Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

МОРФОЛОГИЯ И МОРФОГЕНЕЗ ВИРУСА ГЕРПЕСА ИНДЕЕК

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "МОРФОЛОГИЯ И МОРФОГЕНЕЗ ВИРУСА ГЕРПЕСА ИНДЕЕК"

ISSfo

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ им. Я. Р. КОВАЛЕНКО (ВИЭВ) .

ВСЕСОЮЗНОЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК имени В. И. ЛЕНИНА (ВАСХНИЛ)

На правах рукописи ДЛЯ СЛУЖЕБНОГО ПОЛЬЗОВАНИЯ

экз. № 000024

•I4

УДК 576.558.13.09

МАРЫГИНА Алла Федоровна

МОРФОЛОГИЯ И МОРФОГЕНЕЗ ВИРУСА ГЕРПЕСА ИНДЕЕК

03.00.06 — Вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

MOCK ВА —1S87

Работа выполнена во Всесоюзном научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности Госагропрома СССР н~ во Всесоюзном ордена Трудового Красного Знамени государственном "научно-контрольном институте ветпрепаратов Госагропрома СССР.

Научный руководитель: доктор биологических наук СКА-ЛИНСКИЙ Е. И.

.Официальные оппоненты; доктор биологических наук

ВОРОНИН Е.-С,-(МВА), кандидат биологических наук НАДТОЧЕЙ Г. А. (ВИЭВ)

Ведущее учреждение:' Всесоюзный научно-исследовательский ветеринарный институт птице водства „

Защита диссертации состоится «У » 1987 г.

п « час. иа заседании специализированного совета-Д020.28.01 по защите диссертации на. соискание ученой степени доктора наук при Всесоюзном ордена Ленина научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии, имени Я. Р. Коваленко по адресу; 109472, Москва, Кузьминки, ВИЭВ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ.

Автореферат разослал » 1987 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат ветеринарных наук Ф, Г. ТЕРЕШКОВ

. , ■ ' ОВЬДЯ ЗДРШЕРИСШЛ РйВОТЫ . ' "

Актуальность те.^;, Ликвидация инфекционных заболеваний птиц,, в адсг.е. Ос-теш31 Упрека, является одной из зазэдейта;; проблем . птицеводства. 3 наетояЕке. время единственна зффехтишши средством спе^фическоП прсф!лакт)Ш1 бо.тезян Марека являются влрусвакцины. Наиболее 1з;роко яспользуется ра:«51кэ из вируса герпеса индеек-(Коровин Р.Н.,. Членский В,П.',19Ы).

Создание-ноаьас въдоко¿ффекткэнт;х средств' специфической профиле к гл1:и и с о ве р^к нет во ва нке сугкетвувйих связано с познанием* особенностей репрод/кияк вируса а различиях биологических системах. . ■__'..(

За последние годы достигнуты значительные успехи в выяснении тоню1х механизмов взаимодействия вируса с плёткой (Авакяи А.А.,

Ьыковский А.4. ; [¿уоладэе А,К.,. Маевскея Т.Н.', 1971; Быков-;

' * * \ ский А.О. с соавт*»107э ; Соловьев с соаят.', 1979 ; Бочаров

с соавт.,Х^?о2 ; Сергеев В.,ц., Срдянкин'Б.Г.,1983-)»

В литературных исто*чгш:ках ад» юте я сведения о морфологии, не--■ которых деталях морфогенеза .едруса герпеса иидеек и использовании его в тщ-шопро^илактико болезни Марека ( </Ия еаУа *

аг ', 1*71 ; Ох&л'о /С, ое. , 1&?Й, 197?, 19ВI; Лукина В. А .с . соааг., ¿'¿74,1576 ; Ьдехериан'Б.Е. с соавт.,1976 ; Токарик Э.ф. С\ ссавт;,1976). Те« иб менее, многие вопросы и, особен но, репродукция вируса, в культурах клеток перепелиных шлбркснов изучены слабо, а данные; относ яш ее я к зкеперкментальной отработка технологи ческих параметрое изготовления вирусзакцкня против белзэки Марека в доступньк литературные: источниках отсутствуют.

■ Изучение условий культивирования вируса герпеса индеек (£ГЙ)

представляет не только теоретический но и дада»* интерес и связано с' познанием тогаах механизм< фшдаяэдурэййтетцраядаса &

влетк&ми к влияния на качество и количество репродуцируемого вируса таких основных факторов как вадби алогической системы, и производстве кнцй гзтдмм, велхчшга зарагдзкей дозы, продолжительность і^л&аишроваюіл/ сдосоЗ дезі:нтег^ г

Цель и 'задачи иседбдоптт^. З свези с ■ ВЕгзеуказаннш» перед; наци бшш поставлена цзль с псьоткію методов электронной микроскопии изучить морфологию к морфогенез зируса герпеса индеек на разнас этапах технологического процесса при и з го то влети вирус?-вакцины продав болезни Марека. Для решения бшгл поставлены сле-гдуявие;задачи:; ' -

• ' I.. Изучить,ультраструктуру вируса герпеса индеек. ,

2. ИЗУЧИТЬ Блигапю СроХОЕ ^льтивировадая и-множественности заражения ш . морфологию и;ыорфогенеэ зируса герпеса индеек.

' 3. Изучить улътраструктурнуо характеристику изменений жфі-ізірованнівс клеток л шруса герпеса индеек при дезинтеграции с поуоаьв криомзтода, 'ультразвукоі;оіі оОработіаі и' их сочетанием' ВОЗДЕЙСТВИИ.

• < • (

і Изучить ультраструктуру вируса герпеса индеек'в маточных

* * ' л

сериях, зирусвавдшы против боле от Марека. .

Нау^на.^; новизна.' 3 "сравнительной аспекте з динамике культивирования'изучен морфогенез з вируса герпеса индеек (ВГИ) и ультра-структурные:изыененид. ИНфЯЦИрОВаННЫХ км клеток культур перепелиных» утиных и куриных эмбрионов ; изучено-влияние множественности заражения на морфогенез БГИ и ультраструктурные изменения инфицированных клеток. Получены данные о-характере.ультраструктурних изменений шфіцарованньк клеток и ВГИ при-дезинтеграции с^ помощью криометода, ультразвука.и их сочетанном:применении. На. основе полученнъи данных разработан метод количественного определения в ультратонких срезах ин^трфованных клеток частиц ВГИ-

разные стадий- развития; изучен морфолога чес кий состав вируса в иіаточнїос:ссриях ЕИрусвакгршы ; .установлена зависимость между ко личестаом вирусных частиц различной ультраструктуры, количеством ■ инфицированных'клеток и шфекрюнностью препарата* На основе порученных результатов дано обпертентал ьиое сбосновакие оятшаль нызс сроков'культивирования вируса, эиражгпгвй дозы и параметров дезинтегр^адги ик^идаровэнньж ВГЯ тот ок. .

Практическая г.екпость. йатесиьлы диссертации использованы,, при разработке технологи« изготовления -и контроля вирус вакцины' против беяезни Марека. *

Разработан и внедрен в практику-метод элентрешно-ьшкроеконического контроля маточного штамма ВРИ» всгедтій в'"Инструкцию 1 по-изготовлеш» к контролю жидкой кудьтуральїюії вирус вакцины 41

против Йолезни Марека из отаьыа ІС-12.& вируса го^еса индеек", ' * . * ^ утвервденну» ГУБ МСл СССР 5 декабри 1960 года» и*во "Временную

инструкцию по изготовлению и контроле сухой кудьтургяьноЯ вирус-вакцины протне болезни Марека из ІС-ійб вируса герпеса

индеек",, утвержденную ГУо МСа СССР 1 я-сил 1954 года.

Апсдоацця работы* Осноглц.*е полишення диссертации доложены на 1-й Всесоюзной конференции "Няучні-є основы технологии пр с численного производства ветеринарних биологических препаратов4 № ос хва, І5?5г, ), на 1іі-й конференцій нолодьк учених « спсюшлнс-тоВ'биологической прсмшденности (¡¿+їлкоао, 19?Эг.)» на і 1-Й Всесоюзной? конференции "Научные ссновд технологии прсыыггяенного йроиззорртва ветеринарных биологических препаратов (Москва, í98Iг¿)i на Всесоезной конференции "Разработка, апробация и государственный контроль аетерккарннх препаратов" (Иосква.іеЄІг-ї

Публикации« По результатам проведенные исследований сдуй- , ликоеано 7 работ. ,

.• Объем и структура діссер^а^у. feccep-iaiçîn' изложена ка 188

страницах капшіопиеного текста, состоит иг, б Беден*-; я, обзора ли... " ■ - V ( •

тературы, материалов к методов, результатов исследования» обсуждения результатов, внводой, практических предложений,, списка литературы. Диссертация и ллгое трлр ока на 7 тзблицзни; 69 рисунками, Список литературы включаеї\ 238 источников, s тем числе (I52 . иностранны?:* ' '. 1 " -. . ■ * ■

_ , С,ШСТВ2ННІЕ ИССЖДОЗАКІій

Настояяал .работа'выполнена в соответствии с к з учі:о-тем этических плзнек БШиТИНі л лат.кется коталекскья. ксслсдова-нй& по проблеме 0.69,05., раздел. С4.Н.7В "Усоверазнствовать и. внедрить Б практику ШС ОКС офі*Й К TV! B'f îy» В5КІ31НУ против б о лез ш

ч г i ,

' Марека". - , . . ' ' '

! МДЛЕгЙАЛК К'МЕТОИ '' .

1 В исследованиях использооалгі вирус .герпеса индеек (ЗГИ),

штаммы ФС-І26, Кэрбовгкс и отечеетьенньгїї позлят А-2, выделенный \ ' ' ■ - . старшим^ научным сотрудником лаб.клеточі¡ух- культур и Сиотехноло-

гви-;БШиТШ1 Перемятиной А.Д.. ;

. . Вирусологические исследования проводади ка - бззе лпО.^нсер

' J ^

шрования биопрепаратов В££&'ГИЫ1 (зав.л.ха«д.б и ол.иay:t Тока-

рик Э.Ф.), лзб,клеточных цультур к биотехнологии ВййяГИШ '

• (зas.лаб.канд.ме д. нау к Лу:шна H.A.), -гір:! участии ст.научн.сотр. * ■ "" / 1 Перемитиной А..Д,.» Слепенко Т.Б., канд.биол.кзук ПисеевоЯТ.П. .

Морфологию и морфогенез БГИ исследовали б пэрвично-трипси-

низироваикьос культурах клеток перепелиных, утиных и куриных

эмбрионов через 3,5,10,20,40,60 ш. и 2,3,¿0,24,40,72,76,90

часов после инокуляции вируса.

А ' ..■■:.

В опытах-по исследовании влияшгя доз заражения на морфогенез

ВГИ штамма ЇС-І26 и ультраструктуріше изменения инфищрозашах ■ і "і „

клеток множественность заражения была равной .3,75, 37,5, 75,150,

9 ( " '

300,375 и І5С00 40Е/см8'при постоянной посевной концентрации клеток», равной. 500 тыс.клеток/см*"- и продолжительности культивирования 24-168'часоз посла .инокуляции вируса.. '

¿ля дезинтеграции тфіігірсшншх .БГИ клеток использовали ■

4 ■ * * .. ■ одно- и двукратный крнскетодЧзаморллзівание -40°С, оттаивание

20°С), ультразвуковую обрзоотку после механического съема монослоя (частота 15,</¡¡,35 кГц, интенсивность 2,5-3,0 Бт/см3, про- , долкительность озвучивония ЗО,60,120.сек.). Дозе'заражения -150-300 іСВ/см^, посевная концентрация - 500 тыс.клеток/см^, продолжительность;культивирования - 4В-72 часа после инокуляции ■ вируса. Мор^ссостав изучали на 17 маточных сериях вирусвакцины.

Улектронно-микрсскспическяе' исследования проводили методами негативного контрастирования к'ультратонких' срезов* Для приготовте гая ультратонких срезов клетки центрифугировали.при 1,5-*: тыс.ос/кин. в течение 15 мин,-Осадок фиксировали ЗЙ раствором глутарового альдегида ка- растворе-Хонкса,.постфиксироеэди .

раствором четырехокиси осмия на буфере Шестранда, обезвоиива-ли в спиртах возрастаюизй концентрации и заключали в эпоксидные смолы по /7?о&єуі-Ла&еъ 1064). Ультратонкие срезы, получали 'с псмошью'стекляннах нокей на ультратоме КВД1 (Швеции) и контрастировали их. "¡>% раствором уранила цэ та та и 0,3$ раствором цитрата свинца

,1965). ¿¿я *

негативного контрастирования использовали метод //ац -

Препараты изучали & злектроннсм микроскопе ДЇЕМ-ІООВ (Япония) при ускорявшем напряжении 60 кВт и инструментадьтпс увели-

чекиях 5-60 тыс,

< I

При етитисгачзской обработка рззультйтоэ (совместно с канд. технич.наук ?убанш S.A. и ш1.каучн.согр. Богомоловой-М.Г.) нс-■пользовали коррелш;иошо-рсгрьссио:шйЯ яндлиз :i метод наименьших квадратов (Ä«oi:coh Н,„ Лион <5.,I9b0 ; J!h:ckh Г.5.,1330),

' РЕЗУЛЬТАТУ ИЗОЕДОБ^ВШ

I. Ультростоун^ура ьясусе горпеса индеек i

" В ультратонких средах инЗ»цнрогйкшэс ВГИ клзток'отмечали.. шрусныа частицы с различной ул ь грг» с тру з стур э йчто послужило ocKoasrete.'j 'дал раз деле! am их на £ группы-- нэполнце и полные формы ЗГИ. ■

Группа Г(неполные .Еируслыо частицы) вкл^чгла 3 подгруппы -

- пронуклесидн, кзпаиды и *о"^еокапс;нди. , :

Подгруппаiпронуклеолдэв представлена уернисть?я1 гранулами

диаметра* 30-40 ¡ci, в некоторых оту.еюатсл. центрально-располо-

аенная вакуоль. . <

t

Поргруппа хлпсияов представлена электронно-оптически проз- . рачкыюг замкнутыми сферами или пзстигрпнииками диаметром■ 90-IÖ0 нм. Толшна капскдцо;! оболочки достигала Х&-Х7 им.

Подгруппа ir/>t.i с ска постов, ß нуклескалстдзх выделено 5 форм цуклесида, '

1. Куклеокаг.сида с хояьцйе-лднцм нуклгоидон. в виде тонкостенного кольца диаметр см около 40 нм.

2,' Ну кле окапоиды с гранулярным нуклеоидсм. Предртавллетск ионмоат.« диф^ренцисовать нугсшоиды о виде

одной цэнтрцльно-раополоненноИ гранулы4 2-х.гранул, прилегавших ■к противополсйшш полюсам напсвда, либо 3-6-ти гранул,-локалиэо- " вашихся на знутрошгзй поверхности калсида к придаваквих нуклеои-

ду лолзсгную или аваздча^ув форму.

3,- Нукл$окапсидн с ¿зрагментарнум, куклесидом. Нуклооид включая мелкие гранулы и фрагменты (£мламентоз:шх структур.

4, Нуклеокелеи да с тароиднкм 'нукдесидом, аседстйвденньм стерзкнегидной структурой длиной 70-72 нм, обвитой 2-3-х ииткозой спиралью. В некоторых цуклеондах еадаы стержневиднхз структуры без спирали.,

5, Куклеокепсиды с фибриллярный нуклеейдом о виде мелко-' гранулярного.материала к тонких фибрилл.-

Группа Z (полные внрусньй част::цн> иключалс Z подгруппы -- ядерныз к цитоплазма г. (чсскяе 'зирисны. т

, Подгруппа .пЕепнгя dü^hoho» [ »

¿ля ядернкх еирионои характерно наличие Н1'КЛ90КС1:0;:и' с фибриллярным* pese гранулярным 1(уг£леэидсм t: суперкапслдноК оба-^ лочкя. Участок, ограниченна капе и дек с одной стороны и супер-капсиднсЯ оболочкой с другой, пре-дегаслен эоней ¡какой электрон-но-оптическэя. елотисстк." íuaiietp ядгрньк Еириснов колеблется ' 'в пределах IoO-ItO ií.i,форма - сферическая или слегка вытянутая..

' подгрупп? t ¡л тол л а ?,чо т и "о с к н х вирионов ■ .

'' ' < ■ * ' ■

* ч

ШтсплазмаП!ческие сирлонн д^норулзсеали з цитоплазме и о межклеточных пространствах а гиде скоплений или поодиночно. Харак тернам признаком вирионов является наличие эдексронно-оптически плотного иатриксз*, прилег аиле го к капсиду. Основная часть вирио-нов имела однослойную супернапсидпук оболочку с шиловидными вьятупами либо утолшнну» слоистую ctfccio^cyv Реке оболочка пол-■ностыо или частично стсутствогада.

В сулзрЕсапсиднув оболочку» рек правило, буя заключен'один

нуклеокапсид, Иногда-наблвдали полинуклеокгпевднке вирионыс \ 2-3-мя нуклеокалсидаьш. Нухлеокапснды характеризовались наличи-еынуклеоиди фибриллярной структуры. Диаметр цигоплазкатичесних вирионов 200-320 нм. * , ■ . '

' , * г i ' ' ' * ь *

! • Анализ полученных данных свидетельствует о Бирпкенном поли> < г I • ,

«орфизме частиц вируса геопеса индеек.

• '■ ■■ 2. Влияние сроков культивирования и - множественности зара- . кения на морфолога и моногенез-вируса герпеса-индеек. ■ '

2.1. Морфогенез вируса герпеса-индеек штаммов 'ГС-126, Кар-бозакс, отечественного ияолятаА-2.и ультраглрухтурнме-изменения ' инфжгиропанннх ни клеток.. , ?

• Спустя [0-20 и;:нут после инфицирования культуру клеток в-, мелклеточнкх пространствах;обнарукивали^скопления нухлеокапси-дов и пи топл:*р этических вирионов,. а такке вируснке'часткда. адсорбированиям на плазмолеше. У'адсорбированных цитоплазматичес-

ких вирионов наблюдали разрыхление электроино-опгически плотного

' ► '' ' ' - \ "

матрикса:и частичный или полный лиэис суперкапсидной оболочки, что, отражает процессы, свгоанш.тв с проникновением и депротеини-зацией. их. . ■"...., .

' - Спустя 2-3 часа в: мегллёточЙ1!х пространствах'регистрироза-'ли скопления нуклеокапсидов; у которнт отсутствовали какие-либо ультраструктурнке гакэнения; Ульт'раст^луктура'клеток также оставалась-без изменений, ■ • • ■

Через 16-24 часа после заражения обнарукивалиполикариош!-тн, в:ядрах которых отмечали слабо выраженную каргичатяо хроматина, участки виропласта«' отдельные пронуклеоидн,'капсидьт и нук-леокапсиды. Пемногочисленниецитоплазматическиевириот: локализовались в клетках и -негсклеточных пространствах;.:

При культивировании до 48-54 часов в ядрах клеток .отмечали многочисленные ■ пронухлеоидя,. располагаЕшиеся дяф|узнй .или в виде кристаллолодобньл укладок, множественные скопления куклоокалсидов

." ■ ■ i \ . \

с различной ультраструктурой нуклеоида и сирионы зо внутриядерных вакуолях. ' ■ - . •

.Изменения ядер характеризовались шраженной ыаргинациеЯ хроматина, скикешем электронно-оптической плотности нуклэсплазмы, незнаадтельнш.расширением першуклеарного "пространства.

Вблизи комплекса Голь;даги расширенных цистерн гладкой эндо-плаэмаглческой сети регистрировали■скопления алектронно-плотного матрикса и-мембранных структур, сформированных из одиночных, шпг ' черсду»смхся осмисфильных й осмиофобных слоев, цуклеокалсиды и штоплазматические вирионы.

3 ядрах клеток, находящихся в состоянии митоза отмечали-появление конденсированных хромосом, диссоциация ядрыпек, разрывы в ядерной оболочке и преобразование ее в плоские вакуоли, а в зонах смеиения нуклео- и гиалоплазмы! -.капсиды и нухле онапскды, что монет свидетельствовать о выхода вирусных частиц.из ядер в цитоплазм при митозе. , • .

.3 этот период культивирования в'.отдельнкхклетках наблюдали почкование на плазмолемме окрыленных плотннм матряксомнуклеокал-сидов, завершавшееся еыходом ■указанных, частиц: в межклеточное ■ пространство с;одновремекнш приобретением.ими суаеркапсидной оболочки. • .

Спустя 72-76 часов в клетках, наряду с незначительным: количествен прокуклеоидов, выявляли скопления нуклзокзпеидов, КаПСИ-дов„ формирование множества ядернъи и штоштзматическихшрионоа.

^ Ядерние вириокыбыли заключены по периферии ядра з вакуоли. Нак исключение, ядерные вирионы регистрировали-в центральных

зонах ядра и в расширениях перш^клеарного-пространства. , У. отделъ ных вирионов, локали з о ш ппк хс я в пори пукле ар: ¡ом пространстве,, видны участки лизиса супсркапсидной оболочки и наружной мембраны-ядерной оболочки. В 'прилегаютIX участках 1лтоплазьш выявляли нук-леокапсиды* Указанный факт свидетельствует"о том, что выход.ви-рионов кэ ядер в 15(топлазму мокет осуигствляться с'потерей, ими суперкепсидной оболочки. ' ' .. '

В дотоплазме инфицированных клеток наблюдал;! множественные скопления* окруженных плотном ма Три КС омну кле ока ПС» до 0 , которые формировали крупные и мелкие агрегаты, лшзенные*мембранных струк-

■ ' л , ' т * .

тур. Крале таких включений^ регистрировали: кольцевидные и пластинчатые "пакеты" мембран, вблизи которых'локализовались цуклео-калсидыи цитоплазматичеекке вирионы.- Цитогу1азчатические вирионы-били-сосредоточены, как правило, в расширенных вакуолях гладкой * ондоплазматической сети, а также в межклеточных пространствах.

Для ядер было характернш снижение электронно-оптической, плотности цуклеоплазмы^ резкое расширение перинуклеарногопрост-ранства, моргинация хроматина. В цитоплазме отмечали расширение и вакуолизацию цистерн комплекса Гопьрш и зндоплазматической сети, набухание митохондрий,, снижение тасла рибосом и полисом.:

Культивирование инфицированных ВГИ клеток в течение 96 часов • - ' -

сопровождалось значительный! деструктивньми изменениями клеток.. Отмечали ядра с:резко расширенным перипуклеарным пространством, ядерными "карманами",, лизисом1нуклеоплаэмы и фрагментарюй ядерной оболочки, что приводило к их,тотальной деструкции. В цитоплазме регистрировали многочисленные вакуоли различной величины,

вакуолизированные и мелкие с .плотным матрикссм митохондрии, на-■ . " *. * ' . , рушение;целостности плазмолеоды, что приводило к образованию

детрита,представленного остатками гатоплазматических органоидов.

фрагментами мембран и /щер; В осколках кцер*и среди скоплений- . ' - . * клеточных Фрагментов локализовались вирустд частицы.

Морфогенез вируса и характердеструктивных изменений клеток , культури перепелиных, '/куримых и утинюс эмбрионов' были аналогичными.. ■

Анализ морфогенеза штамма Í-C-I26 и отечественного иэолята А-2. показал, что формирование и накопление максимальных количеств •вирионов происходило в течение »18-72 часов после- инокуляции вируса, При исследовании морфогенеза штамма Карбовакс вирионн об- - - *. * *

нарухивали крайне редко и только через 96 часов после инфицирован!^ клеточного монослоя. , ' ' / * ' •

¿.2- Влияние множественности з араке ни ина морфогенез'вируса герпеса'индеек и ультраструктурній изменения инфицированных клеток. .

Электронно-микроскопическое исследование особенностей морфогенеза вируса, степени и характера специфических-изменений-а клетках показало, что инокуляция вируса с минимальной мновествен-ностьс зараяения Í3.75 и 37,5 í-ОЕУсм^).через 72 часа культивирования ¡индуцироваланезначительна изменения лишь у 5-IG# клеток..

. їормирование вирусных частиц - пронуклеоидов, КЙПСНД08 и- ■ нуклепкапсидов происходило в ядрах единичных клеток. Число-капеи-дов и нуклеокалсидов в срезе ядра составляло 10-20. Ядернь*е ви-рионы-обнаруживали еще реке и только в вакуолях ядер поликарио-питов; *

Продление:при:тех кв условиях-срока культивирования ко 96 -часов-практически не приводило « глубоким изменениям в удьтра- • структуре клеток; В ядрах и цатоплазме отдельных клеток регистрировали^ немногочисленные неполные -частицы ВШ и единичные ви- . рионы. ' '

Ирг мспа^ьзован!!^ средоих доз заракеш!я (75*150*300) р * - -

375 Ф02/аГ) в препаратах также наблюдали поликариоштоз. При

■ I - 2' - '

внесении вируса з культуру клеток в дозе 75 ФОЕ/ск и продолжи-'

тельности ^льтизирования 72 часа деструктивные.изменения был»: :

прйсуси йсслодуемых клеток, - тогда какповшеше доз до

2 ' * * КО,300,375 £02/с.ч приводало к деструкции 50^ клеток уже к 46

часа:.:, а> кчасам - до 70£. Следует отметать,, что при использования шог.естьзняости заражения 150,300,375 ФОЕ/сь^ репродукция

•шруса сопровождалась как формированием пронуклеоидов, капсидов,

1 1 * " 1

нукдеокапсидов, .так и лангих форм вируса". Культивирование до 72 часов способетвовэло большему накоплению как вируса; так и количества клеток, в которых его обнаруживали..Увеличение накопления вирусных частиц Огло отмочено таюке при использовании дозы 75 -КЕ/см^ и продлении культивирования после заражения от: 72. до 120 часов, при этом п цитоплазме, клеток регистрировали шюяеет-'венные скопления 1?:тош:азматичес;«а вирионов, сгустков плотного матрикса и мембранных структур. '

. « • • . ' I

По характеру поражений деструктивнее изменения клеток, от-,

меча'емые при внесении вируса в дозах 150,ЗСО и 375 ЗОЕ/с«11* и

» ' * ' ' ' - '

культивировании'до 96 часов, были сходщ; с повреждениями, каОльэ-

1 л ■ ■■ . '

даемши в клетках 120-ти часового сроки. культИБ;:росУШ1я,'.при :-шо-

иестшнностн заражения 75 <С£/см . '..'■",

; (Цлитольнос культи в;! ро ваш ю (144-103 пасов) сопровождалось тотальной деструкцией оольшинства клеток, вирусныо частицы регистрировали • среди клеточных, органоидов, в изолированных ядрах" и ядерных фрагментах,. в единичных непоьрекденных клетках. -

Понменение высокой г.гнокестЕекности заражения {15СС0 СОЕ/см) проявлялось ранниьи, значительными изменениями . инфихрфОБанньэс клеток и тотальной деструкцией их ухе': к 24 часам ■

после заражения.-Наряду с многочисленными.скоплениями.капсидоз' и чуклеокапсидов, локализовавшихся, в основном, .в детрите, веди-ничиых клетках в небольссм количестве регистрировали, также полные вирусные частицы икристаллоподобныеукладшг пронукдеоидов.

Таким,образом, увеличение множественности заражения от минимальных к средним иповь~снноЙ дозам способствует проявлению: * 1 - -

ранних деструктивных изменений в клетках. Процессы репродукции ■ БГИ, слабовыраженньк лр;: минимальных дозах, проявляются активным7 формированием и: накоплением вирусных частиц при средних дозах ■ заражения. При повышенной дозе заражения создаются'условия для ,формирования многочисленных неполных вирусных частиц.(капсидов.

' и ^клеокапсидов), при незначительном количестве- аирнонов.

^ ■ > ■■ і

" 3. Ультраструктурная характеристика изменений инфицированных клеток и вируса герпеса индеек при'дезинтеграции_

3,1, Ультраструктурні® игменетія ин^цированных-клеток її' .вирус ¿"герпеса индеек при использовании криометода

Б опыта:: с использованием однократного заморажива ния-оттаи-вашія в препаратах.наблюдали, в основном, клетки с пикногичндаи ядрами.. Наружный листок ядерной оболочки образовывал пузыревидные выпячивания в цитоплазму. В отдельных:ядрах, отмечали мел к озер нистую диффуз ную грануляцию нуклеоплазмы иликрупше: плотные глыбки хроматина. Наружный листок ядерной оболочки имел.

глубокие инвагинации: и локальные нарушения целостности.

і

Несколько'иного: типа изменения ядер были, связаны с образованием множественных мелких, средню: по вели чине'или *полноетью занимавших центральную часть ядра электронно-оптически ■прозрачных полостей. Внутренний 'листок ядерной оболочки ссафанял це- ,

лостностъ, тогда как наружный образовывал мелкие фестончатые или белее крупице вшячквапия в гипдоплазму,. был частично или-полностью разруэзн. *■ ^ •

Цитоплазма включала;больаое количество вакуолей, образованных, в; результат© резкого набухания 1?!стерн ондоплазматической: . сети,-комплекса Гольдки и митохондрий. Злостность пдазмолеммы у таких клотокбыла нарушена: ли^ь в отдельных, участках.: Изменения в:цитоплазме были более выражены,: чем-в ядрах.. ■ .

Нарушниег структуры отдельных: клеток при волгло к- "слушва-1сш" цитодлаз)ш, с ядер, - в результате чего'в препаратах-: наблюдали скоплетя ^топлазматичесгаа органелл,.ядер 'и¡ас фрагменты . .. ' После эмлораживания-оттаивания: ядерные: и цктоплазматические форма ВП? локализовались обычно в ядрах,^ реже ,в ндгрнихи'цито-, плазматических крупных и средних по размеру фрагментах.

, У единичных цитоплазмаптеских вирионов..отмечали .нарушение, целостности;суперкапсидной оболочки,,грануляцию и: перикапсидный лизис матрикса. ; • '

' . При; двукратном эшораяивании-оттаиваниидеструктавные процес сы усугублялись фрагментацией «ядер.

Тагам образом, изменения клеток,, вызываемые крисметодом,. •

сопрозождаютсдпинноэом,. вакуолизацией ядер, , набуханием; клеточных > • ■ * •

оргонелл, деструкцией плазмолешы,- образованием (фрагментов клеток. ■ Вирусные частицы,: при этой,, локализуются в ядрах^ цитоплаз-

нг и их фрагментах.. „' ,

*. , .' . ■ '■ -'

З.2., Ультраструктурные изменения ин^ицированных клеток и ви-

руса горлеса индеек под действием'ультраздуковой обработка

В ультратонких срезах клеток^обработанных ультразвукоы на; -частоте,15 кГц в течение^ 30.секунд,, наблодали относительно целые поли кари о ци тип одноядерные клетки. ¿В. ядрах-были-видны мелкие '

ваі^оли .»г глыбки нуклеоплаэмы. Хроматин располагался в * виде электронно-плотной"массы по периферии ядра. ■ ' І .

■' В цитоплазме отмечали образование мелких и* крупных»зле ктр о н-

# *

но-проэрачньэс участков, набухание цистерн:эндоплазматической, сети і. ■ ■ . • и. коьшлекса. Гольд-яг, деструкцию крист и. вакуолизацию магрикса

митохсндрнй.-- . '

Центри^угат обработанных : ультразвукам клеток;содержал скоп» * * * ^

ления клеточных: фра гае нто с,, ядер и вакуояизированные клеточные ■ оргакеллы.: ..." • . ■ '

.после, воздействия ультразвуком в течение 60 1Г 120 сек.г цснт-рк<Ь'гат состоял лизь иа'мелютхи средней во ли чины' а гає нто в ядер и клеточного детрита.; ■ •

Характер, поврекдасузго действия на- клетки при.использовании. . ультразвука, с частотой 22 кГц-был. таким же,, как и на..частоте ' 15. кГц., Увеличение частоты озвучивания до 35 кГ ц'с опр о вожда л ос ь значительтки деструктивными нарушениями■ клеток лишь при1 продолжительном воздействии;.". ' , ' •

- ' . л »

При кретковрсменной ультразвуковой обработке (30 секунд) .. , вирусные частицы (пронуклеойды, капе иды и цуклеокапсида)' локализовались обычно в' ядрах'и'их фрагментах. При:длительном.воэдейст-* і вии ультразвука ^60 и 120 секунд) шрусные частицы в виде.одиночно

'располайенных:'частиц:и: их! скоплений: находали. в мелки хи средних по размеру ядерных фрагментах или. среда 'участков клеточного, детрита.: Незначительные-изменения в виде роэрывов'суперкапсидной-оболочки-и разрыхления:электронно-ллотного^иатрикоа.отмечали'лиса» у, цитоплазматическихвирионов, .

После обработки, на частоте 15 кГц в течение 30 секунд*•ре гист рир о вали нукле окапсиды г и капсида». расположенный пооданочноу по 2-3- частицы или ' в скоплениях по 10-12/частиц» При экспозиции - 60

її 120 секунд отмечалось увеличение: числа диспергированных вирусных частиц, причем на частоте 15 кГц регистрировали до 10-15? отдельно расположенных шрионов и.нуклеокапсидов, заключенных в хлеточныз элементы. Повышение.частоты до 22 кГц и 35 кГц приводи до.к даспергировани» 25% к 60%,таких частиц соответственно.

Ультраструктурній изменения у вирусных частиц характеризовались разрывам, капси до в, набуханием и разрыхлением нуклеокап-сидов, мелкозернистой деструкі£ісїі капсомеров, разрывами суперкап сидной оболочки у отдгльніїл глріїонов. ' .

Таю'-м образом, звуковая обработка ин^лщ'ровантл ЕГ'І!

клеток культуры псрепилііяьіх эмбрионов,, независимо от используемо частотк. характеризуется диспергированием шіруслілх частиц к нарастанием деструктивных повреждений клеток, обусловленных увеличением сроков воздействия.' При повышении- частоты 03*ьу»1>1вак»я до 35 кГц отмечается снижение степени деструкции клеток, ^сгруктив ныв изменежя вирусных частиц резче выражены и чане встречается в препаратах из,объектов, обработанных ультразвуком на частоте 16 кГц.

3.3. Ул ьтра с тру ктурш-а измене(5:я инфицированные клеток и

, ■ ...

вируса герпеса, индеек пр^ сочетании:.: использовании криометода и ультразвуковой ооработки

При ультразвуковой обработке подвергшихся замораямванию-от-таивашю клеток наблюдали:

- относительно сохранившиеся одноядерные.клетки ;

- ядра с различной степенью деструкции

- скопления ¿йрагмзнтов ядер,, клеточных органелл, фрагмен-тарованшх мембран к виеклеточно расположенных »«уфологически

, кеповреащзиных вирусщх частиц.- ■

Нарушения в ультраструктуре клеток проявлялись в виде, л о- " кальннх разрывов плазмолеммы, набухания к вакуолизации митохондрий, tjiCTcpii эндоплазматической сети к комплекса Гольдки, частичной деструкции зон фтоплазмы.

Ядра о сохрагакЬ:хся клетках, , как правило, имели'ядерные "карманы".. _ ' _ .

Для снсбоднорасполокенных среди клеточных ^раплеитое ядер были характерны<шткноз, наличие^ ядерных "карманов", деструкция наружной ме\!б;гани, смоление в центр внутриядерных вакуолей и разрывы их,'а таккс разршш ядер., 1

Вирусные частицы локализовались в ядрах, их фралентах и среди элементов разрушенных клеток. деструктивные изменения обнаружены ли-ь у .-единичных цнтоплазмагических* и ядерных г.ц-иоков.

Таким образом, сочетанноб воздействие однократного заморажи-' ь^ння-огТанзания и ультразвука обеспечивает дезинтеграцию клеток . и осрозотдснпс из них вируса. ■

Аналцз данных, полученных при исследовании указанных способов дезинтеграции, свидетельствует о различном характере и степени ДОСIрукТИБНих изменений клеток. Криометод вызывает, в основном, набухание и вакуолизашю инфицированных клеток, реже их тотальную деструкцию, не приводя при этом, к выраженному диспергированию вирусных частиц. При длительной ультразвуковой обработке инфп?!-. рованных клеток, независимо от используемой частоты, отмечается деструкция большинства клеток, ЧТО создает уОЛОЕИЯ для получения свободных от клеток частиц ВГИ, при этом, повышение частоты оз-* ВуЧИВаНИЯ сопровождается снижением деструктивных изменений как к ' клеток, так и вирусных частиц. Сочетание указанных методов обеспечивает отделение инфицированных клеток от стекло, деструкцию

их при снижении продолжительности ультразвуковой обработки иос-

/

вобождеше вирусных частиц из клеток при кшшмальной; деструкции

последних. _ ^ .

. ' ' - ' '

4. Ультраструктура вируса герпеса индеек в маточных сериях вирусвашфшы.против болезни Марека и разработка метода подсчета ,

вирусных частиц в ультратонких срезах

* * 1 • " •

Исследования проводили по разработанное нами кетору,- в основу которого полажен принцип подсчета, вирусных частиц в ультратонких срезах с последуют* пересчетом в объеме клетки. От каждого образца исследовали 75-100 срезов или"'по 25-30 срезов с

I ' *

каждого из 3-5-ти блоков* При расчете количества.частиц разной' степени морфологической зрелости пользовались как величинами;, имеющимися в литературе - (плошдь клетки)-, так и определению« ■ нами путем морфометрических измерений и расчетов."

Зная средние объемы клетки и ядра, средние объемы среза клетки И; ядра, толшну среза, даа\гетр различных по морфологии-, вирусных частиц, вероятность обнаружения одной частицы о серийных срезах, среднее число срезов с одной.клетки, определяли^ конкретно для каждого образца среднее число чуклеокапсидов,ядерных и цитоплазма тических виряонбв.Так.как не во всех клетках . обнаруживали частицы ВШ,** то учитывав ■ процентное содержание (долю).клеток, включаюшх вирусные частицы., *

Креме определения морфологического состава вируса в маточных сериях производственного штамма.ВГИ, данный метод позволяет осуществить одновременно контроль этих серий_на наличие конта-шнантов .(микроорганизмов и вирусов)*, . .

При оценке морфологического состава вируса . ввирус вакцине"* * * -

против болезни Марека и статистической^обработка данти учитывали и .кодировали 6 факторов: количество цуклеокалсидов С «XV

ядерных вирионов ( ^ ), топлазматических. вирионов ), часто-" ту обнаружения клеток, с нуклсокапсидани с-ядерными вирио-

нами и с цитсплйзматическгсл: вирионами (),

^ , Зависимость, между кодируемый« факторами и инфекционной ак- \ тквность» вкраяаотся уравнением-обшвго вида = 'f ( & ) • где ^ - кн*евдюнная активность." *

После логарифмирования и определения параметроп* регрессии вид функции (зависимость if от параметров можно пред-

ставить как уравнение: - ■ • ,

= •l.ioe+o;?« f1,525 fy-?*,-

-0,0S5 --0,076 fg 31s_ . Так как: в ура вне шя: основное влияние обуславливается суммой логарифмов факторов, приблизительно каждой фактор прсдстагляет собой процент от. ссдеряания в от о Г. сумме.. Для 0олее точного спределения влияния факторов, оно'рассчитывается из среднего эначения'от гсех опытов.

» ! ' i

.-Из получению: результатов следует,.'что в порядке убывания-" влин1г.гп факторов экспериментальные данные уоино расположить в

- Зб£ .

-ITS

' I ' -■IT»'.

-I6J6..

-'loss

- •

19

следующем порядке: *

. Хе (количество нуклеокапсидоэ); ■

ЗУ (частота, обнаружения, клеток с ядерньми

■ * * : . * вирюнами) ■ ' ■ '

(частота обнаружения клеток с цггоплаэ-- матическіслі Еирионсми)

•^(количество ядерных вирионов)

(количество цитоплазматических вирионов)

-Гц ( частота.обнаружения клеток, с нуклео-

капсиддми) ■ '

*

„ ВЫВОДЫ ■ ' , ■ ' V . -

1. В ультратонких срезах тфтцированных вирусом герпеса

^ » »

индеек (ВГИ) клеток культур перепелиных, куриных и утиных эмбрионов выявляются: -..''■',

■ ' г * ,1

- неполные вирусные частицы в виде пронуклеоидов диаметром' 30-40*нм, капсидов и нуклеокапсидов (90-100 нм) с нукдеоэдами кольцевидной, гранулярной, Фрагментарной, торондной и фибрилдяр-ной структуры;

- пол!ше вирусные частицы - ядерные. (160-160 нм) и питоплаз-матиче'ские вирионы (200-320 нм). ■

2. Морфогенез ВГИ штаммов ФС-126, Карбоваке и изоллта А-2 в клетках культур перепелиных, куриных и утинкх эмбрионов представлен следующими этапами: ~ .

, . i .

- адсорбция цитоплазматических вирионов-и нуклеокапсидов на плазмолемме клеток;

- проникновение цитоплазматических вирионов в клетку и деп--ротеиниэация их в первые 10-20 минут после заражения;

- - формирование виропластов, пронуклеоидов; капсидов и нуклеокапсидов в ядрах инфицированных клеток; , . .

- выход капсидов, нуклеокапсидов в .цитоплазму при китоти- -ческом делении клеток, при лизисе суперкапсидной оболочки вирио-на и наружной мембраны ядерной.оболочки;

- формирование вирионов ядерных - в нуклеоплазке и цитоплазматических - в цитоплазме клеток;

- выход всех форм вирусных частиц при деструкции клеток,.а цитоплазматических вирионов - путем почкования на>плазмолемме.

3. Максимальное накопление вирионов происходит через 46-72 часа после инфицирования клеток ВГИ штамма'ФС-126;.гаолята А-2

и через 96 часов ~ штамма КорбОЕакс; ' ■

4 ." Субмикроскопическпе іізмєненшк в инФюдированных ВГИ клетках культур перепелиных, утиных,' куриныхэмбрионов харзіггеризугт— ся раз влткем поликарао цито з а. ішрпзіацией'хроматша. расширением' пергмуклеарного пространства, деструкцией ядерной оболочки, Фор-мироранкем в-цитоплазме япакетов**меыбрш1ных:структур й электронно-плотного матриксанабуханием « вакуолизацией цитоплазмам-, ческих органелл;,локальной и тотальной деструкцией клеток.'

6. Ультраструктура форг.згрующихся вирусных частий, и субтекро-' скопкческке; ¿13 мен шил 'клеток в ' ІЦіСЦЄССЄ ; реп родукци ИВНКХ вируса зависят ст. величины зараяаюцей дозы -11 продолжительност и культігви-роЕанип. Л7овьЕенне;-доз от !.іалкх (3.75 йОЕ/сі^, . 37,5 £ОЕ/сА к средним ІЇЇфОЕМР; 150 иОЕ/см2, .'2СС -ЮЕ/см2. '375 «Ё/с«2) и • , повьтенкым (15000 ¿ОЕ/сы2) ускоряет- сроки появления.глубокой деструкцта. КЛЕТОК" и препятствует^ прохождению вирусом , полного " *-' цикла.морфогенеза. Множественность заражения яв--

ллется оптимальной для накопления максимальных количеств, вирионов ■ о. Пршекеїг/е однократного и двукратного замораживения - оттаивания вызквазг локальную и тотальну» деструкцию пяазшлемми-клеток.набухаяие и1вакуолизацию клеточных органелл. пикноз. вакуолизацию. сЬрагментац;га единичных ядеринвобеспечиваетполу-ченая максимальнкх количеств освоСокденнах иэ клеток вирусных частки. 1 - • '' , '. " ''."' 1 .'.!'' ,

.7., Дробная ультразвуковая- деэинтеграшш ішйицированньк " •ВГИ клеток';культуры' перепзлкных эмбрионов на различных частотах . приводит к; глубоким прог^ссидующим деетрунтивньпі изменениям клеток; более выраженным,при испслъзования:низких'.частот; „"■

. * в. Оптюэльный режим дезинтеграизш клеток при'максимальном ■ ■' освобождении вирусных частки и минимальной деструкции последних -

* І - ■ I . ' " 4 , . " ■ ц

обеспечивается при обработав плеточных сусяадзий ультразвуком'

на частоте 35 кГц, интенсивности 2,5-3,0Вт/с.'.!^ а продолжительности озвучивания 60-120 секунд или сочетание:.: криоуетэда С-40°С - +20°С) с последующи дрсбнгл.озвучиванием е течение X секунд. Ч ,

9.* Разработал злектронно-иякроскопический ^ет'од кодхчеетьен 'ного определения разных форм ЕП1 в вакцине против болезни Марека который применяется при контроле маточного' ста;.г*а, «аточжх -(посевных): производственных серий БП1 на качестЕснн!-?., кол::чест венный-состав, в них вируса .к наличие коптаминантав. -

.101 Статистическая обработка экспер^снтальнь^с данн'эс, полу ченных при исследовании кор^осостава маточнгх' серий ви ру с эакппн к-показала ^зависимость мекду количеством вируст1*-частиц, .клеток, зклгачаюаюс- вирионы я инфекционной активностью препарата.-

• практически прейлонь:^'--:

Рекомендации, полученные на о сн э в ан ии:иэучения мор^ог е нгэ а БП1, характера - ультраетруктурнь-х изменений ин^пцисоЕачкь'х .клеток •и вируса при дезинтеграции.с помоаьякриометода.и ультразвука' . позволили ,научно обосновать оптимальнее сроки культивирования-вируса, величину множественности-заражениями параметра лез интеграции инфицированных БГй клеток.

Разработан и внедрен в практику метод электронно-микроскопического контроля, маточного стамма,. вогедгийв"Инструкц;яэ яз " -гаготовленио и контролю жидкой культуральной вирусвакцинц против болезни Марека из штамма'40-126 .вируса герпеса, ивдеек", утвержденную ГУВ МСХ ССС? б декабря 19(30 года.-.

Разработан «етод количестветюго определения частицВГИ в удьтратонких срезах инфицированных клеток; вопедаий во "Временную инструкцию по изготовлен«» и контролю сухой куль--туральной вирусвакцины против болезни Марека- из- штамма ФС—126 ■ вируса герпеса индеек*, утверкденнуп П/В MCX CCCP I июня 1964 года..

/

СПИСОК РАБОТ, СПУБЛИКСВЛНЫК ПО ТЕМЕ ■ . ДИССЕРТАЦИИ ' -

t • <

Г. Токария Влехорман Б.Е.,\Слепенко Т.Б., .Злоби-

на Ш.З., Марыгкна А.$. Вьиеление и морфология свободного от клеток »wpyca герпеса индеек - Доклады ВДСХНИ2; 1976,* Ш 7, с.33-35. - -

2. БлехерманБ.Е.»ЛУкинаВ,А., МарыгинаА.Ф., Пере ми- . TtiHa А.Д. Морфологические аспекты-промышленного производства, вирусвакцины против- болезни Марека - Материалы. Г Всесоюзной конференции "ручные - основы технологии ■ промышленного прора- • водства ветеринарных биологических препаратов",!!.,1978,с.7-9.

' 3, Ечехерман'Б.Е., Лукина В.А., Ыарыгика А.Ф., Первый- -тина А.Д. Ультраструкгура вируса герпеса в нативной вирусвак-,пине против:болезни Марека-- Передовой < научно-производственный опыт в биологической'прокьсгленности. ЭИ,М.,1979,КЗ,с.9-10 4. Иарыгина А.4., Бяехершн Б.Е., Перемитина А.Д., Лукина В.А., Неньпгикова Н.Г. Влилние условий культивирования на морфологи» "вируса герпеса индеек - Передовой научночгроиз-водственный опыт в биологической промышленности. ЭИ, М.,1979, »'4, с,3-5.

- v

б. Марыгина А.Ф.Морфогенеа п удьтр&струггура производственного штамма. вируса герпеса индеек - Труды ВГНКИ, I960, t;29,. с:90н-Ю5. , .

6..Мариг1ша А;Ф. , Перемитина А.Дч Блехерыан Б.Е.,: Лунина В.А.; Скалинский Е.И. Количественное определение различных ■ ыбрфологичёсних-форм вируса в кидкой: вирусвакцине против болезни Марека.- Материалы II Всесоюзной научной конференции."Научные, основы технологии промышленного производства ветеринарних биологических препаратов"; а.,1981,е., 38-39. „. ., ;. .

7. Царыгина А.й.,,Еяехерман Б.Е., Лукина: В.А., Скалинский Е.И., Качественная, и количественная:характеристика вируса в вакцине против болезни Марека.- Материалы Всесоюзной научно3 4 конференции "Разработка, апробация и государстенннй контроль ■'. ветеринарных препаратов",,' П., ,1991,- с. 152.\. ■ . ■ .

.1

Заа.5004сп. . Тарад іОО экз. 0бьем1.5 печ.д. /.

24 , *• ' .....* Типография АГ7 .