Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфологическая оценка фиброархитектоники лиофилизированных соединительнотканных аллотрансплантатов

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Морфологическая оценка фиброархитектоники лиофилизированных соединительнотканных аллотрансплантатов"

На правах рукописи

БУЛГАКОВА Людмила Александровна

МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ФИБРОАРХИТЕКТОНИКИ ЛИОФИЛИЗИРОВАННЫХ СОЕДИНИТЕЛЬНОТКАННЫХ АЛЛОТРАНСПЛАНТАТОВ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 г МАЙ 2014

Оренбург - 2014

005548601

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Всероссийский центр глазной и пластической хирургии» Министерства здравоохранения Российской Федерации (г. Уфа).

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор,

Шаигина Ольга Ратмировна Официальные оппоненты: Хисматуллина Зухра Рашидовна,

доктор биологических паук, доцент, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Башкирский государственный университет» Министерства образования и науки Российской Федерации, заведующая кафедрой физиология человека и зоологии; Трубина Ольга Михайловна, кандидат медицинских наук, доцент, Оренбургский филиал Федерального государственного бюджетного учреждения «Межотраслевой научно-технический комплекс «Микрохирургия глаза» имени академика С.Н. Федорова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заместитель директора по научной работе.

Ведущая организация. Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарева» Министерства образования и науки Российской Федерации.

Защита состоится 24 июня 2014 года в_часов на заседании диссертационного совета Д 208.066.04 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Оренбургская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 460000, г. Оренбург, ул. Советская, д. 6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Оренбургская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 460000, г. Оренбург, ул. Советская, д. 6 и на сайте: http://orpma.ru

Автореферат разослан » 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, профессор

Шевлгок Н.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. В настоящее время применение биологических тканей для трансплантации получило всеобщее признание (Мир-ский М.Б., 1985; Goldberg V.M. et al., 1993; Noh J.H. et al„ 2011; Miller L.E. et al., 2011). Большинство заготавливаемых в тканевых банках донорских тканей относятся к соединительнотканным формациям: твердая оболочка головного мозга, сухожилия различной локализации, дерма, фиброзные оболочки органов, перикард, хрящи, кости и т. д. (Аськова JI.H. с соавт. 2004; Щербаков Д.А., 2011; Chaushu G. et al., 2009; Nissan J. et al., 2012; Rossi A.C. et al., 2012). Применение их в клинической практике приносит, как правило, положительный результат (Мулдашев Э.Р., 1994; Федяев И.М. с соавт., 2004; Кульбаев Н.Д. с соавт., 2012; Полякова ЕЛО. с соавт., 2012; Timaran С.Н. et al.,2002; Miller L.E. et al., 2011; Nishida Y. et al., 2011).

Донорские ткани, чтобы стать пригодными для пересадки, должны быть консервированными. Все известные методы физико-химической обработки и консервации направлены на снижение антигенных свойств тканей, при сохранении их волокнистого каркаса (Клен Р. 1962; Нигматуллин Р.Т., 2003; Федорова Е.А. с соавт., 2005; Воусе Т. et. al., 1999). Одним из широко используемых методов консервирования донорских тканей является лиофилизация. Лиофили-зация - метод высушивания замороженных тканей в вакууме. Методика нысу-шивания тканей в замороженном состоянии, по мнению ряда авторов, обладает определенным преимуществом перед другими видами консервирования, что, прежде всего, выражается в хорошей сохранности ткани в течение долгого времени (Мнержичка П. с соавт., 1988; Мшнодин Е.С. с соавт., 2004). Лиофилизи-рованные ткани, у которых остаточная влажность до 1%, могут сохраняться при комнатной температуре в течение пяти лет без существенных изменений своих свойств, кроме того, они не требуют специальных условий при транспортировке, что имеет большое практическое значение (Коваленко П.П., 1975; Савельев В.И. с соавт., 2001; Кристинов Г., 1975; Galia C.R. et al., 2009). По мнению В.И. Савельева с соавторами (2004), в процессе лиофилизации ткани приобретают устойчивость к факторам внешней среды и способность сохранять комплекс структурных и биохимических свойств, важных с трансплантационной точки зрения. Кроме того, по мнению этих же авторов, лиофилизация аллоген-ных тканей важна перед стерилизацией гамма-лучами, поскольку без дегидратации в тканях возникают различные изменения, препятствующие их клиническому использованию.

Однако не все авторы придерживаются того же мнения. О том, что лиофилизация отрицательно сказывается на пластических свойствах биологических таа-ней, отмечают в своих работах Г. Кристинов (1978) и Р.Н. Подопригора (2004).

Опубликовано большое количество научных работ по вопросам лиофили-зации биологических тканей, но отсутствуют данные о комплексном исследовании фиброархитектоники, пластических и регенераторных свойств лиофили-зированных соединительнотканных трансплантатов, а так же специфики их применения в клинической практике.

В этой связи представляется актуальным изучение влияния процесса лнофилизации на волокнистый остов и физико-механические свойства соединительнотканных аллотрапсплантатов.

Цель настоящего исследования: провести оценку фиброархитектоники и прочностных свойств лиофилизированных соединительнотканных аллотрапсплантатов.

Задачи исследования:

1. Изучить влияние лиофилизации на фиброархитсктонику соединительнотканных аллотрапсплантатов с различными типами волокнистого остова.

2. Оценить прочностные свойства соединительнотканных аллотрапсплантатов с различными типами волокнистого остова до и после лиофилизации.

3. В эксперименте изучить морфологические особенности замещения лиофилизированных соединительнотканных аллотрапсплантатов.

4. На основе морфологических н физико-механических исследований разработать методические рекомендации по эффективному использованию лиофилизированных аллотрапсплантатов в клинической практике.

Научная новизна. В представленной работе впервые проведена комплексная оценка структуры и прочностных свойств лиофилизированных аллотрапсплантатов. Определено, что изменения, происходящие в структуре трансплантатов, зависят от типа волокнистого остова соединительной ткани и наличия основного вещества. Установлено, что процесс лиофилизации приводит к изменению фиброархитектоники аллотрансплантатов, изготовленных из плотной оформленной соединительной ткани с ориентированным типом волокнистого остова и смешанным типом волокнистого остова. Изменения фиброархитектоники в процессе лиофилизации не наблюдаются у аллотрансплантатов, изготовленных из плотной неоформленной соединительной ткани с неориентированным типом волокнистого остова.

Выявлено, что наибольшее снижение прочностных свойств происходит у лиофилизированных аллотрапсплантатов, изготовленных из плотной оформленной соединительной ткани с ориентированным типом волокнистого остова.

Теоретическая и практическая значимость. Определены критерии сохранности фиброархитектоники лиофилизированных аллотранплантатов в зависимости от типа волокнистого остова соединительной ткани и наличия основного вещества.

На основе полученных данных разработаны методические рекомендации по применению лиофилизированных соединительнотканных аллотранпланта-тов в клинической практике. Морфологически доказано и экспериментально подтверждено, что преобразование структуры и снижение прочностных характеристик лиофилизированных соединительнотканных аллотрансплантатов являются существенным ограничением при использовании их для укрепляющих операций, где главную роль играют физико-механнческие свойства тканей.

Реализация результатов работы. Результаты работы включены в технологический регламент изготовления лиофилизированных соединительнотканных аллотрансплантатов в лаборатории консервации тканей ФГБУ «Всероссийский центр глазной и пластической хирургии» Минздрава России. Аллотранс-плантаты, консервированные методом лиофилизации, применяются в различных областях хирургии и поставляются в 57 клиник России и стран СНГ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Изменения, происходящие в структуре лиофилизированных соединительнотканных аллотрансплантатов, зависят от фиброархитектоники и наличия основного вещества в тканях.

2. Сохранение прочностных свойств лиофилизированных аллотрансплантатов тесно коррелирует с изменениями их фиброархитектоники: выраженные изменения в структуре аллотрансплантатов приводят к снижению предела прочности и модуля упругости.

3. Характер резорбции и замещения лиофилизированных соединительнотканных аллотрансплантатов зависит от их структуры и физико-механических свойств.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены и обсуждены на XXI Межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Новые технологии микрохирургии глаза» г. Оренбург, 2010 г.; на XXII Межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Новые технологии микрохирургии глаза» г. Оренбург, 2011 г.; на V Всероссийском симпозиуме с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» г. Уфа,

2012 г.; на Всероссийской конференции с международным участием «Доклиническое исследование в инновационной медицине и биотехнологиях» г. Самара,

2013 г.; на Всероссийской научной конференции посвященной памяти чл.-корр. АМН СССР профессора Ф.М. Лазаренко «Актуальные проблемы морфологии, адаптогенеза и репаративных гистогенезов» г. Оренбург, 2013 г.; на I Национальном Конгрессе по регенеративной медицине г. Москва, 2013 г.

Работа апробирована на расширенном заседании Башкирского отделения Всероссийского научного общества анатомов, гистологов и эмбриологов (ВРИО АГЭ), г. Уфа, 2014.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ, из них 7 работ в изданиях, рекомендованных ВАК.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, списка использованной литературы. Список литературы содержит 262 источника, из них 165 отечественных и 97 зарубежных. Текст изложен на 137 странпцах печатного текста. Работа иллюстрирована 10 таблицами, 16 рисунками, 52 фотографиями.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования. Заготовка аллогенных тканей, предназначенных для изготовления аллотрансплацтатов, проводилась в Бюро судебно-медицинской экспертизы у доноров, скоропостижно скончавшихся в результате сердечно-сосудистых заболеваний, закрытых травм, механической асфиксии, отравления алкоголем и т. д. Изъятие тканей осуществлялось в течение 24 часов после смерти донора, при условии хранения тела умершего при температуре -5°С. Изъятие кадаверных тканей в России регламентируют Закон Российской Федерации № 4180-1 от 22.12.1992 г. «О трансплантации органов и (или) тканей»; Федеральный закон № 323 от 21.11.2011 г. «Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации»; Приказ Минздравсоцразвития РФ № 346 и от 12.05.2010 г. «Об утверждении порядка организации и производства судебно-медицинских экспертиз в государственных судебно-экспертных учреждениях Российской Федерации». Правовая оценка деятельности тканевых банков подтверждена в письме № 11 (1358-ЕС) Министерства юстиции в МЗ РФ от 14.02.2002 г. Российские требования к отбору кадавсрного донорского материала полностью соответствует положениям Европейской Ассоциации Тканевых Банков (ЕАТВ).

Для исследования был забран материал от 73 трупов доноров обоего пола в возрасте от 20 до 50 лет. Соединительнотканные аллотрансплантаты были изготовлены из анатомических структур, имеющих различную фиброархитекто-нику: пяточного сухожилия, широкой фасции бедра, твердой оболочки головного мозга, дермы опорных участков стопы.

Все забранные ткани разделялись на две группы: первая группа тканей -это нативные ткани (контрольная группа). Вторая группа - это ткани, подвергнутые процессу лиофнлизации (экспериментальная группа). Для получения

достоверных результатов при сравнении нативных и лиофилизированных тканей, исследовали образцы однотипной локализации и одного размера: 25x15 мм. Для получения лиофилизированных соединительнотканных ал-лотрансплантатов исходные биологические ткани замораживали в криогенной камере до -45°С и высушивали под вакуумом (остаточное давление 10 мТорр) при помощи лиофильной установки Dry Winner DW-6 (Heto Holten, Дания). Высушивание проводили до остаточной влажности в пределах 5-8%. Подбор режимов скорости и температуры замораживания проводили эмпирическим путем, определяя полный цикл проведения лиофилизации для каждой ткани индивидуально. Определение остаточной влажности проводили по ГОСТу 24061— 89 «Препараты биологические сухие. Метод определения влажности».

Для изучения структуры нативных и лиофилизированных тканей был использован набор методик от макроскопического до электронно-микроскопического уровня. Лиофилизированные образцы перед проведением морфологических исследований и физико-механических испытаний помещали в изотонический раствор NaCl на 12 часов с целью регидратации.

Изучение внешнего вида, формы и размеров образцов до и после лиофилизации проводили при помощи макроскопических исследований с использованием микрометра, линейки и лупы ЛЦП-1. Толщину образцов до и после лиофилизации измеряли в 9 точках в каждом образце.

Гистологические срезы окрашивали гематоксилином, эозином, по Ван Гизону и по Маллори. Микроскопические исследования проводили с использованием световых микроскопов LEICA DMD-108 и АХЮ IMAGER-Z1 (С. Zeiss, Германия). Микрофотосъемку осуществляли с помощью цифровой камеры Nicon D 100.

Оценку фиброархитектоники аллотрансплантатов проводили при помощи поляризационной микроскопии, основанной на способности волокнистых компонентов соединительной ткани к двойному лучепреломлению (Wolman М., Kasten F.H., 1986). Проводили поляризационную микроскопию неокрашенных гистологических срезов толщиной 10 мкм. Исследование и фотографирование образцов проводили с использованием поляризационного микроскопа МИН-8 и цифровой фотонасадки Nicon Coolpix 4500 при скрещенных фильтрах.

Для исследования ультраструктуры соединительнотканных аллотрансплантатов использовали метод сканирующей электронной микроскопии. Для данного метода образцы тканей проводили в спиртах возрастающей концентрации, в двух порциях 100% этанола, в двух порциях ацетона и высушивали с последующим напылением в ионно-распылительной установке слоем платины (Волкова О.В. с соавт., 1987). Микрофотографирование проводили на скани-

рующем электронном микроскопе JSM-840 (Jeol, Япония) при увеличениях 500,1000,1500,3000.

Количественные показатели (толщину пучков коллагеновых волокон и ширину межпучковых пространств) определяли морфометрическим методом. Для этого использовали микроскоп АХЮ IMAGER-Z1 (С. Zeiss, Германия) с аппаратно-программным комплексом Axiovision. Полученные результаты переводили в программу Microsoft Office Excel 2007, для устранения случайных значений. Затем обработанные данные переводили в программу Statistica 7.0. Для сравнения полученных результатов в различных сериях опытов использовался параметрический метод (t-критерий Стьюдента для независимых групп).

Для определения содержания основного вещества в образцах был проведен гистохимический метод выявления гликозаминогликанов по Хейлу (Конон-ский А.И., 1976). В процессе постановки гистохимической реакции молекулы гидроксида железа взаимодействуют с функциональными группами ГАГ. Образуется комплекс, прочность которого определяется плотностью анионных групп на поверхности тканевых структур, содержащих гликозаминогликаны. В дальнейшем данный комплекс вступает в реакцию с гексациано-(И) ферратом калия, что и приводит к образованию молекул берлинской лазури (синего цвета) по осадкам которых определяется локализация ГАГ. Перед обезвоживанием срезы докрашивали спиртовым раствором эозина, в результате чего коллагеновые волокна приобретают розовый цвет. Полученный контраст между двумя цветами позволяет четко проявиться окрашенным в синий цвет гликозамингликанам.

Изучение физико-механических свойств агоютрансплантатов проводили на универсальной машине для испытания прочностных свойств материалов модели 1185 INSTRON (Англия). Диапазон нагрузок данной машины от 0 до 700 H (ньютонов), скорость перемещения траверсы от 0,005 до 250 мм/мин. Испытуемые образцы имели усиленные концевые фрагменты и стандартную рабочую часть с длиной 15 мм и шириной 4 мм. Прочностные свойства образцов испытывали при постоянной скорости деформации - 2 мм/мин. Ход и результаты исследований записывались с одновременной графической регистрацией диаграмм зависимости «усилие - перемещение». Статистический анализ полученных данных проводили, используя методику, предложенную О.Ю. Ребровой (2002). Полученные результаты переводились в программу Microsoft Office Excel 2007. Затем обработанные данные переводили в программу Statistica 7.0.

Экспериментальные исследования по пересадке аллотрансшинтатов контрольной и экспериментальной групп были проведены на 40 половозрелых самцах крыс породы Wistar примерно одного возраста и веса (250-300 г). Животных содержали в виварии, оборудованном согласно требованиям «Санитарных правил по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-

биологических клшгак (вивариев)» № 1045-73. Исследования осуществлялись в соответствии с правилами проведения работ и использования экспериментальных животных (Приложение к Приказу МЗ СССР № 775 от 12.08.77), «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» от 18 марта 1986г. и Федерального закона РФ «О защите животных от жестокого обращения» от 01.01.1997 г.

Под эфирным наркозом у животных была смоделирована тендопластика. После разреза кожных покровов на задней поверхности голени крыс производилось выделение икроножной мышцы и пяточного сухожилия, а также малоберцового нерва, который должен оставаться без повреждений. Затем из пяточного сухожилия вырезали фрагмент длиной 3-4 мм. В полученный дефект вводили аллотрансплантат шириной 2,5 мм и длиной 10 мм с фиксацией по краям узлами. Последним этапом операции являлось ушивание кожи шелком 5-0.

Животных выводили из эксперимента на 14-, 30-, 60-, 120- и 180-е сутки после операции передозировкой наркоза. Для морфологического исследования образцы аллотрансплантатов иссекали с окружающими тканями. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином, по методу Ван Гизон, по Маллори. Микроскопические исследования и микрофотографирование гистологических препаратов проводили с помощью светового микроскопа Leica DMD 108 (Германия) со специализированным программным обеспечением для управления настройками микроскопа и захвата изображения с возможностью его сохранения на встроенной карге памяти. Пользовались объективами 10х, 20* и 40 х.

Результаты исследования и их обсуждение. В настоящей работе нами проведен сравнительный анализ структурных, прочностных и регенераторных свойств нативных и лиофилизированных соединительнотканных аллотрансплантатов, изготовленных из различных типов соединительной ткани: плотной оформленной с ориентированным типом волокнистого остова (пяточное сухожилие); плотной оформленной со смешанным типом волокнистого остова (твердая оболочка головного мозга, широкая фасция бедра); плотной неоформленной с неориентированным типом волокнистого остова (дерма опорных участков стопы). Указанные аллогенные трансплантаты были выбраны в качестве объекта исследования, как наиболее востребованные в клинической практике.

Учитывая, что основу исследуемых соединительнотканных аллотрансплантатов составляют коллагеновые волокна, основное внимание в нашем исследовании было уделено их фиброархитектонике (Mitliieux S.M. et al., 2005; Kielty C.M., 2006; N. Annabi et al., 2013).

Пяточное сухожилие является типичным образцом плотной оформленной соединительной ткани. Фиброархитектоника образцов в нативном виде представляла собой прилежащие плотно друг к другу параллельные пучки коллаге-

новых волокон, которые имели волокнистый или спиральный ход. Коллагено-вые волокна постоянно разветвлялись и часть составляющих их фибрилл переходила в состав смежных волокон. Поперечно расположенные волокна образовывали связочную систему сухожилий. На сканограммах прослеживалось наличие тонких солитарных волокон, расположенных под углом к основным пучкам и образующим связочную систему сухожилий (рис. 1). При исследовании в поляризационном свете структуры нативных образцов пяточного сухожилия наблюдался выраженный эффект двойного лучепреломления, что свидетельствовало о высокой оптической активности пучков коллагеновых волокон, характерной для плотной оформленной соединительной ткани.

Процесс лиофилизации привел к нарушению структурной организации пучков коллагеновых волокон пяточного сухожилия. Участки продольно расщепленных пучков и коллагеновых волокон чередовались с участками фраг-ментированных плотных пучков волокон. Межпучковые пространства на участках с расщепленными волокнами увеличивались, в тоже время, на фрагмен-тированных участках межпучковые пространства нивелировались. На сканограммах лиофилизированных сухожилий наблюдалось расщепление пучков коллагеновых волокон, в результате которого между пучками образовывались различные по размерам пространства (рис. 2).

Морфометрическая оценка толщины пучков коллагеновых волокон показала, что толщина пучков нативных образцов составила 47,49±10,37 мкм. В качестве объекта для сравнительной оценки толщины пучков коллагеновых волокон нами были условно выделены два типа пучков, в которых измеиения при лиофилизации были наиболее выражены: к первому типу отнесли тонкие пучки коллагеновых волокон, образующиеся за счет разволокнения и фрагментации толстых пучков, толщина которых составила 11,97±2,78 мкм; ко второму типу -пучки коллагеновых волокон, уплотненных в результате лиофилизации с толщиной 133,22±53,55 мкм.

Рис. 1. Ультраструктура нативного пяточного сухожилия. Пространственные взаимоотношения основных пучков и солитарных коллагеновых волокон. Сканирующая электронная микроскопия

Рис. 2. Изменение ультраструктуры аллотрансплантата пяточного сухожилия после лиофшшзации. Сканирующая электронная микроскопия

Величина межпучковых пространств в образцах нативного ПС в среднем составила 19,17±3,57 мкм, в то же время значение аналогичной величины у образцов лиофилизированных аллотрансплантатов - 35,49±8,01 мкм. То есть, величина межпучковых пространств лиофилизированного ПС увеличилась в 1,9 раза (р<0,05).

Для определения состояния основного вещества в нативном ПС было проведено гистохимическое выявление гликозаминогликанов по Хейлу. При подкрашивании препаратов спиртовым раствором эозина коллагеновые волокна окрашиваются в розовые тона, что позволяло создать контраст между двумя цветами и хорошо проявиться окрашенным в синий цвет гликозамингликанам.

При окрашивании препаратов по Хейлу пучки коллагеновых волокон нативного пяточного сухожилия окрашивались в основном в розовый цвет эозином, что свидетельствовало о низком содержании ГАГ. В синий цвет окрашивались лишь тонкие прослойки рыхлой соединительной ткани между пучками волокон.

После лиофшшзации образцы аллотрансплантатов ПС давали так же слабо положительную реакцию при окрашивании препаратов по Хейлу: только отдельные участки окрашивались в синий цвет, что свидетельствовало о незначительном содержании гликозаминогликанов.

Для фиброархитектоники широкой фасции бедра характерно расположение пучков коллагеновых волокон в определенном порядке с образованием волокнистого остова, состоящего из трех слоев. В каждом отдельном слое волнообразно изогнутые пучки коллагеновых волокон располагались параллельно друг другу в одном направлении. В разных слоях направление хода волокон различное, слои коллагеновых волокон расположены между собой достаточно рыхло. На сканограммах отчетливо видна развитая сеть солитарных пучков, осуществляющая связь между слоями (рис. 3). Данные поляризационной микроскопии демонстрировали высокую оптическую активность коллагеновых волокон нативных образцов широкой фасции бедра.

При гистологическом исследовании фиброархитектоники экспериментальной группы аллотрансплантатов широкой фасции бедра выявилось уплотнение пучков коллагеновых волокон — межпучковые пространства практически нивелировались. Степень извитости коллагеновых волокон, присущая нативной ФБ, изменялась. Местами извитость волокон сглаживалась и практически исчезала, а на некоторых участках напротив, происходило увеличение амплитуды изгиба волокон. Пучки коллагеновых волокон плотно приближались друг к другу, образуя достаточно толстые тяжи, между которыми локально наблюдались пространства, заполненные тонкими фрагментироваиными волокнами. Солитарные пучки, соединяющие слои пучков коллагеновых волокон фасции приобрели вид рыхлой неупорядоченной сети, местами произошли их разрыв и дефрагментация, что подтвердилось данными сканирующей электронной микроскопии (рис. 4). Данные поляризационной микроскопии свидетельствовали, что высокая оптическая активность, присущая коллагеновым волокнам широкой фасции бедра, в лиофилизированных образцах сохранялась.

Морфометрический анализ показал, что среднее значение толщины пучков коллагеновых волокон нативной ФБ —107,03±19,03 мкм, лиофилизированных образцов - 205,67±56,12 мкм. Среднее значение толщины пучков коллагеновых волокон лиофилизированных образцов увеличилось в 1,9 раза (р<0,05).

Величина межпучковых пространств образцов широкой фасции бедра так же претерпела изменения в процессе лиофилизации. Среднее значение величины межпучковых пространств нативной фасции бедра составило 39,32±6,66 мкм, лиофилизированных аллотрансплантатов - 22,89±7,05 мкм, что в 1,7 раза меньше значения нативных образцов (р<0,05).

Гистохимические исследования на содержание гликозаминогликанов в нативной ткани широкой фасции бедра показали положительную реакцию по Хейлу - пучки коллагеновых волокон окрасились в синий цвет, и лишь местами наблюдалось розовое окрашивание. Преобладание синего окрашивания свидетельствовало о наличии ГАГ в нативной ткани широкой фасции бедра.

У лиофилизированных образцов широкой фасции бедра при выявлении гликозаминогликанов по Хейлу наблюдалось равномерное чередование участков ткани, окрашенных в розовый и синий цвета. Значительное увеличение участков ткани с розовым окрашиванием свидетельствовало об уменьшении наличия гликозаминогликанов в составе лиофилизированного аллотрансплантата.

Фиброархитектоника нативной твердой оболочки головного мозга представляла собой сложно-переплетенный, относительно плотный соединительнотканный каркас, состоящий из расположенных параллельно друг другу слоев волнообразных пучков коллагеновых волокон. Направления соседних слоев не совпадали друг с другом. При проведении сканирующей электронной микро-

скопии были выявлены солитарные пучки волокон между слоями ТМО, которые переходили из одного слоя в другой, связывая их между собой (рис. 5). Исследования поляризационной микроскопии показали, что коллагеиовым волокнам ТМО характерна высокая оптическая активность.

Рис. 3. Развитая сеть солитарных пучков нативной фасции бедра. Сканирующая электронная микроскопия

Рис. 4. Фрагментация волокнистых пучков аллотрансплантата широкой фасции бедра после лиофилизации. Сканирующая электронная микроскопия

После лиофилизации плотность упаковки пучков коллагеновых волокон, присущая нативной ТМО, полностью нарушалась. Коллагеновые пучки расщеплялись на волокна и приобрели вид тонких волнообразно изогнутых нитей, ориентированных в одном направлении. Очертания слоев, характерных для данной ткани, не просматривались. В целом фиброархитектоника лиофилизи-рованных аллотрансплантатов ТМО приобрела вид мелкоячеистой сети. Данные сканирющей электронной микроскопии свидетельствовали о том, что фиброархитектоника лиофилизированных аллотрансплантатов ТМО имела вид рыхлой мелкоячеистой сети, в некоторых местах наблюдались пустоты между

ячейками, что свидетельствовало о нарушении волокнистого каркаса ТМО (рис. 6). При поляризационной микроскопии очертания отдельных слоев, характерных для данной ткани, не просматривались, хотя оптическая активность, присущая нативной твердой оболочке головного мозга, сохранялась.

Рис. 5. Солитарные пучки волокон между слоями в нативном образце твердой оболочки головного мозга. Сканирующая электронная микроскопия

Рис. 6. Рыхлая мелкоячеистая сеть коллагеновых волокон аллотрансплантата твердой оболочки головного мозга после лиофилиза-

ции. Сканирующая электронная микроскопия

Морфометрические исследования ТМО показали следующие результаты: толщина пучков коллагеновых волокон нативных образцов составила 50,31±0,90 мкм, лиофшшзированных аллотрансплантатов - 5,27±1,18 мкм. Межпучковые расстояния образцов лиофшшзированных образцов ТМО приобрели в большинстве случаев вид ячеистых пространств, стенки которых образованы расщепленными пучками коллагеновых волокон, поэтому в качестве измеряемых значений межпучковых пространств нами была взята ширина ячеек. Среднее значение величины межпучковых пространств в контрольной группе составило 7,16±1,41 мкм, в экспериментальной группе - 31,98±6,77 мкм. Расстояние между пучками и толщина пучков коллагеновых волокон нативных и лиофилизированных образцов ТМО претерпевают значительные изменения.

4бмкт

40мкт

Выявление ГАГ в нативных образцах ТМО показало положительную реакцию по Хейлу. Наблюдалось интенсивное окрашивание в синий цвет во всех слоях ткани. Лишь отдельные пучки волокон неравномерно окрашивались эозином в розовый цвет.

При гистохимическом исследовании лиофилизированных образцов ТМО наблюдалось выраженное розовое окрашивание коллагеновых волокон, что свидетельсвовало о выраженном снижении содержания ГАГ.

Фиброархитектоиика нативных образцов дермы опорных участков стопы представляла собой коллагеново-волокнистый каркас, образованный извилистыми, способными к растяжению, волокнами. Пучки коллагеновых волокон, переплетенные во всех направлениях, имели сложную пространственную архитектонику и представляли собой единое трехмерное переплетение коллагеновых волокон и пучков. На сканограммах отчетливо прослеживались разнонаправленные пучки коллагеновых волокон, между которыми наблюдалась система тонких волокон и фибрилл. При поляризационной микроскопии колла-геновые волокна дермы проявляли оптическую активность.

Процесс лиофилизации не привел к изменениям в структуре дермы опорных участков стопы - ткань сохраняла сложную пространственную организацию. Определялся извилистый ход коллагеновых пучков, связанных между собой редкой сетью связочных волокон и лишь изредка наблюдались отдельные пучки коллагеновых волокон линейной формы.

Так как структура дермы опорных участков стопы образует неориентированный тип коллагенового остова, в котором волокнистые элементы расположены без определенной геометрической закономерности, проведение полноценного морфометрического анализа пучков коллагеновых волокон не представлялось возможным.

Гистохимический анализ по Хейлу показал положительную реакцию (синее окрашивание) на содержание гликозаминогликанов в нативной дерме опорных участков стопы. Интенсивное синее окрашивание основного вещества между пучками коллагеновых волокон и вокруг отдельных волокон в нативных образцах свидетельствовало о высоком содержании ГАГ в основном веществе.

ГАГ в основном веществе лиофилизированной ДП сохранялись в значительном количестве, о чем свидетельствовала положительная реакция Хейла.

Процесс лиофилизации вызывает различные физические и химические изменения в тканях, которые влияют на их пластические свойства, в связи, с чем большой интерес представляют исследования физико-механических свойств лиофилизированных соединительнотканных аллотрансплантатов.

Необходимость изучения механических свойств аллотрансплантатов также вызвана запросами практической медицины. Изучение прочностных и де-

формативных свойств соединительнотканных аллотрансплантатов позволяет решать задачи реконструктивной хирургии и трансплантологии (Пуриня Б.А. с соавт., 1980; Нигматуллин Р.Т. и соавт., 1986; Плотников В.А. и соавт., 1986; Савельев В.И. и соавт., 1992; Сельский Н.Е., 2000; Лекишвили М.В., 2005).

Морфологические изменения в структуре соединительнотканных аллотрансплантатов после лиофилизации приводят к изменению и их прочностных свойств, что подтверждается результатами физико-механических испытаний аллотрансплантатов пяточного сухожилия, широкой фасции бедра, твердой оболочки головного мозга и дермы опорных участков стопы, для которых сохранение прочностных и деформативных свойств является важным фактором, обуславливающим эффект их клинического применения.

Результаты физико-механических исследований аллотрансплантатов пяточного сухожилия после лиофилизации показали снижение прочностных характеристик данной ткани (таб.1). Так, предел прочности нативных образцов пяточного сухожилия равен 17,40±1,74 МПа, тогда как аналогичный показатель образцов экспериментальной группы - 14,30±2,42 МПа. При этом среднее значение предела прочности снизилось в 1,2 раза (р<0,05). Значение модуля Юнга нативных образцов пяточного сухожилия составило 106,80±6,95 МПа, лиофи-лнзированных образцов - 64,70±5,43 МПа, то есть величина модуля Юнга лио-филизированных образцов уменьшилась в 1,7 раза (р<0,05).

Таблица 1

Сравнительные данные показателей физико-мехапичсских свойств

нативного и лиофилизированного аллогенпого пяточного сухожилия

Аллотрансплантаты пяточного сухожилия Предел прочности (МПа) (М±ш) (е) Относительное удлинение(%) (М±щ) (е) Модуль упругости (Юнга) (МПа) (Mini) (е)

Нативные 17,40±1,74 (1,00) 16,30±0,57 (0,33) 106,80i6,95 (4,01)

Лиофилизированные 14,30±2,42 (1,40) 22,40±5,83 (3,37) 64,70i5,43 (3,14)

Полученные нами результаты физико-механических испытаний аллотрансплантатов пяточного сухожилия согласуются с данными Н.П. Демичева (1970), Г.П. Котелышкова и соавт. (2001), которые в своюс исследованиях отмечают cira-жение прочностных показателей сухожилий после процесса лиофилизации.

Изучение прочностных характеристик образцов широкой фасции бедра показало следующее: значение предела прочности нативных образцов широкой фасции бедра составило 8,1 Oil 0,18 МПа, значение предела прочности лиофи-лизированных образцов широкой фасции бедра - 5,90±4,85 МПа, что в 1,4 раза ниже значения предела прочности нативных образцов (р<0,05). Модуль Юнга нативных образцов широкой фасции бедра составил 17,50±21,82 МПа, лиофи-

лизированных образцов широкой фасции бедра - 13,60±11,48 МПа, то есть произошло снижение значения модуля Юнга лиофилизированных образцов в 1,3 раза (р<0,05). Сравнительные данные показателей физико-механических свойств образцов нативной и лиофилизированной широкой фасции бедра представлены в таблице 2.

Таблица 2

Сравнительные данные показателей физико-механических свойств

Аллотрансплантаты широкой фасции бедра Предел прочности (МПа) (М±ш) (с) Относительное удлинение(%) (М±ш) (е) Модуль упругости (Ют а) (МПа) (М±т) (е)

Нативные 8,10±10,18(5,88) 45,50±0,95 (0,55) 17,50±21,82 (12,60)

Лиофилизированные 5,90±4,85 (2,80) 43,40±0,79 (0,46) 13,60±11,48 (6,63)

Снижение прочностных свойств лиофилизированных фасций отмечал в своих работах Н. Петров (1977).

Физико-механические испытания образцов обеих групп твердой оболочки головного мозга показали следующие результаты: значение предела прочности нативных образцов ТМО составило 12,20±0,85 МПа, у лиофилизированных образцов твердой оболочки головного мозга данный показатель составил 8,9±3,16МПа. Значение предела прочности экспериментальных образцов твердой оболочки головного мозга, по сравнению с контрольными образцами, снизилось в 1,4 раза (р<0,05). Схожая картина наблюдалась при анализе изменения значения модуля Юнга. Так, в контрольной группе образцов твердой оболочки головного мозга значение модуля Юнга составило 63,1±2,79 МПа, в экспериментальной группе образцов твердой оболочки головного мозга -50,4±25,15 МПа, то есть произошло снижение значения модуля Юнга у лиофилизированных образцов твердой оболочки головного мозга в 1,2 раза (р<0,05). Сравнительные данные физико-механических испытаний нативных и лиофилизированных образцов твердой оболочки головного представлены в таблице 3.

Таблица 3

Сравнительные данные показателей физико-механических свойств

Аллотрансплантаты твердой оболочки головного мозга Предел прочности (МПа) (М±т) (е) Относительное удлинение(%) (М±ш) (е) Модуль упругости (Юнга) (МПа) (М±т) (е)

Нативные 12,20±0,85 (0,49) 20,5±0,12(0,07) 63,1±2,79 (1,61)

Лиофилизированные 8,9±3,16(1,82) 19,1±4,57(2,64) 50,4±25,15 (14,52)

Прочностные свойства образцов лиофилизированных аллотрансплантатов дермы опорных участков стопы не претерпевают достоверных изменений. Так, результаты физико-механических испытаний нативных и лиофилизированных образцов дермы опорных участков стопы наглядно демонстрировали сохранение прочностных характеристик образцов лиофилизированной дермы опорных участков стопы. Полученные данные приведены в таблице 4.

Таблица 4

Сравнительные данные показателей физико-механических свойств

Аллотрансплантаты дермы подошвы стопы Предел прочности (МПа) (М±т) (е) Относительное удлинение(%) (М±т) (е) Модуль упругости (Юнга) (МПа) (М±т) (е)

Нативные 9,00±1,29 (0,74) 52,6±6,15 (3,55) 17,00±1,59 (0,92)

Лиофилизированные 8,80±1,91 (1,10) 50,1±7,70 (4,45) 16,90±2,3 0(1,33)

Обобщая вышеизложенное, можно заключить, что у изученных анатомических структур в процессе лиофилизации происходят различные структурные преобразования. Эти преобразования, на наш взгляд, зависят от исходной фиб-роархитектоники тканей и наличия основного вещества.

Наиболее выраженные изменения фиброархитектоники и прочностных свойств в процессе лиофилизации происходят в тканях с ориентированным типом волокнистого остова (пяточное сухожилие). В тканях со смешанным типом волокнистого остова (твердая оболочка головного мозга, широкая фасция бедра) в процессе лиофилизации происходят менее выраженные изменения структурных и физико-механических свойств. Пространственный неориентированный тип волокнистого остова обуславливает сохранение архитектоники и пластических свойств в процессе лиофилизации аллотрансплантатам дермы опорных участков стопы.

Наличие и количество молекул воды в составе основного вещества соединительной ткани, в которое погружены пучки коллагеновых волокон, также являются, на наш взгляд, фактором, влияющим на сохранность фиброархитектоники аллотрансплантатов в процессе лиофилизации.

Компонентами основного вещества являются гликозаминогликаны - (Серов В.В., Шехтер А.Б., 1981; Ноздрин В.И. и соавт., 2005). ГАГ вместе с другими компонентами основного вещества - гликопротеинами, обеспечивают стабильность связи и пространственную структуру коллагеновых волокон и определяют механические свойства соединительной ткани, такие как прочность, упругость (Слуцкий, 1969, Серов В.В., Шехтер А.Б., 1981). Известно, что различные типы соединительной ткани содержат различное количество основного вещества

(Шехтер А.Б., 1981). Так, Н.П. Омельянеико, Л.И Слуцкий (2010) указывают, что в сухожилиях между пучками коллагеновых волокон содержится наименьшее количество основного вещества. В ТМО и ФБ при относительно небольшой толщине, достаточно плотном расположении пучков коллагеновых волокон и многослойности - доля основного вещества также невысока (Валишина А.Д., 1979; Нигматуллин Р.Т., 1996). В ДП коллагеновые волокна и образованные ими переплетающиеся пучки погружены в основное вещество, количество которого в два раза выше, чем в оболочках и фасциях (Мулдашев Э.Р. и соавт., 1981; Ноз-дрин В.И. и соавт., 2005). Окружая волокнистые структуры, основное вещество стабилизирует их пространственное положение и объединяет в единый комплекс, выполняя роль межфибриллярного «цементирующего» вещества (Серов В.В., Шехтер А.Б., 1981; Омельяненко Н.П., Слуцкий Л.И., 2010).

Высушивание тканей в процессе лиофилизации приводит к дегидратации аморфного матрикса, окружающего коллагеновые волокна. В результате этого, в зависимости от степени начальной гидратированности аморфного матрикса, происходят структурные преобразования ткани. Таким образом, в процессе сублимационного высушивания происходит удаление воды из основного вещества, что приводит к потере его «цементирующих» свойств. При разрушении основного вещества коллагеновые волокна распадаются на отдельные фибриллы, происходит дезорганизация пучков коллагеновых волокон, что приводит к нарушению пространственной организации ткани и снижению прочностных характеристик.

Результаты экспериментального исследования позволили оценить различия в процессе резорбции-замещення после имплантации консервированного и лиофилизированного пяточного сухожилия. В первой серии экспериментов были пересажены аллотрансплантагы ПС с сохраненной фиброархитектоникой. Процесс замещения протекал равномерно от периферии к центру, образуя через 180 суток регенерат, повторяющий архитектонику пересаженного аллотрансплан-тата сухожилия. Во второй серии имплантировали лиофилизированные ал-лотрансплантаты с выраженными изменениями волокнистого остова. Трансплантация лиофилизированных ПС привела к быстрому и сплошному замещению, при котором исключается роль формообразующего фактора волокнистого остова ал-лотрансплаптата. Сформировавшийся на 180 сутки регенерат больше напоминал фиброзную ткань с неупорядоченной архитектоникой коллагеновых волокон.

Преобразования структуры и падение прочностных характеристик лиофилизированных соединительнотканных аллотрансплантатов пяточного сухожилия, твердой оболочки головного мозга, широкой фасции бедра являются существенным о1раничением при использовании их для укрепляющих операций, где главную роль играют физико-механические свойства тканей. Лиофилизированные соединительнотканные аллотрансплантаты пяточного сухожилия, твердой

оболочки головного мозга, широкой фасции бедра могут использоваться при заполнении объемных дефектов различных тканей (Сироткина И.А., 2005), в нейрохирургической практике при проведении реконструктивных операций (Dufrane D. et al., 2003), в качестве укрывных мембран (Вырмаксин С.И., 2008), для восстановления тканей с дренажной функцией (Мулдашев Э.Р. с соавт., 2005; Нуралиев II.X., 2008), в качестве аллогенных носителей для различных биопрепаратов (Аськова H.H. с соавт., 2004). Существенным ограничением в применении лиофилизированных аллотрансплантатов с измененной структурой является неэффективность их при использовании для укрепляющих операций, где главную роль играют физико-механические свойства тканей.

ВЫВОДЫ

1. Процесс лиофшшзации приводит к изменению фиброархитектоники аллотрансплантатов и их физико-механических свойств.

2. Изменение структуры и прочностных свойств соединительнотканных аллотрансплантатов в процессе лиофилизации зависят от специфичности фиброархитектоники тканей и наличия основного вещества.

3. Процесс лиофилизации приводит к изменению пространственной архитектоники аллотрансплантатов, изготовленных из плотной оформленной соединительной ткани с ориентированным типом волокнистого остова (пяточное сухожилие) и смешанным типом волокнистого остова (твердая оболочки головного мозга, широкая фасция бедра). Изменения фиброархитектоники в процессе лиофилизации не наблюдается у аллотрансплантатов, изготовленных из плотной неоформленной соединительной ткани с неориентированным типом волокнистого остова (дерма опорных участков стопы).

4. Изменения прочностных свойств лиофилизированных аллотрансплантатов пяточного сухожилия, твердой оболочки головного мозга, широкой фасции бедра тесно коррелируют с изменениями их фиброархитектоники: выраженные изменения в структуре перечисленных аллотрансплантатов приводят к снижению предела прочности и модуля упругости. Результаты физико-механических испытаний лиофилизированного аллотрансплантата дермы опорных участков стопы демонстрируют сохранение прочностных характеристик данного аллотрансплантата.

5. Характер замещения соедипителыюткашшх аллотрансплантатов, а так же структура регенерата определяются степенью сохранности волокнистого остова. При пересадке аллотрансплантата пяточного сухожилия с сохраненной фиброархитектоникой происходит формирование регенерата, повторяющего структуру имплантируемой ткани. При трансплантации лиофилизированных пяточных сухожилий исключается роль формообразующего фактора волокни-

стого остова аллотрансплантата. Сформировавшийся на 180-е сутки регенерат представляет собой фиброзную ткань с неупорядоченной архитектоникой кол-лагеновых волокон.

6. Преобразования структуры и падение прочностных характеристик лиофилизированных соединительнотканных аллотрансплантатов пяточного сухожилия, твердой оболочки головного мозга, широкой фасции бедра являются существенным ограничением при использовании их для укрепляющих операций, где главную роль играют физико-механические свойства тканей. Указанные аллотрансплантаты могут применяться при заполнении объемных дефектов тканей, в качестве укрывных мембран, бионосителей для культур клеток.

Практические рекомендации:

1. Полученные результаты включены в лабораторный регламент на изготовление лиофилизированных аллотрансплантатов в лаборатории консервации тканей Федерального государственного бюджетного учреждения «Всероссийский центр глазной и пластической хирургии» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

2. Предсказуемость преобразований фиброархитектоники и физико-механических свойств лиофилизированных аллотрансплантатов в зависимости от типа волокнистого остова соединительной ткани может быть использована при разработке новых видов лиофилизированных аллотрансплантатов в деятельности тканевых банков.

3. Результаты проведенного комплексного анализа структуры и пластических свойств лиофилизированных аллотрансплантатов с различными типами волокнистого остова могут использоваться для коррекции их применения в клинической практике.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Булгакова, Л.А. Имплантация аллотрансплантатов, моделированных разными способами на конъюктиву глазного яблока / O.P. Шангина, Р.Д. Гай-нутдинова, Л.А. Мусина, С.А. Муслимов, Л.А. Булгакова // Вестник Оренбургского Государственного Университета. - 2010. - № 12. - С. 236-238.

2. Булгакова, Л.А. Стандарты предприятия в работе многопрофильных тканевых банков / O.P. Шанпша, Р.Д. Гайнутдинова, Л.А. Булгакова // Метрология и инженерное дело в медико-биологической практике: материалы V межрегиональной научно-практической конференции. - Оренбург, 2011. — С. 112-113.

3. Булгакова, Л.А. Экспериментально-гистологическое обоснование эффективное™ пористого аллотрансплантата для целей офтальмохирургии / O.P. Шанпша, Л.А. Мусина, P.A. Хасанов, Л.А. Булгакова, Г.Г. Корнилаева,

MIL Корнилаева // Вестник Оренбургского Государственного Университета. -2011.-№14 (133).-С. 400-403.

4. Булгакова, JI.A. Особенности структуры лиофилизированных трансплантатов / O.P. Шангина, ДА. Булгакова // Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии : материалы V симпозиума (17-18 мая 2012 г., Уфа). - Уфа, 2012. - С. 118-120.

5. Булгакова, ДА. Морфологические особенности фиброархитектоники лиофилизированных аллотрансплантатов / O.P. Шангина, P.A. Хасанов, Л.А. Булгакова // Морфология. - 2012. - Т. 141, № 3. - С. 175.

6. Булгакова, ДА. Сравнительная характеристика аллотрансплантатов для склеропластики, изготовленных разными методами / ДА. Булгакова, O.P. Шангина 11 Вестник Оренбургского Государственного Университета. - 2012. - № 12 (148).-С. 23-25.

7. Булгакова, Л.А. Закономерности изменений структуры лиофилизированных соединительнотканных аллотрансплантатов / O.P. Шангина, P.A. Хасанов, Л.А. Булгакова // Вестник Оренбургского Государственного Университета. - 2013. - № 4 (153). - С. 299-302.

8. Булгакова, Л.А. Разработка аллотрансплантатов для отохирургии / Д.А. Щербаков, O.P. Шангина, Л.А. Булгакова,// Технологии живых систем. -2013,—Т.10, № 8. С. 65-67.

9. Булгакова, Л.А. Морфологическая оценка эффективности пересадки лиофилизированных трансплантатов при тендопластике / Л.А. Булгакова, O.P. Шангина, Л.А. Мусина // Морфология. - 2013. - Т. 144, № 5. - С. 66-67.

10. Булгакова, Л.А. Применение структурно-модифицированного сухожильного трансплантата в офтальмохирурпш / В.У. Галимова, Л.А. Мусина, O.P. Шангина, P.A. Хасанов, Л.А. Булгакова // Материалы I Национального Конгресса по регенеративной медицине (4-6 декабря, 2013 г., г. Москва). -М. 2013. С.-59.

Список сокращений

ТМО - твердая оболочка головного мозга

ПС - пяточное сухожилие

ФБ - широкая фасция бедра

ДП - дерма опорных участков стопы

ГАГ — гликозаминогликаны

БУЛГАКОВА Людмила Александровна

МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ФИБРОАРХИТЕКТОНИКИ ЛИОФШШЗИРОВАННЫХ СОЕДИНИТЕЛЬНОТКАННЫХ АЛЛОТРАНСПЛАНТАТОВ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Издательская лицензия № 06788 от 01.11.2001 г. ООО «Издательство «Здравоохранение Башкортостана» 450077, РБ, г. Уфа, ул. Ленина, 3, тел. (3472) 22-73-50, факс 22-37-51.

Подписано в печать 17.04.2014 г. Формат 60x84/16. Гарнитура Times New Roman. Бумага офсетная. Отпечатано на ризографе. Усл. печ. л. 1,4. Уч.-изд. л. 1,04. Тираж 100. Заказ № 818.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Булгакова, Людмила Александровна, Оренбург

>

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВСЕРОССИЙСКИЙ ЦЕНТР ГЛАЗНОЙ И ПЛАСТИЧЕСКОЙ ХИРУРГИИ

На правах рукописи

04201459420 Булгакова Людмила Александровна

МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ФИБРОАРХИТЕКТОНИКИ ЛИОФИЛИЗИРОВАННЫХ СОЕДИНИТЕЛЬНОТКАННЫХ

АЛЛОТРАНСПЛАНТАТОВ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Шангина О.Р.

Уфа-2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ...........................................3

ВВЕДЕНИЕ.................................................... 4

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..................................... 9

1.1. Методы консервирования тканей.............................. 9

1.2. Лиофилизация соединительнотканных аллотрансплантатов.........18

1.3. Влияние лиофилизации на структуру и физико-механические

свойства соединительнотканных аллотрансплантатов..................24

1.4 Применение лифилизированных соединительнотканных

аллотрансплантатов в клинической практике..........................30

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ................38

2.1. Методика подготовки соединительнотканных аллотрансплантатов и методы физико-химической обработки..............................38

2.2. Методы морфологического исследования образцов нативных тканей

и соединительнотканных лиофилизированных аллотрансплантатов......39

2.3. Методы физико-механических исследований......................42

2.4. Материалы и методы экспериментально-морфологического исследования лиофилизированных аллотрансплантатов.....................44

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ..........47

3.1. Результаты морфологического исследования......................47

3.2. Результаты физико-механических исследований..................80

3.3. Результаты экспериментально-морфологического исследования.....88

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ..............98

ВЫВОДЫ.......................................................105

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ............................. 107

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.........................................108

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ:

СТТ - соединительнотканные трансплантаты ТМО — твердая оболочка головного мозга ПС - пяточное сухожилие ФБ - широкая фасция бедра ДП - дерма опорных участков стопы ГАГ - гликозаминогликаны

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время применение биологических тканей для трансплантации получило всеобщее признание (Мирский М.Б., 1985; Goldberg V. М. et al., 1993; Noh J.H. et al., 2011; Miller, L.E. et al., 2011). Большинство заготавливаемых в тканевых банках донорских тканей относятся к соединительнотканным формациям: твердая оболочка головного мозга, сухожилия различной локализации, дерма, фиброзные оболочки органов, перикард, хрящи, кости и т.д. (Аськова JI.H. с соавт. 2004; Щербаков Д.А., 2011; Chaushu G. et al., 2009; Nissan J. et al., 2012; Rossi A.C. et al., 2012). Применение их в клинической практике приносит, как правило, положительный результат (Мулдашев Э.Р., 1994; Федяев И.М. с соавт., 2004; Кульбаев, Н.Д. с соавт., 2012; Полякова Е.Ю. с соавт., 2012; Timaran С.Н. et al.,2002; Miller L.E. et al., 2011; Nishida Y. et al., 2011).

Донорские ткани, чтобы стать пригодными для пересадки, должны быть консервированными. Все известные методы физико-химической обработки и консервации направлены на снижение антигенных свойств тканей, при сохранении их волокнистого каркаса (Клен Р., 1962; Нигматуллин Р.Т., 2003; Федорова, Е.А. с соавт., 2005; Воусе Т. et al., 1999). Одним из широко используемых методов консервирования донорских тканей является лиофилизация. Лиофилизация - метод высушивания замороженных тканей в вакууме. Методика высушивания тканей в замороженном состоянии, по мнению ряда авторов, обладает определенным преимуществом перед другими видами консервирования, что прежде всего выражается в хорошей сохранности ткани в течение долгого времени (Мнержичка П. с соавт., 1988; Милюдин Е.С. с соавт., 2004). Лиофилизированные ткани, у которых остаточная влажность до 1%, могут сохраняться при комнатной температуре в течение пяти лет без существенных изменений своих свойств, кроме того, они не требуют специальных условий при транспортировке, что имеет большое практическое значение (Коваленко П.П., 1975; Савельев В.И.

с соавт., 2001; Г. Кристинов, 1975; ваНа С.Я. ег а1., 2009). По мнению В.И. Савельева с соавторами (2004), в процессе лиофилизации ткани приобретают устойчивость к факторам внешней среды и способность сохранять комплекс структурных и биохимических свойств, важных с трансплантационной точки зрения. Кроме того, по мнению этих же авторов, лиофилизация аллогенных тканей важна перед стерилизацией гамма-лучами, поскольку без дегидратации в тканях возникают различные изменения, препятствующие их клиническому использованию.

Однако не все авторы придерживаются того же мнения. О том, что лиофилизация отрицательно сказывается на пластических свойствах биологических тканей, отмечают в своих работах Г. Кристинов (1978) и Р.Н. Подопригора (2004).

Опубликовано большое количество научных работ по вопросам лиофилизации биологических тканей, но отсутствуют данные о комплексном исследовании фиброархитектоники, пластических и регенераторных свойств лиофилизированных соединительнотканных трансплантатов, а также специфики их применения в клинической практике.

В этой связи представляется актуальным изучение влияния процесса лиофилизации на волокнистый остов и физико-механические свойства соединительнотканных аллотрансплантатов.

Цель настоящего исследования: провести оценку фиброархитектоники и прочностных свойств лиофилизированных соединительнотканных аллотрансплантатов.

Задачи исследования:

1. Изучить влияние лиофилизации на фиброархитектонику соединительнотканных аллотрансплантатов с различными типами волокнистого остова.

2. Оценить прочностные свойства соединительнотканных аллотрансплантатов с различными типами волокнистого остова до и после лиофилизации.

3. В эксперименте изучить морфологические особенности замещения лиофилизированных соединительнотканных аллотрансплантатов.

4. На основе морфологических и физико-механических исследований разработать методические рекомендации по эффективному использованию лиофилизированных аллотрансплантатов в клинической практике.

Научная новизна исследования

В представленной работе впервые проведена комплексная оценка структуры и прочностных свойств лиофилизированных аллотрансплантатов. Определено, что изменения, происходящие в структуре трансплантатов, зависят от типа волокнистого остова соединительной ткани и наличия основного вещества. Установлено, что процесс лиофилизации приводит к изменению фиброархитектоники аллотрансплантатов, изготовленных из плотной оформленной соединительной ткани с ориентированным типом волокнистого остова и смешанным типом волокнистого остова. Изменения фиброархитектоники в процессе лиофилизации не наблюдаются у аллотрансплантатов, изготовленных из плотной неоформленной соединительной ткани с неориентированным типом волокнистого остова.

Выявлено, что наибольшее снижение прочностных свойств происходит у лиофилизированных аллотрансплантатов, изготовленных из плотной оформленной соединительной ткани с ориентированным типом волокнистого остова.

Теоретическая и практическая значимость исследования

Определены критерии сохранности фиброаорхитектоники лиофилизацированных аллотранплантатов в зависимости от типа волокнистого остова соединительной ткани и наличия основного вещества.

На основе полученных данных разработаны методические рекомендации по применению лиофилизированных соединительнотканных аллотранплантатов в клинической практике. Морфологически доказано и

экспериментально подтверждено, что преобразование структуры и снижение прочностных характеристик лиофилизированных соединительнотканных аллотрансплантатов являются существенным ограничением при использовании их для укрепляющих операций, где главную роль играют физико-механические свойства тканей.

Реализация результатов исследования

Результаты работы включены в технологический регламент изготовления лиофилизированных соединительнотканных

аллотрансплантатов в лаборатории консервации тканей ФГБУ «Всероссийский центр глазной и пластической хирургии» МЗ РФ Аллотрансплантаты, консервированные методом лиофилизации, применяются в различных областях хирургии и поставляются в 57 клиник России и стран СНГ.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Изменения, происходящие в структуре лиофилизированных соединительнотканных аллотрансплантатов, зависят от фиброархитектоники и наличия основного вещества в тканях.

2. Сохранение прочностных свойств лиофилизированных аллотрансплантатов тесно коррелирует с изменениями их фиброархитектоники: выраженные изменения в структуре аллотранспланатов приводят к снижению предела прочности и модуля упругости.

3. Характер резорбции и замещения лиофилизированных соединительнотканных аллотрансплантатов зависит от их структуры и физико-механических свойств.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы были представлены и обсуждены на XXI Межрегиональной научно-практической конференции с

международным участием «Новые технологии микрохирургии глаза» г. Оренбург, 2010г.; на XXII Межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Новые технологии микрохирургии глаза» г. Оренбург, 2011г.; на V Всероссийском симпозиуме с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» г. Уфа, 2012г.; на Всероссийской конференции с международным участием «Доклиническое исследование в инновационной медицине и биотехнологиях» г. Самара, 2013г.; на Всероссийской научной конференции посвященной памяти чл.-корр. АМН СССР профессора Ф.М. Лазаренко «Актуальные проблемы морфологии, адаптогенеза и репаративных гистогенезов» г. Оренбург, 2013г.; на I Национальном Конгрессе по регенеративной медицине г. Москва, 2013 г.

Работа апробирована на расширенном заседании Башкирского отделения Всероссийского научного общества анатомов, гистологов и эмбриологов (ВРНО АГЭ), г. Уфа, 2014.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 10 работ, из них 7 работ в изданиях, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, списка использованной литературы. Список литературы содержит 262 источника, из них 165 отечественных и 97 зарубежных. Текст изложен на 137 страницах машинописного текста. Работа иллюстрирована 10 таблицами, 16 рисунками, 52 микрофотографиями.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Методы консервирования тканей

Современное развитие науки и техники оказало огромное влияние на развитие биологии и медицины и послужило интенсивному росту наиболее перспективных направлений научных исследований. Одним из таких направлений является трансплантация органов и тканей (Мирский М.Б., 1985; Goldberg V. М. et al., 1993; Garbuz D.S. et al., 1998; Noh J.H.et al., 2011; Miller, L.E. et al., 2011).

В настоящее время применение аллогенных тканей для трансплантации получило всеобщее признание, так как аллогенные ткани являются ценным пластическим материалом (Нигматуллин Р.Т., 1996; Chaushu G. et al., 2009; Гайнутдинова Р.Д. 2011; Nissan J. et al., 2012; Rossi A.C. et al., 2012). Применение их приносит в большинстве случаев положительный клинический результат (Мулдашев Э.Р., 1994; Кульбаев, Н.Д. с соавт. 2012; Полякова, Е.Ю. с соавт. 2012; Nishida Y. et al., 2011). Большое значение имеет также экономический эффект, получаемый при использовании консервированных тканей (Коваленко П.П., 1975). Так, при пластических операциях, осуществляемых с использованием аллогенных тканей, уменьшается продолжительность нетрудоспособности больных, резко снижается их пребывание в стационарах (Триф В.В. с соавт., 2010; Levitt R.L. et. al., 1994; Körnender J., et. al., 2001; Park I.H. et al., 2008). С использованием консервированных тканей уменьшается время операции. Успех пересадок зависит не только от правильных показаний и безупречной техники, но и от особенностей трансплантата, которые определяются выбором и обработкой ткани, а так же применением соответствующего метода консервирования (Клен Р., 1962; Федорова, Е.А. с соавт., 2005; Воусе Т. et. al., 1999). Цели и смысл консервирования заключаются в сохранении тканей на длительное время, а так же ликвидации антигенных свойств ткани под влиянием консервирующих средств (Филатов А.Н., 1960; Муслимов С.А., 2000;

Нигматуллин Р.Т., 2003). Вот почему разработке методов консервирования аллогенных тканей уделяется такое большое внимание.

Консервированием называется сохранение в тканях, изъятых из организма донора, основных трансплантационных, биологических и анатомических качеств и особенностей. Главным здесь является сохранение тканью так называемой биологической активности, другими словами комплекса морфологических и биохимических качеств, определяющих в конечном итоге положительный исход лечения (Савельев В.И. с соавт., 2001; Канюков В.Н. с соавт., 2005; Clark R.P. et al., 2009).

Консервирование тканей является перспективной областью современной медицины и биологии, благодаря которому стало возможным широкое применение алло-и ксенотрансплантатов в хирургии (Ханамирян, Т.В., 2010; Berry, R.B. et. al., 1980). Консервированный трансплантат, как сложный биологический продукт, оказывает многостороннее действие на реципиента. Оптимальные результаты операций достигаются с применением аллогенных трансплантатов вследствие того, что они вызывают наименьшую иммунную реакцию и стимулируют процессы репаративной регенерации (Лузина Л.В. 2007; Salamon А., 1976; Verzen R., 1999; Ikeda J. et al., 2010).

Большинство заготавливаемых в тканевых банках донорских тканей относятся к соединительнотканным формациям: твердая оболочка головного мозга, сухожилия различных локализаций, дерма, фиброзные оболочки органов, перикард, хрящи, кости и т.д. Одной из основных задач при заготовке аллотрансплантатов является сохранение их структуры, биологических и пластических свойств, а так же их физиологической функции в процессе физико-химической обработки, консервирования и стерилизации (Демичев Н.П., 1970; Имамалиев А.С., 1975; Иоффе И.Л. с соавт., 1975 Сучков, В.Б. с соавт.,1982). Важно при этом отметить, что свойства тканей и видоспецифичность, а так же методы их консервирования имеют одно из основных значений в процессах трансформации при пересадке (Нигматуллин Р.Т., 1996; Дунаев П.В., 1999; Шангина О.Р., 2007).

и

Установлено, что определяющим фактором структуры формирующейся ткани на месте пересаженного трансплантата является его фиброархитектоника (Коваленко П.П., 1976). Рядом исследователей отмечается, что при ' пересадке тканей, несущих в основном механическую опорную функцию, клинический эффект не зависит от жизнеспособности трансплантатов (Петров П.Н. с соавт., 1975 Петров Н. с соавт., 1977). Это аллостатические трансплантаты, в которых основополагающую роль играет коллагеново-эластический каркас тканей, служащий базой для инвазии клеток реципиента и регенерации (Фукс Б.Б. с соавт., 1968; Сельский Н.Е., 2000). Каждая ткань в зависимости от своей структуры, а так же биохимического состава нуждается в особом, соответствующем данной ткани, методе консервирования (Саутин Е.П., 1982; Мулдашев Э.Р., 1994; Подопригора Р.Н., 2004; Шангина O.P., 2007). Для одних тканей наиболее подходящими являются консервирующие растворы, для других -замораживание, для третьих - лиофилизация (Бродский А.Ф., 1965). Известно, что такие свойства соединительнотканных трансплантатов, как способность стимулировать процессы репаративной регенерации, иммуногенность, биомеханические параметры имеют принципиальное значение в клинической практике (Обысов A.C., 1971; Сорокин А.П., 1973; Нигматуллин Р.Т., 2003). Все известные методы консервирования позволяют получить аллостатические трансплантаты, которые снижают их антигенную активность. Опираясь на многочисленные факты был сделан вывод, что при оптимальном методе консервирования аллотрансплантаты должны иметь свободную от клеток фиброструктуру (Демичев Н.П., 1970; Савельев В.И. с соавт., 2001; Buchmann S. et al., 2008). Разрабатывая методы консервирования аллогенных тканей исследователи, как правило, исходили, из следующих принципов: снижение антигенных свойств тканей; сохранение биопластических и биомеханических свойства тканей; при этом жизнеспособность тканей не является обязательным условием для пересадок.

Следует отметить, что по последнему принципу не достигнуто единого мнения (ЗайковаМ.В. с соавт., 1984; Григорян С.С. с соавт., 1983).

Результаты многочисленных исследований показали, что соединительнотканные трансплантаты подвергаются в организме реципиента постепенной перестройке и замещению новообразованной тканью (Имамалиев A.C., 1975; Коваленко П.П., 1976; Савельев с соавт., 1992; Бикмуллин P.A. с соавт., 1994; Мулдашев Э.Р., 1994; Муслимов С.А., 2000). Останавливаясь на современных способах консервирован�