Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Морфологические и генетические особенности пикопланктонных цианобактерий озера Байкал
ВАК РФ 03.00.16, Экология
Автореферат диссертации по теме "Морфологические и генетические особенности пикопланктонных цианобактерий озера Байкал"
На правах рукописи
Тихоном Ирин» Вааиимя
МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПИКОПЛАНКТОНИЫХ ЦИЛНОБАКТЕРИЙ ОЗЕРА БАЙКАЛ
03.00.16. ~ экология
Автореферат диссертации и» соискание ученой степени кандидате биологических наук
ИРКУТСК, 2006
Работа выполнена в отделе Ультраструктуры Клетки Лимнологического института СО РАН {г. Иркутск).
Научный руководитель:
кандидат биологических наук, с.н.с. Ольга Ивановна Белых Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Валентин Валерьянович Дрюккер доктор биологически* наук, с.н.с. Любовь Степановна Бузолева
Ведущая организация: Красноярский государственный университет
Защита диссертации состоится «//» 2006 г. в ¿¿.часов на
заседании диссертационного совета Д 212.074.07 при Иркутском государственном университете по адресу: 664003 г. Иркутск, ул. Сухэ-Бэтора, 5, Байкальский музей им. проф.М.М. Кожова(ауд. 219). Факс (3952) 241855, e-mail: dekanat@bio.isu.ni
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Иркутского государственного университета.
Автореферат разослан « /У» j+Q'fa 2006г. Ученый секретарь
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Автотрофный пикопланктон (АРР) - это мельчайшие планктонные водоросли и цианобактерни размером 0,2-2,0 мкм (Sieburth et al, 1978; Stockner, Antia, 1986). Особенно велико значение автотрофного пикопланстона в олиготрофных водах, где он создает до 70 % первичной продукции {Stockner, 1991; Weisse eta!., 1993; Vörös et al, 1998),
Байкал является крупнейшим пресноводным олиготрофным водоемом Центральной Азии. Геологические, географич еские и гидрологические особенности озера определяют уникальность и высокую степень эндемизма его обитателей (Lake Baikal, 1998). Численность АРР достигает в озере 1 млн кл/мл, а вклад в первичную продукцию составляет 60-80 % (Вотинцев и др., 1972; Бондаренко, Гусельникова, 1989;Nagata et al., 1994). Байкальский АРР на 90% состоит из цианобактерий, а на 10 % - из эукар иотически х водорослей (Поповская, Белых, 2003). Несмотря на в ажное значение, которое играют в Байкале пикопланктонные цианобактерни, степень их изученности недостаточна из-за небольших размеров объекта и ограниченного набора морфологических признаков. Для уточнения систематического положения пикоцианобактерий ранее были весьма успешно использованы молекулярио-бнологаческне методы (BHtschgi et al, 1991; NeJissen et al., 1996; Nübel et al, 1997; Emst et al., 1995, 2003). Поэтому предполагается применить комплексный подход в изучении биоразнообразия байкальских пикоцианобактерий с использованием методов морфологии и молекулярной биологии.
Другим важным аспектом в исследованиях цианобактерий является вопрос о потенциальной токсичности некоторых видов. Известно, что такое экологическое явление, как «цветение» водоемов, обусловленное массовым развитием цианобактерий, нередко приводит к появлению в воде токсинов. Наиболее распространенным среда них является микроцистин, который вызывает отравления и поражения печени у человека и животных (Dunn, 1996; Kurmayer el al, 2003). Молекулярно-биологическими методами было показано, что гены, участвующие в синтезе микроцистниа, распространены спорадически среди 5 родов цианобактерий (Rantala et al, 1998). Описано, что некоторые представители родов Synechocystis и Synechococcus содержат гены микроцистинсинтетазы (Rantala et al, 1998; Christiansen et al, 2001). Так как численность цианобактерий высока в течение всего года, исследования байкальских цианобактерий на содержание гена токсичности весьма важны как с научной точки зрения, так и для оценки качества воды.
Цель и задачи исследования. Цель данной работы — исследование морфологии, ультраструктуры и определение последовательности гена 16S рРНК байкальских пикопланктонных цианобактерий и выявление потенциально токсичных цианобактерий.
Для этого необходимо было решить следующие задачи: 1. Описать морфологию и ультраструктуру пикопланктонных цианобактерий озера Байкал /л situ с помощью оптической и электронной микроскопии.
2. Выделить штаммы пи ко цианобакгерий озера Байкал и описать их, используя микроскопические методы.
3. Охарактеризовать генетическое разнообразие байкальских цианобакгерий in situ в сравнение с цианобактериями из других водоемов.
4. Определить нуклеотидные последовательности фрагментов 16S рибосом но го гена культивируемых байкальских цианобакгерий и сравнить с последовательностями цианобактерий из других пресноводных экосистем.
5. Выявить генетический маркер токсичности цианобактерий - геи синтеза микроцнстнна (тсуВ) - в суммарной ДНК плко- н фитопланктон ной фракций озера Байкал и водоемов с различной степенью трофности.
Научная новизна работы. Впервые дана комплексная характеристика байкальских пиколланктонкых цианобактерий, в работе приводятся данные микроскопических, ультраструктурных и моле куля рно-биологических исследований пикоцианобактерий в культурах и in situ. Выявлено высокое морфологическое и генетическое разнообразие пи ко циан обактерий озера Байкал и проведен сравнительный анализ байкальских пнкоцианобакгернй с цианобактериями олиготрофных, мезотрофных и эвтрофных озер. Впервые проведено исследование ДНК байкальских цианобактерий и цианобактерий ангарских водохранилищ с использованием специфических праймеров к гену тсуЕ и показано наличие потенциально токсичных цианобактерий в фитопланктоне Усть-И л и мского водохранилища.
Практическая значимость работы. Исследование байкальского автотрофного пикопланктона позволило уточнить систематическое положение байкальских цианобактерий, ревизия была проведена согласно современной систематике. Нами получены значения биообъемов клеток различных морфотипов байкальских пнкоцианобактсрий, полученные данные можно использовать при мониторинговых исследованиях озера Байкал. Создан банк данных генетических последовательностей 16S рДНК байкальских пикоцнанобактерий, зарегистрировано 24 последовательности культивируемых цианобактерий (DQ399905-DQ39907, DQ401110, DQ401U1, DQ403805-DQ403807, DQ407506-DQ407518, DQ422952, DQ459297, DQ459298) и б последовательностей некульти виру ем ых цианобактерий (DQ418752, DQ297458-DQ297462), получены и зарегистрированы генетические последовательности цианобактерий озера Хубсугул {DQ297464, DQ302754, DQ302755, DQ422951). Использованные в работе методы молекулярно-биологической детекции токсичных цианобактерий являются перспективными для быстрого выявления токсичных видов в различных экосистемах и могут быть применены для мониторинга любых водных объектов н оценки качества воды в них. Эти методы позволяют в короткий срок определить не только наличие токсичных цианобактерий, но и идентифицировать их видовую принадлежность.
В диссертацию вошли результаты, полученные при финансовой поддержке грантов РФФИ № 02-04-49756, 05-04-4S624; РФФИ-Байкал Ха 01-04-97217, 0504-97222; молодежный проект СО РАН № 140; НШ-2195.2003.4 (поддержка ведущих научных школ) и гранта 2006- РИ- 112/001/007.
Защищаемые положения:
1. В автотрофном пнколланктоне озера Байкал доминируют цианобактерии родов Synechocystis, Synechococcus н Cyanobium. Байкальские пикоцианобактерии, несмотря на сходство с другими пресноводными цианобактериями, являются морфологически и генетически отличными.
2. Показано, что цианобактерии озера Байкал, Иркутского и Братского водохранилищ не содержат гена синтеза микроцистииа. В Усть-Илимском водохранилище выявлены цианобактерии Microcystis aeruginosa, которые являются потенциально токсичными.
Апробация работы. Основные результаты работы представлены на научных мероприятиях: международные симпозиумы «SIAL» (Иркутск, 2002), «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек н водохранилищ» (Иркутск, 2003), «1АС 2004» (Люксембург, 2004), «Научные основы сохранения водосборных бассейнов: междисциплинарные подходы к управлению природными ресурсами» (Улан-Удэ - Улан-Батор, 2004); международная конференция «Изменения климата и окружающей среды в Центральной Азии» (Улан-Батор, 2005); молодежная конференция-школа «Научные школы Сибири» (Иркутск, 2005); 4 международная Верещагинская конференция (Иркутск, 2005); III международная конференция по актуальным проблемам современной альгологии (Харьков, 2005); международная конференция «Первичная продукция водных систем» (Борок, 2005); международная конференция «Новые технологии в интеграгивной медицине и биологии» (Паттайя, 2006), Всероссийская конференция с международным участием «Биоразнообразие экосистем Внутренней Азии» (Улан-Удэ, 2006).
Публикации и личный вклад автора. По результатам диссертации опубликовано 18 печатных работ, из них четыре статьи в центральных и зарубежных журналах. Экспериментальные данные были получены автором как самостоятельно, так и в совместных экспериментах. Результаты, представленные в диссертации, защищаются впервые.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на стр., состоит из введения, б глав, выводов, списка литературы, содержащего 167 источников (129 на иностранных языках), содержит 5 таблиц, проиллюстрирована 15 рисунками с S3 микрофотографиями.
Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю х.б.н. О.И. Белых, а также своим соавторам: Е J\ Сороковиковой, А.С. Гладких, Г.В. Помаз кипой, Э.Э. Пензиной. Автор благодарен сотрудникам отдела Ультраструктуры Клетки за ценные указания и помощь в работе.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
Дана общая характеристика цианобактерии, рассмотрены морфологические и ультраструктурные признаки, необходимые для идентификации и систематики иианобактерий порядка Chroococcaies, особое внимание уделено пи ко планктонным родам — Synechocystis, Synechococcus и Cyanobium, Даны
экологические характеристики озер Байкал, Хубсугул и водохранилищ Иркутской области. Приведена история открытия и изучения пикопланктонных цианобактерий в различных экосистемах. Освещены экологические аспекты молекулярно-генетических исследований цианобактерий. Приведены литературные данные по проблеме токсичного цветения водоемов, а также по структуре и механизму синтеза токсинов.
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Отбор проб
Байкал. В период с 1998 по 2003 гг. пробы для получения чистых культур пикоцианобактерий и морфологического анализа in situ были отобраны в фотическом слое по всей акватории озера, включая пелагналь, заливы и мелководья. Для выявления генов синтеза микроцистина в ДНК цианобактерий пробы отбирали ежемесячно в течение 2005 г. в Южном Байкале на середине разреза Листвянка-Танхой с глубин от 0 до 50 метров.
Хубсугул. На озере Хубсугул пробы для выделения ДНК и микроскопического наблюдения были отобраны в пелагиали северной части озера с глубин от 0 до 25 метров в августе 2004 г.
Иркутское. Братское и Усть-Илимское в одохраннлища. Пробы воды для исследований на наличие гена тсуЕ цианобактерий были взяты в водохранилищах в августе 2005 г. В Иркутском водохранилище пробы отобраны вблизи п. Патроны (0*5 м). В Братском водохранилище — в районе залнва Монахово, в Усть-Илимском получены в районе р. Вихорева и в Нижнеилимской ветви с глубин отО до 25 метров. Методы исследования
Монокультуры байкальских цианобактерий получали на среде Z-8 (Rippka, 1988) рассевом проб воды на 1 % агаризованную среду в чашки Петри. Культивирование осуществляли в термостате (New Brunswick G25, USA) со световым режимом 1000-1500 лк (использовали лампы белого света) и температурой 11-12 "С. Полученные иггаммы пикоцианобактерий хранятся в музее Байкальских водорослей, отдел Ультраструктуры Клетки, Лимнологический Институт СО РАН. Для экспериментов по исследованию токсичности цианобактерий были использованы штаммы Microcystis aeruginosa KUtzing CALU 972 и 973, любезно предоставленные Л.Н. Волошко (БИН, Санкт-Петербург).
Для эпифлуоресцентной микроскопии применяли Axiovert 200 (Zeiss), снабженный ртутной лампой HBO 100W. Автофлуоресценцию цианобактерий наблюдали под зеленым фильтром (DM-580+0-590, BF-0-610, G(IF-S45+BG-36), микрофотографии получали камерой Pixera Pengtum 600CL (DiRactor™) с помощью программы ВидеоТесТ-Размер 5.0. Для определения размеров клеток использовали программу «Image-Pro» (версия 4.5.0.29), статистическую обработку данных проводили в программе Excel for Windows 2000. Биообъемы клеток подсчитывали в соответствии с формулами объемов эллипсоида, шара и гемисферического цилиндра (Albertano et а!., 1997).
Для сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) пробы воды и клетки культивируемых цианобактерий фиксировали глутаральдегидом до 1 % конечной концентрации. Затем их фильтровали на поликарбонатные мембраны с диаметром пор 0,22 мкм (Millipore) и дегидратировали в спиртах возрастающей концентрации. Напыление золотом проводили в установке CPD-030 (Balzers), после чего препараты наблюдали в микроскоп Philips SEM 525 M, цифровые фотографии получали с помощью системы электронного сканирования изображения.
Для трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) препараты готовили двумя способами. Для негативного контрастирования цианобактернн фиксировали глутаральдегидом до 1 % концентрации, отмывали байкальской водой и наносили на сеточки с формваровой пленкой. Для исследования ультратонкого строения клетки, материал фиксировали 0,25 % глутаральдегидом и 1 % оксидом осмия (конечные концентрации), высушивали спиртами возрастающей концентрации и ацетоном, после чего заливали в эпоксидные смолы. Ультратонкие срезы после окрашивания уранилацетатом и цитратом свинца и контрастированные препараты наблюдали в электронный микроскоп LEO 906Е при ускоряющем напряжении 80 кВ. Микрофотографии получали с помощью цифровой камеры MegaView II и программного обеспечения Mega Vision (Soft Imaging System GmbH, Germany).
Суммарную ДНК выделяли методом ферментативного лизиса с последующей экстракцией фенол-хлороформом. Для амплификации использовали участок гена I6S рРНК и участок лкуЕ-гена микроцистинсинтетазы (Nübel et al., 1997; Rantala et al., 2004), очистку полученных ПЦР-продуктов выполняли набором «DNA and Gel Band Purification Kit» (Amersham Biosciences, США). Последовательности генов определяли на автоматическом приборе 373А DNA Sequencer (Backmann, США), Для АТ-клонирования цнзнобактернальной ДНК применяли набор реактивов «pGEM-T-Easy Vector Systems» (Promega, США). Выверенные нуклеотидные последовательности генов сравнивали с помощью программы поиска гомологичных последовательностей В! as ta и регистрировали в GenBank, номера зарегистрированных последовательностей представлены выше. Филогенетический анализ и построение деревьев проводили с использованием программ MEGA (версия 3.1, Kumar et al., 2004) и PAUP (версия 4, Swofford, 1998), графическую обработку дендрограмм выполняли в программе CorelDRAW Graphics Suite (версия 12).
Глава 3. МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПИКОЦИАНОБАКТЕРИЙ ОЗЕРА БАЙКАЛ 3.1. Байкальские пикоцианобактерни m situ
В планктоне озера Байкал выявлены доминирующие пикоцианобактерии, которые согласно классификации, предложенной Komárek, Anagnostidis (1999), принадлежат родам Synechocystis Sauv., Syneçhococcw Näg, и Cyanobium Synechocystis limnetica Popovsk., открытым ранее (Поповская, 1968). По данным флуоресцентной микроскопии и последующего морф »метрического анализа,
диаметр клеток составляет в среднем 1,2 мкм, биообъем клетки достигает 1,76 мкм5. Клетки S. ИтпеЧса встречаются чаше всего по 2-4 вместе (рис. 1а). Нами отмечено, что встречаются агрегаты цианобактерий рода Synechocystis sp., весьма сходные с S. ümnetica, но в колониях по S и более клеток.
Род Synechococcus был представлен несколькими морфотмпамя. Первый морфотип назван нами морфотипом «короткие прямые палочки», они составляют 0,69 мкм в диаметре и достигают длины 1,93 мкм. Деление клеток правильное, после деления дочерние клетки иногда остаются соединенными в цепочки по две-четыре клетки, биообъем клетки составляет 1,95 мкм1. Другой морфотип пикоцианобактерий рода Synechococcus определен как «длинные палочки» со слегка изогнутыми концами, клетки имеют размеры 0,68 х 5 мкм, а биообъем составляет 8,5 мкм3.
Цнанобэктерии рода СуапоЪЫт были представлены клетками эллипсоидной формы, реже встречаются коккоидные пнкоцнанобактерии этого рода, при этом кокки располагаются в коротких цепочках из 3-5 клеток (рис. 16), Средний размер эллипсоидных цианобактерий составляет 0,91 х 1,38 мкм, биообъем клетки таких цианобактерий составляет 0,59 мкм1, средний диаметр коккондных — 0,9 мкм, а биообъем равняется 0,47 мкм1. Важными признаками для различения родов СуапоЫит н Synechococcus являются тип деления и морфология дочерних клеток, поэтому только культивирование пикоцнанобактернй позволяет четко различить представителей этих двух родов. В литературе встречаются термины «Synechococcus-type» и SynechococcuslCyanobiutn кластер, которые используются для обозначения представителей этих родов при нехватке морфологических и генетических критериев для точного определения (Callieri, Stockner, 2002).
Наши данные позволили уточнить значения объемов различных байкальских морфотипов, которые в дальнейшем могут быть применены при мониторинговых исследованиях озера Байкал. Так, ранее для этого использовали значения биообъема, приведенные только для эллипсоидного морфотипа пи коцианобактернй (Nagata et al, 1994). Весьма сходны с пикопланктоннымм клетками и клетки некоторых истинно колониальных родов цианобактерий, с размерами клеток до 2 мкм, например, Aphanocapsa Nägeli, Aphanolhece Nägeli, Cyanodiction Pascher и другие (Callieri, Stockner, 2002). В Байкале таким наиболее часто встречаемым родом является Aphanothece. Клетки пи коцианобактернй этого рода располагаются парами или хаотически и объединены общим слоем слизи, которую не видно при эпифлуоресцентном наблюдении. Нами описаны представители вида Aphanothece sp. С плотно расположенными коккоидными клетками. Пи коцианобактернй другого массового вида A. clathrata W. et G.S. West, по результатам СЭМ имеют эллипсоидные клетки шириной 0,8-1,0 мкм и длиной 1,5 мкм (Belykh, Sorokovikova, 2003).
Используя полученные данные, нами было проведено сравнительное исследование морфологических характеристик п it коцианобактернй. Среди известных Synechocystis spp., обитающих в пресноводных водоемах не было найдено представителей этого рода, подобных Synechocystis Hmnetica. Наиболее
S
близка к байкальскому виду цианобактерия S. parvula Perfiliev, но она имеет более мелкие размеры — от 0,7 до 0,8 мкм. Из культивируемых цианобактерий рода Synechocystis близким к байкальскому виду является штамм Synechocystis РСС 8943, выделенный из мелкого пресноводного водоема, размеры клеток этого штамма до 2 мкм.
Сравнивая байкальские цианобактерии Synechococcus морфотипа «короткие палочки» с палочковидными цианобактерия ми других пресноводных озер, следует отметить их несхожесть. Более похожими на них цианобактерия ми являются палочковидные цианобактерия Балтийского моря с диаметром 0,55 мкм и длиной, практически совпадающей с длиной байкальских палочек (Albertano et al.r 1996), Морфология Synechococcus морфотипа «длинные палочки» наиболее близка к морфологии цианобактерий Synechococcus capitatus Bailey-Watts et Komdrek {Bailey-Watts, 1968; Котйгек, Anagnostidis, 1999).
Коккоидные цианобактерии рода Cyanobium, аналогичные байкальским пи ко цианобактерия м, были обнаружены в озерах Гурон, Мичиган (Fahnenstiel, Carrick, 1992) и в озере Онтарио (Leppard et al, 1987). Однако наиболее сходными с байкальскими эллипсоидными цианобактериями этого рода являются эллипсоидные цианобактерии Черного моря (Uysal, 2001).
Сравнительный анализ пикоцианобактерий озер Центральной Азии показал разнообразную морфологию пикоцианобактерий в озерах Телецкое и Хубсугул. Например, в озере Хубсугул выявлены морфотипы пикоцианобактерий родов Cyanobium и Synechococcus, сходные с байкальскими, однако более мелкие — эллипсоидные клетки размером 0,5 х 0,8 мкм и 0,85 х 0,9 мкм (Belykh et aL, 2005). Род Cyanobium представлен клетками размером 0,75 х 1,1 мкм, которые собирались в агрегаты - цепочки, а род Synechococcus - клетками палочковидной формы 0,45 х 5 мкм и 0,75 х 5-10 мкм. Наиболее близкими к байкальским морфотипам являются палочковидные цианобактерии с диаметром клеток 0,75 мкм. Типичными цианобактерия ми родов Synechococcus и Cyanobium Телецкого озера являются кокки со средними размерами 0,65 мкм, мелкие эллипсоидные цианобактерии 0,44 х 0,33 мкм и тонкие папочки размерами 0,35 х 0,95 мкм и 0,3 х 1,2 мкм (Белых, Сафонова, 2005). Все морфотипы цианобактерий сильно отличались от байкальских пикопланктонных цианобактерий.
3.2. Морфологическая характеристика байкальских культивируемых п икоцианобактерий
Для изучения байкальских культивируемых цианобактерий использовали 24 штамма пикоцианобактерий. По морфологическим признакам культивируемые нами цианобактерии разделены на три рода; Synechocystis, Synechococcus и Cyanobium. По пигментному составу штаммы делятся на две группы: фикоэритрин- и фикоцианин-доминирующие. Комплексное описание культур проводится в отдельной таблице диссертации, а некоторые микрофотографии представлены на рис. 1 (в, г).
Культивируемый представитель рода Synechocystis штамм ВАС 9721 является более крупным по сравнению с S. limnetica, а также имеет ярко
красную флуоресценцию, свидетельствующую о высоком содержании фикоцианина. Большая часть культур (13) принадлежат к роду Synechococcus, а 10 — к роду СуапоЫит. Анализируя полученные данные, можно заключить, что клетки эллипсоидного морфотипа наиболее распространены среди культивируемых и некультивируемых байкальских цианобактерий, так, 50 % байкальских штаммов имеют данную форму клетки.
Суммируя морфологические особенности байкальских пикоцианобактернй in situ и в культурах, следует отметить, что пнкоиианобактерии озера Байкал весьма варьируют по форме н размеру. Наибольшей вариабельностью обладает длина клетки, чем ширина, особенно у представителей рода Synechococcus. Также, биообъем клетки у них в 3-5 раз выше, чем у клеток цианобактерий рода СуапоЫит. Среди культивируемых цианобактерий наиболее близкими к байкальским штаммам оказались эллипсоидные Synechococcus/Cyatiobtum OK 01 и OK 10, выделенные из озера Окутама и палочковидные Synechococcus ВО 8807 из озера Констанце. Исследования пикопланюона in situ показали, что наиболее похожими на байкальские пикоцианобакгерии являются цианобакгерии озер Америки и Канады — Гурон, Мичиган, Онтарио и германского озера Констанце.
Глава 4. УЛЬТРАСТРУКТУРА БАЙКАЛЬСКИХ ЦИАНОБАКТЕРИЙ
Исследования цианобактерий с помощью ТЭМ показали ультраструктуру клетки, типичную для порядка Chroococcales и выявили особенности ультратонкого строения трех родов цианобактерий. Микрофотографии некоторых из них представлены на рис. 1 (д, с).
Для рода Synechocystis показано различие в ультраструктуре клеток штамма ВАС 9721 и некультивируемой цианобактерии S. limnetica в количестве тилакоидиых мембран и наличии слизи у разделившихся клеток культуры Synechocystis ВАС 9721. Нами не обнаружен слой гликокаликса в клеточной стенке, ранее описанный для семи морских изолятов Synechocystis (Vaara, 1982). Вероятно, этот признак не является характерным для пресноводных цианобактерий.
Для рода Synechococcus исследования с помощью метода негативного контрастирования показывают разнообразие морфотипов и отсутствие спинов на четырехслойной клеточной стенке. Ультратонкое строение некультивируемых цианобактерий рода Synechococcus весьма простое, с двумя концентрическими тилакондными мембранами. Штаммы Synechococcus ВАС 0103 и ВАС 22 имеют четкое морфологическое отличие на ультратонких срезах - клетки Synechococcus ВАС 0103 прямые, цилиндрической формы, а Synechococcus ВАС 22 - овальные и слегка изогнутые. Тилакоиды располагаются концентрически, параллельно клеточной стенке. Как у Synechococcus sp. из природных образцов, так и у культивируемых штаммов наблюдаются две тилакоидиые мембраны. Наиболее распространенными клеточными включениями являются полифосфатные гранулы н полиэдральные тела, последних больше, чем у представителей p. Synechocystis, они занимают центральную часть клетки, имеют форму многогранника и среднюю
Рис I. Байкальские пикопланкгонные цианобактерии. СЭМ: а — Synechocystis limnetica", б - СуапоЫит sp. in situ\ в - культивируемые цианобактерии СуапоЫит ВАС 106; г - культивируемые цианобактерии Synechococcus ВАС 22. ТЭМ: д - ультратонкий срез СуапоЫит sp. in situ; е -ультратонкий срез Synechococcus ВАС 0103. Обозначения: кс - клеточная стенка; т - тилаконды; н - нуклеоид; пф - полифосфатные гранулы; л -липццные гранулы.
электронную плотность, иногда наблюдается темный контур вокруг включения. Гра нулы полифосфатов выглядели как включения неправильной формы в периферической части клетки. Область нуклеоида четко выражена как в делящихся, так и во взрослых клетках.
Некультивируемые пикоцианобактерии рода СуапоЫит озера Байкал имеют эллипсоидную форму клеток с гладкой поверхностью, без спинов и пил ей и равномерно делятся в одной плоскости (рис. 1, д). Иногда число тилакоидов в клетке достигает трех, хотя наиболее встречаемым морфогипом в природе являются цианобактерии с двумя тилакоидамн. Микрофотографии типичного представителя рода СуапоЫит — штамма ВАС 67 показывают, что центр клетки занимают полиэдральные тела, а область нуклеоида менее осмиофнльная. Два концентрических тилаконда имеют пристенное положение, на их мембранах располагаются фикобилисомы размером 15 им. Из других включений в клетках были отмечены гранулы полифосфатов, небольшие размеры которых {до 30 нм) свидетельствуют о том, что клетка находится в активной стадии роста. Цианобактерни штамма СуапоЫит ВАС 9990 отличаются от цианобактерий штамма ВАС 67 только формой клетки, внутреннее строение их практически одинаково.
Исследование пикоцианобактерий при помощи ТЭМ показало различия трех родов ЗупесИосухМя, ЗупесЬососст и СуапоЫит. Наиболее четко выраженные отличия наблюдаются между родами БупесЬосуз^ и ЗупесНососсия. Между родом ЗупесИососсих и недавно выделенным родом СуапоЫит различия в большей мере связаны с формой клетки и типом деления, ультраструктура их клеток является весьма сходной.
Суммируя данные всех морфологических исследований, можно говорить о том, что для видов ЗупесЬососст и СуапоЫит данные ультратонкого строения не являются информативными для установления их систематического положения. Хотя ранее для разделения этих родов было предложено использовать ультрастру юурн ые характеристики (Котагек, Апа£що£11(Й5,1999).
Глава 5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕРВИЧНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ГЕНА 165 рРНК ПИКОЦИАНОБАКТЕРИЙ И ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ 5.1. Определение первичных последовательностей гена 168 рРНК некультивируемых пикоцианобактерий озера и филогенетический анализ
Определено б последовательностей некультивируемых цианобактерий из озера Байкал и 4 - из озера Хубсугул длиной 600-633 пар нуклеотидов (начиная с 106 нуклеотида гена). Проведенный анализ полученных последовательностей показал, что все они являются новыми, а наибольшую гомологию они имеют с пикоцианобактериями из альпийских озер н озер Хубсугул и Бива (98-99 %). Филогенетический анализ с высокой поддержкой выявил общую кладу для последовательностей цианобактерий озера Хубсугул (клоны 7, 14) и Байкал (клоны 1, 4, 5). Эта клада также содержит последовательности цианобактерий озер Бива, Павин (Франция) и небольших альпийских озер Европы. Остальные клоны были расположены спорадически,
например, последовательность клона 6 (Байкал) принадлежит ветви, включающей фикоэритрин-доминирующие палочки из озер Окутама и Констанце (Katano, Fukui, 2003; Emst et ai., 2003), Cyanobium rubescens Chang и клон цианобакгерии MW 15-2 субальпийского озера (Crosbie et al., 2003). Клоны 9 (Хубсугул) и 3 (Байкал) являются особенными, они лежат в кладе, образованной некультивируемыми цнанобактернями Р 38-23, MW32B5 и MW38B3 из европейских озер. Также эту кладу дополняют представители р. Cyanobium и Synechococcus из озера Бива. Последовательность клона 2 (Байкал) имеет следующих общих родственников — цианобактерия ARC-11 из озера Эри, клон из озера Мичиган и клон МН 301 из озера Мондси. Интересен тот факт, что в одной кладе лежат цианобакгерии из совершенно разных пресноводных озер, как по происхождению, так и по трофносги.
Таким образом, ближайшими родственниками не культивируемых байкальских цианобактерий являются пресноводные цианобакгерии разнообразных водоемов. Такие данные можно объяснить тем, что озеро Байкал имеет много разных экотопов, где варьируют температура, освещенность и другие экологические факторы, что обуславливает наличие высокого разнообразия пикоцианобактерий.
5.2. Определение первичных последовательностей гена 16S рРНК культивируемых пикоцианобактерий озера Байкал и филогенетический анализ
Получено 24 новых последовательности 16S рДНК культивируемых байкальских цианобактерий, 23 фрагмента гена пикоцианобактерий принадлежат к кластеру Synechococcus/Cyanobium, а один фрагмент — к роду Synechocystis. .Длина фрагментов составляет 535 пар нуклеотидов, нуклеотидный состав на 97-100% совпадает со структурой последовательностей цианобактерий p. Synechococcus!Cyanobium из пресноводных водоемов, что свидетельствует о принадлежности к данному кластеру. Последовательности культур ВАС 103 и 104, а также ВАС 16, 67, 9990, 11, 39 имеют 100 % гомологию участка 16S рРНК гена, такой факт был описан ранее для морфологически различающихся видов бактерий (Palys el al., 1997).
Проведенный филогенетический анализ (рис, 2) показывает высокое сходство всех пресноводных цианобактерий, при этом морские пикоцианобактерии Cyanobium bright, Sy nechococcus T7ccl располагаются отдельно, с бутстреп-поддержкой 99 %. Показано, что 41 % культур цианобактерий оз. Байкал образуют «кластер байкальских цианобактерий», а остальные - распадаются на отдельные ветви вместе с цнанобактернями из других водоемов, «Байкальский кластер» имеет высокую бутстреп-поддержку (73), 50 % культивируемых штаммов пикоцианобактерий в этом кластере имеют идентичные нуклеотидные последовательности на данном участке гена, все штаммы являются фнкоэрнтрин-доминнрующими И имеют красно-коричневую окраску (ВАС 9950, 18, 39, II, 9990, 67, 16, 41, 08), Однако, мы можем утверждать, что все штаммы являются разными видами, с учетом проведенных ранее морфологических исследований. Для 33 % последовательностей пикоцианобактерий (ВАС 103,104,9984,9969,105,106)
--Kfioij 7. Уубсугуп Монголия
"}-Клен 1«. XvCcvrvn. Монголия
Клеи 1.Байкал ДТ—Кло« 4. Байкал I Клон 8, Байкал Г~ syatcttocecais «р. MWM83, «льпмАаии емра Европы *TJ Synechacaccus ар. MW32BS, uiuixAeuit озера Европы mJ" Synechococcussp.LBPI,Бива,Япония П— ОуапоЫит sp. LBOi.Sxea, Я по»*» ^Ненультмируошн ба*гт«рия P3B-23,oa«po Павин, Франции юн 9. ХуЙсутул, Монголии — Клон 1. Хубсугуп. Монголия Клон 3. Байкал (Слон В. Байкал
■ Sywtftoeocem ВАС 22. Байкал Synacftoeoceu« »p. MWIS-i.wvnuiicm« озера Европы Syn*choccccut mp. BO а807, Констанце. Германий SyiHcJncoccuB lutescwtt , Sypecfroeoecu* N04, субальпийское озеро
SwsitmcBttia ВАС ИИ.еийтм
— Syntchococcus "Р OK 09, озеро Окутана, Япония
— Цианобактариальный moHLk1mc-29, озеро Киннерет, Израиль -S ynechococ сиз ар.ЬиЬ-б-Хубсугул
** г Клон 2, Байкал ЛГ ' Synechocaccus ар. МН 301, озеро Мондсй, Австрии
'- Некупыкеирусни бактерия, Мичитан
«1-Synecftpcoccua ВАС 06. Байкал
_и S wcfrofoctia ВАС S91j. Байкал
И -Svnechococeat BACIOt. Байкал
J *-Synecftoeoeiui S9JA-38, озаро Касуммгаура, Япония
I- Synechococcus PS 713, Бива, Японии
-Swiacftoeoeem ВАСЭЭОЗ. Байкал
— Synechococcus ВАС ВЯ10, Байкал Synectmcoccu* ARC 11,озеро Эри Aphtnothte* 0BB21S01 ДупееМиоси» ВАС 10«, Байкал СувпиЫит яр. OBB24S01 Synaellotoceut PS МО Pfr)ec/iocpcc^.BAC 10В. Байкал
i-Sytnehocoecut ВАС 9969. Байкал
I-Synechococcu* ВАС 9»В4. Байкал
Svnachococeus ВАС 103. Байкал
SwiBCftQCoccua ВАС 104. вайкая ВАС 1L Байкал
- Svtiecrmeoeeus ВАС 08. Байкал ISypachocaccus ВАС 41. Байкал ¡¡ВимеЮсосео* ВАСЮ.Еайкал 1?ИЧС||1)ДК1Я ВАС 67. Байкал i Synw/ioeoccm ВАС 9990. Байкал $у[га^ососсиа ВАС 11. Байкал Synachocgccm ВАС 39. Байкап Г $ynechacoccui ВАС 18. Байкал
- Synechococcui ВАС 99». Байкал
_I-СупоЫит bright, Красно* мора
'Srnecftococcus вр.Т7сс1, Средиземное море
Т
-ЗутеШуШ РАС mi. Бамап
—— Aphanothoca naegetl
-Synachocyttii РСС 6MS, Капифориия
— Microcystis оотдолш 0DB33SQ2
Рис. 2. Филогенетическое дерево, построенное на основе последовательностей фрагмента гена 16Б рРНК байкальских пикоцианобактерий и цнанобактерий из ОепВапк. Подчеркнуты виды, последовательности которых получены автором.
было характерно образование кластера «фи коцианин-доми нирующнх» пикоцианобакгерий вместе с другими пресноводными видами. Наиболее близкими родственниками для них являются пикоцианобактерин р. Synechococcus из озера Бива и пресноводная Aphanothece sp. из водоема Италии, последовательность которой описана недавно (Castiglioni et о/., 2005). Все штаммы, кроме ВАС 9810, лежащие в кластере с цианобактериями из японских озер, имеют зеленоватую окраску. Штаммы Synechocystis РСС 6805, Synechocystis ВАС 9721, М. aeruginosa OBB35S02 и Aphanothece naegelt лежат в кластере с высокой бутстреп-подцержкой (97 %), причем байкальский штамм Synechocystis ВАС 9721 образует отдельную ветвь.
Предпринятые нами попытки разделить два очень сходных рода — Synechococcus и Cyanobium - только использованием выбранного фрагмента 16S рибосомного гена показали, что цианобактерии этих родов весьма схожи генетически и могут лежать в одной кладе. Например, типичные представители рода Synechococcus с явно выраженным неравномерным делением и присутствием извитых палочек в культуре-штаммы ВАС 22 и ВАС 0103 лежат в одной кладе с видом Cyanobium rubescens, Это говорит о том, что, скорее всего, разделение родов Synechococcus и Cyanobium является неправомерным, а они принадлежат к одному полифилетичному роду цианобактерий.
В заключение, следует отметить, что в озере присутствуют генетически уникальные пикоцианобактерин, образующие вместе с другими пресноводными цианобактериями общую группу. Большое разнообразие генотипов пнкоцианобактерий можно объяснить разнообразием экологических условий на Байкале — например, в пелагиали и литорали.
Глава 6. ВЫЯВЛЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ МАРКЕРОВ ТОКСИЧНОСТИ ЦИАНОБАКТЕРИЙ ОЗЕРА БАЙКАЛ
Штаммы Microcystis aeruginosa CALU 972 и CALU 973, использованные нами в качестве положительного контроля, являлись токсичными для водных животных, как показали проведенные нами эксперименты. Анализ ДНК этих штаммов выявил ПЦР-продукт, соответствующий по молекулярной массе гену тсуЕ, что свидетельствует о способности этих цианобактерий к синтезу микроцистина.
В суммарной ДНК фито- и пикопланктона озера Байкал и фитопланктона Иркутского и Братского водохранилищ ген тсуЕ не выявлен. В результате тестирования ДНК фитопланктона У сть-Ил и мского водохранилища зарегистрирован ПЦР-продукт длиной 812 пар нуклеотидов, что свидетельствует о наличии тсуЕ гена в цианобактернях этого водоема. Определение нуклеотидной последовательности полученного фрагмента показало его принадлежность гену тсуЕ цианобактерии М. aeruginosa, этот вид известен как один из основных возбудителей массового цветения водоемов во многих странах мира. Микроскопический анализ планктонных проб подтвердил, что в августе 2005 г. в Усть-Илимском водохранилище наблюдалось массовое цветение цианобактерий этого вида, численность их достигала 500 тыс. кл/л (Тихонова и др., 2006).
Построенное филогенетическое дерево на основе полученных нами фрагментов гена тсуЕ показало, что контрольные штаммы отличаются от Л/. aeruginosa Усть-Ил имско го водохранилища, который, в свою очередь формировал отдельную ветвь, занимающую базальное положение по отношению к ним (рис. 3). Контрольный штамм М. aeruginosa CALU 973 на дереве располагается вместе со штаммами этого вида, выделенными во время токсичного цветения водоемов Европы. Штамм М. aeruginosa CALU 972 наиболее близок цианобакгериям из японского озера Касумигаура и озера Мира (Португалия).
— 0. 01 замен
Рис. 3. Филогенетическое дерево, построенное на основе фрагмента отсуЕ-гена кластера микроцистннсинтетазы. Подчеркнуты виды, последовательности которых получены автором.
Таким образом, в озере Байкал, Иркутском и Братском водохранилищах не выявлены цианобакгерии, способные продуцировать микроцистин, а в фитопланктоне Усть-Илимского водохранилища методом ПЦР-диагностики показано наличие цианобактерии М. aeruginosa, содержащей один из генов синтеза микроцистнна — тсуЕ, Концентрация этого вида в Усть-Илимском водохранилище в августе 2005 года была намного выше, чем в Байкале и других исследуемых водохранилищах в это же время. Известно, что массовое развитие токсичных цианобакгерий часто является следствием эвтрофирования водоемов, а концентрации органических веществ и биогенных элементов в Усть-Илимском водохранилище превышают ПДК в несколько раз (Кудринская, Морева, 2004), Использованные в работе методы являются перспективными для быстрого выявления токсичных штаммов и прогнозирования состояния экосистемы водоемов, они помогают установить, какой вид цианобакгерий, продуцирующих микроцистин, присутствует в данном водоеме.
М. aeruginosa; иэолят • Усть-Ипимское водохранилища - М. Л*Гид1пО£* CAIU 972 М. aeruginosa X2ANCYA 5
М. aeruginosa Nies69 -M.vJ.z-J.dis Nie=102
.М.aeruginosa СОС7941 1М. aeruginosa sp. 98 ■ M. «eruginosa XZAMCifA 2S
i"-!ЧгГ* sp. 299B -Kostoc sp.10-102-1
{
Pianfctothi-ijt sp. 226
выводы
1, В составе пикоциаиобактериального сообщества озера Байкал на основе данных флуоресцентной и сканирующей электронной микросколии выявлены представители трех родов цианобаюерий: Synechocystis, Synechococcus, СуапоЫит. Род Synechocystis, помимо ранее известного эндемичного вида Synechocystis llmnetica, представлен Synechocystis sp., образующим агрегаты. Морфотипы с цилиндрическими и палочковидными изогнутыми клетками с неравномерным делением определены нами как представители рода Synechococcus. Морфотипы с коккоидными, эллипсоидными и коротко-цилиндрическими формами клеток и равномерным делением отнесены к роду СуапоЫит.
2, Получено 24 штамма байкальских пикоцианобактерий. По составу пигментов штаммы делятся на две группы: фикоэритрин-доминирующие и фнко цианин-доминирующи е. По данным флуоресцентной и сканирующей электронной микроскопии один штамм принадлежит к роду Synechocystis, 14 — к роду Synechococcus, а остальные — к роду СуапоЫит. К роду Synechococcus отнесены штаммы с полиморфными клетками от кокков до длинных палочек, образующие агрегаты. Цианобакгерии рода СуапоЫит представлены различными морфотипами: одиночные или в парах клетки от коккоидной до палочковидной формы размером от 0,6 до 1 мкм.
3, Анализ нуклеотадных последовательностей гена 16S рРНК генов 6 некультивированных пикоцианобактерий озера Байкал показал, что все полученные последовательности уникальны и схожи с не культивируемым и цианобактериями озера Хубсугул, Бива и других пресноводных озер.
4, Все 24 последовательности 16S рРНК генов культивируемых цианобактерий являются новыми и принадлежат родам Synechocystis, Synechococcus и СуапоЫит. Показано, что 41 % культур цианобактерий образуют «кластер байкальских цианобактерий», а остальные распадаются на отдельные ветви вместе с цианобактериями из пресноводных олиготрофных и мезотрофных водоемов. Использование фрагмента рибосомного гена для систематики пикоцианобактерий выявило полифилетичность родов СуапоЫит и Synechococcus и тенденцию схожести пикоцианобактерий по экотопам.
5, Проведен поиск гена синтеза микроцистнна тсуЕ в суммарной ДНК пнко- и ф ито планктонной фракций байкальской воды и ангарских водохранилищ. Установлено, что цианобактерии озера Байкал, Иркутского и Братского водохранилищ не содержат гена тсуЕ в отличие от цианобактерий Усть-Илимского водохранилища, в котором этот ген был обнаружен при помощи молекулярно-биологических методов у вида Microcystis aeruginosa.
Основные работы, опубликованные по теме диссертации
). Пензина Э.Э. Использование люминесцентных методов в систематике водорослей озера Байкал / Пензина Э.Э., Тихонова И.В. // Тезисы лекций и докладов 5 Всероссийской школы-семинара "Люминесценция и сопутствующие явления".-Иркутск,2000,- С.60.
2. Тихонова И.В. Подходы к молекулярно-биологическим исследованиям байкальских автотрофных пнкоцианобактернй / Тихонова,И.В.. Белых О.И. // Тез. докл. конф. «Оценка современного состояния микробиологических исследований в Восточно-Сибирском регионе».— Иркутск, 2002.— С. 123-124.
3. Kalyuzhnaya O.V. Investigation of the cyanobacterial sodB gene from Anabaena sp. of Lake Baikal using PCR, direct sequencing and molecular cloning methods / Kalyuzhnaya O.V., Konstantinov Y.M., Belykh O.I., Tikhonova l.V. // Abstracts of inter. Baikal symposium on Microbiology (IBSM-2003) "Microorganisms in ecosystems of lakes, rivers and reservoirs", - Irkutsk, 2003. — P.58-59.
4: Belykh O.I. Autotrophic picoplankton of Lake Baikal: Species composition, abundance and structure / Belykh O.I., Sorokovikova E.G., Saphonova T.A., Tikhonova l.V. // Abstracts of the third Inter. Simp. Ancient Lakes: Speciation, development in time and space, natural history.-Irkutsk, 2002.-P. 21.
5. Belykh O.I. Cyanobacteria of Lake Khubsugul / Belykh O.I., Tikhonova l.V. // Abstracts , of inter. Baikal symposium on Microbiology (IBSM-2003) "Microorganisms in ecosystems of lakes, rivers and reservoirs'". — Irkutsk, 2003. — P. 180-181.
6. Tikhonova l.V. Biodiversity of picoplankton¡c cyanobacteria in takes Baikal and Hovsgol / Tikhonova I.V.. Belykh O.I., Sorokovikova E.G. // Abs. of «16* Symposium of the Internationa) Association for Cyanophyta Research». — Luxembourg, 2004. - P. 66-67.
7. Белых О.И. Автшрофный пикопланктон крупнейших озер Центральной Азии / Белых О.И., Сороковикова Е.Г.. Тихонова И.В. // Тезисы международной конференции "Научные основы сохранения водосборных бассейнов: междисциплинарные подходы к управлению природными ресурсами", — Улан-Удэ - Улан-Батор, 2004. - С. 135-137.
8. Белых О.И. Продуктивность автотрофкого пикопланктона в озерах Байкал и Xy6cyiyn / Белых О.И., Сороковикова Е.Г., Тихонова, И.В. It Материалы международной конференции "Первичная продукция водных систем".- Борок,2005.-С. 11-13.
9. Tikhonova l.V. Comparing autotrophic picoplankton in Great freshwater Lakes of Central Asia: Baikal and Hovsgol / Tikhonova I.V.. Belykh O.I., Sorokovikova E.G. // Abs. of Third inter, conf. «Environmental Change in Central Asia». — Mongolia, 2005. - P. 110-111.
10. Тихонова И. В .Молекулярно-био логические исследования пнкоцианобактернй озера Байкал / Тихсщдв^ И. В.. Белых О.И. // Материалы III
межд. конф. по актуальным проблемам соврем, альгологии. - Харьков, 2005. -С. 161.
11. Тихонова И В. Выявление токсичных и потенциально токсичных видов цианобактерий в байкальской воде / Тихонова ИД.. Белых О.И., Помазкнш Г.В., Гладких A.C. // Тез. докл. четвертой Верещагинской Байкальской . конференции. - Иркутск, 2005. - С. 190-191.
12. Тихонова И.В. Выявление генетических маркеров токсичности цианобактерий в озере Байкал / Тихонова И.В.. Белых ОЛ. // Тр. Третьей интегр. конф. молодых ученых СО РАН и ВШ - Иркутсж, 2005. - С. 129-130.
13. Belykh O.I. Autotrophic Picoplankon of Lake Baikal: Species Composition and Structure / Belykh O.I., Sorokovikova E.G., Tikhonova I.V.. Saphooova ТЛ. // Hydrobiology. - 2006. - V. 568, sup). 1.-P. 9-17.
14. Belykh O.I. Abundance, moiptiofogical diversity, and spatial distribution of autotrophic picoplankton in Lake Hovsgol (Mongolia) / Belykh О.1., Sorokovikova E.G., TikhoQQv» I-V-. Fedotov A.F. // Aquatic Ecosystem Health ft Management -
2005.-V.8(4).-P. 251-262.
15. Тихонова ИД. Анализ цианобактерий озера Байкал и Усть-Илнмского водохранилища на наличие гена синтеза ыикроцистина / Ти^спиокд И-В-- Белых О.И., Поиаэкина Г.В., Гладких A.C. // Докл. Акад. Наук. - 2006. - Т. 409(3). - С. 1-3.
16. Тихрнфва ИД. Выявление потенциально токсичных циадобмяернй ж оэере Байкал и водохранилищах Иркутской области с помощью вояшераэ&ой цепной реакции / Тихонова И.В.. Гладких A.C., Белых ОН., Сорокаишш ЕГ. // Бюлл. Восточно-Сибирского Научного Центра. - 2006. - Т. 2. - С. 202-205.
17. Белых О.И. Выявление генов синтеза токсинов у цианобактерий озера Байкал и водоемов Байкальского региона / Белых О JH., Сороюшжоаа ЕР., Тихонова ИД.. Гладких A.C. // Международный научный междисциплинарный семинар «Новые технологии в ннтеграггивной биологии и медицине». - Патшйа,
2006.-С. П.
■ 18. Гладких A.C. Выявление токсичных цианобактерий а оэере Байкал к водохранилищах Иркутской области / Гладких A.C., Белых ОД- ТииддЦ И.В-. Помазкина Г .В., Сороковюсова ET. // Тез. Всероссийской конференции. — Улан-Удэ, 2006.-С. 31.
Подписано к печати 16.11.2006 г. Формат 60*84/16. Объем I п.л. Тирах 100 »и. Заказ № 365. Издательство Института географии им. В. Б. Сочавы СО РАН 664033 г. Иркутск, ул. Улан-Баторская, I
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Тихонова, Ирина Васильевна
Введение.
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. Географические и экологические характеристики озер Байкал, Хубсугул и водохранилищ ангарского каскада.
1.2. Систематика цианобактерий.
1.3. Морфология и ультраструктура цианобактерий.
1.3.1. Морфология цианобактерий порядка Chroococcales.
1.3.2. Ультраструктура цианобактерий.
1.4. Экология цианобактерий.
1.5. Пресноводные пикоцианобактерии.
1.6. Байкальские пикоцианобактерии.
1.7. Молекулярно-биологический подход в экологических исследованиях цианобактерий.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Морфологические и генетические особенности пикопланктонных цианобактерий озера Байкал"
Актуальность темы. Автотрофный пикопланктон (АРР) - это мельчайшие планктонные водоросли и цианобактерии размером 0,2-2,0 мкм (Sieburth et al., 1978; Stockner, Antia, 1986; Михеева, Лукьянова, 1998). Особенно велико значение автотрофного пикопланктона в олиготрофных водах, где он создает до 70 % первичной продукции (Stockner, 1991; Weisse et al., 1993; Voros et al., 1998).
Байкал является крупнейшим пресноводным олиготрофным водоемом Центральной Азии. Геологические, географические и гидрологические особенности озера определяют уникальность и высокую степень эндемизма его обитателей (Lake Baikal, 1998). Численность АРР достигает в озере 1 млн кл/мл, а вклад в первичную продукцию составляет 60-80 % (Вотинцев и др., 1972; Бондаренко, Гусельникова, 1989; Nagata et al., 1994). Байкальский АРР на 90 % состоит из цианобактерий, а на 10 % - из эукариотических водорослей (Поповская, Белых, 2003). Несмотря на важное значение, которое играют в Байкале пикопланктонные цианобактерии, степень их изученности недостаточна из-за небольших размеров объекта и ограниченного набора морфологических признаков. Для уточнения систематического положения пикоцианобактерий ранее были весьма успешно использованы молекулярно-биологические методы (Britschgi et al., 1991; Nelissen et al., 1996; Niibel et al, 1997; Ernst et al., 1995, 2003; Fuller et al., 2003). Поэтому предполагается применить комплексный подход в изучении биоразнообразия байкальских пикоцианобактерий с использованием методов морфологии и молекулярной биологии.
Другим важным аспектом в исследованиях цианобактерий является вопрос о потенциальной токсичности некоторых видов. Известно, что такое экологическое явление, как «цветение» водоемов, обусловленное массовым развитием цианобактерий, нередко приводит к появлению в воде токсинов (Dunn, 1996; Kurmayer et al., 2003; Сох, 2005; Xie et al., 2005; Hotto et al., 2005; Rosa et al., 2005; Gkelis et al., 2005; Vieira et al., 2005). Наиболее распространенным среди них является микроцистин, который вызывает отравления и поражения печени у человека и животных (Dunn, 1996; Kurmayer et al, 2003). Молекулярно-биологическими методами было показано, что гены, участвующие в синтезе микроцистина, распространены спорадически среди 5 родов цианобактерий (Rantala et al, 1998). Описано, что некоторые представители родов Synechocystis и Synechococcus содержат гены микроцистинсинтетазы (Rantala et al, 1998; Christiansen et al, 2001). Так как численность цианобактерий высока в течение всего года, исследования байкальских цианобактерий на содержание гена токсичности весьма важны как с научной точки зрения, так и для оценки качества воды.
Цель и задачи исследования. Цель данной работы - исследование морфологии, ультраструктуры и определение последовательности гена 16S рРНК байкальских пикопланктонных цианобактерий и выявление потенциально токсичных цианобактерий.
Для этого необходимо было решить следующие задачи:
1. Описать морфологию и ультраструктуру пикопланктонных цианобактерий озера Байкал in situ с помощью оптической и электронной микроскопии.
2. Выделить штаммы пикоцианобактерий озера Байкал и описать их, используя микроскопические методы.
3. Охарактеризовать генетическое разнообразие байкальских цианобактерий in situ в сравнение с цианобактериями из других водоемов.
4. Определить нуклеотидные последовательности фрагментов 16S рибосомного гена культивируемых байкальских цианобактерий и сравнить с последовательностями цианобактерий из других пресноводных экосистем.
5. Выявить генетический маркер токсичности цианобактерий - ген синтеза микроцистина {тсуЕ) - в суммарной ДНК пико- и фитопланктонной фракций озера Байкал и водоемов с различной степенью трофности.
Научная новизна работы. Впервые дана комплексная характеристика байкальских пикопланктонных цианобактерий, в работе приводятся данные микроскопических, ультраструктурных и молекулярно-биологических исследований пикоцианобактерий в культурах и in situ. Выявлено высокое морфологическое и генетическое разнообразие пикоцианобактерий озера Байкал и проведен сравнительный анализ байкальских пикоцианобактерий с цианобактериями олиготрофных, мезотрофных и эвтрофных озер. Впервые проведено исследование ДНК байкальских цианобактерий и цианобактерий ангарских водохранилищ с использованием специфических праймеров к гену тсуЕ и показано наличие потенциально токсичных цианобактерий в фитопланктоне Усть-Илимского водохранилища.
Практическая значимость работы. Исследование байкальского автотрофного пикопланктона позволило уточнить систематическое положение байкальских цианобактерий, ревизия была проведена согласно современной систематике. Нами получены значения биообъемов клеток различных морфотипов байкальских пикоцианобактерий, полученные данные можно использовать при мониторинговых исследованиях озера Байкал. Создан банк данных генетических последовательностей 16S рДНК байкальских пикоцианобактерий, зарегистрировано 24 последовательности культивируемых цианобактерий (DQ399905-DQ39907, DQ401110, DQ401111, DQ403805-DQ403807, DQ407506-DQ407518, DQ422952, DQ459297, DQ459298) и 6 последовательностей некультивируемых цианобактерий (DQ418752, DQ297458-DQ297462), получены и зарегистрированы генетические последовательности цианобактерий озера Хубсугул (DQ297464, DQ302754, DQ302755, DQ422951). Использованные в работе методы молекулярно-биологической детекции токсичных цианобактерий являются перспективными для быстрого выявления токсичных видов в различных экосистемах и могут быть применены для мониторинга любых водных объектов и оценки качества воды в них. Эти методы позволяют в короткий срок определить не только наличие токсичных цианобактерий, но и идентифицировать их видовую принадлежность.
В диссертацию вошли результаты, полученные при финансовой поддержке грантов РФФИ № 02-04-49756, 05-04-48624; РФФИ-Байкал № 0104-97217, 05-04-97222; молодежный проект СО РАН № 140; НШ-2195.2003.4 (поддержка ведущих научных школ) и гранта 2006 - РИ - 112 /001/007. Защищаемые положения:
1. В автотрофном пикопланктоне озера Байкал доминируют цианобактерии родов Synechocystis, Synechococcus и Cyanobium. Байкальские пикоцианобактерии, несмотря на сходство с другими пресноводными цианобактериями, являются морфологически и генетически отличными.
2. Показано, что цианобактерии озера Байкал, Иркутского и Братского водохранилищ не содержат гена синтеза микроцистина. В Усть-Илимском водохранилище выявлены цианобактерии Microcystis aeruginosa, которые являются потенциально токсичными. Апробация работы. Основные результаты работы представлены на научных мероприятиях: международные симпозиумы «SIAL» (Иркутск, 2002), «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек и водохранилищ» (Иркутск, 2003), «1АС 2004» (Люксембург, 2004), «Научные основы сохранения водосборных бассейнов: междисциплинарные подходы к управлению природными ресурсами» (Улан-Удэ - Улан-Батор, 2004); международная конференция «Изменения климата и окружающей среды в Центральной Азии» (Улан-Батор, 2005); молодежная конференция-школа «Научные школы Сибири» (Иркутск, 2005); 4 международная Верещагинская конференция (Иркутск, 2005); III международная конференция по актуальным проблемам современной альгологии (Харьков, 2005); международная конференция «Первичная продукция водных систем» (Борок, 2005); международная конференция «Новые технологии в интегративной медицине и биологии» (Паттайя, 2006), Всероссийская конференция с международным участием «Биоразнообразие экосистем Внутренней Азии» (Улан-Удэ, 2006).
Публикации и личный вклад автора. По результатам диссертации опубликовано 18 печатных работ, из них четыре статьи в центральных и зарубежных журналах. Экспериментальные данные были получены автором как самостоятельно, так и в совместных экспериментах. Результаты, представленные в диссертации, защищаются впервые.
Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю к.б.н. О.И. Белых, а также своим соавторам: Е.Г. Сороковиковой, А.С. Гладких, Г.В. Помазкиной, Э.Э. Пензиной. Автор благодарен сотрудникам отдела Ультраструктуры Клетки за ценные указания и помощь в работе.
Заключение Диссертация по теме "Экология", Тихонова, Ирина Васильевна
выводы
1. В составе пикоцианобактериального сообщества озера Байкал на основе данных флуоресцентной и сканирующей электронной микроскопии выявлены представители трех родов цианобактерий: Synechocystis, Synechococcus, Cyanobium. Род Synechocystis, помимо ранее известного эндемичного вида Synechocystis limnetica, представлен Synechocystis sp., образующим агрегаты. Морфотипы с цилиндрическими и палочковидными изогнутыми клетками с неравномерным делением определены нами как представители рода Synechococcus. Морфотипы с коккоидными, эллипсоидными и коротко-цилиндрическими формами клеток и равномерным делением отнесены к роду Cyanobium.
2. Получено 24 штамма байкальских пикоцианобактерий. По составу пигментов штаммы делятся на две группы: фикоэритрин-доминирующие и фикоцианин-доминирующие. По данным флуоресцентной и сканирующей электронной микроскопии один штамм принадлежит к роду Synechocystis, 14 - к роду Synechococcus, а остальные - к роду Cyanobium. К роду Synechococcus отнесены штаммы с полиморфными клетками от кокков до длинных палочек, образующие агрегаты. Цианобактерии рода Cyanobium представлены различными морфотипами: одиночные или в парах клетки от коккоидной до палочковидной формы размером от 0,6 до 1 мкм.
3. Анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК генов 6 некультивированных пикоцианобактерий озера Байкал показал, что все полученные последовательности уникальны и схожи с некультивируемыми цианобактериями озера Хубсугул, Бива и других пресноводных озер.
4. Все 24 последовательности 16S рРНК генов культивируемых цианобактерий являются новыми и принадлежат родам Synechocystis, Synechococcus и Cyanobium. Показано, что 41 % культур цианобактерий образуют «кластер байкальских цианобактерий», а остальные распадаются на отдельные ветви вместе с цианобактериями из пресноводных олиготрофных и мезотрофных водоемов. Использование фрагмента рибосомного гена для систематики пикоцианобактерий выявило полифилетичность родов Cyanobium и Synechococcus и тенденцию схожести пикоцианобактерий по экотопам.
5. Проведен поиск гена синтеза микроцистина тсуЕ в суммарной ДНК пико- и фитопланктонной фракций байкальской воды и ангарских водохранилищ. Установлено, что цианобактерии озера Байкал, Иркутского и Братского водохранилищ не содержат гена тсуЕ в отличие от цианобактерий Усть-Илимского водохранилища, в котором этот ген был обнаружен при помощи молекулярно-биологических методов у вида Microcystis aeruginosa.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тихонова, Ирина Васильевна, Иркутск
1. Антипова Н.Л. Сезонные и годовые изменения фитопланктона в озере Байкал /Н.Л. Антипова // Труды ЛИН СО РАН. 1963. - Т. 22. - С. 12-28.
2. Атлас озера Хубсугул / Гл. редактор Б.А. Богоявленский / Омск: ГУГК СССР, 1989.- 118 с.
3. Атлас-Определитель пелагионтов Байкала / О.А. Тимошкин, Г.Ф. Мазепова, Н.Г. Мельник и др. / Новосибирск, Наука, 1995. 693 с.
4. Байкал: Атлас / Гл. редактор Г.И. Галазий: М.: Роскартография, 1993.- 160с.
5. Беликов С. И. Определение таксономического положения бактерий из озера Байкал методом анализа последовательностей фрагментов 16S рРНК / С.И. Беликов, М.А. Грачев, Т.И. Земская и др. // Микробиология. -Т. 65.-С. 855-864.
6. Белькова Н.Л. Видовое разнообразие глубоководных микроорганизмов, выявленное по последовательностям 16S рРНК / Н.Л. Белькова, Л.Я. Денисова, Е.Н. Манакова и др. // Доклады Академии Наук. -1996.- Т. 348.-С. 692-695.
7. Белькова Н.Л. Применение метода гибридизации in situ для выявления цианобактериальных клеток / Н.Л. Белькова, Х.М. Чунг, Т.С. Ан // Микробилогия. 2002. - Т. 71. - С.381-386.
8. Белых О.И. Автотрофный пикопланктон озера Байкал / О.И. Белых, Е.И. Заика, Е.В. Березиков // Сибирский экологический журнал. 1999. - Т. 6.-С. 631-637
9. Белых О.И. Автотрофный пикопланктон Телецкого озера / О.И. Белых, Т.А. Сафонова // Матер. III межд. конф. по актуальным проблемам современной альгологии, Харьков, 2005. С. 161.
10. Определитель бактерий Берджи / Хоулт Д., Криг Н., Снит П. и др. // Москва, Мир. 1997. - 432 с.
11. Бондаренко Н.А. Значение водорослей пико- и нанопланктона в продукционных процессах в оз. Байкал / Н.А. Бондаренко, Н.Е. Гусельникова // Биологические науки. 1989. - Т. 12. - С. 34-36.
12. Вассер С.П. Водоросли / С.П. Вассер, Н.В. Кондратьева, Н.П. Масюк и др. // Киев, Наукова Думка. 1989. - 608 с.
13. Верещагин Г.Ю. Байкал. / Г.Ю. Верещагин // Иркутск. -1947.- 170 с.
14. Воробьева С.С. Фитопланктон водоемов Ангары / С.С. Воробьева // Новосибирск: Наука, 1995. 126 с.
15. Воробьева С.С. Современное состояние и прогноз формирования ангарских водохранилищ / С.С. Воробьева, Т.А. Стрижова, Т.И. Земская // Прогнозирование экологических процессов. Новосибирск: Наука, 1986. -С. 159-164.
16. Вотинцев К.К. О значении ультрананнопланктонных водорослей в создании первичной продукции Байкала в летний период / К.К. Вотинцев, А.И. Мещерякова, Г.И. Поповская // Гидробиологический журнал. 1972. -Т. 8, №3.-С. 21-27.
17. Голлербах М.М. Синезеленые водоросли / М.М. Голлербах, Е.К. Косинская, В.И. Полянский // Определитель пресноводных водорослей СССР 1953. - Москва, Советская наука. - 650 с.
18. Громов Б.В. Цианобактерии в биосфере. / Б.В. Громов // Соросовский образовательный журнал. 1996. - Т. 9. - С. 33-39.
19. Громов Б.В. Ультраструктура синезеленых водорослей / Б.В. Громов // Ленинград, Наука. 1976. - 94 с.
20. Денисова Л.Я. Биоразнообразие бактерий на различных глубинах южной котловины озера Байкал, выявленное по последовательностям 16S рРНК / Л.Я. Денисова, Н.Л. Белькова, И.И.Тулохонов и др. // Микробиология. 1999. - Т. 68. - С. 547-556.
21. Загоренко Г.Ф. Структура и экологические данные о летнем фитопланктоне озера Хубсугул в 1971 году / Г.Ф. Загоренко, О.М. Кожова // Натуральные условия и ресурсы Прихубсугулья: Сб. статей., Иркутск, 1973.-С. 329- 340.
22. Кожов М.М. Живой мир озера Байкал / М.М Кожов // Иркутск. -1947.-305 с.
23. Кожов М.М. О планктоне оз. Хубсугул (Косогол) / М.М. Кожов, Н.Л. Антипова, Г.Л. Васильева и др. // Лимнологические исследования Байкала и некоторых озер Монголии: Сб. статей. М.: Наука, 1965. - С. 181-190.
24. Кожова О.М. Определение продукции фитопланктона в районе Селенгинского мелководья / О.М. Кожова // Известия СО АН СССР. -1966.-№3,- С. 40-52.
25. Кондратьева Т.М. Темпы деления и продукция водорослей / Т.М. Кондратьева // Биологическая структура и продуктивность планктонных сообществ Средиземного моря Киев, Наук. Думка, 1975. - С. 164-174.
26. Кондратьева Н.В. Строение клеточных покровов Cyanophyta / Н.В. Кондратьева // Альгология. 1993. - Т. 3. - С. 96-109.
27. Михеева Т.М. Количественное развитие фототрофного пикопланктона в пресноводных экосистемах / Т.М. Михеева, Е.В. Лукьянова // Гидробиологический журнал. 1998. - Т. 34, № 3. - С. 3-17.
28. Пиневич А.В. Проблемы классификации цианей и других прокариотных оксифотобионтов / А.В. Пиневич // Ботанический журнал -1999.-Т. 84-С. 1-19.
29. Поповская Г.И. Новый вид рода Synechocystis Sauv. в планктоне озера Байкал / Г.И. Поповская // Новости систематики низших растений. -Ленинград, Наука 1968. - С. 3-5.
30. Поповская Г.И. О фитопланктоне пелагиали Байкала / Г.И. Поповская // Круговорот вещества и энергии в озерных водоемах. 1975. -С. 16-20.
31. Поповская Г.И. Фито- и пикопланктон (ультрананофитопланктон) оз. Байкал / Г.И. Поповская // Проблемы экологии Прибайкалья: Тезисы докладов к III Всесоюз. науч. конф. -1988. С. 122-123.
32. Поповская Г.И. Этапы изучения автотрофного пикопланктона озера Байкал / Г.И.Поповская, О. И. Белых // Гидробиологический журнал. -2003.-Т. 39.-С. 12-24.
33. Семенова Е.А. Изучение видового разнообразия пикопланктона озера Байкал путем сравнительного анализа 5'-концевых участков генов 16S рРНК / Е.А. Семенова, К.Д. Кузнеделов // Молекулярная Биология. -1998.-Т. 32.-С. 895-901.
34. Тарасова Е.Н. Компоненты трофического статуса в водах озер Байкал, Хубсугул и Телецкое / Е.Н. Тарасова // Сибирский экологический журнал. 1998. - Т.5. - С. 383-390.
35. Тихонова И.В. Анализ цианобактерий озера Байкал и Усть-Илимского водохранилища на наличие гена синтеза микроцистина / И.В. Тихонова, О.И. Белых, Г.В. Помазкина и др. // Доклады Академии Наук -2006. -Т. 409, №3.-С. 1-3.
36. Шалапенок JI.C. Особенности ультраструктуры и спектральные характеристики фикоэритрина черноморских цианобактерий в культуре / JI.C. Шалапенок, А.А. Шалапенок // Микробиология. 1993. - Т. 62. - С. 96-102.
37. Albertano P. Cell structure of planktic cyanobacteria in the Baltic Sea / P. Albertano, D. Di Somma, D. Leonardi et al. II Archives of Hydrobiological and Algological Studies. 1996. - V. 83. - P. 29-54.
38. Albertano, P. Cyanobacterial picoplankton from the Central Baltic Sea: cell size classification by image-analyzed fluorescence microscopy / P. Albertano, D. Somma, E. Capucci // Journal of Plankton Research 1997. - V. 10-P.1405-1417.
39. Andreoli С. An ultructructural research on natural populations of picoplankton from two brackish water environments in Italy / C. Andreoli, N. Rascio, F. Dalla Vecchia et al. II Journal of Plankton Research. 1989. - V.l 1. -P. 1067-1074.
40. Azam F. The ecological role of water-column microbes in the sea / F. Azam, T. Fenchel, J.G. Field et al. II Marine Ecology Progress Series. 1983. -V. 10.-P. 257-263.
41. Bailey-Watts A.E. Freshwater primary production by a blue-green alga of bacterial size / A.E. Balley-Watts, M.E. Bindloss, J. H. Belcher // Nature. -1968.-V. 220.-P. 1344-1345.
42. Becker S. Genetic diversity and distribution of periphytic Synechococcus spp., in biofilms and picoplankton of Lake Constance / S. Becker, A. K. Singh, C. Postius et al II FEMs Microbiology Ecology. 2004. - V. 49. - P. 181-190.
43. Becker S. Quantitave tracing, by taq nuclease assays, of a Synechococcus ecotype in a highly diversified natural population / S. Becker, M. Fahrbach, P. Boger et al. И Applied and Environmental Microbiology. 2002. -V. 68. - P. 4486-4494.
44. Belykh O.I. Autotrophic picoplankton in Lake Baikal: abundance, dynamics, and distribution / O.I. Belykh, E.G., Sorokovikova // Aquatic Ecosystems Health & Management. 2003. -V. 3. - P. 251-261.
45. Ben-Porath J. Detection and characterization of cyanobacterial nijH genes / J. Ben-Porath, J. Zehr // Applied and Environmental Microbiology. -1994.-V. 60.-P. 880-887.
46. Bonen L. Cyanobacterial evolution: results of 16S ribosomal ribonucleic sequence analyses / L. Bonen, W.F Doolittle, G.E. Fox // Canadian Journal of Biochemistry. 1979. -V. 57. - P. 879-888.
47. Boraas M.E. Determination of eubacterial size and cyanobacterial size and number using epifluorescence / M.E. Boraas, D.W. Bolgrien, D.A. Holen // Internationale Revue der Gesamte Hydrobiologie 1991. - V. 76. - P. 537-544.
48. Brahamsha B.A. Genetic Manipulation System for Oceanic Cyanobacteria of the Genus Synechococcus / B.A. Brahamsha // Applied and Environmental Microbiology. 1996. - V. 62. - P. 1747-1751.
49. Britschgi T.B. Phylogenetic analysis of a natural marine bacterioplankton population by rRNA gene cloning and sequencing/ T.B. Britschgi, S.J. Giovannoni // Applied and Environmental Microbiology 1991. -V. 57.-P. 1707-1713.
50. Burkill P. Synechococus and its importance to the microbial food web of the northwestern Indian Ocean / P. Burkill, R. Leakey, N. Owens et al. II Deep Sea Research. 1993. -V. 40. - P. 773-782.
51. Callieri C. Freshwater autotrophic picoplankton: a review / C. Callieri, G. Stockner// Journal of Limnology -2002. -V. 61.-P. 1-14
52. Callieri C. Photosynthetic efficiency and seasonality of autotrophic picoplankton in Lake Lago Maggiore after its recovery / C. Callieri, R. Piscia // Freshwater Biology. -2002. -V. 47. P. 941-956.
53. Callieri C. Picoplankton of Lake Maggiore, Italy / C. Callieri, M.L. Pinolini // Internationale Revue der Gesamte Hydrobiologie. 1995. - V. 80. -P. 491-501.
54. Campbell L. Photosynthetic picoplankton community structure in the subtropical North Pacific Ocean near Hawaii (station ALOHA) / L. Campbell, D. Vaulot // Deep Sea Researches. 1993. - V. 40. - P. 2043-2060.
55. Caron D.A. Chroococcoid cyanobacteria in Lake Ontario: seasonal and vertical distribution during 1982 / D.A. Caron, F.R. Pick, D.R.S. Lean // Journal ofPhycology. 1985. -V. 21. -P. 171-175.
56. Castenholz R.W. Species usage, concept, and evolution in the Cyanobacteria (blue-green algae) / R.W. Castenholz // Journal of Phycology. -1992.-V. 28. -P.737-745.
57. Castiglioni B. Development of a universal microarray based on the ligation detection reaction and 16S rRNA gene polymorphism to target diversity of cyanobacteria / B. Castiglioni, E. Rizzi, A. Frosini et al. II Microbiology. -2005.-V. 70. P. 7161-7172.
58. Chang P.T. Zwei neue Synechococcus-Arten aus dem Zurich-see. Schweiz. Ztschr. / P.T. Chang // Hydrology. 1980. - V. 42. - P. 247-254.
59. Chisholm S.W. The individual cell in phytoplankton ecology: cell cycle and applications of flow cytometry / S.W Chisholm, E. V. Armbrust, R. J. Olson // Canadian Bulletin of Fisheries and Aquatic Sciences. 1986. - V. 214. - P. 343-369.
60. Cohen Ye. The Cyanobacteria Ecology, Physiology, and molecular Genetics: Chapter 98 / Ye. Cohen, M. Gurevitz // The Prokaryotes: Handbook on the biology of bacteria / Springer-Verlag, New-York Inc., 1992 - P. 2077-2083.
61. Copre W. An electron microscopic study of picoplanktonic organisms from Small Lake / W. Copre, T. Jensen // Microbial Ecology. 1992. - V. 24. -P. 181-197.
62. Cox P.A. Diverse taxa of cyanobacteria produce (3-N-methylamino-L-alanine, a neurotoxic amino acid. / P.A. Cox, A.B. Sandra, J.M. Susan et al. II Proceeding of National Academy of Sciences. 2005. - V. 102, № 14. - P. 5074-5078.
63. Craig S.R. The distribution and contribution of picoplankton to deep photosynthetic layers in some meromictic lakes / S.R. Craig // Acta Academiae Aboensis. 1987. - V. 47. - P. 55-81.
64. Cronberg G. Cyanodiction imperfectum, a new chroococcal blue-green alga from Lake Trummen, Sweden / G. Cronberg // Archiv fuer Hydrobiologie. 1981. - V. 62, №2.-P. 101-110
65. Drews G. Beitrage zur Cytologie der Blaualgen. I. Untersuchungen zur Substruktur von Phormidium uncinatum Gom. / G. Drews, W. Niklowitz // Archives of Microbiology. 1956. - V. 24. - P. 134-146.
66. Dunn J. Algae kills dialysis patients in Brazil / J. Dunn // British Medical Journal. 1996. - V. 312. - P. 1183-1184.
67. Edwards M.R. Ultrastructure of the thermophilic blue-green alga, Synechoccus lividus Copeland / M.R. Edwards, D.S. Berns, W.C. Ghiorse et al. // Journal of Phycology. 1968. - V. 4. - P. 283-298.
68. Ernst A. Cyanobacterial picoplankton from Lake Constanse / A. Ernst, G. Sandmann, C. Postius et al // Botanica Acta. 1992. - V. 105. - P. 161-167.
69. Ernst A. Ecosystem-dependent adaptive radiations of picocyanobacteria inferred from 16S rRNA and ITS-1 sequence analysis / A. Ernst, S. Becker, U.I. Wollenzien et al // Microbiology. 2003. - V. 149. - P. 217-228.
70. Ernst A. Genetic diversity among Synechococcus spp. (cyanobacteria) isolated from the pelagial of Lake Constance / A. Ernst, P. Marschall, C. Postius // FEMs Microbiology Ecology. 1995. - V. 17 - P. 197-204.
71. Fogg G.E. The Blue-green algae / G.E. Fogg, W.D.P. Stewart, P. Fay et al II Academic Press Inc., New York, 1973. 459 c.
72. Glockener F.O. An in situ hybridization protocol for detection and identification of planktonic bacteria / F.O. Glockener, R. Amann, A. Alfreider et al. // Systematic and Applied Microbiology. 1996. - V. 19. - P. 403-406
73. Glockener F.O. Bacterioplankton composition of lakes and oceans: a first comparison based on fluorescence in situ hybridization / F.O. Glockener, B.M. Fuchs, R. Amann // Applied and Environmental Microbiology. 1999. - V. 65.-P. 3721-3726.
74. Glover H.E. Light quality and oceanic ultraphytoplankters / H.E. Glover, M.D. Keller, R. R. Guillard // Nature. 1986. - V. 319. - P. 142-143.
75. Goleski J. Studies on ultrastucture and composition of cell wall of the cyanobacterium Anacystis nidulans / J. Goleski // Archives of Microbiology. -1977.-V. 114.-P. 35-41.
76. Goleski J. Ultrastructure of cell wall and thylakoid of membranes of termofilic cyanobacterium Synechococcus lividus under the influence of the temperature shifts / J. Goleski // Archives of Microbiology. 1979. - V. 120 - P. 125-133.
77. Grilli C.M. Cytology of long-term desiccation in the desert cyanobacterium Chroococcidiopsis (Chroococcales) / C.M. Grilli, R. Ocampo-Friedmann, E.I. Friedmann // Phycologia. 1993. - V. 32. - P. 315-322
78. Hawley G. R. Survey of algal picoplankton from lakes in five continents / G.R. Hawley, B.A. Whitton // Verhand International Verein of Limnologists. -1991.-V. 24.-P. 1220-1222.
79. Herdman M. Deoxyribonucleic acid base composition of cyanobacteria / M. Herdman, M. Janvier, M. Waterbury et al. II Journal of General Microbiology. 1979.-V. 111.-P. 63-71.
80. Hobbie J.E. Use of nuclepore filters for counting bacteria by fluorescence microscopy / J.E. Hobbie, R.J. Daley, S. Jasper // Applied and Environmental Microbiology. 1977. - V. 33. - P. 1225-1228.
81. Hoiczyk E. Cell Wall: News from an Unusual Prokaryotic Envelope / E. Hoiczyk, A. Hansel // Journal of Bacteriology. 2000. - V. 182. - P. 1191-1199.
82. Jasser I. Potential effect of abiotic factors on the abundance of autotrophic picoplankton in four boreal lakes / I. Jasser, L. Arvola // Journal of Plankton Researches. 2003. - V. 25. - P. 873-883.
83. Johnson P. W. Chroococcoid cyanobacteria in sea: a ubiquitous and diverse phototropic biomass / P.W. Johnson, J.M. Sieburth // Limnology and Oceanography. 1979. -V. 24. - P. 928-935.
84. Joint I. R. Production of picoplankton and small nanoplankton in the Celtic Sea / I.R. Joint, A.J. Pomroy // Marine Biology. -1983. V. 77. - P. 19-27.
85. Капа T.M. Effect of irradiances up to 2000 (iE m2 s 4 on marine Synechococcus WH7803-1. Growth, pigmentation, and cell composition / T.M. Kana, P.M. Glibert // Deep-Sea Research. 1987. - V. 34. - P. 479-495.
86. Kaneko T. Complete Genome Structure of the Unicellular Cyanobacterium Synechocystis sp. PCC6803 / T. Kaneko, S. Tabata // Plant Cell Physiology. 1997.-V. 38.-P. 1171-1176.
87. Katano T. Discrimination of two phycoerythrin-pigment types of Synechococcus and their seasonal succession in the Uwa Sea / T. Katano, M. Hirose, S. Nakano // Microbes Environment. 2004. - V. 19. - P. 7-12.
88. Katano T. Identification of cultured and uncultured picocyanobacteria form a mesotrophic freshwater lake based on the partial sequences of 16S rDNA / T. Katano, M. Fukui, Y. Watanabe // The Japanese Society of Limnology. -2001.-V. 2.-P. 213-218.
89. Katano T. Molecular inference of dominant picocyanobacterial populations by denaturant gradient gel electrophoresis of PCR amplified rRNA gene fragments. / T. Katano, M. Fukui // Phycological Researches. 2003. -V. 51.-P. 71-76.
90. Kemp P.F. Bacterial diversity in aquatic and other environments: what 16S rDNA libraries can tell us / P.F. Kemp, J.Y. Aller // FEMs Microbiology Ecology. 2004. - V. 47. - P. 161-177.
91. Kirshtein J. Amplification, cloning, and sequencing of a nifH segment from aquatic microorganisms and natural communities / J. Kirshtein, H.W. Paerl, J. Zehr // Applied and Environmental Microbiology. 1991. - V. 57. - P. 2645-2650.
92. Klut M.E. Picoplankton associations in an ultra-oligotrophic lake on Vancouver Island, British Columbia / M.E. Klut, J. Stockner // Canadian Bulletin of Fisheries and Aquatic Sciences. 1991. - V. 48. - P. 1092-1099.
93. Koksharova O.A. Genetic tools for cyanobacteria / O.A. Koksharova, C.P. Wolk // Applied Microbiology and Biotechnology. 2002. -V.58.-P. 123-137.
94. Komarek J. Cyanoprokaryota 1. Teil: Chroococcales / J. Komarek, K. Anagnostidis // In Stisswasserflora von Mitteleuropa. Jena; Stuttgart; Ltibeck; Ulm. - 1999. - P. 1-548.
95. Komarek J. & Hauer T. (2004): CyanoDB.cz On-line database of cyanobacterial genera // http://www.cyanodb.cz
96. Komarek J. Contribution to the knowledge of planktic cyanoprocaryotes from central Mexico / J. Komarek, J. Komarkova-Legnerova // Preslia, Praha. 2002. - V. - 74. - P. 207-233.
97. Komarek J. Taxonomic review of the genera Synechocystis Sauvl 1982, Synechococcus Nag. 1849, and Cyanothece gen.nov.(Cyanophyceae) /J. Komarek//Archiv fuer Protistenkunde. 1976. - V. 118. -P. 119-179.
98. Komarek J. Towards a combined approach for the taxonomic and species delimitation of picoplanktonic cyanoprokaryotes / J. Komarek // Algological Studies. 1996. -V. 83 - P. 377-401.
99. Kumar S. MEGA3: Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment / S. Kumar, K. Tamura, M. Nei / Briefings in Bioinformatics. 2004. - V. 5. - P. 150-163.
100. Lake Baikal: Evolution and Biodiversity / Ed. by O.M. Kozhova and L.R. Izmest'eva // Leiden: Backhuys Publishers, 1998. — 447 p.
101. Leppard G.L. Characterization of cyanobacterial picoplankton in Lake Ontario by transmission electron microscopy / G.L. Leppard, D. Urciuoili, F.R. Pick // Canadian Bulletin of Fisheries and Aquatic Sciences. 1987. - V. 44. - P. 2173-2177.
102. Li W. Photosynthetic picoplankton in the ocean / W. Li, T. Piatt // Science Progress, Oxford, 1987. -V. 71. P. 117-132.
103. Maeda H. The water bloom of cyanobacterial picoplankton in Lake Biwa, Japan / H. Maeda, A. Kawai, M. Tilzer // Hydrobiologia. 1992. - V. 248. -P. 93-103.
104. Marchesi J.R. Design and evaluation of useful bacterium-specific PCR primer that amplify genes coding for bacterial 16S rRNA / J.R. Marchesi, T. Sato // Applied and Environmental Microbiology. 1998. - V64. - P. 795-799.
105. Munawar M. The abundance and significance of ultraplankton and microalgae at an offshore station in Central Lake Superior / M. Munawar, G. L. Fahnenstiel // Canadian Technical Report of Fisheries and Aquatic Sciences. -1982. -V. 1153 -P. 1-13.
106. Naegali H. Plotzliche Todesfalle von Alprinderm im Kanton Graubiinden / H. Naegali, A. Sahin, U. Braun et al. II Schweizer Archiv fur Tierheilkunde. 1997. -V. 139 - P. 201-209.
107. Nagata T. Autotrophic picoplankton in southern Lake Baikal: abundance, growth and grazing mortality during summer / T. Nagata, K. Takai, K. Kawanode et al. II Journal of Plankton Research. 1994. - V. 16. - P. 945959.
108. Nagata T. The seasonal abundance and vertical distribution of the < 3 |im phytoplankton in the north basin of the Lake Biwa / T. Nagata // Ecological Research. -1986. -V. 1.-P. 207-221.
109. Neilan В. Genetic diversity and phylogeny of toxic cyanobacteria determined by DNA polymorphisms within the Phycocyanin locus / B. Neilan // Applied and Environmental Microbiology. 1995. - V. 61. - P. 3875-3883.
110. Neilan B. rRNA sequences and evolutionary relationships among toxic and nontoxic cyanobacteria of the genus Microcystis / B. Neilan, D. Jacobs, T. D. Dot et al. II International Journal of Systematic Bacteriology. 1997. -V. 47. - P. 693-697.
111. Nelissen B. Phylogenetic relationship of nonaxenic filamentous cyanobacterial strains based on 16S rRNA sequence analysis / B. Nelissen, R. Baere, A. Wilmotte et al. II Journal of Molecular Evolution. 1996. - V. 42. - P. 194-200.
112. Nubel U. PCR primers to amplify 16S rRNA Genes from Cyanobacteria / U. Nubel, G. P. Ferran, G. Muyzer // Applied and Environmental Microbiology. 1997. - V. 63.-P. 3327-3332.
113. Olson R. Pigments, size, and distribution of the Synechococcus in the North Atlantic and Pacific Oceans / R. Olson, S. Chisholm, E. Zettler et al. II Limnology and Oceanography. 1990. - V. 35. - P. 45-48.
114. Palenik B. Chromatic Adaptation in Marine Synechococcus Strains / B. Palenik // Applied and Environmental Microbiology. 2001. - V. 62. - P. 991994.
115. Pan H. Detection of hepatotoxic Microcystis strains by PCR with intact cells from both culture and environmental samples / H. Pan, L. Song, Y. Liu et al. II Archives of Microbiology 2002. - V. 178. - P. 421-427.
116. Pasteur Culture Collection of Cyanobacteria, Institute of Pasteur (France) // http://www.pasteur.fr/recherche/banques/PCC/.
117. Pearl H.W. Ultraphitoplankton biomass and production in some New Zealand Lakes / H.W. Pearl // Journal of Marine and Freshwater Researches -1977.-V. 11.-P. 297-305.
118. Perkins F.O. Ultrastructure of a marine Synechococcus possessing spinae / F.O. Perkins, L. Haas, D. Phillips et al. 11 Canadian Journal of Microbiology -1980.-V. 27.-P. 318-329.
119. Pichel F.G. The phylogeny of unicellular, extremely halotolerant cyanobacteria / F.G. Pichel, U. Nubel, G. Muyzer // Archives of Microbiology. -1998.-V. 169.-P. 469-482.
120. Piatt T. Photosynthetic Picoplankton / T. Piatt, W. Li // Canadian Bulletin of Fisheries and Aquatic Sciences. 1986. -V. 214. - P. 71-120.
121. Porta D. Unusual ultrastructural features in three strains of Cyanothece (cyanobacteria) / D. Porta, R. Rippka, M. Hernandez-Marine // Archives of Microbiology.-2000.-V. 173.-P. 154-163.
122. Postius C. Mechanisms of dominance: coexistence of picocyanobacterial genotypes in a freshwater ecosystem / C. Postius, A. Ernst // Archives of Microbiology. 1999. - V. 172. - P. 69-75.
123. Postius C. Persistence and genetic diversity among strains of phycoerythin-rich cyanobacteria from the picoplankton of Lake Constance / C. Postius, Ernst A. // Journal of Plankton Researches 1996. -V. 18. - P. 11591166.
124. Rantala A. 2004. Phylogenetic evidence for early evolution of microcystin synthesis / A. Rantala, D. Fewer, M. Hisbergues et al. II Proceeding of National Academy of Sciences. V. 101. - P. 568-573.
125. Raven J.A. The twelfth Tansley Lecture. Small is beautiful: the picophytoplankton / J.A. Raven // Functional Ecology. 1998. - V. 12. - P. 503513.
126. Rippka R. Generic Assignments, Strain Histories and Properties of Pure Cultures of Cyanobacteria / R. Rippka, J. Deruelles, J.B. Waterbary, M. Herdman et al. II Journal of General Microbiology. 1979. - V. 111. - P. 1-61.
127. Rippka R. Isolation and purification of cyanobacteria / R. Rippka // Methods of Enzymology. 1988. - V. 167. - P. 28-67.
128. Rodhe W. Productivity: can plankton production proceed during winter darkness in subartic lakes? / W. Rodhe // International Association of Theoretical and Applied Limnology 1955.-V. 12.-P. 117-122.
129. Rudi K. Strain characterization and classification of oxyphotobacteria inclone cultures on basis of 16S rRNA sequences from the variable regions V6, V7,109
130. V8 / К. Rudi, M.O. Skulberg, F. Larsen et al. // Applied and Enviromental Microbiology. 1997. -V. 63. - P. 2593-2599.
131. Sant'anna L.C. Planktic Cyanobacteria from Sao Paulo State, Brazil: Chroococcales / L.C. Sant'anna, M.T. de Azevedo, P.C. Senna et al. II Revista Brasileira de Biologia. 2004. - V. 27. - P. 213-227.
132. Sarokin D.I. Cyanobacterial Spinae / D.I. Sarokin, E.J. Carpenter // Botanica Marina. -1981. V. 24. - P. 389-392.
133. Schonhuber W. In situ identification of cyanobacteria with horseradish peroxidase labeled, rRNA-targeted oligonucleotide probes / W. Schonhuber, B. Zarda, S. Eix et al. // Applied and Environmental Biology. - 1999. - V. 65. - P. 1259-1267.
134. Sherman D. Heterocyst development and localization of cyanophycin in N2-fixing cultures of Anabaena sp. PCC 7120 (cyanobacteria) / D. Sherman, D. Tucker, L. Sherman // Journal of Phycology. 2000. - V. 36. - P. 932-941.
135. Sieburt J.G. Pelagic ecosystem structure: heterotrophic compartments of the plankton and their relationship to plankton size fractions / J.G. Sieburt, V. Smetacek, J. Lenz // Limnology and Oceanography. 1978. - V. 23. - P. 12561263.
136. Sivonen K. Cyanobacterial toxins / K. Sivonen, G. Jones // Chorus and J. Bartram (ed.): Toxic cyanobacteria in water: a guide to their public health consequences, monitoring, and management. E & FN Spon, London, United Kingdom, 1999.-P. 41-111.
137. Smarda J. The Nodularia studies. Introduction, fine structure / J. Smarda, J. Komarek, L. Caslavska et al. II Archiv fuer Hydrobiologie. 1988. - V. 80. - P. 109-129.
138. Staley J.T. Prosthecomicrobium and Ancalomicrobium: new prosthecate freshwater bacteria / J. T. Staley // Journal of Bacteriology. 1960. - V. 95. - P. 1921-1942.
139. Stockner J. Picoplankton and other non-bloom forming cyanobacteria in lakes / J. Stockner, C. Callieri, G. Cronberg // In: The ecology of cyanobacteria, Kluwer Academic Publishers, the Netherlands 2000. - P. 195-231.
140. Stockner J.G. Algal picoplankton from marine and freshwater ecosystems: a multidisciplinary perspective / J.G. Stocker, N.J. Antia // Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 1986. - V. 43. - P. 2472-2503.
141. Stockner J.G. Autotrophic picoplankton in freshwater ecosystems: the view from the summit / J.G. Stockner // Internationale Revue der Gesamten Hydrobiologie. 1991. -V. 76. - P. 483-492.
142. Swofford D.L. PAUP* Phylogenetic Analysis Using Parsimony (*and Other Methods). 1998. Version 4. Sinaver Associates, Sunderland, Massachusetts.
143. Tillett D. Structural organization of microcystin biosythesis in Microcystis aeruginosa PCC 7806: an integrated peptide polyketide syntase system / D. Tillett, E. Dittmann, M. Erhard et al. II Chemical Biology. - 2000. -V. 7.-P. 753-764.
144. Urabe J. Some biological and chemical characteristics of Lake Hovsgol. / J. Urabe, T. Sekino, Y. Hayami et al. II In: Proceedings of Inter. Workshop, Kyoto, Japan 2002. - P. 87-100.
145. Uysal Z. Chroococcoid cyanobacteria Synechococcus spp. in the Black Sea: pigments, size, distribution, growth and diurnal variabilitty / Z. Uysal // Journal of Plankton Research. 2001. -V. 23. -P. 175-189.
146. Vaara T. The outermost surface structures in chroococcacean cyanobacteria / T. Vaara // Canadian Journal of Microbiology. 1982. - V. 28. -P. 929-941.
147. Vincent W.F. Cyanobacterial dominance in the Polar Regions / W. F. Vincen // The Ecology of Cyanobacteria: their Diversity in Time and Space. -Kluwer Academic Publishers, 2000 P. 321-340.
148. Voros L. Freshwater picocyanobacteria along a trophic gradient and light quality range / L. Voros, C. Callieri, К. V. Balogh et al II Hydrobiologia. 1998. -V. 369-370. -P. 117-125.
149. Ward D. M. A natural view of microbial biodiversity within hot spring cyanobacterial mat communities / D. M. Ward, M. J. Ferris, S. C. Nold et al II Microbiology and Molecular Biology Reviews. 1998. -V. 62. - P. 1353-1370.
150. Watanabe M. M., Nakagava M. Purification of freshwater picoplanktonic cyanobacteria by pour plating in 'ultra-low-gelling-temperature agarose / M. Watanabe, M. Nakagava // Phycological Research. 1998. - V. 46. -P. 71-75.
151. Waterbary J.B. The Cyanobacteria Isolation, Purification, Identification: Chapter 97 / J.B. Waterbury // The Prokaryotes: Handbook on the biology of bacteria. - Springer-Verlag, New-York Inc., 1992 - P. 2058-2078.
152. Waterbary J.B. Widespread occurrence of a unicellular, marine, planKtonic cyanobacterium / J.B. Waterbary, S.W. Watson, R.R Guillard et al. // Nature. 1979. - V. 277. - P. 293-294.
153. Weisse T. Ecological characteristics of autotrophic picoplankton in a Prealpine Lake / T. Weisse, U. Kenter // Internationale Revue der Gesamten Hydrobiologie. -1991. -V. 76. P. 493-504.
154. Weisse. T. Dynamics of autotrophic picoplankton in marine and freshwater ecosystem / T. Weisse // Advances in microbial ecology. 1993. - V. 13.-P. 327-370.
155. Wilmotte A. Morphological and genetic criteria in the taxonomy of Cyanophyta (Cyanobacteria) / A. Wilmotte, S. Golubic 11 Algological Studies. -1991.-V. 64.-P. 1-24.
156. Zehr J. Unicellular cyanobacteria fix N2 in the subtropical North Pacific Ocean / J. Zehr, J. Waterbury, P. Turner et al. II Nature. 2001. - V. 412. - P. 635-638.
157. Zheng W.W. Genetic diversity and classification of cyanobacteria in different Azolla species by the use of PCR fingerprinting / W.W. Zheng, M. Nilson, B. Bergman et al. 11 Theoretical and Applied Genetics. 1999. - V. 99. -P. 1187-1193.
-
Тихонова, Ирина Васильевна
-
кандидата биологических наук
-
Иркутск, 2006
-
ВАК 03.00.16
- Сообщества цианобактерий в биопленках и планктоне литоральной зоны озера Байкал
- Генетическое разнообразие пикопланктона озера Байкал
- Структура и продукционные характеристики фитопланктона озера Байкал
- Цианобактерии термальных источников Байкальской рифтовой зоны и их роль в осаждении кремнезема как модельных объектов для исследования микрофоссилий
- Структурная организация и динамика фитопланктонного сообщества пелагиали Южного Байкала
