Морфофункциональные изменения органов иммунной системы при конканавалин А-индуцированном гепатите

Обернихин, Сергей Станиславович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Морфофункциональные изменения органов иммунной системы при конканавалин А-индуцированном гепатите
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Морфофункциональные изменения органов иммунной системы при конканавалин А-индуцированном гепатите"

На правах рукописи

ОБЕРНИХИН СЕРГЕЙ СТАНИСЛАВОВИЧ

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ОРГАНОВ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ ПРИ КОНКАНАВАЛИН А-ИНДУЦИРОВАННМ ГЕПАТИТЕ

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Москва 2005

Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательском институте морфологии человека РАМН

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Болтовская Марина Николаевна

доктор медицинских наук, Бархина Татьяна Григорьена

доктор медицинских наук, профессор Ванько Людмила Викторовна

Ведущая организация-

Московская медицинская академия им. И М. Сеченова

Защита состоится 31 марта 2005 года в_часов на заседании

диссертационного совета (Д.001.004.1) ГУ НИИ морфологии человека РАМН по адресу: 117418, Москва, ул. Цюрупы, д.З.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ морфологии человека РАМН

Автореферат разослан «___»_2005 года

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат медицинских наук Л.П.Михайлова

4ШЗ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние годы возрастает частота заболеваемости гепатитом различной этиологии (вирусный гепатит, алкогольное и лекарственное поражение печени) (Онищенко Г.Г., Шахгильдян И.В., 1987; Серов В.В. и соавт., 2004). Вопросы патогенеза гепатитов различной этиологии изучены недостаточно. По данным литературы поражение печени может быть обусловлено прямым гепатотоксическим, опосредованным вирусами цитолитическим, иммунологическими механизмами (Серов В.В. и соавт., 2004). В последние годы, в связи с разработкой методов иммуномодулирующей терапии, наибольшее внимание привлекают иммунологические механизмы повреждения печени Основная роль в иммунологических механизмах повреждения печени принадлежит клеточным иммунологическим реакциям, опосредованным НК-клетками (натуральные киллеры) и, выделенным в самостоятельную субпопуляцию Т-лимфоцитов НКТ-клеткам (натуральные киллеры - Т-клетки) и цитокинам (Batey R., Cao Q., Gould В., 2002; Saito T. et al., 2004; SunR. et al., 2004).

Для выяснения роли клеточных иммунологических механизмов в развитии патологических процессов в печени на современном этапе наиболее адекватной моделью является модель Кон А-индуцированного гепатита (Tiegs G. et al., 1992; Nicoletti F. et al., 1997). В развитии индуцированного Кон А гепатита важную роль играет активация клеточного звена иммунитета и продукция цитокинов' фактора некроза опухоли (ФНО)-а, интерлейкина (ИЛ)-2 и интерферона (ИФН)-у, ИЛ-4 и ИЛ-10 (Kato M. et al., 2001; Tsutsui H. et al., 2003; Yamanaka A. et al, 2004; Ma X. et al., 2004). Для понимания иммунологических механизмов Кон А-индуцированного гепатита необходимо изучение действия Кон А в системе in vivo на различные звенья иммунитета, патоморфологических особенностей действия этого лектина на органы иммунной системы и печени. Несмотря на почти тридцатилетнюю историю изучения этого митогена,

рос. и5

Бй; Л,ч

С.! ¡í.f?o>Ki

гоа^рк_

морфологические изменения органов иммунной системы при воздействии Кон A in vivo описаны фрагментарно (Okamoto T. et al., 1998; Ksontini R et al., 1998). . Это, по-видимому, связано с тем, что Кон А, являясь мощным "пан-Т-клеточным митогеном", активно изучался преимущественно в иммунологическом аспекте. Большинство работ, связанных с анализом функциональных изменений иммунной системы при Кон А-индуцированном гепатите, посвящены главным образом цитокиновому каскаду (Tsutsui H et al, 2003; Yamanaka A. et al, 2004; Ma X et al., 2004), характеристике иммунокомпетентных клеток по кластерам дифференцировки, т е CD-маркерам клеточной поверхности (Batey R , Cao Q , Gould В , 2002; Saito T et al., 2004; Sun R. et al., 2004) и молекулярным механизмам повреждения гепатоцитов (Okamoto T., 2000). Оценка таких функциональных параметров иммунной системы, как спонтанная и индуцированная пролиферативная активность лимфоцитов, способность к генерированию цитотоксического и супрессорного ответа, на модели экспериментального Кон А-индуцированного гепатита не проводилась В литературе существуют лишь единичные данные о структурных изменениях печени при действии Кон А Эти разрозненные результаты не дают представления о динамике процессов, протекающих в печени и органах иммунной системы при экспериментальном гепатите (Ksontini R. et al., 1998; Tiegs G. et al. 1992; Hentze H. et al, 2000; Santucci L. et al. 2000). Гистологическое исследование печени мышей C57BL/6 через 1 сутки после однократного введения Кон А выявило мелкие фокальные зоны некроза с умеренной воспалительной инфильтрацией портальных зон. В селезенке Кон А индуцировал геморрагический некроз и реактивное развитие герминативные центров (Okamoto T et al., 1998; Ksontini R. et al., 1998). Таким образом, динамика изменений печени, тимусе и селезенки при Кон-индуцированном гепатите не изучена.

Исходя из этого, мы сочли необходимым детально изучить в динамике морфологические изменения в печени, селезенке и тимусе и сопоставить их с

динамикой развития иммунологических реакций при Кон А-индуцированном гепатите.

Цель исследования Изучить морфофункциональные изменения иммунной системы в динамике при экспериментальном Кон А-индуцированного гепатите.

Научная новизна Впервые охарактеризована динамика морфологических изменений в печени и органах иммунной системы при Кон А-индуцированном гепатите.

Впервые данные морфологического исследования органов мишеней соотнесены с результатами функциональных тестов в процессе развития экспериментального кон А-индуцированного гепатита

При анализе динамики Кон А-индуцированного гепатита показано, что в течение первых трех суток происходит нарастание дистрофических и некротических изменений в печени, сопровождаемых развитием геморрагических некрозов селезенки.

В динамике Кон А-индуцированного гепатита в первые трое суток функциональная пролиферативная и цитотоксическая активность лимфоцитов возрастает, что сочетается с прогрессированием альтеративных (дистрофических и некротических) изменений в печени.

В тимусе при Кон А-индуцированном гепатите развивается и прогрессирующе нарастают морфологические проявления акцидентапьной инволюции.

В селезенке в 1-е сутки отмечается опустошение Т-зон, что, по-видимому, обусловлено миграцией активированных лимфоцитов в барьерные ткани В последующие сроки на фоне нормализации пролиферативной активности лимфоцитов отмечается восстановление и гиперплазия Т- и В-зон селезенки

Практическое значение работы. Полученные в работе данные о динамике морфологических изменений иммунной системы при индуцированном Кон А гепатите могут быть использованы для доклинической оценки

иммуномодулирующих и гепатопропротекгорных фармакологических препаратов.

Данные о высоком пролиферативном ответе клеток селезёнки, через 1 сутки после введения 10 мг/кг Кон А, позволяют рекомендовать использование этих клеток в тест- системе для определения активности ИЛ-2, т к этот тест по сравнению со стандартным является менее трудоемким и более информативным.

Апробация работы Основные положения работы доложены и обсуждены на научной конференции ГУ НИИ морфологии человека РАМН "Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии" (Москва, 2003, 2004 гг), межлабораторной конференции ГУ НИИ морфологии человека РАМН (Москва, 2004 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы

Структура и объём работы. Диссертация изложена на страницах машинописного текста, состоит из введения, глав обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов собственных исследований, выводов и списка литературы иллюстрирована 25 рисунками, 1 таблицей Библиография включает 19 отечественных и 90 зарубежных источников

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы

Экспериментальные животные В опытах были использованы мыши-самцы инбредной линии ВАЬВ/с, массой тела 18-20 г (питомник Столбовая).

Индукция гепатита Конканавалином А Мышам опытной группы (20 мышей) с целью моделирования гепатита вводили под эфирным наркозом в ретроорбитальный синус Кон А в дозе 10 мг/кг массы тела в 200 мкл физиологического раствора. Мышам контрольной группы вводили 200 мкл физиологического раствора. Животных забивали на 1-е, 2-е, 3-й и 7-е сутки

после введения Кон А (по 5 мышей в каждой группе) под эфирным наркозом методом цервикальной дислокации При работе с экспериментальными животными руководствовались приказом Минздрава СССР №755 от 12.08.1977 г.

Методы исследования. Гистологические. Печень, селезенку и тамус фиксировали в 10% растворе забуференного формалина Фиксированный материал проводили по спиртам восходящей концентрации, заливали в парафин Изготовляли гистологические срезы и окрашивали их гематоксилином и эозином

Биохимические Для определения каталитической активности аспартатаминотрансферазы (ACT) и аланинаминотрансферазы (AJIT) в сыворотке крови использовали стандартные тест-системы фирмы "PLIVA -Lachema as", Чешская Республика Иммунологические методы исследования

Приготовление суспензий лимфоцитов Из селезенки мышей с помощью гомогенизатора Потгера выделяли спленоциты Для индукции синтеза и секреции ИЛ-2 суспензию клеток селезенки в концентрации 5x10б кл/мл культивировали в среде RPMI 1640 с 5% фетальной сыворотки и добавлением Кон А в конечной концентрации 5 мгк/мл. Оценка спонтанной пролиферации Клетки селезёнки вносили в лунки 96-луночного плейта по 100 мкл в концентрации 2*106 клеток/мл и 100 мкл среды содержащей меченный 3Н-тимидин с активностью (1 MKCi), инкубировали 4 часа при в С02-инкубаторе Индекс стимуляции (ИС) рассчитывали по формуле:

ИС=К/С,

где К - включение 3Н-тимидина в клетки селезёнки после внутривенного введения Кон А, С - включение 3Н-тимидина в клетки селезёнки интактных мышей.

Оценка пролиферации лимфоцитов в реакции бласттрансформации (РБТ) В лунки 96-луночного кругло донного плейта вносили по 100 мкл клеток

селезйнки мышей в концентрации 2*106 клеток /мл и Кон А (5 мкг/мл) Микроплейт инкубировали 72 часа при 37°С в С02-инкубаторе За 4 часа до окончания инкубирования в лунки вносили по 1 мкСл 3Н-тимидина Индекс стимуляции пролиферации в реакции бласлрансформации (ИБ) определяли по формуле: ИБ= А/В,

где А - Кон А -стимулированная пролиферация клеток селезёнки, В -пролиферация клеток селезёнки в среде.

Оценку пролиферации клеток на ИЛ-2 проводили, как описано в методике бласлрансформации, только вместо Кон А вносили ИЛ-2 с таким расчётом, чтобы конечная концентрация ИЛ-2 составляла 500 Ед/мл Индекс пролиферации определяли по формуле: ИП=С/В,

где С - ИЛ-2-стимулированная пролиферация клеток селезёнки, В -пролиферация клеток селезёнки в среде.

Получение 96-часовых Кон А-бластов Клетки селезенки в концентрации 5x106 кл/мл культивировали в СО2 инкубаторе в течение 96-часов в среде Ю>М1 1640 с 5% фетальной сыворотки и добавлением Кон А в конечной концентрации 5 мгк/мл.

Оценка уровня ИЛ-2 Активность ИЛ-2 в тест-образцах определяли на 96-часовых Т-клеточных Кон А-бластах В лунки 96-луночного круглодонного плейта вносили серийные двукратные разведения тест-супернатантов в объёме 0,1 мл (в контроле 0,1 мл среды, содержащей 5 мкг/мл Кон А) и добавляли 0,1 мл суспензии Кон А-бластов Микроплейт инкубировали 24 часа СОг-инкубаторе. За 4 часа до окончания инкубирования в лунки вносили 1 мкО 3Н-тимидина Реакцию оценивали с помощью индекса пролиферации ИП=А/В,

где А - включение метки (имп/мин) в опыте, В - включение 3Н-тимидина в контроле Реакцию с включением 3Н-тимидина оценивали на (3-спектрометре фирмы "ЬКВ", Финляндия.

Определение клеточной цитотоксичности. В качестве мишеней использовали клетки лимфомы EL-4 и YAC-1, культивируемых in vitro Концентрацию клеток доводили до 2*106 клеток/мл, после чего вносили изотоп 51Сг в дозе 100 mkCí и инкубировали в течение часа После трёхкратной отмывки клетки эффекторы смешивали с клетками мишенями в соотношениях 100 1, 50 1 и 101 Затем микроплейты центрифугировали и инкубировали 16 часов в СОг-инкубаторе Для оценки индекса цитотоксичности (по уровню метки во внеклеточном пространстве) отбирали супернатанты и подсчитывали на у-счётчике.

Каждый вариант воспроизводили в трех параллелях, а результат выражали в %, вычисляя по формуле:

выход 5|Сг в опыте - спонтанный выход 51Сг

% лизиса -

максимальный выход 51Сг - спонтанный выход 31Сг

Реакцию с включением 51Сг оценивали на у-спектрометре фирмы "LKB", Финляндия.

Статистическая обработка результатов

Достоверность различий сравниваемых показателей оценивали по t-критерию Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Морфологические и биохимические изменения печени в динамике Кон А-индуцированного гепатита у мышей BALB/c

При гистологическом исследовании печени контрольной группы мышей линии BALB/c патологических изменений не выявлено Балочное и дольковое строение печени сохранено Гепатоциты без дистрофических изменений В строме портальных трактов единичные лимфоциты и гистиоциты.

На 1-е сутки после введения Кон А гепатоциты с явлениями диффузной мелкокапельной дистрофии, мелкие множественные очаги

некрозов, захватывающие 3-5 гепатоцитов, и единичные, более крупные очаги некрозов из нескольких десятков клеток. Вокруг зон некроза выявлялись единичные нейтрофилы и гистиоциты. По ходу стромы портальных трактов определялась инфильтрация единичными гистиоцитами и лимфоцитами. Синусоидные капилляров, венулы и мелкие вены были полнокровны.

На 2-е сутки после введения Кон А выявлялась морфологическая картина острого гепатита, выраженность и распространенность некрозов в печени увеличивались. Вокруг очагов некрозов определялась скудная воспалительная инфильтрация из нейтрофилов, единичных лимфоцитов и гистиоцитов. Гепатоциты вне зоны некроза были с явлениями мелкокапельной вакуольной и баллонной дистрофии. По ходу портальных трактов наблюдалась слабовыраженная инфильтрация лимфоцитами и гистиоцитами Определялось полнокровие синусоидных капилляров На 3-й сутки морфологические проявления острого некротического гепатита по выраженности и распространённости очагов некроза и дистрофических изменений гепатоцитов не отличались от выявленных на 2-е сутки после введения Кон А. В отличие от 2-х суток отмечалось увеличение плотности инфильтрата вокруг зон некрозов и повышение внутри долек числа лимфоцитов и непаренхиматозных клеточных элементов, представленных клетками Купфера, звёздчатыми эндотелиоцитами, клетками Ито и лимфоцитами.

На 7-е сутки после введения Кон А выраженность некротических и дистрофических изменений в печени не отличалась от таковых на 3-й сутки. Вокруг очагов некроза наряду с воспалительной инфильтрацией из гистиоцитов и лимфоцитов отмечалась слабовыраженная фибробластическая реакция.

По данным биохимического исследования на 1-е сутки после введения Кон А уровень аминотрансфераз AJIT и ACT достоверно повышался и оставался высоким на 2-е и 3-й сутки. На 7-е сутки отмечалась тенденция к

снижению показателей уровня AJIT и ACT, но контрольных значений они не достигали.

Таким образом, при морфологическом исследовании печени мышей BALB/c после введения Кон А в дозе 10 мг/кг массы тела выявлен острый гепатит с обширными очагами некрозов Через 24 часа после введения Кон А в печени определялись дистрофические изменения гепатоцитов и мелкие очаговые некрозы На 2-е сутки на фоне нарастающих дистрофических изменений гепатоцитов увеличивалась распространенность и выраженность очагов некроза и вокруг них выявлялась перифокальная воспалительная реакция На 3-й и 7-е сутки в демаркационной зоне отмечалось нарастание воспалительных изменений, сочетавшееся с фибробластической реакцией.

Полученные нами данные о развитии острого некротического гепатита при введении Кон А согласуются с данными литературы (Tiegs G et al, 1992; Toyabe S. et al. 1994; Mizuhara H., 1994; Ksontini et al, 1998; Bonder С at al, 2004) В отличие от указанных работ, в настоящем исследовании изучена динамика развития патологического процесса. Показано, что на 2-3-и сутки Кон А-индуцированного гепатита усиливается выраженность дистрофических и некротических процессов в печени, нарастает воспалительная реакция. На 7-е сутки по сравнению с 3-ми увеличения выраженности некротических и дистрофических процессов не отмечалось, вокруг зон некрозов воспалительная инфильтрация из лимфоцитов и гистиоцитов сочеталась с фибробластической реакцией.

Динамика морфофункциональных реакций иммунной системы при экспериментальном Кон А-индуцированном гепатите

В контрольной группе мышей при гистологическом исследовании селезёнки в ней преобладала белая пульпа Часть фолликулов была со светлыми центрами Периартериолярные лимфоидные муфты представлены 8-15 рядами клеток. Красная пульпа умеренноклеточная, с диффузно рассеянными лимфоцитами и гистиоцитами, образующими

"монослой". В тимусе животных контрольной группы кора широкая, плотно заполнена лимфоцитами. Граница между корковым и мозговым слоем чёткая, в мозговом слое преобладают эпителиальные клетки. Тельца Гассаля 1-2 фаз развития, мелкие, образованы 3-5 эпителиальными клетками

Спонтанная пролиферация клеток селезёнки интактных животных составляла около 2000 имп/мин, что характеризует умеренную пролиферативную активность (рис 1). Индекс пролиферации в РБТ был высоким (рис 2), а при ответе клеток селезенки на экзогенный ИЛ-2 -минимальным (рис. 3).

На 1-е сутки после введения Кон А в селезенке в субкапсулярной зоне выявлялись обширные очаги геморрагических некрозов, резко выраженное полнокровие. Преобладала красная пульпа Белая пульпа занимала 30-40% площади среза Лимфоидные фолликулы со светлыми центрами, в клетках которых выражены явления кариорексиса. Периартериолярные лимфоидные муфты образованы 4-7 рядами лимфоцитов. В красной пульпе снижена клеточность, резко выраженное полнокровие, диффузно рассеянные нейтрофилы, очаговый гемосидероз. На 1-е и 2-е сутки после введения Кон А в тимусе выявлена акцидентальная инволюция 1-2 стадии. Корковый слой тимуса характеризовался картиной "звездного неба" вследствие увеличения числа макрофагов. Субкапсулярная зона коркового слоя была расширена за счет увеличения числа бластных форм лимфоцитов. Граница между корковым и мозговым слоями нечеткая. В мозговом слое большое количество гибнущих клеток с явлениями кариорексиса. Тельца Гассаля 1-2 фаз развития представлены 3-5 эпителиальными клетками.

По данным литературы на ультраструктурном уровне показано, что наиболее ранним событием (4 часа после введения Кон А) является адгезия лимфоцитов к эндотелию сосудов. В это же время начиналось разрушение эндотелиальных клеток и гепатоцитов. Часто наблюдалось непосредственное

б 18 48 72

Время (час.), прошедшее после введения Кон А

Рис. 1. 4-х часовая спонтанная пролиферация клеток селезёнки мышей Balb/c после внутривенного введения 200 мкгКонА

------контроль

Достоверность различий по сравнению с контролем: * - р<0,001 **-р<0,1

150 -

100

50 -

. . I

Контроль 18 48 72 168

Время (час ), прошедшее после введения Кон А

Рис. 2. Пролиферация клеток селезёнки в РБТ у интактных мышей (□) и после внутривенного введения Кон А в дозе 200 мкг/мышь (■)

Достоверность различий по сравнению с контролем: * - р<0,001

Интактные 18 72

Время (час.), прошедшее после введения КонА

Рис 3 Пролиферация клеток селезёнки мышей в ответ на рекомбинантный человеческий ИЛ-2 после внутривенного введения 200 мкг Кон А.

Достоверность различий по сравнению с контролем: * - р<0,001

взаимодействие между активированными макрофагами и лимфоцитами (Tiegs G. et al., 1992). Поэтому мы сочли целесообразным оценить спонтанную пролиферативную активность лимфоцитов на более раннем сроке патологического процесса. Однако, через 6 часов после введения мышам Кон А спонтанная пролиферативная активность достоверно не изменялась. Через сутки она достигала максимального уровня, который оставался достоверно высоким в течение последующих 3-х суток (см. рис.1) По сравнению со спленоцитами интактных мышей, клетки селезенки, выделенные через 1 сутки после введения Кон А отвечали на этот митоген значительно слабее, при этом резко усиливалась пролиферация в ответ на экзогенный ИЛ-2 (см. рис. 2-3).

Для определения активности ИЛ-2 сравнивали показатели пролиферативного ответа на ИЛ-2 4-х дневных Кон А бластов интактных мышей с клетками селезёнки мышей, которым за 1 сутки до поставленного теста вводили 10 мг/кг Кон А Пролиферативный ответ на ИЛ-2 клеток селезенки, полученных через 1 сутки после введения Кон А по сравнению с ответом в стандартной системе был достоверно более высоким (таблица 1) Уровень пролиферативного ответа спленоцитов Кон А-стимулированных мышей как на рекомбинантный ИЛ-2, так и на культуральный крысиный супернатант, содержащий ИЛ-2, спленоцитов, был в несколько раз выше, чем у Кон А-бластов. Полученные данные о высоком пролиферативном ответе клеток селезёнки, полученные через 1 сутки после введения 10 мг/кг Кон А, позволяют рекомендовать их к использованию в тест- системе для определения активности ИЛ-2, т.к. этот тест по сравнению со стандартным является менее трудоемким и более информативным.

Для определения цитотоксической активности спленоцитов мышей BALB/c использовали меченные 51 Cr клетки опухолевых линий YAC-1 и EL-4, культивируемых in vitro. Выявлено увеличение цитотоксической активности в отношении мишени YAC-1 как у опытных, так и у контрольных животных, в то время как против мишени EL-4

Таблица 1

Чувствительность к ИЛ-2 4-х дневных Кон А-бластов, индуцированных in vitro, и спленоцитов, полученных через 1 сутки у мышей BALB/c после внутривенного введения Кон А

Вид ИЛ-2 Доза или разведение Включение 3Н-тимидина имп/мин (М±ш) Достоверность различий

Кон А-бласты Спленоциты, активированные Кон А in vivo

Контроль (среда RPMI 1640) - 59+3 117+5 <0,01

2500 904+91 42845+2821 <0,001

ИЛ-2 рекомбинантный 625 1242+98 44835+1789 <0,001

человеческий (ед/мл) 156 1030+135 4845+146 <0,05

40 547+57 973+41 <0,001

1:2 2851+217 22469+4057 <0,001

ИЛ-2 культуральный крысиный 1:8 2868+27 5347+49 <0,001

1:32 785+34 598+35 <0,05

1:128 333+45 276+71 >0,05

литическая активность не проявлялась. Так как молекулы адгезии играют существенную роль в развитии Кон А-индуцированного гепатита, мы проводили сравнение цитотоксичности клеток селезенки, фракционированных по адгезивным свойствам Прилипающая фракция клеток селезёнки, полученная от интактных животных, обладала большей цитотоксичностью в отношении мишени YAC-1, чем та же фракция, полученная от мышей с экспериментальным гепатитом Цитотоксичность в отношении мишени EL-4 в прилипающей популяции клеток селезенки была достоверно выше у мышей с Кон А- индуцированным гепатитом по сравнению с контрольными животными (рис 4)

Таким образом, через 1 сутки после введения Кон А при морфологическом исследовании в селезенке обнаружено опустошение белой пульпы с редуцированием Т-зоны, в тимусе выявлена акцидентальная инволюция 1-2 ст В функциональных тестах показано, что уже через сутки резко возрастает индекс спонтанной пролиферации in vitro При этом в классической постановке реакции бластгрансформации уровень пролиферативного ответа клеток селезёнки на Кон А снижается В то же время мы наблюдаем резкое увеличение пролиферативного ответа на ИЛ-2 Снижение пролиферативного ответа на Кон A in vitro можно было бы объяснить более ранней активацией лимфоцитов in vivo, когда первые стадии возбуждения Т-клеток уже прошли Однако при этом эти клетки активно отвечали на экзогенный ИЛ-2, и, можно было предположить, что в клеточной культуре снижается количество ИЛ-2, который является фактором роста Т-лимфоцитов Однако в супернатанте клеток полученных от интактных животных и животных после внутривенного введения Кон А количество ИЛ-2 достоверно не отличалось Что же касается несоответствия между резким

увеличением спонтанного пролиферативного ответа и морфологической картиной, опустошения Т-зон селезенки, то данный феномен можно объяснить интенсивной миграцией активированных лимфоцитов в печень и барьерные ткани (Хаитов Р М , Лесков В П , 2001)

о ж а-к

0 а

к Я

1 г

_ ■

н-и

■

Рис.4. Цитотоксическая активность спленоцитов в прилипающей (□) и общей (■) популяции спленоцитов интактных (1) и мышей с Кон А-индуцированным гепатитом, через 1 сутки после введения (2)

Достоверность различий по сравнению с контролем: * -р<0,001

В селезенке на 2-е сутки после введения Кон А около 40% площади среза представлено белой пульпой Фолликулы со светлыми центрами с явлениями кариорексиса Периартериолярная лимфоидная ткань представлена 6-10 рядами лимфоцитов. Красная пульпа умеренно полнокровная В ней преобладают диффузно рассеянные лимфоциты, которые составляют 5-10% общей популяции клеток красной пульпы В субкапсулярной зоне встречаются обширные единичные очаги геморрагического некроза Зоны геморрагических некрозов отделены от сохранённой ткани клеточным валом из гистиоцитов и лимфоцитов.

На 3-й сутки после введения Кон А 60-70% площади гистологических срезов селезёнки представлены белой пульпой. Лимфоидные фолликулы крупные со светлыми центрами Периартериолярная лимфоидная ткань представлена 10-25 рядами клеток. В красной пульпе клеточные элементы образуют "монослой" и представлены лимфоцитами и гистиоцитами с примесью небольшого количества нейтрофилов Вокруг уплотнившихся субкапсулярных очагов некроза диффузная инфильтрация лимфоцитами гистиоцитами и нейтрофилами с начальными явлениями фибробластической реакции, очаговый гемосидероз.

На 3-е сутки после введения Кон А в тимусе явления акцидентальной инволюции 2-3 стадии. Корковый слой очагово опустошен, представлен узкой прерывистой полосой из лимфоцитов. Мозговой слой широкий с нечёткими границами и умеренным числом лимфоцитов Число телец Гассаля увеличено, они 3-4 фаз развития

Уровень спонтанной пролиферации на 3-й сутки развития Кон А-индуцированного гепатита оставался высоким, а индекс пролиферации в РБТ - сниженным (см. рис 1-2) Реакция клеток селезенки в ответ на ИЛ-2 снижалась, ее показатели достоверно не отличались от показателей в контрольной группе.

Таким образом, на 2-3-е сутки развития экспериментального гепатита в тимусе нарастает выраженность инволютивных изменений, в селезенке

отмечается тенденция к восстановлению функциональных зон Наряду с этим индекс спонтанной пролиферации оставался высоким, однако, ответ на ИЛ-2 снижаался, что по-видимому свидетельствует о значительном уменьшении уровня экспрессии рецепторов к ИЛ-2 на 3-й сутки.

В селезёнке на 7-е сутки после введения Кон А белая пульпа составляет около 60% площади гистологического среза. Фолликулы со светлыми центрами В светлых центрах небольшое количество распадающихся клеток с явлениями клазматоза ядер. Периартериолярные лимфоидные муфты представлены 10-30 рядами клеток Красная пульпа умеренно полнокровная, в ней преобладают лимфоциты, гистиоциты и определяются диффузно-рассеянные нейтрофилы В белой пульпе умеренное количество клеточных элементов, представленных, в основном, лимфоцитами Нейтрофильная реакция была менее выражена по сравнению с более ранними сроками развития гепатита. Определялись единичные очаги субкапсулярных геморрагических некрозов, в демаркационной зоне которых в отличие от 3-х суток определялась более выраженная фибробластическая реакция

На 7-е сутки после введения Кон А при гистологическом исследовании в тимусе выявлена картина акцидентальной инволюции тимуса 2-3 стадии В корковом слое диффузно-очаговое опустошение, границы мозгового и коркового слоя не четкие. По сравнению с предыдущим сроком количество тимических телец Гассаля увеличено, они 3-4 фаз развития располагаются и в корковом слое

Показатели спонтанной пролиферации спленоцитов, индекс пролиферации их в РБТ, а также в ответ на ИЛ-2 не отличался от такового в контрольной группе животных (см рис. 1-3)

Таким образом, на 7-е сутки после введения Кон А в тимусе выявляется акцидентальная инволюция 2-3 ст., в селезенке отмечается гиперплазия функциональных зон. Показатели спонтанной и индуцированной пролиферативной активности в эти сроки экспериментального гепатита нормализуются.

Нами впервые показано, что внутривенное введение Кон А мышам приводит к существенным морфологическим изменениям как в одном из центральных органов иммунной системы, тимусе, так и в периферическом лимфоидном органе, селезенке.

Тимус реагирует на системное введение Кон А неспецифической реакцией, а именно акцидентальной инволюцией По данным литературы она развивается на фоне общего адаптационного синдрома, где ключевую роль играют глюкокортикостероиды, вызывающие нарастающую альтерацию кортизон-чувствительных лимфоцитов К ним, в первую очередь, относится субпопуляция фенотипически и функционально незрелых малых Т-лимфоцитов, локализующихся, преимущественно, в субкапсулярной зоне ( Dourov N.,1986; Marinova T.,2005).

Под воздействием Кон А происходит пролиферация Т-лимфоцитов, что сопровождается выбросом значительного количества цитокинов, которые, в свою очередь, непосредственно влияют на нейроэндокринные центры гипоталамуса. Это приводит к активации гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы и, как следствие, к повышению уровня глюкортикоидов в крови (Besedovsky H.et al ,1984; Martin J.,1984; Гринцевич И.И.,1989; Islander U.et al.,2005).

Выявленное нами возрастание количества телец Гассаля и их нетипичное распределение в тимусе может быть обусловлено как непосредственным или опосредованным через элементы цитокинового каскада токсическим воздействием КонА на эпителий тимуса, так и нарушением коммуникаций эпителиальных клеток с тимоцитами.

Вследствие акцидентальной инволюции блокируется экспорт созревающих клеток в периферические лимфоидные органы, в частности в селезенку.

В селезенке изначальное опустошение периартериолярных муфт может быть обусловлено интенсивной миграцией активированных Т-лимфоцитов в печень и, возможно, в барьерные ткани. Наблюдаемая в селезенке, начиная с

3-го дня гиперплазия периартериолярных лимфоидных муфт, то есть Т-клеточной зоны, не может быть связана с поступлением вновь образуемых Т-лимфоцитов из тимуса Очевидно, в основе гиперпластического процесса лежит нарушение гомеостатической пролиферации Т-лимфоцитов. Запуск этого процесса осуществляется через низкоаффинное распознавание Т-лимфоцитами собственных пептидов в контексте молекул главного комплекса гистосовместимости и уровень пролиферации определяется обширностью пустующих лимфоидных пространств (Surh C.D., Sprent J., 2002)

Обширные деструктивные изменения в печени после внутривенного введения Кон А могут быть обусловлены множественными механизмами Кон А не оказывает прямого гепатотоксического действия. Как известно, ведущая роль в развитии Кон А-опосредуемого гепатита принадлежит Т-лимфоцитам, NKT- и NK-клеткам, оказывающим прямой и/или опосредуемый цитокинами (интерферон-у, фактор некроза опухоли и др.) цитотоксический эффект. Согласно нашим данным уже с первых суток после введения Кон А нарастает инфильтрация печени лимфоцитами.

Массивность поражения печени можно объяснить эндотоксинемией, возникающей вследствие нарушения кровотока и возрастания проницаемости брыжеечных сосудов из-за начального поражения органа, опосредуемого Кон А. Сходные морфологические изменения печени наблюдают при моделировании гепатита путем непосредственного введения животным липополисахарида (Streetz К. et al., 2003).

Известно, что бактериальный липополисахарид индуцирует выработку панели цитокинов, способствующих развитию патологических процессов в печени. В то же время этот набор включает интерлейкин 6 - цитокин, обладающий гепатопротективным эффектом, обеспечивающим постепенное затухание активного патологического процесса в печени (Sun R. et al, 2004), что мы и наблюдали, начиная с 3 дня после введения Кон А.

Таким образом, механизмы патогенеза гепатита в результате

воздействия Кон А связанны как непосредственно с клеточной

цитотоксичностью, так и с опосредованным воздействием через цитокины.

ВЫВОДЫ

1. По данным морфологического исследования у мышей ВАЬВ/с после введения Кон А в дозе 10 мг/мышь развивается острый некротический гепатит, характеризующийся в динамике на 1-3-и сутки увеличением распространенности и выраженности дистрофических изменений гепатоцитов и очагов некроза и сочетанием поражения печени с геморрагическими некрозами селезенки.

2. В тимусе, начиная с 1-х суток развития экспериментального гепатита, выявляется акцидентальная инволюция, выраженность которой нарастает к 7 суткам.

3. В селезенке на 1-2-е сутки происходит опустошение белой пульпы с редуцированием Т-зон, образованием очагов геморрагических некрозов, но уже на 3-й сутки отмечается тенденция к восстановлению функциональных зон, которые претерпевают гиперплазию на 7 сутки

4 Спонтанная пролиферативная активность клеток селезенки возрастает на 1-е сутки, поддерживается на высоком уровне до 3 суток и нормализуется на 7-е сутки.

5 Пролиферативный ответ клеток селезенки мышей на интерлейкин-2 повышен на 1-е сутки и снижается на 3-й сутки, приближаясь к базовому уровню.

6. В динамике Кон А-индуцированного гепатита в первые 3 суток пролиферативная и цитотоксическая активность лимфоцитов возрастает, что сочетается с прогрессированием альтеративных (дистрофических и некротических) изменений в печени. В последующие сроки пролиферативная активность лимфоцитов нормализуется, что согласуется с позитивными морфологическими изменениями в селезенке (восстановление и гиперплазия функциональных зон).

Список работ опубликованных по теме диссертации:

1 Рахмилевич A.J1. , Рахимова М.С, Обернихин С.С Увеличение чувствительности спленоцитов мышей на ИЛ-2 после введения in vivo липополисахарида, мурамилдипептида и Конканавалина А. //Антибиотики и химиотерапия. - 1989. - т.34, -№11. - с.839-841.

2. Рахмилевич A.JI., Обернихин С С. Усиление чувствительности клеток селезёнки мышей к интерлейкину-2 после внутривенного введения конканавалина А. //Иммунология. - . - 1990. - №1. - с.68-69.

3. Обернихин С.С. Изменение пролиферативного ответа спленоцитов мышей при Кон А-индуцированном повреждении печени. Сб. научн трудов «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии» Москва, 2003, стр. 78-80.

4. Обернихин С С., Малайцев В.В., Болтовская М.Н., Макарова О.В. Пролиферативная активность лимфоцитов селезёнки и печени при Кон А-индуцированном остром гепатите. Сб. научн. трудов «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии». Москва, 2003, стр. 78-80.

Соискатель

ООО «ТРАНСКОПИ» ул. Новая Басманная, Д.4/6 Зак. а тир. Ш эю. 2005; г.

s i

)

t s i i

[ J

i t

I ¡

РНБ Русский фонд

2005-4 45893

■ti \

fi tiH

Содержание диссертации, кандидата технических наук, Обернихин, Сергей Станиславович

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общая характеристика Кон А.

1.2. Иммунологические аспекты действия Кон А.

1.3. Роль клеточных популяций в развитии гепатита.

1.4. Роль адгезии лимфоцитов в развитии гепатита.

1.5. Роль цитокинов в развитии гепатита.

1.6. Морфологическая характеристика модели Кон А-индуцированного гепатита.

Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Морфологические изменения внутренних органов мышей линии BALB/c после введения Кон А.

3.2. Функциональные изменения иммунной системы мышей линии BALB/c после введения Кон А.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ СОБСТВЕННЫХ

ИССЛЕДОВАНИЙ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Морфофункциональные изменения органов иммунной системы при конканавалин А-индуцированном гепатите"

Актуальность темы. В последние годы возрастает частота заболеваемости гепатитом различной этиологии (вирусный гепатит, алкогольное повреждение печени). Только от вирусного гепатита пострадало более 2 миллиардов человек в мире. Патогенез развития некоторых форм гепатита до сих пор остаётся невыясненным. В ряде работ показано, что конканавалин А (Кон А) является хорошим индуктором для создания модели гепатита (Tiegs G. et al., 1992; Nicoletti F. et al., 1997). Некоторые авторы придерживаются мнения о том, что алкогольное (Batey R.G. et al.,2002) и вирусное (Lasarte J. et al, 2003) повреждение печени имеет сходную природу с Кон А-индуцированным гепатитом и связано с активацией Т-лимфоцитов.

Кон А — лектин, широко применяемый в иммунологии как Т-клеточный митоген. Достаточно хорошо изучено активирующее влияние Кон А на лимфоциты. В конце 60-х начале 70-х годов появилось большое количество работ по активации Кон А антигеппеспецифических Т-супрессоров. Было показано, что Кон А приводит к значительной супрессии первичного и вторичного иммунного ответа на эритроциты барана, генерировании цитотоксичесих Т-клеток в смешанной культуре лимфоцитов (CKJI), а также антительного ответа. Была исследоваиа не только супрессия клеточной цитотоксичности, но и перенос её клетками перитонеального экссудата при внутрибрюшинной инъекции Кон А. Отмечали замедление отторжения трансплантанта у животных, которым вводили Кон А. Однако, в дальнейшем, было обнаружено, что Кон А активирует также и хелперпое звено иммунитета. Имеются факты, свидетельствующие об активирующем влиянии Кон А на лимфоциты: выработка интерлейкина (ИЛ)-2, генерирование неспецифических киллеров, индукция пролиферации лимфоцитов и повышение уровня экспрессии рецепторов к ИЛ-1.

Выяснение механизмов повреждения печени играет серьёзную роль в понимании патогенеза гепатита и поиске оптимальных способов его лечения.

В последние годы нарастает количество работ, посвященных влиянию Кон А на печень. Так показано, что при развитии индуцированного Кон А гепатита важную роль играют цитокины: фактор некроза опухоли (ФНО)-а, ИЛ-2 и интерферон-у, увеличивается содержание ИЛ-4 и ИЛ-10. Наряду с этим происходит активация клеточного звена иммунитета (Kato М. et al., 2001). Таким образом, Кон А-индуцированное повреждение печени является адекватной экспериментальной моделью гепатита.

Остаются невыясненными механизмы действия Кон А в системе in vivo на различные звенья иммунитета, патоморфологические особенности действия лектина на органы иммунной системы и печени. Несмотря на почти тридцатилетнюю историю изучения этого митогена, морфологические особенности действия Кон A in vivo описаны чрезвычайно скудно. Это, по-видимому, связано с тем, что Кон А, являясь мощным "пан-Т-клеточным митогеном", активно изучался только в иммунологическом аспекте и был обделён вниманием морфологов. Достаточно большое количество работ, появившихся в последние годы по данной теме лишь подтвердили вышеизложенное. Исходя из этого мы сочли необходимым более детально изучить морфологические изменения в печени, селезенке и тимусе, т. к. в формирование гепатита вовлекаются и органы иммуногенеза, не оставляя без внимания, при этом, и некоторые иммунологические аспекты данной модели.

Цель исследования. Изучить морфофункциональные изменения иммунной системы в динамике при экспериментальном Кон А-индуцированном гепатите.

Задачи исследования.

1. Изучить в динамике морфологические изменения в печени и органах иммунной системы при Кон А-индуцированном гепатите.

2. Изучить влияние Кон А на клетки иммунной системы in vivo.

3. Изучить in vitro функциональную активность клеток иммунной системы после системного введения Кон А.

4. Изучить влияние Кон А на генерирование неспецифических киллеров.

Научная новизна. Впервые охарактеризована динамика морфологических изменений в печени и органах иммунной системы при Кон А-индуцированном гепатите.

Впервые данные морфологического исследования органов мишеней соотнесены с результатами функциональных тестов в процессе развития экспериментального кон А-индуцировапного гепатита.

В динамике Кон А-индуцированного гепатита в первые трое суток функциональная пролиферативная и цитотоксическая активность лимфоцитов возрастает, что сочетается с прогрессировапием альтсративпых (дистрофических и некротических) изменений в печени.

В тимусе при Кон А-индуцированном гепатите развиваются и прогрессирующе нарастают морфологические проявления акцидентальной инволюции.

В селезенке в 1-е сутки отмечается опустошение Т-зон, что, по-видимому, обусловлено миграцией активированных лимфоцитов в барьерные ткани. В последующие сроки на фоне нормализации пролиферативной активности лимфоцитов отмечается восстановление и гиперплазия Т- и В-зон селезенки.

Научная ценность. Только в условиях эксперимента мы можем проследить этапы участия различных клеточных популяций и тканевых элементов в печени, селезенке и тимусе в процессе развития экспериментального гепатита.

Данные о высоком пролиферативном ответе клеток селезёнки, через 1 сутки после введения 10 мг/кг Кон А, позволяют рекомендовать использование этих клеток в тест- системе для определения активности ИЛ-2, т.к. этот тест по сравнению со стандартным является менее трудоемким и более информативным.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Модель Кон А-индуцировапного гепатита дает возможность проанализировать динамику морфологических изменений в печени, селезенке и тимусе па фоне развития острого некротического гепатита.

2. Развитие острого некротического гепатита сопровождается резким увеличением активности лимфоцитов селезенки, проявляющейся в усилении пролиферации как спонтанной, так и в ответ на экзогенный интерлейкин-2. Пролиферативная активность возвращается к контрольному уровню на 4-сутки.

3. Обнаружено увеличение цитотоксической активности лимфоцитов в прилипающей фракции спленоцитов в 3,5 раза по сравнению с общей популяцией клеток селезенки, что указывает на роль клеточной адгезии в механизмах поражений печени.

4. Активированные Кон А клетки селезенки обладают выраженной супрессорной активностью, проявляющейся в соответствующих функциональных тестах (генерировании цитотоксических Т-лимфоцитов, реакции бласттрансформации).

Апробация работы. Результаты диссертационной работы представлены на конференции по патологии клетки (Москва, 2004) и на заседании Ученого Совета НИИ морфологии человека РАМН (Москва, 2004).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано четыре печатные работы.

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 92 страницах машинописного текста, состоит из введения, глав обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов собственных исследований, выводов и списка литературы, иллюстрирована 25 рисунками, 1 таблицей. Библиография включает 18 отечественных и 90 зарубежных источников.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Обернихин, Сергей Станиславович

ВЫВОДЫ.

1. По данным морфологического исследования у мышей BALB/c после введения Кон А в дозе 10 мг/мышь развивается острый некротический гепатит, характеризующийся в динамике на 1-3-и сутки увеличением распространенности и выраженности дистрофических изменений гепатоцитов и очагов некроза и сочетанием поражения печени с геморрагическими некрозами селезенки.

3. В селезенке на 1-2-е сутки происходит опустошение белой пульпы с редуцированием Т зон, образованием очагов геморрагических некрозов, но уже на 3-й сутки отмечается тенденция к восстановлению функциональных зон, которые претерпевают гиперплазию па 7 сутки.

4. Спонтанная пролиферативная активность клеток селезенки возрастает на 1 сутки, поддерживается на высоком уровне до 3 суток и нормализуется на 7-е сутки.

5. Пролиферативный ответ клеток селезенки мышей на интерлейкин 2 повышен на 1-е сутки и снижается на 3-й сутки, приближаясь к базовому уровню.

Заключение.

Таким образом, при введении Конканавалина А в дозе 10 мкг/кг у мышей BALB/c по данным морфологического исследования развивается острый гепатит с обширными некрозами, в селезёнке на 1 -3 сутки очаговые некрозы и опустошение белой пульпы, а на 7-е сутки тенденция к нормализации морфологической картины. В тимусе на 1 -3 сутки акцидентальная инволюция 1-3 стадий; на 7-е сутки выраженность акцидентальной инволюции нарастает до 2-3 стадии. 3.2. Функциональные изменения иммунной системы мышей линии BALB/c после введения Кон А.

Изменение пролиферативной активности клеток селезёнки мышей после внутривенного введения Кон А.

Индукция гепатита Кон А приводит к значительному изменению состояния иммунной системы, поэтому важным моментом в исследовании явилось изучение пролиферативной активности спленоцитов в классической реакции бласттрансформации после внутривенного введения Кон А.

Для этих целей исследовали пролиферативную активность клеток селезёнки в различные сроки после введения лектина. Спленоциты получали через 18, 48, 72 и 96 часов после внутривенного введения Кон А. Полученные результаты РБТ представлены на рисунке №11.

150 Н □

Интактные

Время (час), прошедшее после введения Кон А.

Рис. 11 Пролиферация клеток селезёнки в РБТ у интактных мышей (□) и после внутривенного введения Кон А в дозе 200 мкг/мышь (■) . Достоверность различий по сравнению с контролем: * - р<0,001

Как видно из рисунка через 18 часов после введения 200 мкг Кон А ответ на митоген значительно снижается по сравнению с интактными спленоцитами, а восстановление пролиферативпого ответа происходит только спустя 96 часов после введения митогена.

В следующей серии опытов сравнивали величину пролиферативпого ответа клеток селезёнки мышей через 18 часов после внутривенного введения различных доз Кон А. Животным вводился лектин в дозах 25, 50, 100 и 200 мкг. Более высокие дозы Кон А были токсичны и приводили к гибели животных. Обобщающие данные этих опытов представлены на рисунке №12.

На диаграмме видно, что пролиферативный ответ на Кон А был обратно пропорционален дозе вводимого митогена. Наибольшим эффектом обладала доза 200 мкг/мышь.

Пролиферация лимфоцитов в ответ на ИЛ-2.

В следующей серии опытов исследовали влияние Кон А, введённого внутривенно, на способность клеток селезёнки пролиферировать в ответ на ИЛ-2. Наш интерес был вызван тем, что, судя по литературным данным после 18 часов контакта с митогепом in vitro на лимфоцитах экспрессируется большое количество рецепторов к ИЛ-2.

Также как и в опытах, описанных выше, определяли величину пролиферативного ответа клеток селезёнки на ИЛ-2 в зависимости от времени, прошедшего после внутривенного введения лектина в дозе 200 мкг. Полученные данные представлены на рисунке №13. Способность клеток селезёнки отвечать на ИЛ-2 резко возрастала к 18 часам и уменьшалась с увеличением интервала времени после введения Кон А.

Результаты опытов, отражающие величину пролиферативного ответа спленоцитов на ИЛ-2 в зависимости от дозы введённого Кон А, представлены на рисунке №14.

150 х s г rz о»

-е-s и о

Q. о Ьй D 4

100

50 0

Интактные 50 100

Доза Ко11 А (мкг/мышь) n

200

Рис. 12. Пролиферация клеток селезёнки мышей Balb/c в РБТ через 1 сутки после внутривенного введения Ком А. Достоверность различий по сравнению с контролем: * - р<0,001

40 i

Й к гг о.

QJ s 5

Едо с о ы 0> п X Б

Интактные 18 72 время (ч) прошедшее после введения КонА

Рис. 13 Пролиферация клеток селезёнки мышей на HJ1-2 после внутривенного введения 200 мкг Кон А. Достоверность различий по сравнению с контролем: * - р<0,001

40 т

30 s s а я О. U ^^ J s а. 20 с и

Ьй ©

4 X 5

Интактные 50 100 доза Кон А (мкг/мышь)

200

Рис. 14.Пролиферация клеток селезёнки мышей Balb/c in vitro через 1 сутки после внутривенного введения Кон А. Достоверность различий по сравнению с контролем: * -р<0,001; ** -р<0,01

Из рисунка видно, что пролиферативный ответ на ИЛ-2 возрастал с увеличением дозы вводимого митогена.

Поскольку нельзя исключить возможность продукции ИЛ-2 в организме мышей через 18 часов после введения Кон А, аналогично тому, что происходит в культуре, мы исследовали содержание ИЛ-2 в монокультурах спленоцитов Кон А-стимулированных мышей. Однако нам не удалось обнаружить ИЛ-2 в этих культурах, а при стимуляции спленоцитов, полученных после введения Кон А, не зафиксировано достоверного увеличения продукции ИЛ-2 от такового в контроле. Эти данные иллюстрирует рисунок №15.

Далее сравнивали величину пролиферативного ответа на ИЛ-2 клеток селезёнки мышей, которым за 18 часов вводили 200 мкг Кон А и 4-х дневных Кон А бластов, экспрессирующих большое количество рецепторов к ИЛ-2 и стандартно использующихся наряду с ИЛ-2-зависимыми линиями для определения активности этого лимфокина. Результаты типичного опыта представлены в таблице №1. Из таблицы видно, что величина пролиферативного ответа как на рекомбинантный ИЛ-2, так и на культуральный крысиный супернатант, содержащий ИЛ-2, у спленоцитов, полученных от Кон А-стимулированных мышей, была в несколько раз выше, чем у Кон А-бластов. Эти данные позволяют предложить использовать клетки селезёнки, полученные от мышей через 18 часов после введения 200 мкг Кон А, в качестве гест-системы для определения активности ИЛ-2 в культурах.

Проведена также сравнительная характеристика пролиферативного ответа спленоцитов Кон А-стимулированных мышей на рекомбинантный и кукльтуральный крысиный ИЛ-2 в зависимости от времени культивирования с цитокином in vitro. Как отражено на рисунке №16 максимальный индекс пролиферации был зарегистрирован при 72 часовой инкубации.

1 2

Рис. 15 Продукция ИЛ-2 клетками селезёнки мышей через 1 сутки после введения 200 мкг Кон А - Клетки селезёнки интактиых мышей ■ - Клетки селезёнки Кон А-стимулированных мышей

1 - Нестимулированные клетки селезёнки

2 - Клетки селезёнки стимулированные Кои Л in vitro

Библиография Диссертация по биологии, кандидата технических наук, Обернихин, Сергей Станиславович, Москва

1. Абдумуратова Д.А. Морфогенез и иммунологическая характеристика лимфатических узлов плода человека. //Дисс. канд. м. н. М. - 1990. - 193 с.

2. Агеев А.К. Гистопатология вилочковой железы человека. — Л.: Медицина, 1973. 175 с.

3. Вепхвадзе Л.К. Изменение плоидности гепатоцитов крыс в течение суток в контроле и после частичной гепатэктомии. // Известия АН ГССР, серия биологическая. 1984. - т. 10. - N4. - с.274-278.

4. Гринцевич И.И. Функциональная морфология тимуса при антигенных и неантигенных воздействиях на организм. //Дисс. доктора мед. наук. — Л. — 1989.

5. Зайратьянц О.В. Патология вилочковой железы и аутоиммунные болезни. //Дисс. доктора мед. наук. М. - 1992.

6. Ерофеева Л.М. Тимус крыс в условиях воздействия на организм диметилсульфата. //Дисс. канд. м.н. — М. 1993. - 216 с.

7. Имре Барта. Селезёнка. //Из-во акад. наук Венгрии. — Будапешт. — 1976. — 264 с.

8. Коваленко Н.Я. Функциональный элемент печени в норме и патологии. Обзор. .Патол. физиол. и эксперим. терапия. 1984. вып. 1 - с. 83-88.

9. Ляшенко А.А., Уваров В.Ю. К вопросу о систематизации цитокинов. // Усп. совр. биол. -2001. т.121. —N6. - с.589-603.

10. П.Онищенко Г.Г., Шахгильдян И.В. Парентеральные вирусные гепатиты — актуальная проблема здравоохранения России. //Гепатит В, С, D и Gпроблемы изучения, диагностики, лечения и профилактики. М., - 1997. -с. 164-166.

11. Романова Л.К. Регуляция восстановительных процессов. М.: Изд-во Моск. ун-та. - 1984. - 209 с.

12. Сапин М.Р., Харин Г.М., Вавилов В.И. Цитоконструкция вилочковой железы у половозрелых обезьян. // Архив АГЭ. 1977. - т.72 - №1. - с.32-36

13. Сапин М.Р., Юрина П.А., Этинген Л.Е. Лимфатический узел. М. -Медицина - 1978.-271 с.

14. Серов В.В., Апросина З.Г., Крель П.Е. и соавт. Хронический вирусный' гепатит одна из наиболее важных проблем современной медицины. //Архив патологии. - 2004. - т.66. - 6. - с.6-11.

15. Ткачук М.Г. Морфологические изменения вилочковой железы под влиянием дозированных физических нагрузок в возрастном аспекте. // Автореф. дис. канд. биол. наук — 1985. 16 с.

16. Хлыстова З.С. Становление иммуногенеза плода человека. //М., Медицина. 1987.

17. Фукс Б.Б., Малайцев В.В., Богданова И.М. Отсутствие генерализованной иммуносупрессии у мышей С57В1/6 при прогрессивном росте сингепной Т-лимфомы EL-4 и легочной карциномы Льюиса 3LL. // Бюлл. экспер. биол. и мед. 1986. - т.С1. - пб. - с.725-728.

18. Arcaro KF, Wang J, Otis CN, Zuckerman BM. Beta-galactosidase and alpha-mannosidase inhibit formation of multicellular nodules in breast cancer cell cultures. //Anticancer Res. 2004. - v.24. - n.l. - p. 139-144.

19. Arya S., Gilbert E., Hong R., Bloodworth B. The Thymus. //In: Endocrine pathology, general and surgical/Ed. J.Bloodworth. N.Y. - 1982. - 2 ed. — p.767-833.

20. Askari F, Dick R.,Mao M., Brewer G. Tetrathiomolybdate Therapy Protect Against Concanavalin A and Carbon Tetrachloride Hepatic Damage in Mice. //Exp. Biol, and Med. 2004. - v. 229. - p.857-863.

21. Baenzinger J.U., Fiete D. Structural determinants of Concanavalin A specificity for oligosaccharides. //J. Biol. Chem. 1979. - v.254 - p.2400-2407.

22. Barbosa Т., Arruda S., Cavada B. et all. //Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 2001. -v.95. n.5. - p.673-678.

23. Batey RG, Cao Q, Could B. Lymphocyte-mediated liver injury in alcohol-related hepatitis. //Alcohol. 2002. - v.27. - N1. - p. 37-41.

24. Batey RG., Wang J. Molecular pathogenesis of T lymphocyte-induced liver injury in alcoholic hepatitis. //Front. Biosci. 2002. - v.l. - n.7 - p.dl662-1675.

25. Becker J.W., Reeke G.N., Cunningham R.A., Edelman G.M. New avidence on the location of the saccharide-binding site of Concanavalin A. //Nature. 1976. - v.259. - p.406-409.

26. Becker J., Reeke G., Wang, J., Cunningham В., and Edelman,G. The Covalent and Three-Dimensional Structure of Concanavalin A. III. Structure of the Monomer and its Interaction with Metals and Saccharides. // J. Biol. Chem. -1975. v.250. - p.1513.

27. Ben-Bassat H. and Goldblum N. Concanavalin A Receptors on the Surface Membrane of Lymphocytes from Patients with Hodgkin's Disease and Other Malignant Lymphomas. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1975. - v.72. - p. 1046.

28. Besedovsky H., Rey A., Sorkin E. Immunoregulation by neuroendocrine mechanisms. //In: Neuroimmunology. Ed. P.Beham, F.Spreafice. — N.Y., 1984- 12-p. 445-450.

29. Berzins K. and Blomberg F. Identification of Concanavalin A-Binding Plasma Membrane Antigens of Rat Liver. //FEBS Lett. 1975. - v.54. - p. 139.

30. Beyer C. and Bowers W. Periodate and Concanavalin A Induce Blast Transformation of Rat Lymphocytes by an Indirect Mechanism, //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1975. - v.72. - p.3590.

31. Black C.D., Kroczek R.A., Barbet J., et al. Induction of IL-2 receptor expression in vivo: response of Concanavalin A. //Cell Immunol. 1988. -v.lll.- p.420-432.

32. Bockman D.E. Fine structure of normal human thymus from children and adults. //RES J. Reticuloendothel. Soc. - 1977. - v.22. - №6. - p.36.

33. Boenisch T. and Norgaard-Pedersen B. Carcinoembryonic Antigen (CEA) of Human Tissue Extracts: Partial Characterization of Two Variants Separated by Affinity Chromatography on Concanavalin A. //Clin. Chim. Acta. 1975. -v.60. — p.51.

34. Bonder C., Ajuebor M., Zbytnuik L. et al. Essential Role for Neutrophil Recruitment to the Liver in Concanavalin A-Induced Hepatitis. // J. of Immunol. 2004. - v. 172 -Nl. - p.45-53.

35. Brattain M. Jones C., Pittman J. and Pretlow T. The Purification of Carcinoembryonic Antigen by Glutaraldehyde Cross-Linked Concanavalin A //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1975. — v.65. - p.63.

36. Brunson K. and Watson D. Concanavalin A Preparation with Activities Related to Bacterial Lipopolysaccharide. //J. Immunol. 1975. - v. 115. -p.599.

37. Chikamori K., Araki Т., Yamada M. Pattern analysis of geterogenous distribution succinate dehydrogenase in single rat hepatic loubules. //Cell and Mol. Biol. 1985 - V.31.-N3.- p.217-222.

38. Clark A. and Denborough M. The Interaction of Concanavalin A with Blood-Group-Substance Glycoproteins from Human Secretions. //Biochem. J. — 1971. -v.121.-p. 811.

39. Cunningham В., Wang J., Waxdal M. and Edelman G. The Covalent and Three-Dimensional Structure of Concanavalin A. II. Amino Acid Sequence of Cyanogen Bromide Fragment F3. //J. Biol. Chem. 1975. - v.250. - p. 1503.

40. DePetris S. Concanavalin A Receptors, Immunoglobulins, and О Antigen of the Lymphocyte Surface. Interactions with Concanavalin A and with Cytoplasmic Structures. //J. Cell. Biol. 1975. - v.65. - p. 123.

41. Dourov N. Thymus Atrophy and Immune Deficient in Malnutrition. //The Human Thymus/Eddition H.Muller-Hermellink. -Berlin Springer Verlag. -1986 -p.127-150.

42. Dutton R.W. Inhibitory and stimulatory effects of Concanavalina A on the responce of mouse spleen cells to antiden. // J. Exp. Med. 1973. - v. 138. -p.1496.

43. Ekstedt R.D., Merdian D.G. Effect of Concanavalin A treatment of the allogenic responce of mice to challenge with P815 mastocytoma: Interleukin 2 treatment reverses Concanavalin A supression. // Cell Immunol. 1984. - v.85.- p.447.

44. Ellis J.A., Demartini J.C. Ovine Concanavalin A-induced supressor cells: generation, assay, age related effects and re-evaluation of mechanism of supression. //Immunol. 1985. - v.54. - p.353-362.

45. Farr A.G., Bruyn P. Macrophage-lymphocyte clusters in lymph nodes: possible substrate for cellular interactions in the immune response. //Amer. J. Anat. -1975. v. 144. - № 2. - p. 209-232.

46. Gantner F., Leist M., Lohse A.W. et al. Concanavalin A-induced T-cell-mediated hepatic injury in mice: the role of tumor necrosis factor. //Hepatology.- 1995.-v.21.- p.190-198.

47. Hentze H., Ganter F., Kolb S., Wendel A. Depletion of Hepatic Glutathione Prevents Death Receptor-Dependent Apoptotic and Necrotic Liver Injury in mice. //Am. J. of Pathology. 2000. - v. 156. - N6. - p.2045-2056.

48. Hasegawa A., Cheng X., Kajino K. et al. Fas-disabling small exocyclic peptide mimetics limit apoptosis by an unexpective mechanism. //PNAS. 2004. -v.101. - n.17. -p.6599-6604.

49. Hershkoviz R., Bruck R., Aeed H. et al. Treatment of concanavalin A-induced hepatitis in mice with low molecular weight heparin. //J. Hepatol. 1999. — v.31. - n.5. - p.834-840.

50. Huet C. and Bernadac A. Dynamic State of Concanavalin A. Receptor Interactions on Fibroblast Surfaces. //Biochim. Biophys. Acta. — 1975. — v.394. — p.605.

51. Inbar M. and Sachs L. Structural Difference in Sites on the Surface Membrane of Normal and Transformed Cells. //Nature. 1969. - v.223. - p.710.

52. Janossy G., Bofill M., Tredosiewicz L. et al. Cellular differentiation of lymphoid subpopulations and their microinviron.//The Human Thymus/Ed.H.Muller-Hermellink. Berlin, ect.,: Spriger Verlag. - 1986. -p.89-127.

53. Kato M, Ikeda N., Matsushita E, Kaneko S, Kobayashi K. Involvement of IL-10, an anti-inflammatory cytokine in murine liver injury induced by Concanavalin A. //Hepatol. Res. 2001. - v.20. - N2. - p.232-243.

54. Katzen H. and Soderman D. Interaction of Concanavalin Binding Sites on Concanavalin A-Agarose with Receptors on Adipocytes Studies by Buoyant Density Method. //Biochem. 1975. - v. 14. - p.2293.

55. Kimura K, Ando K, Ohnishi H, Ishikawa T, Kakumu S, Takemura M, Muto Y, Moriwaki H. Immunopathogenesis of hepatic fibrosis in chronic liver induced by repeatedly administered concanavalin A. //Int. Immunology. 1999. - N9. p. 1491-1500.

56. Kornfeld R. and Ferris C. Interaction of Immunoglobulin Glycopeptides with Concanavalin A.//J. Biol. Chem. 1975. - v.250. - p.2614.

57. Kristin H. The human thymus in desease with particular emphysis on thymus and thymoma. // The thymus gland. 1981. - London: Acad. Press. - p.85- 111.

58. Ksontini R. et all. Disparate Role for TNF-a and Fas Ligand in Concanavalin A-Induced Hepetitis. //J. Immunol. 1998. - v. 160. -p.4082-4089.

59. Kubota J. and Kanatani H. Concanavalin A: Its Action in Inducing Oocyte Maturation-Inducing Substance in Starfish Follicle Cells. //Science. 1975. -v.187. - p.654.

60. Langweiler M. I., Cockerell G.L. Generation of Concanavalin A-induced supressor cell in the cat. // Int. arch allergy appl. immunol. 1982. - v.69. -p.148-153.

61. Lasarte JJ, Sarobe P, Boya P et al. A recombinant adenovirus encoding hepatitis С virus core and El proteins protects mice against cytokine-induced liver damage. //Hepatology. 2003. - v.37. - n.2. - p.461-470.

62. Ma X., Qiu DK., Li EL, Peng YS, Chen XY. Effect of T-cell vaccination in murine experimental autuimmune hepatitis. //Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. 2004. - v. 1. - p.44-46.

63. Martin J. Neuroendocrine regulation of immune response. //In: Neuroimmunology. /Ed. P.Beham, F.Spreafico. N.Y. - 1984. - 12. - p.443-444

64. Massaguer A, Perez-Del-Pulgar S., Engel P. et al. Concanavalin A-induced injury is severely impaired in mice deficient in P-selectin. //J. Leukoc. Biol. — 2004. v.72. - N2. - p.262-270.

65. Mathers D. and Usherwood P. Concanavalin A Blocks Desensitization of Glutamate Receptors on Insect Muscle Fibres. //Nature. 1976. - v.259. -p.409.

66. McKenzie G, Sawyer W. and Nichol L. The Molecular Weight and Stability of Concanavalin A. // Biochim. Biophys. Acta. 1972. - v.263. - p.283.

67. Mizuhara H., O'Neill E., Seki N., Ogawa T. et al. T cell activation-associated hepatic injury: mediation by tunor necrosis factors and protection by interleukin 6. //J. Exp. Med. 1994. - v. 179. - p. 1529-1537.

68. Mizuhara H, Uno M, Seki N et al. Critical involvement of interferon gamma in the pathogenesis of T-cell activation-associated hepatitis and regulatory mechanisms of IL-6 for the manifestation of hepatitis. //Hepatology. -1996. -N6. p.1608-1615.

69. Moscona A. Embryonic and Neoplastic Cell Surfaces: Availability of Receptors for Concanavalin A and Wheat Germ Agglutinin. //Science. — 1971. -v.171.-p.905.

70. Nadler L.M., Strachenko P., Hardy R. et al. Characterization of human B-cell specific antigen (B2) distinct from B1 //J. immunol. 1981. - v. 126. - p. 1941-1947.

71. Nel A.E., Wooten M.W., Galbraith R.M. Molecular signalin mechnisms in T-lymphocyte activation pathway: a review and future prospects. //Clin, immunol. and immunopathol. 1987. - v.44. -N2. -p. 167-186.

72. Nicholson G. Topography of Membrane Concanavalin A Sites Modified by Proteolysis. //Nature New Biol. 1972. - v.239. - p. 193.

73. Nicoletti F., Beltrami В., Raschi E. et al. Protection from concanavalin A (ConA)-induced T-cell-depended hepatic lesions and modulation of cytokine release in mice by sodium fusidate. //Clin. Exp. Immunol. 1997. - v.l 10. -N3.-479-484.

74. Ogawa M., Mori Y., Mori T. et al. Adoptive transfer of Experimental autoimmune hepetitis in mice — cellular interactin between donor and recipient mice. //Clin, exper. Immunol. 1988. - v.- 73. - n.2. - 276-282.

75. Okamoto Т., Nakano Y., Asakura W. et al. Expression of Cytokine mRNA in Extrahepatic Organs in a Mouse Concanavalin A-Hepatitis Model. //Jpn. J. Pharmacol. 1998. - v.77. - p.219-225.

76. Packman K., Packman U., Penning R. Allocation of the suppressive activity of normal peripheral blood lymphocytes induced by diffusion. // Cell Immunol. -1985. -v.94.-N1 -p.21-31.

77. Pommier G., Ripert G., Azoulay R. and Depieds R. Effect of Concanavalin A on Membrane-Bound Enzymes from Mouse Lymphocytes. //Biochim. Biophys. Acta. 1975.- v.389. - p.483.

78. Radaeva S., Sun R., Pan H., Hong F., Gao B. Interleukin 22 (IL-22) plays a protective role in T cell-mediated murine hepatitis: IL-22 is a survival factor for hepatocytes via STAT3 activation. //Hepatology. 2004. - v.39. - n.5. -p. 1332-1342.

79. Reeke G., Becker J., and Edelman G. The Covalent and Three-Dimensional Structure of Concanavalin A. IV. Atomic Coordinates, Hydrogen Bonding, and Quaternary Structure. //J. Biol. Chem. 1975. - v.250. - p. 1525-1529.

80. Roth R.,Cassel D., Maddux B. and Goldfine J. Regulatin of insulin receptor kinase activity by insulin mimickers and an insulin antagonist. //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1983. - v.l 15. - p.245-252.

81. Saito Т., Okumura A., Watanabe H. et al. Increase in Hepatic NKT Cells in Leucocyte Cell-Derived Chemotaxin 2-Defient Mice Contributes to Severe Concanavalin I-Induced Hepatitis. //J. Immunol. 2004. - v. 173. - p.579-585.

82. Sass G., Heinlein S., Agli A., Bang R. et al. Cytokine expressin in three model of experimental hepatitis. //Cytokine. 2002. - v. 19. - n.3. - p.l 12-120.

83. Sharon N. and Lis H. Lectins: Cell-Agglutinating and Sugar Specific Proteins. //Science.- 1972.-v. 177- p.949.

84. Shoham J., Inbar M. and Sachs L. Differential Toxicity on Normal and Transformed Cells in vitro and Inhibition of Tumour Development in vivo by Concanavalin A. //Nature. 1970. - v.227. - p. 1244.

85. Simon H., Wenzelides K., Guski H., Kranz D. Zur regeneration der leberparenchym und sinusoidazellen nach teilhepatektomie. // Zbl. allg. Pathol, und Patol. Anat. - 1985. - Bd. 130.-Nl. - p.57-62.

86. Smith E. and Goldstein 1. Protein-Carbohydrate Interaction. V. Further Inhibition Studies Directed Toward Defining the Stererochemical Requirements of the Reactive Sites of Concanavalin A. //Arch. Biochem. Biophys. 1967. -v.121. - p.88.

87. Smith W. G., Usinger W.R., Splitter G.A. Bovine Con A induced suppressor cell: generation, macrophage requirement and possible mechanisms of regulatory action. // J. Immunol. 1981. - v.43. - p.91-97.

88. Streetz K., Wustefeld Т., Klein C. at al. Lack of gpl30 expression in hepatocytes promotes liver injury. //Gastroenterology. 2003. - v. 125. - p.532.

89. Sumner J., and Howell, S. The Identification of the Hemagglutinin of the Jack Bean with Concanavalin A. //J Appl. Bacteriol. 1936. — v.32, p.227.

90. Sun R., Tian Z., Kulkami S. and Gao B. IL-6 Orevents T Cell-Mediated Llepatitis via Inhibition of NICT Cells in CD4+ T Cell- and STAT3-Dependent Manners. //J. Immunol. 2004. - v. 172. - p.5648-5655.

91. Suntucci L., Fiorucci S., Cammilleri F. ey al. Galectin-1 exerts immunomodulatory and protective effects on concanavalin A-induced hepatitia in mice. //Hepatology. 2000. - v.31. - n.2. - p.399-406.

92. Surh C.D. and Sprend J. Homeostasis T cell proliferation: how far can T cells be activated to self-ligands? //J. Exp. med. 2002. - v. 192. - f9.

93. Tiegs G., Hentschei J., Wendel A. A T cell-dependent experimental liver injury in mice inducible by Concanavalin A. //J. Clin. Invest. 1992. — v.90. — p. 196-203.

94. Toyabe S., Seki S., Iiai T. et al. Requirement of IL-4 and liver NK1f T cells for Concanavalin A-induced hepatitis injury in mice. Hi. Immunol. 1997. -v.159. - p.1537.

95. Toyoshima S., Iwata M., Osawa T. Kinetics of lymphocyte stimulation by Concanavalin A. // Nature. 1976. - v. 264. - p.447-449.

96. Trautwein C., Rakemann Т., Malek N. ey al. Concanavalin A-induced Injury Triggers Hepatocyte Proliferation. //J. Clin. Invest. 1998. - v.101. -n.9. - p. 1960-1969.

97. Tsutsui H, Adachi K., Seki E., Nakanishi K. Cytokine-induced inflamatory liver injures. //Curr. Mol. Med. 2003. - v.3. - n.6. - p.545-559.

98. Wang J., Cunningham В., Waxdal M. and Edelman G. The Covalent and Three Dimensional Structure of Concanavalin A. I. Amino Acid Sequence of Cyanogen Bromide Fragments F1 and F2. //J. Biol. Chem. 1975.,v.250. — p. 1490.

99. Wang J., Zhao Y., Xu Q. Astibin prevents concanavalin A-inducecl liver injury by reducing TNF-alfa production and T lynphocytes adhesion. //J. Pharm. Pharmacol. 2204. - v.56. - n.4. - p.495-502.

100. Xiang M., Zaccone P., Marco D. et al. Prevention by rolipram of concanavalin A-induced T-cell-dependent hepatitis in mice. //Eur. J. Pharmacol. 1999.- v.367.- n.2-3. - p.399-404.

101. Yamanaka A., Hamano S., Miyazaki Y. et al. Hyperproduction of proinflammatory cytokines by WSX-1 -dificient NKT cells in concanavalin A-induced hepatitis. //J. Immunol. 2004. - v. 172. - n.6. - p.3590-3596.

Информация о работе

Обернихин, Сергей Станиславович
кандидата технических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.25

Диссертация

Морфофункциональные изменения органов иммунной системы при конканавалин А-индуцированном гепатите - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы