Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфогенетическая и цитогенетическая характеристики природных популяций зеленых лягушек Rana Esculenta в естественных условиях и подверженных антропогенному воздействию

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Морфогенетическая и цитогенетическая характеристики природных популяций зеленых лягушек Rana Esculenta в естественных условиях и подверженных антропогенному воздействию"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Институт Биологии Развития им. Н.К.Кольцова

сп;

О

На правах рукописи УДК 575.17

ЧУБИНИШВИЛИ Александр Теймуразович

МОРФОГЕНЕТИЧЕСКАЯ И ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПРИРОДНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ ЗЕЛЕНЫХ ЛЯГУШЕК ГИБРИДОГЕННОГО КОМПЛЕКСА RANA ESCULENTA В ЕСТЕСТВЕННЫХ УСЛОВИЯХ И ПОДВЕРЖЕННЫХ АНТРОПОГЕННОМУ ВОЗДЕЙСТВИЮ

03.00.15 - генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -1997

Работа выполнена в лаборатории постнатального онтогенеза Института биологии развития им. Н.«.Кольцова РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук Владимир Михайлович Захаров

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Владимир Григорьевич Митрофанов

доктор биологических наук, профессор Илья Артемьевич Захаров

Ведущее учреждение:

Биологический факультет МГУ им. М.В.Ломоносова

Защита состоится 997г. в часов на заседании

специализированного совета Д 002.85.01 по защите диссертаций в Институте биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН по адресу: 117808, Москва, ул. Вавилова 26.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН.

Автореферат разослан " "_1997г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Е.В. Волина

Актуальность темыл Гомеостаз является важнейшей характеристикой живого организма и характеризует способность поддерживать относительное постоянство внутренней среды организмов в процессе их функционирования и при наличии внешних или внутренних возмущений (Cannon 1929).

Нарушение гомеостаза может быть вызвано внутренними причинами, связанными с генетическим стрессом, вызываемым инбридингом или нарушением генетической коадаптации. Однако наиболее обычными причинами нарушения гомеостаза в природных популяциях, видимо, являются факторы внешней среды, и 'в особенности стрессирующее воздействие антропогенных факторов (Захаров 1987). Последствия такого воздействия могут выражаться в изменении демографических параметров природных популяций. Зачастую такие изменения становятся очевидными, когда негативные процессы уже имеют необратимый характер. Поэтому важно улавливать изменения, происходящие в популяциях, прежде, чем они скажутся на демографических показателях. Такую возможность дает исследование стабильности развития организма.■

Стабильность развития - способность организма к формированию фенотипа без онтогенетических нарушений (Mather 1953).

Развитие двух сторон билатерально симметричного организма контролируется единым геномом, и происходит под воздействием одинаковых условий среды, что в идеальном случае должно приводить к формированию абсолютно симметричных организмов. На практике этого не происходит, что является следствием несовершенства механизмов контролирующих процессы развития, неспособности противостоять негативному воздействию внешней среды (Palmer, Strobeck 1986). Таким образом, уровень стабильности развития зависит от генетических и средовых факторов.

Другим способом оценки гомеостаза организма является изучение' цитогенетической стабильности (Ильинских 1986). В организме имеются механизмы призванные поддерживать генетическое постоянство. Несмотря на спонтанный или индуцированный мутагенез, благодаря эффективной работе

систем репарации большинство нарушений устраняется. Частота остающихся нарушений в норме невелика.

При воздействии на организм различного рода негативных факторов эффективность работы систем репарации и иммунной системы снижаются, что приводит к нарушению цитогенетической стабильности и накоплению хромосомных и генных нарушений. Таким образом, уровень цитогенетических нарушений показывает эффективность работы репаративной и иммунной систем организма и отражает степень воздействия различных негативных факторов на организм.

Целью работы была оценка состояния амфибий в популяциях обитающих в естественных и антропогенных условиях, при помощи морфогенетических и цитогенетических подходов.

Объектом исследования служила группа европейских зеленых лягушек, гибридогенный комплекс Rana esculenta. Эта группа содержит три формы: озерная лягушка (Rana ridibunda), прудовая лягушка (Rana lessonae) и гибридная форма (Rana esculenta). Гибридогенный комплекс Rana esculenta был выбран в качестве объекта исследований благодаря широкому распространению, а также особенностям генетической структуры.

Задачи:

1. Разработать систему признаков дающих возможность разносторонне оценить стабильность развития. Разработать систему показателей для характеристики уровня стабильности развития.

2. Выяснить, влияет ли гибридная природа формы Rana esculenta на уровень стабильности развития.

3. Исследовать, есть ли изменения стабильности развития у особей с различной плоидностью (2п и Зп).

4. Исследовать стабильность развития в популяциях, подверженных антропогенному воздействию различной природы (химическому и радиационному).

5. Исследовать с помощью микроядерного теста цитогенетический гомеостаз в популяциях, подверженных антропогенному воздействию

6. Сравнить данные, полученные с применением морфогенетического и цитогенетического методов.

' Научная новизна: Впервые разработана система морфологических признаков и статистических показателей, пригодная для оценки стабильности развития зеленых лягушек.

Произведено сравнение стабильности развития гибридной формы (Кеэси/еМа) и родительских форм (озерной лягушки Ялсйэшс/а и прудовой лягушки Я/езголае). Показана равноценность гибридной формы и родительских видов с точки зрения стабильности развития;

Исследовано влияние плоидности ;на стабильность развития зеленых лягушек. Показано отсутствие влияния повышенной плоидности на стабильность развития;

Исследована стабильность развития природных популяций комплекса Яе5си/ел?а подвергающихся антропогенному воздействию, при помощи морфогенетическогб показателя. Показано снижение стабильности развития в популяциях, подверженных средовому стрессу;

Впервые произведено сравнение данных по состоянию природных популяций зеленых лягушек, полученных морфогенетическими и цитогенетическими методами. Оно выявило синхронность изменений этих двух показателей.

Практическая ценность работы: Разработанный метод оценки состояния популяций позволяет улавливать негативные процессы, происходящие в популяциях, на самых ранних этапах. Это позволяет предложить его для мониторинга возможных изменений состояния популяций и решения ряда практических задач, связанных с природоохранной деятельностью. Метод оценки состояния популяций амфибий может быть применен для тестирования как наземных так и водных экосистем.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Международной конференции "Новые методы популяционных исследований" (Москва, 1995); V Международном симпозиуме: "Биотест: оценка состояния природных популяций по гомеостазу развития" (Москва 1995); Международной

конференции "Водно-болотные угодья и развитие" (Куала-Лумпур 1995); конференциях молодых ученых ИБР РАН (Москва 1995, 1997); коллоквиумах лаборатории постнатального онтогенеза и объединенном коллоквиуме генетических лабораторий ИБР РАН.

По теме диссертации- опубликовано 5 работ, 2 работы находятся в

печати.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 6 глав, выводов и списка литературы (205 названий, в том числе 170 иностранных). Общий объем работы 116 стр. включая 11 рисунков.

Глава 1. Характеристика подходов и объекта исследования

Показателем стабильности развития может служить флуктуирующая асимметрия, которая является результатом' неспособности организма развиваться по строго заранее детерминированному пути. Флуктуирующая асимметрия представляет собой незначительные ненаправленные отклонения от строгой' симметрии и может быть идентифицирована по нормальному распределению относительно нуля различий между сторонами, взятых со знаком (Van Vallen 1962). Этот показатель неоднократно использовался для характеристики гомеостаза развития в условиях средового стресса.

Методом оценки цитогенетического гомеостаза может служить микроядерный тест, суть которого состоит в подсчете частоты клеток с микроядрами (Schmidt 1975). Хромосомные, хроматидные перестройки, такие как асимметричные и неполные обмены при митозе вызывают появление ацентрических фрагментов, которые часто после деления клетки остаются за пределами дочернего ядра в виде микроядер. Микроядра могут содержать также целые хромосомы. Это происходит, если под действием мутагена повреждается веретено деления. Рядом экспериментальных работ была показана зависимость частоты клеток с микроядрами от концентрации мутагена и времени экспозиции. Была продемонстрирована возможность применения этого метода для биомониторинга.

Амфибии являются удобным объектом при оценке состояния природной среды. Обитая на границе двух сред - водной и наземной, амфибии подвергаются воздействию факторов действующих как на суше так в воде и, таким образом, изменения тех или иных морфофизиологических показателей отражают действие всего комплекса факторов существующих в данной местности.

В качестве объекта исследования мы использовали бесхвостых амфибий, представителей группы европейских зеленых лягушек. Эта группа включает в себя три основные формы, это - озерная лягушка Rana ridibunda Pall., прудовая лягушка Rana lessonae Cam. и гибридная форма Rana escalenta L. Наличие широкого ареала послужило одной из причин для выбора данной группы в качестве объекта наших исследований. Это дает возможность проводить оценку состояния популяций на обширной территории, получая при этом сопоставимые результаты.

Кроме того, группа европейских зеленых лягушек интересна с генетической точки зрения. Основой репродуктивного процесса гибридной формы R.esculenta является гибридогенез, суть которого состоит в том, что в ходе гаметогенеза один из родительских геномов избирательно элиминируется и в гаметах оказывается только геном другого родителя. Благодаря такой форме размножения R.esculenta воспроизводится за счет скрещивания с той родительской формой геном которой был элиминирован.

Таким образом, представители гибридогенного комплекса Rana esculenta являются удобными объектами для изучения состояния популяций земноводных обитающих в природных и антропогенных условиях, а также представляют большой интерес с точки зрения изучения влияния генетических факторов на стабильность развития.

Глава 2. Материал и методы

Для решения поставленных задач в 1993 - 1996 годах материал собирался в регионах, где природные сообщества подвержены

антропогенному воздействию: в Астраханской, Самарской и Брянской областях. Кроме этого были исследованы герпетологические коллекции ЗИН РАН.

В Астраханской области нами были обследованы выборки из 4 точек. Точка 1, расположенная выше по течению р. Волги от основных источников загрязнения (предприятий расположенных в районе г. Астрахани), рассматривалась в качестве условного контроля. Точка 2 расположена в районе сброса сточных вод города Астрахани и промышленных предприятий и была выбрана для оценки ситуации при сильной комплексной антропогенной нагрузке (2а берег реки, 26 оросительный канал). Точка 3 выбрана для оценки ситуации на значительном удалении от основного источника загрязнения -города Астрахани, но расположена в районе интенсивной сельскохозяйственной деятельности.

Материал был собран также в Чапаевском районе Самарской области. Были исследованы 3 выборки. В качестве условно контрольной рассматривалась выборка из городской зоны отдыха (точка 1). Вторая выборка взята была взята для оценки воздействия химического предприятия на амфибий в непосредственной близости от него (точка 2). Еще одна выборка была взята для оценки воздействия сточных вод химического предприятия в районе сброса (точка 3).

Исследования проводились также в Брянской области, подвергшейся радиационному загрязнению вследствие аварии на Чернобыльской АЭС. Были взяты выборки из трех точек с различным уровнем радиационного, гамма-фона. Исследования проводились в течение двух лет. В качестве контроля была взята выборка из окрестностей заповедника "Брянский лес" (точка 1). Были также обследованы 2 точки с различным уровнем радиационного гамма-фона точка 2 - 30-140 мкР/ч и точка 3 - 80-420 мкР/ч.

Нами были исследованы также выборки из Московской, Воронежской, Днепропетровской областей. Кроме этого были обработаны выборки из герпетологической коллекции ЗИН РАН. В частности выборки симпатрических популяций разных форм зеленых лягушек из Латвии и 30-километровой зоны

Чернобыльской АЭС и выборки диплоидных и триплоидных R.esculenta из Восточной Германии и Западной Польши.

В качестве метода оценки стабильности развития использовали анализ, флуктуирующей асимметрии. Всего было использовано 13 признаков: число полос и пятен на бедре, голени и стопе; число пятен на спине; число белых островков на плантарной поверхности второго, третьего и четвертого пальцев; число пор на плантарной поверхности четвертого пальца; число зубов на межчелюстной кости и сошнике.

В качестве показателя асимметрии была использована средняя частота асимметричного проявления на признак, которая рассчитывалась как среднее число асимметричных признаков на особь поделенное на число проанализированных признаков. Статистическую значимость различий определяли при помощи t-критери'я Стьюдента (Sokal, Rohlf, 1981).

Для оценки цитогенетической стабильности был использован' микроядерный тест. Микроядра учитывали в эритроцитах периферической крови. Для этого делали мазки крови, которые фиксировали в течение 10-15

I

минут в метаноле, после чего окрашивали при помощи красителя Гимзы 10-12 минут. Учет микроядер производили под микроскопом при увеличении 1000. У каждой особи анализировали по 2000 эритроцитов.

Сравнение результатов полученных для разных выборок производили при помощи t-критерия Стьюдента. с преобразованием фи-Фишера (Sokal, Rohlf 1981).

Глава 3. Оценка влияния генетических факторов на уровень стабильности развития

Гибридизация может оказывать негативное влияние на стабильность эазвития (Soûle 1967; Leary 1985). Перед нами стояла задача выяснить влияет 1и гибридизация на стабильность развития в нашем случае.

Показатели стабильности развития полученные для симпатрических популяций R.rihibunda и R.esculenta из Латвии оказались практически идентичными (и составили 0,59±0,04 и 0,58+0,02 соответственно).

На, примере симпатрических популяций трех видов из 30-километровой зоны ЧАЭС был исследован вопрос реагируют ли все три формы европейских зеленых лягушек на внешнее воздействие сходным образом. Были получены следующие результаты: R.ridibunda - 0,62±0,03; R.lessonae - 0,58±0,03; R.esculenta - 0,62±0,03. Статистически значимых различий не найдено.

Часто популяции R.esculenta содержат триплоидных особей. Мы сравнили стабильность развития диплоидных и триплоидных особей R.esculenta. Показатель стабильности развития диплоидных особей оказался равен 0,57±0,04, триплоидных - 0,61 ±0,03. Статистически значимых различий между этими двумя выборками не найдено.

Таким образом, нами не обнаружено влияния гибридизации на уровень стабильности развития. Все три формы реагировали на внешнее воздействие'сходным образом.

В качестве генетических факторов влияющих на' стабильность развития обычно рассматриваются уровень гетерозиготности и коадаптация генома (Tebb, Thoday 1954; Ferguson 1986). При гибридизации гетерозиготность повышается, коадаптация может нарушаться.

В нашем случае у гибридов, по-видимому, не происходит нарушения коадаптированности генома. Это может быть следствием того, что родительские виды достаточно близки генетически (по литературным данным генетические различия между этими видами соответствуют различиям наблюдаемым между видами в стадии становления).

В то же время на стабильность развития может положительно влиять высокий уровень гетерозиготное™ характерный для гибридов. Многими авторами отмечается, что при высоком уровне гетерозиготности стабильность развития также высока, что объясняется тем, что у гетерозигот не проявляется

действие рецессивных неблагоприятных мутаций и они сильнее забуферены по отношению к воздействию окружающей среды.

Коадаптированный геном у гибридов может также возникать вследствие обмена родительских видов генетическим материалом через гибридную форму на протяжении длительного периода времени.

Источником приспособленности триплоидных гибридов также может быть высокий уровень гетерозиготности.

Глава 4. Оценка влияния среды на уровень стабильности развития

Как уже отмечалось, кроме' генетических факторов стабильность развития зависит от факторов среды обитания организма (Valentine et al. 1973; Zakharov 1994), вследствие чего по степени отклонения показателя стабильности развития от условно нормального уровня можно судить о степени внешнего воздействия на исследуемый объект.

Астраханская область

Среди выборок из Астраханской области наименьшее значение показателя флуктуирующей асимметрии было получено для выборки из условно контрольной точки (точка 1). Наибольшая величина показателя флуктуирующей асимметрии была получена для выборок вблизи основных источников загрязнения (точка 2). Выборка на большом расстоянии от основных источников загрязнения (точка 3) характеризовалась промежуточным уровнем асимметрии (рис. 1А). Сравнение результатов при помощи t-критерия Стьюдента выявило статистически значимые различия (р<0,05) между точками 1 - 2а, 1 - 26, 1 - 3 и 26 - 3.

Данные полученные нами свидетельствуют о том, что в точках 2а, 26 и 3, находящихся • ниже по течению от г. - Астрахани, наблюдается

существенное нарушение стабильности развития по сравнению с контролем.

/

Наибольшие значения этого показателя наблюдаются в точках 2а и 26. В точке 3 уровень асимметрии несколько ниже чем в точке 2, однако остается на

достаточнб высоком уровне. По-видимому, несмотря на большое удаление от основных источников загрязнения антропогенный пресс остается здесь достаточно сильным вследствие сельскохозяйственной деятельности ведущейся на всем протяжении русла реки. .

Рисунок 1.

Величина морфо-генетического (А) и цитогенетического (Б) показателей в выборках озерной лягушки (Rana rídlbunda) из Астраханской области.

Выборки:

1 - условный контроль; 2 - район сброса (2а - река, 26 - оросительный канал); 3 - 40 км ниже по течению от сброса.

•Самарская область

Среди выборок из Самарской области наименьшее ^ значение показателя флуктуирующей асимметрии было зафиксировано для выборки из условного'контроля (точка 1). Особи отловленные в месте сброса сточных'зод

химического предприятия (точка 3) характеризовались наибольшим уровнем асимметрии. В выборке собранной рядом с предприятием (точка 2) наблюдался промежуточный уровень флуктуирующей асимметрии (рис. 2А). Сравнение полученных результатов выявило статистически значимые различия (р<0,05) между точками 1 и 3.

N выборки

1

N выборки

Рисунок 2.

Величина морфоге-нетического (А) и цитогенетического (Б) показателей в выборках озерной лягушки (Rana ridibunda) из Самар- • ской области.

Выборки:

1 - условный контроль; 2 - вблизи завода; 3 - место сброса.

Полученные результаты свидетельствуют о том что наиболее благополучная обстановка наблюдается в условно контрольной точке. Наиболее сильное нарушение стабильности развития наблюдаете^ в

популяции обитающей в районе выброса сточных вод химического предприятия.

Брянская область

Среди выборок из Брянской области наименьшим уровнем флуктуирующей асимметрии характеризовались особи из контрольной точки (точка 1). В течение двух лет исследований наибольший уровень

Рисунок 3. Величина морфоге-нетического (А) и цитогенетического (Б) показателей в выборках зеленых лягушек из Брянской области.

Выборки:

1 - контроль, гамма -фон 15 мкР/ч; 2 -низкое радиационное загрязнение, гамма-фон бОмкР/ч; 3 - повышенное радиационное загрязнение, гамма-фон 220 мкР/ч.

флуктуирующей асимметрии был зафиксирован в точке с наибольшим уровнем радиационного гамма-фона (точка 3). Промежуточным значением характеризовались выборки из точки с промежуточным уровнем радиационного гамма-фона (точка 2) (Рис. ЗА).

■ Как в 1993, так и в 1994 годах показатель асимметрии полученный для выборки из точки 3 статистиче'ски значимо (р<0,05) отличался от показателей полученных для остальных выборок. Таким образом, наиболее сильное нарушение стабильности развития характерно для особей из точки с наиболее высоким уровнем радиационного гамма-фона, наименьшее - для особей из контрольной точки.

Московская область

Показатель стабильности развития для выборки КпсИЬипба из Москва-реки в районе Капотни оказался равен 0,57±0,03.

Днепропетровская область

Показатель стабильности развития оцененный для выборки Я.НсИЬипс]а из Каховского водохранилища (Никопольский район, Днепропетровская область), куда сбрасывают сточные воды ряд предприятий, оказался равен 0,58±0,02.

Для другой выборки И.псИЬип(1а исследованной в Днепропетровской области (место сброса сточных вод ряда предприятий в Днепродзержинское водохранилище), показатель стабильности развития составил 0,72±0,04.

Воронежский заповедник

Показатель стабильности развития для выборки Я/езяолае из Воронежского заповедника оказался равен - 0,53±0,03.

В Московской, Днепропетровской и' Воронежской областях мы располагали единичными выборками, и таким образом для этих данных определение степени отклонений от условной нормы было затруднено. Для

решения этой проблемы нами была разработана пятибалльная система

*

оценки степени отклонений стабильности развития от условной нормы. 'Первый балл соответствует условно нормальному, фоновому состоянию популяции, пятый - критическому.

Диапазон значений полученных для всех выборок мы разбили на пять условных групп, каждая из которых соответствует определенному баллу: значения показателя стабильности развития ниже 0,50 соответствуют первому баллу, от 0,50 до 0,55 - второму, от 0,55 до 0,60 - третьему, от 0,60 до 0,65 -■ четвертому, выше 0,65 - пятому баллу. Такая балльная шкала позволила нам оценить степень отклонения показателя стабильности развития в тех случаях, когда мы не имели контрольной выборки для сравнения.

Глава 5. Цитогенетическая характеристика состояния популяций

Параллельно с исследованием стабильности развития проводили оценку цитогенетической стабильности при помощи микроядерного теста.

Астраханская область

В Астраханской области 'частота эритроцитов с микроядрами была наименьшей у лягушек из условно контрольной точки (точка 1). Особи из точек, расположенных ниже по течению от основных источников загрязнения характеризовались более высокой частотой цитогенетических нарушений (рис. 1Б). Статистически значимые различия (р<0,001) были выявлены между выборками из точек 1 - 26 и 2а - 26.

Полученные данные свидетельствуют о повышении частот цитогенетических нарушений у особей из точек расположенных ниже по течению от г. Астрахани по сравнению с особями из контрольной точки.

Самарская область

В Самарской области микроядерный тест был проведен для двух выборок: из условно контрольной точки 1 и точки 2 расположенной рядом с

I г

14

химическим предприятием. Особи из точки 1 характеризовались. низкой частотой эритроцитов с микроядрами. В' точке 2 эта величина была статистически значимо выше (р<0,05) чем в условном контроле (рис. 2Б).

Таким образом, мы зафиксировали нарушение цитогенетической стабильности у особей подвергающихся антропогенному воздействию.

Брянская область

В Брянской области микроядерный тест был проведен для трех выборок отловленных в 1994 году. С наименьшей частотой эритроциты с микроядрами встречались у особей из контрольной выборки (точка 1). Наибольшая частота эритроцитов с микроядрами была зафиксирована в точке с наиболее высоким уровнем радиационного гамма-фона (точка 3). Выборка из точки с относительно невысоким уровнем радиационного фона (точка 2) характеризовалась промежуточной частотой эритроцитов с мйкроядрами (рис ЗБ). Частота эритроцитов с микроядрами полученная для контрольной выборки статистически значимо (р<0,05) отличалась от результатов полученных для двух других выборок.

Таким образом, нами обнаружена зависимость частоты цитогенетических нарушений от уровня радиационного гамма-фона.

Московская область

Микроядерный тест был проведен для двух выборок. Для выборки из Москва реки из района Звенигородской биологической станции МГУ (точка 1) частота эритроцитов с микроядрами оказалась равной 0,17%о. В выборке из Москва реки из Капотни (точка 2) этот показатель был равен 3,86%о.

Между значениями полученными в этих точках были обнаружены :татистически значимые различия (р<0,001). *

Днепропетровская область

Микроядерный тест был проведен только для выборки взятой из ^непродзержинского водохранилища. Было проанализировано 8 особей.

•Микроядра в эритроцитах периферической крови встречались со средней частотой 27,81%о.

Воронежский заповедник

При помощи микроядерного теста для двух особей Шеэзопае были выявлены неожиданно высокие частоты эритроцитов с микроядрами: для одной особи частота эритроцитов с микроядрами составила 59,0%о; для другой особи общая частота эритроцитов с микроядрами составила 425,3%о. Для остальных особей Я/еязолае средняя частота эритроцитов с микроядрами составила 1,67%о.

Среди обследованных нами выборок чаще встречались небольшие одиночные микроядра лежащие отдельно от ядра, или связанные с ядром. При сильном нарушении цитогенетической стабильности появлялись новые типы микроядер обычно не встречающиеся у других особей, такие как множество мелких микроядер в одной клетке и крупные микроядра неправильной формы.

При проведении микроядерного теста было обнаружено, что молодые особи, отловленные в год метаморфоза характеризуются пониженной частотой микроядер. Такая зависимость была обнаружена при исследовании контрольных точек в Московской и Брянской областях. По сравнению с частотами микроядер полученными для других контрольных выборок, которые состояли из более взрослых особей, частоты микроядер полученные в этих точках в несколько раз ниже.

Нами зафиксированы случаи, когда отдельные особи резко отличались по частоте микроядер от основной массы выборки. Так при проведении микроядерного теста для выборки из Воронежского заповедника обнаружены 2 особи частота микроядер у которых в 35 и в 300 раз превосходила среднее значение этого показателя для остальной выборки. Из литературы известно, что подобная дестабилизация генома может наблюдаться у больных особей (Ильинских 1986).

Глава 6. Сравнение результатов морфогенетического и цитогенетического подходов

Сравнение результатов полученных морфогенетическим и цитогенетическим методами было возможно для выборок из Астраханской, Самарской и Брянской областей. В целом изменения уровня флуктуирующей асимметрии и частоты эритроцитов с микроядрами происходили согласованно: коэффициент согласованности Кенделла для этих показателей, рассчитанный по 13 выборкам оказался равен 0,84 (р<0,01).

Синхронность изменений обоих показателей свидетельствует о том, что использованные нами подходы характеризуют важные аспекты состояния организмов в целом.

Выводы:

1. Разработана система морфологических признаков и показателей для оценки стабильности развития зеленых лягушек в природных популяциях.

2. Наши исследования показали, что гибридная природа ЯеБси/елГа не вызывает снижения стабильности развития по сравнению с родительскими видами. Не обнаружено различий по стабильности развития при сравнении диплоидных и триплоидных особей. Это дает основание для предположения об отсутствии существенного нарушения генетической коадаптации при данной форме гибридизации.

3. Исследование природных популяций из разных районов позволило выявить нарушение стабильности развития при неблагоприятных средовых воздействиях (в районе химического и радиационного загрязнения).

4. Сравнительный анализ данных, полученных для разных природных популяций позволяет ранжировать значения показателя стабильности эазвития по пятибальной шкале. Ее применение позволяет получить эриентировочную оценку степени отклонения от условной нормы даже для отдельной выборки.

5. С помощью микроядерного теста были выявлены нарушения цитогенетической стабильности в популяциях подвергающихся негативному воздействию внешних факторов.

6. - Сходство выявленных изменений морфогенетических и цитогенетических показателей гомеостаза свидетельствует о возможности характеристики общего состояния организма ' при использовании данных подходов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Чубинишвили А.Т., Борисов В.И., Баранов А.С., Захаров В.М. Земноводные: Стабильность развития. В кн. "Последствия Чернобыльской катастрофы: Здоровье среды", под редакцией В.М.Захарова и Е.Ю.Крысанова, Москва, 1996, с.49-53.

i

2. Чубинишвили А.Т. Земноводные: Цитогенетический гомеостаз. В кн. "Последствия Чернобыльской катастрофы: Здоровье среды", под ред. В.М.Захарова и Е.Ю.Крысанова, Москва, 1996, с.53-54.'

3. Чубинишвили А.Т., Баранов А.С., Захаров В:М. Амфибии: Стабильность развития. В сборнике: Экологическое состояние бассейна реки Чапаевки в антропогенных условиях (биологическая индикация). Экологическая безопасность и устойчивое развитие Самарской области. (3). 1996. Тольятти, с. 291-294.

4. Чубинишвили А.Т. Амфибии: цитогенетический гомеостаз. В сборнике: Экологическое состояние бассейна реки Чапаевки в антропогенных условиях (биологическая индикация). Экологическая безопасность и устойчивое развитие Самарской области. (3). 1996. Тольятти, с. 294-295.

5. Zakharov V.M., Dmitriev S.G., Baranov A.S., Borisov V.I., Valetski A.V., Chubinishvili A.T., Isaeva E.I., Chekhovich A.V., Chuikov Yu.S. Integrated biological

estimation of wetland ecosystem health (with particular reference to the Low Volga). Proceedings of International Conference on Wetlands and Development (8-14 october, 1995) 1997. p. 165-177.

6. Chubinishvili A.T. The Status of Natural Populations of the Rana escuienta - complex in Response to Anthropogenic Influences: A Morphogenetic Approach. Advances in Amphibian Research. 1997. (PENSOFT Publishers, Sofia -Moscow) Vol. 1. p. 111-222. (In press).

7. Чубинишвили A.T. Оценка состояния природных популяций озерной лягушки (Rana ridibunda Pall.) по гомеостазу развития обитающих в районе Средней Волги в условиях химического загрязнения. Экология. 1997. (в печати).

Типография ордена "Знак Почета" издательства МГУ

119899, Москва, Воробьевы горы.

Заказ N Ц$5 Тираж ши экз.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чубинишвили, Александр Теймуразович, Москва

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Институт Биологии Развития им. Н.К.Кольцова

На правах рукописи

УДК 575.17

ЧУБИНИШВИЛИ Александр Теймуразович

МОРФОГЕНЕТИЧЕСКАЯ И ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПРИРОДНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ ЗЕЛЕНЫХ ЛЯГУШЕК ГИБРИДОГЕННОГО КОМПЛЕКСА RANA ESCULENTA В ЕСТЕСТВЕННЫХ УСЛОВИЯХ И ПОДВЕРЖЕННЫХ АНТРОПОГЕННОМУ ВОЗДЕЙСТВИЮ

03.00.15 - генетика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата

биологических наук

Москва -1997

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение 4 Глава 1. Характеристика используемых подходов и

объекта исследования 10

1.1. Флуктуирующая асимметрия как мера морфогенетического гомеостаза 10

1.2. Микроядерный тест как мера

цитогенетического гомеостаза 13

1.3. Характеристика объекта исследования 17 Глава 2. Материал и методы 22

2.1. Места сбора материала 22

2.2. Методы обработки данных 27 Глава 3. Оценка влияния генетических факторов на уровень стабильности развития. 34

3.1. Основные генетические причины нарушения стабильности развития (постановка проблемы) 34

3.2. Оценка влияния гибридной природы

Rana esculenta на стабильность развития 37

3.3. Оценка влияния плоидности на уровень стабильности развития в популяциях Rana esculenta 38

3.4. Обсуждение полученных результатов 38 Глава 4. Оценка влияния среды на уровень стабильности развития 48

4.1. Стабильность развития и средовой стресс (постановка проблемы) 48

4.2. Оценка стабильности развития в природных популяциях зеленых лягушек из районов антропогенного воздействия 51

4.3. Обсуждение полученных результатов 60 Глава 5. Цитогенетическая характеристика состояния

популяций, подверженных антропогенному воздействию 69

5.1. Использование микроядерного теста для оценки мутагенности среды (постановка проблемы) 69

5.2. Результаты цитогенетического анализа природных популяций зеленых лягушек 72

5.3. Обсуждение полученных результатов 79 Глава 6. Сравнение результатов морфогенетического

и цитогенетического подходов 87

Выводы 92

Список литературы 93

Введение

Одной из важнейших характеристик биологических систем является гомеостаз. Термин "гомеостаз" был введен У.Кенноном, который подразумевал под ним относительное постоянство внутренней среды организмов и других биосистем в процессе их функционирования и при наличии внешних или внутренних возмущений (Cannon 1929). Первоначально этот термин был предложен для характеристики постоянства состояния биологической системы. В дальнейшем были развиты представления о гомеорезе (Waddington 1957), или гомеостазе развития (Dobzhansky, Wallace 1953, Lerner 1954), под которыми подразумевается наличие стабилизированного потока траекторий развития.

Принято выделять два основных аспекта гомеостаза развития. К первому аспекту относятся канализированность (Шмальгаузен 1940; Уоддингтон 1947) и пластичность (Thoday

1953) развития. Канализированность - это способность к развитию по определенной основной траектории - креоду при разных условиях среды; пластичность - способность к изменениям путей развития под действием среды. В обоих указанных случаях изменчивость оказывается минимальной при одних, оптимальных, условиях и неспецифично возрастает при других, отклоняющихся от этого условного оптимума. Эта изменчивость характеризует второй аспект общего гомеостаза развития - стабильность развития, или морфогенетический гомеостаз (Mather 1953, Lewis

1954). Под стабильностью развития подразумевается способность к развитию сходного фенотипического эффекта при данных условиях среды. Она отражает ширину потока траекторий

развития. Высокой стабильности развития соответствует узкий поток траекторий, низкой - относительно широкий. При анализе стабильности развития оценивается ширина потока траекторий развития вне зависимости от изменений самого креода. Оценка стабильности развития характеризует оптимальность условий и сбалансированность генных комплексов (Захаров 1987).

Другим аспектом общего гомеостаза организма является цитогенетический гомеостаз (Ильинских и др. 1986). В организме имеются механизмы, призванные поддерживать генетическое постоянство. Несмотря на спонтанный или индуцированный мутагенез, благодаря эффективной работе систем репарации, большинство нарушений устраняется. Клетки, несущие хромосомные изменения, либо погибают из-за неспособности к осуществлению жизненно важных функций, либо удаляются иммунной системой организма. Частота остающихся нарушений в норме невелика (Ильинских и др. 1986; Виленчик 1991; Захаров, Крысанов 1996).

При хроническом воздействии на организм различного рода негативных факторов, эффективность работы систем репарации и иммунной системы снижаются, что приводит к нарушению цитогенетической стабильности и накоплению хромосомных нарушений. Таким образом, уровень цитогенетических нарушений показывает эффективность работы репаративной и иммунной систем организма, и отражает степень воздействия различных негативных факторов на организм.

Оценка морфогенетического и цитогенетического гомеостаза представляется перспективной для интегральной характеристики состояния организма. Такая характеристика необходима для решения ряда практических и теоретических вопросов, связанных с

оценкой оптимальных условий развития, генетической коадаптации, состояния природных популяций, а также задач, связанных с охраной природы.

Целью данной работы была оценка состояния амфибий в популяциях, обитающих в естественных и антропогенных условиях, при помощи морфогенетических и цитогенетических методов.

Объектом исследования служила группа европейских зеленых лягушек, гибридогенный комплекс Rana esculenta. Эта группа содержит три формы: озерная лягушка (Rana ridibunda), прудовая лягушка (Rana lessonae) и гибридная форма (Rana esculenta). Гибридогенный комплекс Rana esculenta был выбран в качестве объекта исследований благодаря широкому распространению, а также особенностям генетической структуры.

Задачи:

1. Разработать систему морфологических признаков и статистических показателей для характеристики уровня стабильности развития.

2. Выяснить, влияет ли гибридная природа формы Rana esculenta на уровень стабильности развития.

3. Исследовать, есть ли различия по стабильности развития у особей с различной плоидностью (2п и Зп).

4. Исследовать стабильность развития в популяциях, подверженных антропогенному воздействию различной природы (химического и радиационного).

5. Исследовать с помощью микроядерного теста цитогенетический гомеостаз в популяциях, подверженных антропогенному воздействию различной природы.

6. Сравнить данные, полученные с применением морфогенетического и цитогенетического методов.

Новизна:

Впервые разработана система морфологических признаков и показателей для оценки стабильности развития в природных популяциях группы зеленых лягушек.

Произведено сравнение стабильности развития гибридной формы (R.esc¿y/eA7ía) и родительских форм (ЯпсЛЬипс1а, ^/езэопае). Показана равноценность гибридной формы и родительских видов с точки зрения стабильности развития.

Исследовано влияние плоидности на стабильность развития амфибий. Показано отсутствие влияния повышенной плоидности на стабильность развития.

Исследована стабильность развития природных популяций амфибий, подвергающихся антропогенному воздействию (химическое и радиационное загрязнение). Показано снижение стабильности развития в популяциях амфибий, подверженных средовому стрессу.

Впервые произведено сравнение данных по состоянию природных популяций амфибий, полученных морфогенетическими и цитогенетическими методами. Обнаружена согласованность изменения показателей морфогенетического и цитогенетического гомеостаза.

Практическая ценность работы:

Разработанный метод оценки состояния популяций позволяет улавливать негативные процессы, происходящие в популяциях, на самых ранних этапах. Это позволяет предложить его для

мониторинга возможных изменений состояния популяций и решения ряда практических задач, связанных с природоохранной деятельностью. Метод оценки состояния популяций амфибий может быть применен для тестирования как наземных, так и водных экосистем.

Апробация работы:

Материалы диссертации были представлены на Международной конференции "Новые методы популяционных исследований" (Москва, 1995); V Международном симпозиуме: "Биотест: оценка состояния природных популяций по гомеостазу развития" (Москва 1995); Международной конференции "Водно-болотные угодья и развитие" (Куала-Лумпур 1995), конференциях молодых ученых ИБР РАН (Москва 1995, 1997); коллоквиумах лаборатории постнатального онтогенеза и объединенном коллоквиуме генетических лабораторий ИБР РАН.

По теме диссертации опубликовано 5 работ, 2 работы находятся в печати.

Структура и объем работы:

Диссертация состоит из введения, 6 глав, выводов и списка литературы (205 названий, в том числе 170 иностранных). Общий объем работы цб стр. включая 11 рисунков.

Благодарность

Я искренне признателен сотрудникам отдела герпетологии Института зоологии РАН (Санкт-Петербург), за предоставленную возможность работы с герпетологическими коллекциями института. Особую благодарность хотел бы выразить сотруднику Института цитологии РАН (Санкт-Петербург) А.Е. Виноградову за

определение видового состава выборок методом проточной ДНК-цитометрии. Я благодарен сотрудникам Минского Института цитологии БАН, в особенности, К.Г. Елисеевой и A.M. Войтовичу, сотруднику Института проблем экологии и эволюции РАН Е.Ю. Крысанову, а также сотруднику кафедры эмбриологии Московского Государственного Университета С.Т. Захидову за ценные консультации при проведении цитогенетического анализа. Я искренне признателен сотрудникам лаборатории постнатального онтогенеза Института биологии развития РАН за постоянное внимание и поддержку на всех этапах работы, в особенности В.И. Борисову за проведение электрофоретического анализа, Д.В. Щепоткину за помощь при статистической обработке материала, A.C. Баранову за помощь при проведении морфогенетической обработки материала. Особую благодарность хотел бы выразить своему научному руководителю В.М. Захарову за внимательное отношение к моей работе и ценные критические замечания.

Глава 1. Характеристика подходов и объекта исследования

1.1. Флуктуирующая асимметрия, как мера морфогенетического гомеостаза

Для оценки стабильности развития нужно выявить не все фенотипическое разнообразие, а лишь ту его часть, которая является следствием нарушений развития. Это необходимо, поскольку те фенотипические различия между развивающимися индивидуумами, которые являются результатом генотипического их несходства или прямым следствием различий в условиях развития, свидетельствуют лишь о направленных изменениях креода и не дают информации о стабилизированности как таковой (Захаров 1987). Очевидно, что единственной формой изменчивости, удовлетворяющей этим требованиям, является случайная изменчивость развития, случайная в том смысле, что не может быть прямо объяснена генотипическими или средовыми различиями. Таким видом изменчивости является флуктуирующая асимметрия, которая представляет собой мелкие ненаправленные отклонения от билатеральной симметрии.

Флуктуирующая асимметрия возникает в связи с неспособностью организма развиваться строго по заранее детерминированному пути (Palmer, Strobeck 1986). Она выражается в нормальном (или биномиальном) распределении различий между сторонами, взятых со знаком и сходным средним развитием признака на каждой стороне (Van Valen 1962).

Флуктуирующая асимметрия охватывает практически всех особей в популяциях. Она находит выражение в самых различных признаках, причем наблюдаемые различия между сторонами

оказываются несходными как по направленности, так и по величине даже для соседних признаков. Возникновение флуктуирующей асимметрии не может быть объяснено генетическими или средовыми причинами, так как развитие признака на обоих сторонах тела происходит на основе одного и того же генотипа под влиянием одних и тех же условий среды (Mather 1953; Thoday 1955; De Marinis 1959; Reeve 1960).

Для объяснения причин возникновения флуктуирующей асимметрии была предложена гипотеза о независимости развития признака слева и справа (Астауров 1927; Latter 1964; Whitten 1966; Robertson 1965): при принципиально сходных морфогенетических процессах в развитии билатеральной структуры на разных сторонах тела в силу их нескоррелированности могут происходить те или иные независимые изменения. Повышение частот таких случайных событий находит отражение на фенотипическом уровне (Soûle 1982).

Таким образом, наблюдаемые при флуктуирующей асимметрии различия между сторонами можно рассматривать как проявление случайности, как следствие ошибок, шума или нарушений развития (Mather 1953; Reeve, Robertson 1953а; Robertson, Reeve 1952, 1955; Waddington 1957; Reeve 1960). Под нарушениями в данном случае подразумевается то, что наблюдаемые различия между сторонами являются свидетельством некоторого несовершенства развития, его неспособности к формированию идентичных фенотипов. Именно в этом смысле по возрастанию величины флуктуирующей асимметрии выявляется нарушение стабильности развития, т.е. снижение способности к развитию сходного фенотипического эффекта при данных условиях (Захаров 1987). Стохастическая

природа данной формы изменчивости не противоречит возможности существования генетического контроля ее уровня и зависимости от определенных внешних условий.

Ряд особенностей метода оценки состояния популяций при помощи флуктуирующей асимметрии делает его привлекательным для широкого применения. Одним из таких свойств является доступность для широкого использования. Для анализа требуется лишь точный учет величины различия в проявлении признака на разных сторонах тела. Важной чертой данного подхода является возможность его проведения лишь с использованием признаков внешней морфологии, что позволяет получать необходимую информацию в отношении живых объектов.

Проведение анализа при помощи флуктуирующей асимметрии возможно с использованием музейных коллекций, что дает возможность прослеживать изменения обстановки, происходившие в течение многих лет. В качестве примера такой оценки можно привести исследование флуктуирующей асимметрии Балтийских тюленей по признакам черепа (Zakharov, Yablokov 1990). Были обследованы музейные коллекции черепов тюленей из одной популяции, рожденных до сороковых годов, и после шестидесятых годов, т.е. до и после интенсивного загрязнения Балтики (в основном ДДТ и ПХБ). Было обнаружено, что флуктуирующая асимметрия резко возросла вследствие антропогенного воздействия.

Метод является чувствительным и позволяет улавливать негативные изменения, происходящие в популяциях, до того как они отразятся на параметрах приспособленности (Valentine et al. 1973; Clarke 1992). Универсальность данного подхода заключается в возможности его использования в отношении представителей

разных групп живых существ. Это связано с тем, что причинная обусловленность различий в значениях признаков на двух сторонах тела при флуктуирующей асимметрии оказывается принципиально сходной в отношении различных морфологических структур у самых разных видов (Захаров 1987).

1.2. Микроядерный тест, как мера цитогенетического гомеостаза

В природе существует множество факторов, вызывающих нарушения в генетическом аппарате клеток организма. Эти факторы могут быть как биологического, так и небиологического происхождения. К биологическим факторам, влияющим на уровень цитогенетических повреждений, можно отнести нервное, гуморальное воздействие, экзогенные биологические факторы, такие как вирусные инфекции, бактерии, паразиты. Однако наиболее остро в настоящее время стоят проблемы, связанные с мутационными изменениями, вызываемыми химическими и физическими агентами, образующимися вследствие хозяйственной деятельности человека.

Существуют разные методы учета цитогенетических повреждений, наиболее распространенным из которых является учет хромосомных аберраций в метафазных пластинках (Бактон, Эванс 1975; КПдегтап е! а1. 1975). Однако этот метод трудоемок и зачастую неудобен, особенно, когда изучаемый объект имеет большое число мелких хромосом. Проведение анализа хромосомных аберраций также затрудняется из за низкого числа метафазных пластинок. Такой тест применим только для клеток с высокой пролиферативной активностью.

Альтернативой классическому анализу метафазных пластинок может служить микроядерный тест, суть которого состоит в подсчете частоты клеток с микроядрами. Микроядра имеют вид небольших дополнительных ядер в цитоплазме. Причиной их возникновения является нарушение нормальной сегрегации отдельных хромосом при митозе вследствие повреждения веретена деления или образование ацентрических хромосомных фрагментов из-за хром�