. Показано также, что морфологические варианты могут храниться в течение длительного времени (6 лет) на питательной среде Ш без добавления ПАВ под слоем вазелинового масла при комнатной температуре, не изменяя при отом основных сsotarи. '

изучение деструктивной активности полученных «ора^ логических вариантов сггамиз Р.детазХпова 1С . Проведенные исследования показали, что П- и нитчатый варианта при росте на синтетической жидкой среде, где додецилсульфат служи* единсгвешшм источником углерода, активно разрушают ПАВ, сохраняя при этом морфологическую стабильность. Разрушение 0,4 г/л додецилсульфата натрия происходит за 8-10 часов. Гладкий вариант не способен к деструкции по-верхностно-гктквного вещества, но в присутствии додецилсульфата натрия происходят его расцепление и переход в исходную форму или/и в Н -вариант, которые активно используют ПАВ (рис. I). Как показано на рис. I, в конце лаг-фазы через 20 часов наблюдалось уменьшение в популяции содержания клеток з -варианта до 76,2 %, н -вариант составил 0,2 исходный шташ - 23,6 При таком соотношении морфологических типов начиналась интенсивная деструкция. К . концу процесса, через 36 часов, отмечено полное изменение соотношения вариантов в популяции Р.аегизл.поэа ю : походный тип составлял 90,6 %; 3 -вариант - 9,2 %\ н -вариант - 0,2 %.

Чувствительность клеток морфологических вариантов к доденил-сульфату натрия. Установлено, что чувствительность клеток морфологических вариантов к додецилсульфату натрия различна и зависит от концентрации ПАВ и времени инкубации бактерий. Клетки гладкого варианта оказались особо устойчивы к воздействии ДСН (рис. 2). Так,при 3-часовой инкубации клеток 3 -варианта в растворах с содержанием додецилсульфата натрия 1,0 и 2,0 г/л не наблюдалось падения оптической плотности бактериальной суспензии. Клетки н -варианта были наиболее чувствительными. При контакте клеток с додецилсульфатом в концентрации 1,0 г/л за 3 часа отмечено падение оптической плотности на 12 %, а в присутствии 2,0 г/л вещества оптическая плотность баятериал1 чой суспензии снижается уже через 10 мин на 15 через 3 часа - на 55 %, Нитчатый вариант по чувствительности к ДСН занимал промежуточное положение.

На примере морфологических вариантов штамма-деструктора р.ает-еиюза ю показано отсутствие связи между устойчивостью к литическому действию додецилсульфата натрия и способностью н его деотрушши, что, возможно, определяется различным строением их клеточной поверхности.

• Обнаружено, что популяция бактерий р.аеги-.

гис. 1- Разрушение додвавлсульфага нэтрнл(Дин) морфо-■ логическими вариантами Pseudomonas aerugi-, r.osE Ю i; диссоциация 5-варпокта в процесса яестпукпи::: I - К-еаокант; 2 - нктча-•rmi sa"K5HT: 3 - 5 -вариант; -О - В-варпант» 53-s - ваоиапт: и - исходные игам»

-1-1-1-;--1_|__

20 40 60 80 100 120 140 loj 1 1зрзг.".п. г

2. Чувствительность клеток :.:г\рфэло Ч80КШС ваоиЕ.чтов Pseudomonas aeruginosa 1С к дод£НЕ;юулЬ'Т:ату натрия. Концентрация ДСН:- —

- I г/л; ---2,0 г/х.)

-л- .в -вариант; о - шячахий; О-В -варкага.

-р.по-за 1С , яолучопзал :1а зантстпческои с роде о Д'Л1 при ';зу;еп;;кл рН дкс;нро;:опио;1 сред:;, ивляетая гстсрогснии" па Я" -но -тояииалу. о*дсмышх 7Д<зток (рас. 3), Хлоактерпш признаком по пул я-ййп |'.пеги-1пог,т йзля?тся калачи? дзух групп шток. Тач, г< ■гаотвоота, щ>я рН 2 (рис. за) среднее зяачеяее & -потзнгхзяч отпя условно тдо«~гшас групп бакпряХ с .стазлязт соотвотствзяпо 3-9 11 Ц-15 ьВ. Кзуъишв рП-зовиовмоотя С -потенциала клеток мор^юлотичвеких вариантов кудьтувн ?.а«гц(?1поза ш показало, что клетки нитчатого я в -пяраанта имеют- аналогичкне ялвктрокк-неппезкио сво::стг.ч, В то г.з врзал завзесшооть £ -потенциала от рИ среда меток а -нарпанта имеет- сходство с подоЗноР завпонкоетт-я, иолугеяиоН для (Заяггряй исходного аякша. Такав образом, мокно предпологить, что появление я популлпии исходного втаиха двух групп меток отражает процесс раздодгшн йулмурк Р.аеп^по«;* 1С иод да.':стз:'.ем ДСН-па два типа морфологических варла.чтоп, оглкпая-вдхся по элекгрсккпзтическ::м свойствам. Данные изучонпя рК-зава-оимостп 5Г -яотешшада позволяют заключить, что бактерии нитчатого-в £» -вариант)»)»в огллчие от П -варианте, имеют более однородную поверхность.

Исследование гндройильпостя-гпдоо-' обностй поверхности бтто-риК морфологических вариантов. Установлено, что нитчатый и з -варианты имеют в основном гидрофильную поверхность, в отлично от Н -варианта * который проявлял гидро^-обнпе свойства, что свидетельствует о более высо.чом содержании липлдсодержащпх участков на поверхности его клотоК.-Такое различие в строении наружной части внесшее мембраны меток штамма-деструктора монет являться одной из причин обнаруженной нами ранее починенной устойчивости нитчатого и 3 -вариантов к солгобилизирующему действию ПАВ. В связи с этим целесообразно было изучить особенности липшшого обмена у устойчивых и чувствительных к ПАВ бактерий.

ДйИазнМ состав клеток исходно^ытд^^отрук^рд^Каеш-31поза ХС изучала у бактерий, характеризующихся различная чувствительностью к ДС!Ь Такие бактерии получали', вияапшиэя их на . жидких средах с различивши источникам углерода: I) 1.Л7Б, Z) синтетической среде .с 0,05 % додзхдиюуль':ата натопя я 3) синтетической среде о i % глюкозы. Для сравнения толя» брали е опкт е1-:ра-щоннне в цш клетки э -варианта, особо усгоСчзгого к ЛСН. Наибольшее количество лппидов, как легкоэкстрагируегдш, так и кис-лотоэкстрагяруеиге-с, содержали метки походного ита:/,па-Деструктора

я « о о к t. о о с, ч. 6} к

s

rí §

«i « к

С. <0 ti

о о

С! С я i

«5 сз я и

« Ol

га о я

о й. о м а и а «о и ta га <о i о ö OA

о &3 ьо о 1 —-

etr

ЯМ»

ОН SS!

я о » ta ч л с-<

В О J. и

м >3< Ч вс а.--^ н о о к К 53 &î к

-'ЛОЛОГЯ 0üi0Bí¡Klr0)J

я его э -варианта, выращенные в ¡31Б. Эти же клетки отличались повыше яноЕ устойчивость*) к литическо:.:у дойствпю ЛСН. Клетки, ш-ра-пданние на среде с глюкозой, имели наименьшее количество лппнлов а характеризовались позккенной чувствительностью к ДСП. Таким образом, у бактерий, полученных в ЮТ и спаде с глюкозой, откачена связь резистентности и уровня синтеза липидов, что согласуется с литературными данными /Рубан, 1977/. ь клетках втокка-даструк-тора Р.аешв1пова 1с , вкракенпнх на среде с ДИ а зепг.капяях промежуточное положение по чувствительности, увеличено количество общих лияядов, что однако не обеспечивает повиташю'»'. устойчивости к додвшясуль^ату. Это дает основание предположить, что не общие ляпяда являются факторами уатоГлпаоотя изуча«-*!« бактерий я ПАЗ.

йирнок.-.слотяь'й ссстав клеток и легкоэкотрагяруеккх липидоз (ЛЗЛ) исходного ата-у.уа-деструктора Р-аегиеИтза 1С . Показано, что вцраэдзвание при различш.-х условиях обеспечим ;т нэодаплхозую устойчивость бактерий к доденилсуль'ату. Так, из тзбдипн I видно,' что при росте вгаа'лда-деотруктора на различию: патагзпьшае средах наблюдается одновременное снижение устойчивости клеток к дог.еш'-л-сульфату натрия, повышение содержания илклопропановых кислот и понижение состава их биосннтетичэских предшественников - мононенз-сыденных яарннх кислот. Обнаружено, ::о д:я резистентных бактерий характерно высокое содержание октадеисновоЯ кислоты. Установлено также, что в спектре тарных кислот Л£Л по сравнения с общим кирно-кислотним составом клетки, выявляется ¡/.еныаее число короткопепо-чэчных кислот. Общая нзнасыщенность ЛЭЛ у клеток различной чувствительности выше на 10-15 %, чем у лялвдяого пула клетки , общее содержание циклопропан! лд кислот ЛЗЛ у чувствительного варианта меньше на 3-10 %, чеь?^сло точных липядах.

дирноклслотный состав клеток и ДЭЛ .'.;ор?ологаческгас вариантов р..чегид1по5з ТС . Клетки,'выращенные- в одинаковых условиях, отличаются по качественному, и количественному составу якрннх кислот. Так, в пуле яярных кислот гладкого и нитчатого вариантов обнаруживаются. дополнительные кислоты,не синтезируемые у походного штажа я л -варианта (рис, 5).-Установлено также, что варианты, разлачакщеоя по чувствяте «ностя к ДСН, водит существенные количественные отличия в их ¡¡сирнокзслотном составе. Резистентный к додешисульйату з -ваоиант имеет самую высокую непасы-ценность лютлдоз - 56,0 %..У нитчатого гаркапта.чувстяптелытого к

J

9 С1?д

I/

/

"17л 11^170

(Я

и

-Г.

«I ¥ 1

I 1/1 !!

1 ! ! М 1

и ЬЛУ

.Рис. 5. Спектры жирнюс кислот ксрс'олагяческих вариантов штэжа-деетрчктора Рзеийошояаэ аэгид1поз£ 10

Состав кайло? клзтьк кихолисто »•»»>»

Довит* ¡:»-1-«в-»поза и; ¿дохшие*! ••¡уистввтезъвосги :•■ ЛЯ!

Кислота

Шзсо-псг.тоиный

бульон

Сйнтетйческйя Опитегиччская среда с доле- среде г г»о-

шгдеулъфатом аой

чувствительность ¿актерай к ДСП" {%)

0 6 40 7 44 52 73

°12р сл. 0,4 0 1.2 0,9 0,1 1,1

°12:0 4,2 5,5 2,7 4,7 4,6 3,0 2,7

14р 1.7 1,5 2,5 1,7 1,7 1Д 1.6

С14:0 1,0 1,4 0,4 0,6 1,0 1,0 0,9

015:0 0,9 0,4 0,8 0,2 0,1 0,3 0,1

С16:1 14,5 13,7 5,2 10,8 9,7 8,9 13,2

С16:0 26,7 32,9 34,8 36,0 33,Г 3-1,6 30,8

ч С18:1 2,0 2,В 5,3 1,9 3,8 4,5 6,6

42,8 33,8 28,7 36,7 30,9 26,8 24,7

С18:0 2,2 3,2 2,6 1,7 1,9 2,8 2,3

С19л Всего: 3,0 3,6 14,4 3,6 11,6 16,2 15,2

насыщениях 36,0 44,2 43,5 44,1 41,4 42,4 37,6

ненасыщенных 57,3 47,5 33,9 47,5 40,6 35,7 37,9

циклопропан. 5,0 6,4 19,7 5,5 15,4 20,7 21,8

разветвленных 1,7 1,9 2,9 2,9 2,6 1,2 2,7

Примечание: Чувств .'ельность бактериг. оценивали по степени па-

денпя оптической плотности бактериально;; суспензия при контакте клеток с 0,2 /ГДОН, ввраяевноС в % по отношению к контролю.

.¿¡ОН, наблнчается увеличение о5щего соззраания насыщэштх и раз-вагл^знн^; кислот, йероховвтый и -завваат, отлнчавщй'ся чувст-иптьиыюотш к ДОН, характеризуется значите ¡ши свааеивем уровня лппвдов, по ор&впвни® с рззистзнтннг.:и вариантами

и

(с 56 до 31,2 }$), ■ и поашением содержания цвклопропавових

кислот (с 5,3 до 23 /1).

л ЛсЛ вариантов штамма-деструктора отмечается повышенное содержание общего количества нзнасвденншс кислот, по сравнению о общим аирнокислотни; составом клеток - у резистентного гладкого варианта - незначительно, а у чувствительного шероховатого - более, чем на 20 Таким образом, полученные результат позволяют предполо-нить наличие связи между резистентностью клеток бактерий-деструкторов и степенью насьт^шости их липидов.

Изменение состава жирных кислот штзмма-дестр.уктора, выращенного в присутствии додеиплсульйата натрия. Наиболее четко зависимость лнпндного состава бакгзрий-деструктороз от присутствия в среде ДОН прослеживается по изменению показателя насищенноста(ПН-С|^ лредставлякчзго собой отношение насиненной гексадекаиовой кислоты

к пенаиьщэнпой гексадепеновой (табл. 2).

Таблица 2

Изменение показателя насыщенности (ПН-Cjg) у клеток v.aeruginosa 1С ■ выращенных на среде с ДСН

Концентрация ДСН (г/л) ПН-Cjg

Без ДОН (контроль) 3,0

0,7 3,3

1,0 1,8

1.5 . 1,3

Из таблицы 2 видно, что с увеличением концентрации ДСН в среде спрашивания у клеток постепенно снижается насыщенность липмдов.

Следует также отметить, что с увеличением концентрации доде-цплсульфата ;> среде в липидном пула клеток штамма-дебтруктора возрастает доля ненасыщенных жирных кислот и при этом увеличивается' содержание разветвленных кислот с 12 и 14 углеродными атомами. и,..-¡южно, такие перестрочи являются адаптациошшми и направлены на придание клетке устойчивости к действию ШЫ.

Изучение реакции липицного пула клеток штамма-деструктора » ответ па импульсное внесение ДСН. Показано, что изменения в хзрискислотион составе клеток происходят в зависимости от про-П'лштеяшооти действия еещютва, его коишитрашш 'и степени склк"¡енип и постав клеточных компонентов. При импульсном внесении

додацилсульфата нлзткз аодаергшзтоя стрессовому воздействию. В мойва* стресса у бактерий следует отштвть наличие корреляции кзяду содержанки неваешвнша кислот а производит® пика ДСй, вшшчешшх в тяюгмощ! спектр. 0 увеличением концентрации и времени кон-, тента'/о меткой в составе гкринх кислот повышается оодеркание вахлощюпанввих кислот с ооотвегствэннш снааениеа общей суша нвнасшрнщ«. НоиЗсльпк г.змзезнгя в клетках в момент стресса ЕёОлюдеютоя на урсгнз Еаскзднвой геасадакановой киолотн - предшественника даноБзваойззшшх кислот - гексадепановой и октадаце-вовой. Поэтому дпнглгку ре'щщва гзрнскислотного состава пра ка-пуяьсвшд внесении ДОН в среду яучса всего иожно проследить по показателю песиценносгд ПЗ-Cjg (таблица 3).

Таблим 3

Пэ из не ¡те показателя паиздайноста Ш-Gjg пра импульсном знеоешш ДСН в среду роста P.aeruginosa ю

Концентрация Показатель насыщенности Площадь пика

Д7Н, г/л ПН-Cjg (числитель) произвошшх^ЖЛ,^ i«2

Вракя воздействия додецилсульфата (мин)

"ТГ (контроль)

15 30 60 80

0,5 . 1,0/0 1,0/12 1,5/65 8,3/204 0,2/1000

0,7 1,0/0 1,4/27 1,5/48 1,2/112 0,4/801

1,0 1,0/0 1,4/24 0,5/218 1,6/1000 1,6/2000

Из данных таблидц видно, что за 30 >.шн взаимодействия клеток с ДСК в концентрации 1,0 г/л показатель насыщенности уменьшается в 2 раза. Влияние'ДОН в меньших концентрациях - 0,5 и 0,7 проявляется через более длительное вреди - 90 мин. За этот период показатель настанноста снижается в 5 и 2,5 раза соответственно, при этом наблвдается включение производных ДСК в спектр жирных кислот. Таким образом, у бактерий-деструкторов в состояний стресса за короткое время контакта с ингибитором происходят резкие перестроЕки в состава клзточных лапидов, что особенно выражается в изменении степени их насыщенности.

Динамика жирных кислот клеток штама-десТруятора в процессе выхода из стресса. Учитывая перестройки в липщвоа пуле под низы ДОН, представлялось интересным' изучить пронесен, происходя-

атплем и

г0г1?

и-

1Г-.

Таб.«'-;

... ГТТТТ^р ^ . т

и')

ШЮЦКЩ; П.'О

Л1Й; !

0,& 8

1,6 1,0 240

, 0 0,2

- 13 0 о о .0 '

ТО (\ 4,3 с

¡шиизБоя:

Кокцгкграшт Ло!1 I г/л

Как еедйо из таблицы 4, и пориод адаптации бактерий К'дейст-вя» ЩВ (5 часов контакга клеток с Д«Н) показатель ваоюцзшюети резко падает с 1,3 до 0,2, что отражает физиологическое состояние популяции деструктора в ксконт стресса, а именно интенсивное увеличение обагЬ оушн иенасквгшшх кислот. Через 10 часов шшубиро-вшта клеток о ДрН лабладазгоя уменьшение ненасшвяностя лпивдов клетки более чем па 20 по сравнению с 5-часовш. временем контакта, а содержание насыщенных жирных кислот увеличивается почти на 20 Через 13 часов ¡слетки выходят из стресса полностью, ПН-О^ при 5,ом.составлявг 2,2, а через 19 часов завершается разрушение ДСН и показатель насыщенности .достигает 4,3, '

В итоге, анализируя динашку жирных кислот клеток Р.аегиз!-8а 1С , нояю предположив, что способность бактеряЕ-деотрук-торов противостоять воздействиям поверхностно-активных' веществ • связана с ах лшкдаша обменом.

На основания полученных, результатов разработан микробиологический и хрог.:атогра<5ический методы контроля за состоянием, популяция бактерий-деструкторов при заселении и скоплуатацяи очистных

соору-тенпК.

тг1 IV фС'+юхш-мастИ ¡.чл-од омць^^.л «Й ои^амлс-ШЩ I Л I . V . .1 О Ц6Л1.Ы •ОДЩ'ВДОЙв Йантсупн'; ).■ ооу-

гояш и V с, 1 р и' „и).«аш1 вглбилвм *!»«№»««. аорктгои, «до о.ю-бешм ва»ш ирн подушит йкоэдоиы и ьишюяшгё дтдоктнкво.п активное^» длч заселения доямыих очаотанх соору-мшпй.

Хрокатсгрсфич'яскпй метод осксвсц и я контроле состава ^хряцх кисло'!?, хйргктеразуюнтх стапеяь устойчивости «йкжаеси деструкторов к ШВ. 3 результате сделано заключение, что .на этапе пуска очкотннх сооружений технологически пригодной является биомасса бактерш!-

деструюсров, которая содержит сзнвв 40 % октадеденовой кислого • от суммы всзх зшрккх кислот.

■ вшоди

1. Впервые установлена изменчивость штамма-деструктора ал-калсульфатов Р.аегид1поаа хс под действием додепилсульфата натрия. Популяция исходного штамма-деструктора при контакте с ДСН диссоциирует на варианты, различающиеся морфологивК колоний и йизиолого-биохимическими свойствами клеток.

2. Популяция штамма-деструктора р.аагиз1г.оза 1С является гетерогенной по способности' разрушать ДОН. Обнаружено, что гладкий вариант не способен разрушать додецилсульцат, в отличие от высокоактивных нитчатого и шероховатого вариантов.

3. Показано, что морфологические варианты различаются меаду' собой по степени устойчивости к ПАВ. Так, гладкий вариант - резистентен к ДиН, нитчатый менее устойчив, а шероховатый вариант характеризуется повышенной чувствительностью. Отмечено такте отсутствие овязи меаду устойчивостью морйэлогаческих вариантов к литическому действию ДСН и способности К деструкции.

4. Методом микроэлектрофореза в популяции исходного штамма-Деструктора выявлено две группа клеток, отличающихся по елекгро-канетическим свойствам. Поверхность шероховатого варианта характеризуется положительным и отрицательным зарядом. На поверхног<йи>>~&: гладкого и нитчатого вариантов отсутствует положительный заряд.

5. Установлено, что клетки исходного штамма, гладкого и нитчатого вариантов р.аегиз1поаа 1С имеют гидрофильную поверхность. Поверхность клеток шероховатого варианта, наряду о гидрофильными участками, содержит и гидрофобные, что свидетельствует о различиях в составе Паточных стенок »тпх вариантов.

6. Впервш установлено, что клоткп исходного итамыа-дзотрук-тора, характеризующиеся различной чувствительностью к ДСН, содержат неодинаковое количество липидоз. Устойчивее к ДСН бактерии,

в отличие от чувствительных, синтезирую*. повншзшшз количзстго легноэкстрагируеынх н кислотсэкотрагируомых.дниедов.

7. Показано, что бактерии, выращзшшз ка средах, гда ШЗ олугаг одаясхюэишви источником углореда, содархат пэзигзшюз количество обете клеточаюс лилвдоз.

8. Обнаружена зависимость кззду сгоаэпг» уогсЗчззосК! глатог деструктора к ШВ и составоа «ирных кислот дипвдов. РезЕотоаткосз клеток коаао характеризовать кодзчэствог* окхйдедоковоЙ КЕслоуа в сумкой циклопропановнх кислот. Клетки, содаркащш в карнокпело^-ноы пуле свака 40 % октадецзновой кислоты, устойчивы к литяческо-му действию ПАВ, а бактерии с содерзднизы циклонропановых кислот около 20 % и более - особенно чувствительна.

2. Установлено, что морфологические варианта раааячйвгея по колачестве11ноад и качественному составу гшрннх кислот. Резисгоиг-ный з -вариант содержит Л2,2-$ ненасыщенной октадашновой кисло: В отлична от других вариантов, у кого синтезируются дополнительная ненасисанная гептадзценовая кислота. Отличием нитчатого вара> анта является наличие разветвленной кислоты с 17 углеродными ето-Kaf.ni. Чувствительный шероховатый вариант имзет повышенное с о дергание цнклопропановых кислот.

10. Впервые показано, что у клеток иташа-деогруктора, выраженных в присутствии ДСН, в стационарной фазе роото повышается общее содержание мононенасыщзнных кислот и уменьшается количеств! насыщенных.

II. Установлено, что вмпульоясэ внесение ДШ в среду виращ еаняя приводит РвеиЗоЕопав аегиз1позак стрессу и аниязт на лшшд ный обеган. Стрессовое состояние клегой штажа-деструктора характ эуется резкиы пзканеннзн соохношгния жирных кислот с 16 углеродными атомами ва счет понитшл содержания гекоадекановоИ кислоты. В прошссе выхода бактерий из стрессового состояния это отношение нормализуется.

• 12. Разработаны рекомендации по контрою состояния биомассы, используемой для заселения очистного сооруяания, и биопленки в работающих установках. . .'■•'■

с/ /

'1 1.

■ <...- с,- -

7/ у

ПО МАТЕРИАЛАМ ДИС^РТАШШ OIOTuTrKCbAHU 0:Кда ¡:?В {'Ш'Ш:

1. Кривей И.А., Настоящая Н.И» Изменчивость ГяеНопот? чяпс;». - В сб.: "Микробиология очистки води". - Кп«в: Нп.у

1982. -С. 127.

2. Кривец И.А., Настоящая Н.И., Ставскал О'.О. Пзмлчпш, ;ь П»ти^м':>-ч пае aeruginosa 1С-деструктора алкнлсульфатов 11 МцКроЗрил.

яурн. - 1987. - 49, й 2. - С. 3-6.

3. Кривзц И. А., Нас тощая Н.П. Морйологические вариант деструктора алнилсульфатов. - В кн.: Труди УI съезда Украинского микробиологического общества. - Киев: Наукова лукка. - 1914. -0. 164-165.

4. Кривец И.А., Гордиенко A.C., Настоящая Н.И. Иикроэлектройороз domonae aeruginosa 1С " Деструктора алкилсульфатов // Ши-р-гН-от. лсурн. - IS87. - С.

5. Васюренко З.П., Кривей H.A., Настоящая Н.И., Стзвскгя 0.0., Островская ¿i.A. Особенности жирнокислотного ссотявз клеток рчяц-

domonaa aeruginosa ic, различающихся по устоГч'шоети п доле- • цилсульфату // Микробиология. - 1937. - 56, й I. - С. -40-4.3.

6. Популяционная изменчивость P.aeruginosa 1С - деструктора алкилсульфатов / И.А.Кривец, С.С.Станская, П.П.Настоящая

// Тез.докл. Всес.кон'5. по биофизике микробных популяций, Красноярск, 1987 г. - С. 7-26 7» Кривец U.A., Настоящая Н.И. Изменение хприогаслотиого состава бактерия деструкторов ПАВ под влиянием До'Н // Тез .докл. Всес. конф. лплнд. .Г.Пудино-на-Оке, 1988 г. - С. 35 В.. Кривец И. А., Настоящая H.H. В.'аямодзСствие p. aeruginosa 1С

"деструктора алкилсульфатов с доденнлеуль^атом Натрия // УП съе?л Украинского микробиол. общества. Тез.докл., Черновш», септ., 1989 г, ч. I, с. 265

9. Настоящая Н.И. Физиолого-баохимяческке особенности бтктярш; -деструкторов ПАВ пои очистке волн // Тез.:!Окл. Безо. спмп.

Оренбург, 1991 г. - С. 64-65.

10. Кривац И.А.,-Настбящая Н.И., Сгзвская С.С. Гидрофильно-гидрофобные свойства бактерий - деструкторов ПА!! // Хим. 3 т?хн, воды. - 1992. - Т. 14. -й 7. -С. 368-371.

Подписано а печати 5.04.92г. Зад.1049 тир.100