Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микробиологическая деструкция анионных поверхностно-активных веществ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Микробиологическая деструкция анионных поверхностно-активных веществ"

г! о 3 О

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РСФСР ЧЕЛЯБИНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

ГОРЕЛИК Эсфирь Владимировна

УДК 577:614.7(04)

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДЕСТРУКЦИЯ АНИОННЫХ ПСВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Челябинск, 1990

/

Работа выполнена в Межотраслевой научно-исследовательской лаборатории микробиологических методов борьбы с загрязнением окружающей среды при Саратовском государственном медицинском институте. Саратовском филиале ВНИИгенетики.

Научный руководитель - доктор медицинских наук, профессор Б.А.Шендеров.

Консультант - доктор медицинских наук, профессор Г.М.Шуб.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Р.А.Пшеничное; доктор медицинских наук, профессор С.Г.Смирно1

Ведущее учреждение, дающее заключение о научно-практическ( ценности работы - Всесоюзный научно-исследовательский инстит; антибиотиков г.Москва.

Защита состоится "_"_1990 года в "_" час

на заседании специализированного Ученого Совета К 034.04.03 1 бинского государственного медицинского института (454092, Че бинск, ул.Воровского, 64).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Челябинско государственного медицинского института.

Автореферат разослан " "_1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат медицинских наук,

доцент K.M.Лебедева

^ V, СВДш ХАРА1СГЕРИСТИКА РАБОТЫ

Ч.

'V ' -J- А-АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМУ. Возрастающее антропогенное загрязнение ^гЧг'биосфегь- вузывает необходимость активного вмешательства в процес-ик ее самоочищения. В "Основных направлениях экономического и социального развития СССР на 1966-1990 гг. и на период до £000 г." большее внимание оделено проблеме охрани водоемов от загрязнений ' неочищенными сточными водами. Среди химических соединений, загрязняющих окруж iopyo среду, значительное место занимают анионные поверхностно-активные вещества (АПАЗ), на долю которых приходится около 00? всех производимых в миро ПАВ. Среди АПАВ наибольшее применение получили 8л-''.'чг\'ль1?>аты, алкилбензолсульфонаты и азотсодержащие АПАВ. На долю алкилбензолгульфонатов (АБС) приходится 70^ общего объема производимых в мире АПАВ, что связано с их хорошей моющей способностью и относительно низкой себестоимостью (Волков В.А., 1965; Ставская С.С. и др., 1986; Щукин Е.Д., Гершенович А.И., 1980). Из отечественных препаратов этой группы широко используется сульфонол-45.

Широкое применение АПАВ ведет к их накопления в окружающей среде, что создает неблагоприятные условия для жизнедеятельности практически всех компонентов биосферы, включая человека (Мояаев Е.А., 1976; Григорьева Л.В., 1986).

Высокая насыщенность окружающей среды АПАВ, а также клинические и экологические последствия диктуют необходимость разработки и внедрения высокоэффективных методов очистки сточных вод от этих ксенобиотиков. Одним из перспективных методов борьбы с загрязнением окружающей среды от АПАВ является микробиологический, основанный на применении высокоактивных бактерий - деструкторов, способных разрушать эти соединения (Карасевич E.H., 1975; Ротмистров М.Н., Гвоэдяк П.И., Ставская С.С., 1978; Cook A.M., 1983; Swisher H.D., 1970). К сожалению, вопросами микробиоло-

гической очистки сточных "¡од от АПАВ, включая АБС, до настояще времени уделяется внимание несоответствующее масштабам их прои; водства и их применения. Необходимость удалени;. из сточных вод АБС, как наиболее распространенных загрязнителей, и явилось ос ваниеы для проведения настоящей работы.

Для вкяснеиия процессов и мехьнизмиь формирования генетичес систем деградации ксенобиотиков важным является знание геиетич кой природы детерминирования признака деструктивной активности Эти знания необходимы также для целенаправленного конструирова новых штаммов-деструкторов для очистки окружающей среды. Создв таких штаммов с улучшенными характеристиками весьма перспекти как в плане расширения спектра утилизации соединений, тек и ус леки/т деструктивной активности (Воронин А.X., 19У7; Chek-reber' i.и., 1980). После открытия плазмид биодеградации методами ной инженерии ухе созданы ряд высокоактивных деструкторов аро» чесзих, полхкдерных, алифатических, галоароматических соедине! (Воронин A.M., Пориц А.Л., Скрябин Г.К. A.C.» 612958 25.06.19"; Корженевич Б.И., Шуб Г.М., 1905; mello D.i., Hylroie J.K., Chakrtbarty A.B., 1976; Reineke W. et »1., 1982).

Тагам образом, поиск и изучение микроорганизмов-деструктор' получение методом индуцированного мутагенеза и селекции шта»м с повышенной деструктивной активностью, выявление новых плазм биодеградации является весьма актуальным направлением.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Цель настоящей работы - повыше эффективности борьбы с загрязнением окружающей среда АПАВ на

новании их микрсг.ислогим-гксй деструкции1*.

Ь соответствии с эюП [¡елью предстояло решить следующие за,г.ь- л.

I. изучить распространенность кикреорганизиеп.способных утилизировать А11АВ (дсдпцилсульфат натрия, сульфонол-45 и кетаупон) в хечестеи Iд;питЕенно."о источника углерода, серы И энергии.

?. Апробировать существующие и сконструировать новые индикатор-ко-ссл1'ктирны(? среды для выделения из объектов окружасщей среды микрсср['бкизмов, утилиэир-.пщих АПАВ ка основе аякклеульфатев, ая-кил^ензолоульфонатов и азотсодержащих АПАВ.

3. Методом индуцированного мутагенеза и селекции получить итам-мы с повывенной деструктивной активностью в отношении наиболее

"жесткого" по ?иораэлагаемости АПАВ судьфснола—'.о. Установить фпк-торь, определяющие оптимальный режим для проявления деструктивной активности.

4. Выявить генетическуч природу детерминирования признаха суль-фонолутилизац'.'и и исследовать некоторые основные пути микробиологического разлогения сульфонола-45 у одного из отобранных штаммов-деструкторов.

5. Установить принципиальную возможность очистки сточных вод от АПАВ с помощью селектированного штамма с повыаенной деструктивной активностью и длительность его персистирования б естественном биоценозе стоков.

* Считав своим долгом принести глубокую благодарность члену-хорреспонденту АМН СССР профессору Игорю Валериановичу Домарад-скому, принимавшее активное личное участие в формировании научного направления по изучению микробиологической деструкция ксенобиотиков, организации и обеспечении работы соответствующей лаборатории при Саратовском медицинском институте и выполнения наших исследований.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Показана низкая частота распространения признака сульфонолутилиэации у микроорганизмов различного происхождения. Установлено, что микроорганизмы с указанным признаком наиболее распространены в местах, содержащих значительные концентрации этого поверхностно-активного соединения. Сконструирована селективно-индикаторная среда для выделения микроорганизмов, утилизирующих АПАВ (рацпредложение № 887, БР«!3 С® от 9.09.1983 г. положительное решение на получение авторского свидетельства по заявке * 4282275/30-31 115790 от 13.07.19ЕГ7 г."».

Из почвы изолированы штаммы псевдомонад и представители рода алкалигенес с деструктивной активностью в отношении сульфонола-4! Впервые методом воздействия микроволнового излучения децимегрово го диапазона с последующей селекцией отобран штамм А1саХ1еепеа (1епКг1Г1сапа ГШ-2 с высокой деструктивной активностью п отно шении суль^онола (Авторское свидетельство П048&2). Впервые дс казана внехромосомная локализация генов ответственных за утилиз; цию сульфонола-45, дана генетическая и молекулярно-биологическш характеристика выявленной трансмиссивной плаэмида биодеградации сульфонолв-45 рОЭ. Экспериментально обоснована принципиальна возможность использования бактерий, несущих плазмиду биодеграде ции сульфонола-45, для очистки сточных вод промышленных предпру тий, а также предприятий бытового обслуживания.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ:

- сконструирована селективно-индикаторная среда для выделен микроорганизмов, утилизирующих сульфонол -45 (рацпредложение

* 887 БРИЗ СМИ от 9.09.1983 г., положительное решение на получ кие авторского свидетельства по заявке № 4282275/30-31 (П579С от I3.Cf7.I907 г. ;

- создана коллекция втаммов аэробных граиотрицателькых мик-

организмов, способных утилизировать с;льфонол-45 при его концентрации з среде до 250 мг/л;

- игами Ж1са11еепез <1еп1Лг1Г1са118 ПП-2 - деструктор сульфо-колп-45 депонирован в Центральном музее промышленных микроорганизмов (ВНИИ генетика, г.йосквя, коллекционный номер В-2842) и-зая^-цен авторским свидетельством ? 1184852;

- у итамма А.аепАгг1Г1сап8 ПП-2 выявлена трансмиссивная плаз-мидв биодеградации сульфонола-45 рвв. Дана ее генетико-молеку-лярная характеристика;

- покачана принципиальная возможность использования селектированных бактерий для очистки стоков предприятия, содержащих АПАВ на осного плкилсудьфатов, алкилбензолсулъфонатов и азотсодержащих АПАВ.

Практическая ценность исследований определяется использованием штамма А.<1еп1г.г1Г1оап8 ГГ-2 в работе различных лабораторий научно-исследовательских институтов и высших учебных заведений (акты о внедрении от 18.02.1986 г., 23.12.1986 г., 13.07.87 г., 25.05.1988 г., 27.01.1989 г.). Материалы исследований представлялись на ВДНХ, а также на Мевдунарсдной выставке стран членов СЭВ (Венгрия, 1986 г.).

Проведено испытание штампа д.ЛкиЛгИЧсапв ПЗ-2 в реальных сточных водах гальванического производства (акт испытания от 3.11.1989 г.).

Настоящая работа является частью комплексных исследований, выполняемых по программе ШГГ 074.05.Н4 Генетика и молекулярная биология бактерий.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы исследований я основные результаты обсуждались на Всесоюзной конференции "Биологический фактор, производственная и окружвсщая срсда - здоровье человека" (Москва, 1984), IX Всесоюзном совещании по программ "Плазмидч" (Москва, 1984), УП съезде Всесоюзного микробиологического общества (Алма-

Ate, 1985), Областной конференции "Актуальные вопросы гигиенъ села в свете выполнения Продовольственной программы" (Сарато! 1986), Всесоюзном симпозиуме "Механизмы биологического дейст! электромагнитных излучений" (Пущино, 1987), Всесоюзном симпо: "Методологические проблемы биоразлагаемости и биоаккуиуляции ных веществ в водных объектах" (г.Шебекино, 1989), Регионалы конференции "Экологические проблемы Волги" (г.Саратов, 1989)

ПУБЛИКАЦИИ. Опубликовано 12 работ, в том числе 2 авторски детельства: .V II84852; положительное решение на выдачу автор свидетельства по заявке № 4282275/30-31 1I57S0 с приоритетом 13.07.1987 г. . удостоверение на рацпредложение.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертационная работа состоит введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследовали? ключекия, выводов, списка использованной литературы, вклпчш 01 работу отечественного и 117 зарубежных авторов,ICO стра) машинописного текста, 20 рисунков, 12 таблиц.

СОДЕРНАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Материалом для исследования служили 60 образцов почв, 21 разцов промышленных и бытовых стоков, 15 образцов активногс очистных сооружений, 10 проб речной воды. Поиск штаммов-де< торов АПАВ проводили также среди 100 штаммов клинического i хождения (энтеробактерий - 79, флуоресцентных псевдомонад стафилококков - 5) 92 коллекционных культур представителей Escherichla, Baterobacter, Serratia, Erudnia, Acliietobactí Ucraxella, Flavobacterium, Paeudomonae, JLlcaligenee.

Для специальных целей использовали различные полноценна

синтетические среды: среда из, среда МЭ (Миллер Дж., 1976), среда сь»ас!а (Сйшасаа К., 1975) селективно-индикаторные среды.

В работе использовали следующие поверхностно-активные- вещества отечественного производства: додецилсульфат натрия (ДСН), натриевая соль н -метил(9-октадецемоил)-2-карбамоилэтансульфокислсты (метаупон); алкилбензолсульфонат натрия (сульфонол-45); сульфат оксиэтилированных алкилфенолов (А$-сульфат); карбоновые кислоты (олеиновая кислота); оксиэтилированные высшие жирные спирты (ок-санол-2, синтанол ДС-10); оксиэтилированные жирные кислоты (сте-арокс-6); алкилфенолэтоксилаты (Ш-4, СП-7, Ш-10); катиониые ПАВ (триалкилаиикы, катамин АВ), а также ароматические соединения: фенол, резорцин, бензойная кислота, п-оксибензойная кислота, 2,5-диоксибензсйняя кислота, 3,4-диоксибензойная кислота, о-нитробен-зойная кислота, пирокатехин, п-нитрофенол, о-оксибензойноя кислота, орцин, флероглицин. Технический препарат сульфонол-45, на основе алкилбензслсульфоната натрия, использованный в работе, получен с завода синтетических моещнх средств. Содержание сульфоно-ла-45 в среде в зависимости от задач эксперимента составляло от 60 до 400 мг/'л в пересчете на активное вещество, додецилсульфата натрия - 1000 мг/л, метаупона - 500 ыг/л.

Минимальную ингибирующув концентрации (МИК) сульфонола-45 устанавливали методом серийных разведений на жидкой питательной среде ьв. Посевная доза - 10^ кл/ил. Результаты учитывались через 24 ч инкубации при 30°С.

Выделение микроорганизмов-деструкторов АПАВ проводили с помощью метода накопительных культур (Ставская С.С., 1981), а также разработанного нами метода прямого выделения, в основу которого положен высев серийных десятикратных разведений образцов исследуе-

мк 1.ро' непосредственно на индикаторное среды, содержащие А1 в качестве единственного источника ^глерода, .еры и энергии.

Динамика изменения содержания АПАВ е ср"-де культивирована ределялась спектрзфоюметрически с метиленоьим синим при дли! иол;ш 650 ни на спектров ~с етре М-Г " (Лурье 1).1>.. Рыбников! К'84). Динамику ростч микрооргаь.:пмов оценивали по данным СП! фотометрии пру длине волны 6СС пм.

Идентификацию зтаммов-д: -етрукторсг осуществляли на основа комплекса морф>.лого-кул■ т.-ральных и физиолсго-'иохимическг . теристик ( Ьегвеу'з, -лидеров Б./., Серкова Г.П. , 19

Герхард й., 19Ь4).

Облучение втаыма АДсаПбеоез с1еп1<.г:1)'1с«шз ГГ-1 электрс нитшм полом осуществляли на эксперимент ольи^и устанорке, ог

г)

ной В.В.Игнатовым с соавт. (1973), р режиме УПМ 100 Вт/см , тотой 2375 нГц и мощности генератора 1,516 кВт.

Деструкцию сульфонояа-45 штаммом А.<1еп1Лг1Г1свло ГШ-1 I вели в 2-х литровых колбах, содержащих 0,2 л среды М9 и сул! кол-45 в концеьтреции 60-400 мг/л, в условиях усиленной аэ] с помощьс микрокомпрессора АЭН-Г (производительность при да! водяного столба высотой 400 мм не менее 20 л/час) при темпе ре 30-35°С. Разрушение Д2Н и метеупока птлмыом А.аепПгЧ^с П2-2 проводили в литровых колбах Зрленмейера, содержащих О, среды 1& и выше укаэенкые вещества в концентрации 10С0-500 соответственно при культигировыши на качалке (180 об/мин) температуре 28-ЗС°С.

Динамику содержания бактерий-деструкторов в реальных и г леших сточных водах исследовали путем высева десятикратны? ведений проб на селективно-индикаторные среды. Содержание 1 в сточных водах определяли спектрофотометрическим методом ;

тиленсвым синим (Лурье D.D., Рыбникова А.И., 1984).

Стабильность признака сульфонолутилизацин у исходной и рексм-бинантных культур определяли в кеседективных условиях и под действием элиминирующих агентов (акридиновый ораняэвый, митомкцкн С, СВЧ-облучение) (Chakrabarty А.Н., 1972; Игнатов В.В. и др., 1973).

Трансмиссивность признака биодеградации сульфонола-45 исследовали по стандартной методике (Chairaborty A.n., 1972), используя в качестве реципиентов птаюгы Pseudoaonae putida AC 340 trp etrri P. putida 394 с ya rif^j Escherichia coli C600 thr,. leu, thi, etrrj S.coli J53 net pro etrr rif1} K-coli ¿62 trp pro his Btr5^, B.coli col В trp his pro strr nalr rifr¡ B.coll 1M7 rif1.

Пдазыиднув ДНК выявляли методом вертикального электрофореза в 0.7Í агарозном геле ( Eckhardt Т., 1978).

Препаративное выделение плазмидной ДНК проводили, используя метод О.Т.Мокарова (1983) в градиенте хлористого цезия. Стандартными реперами служили ДНК ВР4 вггамма в. coli С600 размером 40 läd, плазмидные ДНК штамма Aiospirllliua brasileñas ер.2^5 с молекулярным весом > 300, 130,120,86 Kd.

Препараты ДНК для электронной микроскопии готовили по методу н.9.Davis (1971) с соавторами. Просмотр а фотографирование препаратов проводили на электронном микроскопе " ai lipa увеличение 4600-6000. Контурную длину молекул плазмидной ДНК измеряли курвиметром и молекулярную массу определяли относительно реперпсЯ молекулы рВН 322.

Содержание гуанина и цитозина определяла по форцуле М.Мгндгля (1970).

Трансформирусцув активность плазмидией ДНК изучали в опытах с Еомпзтеятгааи кееткакя B.coli С600 thr leu thi st г1- (Sago-

го S. et al., ЮЭО). Частоту трансформации определяли отно!& нием числа полученных рекомбинантов на единиц массы плазмидно! ДНК (ГнодсЯ С.Н. л др., 1977).

Интермсдиаты, образующиеся в процессе микробной деструкции сульфснола-45 определяли спектрофотометрическим методом на СС-или " Spe^ord а также методом тонкослойной хроматографии ( # куп; а З.А., 1977 \

Десульфонирупщую активность микроорганизмов оценивали по ко ч«..:тву образующегося из суль<*юнола-45 сульфат-иона. Содержание сульфат-ионо определяли гравиметрическим методом с хлористым б ^м (Лурье D.D., Рыбникова А.VI., I9&4).

О разрушении бензольного кольца молекулы сульфонола-45 суди по изменению полос поглощения в УФ-спектре (Радчснко О.С., I9E Перов П.А. с соавт., 19(36).

Путь окисления бензольного кольца в молекуле АБС определял!' спектрофотометрически в l'S-области по появлению полос поглощеь характерных Цля отдельных метаболитов (Davey J.B., Gibson D.T. 197*4 Farr D.U., Cain R.B., 196Ö).

Разделение ADC на гомологи проводили методом тонкослойной ) матографии в системе н-пропанол-хлороформ-метанол-10 Н раство; аммиака (10:10:5:Г) с последующим проявлением хроматографии в при 360 нм (Закупра В.А., 1977). Статистическая обработка рез' татов проведена общепринятым методом с применением коэффициен-Стьюдента (Ггр/ардФ., 1984).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для оценки распространения в природе штаммов-деструкторов j нами было исследовано 579 культур грамотрицательных и грампол тельных бактерий различного происхопдения (музейные, клиничес и выделенные из почвы, речной вода, активного ила, реальных с ных вод прокшзеюшх и ботовых предприятий).

На первом этапе исследований отбор деструкторе') АЛАЗ (дсдеиил-сульфа^ нат;.ин, метаупок, сулы}снол-45) осуществлялся по способности к росту бактерий на минимальной солевой среде Ж, соде^та-¡цеК исследуемые соединения в качестве единственного источник* углерода, серы и энергии в концентрации IC0C, 500, 50 мг/л со тм ч-ственно.

Анализ результатов по распространения микроор'анизмсв-деструк-торов АПАВ в различных объектах внешней ср<-дк показал относитель-"0 низкую частоту вотречаемости сульфонолутилизации. Ни один музейный и клинический штаммы не проявляли деструктивной активности в отношении сульфонола-45. Подобные штаммы не обнаруживались и среди микроорганизмов, выделенных из речноР. воды, содержащихся в активном иле городских очистных сооружений, очистных сооружениях промышленных предприятий. В то же время пробы, взятые на территории комбината по производству CMC, постоянно содержали грамотри-цательные бактерии, утилизирующие сульфонол-45.

Поиск штаммов-деструкторов загрязнителей окружающей среды неразрывно связан с созданием быстрых и надежных методов их выявления. Предложенная для этой цели модифицированная индикаторная среда K.Ohwada (рацпредложение № 8сГ7 БН13 СМИ от 9.09.1983 г.), как показали наши исследования, имеет ряд ограничений для широких скрининговых исследований по селекции из окружающей среды микроорганизмов-деструкторов сульфонола. Ее малая пригодность для этих целей обусловлена прежде всего тем, что процесс выделения деструкторов приходится проводить в несколько этапов, наконец, индикаторная смесь, используемая ка последнем этапе,содержит соединение, бактерицидное для микроорганизмов. Это вынуждает проводить трудоемкую операцию по предварительному переносу исследуемых колоний на дополни™ельнуи среду. В связи с этим нами была разра-

ботана индикаторно-селективная среда с минимальным содержание» тательных компонентов, индикатором бромтимоловым синим и еулы! лом-45 от I00-40G г/л в качестве единственного источника угле; серы и энергии, ¡микроорганизмы, утилизирующие сульчонол—¡ó. Jo; руют на этой среде колонии желто1'о цвета с желтым ореолом, п^: лящимся на 3-10 сутки культивирования. Это позволяет легко и чить их от колоний других прототрофных, устойчивых к суль^оно бактерий, присутствующих в исследованном материале, которые i| руют на этой среде колонки под цвет среды и с'елсго цвета. Трогаемая среда позволяет вести поиск деструкторов и других АНкЬ частности, додецилсульфата натрия, и метаупона. На данную с peí лучено положительное решение на выдачу авт орско!о свидетель-;! от 13.(77.19cf7 по заявке .г 4£сС.'-7о.

Определение чувствительности штаммов, способных к роет} нг дикаторной среде, к сульфонолу-40, некоторых грамотрицательнь бактерий-деструкторов ароматических веществ, а также коллекщ ных культур методом серийных разведений в среде LH показало его минимальная ингибируоцая концентрация после 4Ü ч инку'оац: стааляла 100-400 иг/я.

1ри штамма, выделенные из почиы на территории завода C.'JC, более активно утилизирующие сульфонсл-4Ь на минимальной сред на основании определения комплекса морфолого-культуральных и зиолого-биохимических свойств были идентифицированы как Paei monas putida 2', Peeudomonao эр.i, Alcali¿enea denitrificac: ГШ-I. Сравнение биодеструктивной активности в отношении су ль ла трех отобранных штаммов показало, что в наибольшей степе) выражена у штамма ¿lcaligenes denitrificana IU-Í. От i' Kyj pa при температуре 30°C б условиях аэрации в минеральной ср> за 7 суток вызывала разрушение 44' суль-1 онола, внесенного е культивирования (250 мг/'л!.

С цельо повышения деструктивной активности штамма a.denitri-ficans Гш-1 мы использовали нетрадиционный прием индуцированного мутагенеза - кратковременное (3,6-4,8 с) воздействие микроволнового излучения дециметрового диапазона. По данным В.В.Игнатова с соавторами (1978) воздействие этого фактора на бактерии сопровождается быстрым нагревом среды и микроорганизмов (до 95-100°С), что ведет с одной стороны, к интенсивной гибели клеток, а с другой стороны, возникновению среди выживших особей разнообразных мутаций, затрагивающих практически любые микробные характеристики. Проведенные нами исследования подтвердили высокую чувствительность A.deaitrificans 11Г—I к летальному действию микроволнового излучения СВЧ-диапазона. Одновременно было обнаружено, что при экспозиции 4,6 сек с частотой 0,4Х на число выживших клеток возникают стабильные клены, характеризующиеся как в большей степени деструктивной активностью, так и укорочением сроков этого процесса. Селектированный штамм был обозначен нами A.denitrificans 1UI-2.

Нами Оыло проведено изучение деструктивной активности полученного стемна в минеральной среде при различных условиях культивирования: рН среды 2,18-11,9, концентрация сульфонола-45 60-400 мг/л, температура культивирования от 25 до 42°С, величина посев-

о о

ной дозы 10 -5-10 кл/мл. Установлено, что в условиях аэрации наибольшая деструктивная активность штамма A.denitrificans IHI-2 в минеральной среде-проявляется при рН 7,2, посевной дозе 10^ кл/мл, температуре 30°С, концентрации сульфонола-45 250 мг/л. В этих условиях, его концентрация в среде снижалась за 5 суток на 34$ с 250 до 40 мг/л (рис.1).

Для изучения спектра деструктивной активности штамма A.dealt-rifloans ПИ-2 нами были проведены эксперименты по утилизации

С, мг/л

РисЛ. Динамика разруиения сульфонода-45 штаммом

Ж.авпИг1Г1о«аа Ш-1 и его мутантом ГШ-2:

А

I - ПВ-1; 2 - ПП-2.

этими бактериями различных поверхностно-активных веществ и ароматических соединений. При этом установлено, что исследуемая культура наряду с сульфонолом-45, активно утилизирует только серусодер-жащие АПАВ: ДРН и метаупон. Оба соединения, внесенные в жидкую минеральную среду в концентрации 1000 и 500 иг/я соответственно, при оптимальных условиях культивирования полностьо разрукались за 1-2 суток.

Штамм i.denitrifleans ГШ-2, деструктор сульфонода-45, депонирован в Центральном музее промышленных микроорганизмов (ВШИ генетика, г.Москва, коллекционный номер В-2842) и защищен авторским свидетельством № II84862.

Нами проведены исследования по Еыясненкэ мехакззмоз генетического регулирования признака биодеградации сульфонола у штамма A.denitrificans ПП-2. Для решения этого вопроса использовали общепринятые (Chakrabarty A.U., 1972; Hewetson L., Dunn H.H., Dunn я.в., 1978; Kiyohara H. et al., 1983) критерии - стабильность признака в условиях культивирования на полноценных и селективных среда* и при действии мутагенов, определение наличия

плазмидной ДНК электрофоретическим методом и с помощь» электронной микроскопии, выявление трансмиссивности исследованного признака при коньюгационном скрещивании я при трансформации плазкид-коя дак.

Популяцаоикй! анализ более 2000 югокоэ A.denitriflcane П25-2, полученных путем 3-5 рассевов исходного nratssa на агаре lb, показал, что культкэнровакжз на неселектиэноЯ средо не сопровождается утратой признака суяъфокоаутахкзацпа. Воэдейстгвэ суббахтерно-статэтескмх йонцэктрацлЯ агридгнозого оранжевого вхп штоигцгкэ С позволило с частотой 10-15? соответственно получеть каокы со стойкой злзтггцягЯ этого ервзкзка. НаЕболькгЯ выход влкыитантеэ

ia

со стойко утраченной способность» к биодеградации сульфонояа-45 был получен при облучении дециметровым диапазоном СВЧ 10^ кл/мл физрастворе в течение 4,6 с. Частота выхода бесплазмицных клс нов в этих условиях достигала 85%. При меньших экспозициях утра? признака биодеградации сульфонола-45 происходила с меньшей част< той. Следует отметить, что наряду с клонами, утратившими способ ность утилизировать сульфонол-45, выявлялись и варинаты более а тивно использующие этот ПАВ в качестве единственного источника углерода, серы и энергии.

Выше изложенное послужило основанием для предположения плаз» ной природа детерминирования признака деградации сульфонола-45. Это предполокение получило подтверждение при эдектрофоретическ< исследовании ДНК втамма A.deaitrificans ПЗ-2 и его злнминанп 1рис Z), а также электронно-микроскопическом анализе ДНК, выде. кой из этого штамма при ультрацентрифугировании в градиенте хл ристого цезия. Обнаруженная в этих экспериментах плазмнда уело но обозначена как pGS. В процессе исследования были изучены кие молекулярно-биологические характеристики плазмиды биодегр! ции pGS, как молекулярная масса, плавучая плотность плазмх; ной ДНК и процентное содержание гуанина и цятозина. Молекуляр: масса плазмиды, определенная электрофоретичаским и электронно; роскогичесгаш методами, составила 95-96 Md. Плавучая плотн штзмидной ДНК в растворах хлориитого цезия равна 1,737-1,739 что свидетельствует о мольной доли гуанина и цвтозина равной 78-8СЙ. Плазмнда рСЗ трансмиссивна и при совместном кухьтю вакни с частотой передается реципкентным втакиая 1

tide АС 340 и В.coll С600. Ори использовании в качестве ] пиентов Бтаммов P.putIda 394, В. coll J53, ¿62 Col в, MI7 pe дача плазмиды pGS hs наблвдалась. Подучешше рекомбинант

Рис.2. ЭлектроФореграмма штзкидкых ДНК штаммов А.<1еп1Лг1Г1-соп5 ГШ-1 и ГШ-2, а также их элкмикантов, полученных под воздействием китомииина С (12,5 ыкг/ил) и СЗЧ-облу-чекня 4,2с) по методу Экхзрда:

1 и 6 - ДКК плазмид штамме A20spirilli.ua ЬгавНепве ар. 245 (мол.вес 300, 130, 120, йб иа );

2 - элиыинант 11Е-2 (митоцицин С); 3 - то же (СЗЧ-облу-чение); 4 - ДНК штамма А.4епПг1Г1с*са ГШ—I;

5 - ДНК штамма А.ЗепПх^Псапв ГЕ-2; 7 - ДНК плаэмида штамма Е.соИ С600 ( НР^, мол.вес 40 Ыс1 ).

ли нестабильны. Их рассев на средах без сульфонола-45 сопровок-дался утратой признака сульфонолутилизации. Частота спонтанной элиминации признака деградации сульфонола-45 была высокой и у | комбинантов P.putida АС340 составила 12-15?, a E.coli ¿62 1 20 до 25%. Рекомбинанты E.coli CG00 по признаку утилизации с фонола-45 были получены и в опытах по изучения трансформируют активности ДНК плазмиды pGS. Выход рекомбинантов был невысок (5-10 клонов на I мкг плазмидной ДНК). Однако полученные рекои нанты стабильно сохраняли признак утилизации сульфонола.

В литературе имеются сведения о биохимических путях разлож< АБС, изученные на различных микроорганизмах - деструкторах (Ci Е.В., 1981; Swisher R.D., 1970; Willetts Ж.J., 1974; wi letts A.J., 1976; Willetts A.J., 1972). Показано, что в цессе окисления етого ксенобиотика монет происходить окислени алкильного радикала, деоульфонирование, расцепление ароматиче го кольца по классическому пути через орто- и мета-пути разлс ник с различными вариантами ( Cain В.В., Willetts A.J., Bird I.A., 1979; Willetts A.J., 1974). В то же время лишь в ной работе указано, что разложение АБС у F.teetosteroni де' минируется генами плазмиды pASL ( Cain к.В., I9GI). В ев: с этим представляло интерес выяснить,контролирует ли у A.dei rificano ГШ-2 выявленная нами плазмида pgs процесс десу каровашш. Проведенные нами эксперименты показали, что перве ной реакцией деструкции сульфонола A.denitrificans ГШ—2 р является деоульфонирование с освобождением сульфита и образе ем окевфенклалкановой кислоты. Очевидно, что эта реакция ко] лируется генами плазмиды pGS, так как элиминанты, утроят пхазыаду pas не способны индуцировать sty реакцию. Одновр но, методом спектрофотометр)® нами показано, что длительный

такт с сулъфснолом-45 сопровождается также разрушением бензольного кольца. Б процессе культивирования A.denitrificans ГШ-2 в присутствии сульфонола-45 появляется дополнительный пик поглощения в области ГСО нм. Извеетно, что пик поглощения при "60 км характерен для цис, цис-муконовоЯ кислоты ( Davey I.E., Gibson D.I., 1974). Поскольку з наших опытах не отмечалось появление пика поглощения при 375 нм, характерного для ?-гидроксимуконового полуальдегида, мы пришли к заключения, что разрушение бензольного кольца штаммом A.denitrificans ПП-2 идет по ерто-пути расщепления ароматических соединений.

Методом тонкослойной хроматографии показано, что разрушение сулъфинола-45 штаммом A.denitrificans ГЕ-2 происходит путем утилизации высокомолекулярных фракций с сохранением низкомолекулярных компонентов исходного вещества.

С иелью изучения потенциальной возможности использования селектированного нами штамма A.denitrifican3 ГШ-2 для очистки сточных вод от сульфснола—15, мы проэели модельные исследования в реальных сточных водах гальванического производства, фабрики спортивного трикотажа, банно-прачечного комбината. При этом показано, что в процессе культивирования штамма A.denitrificans ГШ-2 в образцах сточных вод, содержащих значительное количество (250300 мг/'л) АПАВ происходило активное разрушение последних, и через 5-7 дней содержание их снижалось на 50-60^.

'Изучение жизнеспособности штамма A.denitrificans ГШ-? в сточных водах показало, что даже через 20-25 суток (конец срока наблюдения) концентрадая внесенных бактерий оставалась довольно значительней (до 10^-10® кл/мл). При этом штамм обнаружил высокую конкурентоспособность по отношению к естествегаой микрофлоре стоков. Позитивным моментом использования A.denitrificans ГШ-? для

очистки реальных стоков от АПЛВ является т :кже то, что окрашен стсчнке вода фабрики спортивного трикотажа в этих условиях обе цвечивались. Однако, использование предлагаемого штамма не пp^ дило к полному удаление АПАВ из сточных вод промышленных и быт вых предприятий. Очевидно, это обусловлено присутствием в них верхностно-активных веществ, не входящих в спектр деструктивж активности А.<1ег11гг1Г.1сапз ПП-2.

Таким образе;.-, наши исследования убедительно показали, что кробнея локальная счистка сточных вод предприятий, производящ и использукпцих ЛПАВ, вполне реальна и весьма перспективна. Пр денные исследования в сбласти микробиологии, биохимии и генет микроорганизмов-деструкторов позволит разработать технологию очистки, полностьп предотвращающую загрязнение окружающей с ре от таких широко распространенных ксенобиотиков, как АПАВ.

вывода

1. При изучении 579 колле.^ционньтс, клинических и вкделенм из объектов окружающей среды штаммов> показяка неравномерное распространения в биоценозах культур, способных к утилизации Более насыщены штаммами-деструкторами АПАВ биоценозы, постоя подвергаемые воздействию этих веществ.

2. Разработан способ выявления штаммов-деструкторов аниоь поверхностно-активных веществ на основе алкилсульфатов, алм эолсульфонатов, а также азотсодержащих АПАВ (рацпредложение СМИ от 9.09.1983 г., положительное решение по заявке на полз агторского свидетельства » 4282275/30-13 115790 от 13.07.191

3. Отобраны 3 птамма, способные использовать сульфонол-4!

качестве единственного источника углерода, серы и энергии. Ьти штаммы идентифицированы как ¡.'леиа./ЗопаБ Ь: .А, Р.рШЫа 2', А.йе-п^гИЧсапэ П11-1.

4. Методом индуцированного мутагенеза получен стабильный штвым д. ¿епзЛгйПсапз ГШ-2 с повышенной деструктивной активностью в отношении сульфонола-45. Установлен оптимальный режим процесса утилизации сульфонола-45 этим штаммом, при котором за 144 ч содержание сульфонола-45 в среде снижается на 842- Штамм А.асазЛг1:~1-сапз 1111-2 депонирован в Центральном музее промышленных микроорганизмов (ВНИИ генетика, г.Москва, коллекционный номер 3-2842) и защищен авторским свидетельством № 1184852.

5. Установлена плазмидна.1 ::рирода детерминирования признака утилизации сульфонола у А.-^ nj.tr: Г1еапз ГИ-2. Трансмиссивная плазмида риБ несет гены деградации сульфонола-45. Молекулярная масса плаэмиды рСЭ составляет 95-96 Чс1. Гены плазмиды Р^Э контролируют первоначальную реакцию биодеструкции сульфонола-45 десульфонирование.

6. Показано, что А.йепдЛиПсапв П11-2 сохраняет деструктивную активность, конкурентоспособность в сточных водах бытовых и промышленных предприятий, содержащих АДАВ, что обуславливает возможность его применения для очистки окружающей среды от АПАВ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Горелик Э.В. Микробиологическая деструкция анионных синтетических ПАВ //'Биологический фактор - производственная и окружаи-щая средо - здоровье человека: Тез.докл.Всесояэ.конф. 9-П октября.- Ы., 1984. - С.186-187.

2. Горелик Э.В. Грамнегативные бактерии, активно разрушающие сульфонол //Гибридные плазмида и экспрессия плазмидных генов:

Тез.докл.IX Всесоюэ.совещ.по прогр.пПлпзмида". 18-Л ноября М., 1984, С.99 (в соаьторстве с Подг рноЯ Г.П., Шендеровым ]

3. Горелик Э.З. Биодеградацчя поверхностно-активных веще //Достижения микробиологии - практике: Тез.УН съезда Всесоо ройиол.об-ва.- Алма-Ата, 1985. Т.Е. С.44 (в соавторстве с О ковской).

4. Горелик о.В. Микробиологическая деструкцич знионогенн //Актуальные вопросы гигиены в сельскохозяйственной произво Изд-во Серат.ун-та, 198Г7. С.14-17.

5. Горелик Э.В. Деградация ксенобиотиков антропогенного хоядекия микроорганизмами природных биоценозов //Актуальны« просы гигиены в сельскохозлйстэенном производстве.- Изд-во ун-та, 1987. С.18-23 (в соавторстве с А.Л.Барковским, В.ИЛ невнчем, С. В .Таковской).

6. Горелик Ь.В. Штадш Г21-2 - деструктор алкилбензолсулы! //Вопросы биохимии и физиологии микроорганизмов.- Изд-во С! ун-та, 1987. Вып.II. С.62-66 (в соавторстве с Б.А.Шендеров!

7. Горелик Э.В. Действие мощного микроволнового излучен! втвшы-деструкторы сульфонолв //Механизмы биологического д> электромагнитных излучений: Тез.докл.сиил.27-31 октября 19 Пущино, 1987. С.185 (в соавторстве с Г.Ы.Шубом, В.И.Нанасе Б.А.Шендеровым).

0. Горелик Э.В. Выделение штаммов-д' структсров суль|онс * характеристика их биологической активности //Прикл.''и0хими

ро"5иол.- 198Э.- Т.ХХУ, вып.6.- С.В43-046 (в соавторстве с Корхеневичем, Г.Ы.Шубом, Б.А.Еендоровым).

9. Горелик Э.В. Защита водных объектов от загрязж-ний г ностне-активными веществами с помощью микроорганиэмог-дест ров //Экологические проблемы Волги: Тез.докл.регион конф.-

тов, 1300. С.257 (в соавторстве с О.В.Турковской, Г.М.Шубом).

10. Авторское свидетельство № 1184052 "Штамм Л1са11вег"Б йе-п1Лг1Гз.сапа ПП-2, испсльзуемыЯ .для очистки сточных вод от суль-фоноля" (в соавторстве с Б.А.Еендеровым, В.И.Панасенко).

11. Авторское свидетельство на заявку * 4282275 "Способ выявления микроорганизмов, разрушающих сульфонол". Положительное решение ГЙ ХСР по делам изобретения и открытий от 13.07.1987 г. (в соавторстве с Г.Ц.Еубом, А.Л.Еарчсрским).