Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфологическая характеристика репаративных процессов в коже при действии митохондриально-направленного антиоксиданта SkQ1

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Морфологическая характеристика репаративных процессов в коже при действии митохондриально-направленного антиоксиданта SkQ1"

На правах рукописи

ДЕМЬЯНЕНКО ИЛЬЯ АЛЕКСАНДРОВИЧ

МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РЕПАРАТИВНЫХ ПРОЦЕССОВ В КОЖЕ ПРИ ДЕЙСТВИИ МИТОХОНДРИАЛЬНО-НАПРАВЛЕННОГО АНТИОКСИДАНТА БкС>1

03.03.04. - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2012

005057072

Работа выполнена на кафедре клеточной биологии и гистологии Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент

Ильинская Ольга Петровна

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор

Макарова Ольга Васильевна

Официальные оппоненты: Руководитель группы функциональной

морфологии стресса ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН, ведущий научный сотрудник, доктор биологических наук, доцент Кондашевская Марина Владиславовна

Ведущий научный сотрудник лаборатории клеточной физиологии ГНЦ РФ Института медико-биологических проблем РАН, кандидат биологических наук

Андреева Блена Ромуальдовна

Ведущая организация: Институт биологии развития имени

Н.К. Кольцова РАН

Защита состоится 20 ноября 2012 года в 15 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д.501.001.52. при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу 119234, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, Биологический факультет МГУ, аудитория М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан » октября 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Калистратова Е.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Снижение репаративных возможностей тканей с возрастом является одним из характерных проявлений старения организма у большинства млекопитающих, включая человека (Yanai H. ее. al., 2011). Кроме того, некоторые возрастные заболевания, в частности сахарный диабет II типа, способствуют значительному замедлению регенеративных процессов и могут сопровождаться развитием длительно незаживающих ран (Menke N. et al., 2007). Механизмы развития подобных нарушений репаративной регенерации к настоящему времени остаются до конца не исследованными. Согласно современным литературным данным, активные формы кислорода (АФК) являются одним из важных элементов регуляции репаративных процессов в коже, оказывая воздействие на внутриклеточные пути передачи сигналов в различных типах клеток, участвующих в заживлении ран (Soneja A. et al., 2005; Sen С. К., Roy S., 2008; Schafer M., Werner S., 2008). При этом хроническое течение раневого заживления при старении и сахарном диабете сопровождается развитием окислительного стресса в зоне повреждения (Rasik A.M., Shukla А., 2000; James T.J. et al., 2003; Yeoh-Ellerton S., Stacey M.C., 2003). Кроме того, в различных экспериментальных и некоторых клинических исследованиях было показано, что как локальное, так и системное воздействие антиоксидантов, может стимулировать заживление кожных ран (Fitzmaurice et al., 2011). Таким образом, литературные данные указывают на то, что повышенное образование АФК способствует замедлению репаративных процессов.

Гиперпродукцию АФК рассматривают как один из механизмов развития многих признаков физиологического старения, а также возрастных патологий. При этом ключевую роль отводят АФК, которые образуются в электронтранспортной цепи митохондрий (Harman D., 1956; Papa S., Skulachev V.P., 1997; Droge W., 2002). Для изучения селективной роли митохондриальных АФК в различных биологических процессах применяют митохондриально-направленные антиоксиданты, состоящие из молекулы антиоксиданта, присоединенной к липофильному катиону (Burns R.J. et al., 1995; Антоненко Ю.Н. и др., 2008). Химическая структура подобных соединений позволяет им избирательно накапливаться в энергизованных митохондриях клеток и действовать в чрезвычайно низких концентрациях. Одним из наиболее перспективных митохондриально-направленных антиоксидантов для использования в экспериментах, проводимых на животных, является 10-(6'-пластохинонил) децилтрифенилфосфония - SkQl. Это обусловлено наличием широкого диапазона доз, в которых он проявляет антиоксидантное действие, а также его относительной химической стабильностью. Проведенные ранее исследования показали, что SkQl при длительном введении замедляет развитие целого ряда признаков старения у млекопитающих (мыши, крысы). Кроме того, данный антиоксидант оказывает защитное действие в различных моделях возрастных патологий (Skulachev M.V. et al., 2011 ). Однако изучение влияния SkQl на возрастное замедление репаративных процессов при заживлении

кожных ран ранее не проводилось. В настоящее время роль АФК митохондриального происхождения в развитии возрастных и патологических нарушений репаративной регенерации кожи остается мало изученной. Кроме того, в литературе отсутствуют работы, посвященные изучению влияния митохондриально-направленных антиоксидантов на процессы заживления ран in vivo, что обуславливает актуальность исследований в данной области.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей диссертационной работы явилось исследование влияния митохондриально-направленного антиоксиданта SkQl на репаративные процессы в коже на экспериментальных моделях физиологического и патологического заживления ран у животных.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать влияние длительного перорального введения SkQl на репаративные процессы в полнослойных кожных ранах у старых мышей.

2. Изучить эффект длительного перорального введения SkQl на репаративные процессы в полнослойных кожных ранах на модели сахарного диабета II типа у мышей.

3. Охарактеризовать влияние перорального введения SkQl на динамику изменения клеточного состава инфильтрата в различных фазах асептического воспаления у мышей.

4. Исследовать эффект локального интрадермального введения SkQl на репаративные процессы в полнослойных кожных ранах у крыс.

Научная новизна работы

Впервые исследованы эффекты локального и системного воздействий митохондриально-направленного антиоксиданта SkQl на репаративные процессы в коже in vivo в различных моделях физиологического и патологического заживления ран у животных.

Впервые показано, что длительное системное воздействие SkQl препятствует развитию нарушений заживления кожных ран у стареющих (возраст 24 мес) мышей Fl(CBAxC57Bl/6), а также у мутантных мышей с признаками сахарного диабета II типа C57BIKS-Lepr /J (db/dh).

Впервые получены данные о том, что в различных моделях репаративной регенерации кожи и асептического воспаления введение SkQl подавляет нейтрофильную инфильтрацию зоны повреждения. Кроме того, в исследованных моделях заживления полнослойных кожных ран впервые показано, что SkQl при различных схемах введения ускоряет процесс формирования грануляционной ткани в зоне раневого дефекта.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные экспериментальные данные указывают на важную роль митохондриальных АФК в регуляции репаративных процессов, а также в развитии возрастных и патологических нарушений заживления ран. Результаты

данной работы свидетельствуют о перспективности дальнейших исследований возможных механизмов действия митохондриально-направленных антиоксидантов на процессы репаративной регенерации тканей.

Результаты исследования могут стать основой для разработки фармацевтических препаратов на базе митохондриально-направленных антиоксидантов, предназначенных для профилактики и лечения нарушений репаративной регенерации кожи, как при физиологическом старении, так и при различных возрастных патологиях.

Апробация работы

Основные результаты и положения диссертации были представлены и обсуждены на XVII, XVIII и XIX международных научных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2010, 2011, 2012); VIII Всероссийской конференции по патологии клетки (Москва, 2010); VII национальной научно-практической конференции с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 2011); Всероссийской конференции «Регенеративная биология и медицина» (Москва, 2011); X международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Шевченковская весна 2012: биологические науки» (Киев, 2012); заседании кафедры клеточной биологии и гистологии биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (сентябрь 2012 г).

Публикации

По результатам диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них статей в журналах, соответствующих перечню ВАК РФ - 3, тезисов докладов и материалов конференций - 9.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов, списка литературы и приложений. Текст диссертации изложен на 150 страницах, содержит 56 рисунков и 3 таблицы. В приложениях содержится 18 таблиц. Список литературы состоит из 200 цитируемых источников, из которых - 30 на русском, 170 - на иностранном языке.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Работа проведена на мышах гибридах Fl(CBAxC57Bl/6) (п = 34), мышах C57BLKS-LepAí (п = 22), мышах аутбредного стока CD1 (п = 70) и белых беспородных крысах (п = 40). Работу с лабораторными животными проводили в соответствии с приказом Минздрава СССР №755 от 12.08.1977г.

Воздействие SkQl на репаративные процессы в коже изучали в четырех независимых экспериментах, используя различные модели физиологического и патологического заживления ран.

Эксперимент по изучению влияния длительного перорального приема SkQl на репаративные процессы в кожных ранах у старых мышей

проведен на самках мышей гибридов Fl(CBAxC57Bl/6) (п = 34). Опытная группа (п = 10) была представлена старыми животными возрастом 24 мес., получавшими ad libitum питьевую воду, содержавшую митохондриально-направленный антиоксидант SkQl [Ю-(б'-пластохинонил)

децилтрифенилфосфония] в концентрации 1мкМ, начиная с 16-ти мес. возраста до выведения их из эксперимента. Расчетная средняя суточная доза при этом составляла 100 нмоль/кг массы тела. Контрольная группа (п = 12) включала старых животных возрастом 24 мес, не получавших SkQl. В качестве дополнительной группы сравнения использовали молодых половозрелых животных возрастом 6 мес, не получавших SkQl, Всем животным наносили полнослойные кожные раны в межлопаточной области спины. На 7-е и 13-е сут после нанесения ран животных выводили из эксперимента и проводили забор кожного лоскута с раневой областью для гистологического исследования. Эксперимент по изучению влияния длительного перорального приема SkQl на процесс заживления ран на модели сахарного диабета II типа проведен на самцах мышей C57B1KS-Leprdi>/J (п = 22), несущих в 4-й хромосоме рецессивную мутацию гена db, кодирующего рецептор лептина. У большинства гомозиготных по данной мутации особей (db/db) к концу первого месяца жизни наблюдается спонтанное развитие ожирения, гиперфагия, а также симптомы сахарного диабета II типа: инсулинорезистентность, гипергликемия, полидипсия и полиурия. Гетерозиготные животные (db/+) имеют нормальный фенотип (Srinivasan К., Ramaro Р., 2007). Опытная группа (п = 8) была представлена гомозиготными (db/db) животными возрастом 21 нед. Начиная с 10-и недельного возраста до выведения из эксперимента, животным один раз в сутки при помощи механического дозатора вводили в ротовую полость антиоксидант SkQl в виде 700 мкМ раствора в 20% глицерине. Суточная доза антиоксиданта при этом составляла 250 нмоль/кг массы тела. Контрольная группа (п = 9) включала гомозиготных животных (db/db), получавших 20% глицерин без SkQl в той же дозе, что и животные опытной группы. В качестве дополнительной группы сравнения (п = 5) использовали гетерозиготных животных (db/+) также получавших 20% глицерин без SkQl. Всем животным наносили полнослойные кожные раны в межлопаточной области спины. На 7-е сут после нанесения ран животных выводили из эксперимента и проводили забор кожного лоскута с раневой областью для гистологического исследования. Эксперимент по изучению влияния перорального введения SkQl на динамику изменения клеточного состава инфильтрата в различных фазах асептического воспаления проведен на самцах аутбредных мышей стока CD1 (п = 70). Возраст всех животных на момент проведения операций составлял 3 мес. Животные опытной группы (п = 35) получали ad libitum питьевую воду, содержавшую митохондриально-направленный антиоксидант SkQl в концентрации 200 нМ на протяжении 3-х недель перед индукцией асептического воспаления и до выведения их из эксперимента. Расчетная средняя суточная доза SkQl при этом составляла 30 нмоль/кг массы тела.

Животные контрольной группы не получали SkQl. Всем животным проводили операции по индукции асептического воспаления, вводя стерильные покровные стекла круглой формы под кожу спины через разрез в межлопаточной области. Животных выводили из эксперимента через 12 час, 2, 3, 5, 7, 10, 14 сут после проведения операций. Введенные под кожу стекла извлекали для проведения морфологического исследования адгезировавших на них клеток. Эксперимент по изучению эффекта локального интрадермалыюго введения SkQl на репаративные процессы в полнослойных кожных ранах проведен на самцах белых беспородных крыс (п = 40). Возраст всех животных составлял 2 мес. Всем крысам наносили полнослойные кожные раны в межлопаточной области спины. Животным опытной группы (п = 20) сразу после нанесения ран интрадермально инъецировали 50 мкл 200 нМ раствора SkQl, приготовленного на 0,9 % NaCI, на расстоянии 0,5 см от края раневой поверхности. В дальнейшем такие же инъекции повторяли один раз в сут. Животным контрольной группы (п = 20) инъецировали 0,9 % раствор NaCI, не содержавший SkQ, по той же схеме, что и животным опытной группы. Животных выводили из эксперимента через 7 час, 1, 2, 5, 14 сут после проведения операций и проводили забор кожного лоскута с раневой областью для гистологического исследования.

Методы исследования

Определение массы тела животных в ходе длительного предоперационного введения SkQl. Взвешивание старых мышей Fl(CBAxC57Bl/6) проводили непосредственно перед началом введения SkQl, затем через 4 месяца после начала введения, а также перед нанесением ран. Диабетических мышей C57BIKS-Lepr /J взвешивали регулярно один раз в 2 - 3 недели в ходе предоперационного введения антиоксиданта.

Оценка состояния эстрального цикла. У старых и молодых мышей Fl(CBAxC57Bl/6) ежедневно в 10-11 часов утра на протяжении двух недель до нанесения ран проводили взятие влагалищных мазков. На основании полученных кольпоцитограмм оценивали регулярность и продолжительность эстральных циклов.

Измерение показателен уровня глюкозы в крови у диабетических мышей

C57B1KS-Lepr /J проводили в ходе предоперационного введения SkQl один раз в 2 - 3 недели с помощью прибора Accu-Check performa nano (Roche, Франция). Кроме того, на 11-ой неделе премедикации проводили измерение уровня гликозилированного гемоглобина (HbAlc) в крови с использованием прибора NycoCard reader II (Axis-Shiel, Норвегия). Забор крови (5 мкл) проводили из хвостовой вены в утренние часы после 12-и часового голодания животных.

Моделирование полнослойной кожной раны. Для моделирования полнослойной кожной раны мышам Fl(CBAxC57Bl/6), C57B1KS-Lepr'ft/J и белым беспородным крысам под эфирным наркозом в межлопаточной области спины электрической машинкой сбривали шерсть и обрабатывали поверхность кожи 96% этиловым спиртом. Затем при помощи хирургических ножниц и

пинцета там же наносили резаную полнослойную кожную рану площадью ~ 0,7 х 0,7 см2. Заживление ран на всем протяжении эксперимента происходило под струпом.

Изучение динамики сокращения площади раневой поверхности. Для

оценки динамики сокращения площади ран проводили макрофотосъемку раневой поверхности при помощи цифровой камеры Casio Exilim EX-Z75 (Casio, Япония). Площадь раневой поверхности измеряли на фотоснимках, используя программу ImageJ (National Institutes of Health (NIH) http:/rsb.info.nih.gov/ij/). Относительную площадь ран (S) вычисляли по следующей формуле:

S = — хЮ0% So

где So - площадь раны непосредственно после её нанесения, a St - площадь раневой поверхности на данном сроке заживления.

Гистологическое изучение ран. После выведения животных из эксперимента проводили забор кожного лоскута с раневой областью. Кожу мышей фиксировали в 10% формалине на фосфатном буфере (pH 7,2), а кожу крыс - в фиксаторе Буэна. Кожный лоскут разрезали лезвием в поперечной плоскости ровно через центр раневой поверхности, затем подвергали стандартной гистологической обработке и заключали в заливочную среду на основе парафина HISTOMIX-extra (Биовитрум, Россия) или TissuePrep2 (Fisher Scientific, США). Затем на микротоме изготавливали гистологические срезы центральной области ран в поперечной плоскости толщиной 5 мкм. Для морфологического исследования срезы окрашивали гематоксилин-эозином и по Маллори.

Иммуногистохимическое выявление антигенов на срезах. Для

иммуногистохимического анализа срезы обрабатывали 3% перекисью водорода для ингибирования эндогенной пероксидазы. У мышей выявляли специфический макрофагальный антиген f4/80 с помощью крысиных моноклональных антител (Serotec, Великобритания) в разведении 1:400, а-актин гладких мышц - с помощью кроличьих поликлональных антител (Abeam, Великобритания) в разведении 1:100. После нанесения первых антител срезы инкубировали с биотинилированными козьими поликлональными антителами, соответственно, к крысиным (разведение 1:400) или кроличьим (разведение 1:200) IgG (Vector, США). Для выявления эндотелиальных клеток после депарафинирования срезов дополнительно проводили температурное демаскирование антигенов на водяной бане (97-99°С) в растворе Vector Antigen Unmasking Solution (Hi pH) (Vector, США) в течение 40 минут. На срезы наносили кроличьи поликлональные антитела к CD31 (Abeam, Великобритания) в разведении 1:50, далее срезы инкубировали с биотинилированными козьими поликлональными антителами к кроличьим IgG (Vector, США) в разведении 1:200.

У крыс выявляли гладкомышечный а-актин с помощью мышиных моноклональных антител против а-актина гладких мышц (DAKO, США) в разведении 1:100. В качестве вторых антител применяли биотинилированные

лошадиные поликлональные антитела к мышиным IgG (Vector, США) в разведении 1:1000.

Морфометрическое исследование заживления ран. Измерение и подсчет различных морфометрических параметров проводили на цифровых микрофотоснимках, полученных на микроскопе Leica DM 1000 с помощью камеры Leica DFC295 (Leica, Германия) при оптическом увеличении х400. Для анализа использовали 1 - 2 поперечных гистологических среза центральной области ран. Для каждого животного на препаратах между краями раневого дефекта подсчитывали суммарное количество клеточных форм и число нейтрофилов, приходящихся на общую площадь среза в 200 тыс. мкм2. Кроме того, у мышей в новообразованной соединительной ткани подсчитывали число макрофагов, а также объемную плотность сосудов. У крыс дополнительно подсчитывали число миофибробластов в грануляционной ткани на 5-е сут ранозаживления. Определение средней толщины грануляционной ткани и рубца проводили путем усреднения значений толщины новообразованной соединительной ткани, измеренных в 20-и равноудаленных точках, расположенных между краями ран. При этом две крайние точки, в которых проводили измерения, располагались на границах раневого дефекта. Для оценки степени эпителизации ран вычисляли отношение эпителизированной поверхности к общей поверхности раны в процентах. Для характеристики регенерирующего эпидермиса проводили оценку его средней толщины до рогового слоя в областях, расположенных рядом с границами раневого дефекта. Для этого усредняли значения толщины эпидермиса, измеренной в 5-и случайно выбранных точках каждого из двух краев раны.

Измерение уровня перекисного окисления липидов в печени мышей Fl(CBAxC57Bl/6) и C57BIKS-Lepr"7J проводили, оценивая количество малонового диальдегида (МДА) в гомогенатах данного органа стандартным колориметрическим методом на основе реакции МДА с тиобарбитуровой кислотой (Uchiyama М., Mihara М„ 1978). Концентрацию МДА нормализовали на количество белка в гомогенате, которое определяли по методу Брэдфорд (Bradford М.М., 1976). Р V V

Моделирование асептического воспаления проводили на аутбредных мышах CD1. У животных, находившихся под эфирным наркозом, в асептических условиях выщипывали шерсть в межлопаточной области спины, затем поверхность кожи обрабатывали 96% этиловым спиртом и хирургическими ножницами наносили полнослойный сагиттальный разрез кожи. Справа и слева от разреза кожу отделяли от подлежащей фасции и вводили под кожу стерильные круглые покровные стёкла (Fisher Scientific, Германия) диаметром 12 мм, толщиной 0.17 мм. Разрез зашивали стерильными шёлковыми нитями и наносили сверху медицинский клей БФ-6 (Муромский ПСЗ, Россия). Исследование динамики смены клеточного состава инфильтрата в очаге асептического воспаления. Стекла, извлеченные из подкожных карманов, помещали для фиксации в абсолютный метанол и окрашивали гематологическими красителями по Паппенгейму (Ромейс Б., 1953). Далее проводили микроскопический анализ клеточных форм на поверхности стекол с

помощью микроскопа ЛОМО (Россия). Для этого на произвольно выбранных удалённых от края стекла участках морфологически идентифицировали и подсчитывали количество нейтрофилов, макрофагов, фибробластов, лимфоцитов и гигантских клеток инородных тел (ГКИТ), приходящихся на 1000 клеток. Вычисляли численную долю каждой клеточной формы в очаге воспаления в процентах.

Статистическая обработка результатов проведена с помощью программ STATISTICA 7.0 и Microsoft Excel. Для оценки статистической значимости отличий применяли двусторонний непараметрический критерий Манна-Уитни. Статистически значимыми считали различия при р < 0,05. На таблицах и графиках данные представлены в виде среднего арифметического значения ± стандартная ошибка среднего.

Результаты исследования и их обсуждение

Влияние длительного пероралыюго приема SkQl на репаративные процессы в кожных ранах у старых мышей. В данном эксперименте исследовали эффекты длительного (8 мес) системного воздействия SkQl на репаративные процессы в полнослойных кожных ранах у 24-месячных мышей гибридов Fl(CBAxC57Bl/6). В ходе предоперационного введения SkQl не было обнаружено влияния на динамику изменения массы тела, а также на возрастные изменения эстрального цикла животных. Измерение относительной площади раневой поверхности выявило значительное замедление сокращения площади ран на ранних этапах заживления (1-5 сут) у старых животных контрольной группы по сравнению с молодыми (рис. 1). Результат вполне согласуется с литературными данными для старых крыс и мышей (Bailas C.B., Davidson J.M., 2001; Keylock К.Т. et al., 2008) и, вероятно, объясняется замедлением контракции ран вследствие пролонгирования воспалительной стадии и задержки формирования грануляционной ткани. В то же время динамика сокращения площади ран у старых мышей, получавших SkQl, была практически идентична динамике, наблюдавшейся у молодых животных (рис.

Гистологическое исследование поперечных срезов центральной области ран на 7-е сут заживления показало, что область раневого дефекта у животных всех экспериментальных групп была частично или полностью эпителизирована. У старых мышей контрольной группы очаги формирования грануляций были расположены только по краям ран - на границе с интактной кожей. Здесь наряду с фибробластами располагались многочисленные клетки воспалительного инфильтрата, а также нерегулярно ориентированные тонкие коллагеновые волокна. Центральная область дна раны была представлена жировой тканью, инфильтрированной лейкоцитами, изредка встречались тонкие прослойки незрелой соединительной ткани (рис. 2А, Г, Ж).

Площадь раны, % э ё £ 2 § 8 8 I - — Молодые т у — — Старые —Г -о-Старые, БкСИ 100 нмоль/кг в сут К 1 \ V* * 1\г V-* г» V к *Ч

1 2 3 4 5 в 7 в 9 10 11 12 13 14 Время, сут

Рис. 1. Изменение относительной площади раневой поверхности у старых (возраст 24 мес) животных опытной и контрольной групп, а также у молодых (возраст 6 мес) животных. Значения, отмеченные звездочкой, достоверно (р<0,05) отличаются от значений группы, состоявшей из старых животных, не получавших ЭкСН.

Рис. 2. Поперечные гистологические срезы центральной области ран старых (возраст 24 мес) животных опытной (Б, Д, 3, Л, П) и контрольной (А, Г, Ж, К, О) групп, а также у молодых (возраст 6 мес) животных (В, Е, И, М, Р) на 7-е (А - И) и 13-е (К - Р) сут заживления. Область раневого дефекта на малом увеличении микроскопа (А - В). Участок новообразованной соединительной ткани в краевой зоне раневого дефекта (Г - Р). Окраска гематоксилин-эозином (А - Е, К - М) и по Маллори (Ж - И, О - Р).

В опытной группе старых мышей, получавших вкСН, в отличие от контрольных старых, характер течения репаративных процессов в целом соответствовал таковому у молодых животных. Обильно васкуляризованная грануляционная ткань заполняла практически всю область раневого дефекта, в ней располагались более зрелые и регулярно ориентированные коллагеновые волокна, реже встречались очаги лейкоцитарной инфильтрации (рис. 2Б, Д, 3). Как у молодых, так и у старых мышей, получавших БкСН, в составе грануляционной ткани иммуногистохимически было выявлено большое число клеток, экспрессировавших гладкомышечный а-актин, которые были

представлены миофибробластами и гладкомышечными клетками медии сосудов. У старых контрольных мышей были обнаружены лишь небольшие скопления таких клеток по краям раны на границе с неповрежденной кожей. Табл. 1. Морфометрические показатели репаративных процессов в области ран на 7-е сут

заживления.

Исследуемый параметр Группы животных Достоверность различий

Старые Молодые

Контрольные Опытные

1 2 3

Средняя толщина грануляционной ткани, мкм 120,3 ± 17,6 401,7 ±72,4* 417,9 ± 73,0* р,.2 = 0,0087 р 1.3 » 0,0043 р2.з»0,8413

Число клеток в грануляционной тканина 1000 мкмг площади среза 5,73 ±0,31 4,61 ±0,34 5,09 ± 2,50 р,.2= 0,1255 р,.3 = 0,1775 р2., = 0,5476

Число нейтрофилов в грануляционной ткани на 1000 мкм2 площади среза 1,21 ±0,18 0,36 ±0,09* 0,22 ± 0,03* р,.2= 0,0087 р,.з= 0,0433 р2.з = 0,2222

Число макрофагов в грануляционной ткани на 1000 мкмг площади среза 0,15 ±0,03 0,26 ± 0,06 0,66 ±0,05* р,.2= 0,3290 р,.з= 0,0043 р2.,= 0,0079

Объемная плотность сосудов в грануляционной ткани, % 2,79 ±0,30 6,97 ±0,80* 7,90 ±0,88* р,.2= 0,0043 р,.з = 0,0043 р2.з = 0,6905

Степень эпителизации раны, % 51,70 ± 12,01 97,20 ± 2,79* 84,59 ± 11,27 р,.2= 0,0043 р,.з = 0,0520 р2.з = 0,3095

Средняя толщина регенерирующего эпителия в краевых областях раны, мкм 86,4 ± 10,6 91,7±7,7 85,7 ± 11,3 р,.2= 0,2468 р,.з= 0,7922 р„ = 0,8413

*- р < 0,05 по сравнению с группой, состоящей из старых животных, не получавших 5кС> 1.

На 13-е сут после нанесения ран у животных всех экспериментальных групп область повреждения представляла собой полностью эпителизированный соединительнотканный рубец (рис. 2К - Р).

Морфометрическое исследование показало, что 8-месячное системное воздействие антиоксиданта БкС.) 1 оказывает статистически значимый эффект на целый ряд параметров, характеризующих репаративные процессы в полнослойных кожных ранах (табл. 1, 2). Установлено, что БкСП увеличивает среднюю толщину грануляционной ткани (7-е сут), снижает нейтрофильную инфильтрацию (7-е, 13-е сут), увеличивает объемную плотность сосудов в грануляциях (7-е сут), увеличивает степень эпителизации ран (7 сут), снижает «клеточность» рубца (13-е сут). При этом значение большинства исследованных параметров было сопоставимо с таковым у молодых животных.

В целом, полученные данные свидетельствуют об эффективной коррекции репаративных процессов в модели заживления полнослойных

кожных ран у старых мышей после длительного перорального приёма БкСН (100 нмоль/кг массы тела в сут).

Табл. 2. Морфометрические показатели репаративных процессов в области ран на 13-е сут заживления.

Исследуемый параметр Группы животных Достоверность различий

Старые Молодые

Контрольные Опытные

1 2 3

Средняя толщина рубца, мкм 294,3 ± 28,4 268,2 ±38,9 357,5 ±25,8 р,.2= 0,6623 рм-0,0931 р2.з= 0,1255

Число клеток в рубце на 1000 мкм2 площади среза 3,95 ± 0,24 3,07 ±0,06* 2,49 ±0,13* р,.2= 0,0043 р,.з = 0,0022 р2.з-0,0043

Число нейтрофилов в рубце на 1000 мкм2 площади среза 0,33 ± 0,06 0,18 ±0,02* 0,10±0,01* Ры= 0,0303 р |.э =0,0022 р2-з = 0,0173

Число макрофагов в рубце на 1000 мкм2 площади среза 0,63 ±0,10 0,28 ± 0,07* 0,33 ± 0,04* р,.2= 0,0173 р,.з = 0,0087 Р2.з = 0,1143

Объемная плотность сосудов в рубце, % 2,11 ±0,12 1,49 ±0,34 2,59 ± 0,22 Риг" 0,1143 Р1.з = 0,4110 Р2-з= 0,3811

Степень эпителизации раны, % 100,00 ±0,00 100,00 ±0,00 100,00 ±0,00 Р|.:= 1,0000 р,.,- 1,0000 р2.з= 1,0000

Средняя толщина регенерирующего эпителия в краевых областях раны, мкм 38,0 ±3,8 47,4 ± 11,6 56,5 ± 4,7* р 1^2 = 1,0000 р,-3=0,0152 р2.з= 0,3290

*- р < 0,05 по сравнению с группой, состоящей из старых животных, не получавших БкС?!

Влияние длительного перорального приема Бк(21 на процесс заживления ран на модели сахарного диабета II типа у мышей. В данной части работы исследовали влияние длительного приема митохондриально-направленного антиоксиданта 8к(}1 на процесс репаративной регенерации кожи при сахарном диабете II типа у мутантных мышей С57В1К8-ЬерЛ/1

Измерения массы тела, уровня глюкозы и гликозилированного гемоглобина в крови, проведённые в процессе предоперационного введения БкСМ, не выявили достоверного влияния антиоксиданта на развитие ожирения и гипергликемии у гомозиготных животных. Проведенный с помощью цифровой фотопланиметрии анализ процесса заживления ран выявил статистически значимое увеличение относительной площади раневой поверхности у контрольных гомозигот по сравнению с гетерозиготами на всех исследованных сроках после нанесения раны. В то же время приём митохондриально-направленного антиоксиданта вкСН вызывал у гомозигот опытной группы достоверное сокращение площади ран на 6-е и 7-е сутки регенерации, в среднем в 1,6 и 2,9 раза, соответственно (рис. 4)

Рис. 3. Изменение относительной площади раневой поверхности у гомозиготных (<1ЬМЬ) животных опытной и контрольной групп, а также у гетерозигот (<#>/+). Значения, отмеченные звездочкой, достоверно (р<0,05) отличаются от значений группы, состоящей из гомозиготных (с№/£Й>) животных, не получавших БкС}!

Рис. 4. Поперечные гистологические срезы центральной области ран гомозиготных (¿¿/с/6) животных опытной (Б, Д, 3, Л) и контрольной (А, Г, Ж, К) групп, а также гетерозигот (с1Ь/+) (В, Е, И, М) на 7-е сут заживления. Область раневого дефекта на малом увеличении микроскопа (А - В). Участок новообразованной соединительной ткани в краевой зоне раневого дефекта (Г - М). Окраска гематоксилин-эозином (А - Е) и по Маллори (Ж - И). Иммуногистохимическое выявление а-актина гладких мышц (К - М). Визуализация при помощи АВС-пероксидазы (коричневое окрашивание), ядра окрашены гематоксилином.

Морфологическое исследование поперечных гистологических срезов центральной области ран на 7-е сут заживления показало, что во всех экспериментальных группах раневая поверхность была эпителизирована более чем наполовину. У гомозиготных контрольных животных зона новообразования грануляционной ткани преимущественно ограничивалась краевыми участками раневого дефекта. Центральная область повреждения при этом была заполнена жировой тканью, строма которой содержала множество клеток лейкоцитарного инфильтрата. В очагах образования грануляционной ткани наряду с фибробластами и моноцитами/макрофагами в большом количестве присутствовали нейтрофилы. При этом в составе внеклеточного матрикса практически не наблюдалось толстых и регулярно ориентированных

пучков коллагеновых фибрилл. Клетки, экспрессирующие гладкомышечный а-актин, выявлялись в небольшом количестве, главным образом в составе стенок микрососудов (рис. 4А, Г, Ж, К).

Репаративные процессы в полнослойных кожных ранах в группе гомозиготных мышей, принимавших 8кС>1, характеризовались формированием в зоне повреждения тонкого слоя грануляционной ткани, покрывающей на срезе всю раневую поверхность. Лейкоцитарная инфильтрация новообразованной соединительной ткани была менее выражена по сравнению с контрольными гомозиготными особями. В грануляционной ткани наблюдали множество микрососудов и фибробластов. Так же как и у гетерозиготных мышей в большом количестве выявлялись фибробласты и клетки медии сосудов, экспрессирующие гладкомышечный а-актин (рис. 4Б, Д, 3, Л).

У гетерозиготных мышей вся зона полнослойной кожной раны была заполнена грануляционной тканью. При этом толщина новообразованной соединительной ткани в основном превышала толщину интактной дермы, ограничивающей зону раневого дефекта. В составе грануляционной ткани наблюдали большое число фибробластов, микрососудов, а также упорядоченно ориентированных пучков волокон коллагена. В большом количестве выявлялись фибробласты и клетки медии сосудов, экспрессирующие а-актин гладких мышц (рис. 4В, Е, И, М).

Морфометрическое исследование показало, что употребление вкСМ гомозиготными мышами С57В1К8-Ьерг'1ь/Л вызывало в ранах статистически значимое увеличение средней толщины грануляционной ткани и объемной плотности сосудов, снижение нейтрофильной и увеличение макрофагальной инфильтрации, увеличение степени эпителизации (7 сут) (табл. 3). Средние значения численности нейтрофилов и объемной плотности сосудов в новообразованной соединительной ткани были на уровне показателей, характерных для гетерозиготных животных, а среднее значение степени эпителизации раневой поверхности на 7-е сут заживления превышало таковое у здоровых мышей. Полученные результаты свидетельствуют о частичном восстановлении нарушений репаративной регенерации кожи в модели сахарного диабета II типа при длительном пероральном введении митохондриально-направленного антиоксиданта БкС)! (250 нмоль/кг массы тела в сут). Данные эффекты 8кС>1 наблюдались на фоне практически 3-х кратного снижения уровня перекисного окисления липидов в печени (рис. 5).

Рис. 5. Уровень малонового диальдегида (МДА) в печени гомозиготных (¿й>/У6) животных опытной и контрольной групп, а также у гетерозигот (<#>/+) на 7-е сут заживления ран. Значения, отмеченные звездочкой, достоверно (р<0,05) отличаются от значений группы, состоящей из гомозиготных (М/М) животных, не получавших ЭкС}!.

а Гомозигот» (дал) О Гомозиготы («ЙЯ». Бк(21 250 "I ¡Я Гетвртиго'ы

Табл. 3. Морфометрические показатели репаративных процессов в области ран на 7-е заживления.

Исследуемый параметр

Средняя толщина грануляционной ткани, мкм

Число клеток в грануляционной ткани на 1 ООО мкм' площади среза

Число нейтрофилое в грануляционной ткани на 1000 мкм" площади среза

Число макрофагов в грануляционной ткани на 1 ООО мкм" площади среза

Объемная плотность сосудов в грануляционной ткани, %

Степень эпителизации раны, %

Группы животных

Гомозиготы (¿Ь/(1Ь)

Контрольные

I

57,9 ± 29,5

5,87 ± 0,40

1,13 ± 0,15

0,16 ±0,04

3,12 ±0,38

Средняя толщина регенерирующего эпителия в краевых областях раны, мкм

66,55 ± 10,58

87,89 ±3,96

Опьгп

165,8 ±19,5*

5,54 ±0,41

0,35 ± 0,08*

0,26 ±0,05*

8,50 ±3,45*

94,48 ± 3,89*

79,58 ±6,19

Гетерозиготы

513,9 ±67,1*

Достоверность различий

6,33 ±0,19

0,29 ± 0,04*

0,56 ±0,15*

р,_2 = 0,0007 Рм = 0,0061 Рз.з = 0,0028

р,.2 = 0,7577 Ри= 0,5303 р2.3= 0,1898

Рп2= 0,0004 р,.з = 0,0025 Рз-з= 1,0000

7,47 ± 1,48*

66,74 ± 14,76

74,83 ± 4,99

р,.2= 0,0418 р,_з= 0,0177 р2.з = 0,0829

Р1_2= 0,0021 Ри-0,0303 Р;.з = 0,4376

р,.2= 0,0007 Ри = 0,4221 Р;-з = 0,0755

Ри" 0,4698 Ри= 0,0727 Р2-з= 0,3301

р < 0,05 по сравнению с группой, состоящей из гомозиготных (ЛЬ/ЛЬ) животных не получавших ЭкСМ.

Влияние перорального введения 8к01 на динамику изменения клеточного состава инфильтрата в различных фазах асептического воспаления у мышей. Для изучения воздействия БкС^ на динамику клеточных реакций при воспалении мы использовали модель асептического воспаления, вызванного введением инородного тела. Результаты подсчета различных клеточных форм на стеклах показали, что у животных опытной группы происходило статистически достоверное (более чем в 2 раза) снижение доли нейтрофилов по сравнению с животными контрольной группы через 12 часов после индукции воспаления (рис. 6А). В то же время происходило достоверное увеличение относительного числа макрофагов (в среднем на 25,9 %), которые преобладали в очаге воспаления у опытных мышей через 12 часов после операций (рис. 6Б). В дальнейшем количество нейтрофилов у опытных мышей находилось на невысоком уровне (2,2 - 7,4 %) и достоверно не отличалось от контроля. На 2 - 10-е сут не было обнаружено статистически значимых различий между опытными и контрольными животными по количеству макрофагов. Однако на 14-е сут наблюдалось достоверное уменьшение доли макрофагов в опытной группе по сравнению с контрольной (в среднем на 22 %). Подсчет

относительного числа фибробластов в очаге воспаления у животных опытной группы показал его небольшое достоверное увеличение на 5-е и 7-е сут (в среднем, соответственно, на 4,1% и 6%), а также значительное достоверное увеличение (более чем в 2 раза) на 14-е сут после проведения операций (рис. 6В). В свою очередь анализ динамики изменения доли ГКИТ и лимфоцитов не выявил каких-либо достоверных отличий между опытными и контрольными животными.

60 Е) Кон г рола

ПвкСМ. 30 «мо ь/ет в сут

и ьо

я 40

! ! И ¡1 30 20 •ь

2 5 10 ф}

т ' А-ь 9*1 а., ягЬ @1ь! ; | ^

0.6 2 3 з 7 10 14

Время, сут

II

@Контроль £$к01,30 нмоль'Ъг в сут

В

*»*

I?50 '•I' И

II»-

0 нмаль/кг в сут

Рис. 6. Изменение относительного числа нейтрофилов (А), макрофагов (Б) и фибробластов (В) в очаге асептического воспаления у животных опытной и контрольной групп. Значения, отмеченные звездочкой, достоверно (р<0,05) отличаются от значений контрольной группы.

Полученные данные свидетельствуют о сокращении длительности нейтрофильной и ускорении начала пролиферативной фазы асептического воспаления при 3-х - 5-и недельном введении 8к<31 с питьевой водой (30 нмоль/кг массы тела в сут) аутбредным мышам СО 1.

Эффект локального введения 8к(}1 на репаративные процессы в полнослойных кожных ранах у крыс. Для изучения локального действия 8к(}1 на репаративные процессы в полнослойных кожных ранах у молодых животных мы использовали метод интрадермапьного введения (Кароог М, е1 а1., 2004; Яоу е1 а1., 2006; Луцевич О.Э. и др., 2008).

Анализ динамики изменения относительной площади раневой поверхности показал, что на 5 сут после нанесения ран происходило статистически достоверное уменьшение значения данного параметра (в среднем на 19%) у крыс, которым вводили 8к<31, по сравнению с контролем (рис. 7А). Морфологическое исследование выявило, что в обеих экспериментальных группах последовательно наблюдались воспалительная стадия заживления (7 час - 2 сут), образование грануляционной ткани (5 сут), формирование соединительнотканного рубца (14 сут).

А

Б

& Контроль □ 5кО1,200 им

Грануляционная тк

Рис. 7. Изменение относительной площади раневой поверхности (А), нейтрофильной инфильтрации зоны раневого дефекта (Б), а также средние показатели толщины грануляционной ткани и рубца в зоне раневого дефекта (В) у животных опытной и контрольной групп. Значения, отмеченные звездочкой, достоверно (р<0,05) отличается от значений контрольной группы.

Морфометрический анализ показал, что на раннем этапе воспалительной стадии заживления (7сут) происходило более чем двукратное статистически достоверное снижение числа нейтрофилов в опытной группе животных по сравнению с контрольной (рис. 7Б).

Измерение средней толщины грануляционной ткани (5 сут) показало, что у крыс, которым вводили 8кС>1, средняя толщина грануляций достоверно увеличивалась более чем в 1,5 раза по сравнению с контролем (рис. 7В). Кроме того, структура грануляционной ткани у крыс позволила морфологически и иммуногистохимически идентифицировать в её составе отдельные фибробласты, экспрессирующие гладкомышечный а-актин (миофибробласты), и провести анализ их количества в новообразованной соединительной ткани на 5-е сут заживления. Было выявлено более чем трехкратное достоверное увеличение числа миофибробластов в грануляционной ткани под воздействием БкС^ (рис. 8).

Полученные в данной части исследования данные указывают на то, что локальное введение БкС^! в виде однократных ежедневных интрадермальных инъекций вокруг полнослойной кожной раны (50 мкл 200 нМ р-ра), начиная с момента ее нанесения, вызывает у белых беспородных крыс (возраст 3 мес) снижение нейтрофильной инфильтрации раны на раннем этапе воспалительного процесса, а также ускоряет новообразование грануляционной ткани.

0.3

1

I 0Л5

Ii"

I jots

Е) Контроль *

О SkQ1, 200 нМ

Т ■

Рис. 8. Показатели численности миофибробластов в грануляционной ткани ран у животных опытной и контрольной групп на 5-е сут заживления (А). Значение, отмеченное звездочкой, достоверно (р<0,05) отличается от значения контрольной группы. Участок новообразованной соединительной ткани в краевой зоне раневого дефекта на поперечных гистологических срезах центральной области ран животных опытной (Б) и контрольной (В) групп на 5-е сут заживления. Иммуногистохимическое выявление а-актина гладких мышц. Визуализация при помощи АВС-пероксидазы (коричневое окрашивание), ядра окрашены гематоксилином.

Заключение. Результаты настоящего исследования, полученные при использовании различных экспериментальных моделей на животных, свидетельствуют о том, что митохондриально-направленный антиоксидант SkQl оказывает воздействие на процессы репаративной регенерации кожи. Длительное системное введение SkQl препятствует развитию нарушений заживления кожных ран у стареющих и диабетических (db/dV) мышей. Во всех исследованных моделях репаративной регенерации кожи и асептического воспаления применение SkQl понижало нейтрофильную инфильтарцию зоны повреждения. При заживлении полнослойньтх кожных ран SkQl ускорял формирование грануляционной ткани независимо от схемы введения.

Данные различных работ, представленных в научной литературе, показывают, что гиперпродукция митохондриальных АФК вызывает целый ряд процессов, которые могут напрямую способствовать замедлению репаративной регенерации кожи, а также развитию нарушений заживления ран при старении и ряде заболеваний. Выявлено, что повышение образования АФК митохондриями приводит к усилению экспрессии молекул адгезии на эндотелии и секреции провоспалительных цитокинов (Mukherjee Т.К. et al., 2007; Lowes D.A. et al., 2008), повышению образования матрикс-деградирующих ферментов (Wenk J. et al., 1999; Fisher G.J. et al., 2009), препятствует миофибробластной дифференцировке (Popova E.N. et al., 2010), играет важную роль в снижении числа циркулирующих в крови эндотелиальных клеток-предшественников и нарушении их способности к новообразованию сосудов (Marrotte E.J. et al., 2010). Вполне вероятно, что действие SkQl на данные процессы определяет его эффекты на воспаление и репаративную регенерацию кожи, наблюдаемые в настоящей работе. Также, ранее было показано, что SkQl при длительном пероральном введении стимулирует увеличение числа ранних стромальных предшественников in vivo у мышей (Shipounova I.N. et al., 2010). Кроме того, в опытах in vitro SkQl вызывал ускорение миграции крысиных эпителиоцитов линии IAR2 в область повреждения монослоя (Демьяненко И.А. и др., 2010). Возможно, что

коррекция нарушений заживления ран при длительном введении Бк(21 старым и диабетическим мышам может бьггь отчасти обусловлена воздействием антиоксиданта на процессы дифференцировки мезенхимных стромальных клеток, а также на процессы миграции эпителиальных клеток в область раны при восстановлении поврежденного эпителия. Результаты, полученные в данной диссертационной работе, свидетельствуют о необходимости дальнейших исследований возможных механизмов действия митохондриально-направленных антиоксидантов на процессы регенерации.

ВЫВОДЫ

1. Митохондриально-направленный антиоксидант 5к(}1 (100 нмоль/кг массы тела в сут) при длительном (8 мес) введении с питьевой водой вызывает эффективную коррекцию возрастных нарушений репаративных процессов кожи у старых (возраст 24 мес) мышей Р1(СВАхС57В1/6).

2. Однократное ежедневное введение БкС}1 рег оэ (250 нмоль/кг массы тела в сут) на протяжении 12-и недель приводит к частичному восстановлению нарушений репаративной регенерации кожи у мутантных мышей с признаками сахарного диабета II типа С57В1К5-ЬерЛ1 {йЪ/йЩ.

3. При введении 8к(31 с питьевой водой (30 нмоль/кг массы тела в сут) в течение 3-5 недель аутбредным мышам СБ1 (возраст 2 мес) происходит сокращение длительности нейтрофильной и ускорение начала пролиферативной фазы асептического воспаления.

4. Локальное введение Бкр1 в виде однократных ежедневных интрадермальных инъекций вокруг полнослойной кожной раны (50 мкл 200 нМ раствора), начиная с момента её нанесения, вызывает у белых беспородных крыс (возраст 3 мес) снижение нейтрофильной инфильтрации раны на раннем этапе воспалительного процесса, а также ускоряет образование грануляционной ткани.

5. Во всех исследованных моделях репаративной регенерации кожи и асептического воспаления применение Бкр1 снижало нейтрофильную инфильтарцию зоны повреждения. Данный эффект был зарегистрирован на ранних этапах воспалительного процесса в моделях асептического воспаления у мышей и заживления полнослойной кожной раны у крыс, а также на стадии образования соединительной ткани при нарушении заживления ран у старых и диабетических мышей.

6. В исследованных моделях заживления полнослойных кожных ран, независимо от схемы введения, 5к(31 ускорял процесс формирования грануляционной ткани в зоне повреждения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах, соответствующих перечню ВАК РФ

1. Демьяненко И.А., Васильева Т.В., Домнина Л.В., Дугина В.Б., Егоров М.В., Иванова О.Ю., Ильинская О.П., Плетюшкина О.Ю., Попова E.H., Сахаров И.Ю., Федоров А.В.,Черняк Б.В. Новые митохондриально-направленные антиоксиданты на основе «ионов Скулачёва» ускоряют заживление кожных ран у животных // Биохимия. 2010. Т. 75. №3. С. 337-345.

2. Демьяненко И.А., Васильева Т.В., Галкин И.И., Егоров М.В., Ильинская О.П., Манских В.Н., Попова E.H., Федоров A.B. Новый митохондриально-направленный антиоксидант ускоряет репаративные процессы в полнослоинои кожной ране у мышеи C57BLKS-Lepr'"VJ с генетически обусловленными нарушениями углеводного и липидного обмена // Морфологические ведомости. 2011. №. 4. С. 23-30.

3. Демьяненко И.А., Васильева Т.В., Галкин И.И., Егоров М.В., Ильинская О.П., Манских В.Н., Федоров A.B., Макарова О.В. Исследование репаративных процессов при заживлении полнослойных кожных ран у старых мышей на фоне длительного приёма Ю-(б'-пластохинонил) децилтрифенилфосфония // Морфологические ведомости. 2012. №2. С. 2433.

Тезисы докладов и материалов конференций

4. Демьяненко И.А., Федоров A.B. Воздействие митохондриально-направленного антиоксиданта SkQl на процесс заживления кожных ран. Тезисы докладов XVII международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов — 2010». Секция «биология». Москва: Макс Пресс. 2010. С. 298-299.

5. Демьяненко И.А., Васильева Т.В., Фёдоров A.B., Егоров М.В., Ильинская О.П. Митохондриально-направленный антиоксидант SkQl ускоряет заживление ран у старых мышей. Сборник научных трудов VIII Всероссийской конференции по патологии клетки. Москва: МДВ. 2010. С 90-91.

6. Демьяненко И.А. Изучение воздействия митохондриально-направленного антиоксиданта SkQl на процесс заживления ран у старых и диабетических мышей. Тезисы докладов XVIII международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов — 2011». Секция «биология». Москва: Макс Пресс. 2011. С. 281-282.

7. Демьяненко И.А. Изучение воздействия длительного приёма Митохондриально-направленного антиоксиданта SkQl на репаративные процессы в кожных ранах у диабетических мышей C57B1KS/J, db/db. Фундаментальные и прикладные исследования в биологии: Материалы II Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых. Донецк: «Ноулидж», 2011, стр. 83.

8. Демьяненко И.А., Васильева Т.В., Федоров A.B., Попова E.H., Галкин И.И., Ильинская О.П. Новые митохондриально-направленные антиоксиданты на основе «ионов Скулачева» ускоряют заживление кожных ран у животных. Сборник материалов 7-ой национальной научно-практической конференции с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека». Смоленск: «Смоленская городская типография». 2011. С. 81-82.

9. Демьяненко И.А. Воздействие длительного приёма митохондриально-направленного антиоксиданта SkQl на процесс заживления полнослойных кожных ран у диабетических мышей C57BlKS-ie/jr äbU. Сборник научных трудов Всероссийской конференции «Регенеративная биология и медицина». Москва: Издательский дом «Нарконет». 2011. С 59-60.

10. Демьяненко И.А. Исследование влияния длительного воздействия митохондриально-направленного производного пластохинона на репаративные процессы в полнослойных кожных ранах у старых мышей. Шевченивська весна 2012: бюлопчш науки. Матершш X м1жнародноУ науково! конференцп студенев та молодих науковщв. Кшв: Наукове видання. 2012. С. 95-96.

П.Демьяненко И.А. Исследование воздействия длительного приёма митохондриально-направленного производного пластохинона на репаративные процессы в полнослойной кожной ране у старых мышей Fl(CBAxC57Bl/6). Тезисы докладов XIX международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2012». Секция «биология». Москва: Макс Пресс. 2012. С 140.

12. Демьяненко И.А., Васильева Т.В., Федоров A.B., Егоров М.В., Ильинская О.П., Макарова О.В. Исследование репаративных процессов в полнослойных кожных ранах у старых мышей на фоне длительного приёма 10-(6'-пластохинонил) децилтрифенилфосфония. Сборник научных трудов научной конференции «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии». Москва: издательство «4Мпресс». 2012. С. 56-60.

Соискатель

И.А. Демьяненко

Подписано в печать 11.10.2012 Формат 60x88 1/16. Объем 1.0 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 1252 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. А-102

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Демьяненко, Илья Александрович

Список сокращений.

Введение.

Глава I. Обзор литературы.

1. Репаративная регенерация кожи.

1.1. Заживление кожных ран.

1.1.1. Стадия воспаления.

1.1.2. Стадия новообразования соединительной ткани.

1.1.3. Стадия ремоделирования новообразованной соединительной ткани

1.2. Заживление ран при внутриутробном развитии млекопитающих.

1.3. Раневое заживление при физиологическом старении организма. Заживление ран как показатель биологического возраста.

1.4. Патологическое заживление ран.

1.4.1. Хронические раны. Заживление при сахарном диабете.

1.4.2. Гипертрофические и келоидные рубцы.

2. Активные формы кислорода и азота.

2.1. Активные формы кислорода.

2.2. Активные формы азота.

2.3. Повреждающее действие активных форм кислорода и азота. Оксидативный и нитрозо гивный стрессы.

2.4. Роль активных форм кислорода в процессах внутриклеточной передачи сигналов.

3. Антиоксид анты.

4. Митохондриально-направленные антиоксиданты.

5. Роль активных форм кислорода в регуляции репаративной регенерации кожи и развитии длительно незаживающих ран. Применение антиоксидантов для коррекции нарушений репаративных процессов.

Глава II. Материалы и методы.

Глава III. Результаты исследования.

1. Влияние длительного перорального приема ЭкСП на репаративные процессы в кожных ранах у старых мышей.

2. Влияние длительного перорального приема 8к(^1 на процесс заживления ран на модели сахарного диабета II типа у мышей.

3. Влияние перорального введения 8кС)1 на динамику изменения клеточного состава инфильтрата в различных фазах асептического воспаления у мышей

4. Эффект локального введения 8кС>1 на репаративные процессы в полнослойных кожных ранах у крыс.

Глава IV. Обсуждение результатов.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Морфологическая характеристика репаративных процессов в коже при действии митохондриально-направленного антиоксиданта SkQ1"

Снижение репаративных возможностей тканей с возрастом является одним из характерных проявлений старения организма у большинства млекопитающих, включая человека (Yanai Н. et. al., 2011). Кроме того, некоторые возрастные заболевания, в частности сахарный диабет II типа, способствуют значительному замедлению регенеративных процессов и могут сопровождаться развитием длительно незаживающих ран (Menke N. et al., 2007). Механизмы развития подобных нарушений репаративной регенерации к настоящему времени остаются до конца не исследованными. Однако, считается, что они обусловлены целым рядом патофизиологических процессов, затрагивающих как локальную, так и системную регуляцию ранозаживления (Guo S., DiPietro L.A., 2010). Согласно современным литературным данным, активные формы кислорода (АФК) являются одним из важных элементов регуляции репаративных процессов в коже, оказывая воздействие на внутриклеточные пути передачи сигналов в различных типах клеток, участвующих в заживлении ран (Soneja A. et al., 2005; Sen С. К., Roy S., 2008; Schafer M., Werner S., 2008). При этом хроническое течение раневого заживления при старении и сахарном диабете сопровождается развитием окислительного стресса в зоне повреждения (Rasik A.M., Shukla А., 2000; James T.J. et al., 2003; Yeoh-Ellerton S., Stacey M.C., 2003). Кроме того, в различных экспериментальных и некоторых клинических исследованиях было показано, что как локальное, так и системное воздействие антиоксидантов, может стимулировать заживление кожных ран (Fitzmaurice et al., 2011). Таким образом, литературные данные указывают на то, что повышенное образование АФК способствует замедлению репаративных процессов.

Гиперпродукцию АФК рассматривают как один из механизмов развития многих признаков физиологического старения, а также возрастных патологий. При этом ключевую роль отводят АФК, которые образуются в электронтранспортной цепи митохондрий (Harman D., 1956; Papa S., Skulachev V.P., 1997; Droge W., 2002). Для изучения селективной роли митохондриальных АФК в различных биологических процессах применяют митохондриально-направленные антиоксиданты, состоящие из молекулы антиоксиданта, присоединенной к липофилыюму катиону (Burns R.J. et al., 1995; Антоненко Ю.Н. и др., 2008). Химическая структура подобных соединений позволяет им избирательно накапливаться в энергизованных митохондриях клеток и действовать в чрезвычайно низких концентрациях. Одним из наиболее перспективных б митохондриально-направленных антиоксидантов для использования в экспериментах, проводимых на животных, является Ю-(б'-пластохинонил) децилтрифенилфосфония -SkQl. Это обусловлено наличием широкого диапазона доз, в которых он проявляет антиоксидантное действие, а также его относительной химической стабильностью. Проведенные ранее исследования показали, что SkQl при длительном введении замедляет развитие целого ряда признаков старения у млекопитающих (мыши, крысы). Кроме того, данный антиоксидант оказывает защитное действие в различных моделях возрастных патологий (Skulachev M.V. et al., 2011). Однако изучение влияния SkQl на возрастное замедление репаративных процессов при заживлении кожных ран ранее не проводилось. В настоящее время роль АФК митохондриального происхождения в развитии возрастных и патологических нарушений репаративной регенерации кожи остается мало изученной. Кроме того, в литературе отсутствуют работы, посвященные изучению влияния митохондриально-направленных антиоксидантов на процессы заживления ран in vivo, что обуславливает актуальность исследований в данной области.

Цель и задачи работы

Целыо настоящей диссертационной работы явилось исследование влияния митохондриально-направленного антиоксиданта SkQl на репаративные процессы в коже на экспериментальных моделях физиологического и патологического заживления ран у животных.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать влияние длительного пероралыюго введения SkQl на репаративные процессы в полнослойных кожных ранах у старых мышей.

2. Изучить эффект длительного перорального введения SkQl на репаративные процессы в полнослойных кожных ранах на модели сахарного диабета II типа у мышей.

3. Охарактеризовать влияние перорального введения SkQl на динамику изменения клеточного состава инфильтрата в различных фазах асептического воспаления у мышей.

4. Исследовать эффект локального интрадермального введения SkQ 1 на репаративные процессы в полнослойных кожных ранах у крыс.

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Демьяненко, Илья Александрович

выводы

1. Митохондриально-направленный антиоксидант SkQl (100 нмоль/кг массы тела в сут) при длительном (8 мес) введении с питьевой водой вызывает эффективную коррекцию возрастных нарушений репаративных процессов кожи у старых (возраст 24 мес) мышей Fl(CBAxC57Bl/6).

2. Однократное ежедневное введение SkQl per os (250 нмоль/кг массы тела в сут) на протяжении 12-и недель приводит к частичному восстановлению нарушений репаративной регенерации кожи у мутантных мышей с признаками сахарного диабета II типа C57BlKS-LepAi (db/db).

3. При введении SkQl с питьевой водой (30 нмоль/кг массы тела в сут) в течение 3-5 недель аутбредным мышам CD1 (возраст 2 мес) происходит сокращение длительности нейтрофильной и ускорение начала пролиферативной фазы асептического воспаления.

4. Локальное введение SkQl в виде однократных ежедневных интрадермальных инъекций вокруг полнослойной кожной раны (50 мкл 200 нМ раствора), начиная с момента её нанесения, вызывает у белых беспородных крыс (возраст 3 мес) снижение нейтрофильной инфильтрации раны на раннем этапе воспалительного процесса, а также ускоряет образование грануляционной ткани.

5. Во всех исследованных моделях репаративной регенерации кожи и асептического воспаления применение SkQl снижало нейтрофильную инфильтарцию зоны повреждения. Данный эффект был зарегистрирован на ранних этапах воспалительного процесса в моделях асептического воспаления у мышей и заживления полнослойной кожной раны у крыс, а также на стадии образования соединительной ткани при нарушении заживления ран у старых и диабетических мышей.

6. В исследованных моделях заживления полнослойных кожных ран, независимо от схемы введения, SkQl ускорял процесс формирования грануляционной ткани в зоне повреждения.

Заключение

Результаты настоящего исследования, полученные при использовании различных экспериментальных моделей на животных, свидетельствуют о том, что митохондриально-направленный антиоксидант БкСП оказывает воздействие на процессы репаративной регенерации кожи. Длительное системное введение БкС)1 препятствует развитию нарушений заживления кожных ран у стареющих и диабетических (йЪ/йЪ) мышей. Во всех исследованных моделях репаративной регенерации кожи и асептического воспаления применение 8кС>1 понижало нейтрофильную инфильтарцию зоны повреждения. При заживлении полнослойных кожных ран ускорял процесс формирования грануляционной ткани независимо от схемы введения.

Полученные экспериментальные данные указывают на важную роль митохондриальных АФК в развитии возрастных и патологических нарушений заживления ран, а также в регуляции процессов нейтрофильной инфильтрации и новообразования соединительной ткани в зоне повреждения. Данные различных работ, представленных в научной литературе, показывают, что гиперпродукция митохондриальных АФК вызывает целый ряд процессов, которые могут напрямую способствовать замедлению репаративной регенерации кожи, а также развитию нарушений заживления ран при старении и ряде заболеваний. В связи с этим, результаты, полученные в данной диссертационной работе, свидетельствуют о необходимости дальнейших исследований возможных механизмов действия митохондриально-направленных антиоксидантов на процессы регенерации.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Демьяненко, Илья Александрович, Москва

1. Абаєв Ю.К. Раны и раневая инфекция. Ростов-на-Дону: Феникс. 2006. С. 6-30, 57-64,92.101,202-210.

2. Агапова JI.C., Черняк Б.В., Домнина J1.B., Дугина В.Б., Ефименко А.Ю., Фетисова

3. Анисимов В.Н. Молекулярные и физиологические механизмы старения. Санкт

4. Петербург: Наука. 2008. Т. 1. С. 107-378.

5. Анисимов В.Н. Молекулярные и физиологические механизмы старения. Санкт

6. Петербург: Наука. 2008. Т. 2. С. 317-335.

7. Анисимов В.Н., Бакеева Л.Е., Егормин П.А., Филенко О.Ф., Исакова Е.Ф., Манских

8. Антоненко Ю.Н., Аветисян A.B., Бакеева Л.Е., Черняк Б.В., Чертков В.А., Домнина

9. Архипова JI.T., Архипова М.М., Бакеева JI.E., Фурсова А.Ж., Григорян E.H.,

10. Бабаева А.Г. Регенерация: факты и перспективы. Москва: издательство РАМН. 2009.1. С. 189-193,281-291.

11. Бакеева Л.Е., Барсков И.В., Егоров М.В., Исаев Н.К., Капелько В.И., Казаченко А.В,

12. Беляев А.Н., Рыгин Е.А., Захватов А.Н., Гулин А.Н., Грузнов А.Г. Системная и регионарная ангиоксидантная терапия при осложненных формах диабетической стопы // Хирургия. 2007. Т. 11. С. 46-50.

13. Виноградова И.А., Чернова И.В. Влияние светового режима на возрастную динамику астральной функции и уровня пролактина в сыворотке крови у крыс // Успехи геронтологии. 2006. Т. 19. С. 60-65.

14. Гланц С. Медико-биологическая статистика. Москва.: Практика. 1999. С 360-380.

15. Ефимов Е.А. Посттравматическая регенерация кожи. Москва: Медицина. 1975. С. 31-44, 72-127.

16. Кабак Я.М. Практикум по эндокринологии. Москва: Издательство Московского Университета. 1968. С. 30-36.

17. Кондашевская М.В. Гепарин новая парадигма эффектов действия. Москва: Студия МДВ. 2011. С. 14-57.

18. Луцевич О.Э.,. Ширинский В.Г, ШехтерА.Б., Толстых М.П., Галлямов Э.А., Роднико С.Е. Стимуляция репаративных процессов при заживлении ран // Хирургия. 2008. № 6. С. 6-10.

19. Маянский Д.Н. Хроническое воспаление. Москва: Медицина. 1991. С. 10-105, 130151.

20. Нестеров Ю.М., Чумакова A.C., Турченко Н.В. Влияние стресс-индуцированных воздействий разной модальности и антиоксиданта на свободнорадикальные процессы в легких и печени белых крыс // Естественные науки. 2010. Т. 32. № 3. С. 122-126.

21. Ноздрин В.И., Белоусова Т.А., Альбанова В.И., Лаврик О.И. Гистофармакологические исследования кожи. Москва: «ЗАО» Ретиноиды. 2006. С.179.202.

22. Поликар А. Воспалительные реакции и их динамика. Новосибирск: Наука. 1969. С. 155-158.

23. Ромейс Б. Микроскопическая техника. Москва: Иностранная литература, 1953, С. 326, 352.

24. Скулачев В.П. Попытка биохимиков атаковать проблему старения: «Мегапроект» по проникающим ионам. Первые итоги и перспективы // Т. 72. № 12. С. 1700-1714.

25. Фенчин K.M. Заживление ран. Киев: Здоров'я. 1979. С 8-113.

26. Хрущов Н.Г. Гистогенез соединительной ткани. Москва: Наука. 1976. С. 41-87.

27. Шубникова Е.А. Функциональная морфология тканей. Москва: Издательство Московского Университета. 1981. С. 48-52.

28. Шубникова Е.А. Эпителиальные ткани. Москва: Издательство Московского Университета. 1996. с 50-56.

29. Adlam V.J., Harrison J.C., Porteous С.М., James A.M, Smith R.A.J., Murthy M.P., Sammut I. A. Targeting an antioxidant to mitochondria decreases cardiac ischemia-reperfusion injury // FASEB journal. 2005. V. 19. № 9. P. 1088-1095.

30. Alt E.U., Senst C., Murthy S.N., Slakey D.P., Dupin C.L., Chaffin A.E., Kadowitz P.J., Izadpanah R. Aging alters tissue resident mesenchymal stem cell properties // Stem cell research. V. 8. № 2. P. 215-225.

31. Andizak В., Buffenstein R. Disparate patterns of age-related changes in lipid peroxidation in long-lived naked mole-rats and shorter-lived mice // Aging cell. 2006. V. 5. №6. P. 525-532.

32. Ashcroft G.H., Mills S.J., Ashworth J.J. Ageing and wound healing // Biogerontology. 2002. V. 3.№6. P. 337-345.

33. Babior B. Phagocytes and Oxidative Stress // American journal of medicine. 2000. V. 109. № 1. P. 33-44.

34. Babior B. The leukocyte NADH oxidase // Israel Medical Association journal. 2002. V. 4. № 11. P. 1023-1024.

35. Babior B., Kipnes R. Curnut J. Biological defense mehanisms: the production by leukocytes of superoxide, a potential bactericidal agent // Journal of clinical investigation. 1973. V. 52. №3. P. 741-744.

36. Barrientos S., Stojadinovic O., Golinko M.S., Brem H., Tomic-Canic M. Growth factors and cytokines in wound healing // Wound repair and regeneration. 2008. V. 16. № 5. P. 585-601.

37. Bellini A., Mattoli S. The role of the fibrocyte, a bone marrow-derived mesenchymal progenitor, in reactive and reparative fibroses // Laboratory investigation. 2007. V. 87. № 9. P.858-870.

38. Billingham R.E., Russel P.S. Studies on wound healing, with special reference to the phenomenon of contracture in experimental wounds in rabbits' skin // Annals of surgery. 1956. V. 144. №6. P. 961-981.

39. Bishop A. Role of oxygen in wound healing // Journal of wound care. 2008. V. 17. № 9. P. 399-402.

40. Blakytny R., Jude E. The molecular biology of chronic wounds and delayed healing in diabetes // Diabetic medicine. 2006. V. 23. № 6. P. 594-608.

41. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Analytical biochemistry. 1976. V. 72. P. 248-254.

42. Bran G.M., Goessler U.R., Hormann K., Riedel F., Sadick H. Keloids: current concepts of pathogenesis (review) // International journal of molecular medicine. V. 24. № 3. P. 283-293.

43. Brem H., Tomic-Canic M. Cellular and molecular basis of wound healing in diabetes // Journal of clinical investigation. 2007. V. 117. № 5. P. 1219-1222.

44. Briggs S.L. The role of fibronectin in fibroblast migration during tissue repair // Journal of wound care. 2005. V. 14. № 6. P. 284-287.

45. Brubaker A.L., Schneider D.F., Kovacs E.J. Neutrophils and natural killer T cells as negative regulators of wound healing // Expert review of dermatology. 2011. V. 6. № 1. P. 5-8.

46. Burns R.J., Smith R.A., Murphy M.P. Synthesis and characterization of thiobutyltriphenylphosphonium bromide, a novel thiol reagent targeted to the mitochondrial matrix // Archives of biochemistry and biophysics. 1995. V. 322. JVb 1. P. 60-68.

47. Cadenas E., Davies K.J. Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging // Free radical biology and medicine. 2000. V. 29. № 3-4. P 222-230.

48. Calhoun J.H., Overgaard K.A., Stevens C.M., Dowling J.P., Mader J.T. Diabetic foot ulcers and infections: current concepts // Advances in skin and wound care. 2002. V. 15. № 1. P. 31-42.

49. Callaghan M.J., Ceradini D.J., Gurtner G.C. Hyperglycemia-induced reactive oxygen species and impaired endothelial progenitor cell function // Antioxidants and redox signaling. 2005. V. 7. № 11-12. P. 1476-1482.

50. Carr A.C., McCall M.R., Frei B. Oxidation of LDL by myeloperoxidase and reactive nitrogen species: reaction pathways and antioxidant protection // Arterioclerosis, thrombosis and vascular biology. 2000. V. 20. № 7. P. 1716-1723.

51. Case J., Ingram D.A., I-Ianeline L.S. Oxidative stress impairs endothelial progenitor cell function // Antioxidants and redox signaling. 2008. V. 10. № 11. P. 1895-1907.

52. Chappie I.L.C. Reactive oxygen species and antioxidants in inflammatory diseases // Journal of clinical periodontology. 1997. V. 24. № 5. P. 287-296.

53. Coleman D.L., Hummel K.P. Studies with the mutation, diabetes, in the mouse // Diabetologia. 1967. V. 3. № 2. P. 238-248.

54. Cowin A.J., Brosnan M.P., Holmes T.M., Ferguson M.W.J. Endogenous inflammatory response to dermal wound healing in the fetal and adult mouse // Developmental dynamics. 1998. V. 212. № 3. P. 385-393

55. Curzio M. Interaction between neutrophils and 4-hydroxyalkenals and consequences on neutrophil motility // Free radical research communications. 1988. V. 5. № 2. P. 55-66.

56. Curzio M., Esterbauer H., Dianzani M.U. Chemotactic activity of hydroxyalkenals on rat neutrophils // International journal of tissue reactions. 1985. V. 7. № 2. P. 137-142.

57. Curzio M., Esterbauer H., Poli G., Biasi F., Cecchini G., Di Mauro C., Cappello N., Dianzani M.U. Possible role of aldehydic lipid peroxidation products as chemoattractants // International journal of tissue reactions. 1987. V. 9. № 4. P. 295-306.

58. Cuthbertson A.M. Contraction of full thickness skin wounds in the rat // Surgery, gynecology and obstetrics. 1959. V. 108. № 4. P. 421-432.

59. Dalle-Donne I., Rossi R., Colombo R., Giustarini D., Milzani A. Biomarkers of oxidative damage in human disease // Clinical Chemistry. 2006. V. 52. № 4. P. 601-623.

60. Davies M.J., Fu S., Wang H., Dean R.T. Stable markers of oxidant damage to proteins and their application in study of human disease // Free radical biology and medicine. 1999. V. 27. № 11-12. P. 1151-1161.

61. Delavary B.M., van der Veer W.M., van Egmond M., Niessen F.B., Beelen R.H.J. Macrophages in skin injury and repair // Immunobiology. 2011. V. 216. № 7. P. 753-762.

62. Desmouliere A., Redard M., Darby I., Gabbiani G. Apoptosis mediates the decrease in cellularity during the transition between granulation tissue and scar // American journal of pathology. 1995. V. 146. № 1. P. 56-66.

63. Doughan A.K., Dikalov S.I. Mitochondrial redox cycling of mitoquinone leads to superoxide production and cellular apoptosis // Antioxidants and redox signaling. 2007. V. 9.№ 11. P. 1825-1836.

64. Droge W. Free radicals in the physiological control of cell function // Physiological reviews. 2002. V. 82. № 1. P. 47-95.

65. DuNouy P.L. The relation between the age of the patient, the area of the wound, and the index of cicatrisation // Journal of experimental medicine. 1916. V. 24. P. 461-470.

66. Emmerson E., Hardman M.J. The role of estrogen deficiency in skin ageing and wound healing // Biogerontology. V. 13. № 1. P. 3-20.

67. Esterbauer H., Schaur R.J., Zollner H. Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynonenal, malonaldehyde and related aldehydes // Free radical biology and medicine. 1991. V. 11. № LP. 81-128.

68. Fatah M.F., Ward C.M. The morbidity of split-skin graft donor sites in the elderly: the case for mesh-grafting the donor site // British journal of plastic surgery. 1984. V. 37. № 2. P. 184-190.

69. Ferguson M.W.J., O'Kane S. Scar-free healing: from embryonic mechanisms to adult therapeutic intervention // Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 2004. V. 359. № 1445. P. 839-850.

70. Fitzmaurice S.D., Sivamani R.K., Isseroff R.R. Antioxidant therapies for wound healing: a clinical guide to currently commercially available products // Skin pharmacology and physiology. 2011. V. 24. № 3. P. 113-126.

71. Fleissner F., Thum T. Critical role of the nitric oxide/reactive oxygen species balance in endothelial progenitor dysfunction // Antioxidants and redox signaling. 2011. V. 15. № 4. P. 933-948.

72. Fraticelli A., Serrano C.V. Bochner B.S., Capogrossi M.C., Zweier J.L. Hydrogen peroxide and superoxide modulate leukocyte adhesion molecule expression and leukocyte endothelial adhesion // Biochimica et biophysica acta. 1996. V. 1310. № 3. P. 251-259.

73. Ghafourifar P., Cadenas E. Mitochondrial nitric oxide synthase // Trends in pharmacological sciences. 2005. V. 26. № 4. P. 190-195.

74. Giacco F., Brownlee M. Oxidative stress and diabetic complications // Circulation research. 2010. V. 107. № 9. P. 1058-1070.

75. Gilliver S.C., Ashworth J.J., Ashcroft G.S. The hormonal regulation of cutaneous wound healing // Clinics in dermatology. V. 25. № 1. P. 56-62.

76. Gomes E.C., Silva A.N., de Oliveira M.R. Oxidants, antioxidants, and the beneficial roles of exercise-induced production of reactive species // Oxidative medicine and cellular longevity. 2012. V. 2102. P. 1-12.

77. Gopinath D., Ahmed M.R., Gomathi K., Chitra K., Sehgal P.K., Jayakumar R. Dermal wound healing processes with curcumin incorporated collagen films // Biomaterials. 2004. V. 25. № 10. P. 1911-1917.

78. Gosain A., DiPietro L.A. Aging and wound healing // World journal of surgery. 2004. № 3. V. 28. P. 321-326.

79. Grinnel F. Fibroblasts, Myofibroblasts, and Wound Contraction // Journal of cell biology. V. 124. №4. P. 401-404.

80. Grinnell F. Fibronectin and wound healing // Journal of cellular biochemistry. 1984. V. 26. №2. P. 107-116.

81. Groleau J., Dussault S., Turgeon J., Haddad P., Rivard A. Accelerated vascular aging in CuZnSOD-deficient mice: impact on EPC function and reparative neovascularization // 201 l.V. 6. №8.e23308.

82. Guo S., DiPietro L.A. Factors affecting wound healing // Journal of dental research. 2010. V. 89. №3. P. 219-229.

83. Gurtner G.C., Werner S., Barrandon Y., Longaker M.T. Wound repair and regeneration //Nature. 2008. V. 453. № 7193. P. 314-321.

84. Halliwell B., Gutteridge J. Free Radicals in Biology and Medicine 2nd edition. Oxford, UK: Oxford University Press. 1989.

85. Halliwell B., Gutteridge J.M.C. Free radicals in biology and medicine (3rd edition). Oxford, UK: Oxford University Press. 1999.

86. Harman D. Aging: a theory based on free radical and radiation chemistry // Journal of gerontology. 1956. V. 11. P. 298-300.

87. Higton D.I., James D.W. The force of contraction of fullthickness wounds of rabbit skin // Britain Journal of surgery. 1964. V. 51. № 6. P. 462-466.

88. Hinz B. Formation and function of the myofibroblast during tissue repair // Journal of investigative dermatology. 2007. V. 127. № 3. P. 526-537.

89. Holt D.R., Kirk S.J., Regan M.C., Hurson M., Lindblad W.J., Barbul A. Effect of age on wound healing in healthy human beings // Surgery. 1992. V. 112. № 2. P. 293-297.

90. Hubner G.,Brauchle M., Smola H., Madlener M., Fassler R., Werner S. Differential regulation of pro-inflammatory cytokines during wound healing in normal and glucocorticoid-treated mice // Cytokine. 1996. V. 8. № 7. P. 548-556.

91. Hunt N.D., Li G.D., Zhu M., Levette A., Chachich M.E., Spangler E.L., Allard J.S., Ilyun D.II., Ingram D.K., de Cabo R. Effect of calorie restriction on skin wound healing in the rat// Age. 2011. DOI: 10.1007/s 11357-011-9321-6

92. James T.J., Hughes M.A., Cherry G.W., Taylor R.P. Evidence of oxidative stress in chronic venous ulcers // Wound repair and regeneration. 2003. V. 11. № 3. P. 172-176.

93. Jauslin M.L., Meier T., Smith R.A.J, Murthy M.P. Mitochondria-targeted antioxidants protect Friedreich Ataxia fibroblasts from endogeneous oxidative stress more effectively than untargeted antioxidants//FASEB journal. 2003. V. 17. № 13. P. 1972-1974.

94. Jorneskog G., Brismar K., Fagrell B. Skin capillary circulation severely impaired in toes of patients with IDDM, with and without late diabetic complications // Diabetologia. 1995. V. 38. №4. P. 474-480.

95. Kapoor M., Howard R., Hall I., Appleton I. Effects of Epicatechin Gallate on wound healing and scar formation in a full thickness incisional wound healing model in rats // American journal of pathology. 2004. V. 165. № LP. 299-307.

96. Kim H., Kawazoe T., Han D., Matsumara K., Suzuki S., Tsutsumi S., Hyon S. Enhanced wound healing by an epigallocatechin gallate-incorporated collagen sponge in diabetic mice // Wound repair and regeneration. 2008. Y. 16. № 5. P. 714-720.

97. Klyubin I.V. Kirpichnikova K.M., Gamaley I.A. Hydrogen peroxide-induced chemotaxis of mouse peritoneal neutrophils // European journal of cell biology. 1996. V. 70. №4. P. 347-351.

98. Kondo T., Ishida Y. Molecular pathology of wound healing // Forensic science international. V. 203. № 1-3. P. 93-98.

99. Kruk J.M., Jemiola-Rzeminska, Strzalka K. Plastoquinol and a-tocopherol quinol are more active than ubiquinol and a-tocopherol in inhibition of lipid peroxidation // Chemistry and physics of lipids. 1997. V. 87. № 1. P. 73-80.

100. Kunkel E.J., Butcher E.C. Plasma-cell homing //Nature reviews. Immunology. 2003. V. 3. № 10. P. 822-829.

101. Lateef H., Aslam M.N., Stevens M.J., Varani J. Pretreatment of diabetic rats with lipoic acid improves healing of subsequently-induced abrasion wounds // Archives of dermatological research. 2005. Y. 297. № 2. P. 75-83.

102. Leonard S.S, Harris G.K., Shi X. Metal-induced oxidative stress and signal transduction // Free radical biology and medicine. 2007. V. 37. № 12. P. 1921-1942.

103. Liochev S.I., Fridovich I. The Iiaber-Weiss cycle 70 years later: an alternative view // Redox report. 2002. V. 7. № 1. P. 55-57.

104. Mantovani A., Sozzani S., Locati M., Allavena P., Sica A. Macrophage polarization: tumor-associated macrophages as a paradigm for polarized M2 mononuclear phagocytes // Trends in immunology. 2002. V. 23. № 11. P. 549-555.

105. Marrotte E.J., Chan D., Hakim J.S., Chen A.F. Manganese superoxide dismutase expression in endothelial progenitor cells accelerates wound healing in diabetic mice // Journal of clinical investigation. 2010. V. 120. № 12. P. 4207-4219.

106. Martin P. Wound healing aiming for perfect skin regeneration // Science. 1997. V 276. №5309. P. 75-81.

107. Menke N.B., Ward.K.R., Witten T.M., Bonchev D.G., Diegelman R.F. Impaired wound healing // Clinics in dermatology. 2007. V. 25. № 1. P. 19-25.

108. Monako J.L., Lawrence W.T. Acute wound healing. An overview // Clinics in plastic surgery. 2003. V. 30. № 1. P. 1-12.

109. Mowat A, Baum J. Chemotaxis of polymorphonuclear leukocytes from patients with diabetes mellitus// New England journal of medicine. 1971. V. 284. № 12. P. 621-627.

110. Murphy M.P., Smith R.A.J., Drug delivery to mitochondria: the key to mitochondrial Medicine // Advanced drug delivery reviews. 2000. V. 41. № 2. P. 235-250.

111. Nakamura H., Herzenberg L.A., Bai J., Araya S., Kondo N., Nishinaka Y., Herzenberg L.A., Yodoi J. Circulating thioredoxin suppresses lipopolysaccharide-induced neutrophil chemotaxis // PNAS. 2001. V. 98. № 26. P. 15143-15148.

112. Nathan C. Point of control in inflammation //Nature. 2002. V. 420. P. 846-852.

113. Nielson E.G., Phillips S.M., Jimenez S. Lymphokine modulation of fibroblast proliferation//Journal of immunology. 1982. V. 128. № 3. P. 1484-1486.

114. Novo E., Parola M. Redox mechanisms in hepatic chronic wound healing and fibrogenesis//Fibrogenesis and tissue repair. 2008. V. 1. № 1. P. 1-58.

115. O'Malley Y., Fink B.D., Ross N.C., Prisinzano T.E., Sivitz W.I. Reactive oxygen and targeted antioxidant administration in endothelial cell mitochondria // Journal of biological chemistry. 2006. V. 281. № 52. P. 39766-39775.

116. Papa S., Skulachev V.P. Reactive oxygen species, mitochondria, apoptosis and aging // Molecular and cellular biochemistry. 1997. V. 174. № 1-2. P. 305-319.

117. ParkN., Lim Y. Short term supplementation of dietary antioxidants selectively regulates the inflammatory responses during early cutaneous wound healing in diabetic mice // Nutrition and metabolism. 2011. V. 8. № 1. P. 1-9.

118. Peus D., Yasa R.A., Meves A., Pott M., Beyerle A., Squillace K., Pittelkow M.R. H202 is an important mediator of UVB-induced EGF-receptor phosphorylation in cultured keratinocytes // Journal of investigative dermatology. 1998. V. 110. № 6. P. 966-971.

119. Pop-Busui R., Sima A., Stevens M. Diabetic neuropathy and oxidative stress // Diabetes/metabolism research and reviews. 2006. V. 22. № 4. P. 257-273.

120. Rahban S., Gamer W. Fibroproliferative scars // Clinics in plastic surgery. 2003. V. 30. № l.P. 77-89.

121. Rasik A.M., Shukla A. Antioxidant status in delayed healing type of wounds // International journal of experimental pathology. 2000. V. 81. № 4. P. 257-263.

122. Ray P.D., Huang B.W., Tsuji Y. Reactive oxygen species (ROS) homeostasis and redox regulation in cellular signaling // Cellular signaling. 2012. V. 24. № 5. P. 981-990.

123. Reiber G.E., Boyko E.J., Smith D.J. Lower extremity foot ulcers and amputations in diabetes. Diabetes in America. Flarris M.I. and Stern M.P., editors. U.S. Goverment Printing Office. Bethesda, Maryland, USA. 1995. P. 409-428.

124. Ren-Feng G., Peter W. Role of oxidants in lung injury during sepsis // Antioxidants and redox signaling. 2007. V. 9. № 11. P. 1991-2002.

125. Rodero M.P., Khosrotehrani K. Skin wound healing modulation by macrophages // International journal of clinical and experimental pathology. 2010. V. 3. № 7. P. 643-653.

126. Rossi D.J., Jamieson C.H., Weissman IL. Stems cells and the pathways to aging and cancer // Cell. V. 132. № 4. P. 681-696.

127. Rossi M.A., Di Mauro C., Dianzani M.U. Experimental studies on the mechanism of phospholipase C activation by the lipid peroxidation products 4-hydroxynonenal and 2-nonenal // International journal of tissue reactions. 2001. V. 23. № 2. P. 45-50.

128. Roy S., Khanna S., Kishore N., Hunt T.K., Sen C.K. Dermal wound healing is subject to redox control // Molecular theraphy. 2006. V. 13. № 1. P. 211-220.

129. Roy S., Khanna S., Sen C.K. Hydrogen peroxide, the common link between physical exercise and cutaneous wound healing // Free radical biology and medicine. 2008. V. 44. №2. P. 180-192.

130. Saretzki G., Murphy M.P., von Zglinicki T. MitoQ counteracts telomere shortening and elongates lifespan of fibroblasts under mild oxidative stress // Aging cell. 2003. V. 2. № 2. P. 141-143.

131. Schafer M., Werner S. Oxidative stress in normal and impaired wound repair // Pharmacological research. 2008. V. 58. № 2. P. 165-171.

132. Sen C.K. The general case for redox control in wound repair // Wound repair and regeneration. 2003. V. 11. № 6. P. 431-438.

133. Sen C.K., Roy S. Redox signals in wound repair // Biochimica et biophysica acta. 2008. V. 1780. № 11. P. 1348-1361.

134. Sethe S., Scutt A., Stolzing A. Aging of mesenchymal stem cells // Ageing research reviews. V. 5. № 1. P. 91-116.

135. Sethe S., Scutt A., Stolzing A. Aging of mesenchymal stem cells // Ageing research reviews. 2006. V. 5. № 1. P. 91-116.

136. Sibbald R.G., Woo K.Y. The biology of chronic foot ulcers in persons with diabetes // Diabetes/metabolism research and reviews. 2008. V. 24. P. 25-30.

137. Silverman E.M., Silverman A.G. Granulocyte adherence in the elderly // American journal of clinical pathology. 1977. V. 67. № 1. P. 49-52.

138. Singer A.J., Clark R.A.F. Cutaneous wound healing // The New England journal of medicine. 1999. V. 341. № 10. P. 738-746.

139. Skulachev V.P. Mitochondria-targeted plastoquinone derivatives. Effect on senescence and acute age-related pathologies // Current drug targets. 2011. V. 12. № 6. P. 800-826.

140. Smith R.A., Porteous C.M., Coulter C.V., Murphy M.P. Selective targeting of an antioxidant to mitochondria // European journal of biochemistry. 1999. V. 263. № 3. P. 709-716.

141. Soneja A., Drews M., Malinski T. Role nitric oxide, nitroxidative and oxidative stress in wound healing // Pharmacological reports. 2005. V. 57. P. 108-119.

142. Soneja A., Drews M., Malinski T. Role nitric oxide, nitroxidative and oxidative stress in wound healing // Pharmacological reports. 2005. V. 57. P. 108-119.

143. Srinivasan K., Ramaro P. Animal models in type 2 diabetes research: An overview // Indian journal of medical research. 2007. V. 125. № 3. P. 451-472.

144. Stolzing A., Scutt A. Age-related impairment of mesenchymal progenitor cell function // Aging cell. 2006. V. 5. № 3. P. 213-224.

145. Stolzing A., Jones E., McGonagle D., Scutt A. Age-related changes in human bone marrow-derived mesenchymal stem cells: consequences for cell therapies // Mechanisms of ageing and development. 2008. V. 129. № 3. P. 163-173.

146. Sverko V., Balog T., Sobocanec S., Gavella M., Marotti T. Age-associated alteration of lipid peroxidation and superoxide dismutase activity in CBA and AKR mice // Experimental gerontology. 2002. V. 37. № 8-9. P. 1031-1039.

147. Swift M.E., Burns A.L., Gray K.L., DiPietro L.A. Age-related alterations in the inflammatory response to dermal injury // Journal of investigative dermatology. 2001. V. 117. №5. P. 1027-1035.

148. Swift M.E., Kleinman U.K., DiPietro L.A. Impaired wound repair and delayed angiogenesis in aged mice // Laboratory investigation. 1999. V. 79. № 12. P. 1479-1487.

149. Tkalcevic V.I., Cuzic S., Parnham M.J., Pasalic I., Brajsa K. Differential Evaluation of Excisional Non-occluded Wound Healing in db/db mice // Toxicologic pathology. 2009. V. 37. №2. P. 183-192.

150. Tsirogianni A.K., Moutsopoulos N.M., Moutsopoulos IT.M. Wound healing: Immunological aspects // Injury. 2006. V. 37. № 1. P. 5-12.

151. Uchiyama M., Mihara M. Determination of malonaldehyde precursor in tissues by thiobarbituric acid test // Analytical biochemistry. 1978. V. 86. № 1. P. 271-278.

152. Valko M., Leibfritz D., Moncol J., Cronin M., Mazur M., Joshua T, Free radicals and antioxidants in normal physiological function and human disease // International journal of biochemistry and cell biology. 2007. V. 39. № 1. P. 44-84.

153. Werner S., Grose R. Regulation of wound healing by growth factors and cytokines // Physiological reviews. 2003. V. 83. № 3. P. 835-870.

154. Williamson K., Stringer S.E., Alexander M.Y. Endothelial progenitor cells enter the aging arena // Frontiers in physiology. 2012. V. 3. № 30. P. 1-7.

155. Witte M.B., Barbul A. General principles of wound healing // Surgical clinics of North America. 1997. V. 77. № 3. P. 509-528.

156. Wlaschek M., Scharffetter K. Oxidative stress in chronic venous leg ulcers // Wound repair and regeneration. 2005. V. 13. № 5. P. 452-461.

157. Wu Y., Wang J., Scott P.G., Tredget E.E. Bone marrow derived stem cells in wound healing: a review // Wound repair and regeneration. 2007. V. 15. P. 18-26.

158. Wu Y., Zhao R.C., Tredget E.E. Concise review: bone marrow-derived stem / progenitor cells in cutaneous repair and regeneration // Stem cells. 2010. V. 28. № 5. P. 905-915.

159. Yanai H., Budovsky A., Tacutu R., Fraifeld V.E. Is rate of skin wound healing associated with aging or longevity phenotype? // Biogerontology. 2011. V. 12. № 6. P. 591-597.

160. Yeoh-Ellerton S., Stacey M.C. Iron and 8-isoprostane levels in acute and chronic wounds // Journal of investigative dermatology. 2003. V. 121. № 4. P. 918-925.

161. Yonezawa Y, Kondo H, Nomaguchi TA. Age-related changes in serotonin content and its release reaction of rat platelets // Mechanisms of ageing and development. 1989. V. 47. №1. P. 65-75.