Бесплатный автореферат и диссертация по географии на тему

Морфофункциональные изменения иммунной системы карпа Cyprinus carpio L. при хронических токсикозах

ВАК РФ 11.00.11, Охрана окружающей среды и рациональное использование природных ресурсов

Автореферат диссертации по теме "Морфофункциональные изменения иммунной системы карпа Cyprinus carpio L. при хронических токсикозах"

с -

<•■ „ С>-

с

5 ^ АСТРАХАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

-

с\/

на правах рукописи

КРЮЧКОВ ВИКТОР НИКОЛАЕВИЧ

Морфофункцнональные изменения иммунной системы карпа Cyprinus carpió L. при хронических токсикозах

специальность - 11.00.11 - охрана окружающей среды и рациональное использование природных ресурсов

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Астрахань 1997

Работа выполнена в Астраханском государственном техническом университете

Научный руководитель: доктор сельскохозяйственных наук,

профессор Зайцев В.Ф.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Сидоров B.C., кандидат медицинских наук Михайлов Г.М.

Ведущая организация:Краснодарский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства (КрасНИРХ)

Защита состоится " апреля 1997 г. в ¡4 часов на заседании специализированного совета К 11707.04 при Астраханском государственном техническом университете (414025, Астрахань, ул. Татищева, 16, гл. корпус, пуд. 309).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета Автореферат разослан " марта 1997 г.

Ученый секретарь специализированного совета,

кандидат биологических наук Мелякина Э.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Иммунная система является одной из важнейших в организме рыб, функции которой, наряду с нервно-эндокринной регуляцией, направлены на сохранение гомеостаза. Медико-биологическими исследованиями последних 10-15 лет позволили установить. что степень и выраженность интоксикации у животных находятся в тесной зависимости от иммунной резистентности организма (Криворучко. Джаббаров, 1989). Устойчивость рыб к действию внешних факторов среды, обусловленная иммунной и связанной с нею другими системами, определена как иммунофизиологическая реактивность (Корнева, 1979). Наряду с высшими позвоночными, получили развитие представления о системном принципе функционирования иммунной системы рыб (Jorgensen. 1989). Иммунофизиологические исследования рыб получили распространение в связи с развитием аквакультуры и освоением новых объектов разведения (Чихачев, 1991; Вихман, 1994), при установлении опасности технологических воздействий (Федоров, 1990). Вместе с тем, вопрос о хроническом влиянии на иммунную систему рыб имеющегося загрязнения водной среды в доступной литературе не освещен в должной мере.

В последние годы в связи с проводимыми природоохранными мероприятиями и современном падением промышленного производства острые экзотоксикозы водных животных стали относительно редкими. Вместе с тем, в водоемах, в частности, в р. Волге, постоянно присутствуют загрязняющие вещества в концентрациях, зачастую превышающие предельно допустимые (Андреев и др., 1989; Мумжу и др., 1989). Так, по данным Комитета экологии и природных ресурсов Астраханской области загрязнение воды в районе г. Астрахани составляет по нефтепродуктам до 5 ПДК, по меди - до 7 ПДК,, нитритов, фенолов - на уровне 1 - 2 ПДК. Хло-рорганические пестициды присутствуют в волжской воде в концентрациях порядка 0,005 - 0,02 мкг/л, они обладают большой способностью пакаплп-

ваться в организме и представляют серьезную опасность для биоты (Врочинский, Перевозников. 1990).

Иммунная система, безусловно, может испытывать влияние загрязняющих веществ в результате не только острых и подострых, но и хронических интоксикаций. Исходя из этого, представляет большой научный и практический интерес вопрос о иммунофизиологическрй реактивности рыб в зависимости от загрязнения водной среды. Исследования в этой области актуальны в связи с отдаленными последствиями, возникающими в результате накопления токсикантов в организме рыб.

Целью работы являлось изучение морфологических и иммунофизно-логических реакций в органах и тканях карпа на воздействие хронических интоксикаций тяжелыми металлами и хлорорганическими пестицидами.

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

1. Определить количественную динамику содержания тяжелых металлов (цинк, медь, свинец, кадмий и др.) и хлорорганических пестицидов (ДДТ, ГХЦГ, гептахлор) в воде дельты р. Волги и замкнутых водоемах.

2. Установить уровень кумуляции тяжелых металлов и хлорорганических пестицидов в органах и тканях карпа.

3. Изучить функциональные нарушения кроветворения, характер и степень патогистологических изменений паренхиматозных органов карпа на фоне накопления в них изучаемых токсикантов.

4. Изучить изменения лейкоцитарного состава крови карпа и морфс-функциональные нарушения дыхательной функции эритроцитов.

5. Определить функциональное соотношение клеточных и гуморальных факторов иммунитета в зависимости от тяжести патогистологических изменений внутренних органов.

6. Изучить направленность и сопряженность изменений иммунофп-зиологических показателей крови и внутренних органов карпа при экспериментальной хронической интоксикации медью.

7. В экспериментальных условиях установить степень резистентности карпа к условно-патогенным бактериям Pseudomonas fluorescens после токсического воздействия медью.

Научная новизна работы. Впервые проведены комплексные исследования по изучению гематологических и иммунологических показателей карпа, оценке степени патоморфологических изменений в органах и тканях при накоплении в них тяжелых металлов и хлорорганических пестицидов.

Выявлено нарушение соотношения концентраций микроэлементов при патогистологических изменениях в органах. Установлено, что патологические изменения в печени изучаемых рыб развиваются раньше, чем в других органах. Установлена зависимость между недостаточностью гра-нулоцитов в периферической крови и степенью проявления неспецифического иммунодефицита карпа. Кроме того показано, что реакция иммунной системы в ответ на интоксикацию проявляется в виде повышения активности гуморальных факторов иммунитета при угнетении клеточных. Доказана возможность оценки токсикорезистентности рыб по иммуно-морфофизиологическим показателям.

Практическое значение работы. Предложен комплекс иммуномор-фофизиологических методов, позволяющих оценить неспецифическую резистентность карпа и степень ее изменения, что важно при решении конкретных задач в области аквакультуры, включая оценку адаптивных возможностей и прогноз устойчивости рыб к заболеваниям. Указанный комплекс методов применим при проведении мониторинговых исследованиях в естественных ареалах. Материалы исследования используются в преподавании курса гистологии на рыбохозяйственном факультете АГТУ.

Апробация. Результаты работы докладывались на Всесоюзных и региональных научных и научно-практических конференциях "Проблемы изучения, охраны и рационального использования природных ресурсов Волго-Ахтубинской поймы" (Астрахань, 1989), "Экологические проблемы Волги" (Саратов, 1989), "Рыбохозяйственная токсикология" (Санкт-Петербург, 1991), "Проблемы сельского и водного хозяйства Поволжья" (Саратов, 1992), на ежегодных научно-технических конференциях научно-преподавательского состава АГТУ (1989-1991).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, изложенных в трех главах, заключения и выводов. Материал изложен на/*/0страницах машинописного текста, имеет 33 рисунка и 20 таблиц. Список использованной литературы содержит 174 наименования, из них 25 на иностранных языках.

Материал н методы исследовании.

Работа выполнена на базе Башмаковского рыбопитомника. Волжского экспериментального рыбоводного завода, расположенных в дельте р. Волги, а также на кафедрах ихтиологии и гидробиологии, биологии, генетики и селекции рыб Астраханского государственного технического университета в 1990 - 1993 гг. В работе были применены методы химического, гематологического, гистологического и иммунологического анализов.

Материалом для исследований послужили 240 экз. беспородного чешуйчатого карпа (Cyprinus carpió L.), их органы и ткани. Объектом наблюдения являлись внешне здоровые экземпляры карпа в возрасте 3+ - 4+

массой от 1,0 до 3,25 кг. В аквариальных условиях опыты проводились с сеголетками и годовиками массой от 40 до 50 г.

Сбор материала включал в себя 3 этапа: 1-й этап - полевые наблюдения с апреля по сентябрь 1990 - 1993 годов, в это время проводился отбор проб воды в прудах, воды из реки Волги в районе Башмаковского рыбопитомника. При анализе воды использовалась усредненная проба за месяц (отбор проб 4-х кратный). Рыбу для гематологических, гистологических и иммунологических исследований брали в конце мая - начале июня каждого года.

2-й этап исследований проводился в лабораторных условиях. Изучение содержания тяжелых металлов в органах и тканях карпа проводилось методом атомно-абсорбционной спектофотометрии (Прайс, 1976) на спектрофотометре "Хитачи" модели AA-S i 80-50. Анализ хлорорганических пестицидов (ХОП) на газовом хроматографе "Янако" с детектором по захвату электронов. Колонка стеклянная, длина 1,0 м, диаметр 3 мм. Неподвижная фаза - метил-силикон SE-30 (5%). Газ-носитель - азот. Количественное определение проводили методом соотношения со стандартом по высоте пиков.

Изучение гематологических показателей проводилось по методикам, рекомендованными Н.Т. Ивановой (1983). Для изучения гемопоэтической активности органов приготавливали отпечатки селезенки, головной и туловищной почек. Фиксация и анализ аналогичны таковым при изучении мазков крови.

Иммунофизиологическне исследования включали в себя следующие тесты: лизосомально-катионный тест, определение лизоцима и естественных гемагглютининов, фагоцитарная активность нейтрофилов. Выбор методов был обусловлен их доступностью и тем, что они отражают различные уровни иммунофизиологических исследований: собственно иммунную систему (естественные антитела) и систему неспецифической инактивации

патогенов (гуморальные факторы л фагоцитоз без специфического усиления). Определение в гранулоцитах крови неферментных катионных белков (лизосомапьно-катионный тест) проводили по методике, предложенной В.Е. Пигаревским (1981) и Н.А.Макаревичем (1988). Фагоцитарную активность нейтрофилов определяли общепринятым способом (Козлюк и др., 1967).

Естественные гетерогемагглютинины в сыворотке крови и экстрактах органов определяли в планшетах с V-образными лунками (Никитин, 1977; Мусселиус и др., 1983). Реакцию учитывали по 4-х крестовой системе (Никитин, 1977). Лизоцим в экстрактах тканей и сыворотке крови определяли методом серийных разведений по литическому воздействию на тест-микроорганизмы Micrococcus lysodeicticus (Генералова, Ситнова, 1994).

Для патогистологического анализа использовались ткани жабр, печени, головной и туловищной почек, селезенки. Гистологические препараты приготавливали по общепринятым методикам (Ромейс, 1953). Тяжесть патологии оценивали по бальной системе, предложенной Л.А. Лесниковым и И.Д. Чинаревой (1987), когда за I степень патологии принимали реакции тканей, не связанные с их повреждением, И степень - легкие повреждения, III - повреждения средней тяжести, IV - тяжелые и V - летальные повреждения.

Третий этап исследований - экспериментальный. Экспериментальные работы проведены в аквариальных условиях. В качестве токсиканта использовался ион меди в концентрации 0,25 мг/л, которая была выбрана в серии предварительных опытов по установлению максимально переносимой концентрации. Биоматериал для анализа в ходе экспериментов отбирался каждые две недели.

Был проведен эксперимент по заражению карпов, подвергнутых воздействию иона меди, условно-патогенной культурой Pseudomonas fluorescens,

штамм 1138, предоставленную кафедрой инфекционных болезней ЛГМ11. Введение культуры проводилось путем внутрибрюшинной инъекции.

Всего было поставлено 6 опытов длительностью до 100 дней. Весь опытный материал сравнивали с контролем.

Было обработано 540 проб на содержание тяжелых металлов, 320 проб на содержание ХОП, 210 проб на гистологический анализ, выполнен анализ 240 мазков крови, около 500 проб на различные виды иммунофизиологиче-ского анализа.

Данные количественного анализа обрабатывались статистическими методами (Лакин, 1973 ).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Тяжелые металлы и хлорорганические пестициды в воде рыбохозяй ствеиных водоемов Нижней Волги

Содержание растворенных форм металлов подвержено сезонным колебаниям, причем наиболее существенные изменения связаны с паводковым периодом. К общим закономерностям можно отнести наибольшее содержание в воде из изучаемых элементов цинка и марганца и меньшее - кадмия, в среднем, соответственно, 50.14,40.47 и 0.07 мкг/л (табл. 1).

Концентрации металлов в воде прудов (в среднем за период наблюдений) превышают, за исключением цинка, аналогичные показатели в речной воде в 1,1-1,8 раза.

Были отмечены превышения ПДК в речной воде и в прудах цинка, марганца, меди и кадмия , максимально в 10,3, 8,0, 9,9 и 2,1 раз.

Хлорорганические пестициды определялись в воде р. Волги и в прудах в течение всего периода наблюдений с апреля по октябрь (табл. 2).

Содержание тяжелых металлом и ноле дельты р. Полги н мру дет н районе е. Кашмакчжка, (мкт /л)

Месяц ЭЛЕМЕНТЫ

Ъ\\ Мп Си Со Р/1 РЬ С1)

р.Волга пруд р.Волга пруд р.Волга пруд р.Волга пруд р.Волга пруд р.Волга пруд р.Волга пруд

Апрель 84.8 3,9 7.7 2,9 5,1 6.1 0,4 _

Май 41,2 20,8 3,5 2,7 5.8 6.4 3,2 4,1 4.3 4,5 7,3 8,5 0,6 0.7

Июнь 103,9 32.8 65,0 80.0 6,0 8,3 1,9 1,9 7,2 7.3 5,1 6,8 2,1 1,2

Июль 24.7 20,5 18.1 7,3 8,3 6,6 5,0 4,1 7,0 8,9 3,7 ' 6,1 0,9 0,7

Август 34.5 46,6 17.7 62.2 5.2 7,3 3.4 5.1 8.1 ил 5.3 7,8 0,8 1:3

Сентябрь 30.6 41,8 21,7 44,4 4,1 9,0 4,1 5,2 8,5 18,3 4,1 7,8 0,9 и

Октябрь 31,3 62,1 26,8 46.2 4.2 9,9 3,1 5,0 6,2 10,0 5,8 7.4 1,1 1.4

Среднее 50,14± 11,75 37,40+ 6,56 22.39+ 7.82 40,47+ 9,36 5,90± 0,61 7,92± 0.57 3,38+ 0,36 4,23+ 0,51 6,63+ 0.57 10,02+ 1,80 5,34± 0,46 7,40+ 0,34 0,97+ 0,21 1,07+ 0.12

пдк 10.0 10.0 1.0 10.0 10.0 30.0 1,0

Содержание ХОП в воде р. Волга н прудоп (мкг/л)

ГХЦГ ДДТ Гептахлор

Месяц р.Волга пруд р.Волга пруд р.Волга пруд

Апрель 0.0101 - 0,0507 - 0.0098 -

Май 0,0091 0.0070 0,0123 0,0250 0,0060 0.0055

Июнь 0,0048 0.0013 0,0077 0,0100 0.0117 0.0048

Июль 0,0030 0.0023 0,0024 0,0025 0.0402 0.0031

Август 0.0015 0.0026 0,0519 0,0061 0.0030 0,0029

Сентябрь 0,0027 0.0039 0.0263 0,0087 0.0036 0.0007

Октябрь 0.0014 0.0036 0.0063 0,0063 0.0020 0.0009

Среднее 0.0047± 0.0035+ 0,0225+ 0,0098± 0.0109+ 0.0029±

0.0013 0.0008 0.0080 0,0032 0.0051 0.0007

ПДК - отсутствие

Наибольшее количество ХОП наблюдалось весной, когда средние концентрации ГХЦГ, ДДТ и гептахлора были соответственно 0,0101, 0.0507 и 0,0098 мкг/л. Во время паводка отмечалось снижение концентраций пестицидов в воде, что связывается с увеличением объема стока. Для ГХЦГ за время наблюдений прослеживалась тенденция уменьшения его концентрации в воде от весны к осени. Концентрации ДДТ и гептахло-ра в речной воде колебались в широких пределах: от 0,0005 до 0,0900 мкг/л ДДТ и от 0,0001 до 0,0070 мкг/.л гептахлор.

Содержание ХОП в воде прудов в мае было меньше, чем в речной воде в аналогичный период. В течение лета наблюдалось снижение концентраций ХОП, что, связано, во-первых, с процессами аккумуляции пестицидов растительными и животными организмами, во-вторых, с незначительным новым поступлением ХОП в пруды с речной водой, т.к. в летнее время объемы забираемой из реки воды меньше.

Наблюдавшееся осеннее увеличение концентрации ХОП связано, на наш взгляд, с ослаблением ассимиляционных процессов, разложением образовавшейся за лето органики и переходом пестицидов в растворенное состояние, на что указывалось ранее Л.П. Брагинским и др., (1979).

ч

2. Морфофункцнональная характеристика органов п тканей карпа в условиях аквакультуры

2.1. Накопление изучаемых экзотоксикантов в органах и тканях

карпа

Тяжелые металлы распределяются в организме неравномерно в зависимости от свойств элемента и функциональных особенностей органов п тканей (табл. 3).

В наиболее высоких концентрациях в органах и тканях карпа содержатся железо и цинк. На первом месте по накоплению железа находится селезенка, , при этом минимальное значение накопления железа было

322,2 мг/кг, а максимальное - 974,7 мг/кг. Далее по содержанию железа

»

следуют туловищная почка, жабры, кишечник, головная почка, мышиы. что согласуется с литературными данными (Воробьев, 1979). Цинк в основном концентрируется в головной и туловищной почках и селезенке (соответственно 1168,4, 490,0, и 1412,9 мг/кг), кроме того, значительное количество этого элемента накапливается в желудочно-кишечном тракте (до 529,7 мг/кг), гораздо меньше его было в печени и в мышцах.

Медь активно депонируется печенью (до 69,1 мг, кг), при этом ее концентрация в данном органе в среднем в 3,9 раза больше, чем в жабрах л в 8,4 раза больше, чем в мышцах. Марганец и никель максимально накапливаются в жабрах (9,7 и 5,5 мг/кг), а содержание свинца и никеля в органах и тканях карпа относительно невелико.

Концентрации металлов в органах и тканях карпа можно расположить

в убывающие ряды:

мышцы: Ре > > Со > N1 > Си > РЬ > Мп > Сс1

почка тул.: Ре> Ъп > Со > Си > N1 > Мп > Сс1 > РЬ

печень: Ре > Ъп > Си > Мп > Со > ЬП > Сс) > РЬ

селезенка: Ре > 1х\ > Со > Си > № > Мп > Сс1 > РЬ

ю

Содержание тяжелых металлов н органах н тканях карпа, мг/кг сухого неса

Покупатели Зссеиичал 1,иые микроэлементы Услоино-»ссенц.мнкро-1ЛСМС1ПЫ Токсичные микроэлементы

Орган Железо МеЛ1, 1 {инк Марганец Кобальт 1 !нкел>> Сшшец Кадмий

Жабры 1 18.4-583,7 2.6-4.6 167.8-421.3 0,9-16,1 6.4-9,8 3.9-7,4 6.5-13.3 0,9-2,4

232,95127,8 3,48+0,13 289,95+14,3 9,73±0,85 8,01 ±0.22 5,4510,21 9,9±0,38 1,35+0,11

Мышцы 22,3-67.4 41,58+2,53 0,8-4,0 1.6+0,21 14.0-39,0 26,0811,70 0,7-1,6 1,0510,11 2,5-4,0 3.3710,10 1.2-2,5 1,8710,10 0,1-0.8 0,1810,07 0,3-0,7 0,4510,03

Печень 238.8-557,6 378,12+19,2 3.8-29.8 13,48+1.63 68.1-257.4 152.38+11,48 2,5-3.9 3,36+0,95 2.7-3,5 3,11±0,(>6 1,1-2,2 1,63+0,07 0-1.0 0,1210,06 0.6-1,1 0,7310,04

Кишечник 11.2-210.6 111,8+13,01 2.7-5.6 3,88+0,20 89.9-529.7 352,36±29,05 1.7-5,9 3,11+0,24 2,1-3,7 2,82±0,12 0,0-2,4 1.7410,11 следы 0,3-0,7 0,575+0.03

Селезенка 540.6-974.7 769.2+36,51 1,3-2,7 1,78+0,13 92,2-657,8 360.38+45.72 0,2-1,2 0,65+0,06 2,7-3,8 3,33±0,08 0,9-2.5 1,6+0,07 0,1-1,1 0,210,09 0.3-1,0 0,51+0,06

Тулон.почка 142.8-491,1 290,45±2б,08 2.1-6.2 3.74+0.26 286.9-490.0 366,68+17,03 0,8-2.0 1,3±0,05 2,6-4,0 3,45±0,|3 1,65+0,27 следи 2»Ы,3 0,95+0.04

Чош) я 32,6-81,0 44.413.08 1,9-5,8 3.5 10,28 48,1-102,0 ■ 65,910,30 4,8-11,1 7,6710,46 4,6-7.7 6.310.24 3.2-5.3 • 1.4110,17 4.3-10,7 7,2 110,46 0.6-0.9 0,810.02 '

ПРИМЕЧЛ1П !Е; в числителе - размах колебаний, и знаменателе - среднее значение.

Таблица -I

Содержание ХОП в органах и тканях карпа, мкг/кг сырого вещества

Орган и - ГХЦГ у -ГХЦГ I ГХЦГ ддэ ДДД дцт £ ДЦТ Рентахлор

Жабры 0.6-4.1 2.26±0,23 0.6-4.1 3,16±0.51 1,0-13.9 5,43±0.65 1.2-68,4 11,34±4,08 1,7-133,0 21,36±8,02 2,8-173.4 28,75± 10,33 5,0-374,0 61,35±15,07 0,0-0,0 0,00

Мышцы 0.2-4,0 1,43±0,23 0,0-1,8 0,84±0,18 0,5-5.3 2,17±0,13 0,8-28,0 5,82=Ы,36 0,0-58,10 8,11±3,14 0,0-105,4 16,03±5,5 1,5-191,5 29,97±5,0 0,0-0,9 0,3б±0,09

Печень 0.0-4.5 Э.01±0,25 0,0-3.0 !.83±0,14 0.0-7.5 4,84±0,ЗВ 0,0-16.0 8,б9±1,04 0.0-50,8 16,66±3,14 0.0-212.8 50,09± 13,54 0.0-279.6 71,83±17,49 0.0-4,8 1,03±0,40

Селезенка 0,6-6.3 2,77±0,85 0.0-1.1 0,37±0,17 0.6-6.3 3,13±0,80 0.0-2.0 0,67±0,34 0,0-1,9 0,63±0,23 0.0-2.8 1,3±0,47 0,0-5.0 2,6±0,71 0.0-2.6 0,87±0,24

Почка 0.6-9.1 4.131 1.21 2.5-6.4 3,8710.67 4.2-15.5 8.01 1.98 0,0-3.6 1.5-10,44 8.2-54,1 24.7.1 7.35 0.0-13.1 5.61 1,88 12,8-54.1 3I.83J6.05 1,0-23,2 8.5Л.!

Кровь 0.0-3.4 1.5±0.40 0.0-3.3 1,73±0.40 0.0-6,4 3.23±1.04 0,0-11.3 4,13±1.15 0.0-16.7 4,43±1,96 0.0-29.1 9.4±3.35 0,0-57,1 17,95±7,74 0,0-0,5 0,13±0.06

Чешуя 1,0:4,3 2.42±0.29 .1,0.-4.0 2.02.Ш.35 2,5-6,2 4.0410.36 5,24±0.71 .1,2113,4 7,76± 1,11 .1,3-17,3 7,94±3.09 6,0:40,3 20,94±3.03 МШ 0,00

11Р11МГЧЛ11111'!: !1 числи геле - размах колебаний, н знаменателе - среднее значение.

У отдельных особей были отмечены отклонения от среднего количественного соотношения элементов в органов, например, в селезенке: Zn > Fe > Cu > Ni > Со > Cd > Mn > Pb в тул. почке: Zn > Fe > Cu > Со > Mn > Cd > Ni > Pb Эти явления сопровождались значительными патологическими изменениями во внутренних органах, что будет показано ниже.

Хлорорганические пестициды были обнаружены во всех исследованных тканях карпа (табл. 4), но наиболее высокий уровень их накопления отмечен в печени п в туловищной почке. Высокие концентрации ХОП в печени обусловлены большим содержание в ней жиров, хорошо растворяющих хлорорганические соединения и активной детоксикационной функцией органа. Значительное содержание ХОП в туловищной почке связано с ее функцией выведения из организма продуктов метаболизма и ксенобиотиков. Высокий уровень кумуляции ДЦТ и его метаболитов отмечается в мышцах карпа. Учитывая большой соматический индекс скелетной мышцы, она является одним из основных депо ХОП в организме. Преобладание ДДТ над его метаболитами в кишечнике свидетельствует о его постоянном поступлении из внешней среды в организм рыб. Наличие пестицидов в крови карпа указывает на активное вовлечение их в процессы метаболизма (Клнсенко, 1970).

2.2. Особенности клеточного состава периферической крови карпа и цмтопатологическая характеристика форменных элементов. Анализ клеточного состава периферической крови карпа показал существенные различия у разных рыб по соотношению основных форм лейкоцитов. (табл. 5). Все рыбы были разделены натри группы по относительному количеству в крови граиулоцитов. Выбор был обусловлен тем, что эти клетки играют большую роль не только в защите орга-

Клеточный состав периферической крови карпа, %

Груши рыб К'-во рыо (¡ластимо КЛС1КИ Г р а и у л о и п т ы Лграиулшшты

ГЦБ НГ, МН ММН ПЯН СЯН МпЭ ММпЭ ПЯпЭ СЯпЭ АГ ПК МН м Л

1 76 1,65+ 0.41 0.021 0.00-1 1,221 0,087 3,041 0.56 <1,41 0,48 4,82± 0.25 0,0 0,0 1,351 0,33 0,033± 0,017 0,201 0,08 5,061 0,58 1,411 0.007 0,221 0.087 76,01 1.34

II 35 5.27+ 1,71 0.0 0.30+ 0,16 4,40± 0,80 3.46+ 0.07 3,0± 0,65 0,0 0,0 0,01± 0,005 0,014+ 0.004 0,37± 0.007 2,67+ 0.66 2,64+ 0,23 1,30+ 0,16 76,52+ 5.33

III 30 7,571 2.71 0.05 1 0.005 0,361 0,004 0,521 0,03 1,201 0,31 0,411 0,15 0,0 0,0 0,0 0,0 1,071 0,67 0,061 0,65 0,401 0,13 4,361 0,16 83,11 2,03

Обозначения: Л - лимфоциты, ГЦК -гемоцитобласты, МВ - монобласты, М - моноциты, МН- пейторофильиые миелоциты, МММ нейтрофильныс метамиелокнты. ПЯН - палочкоядерные лейтрофилы, СЯМ- сегмеитноядерные нейтрофилы, Мпэ - миелоиит) исендоюзннофильные. ММиЭ - метамиелоци 1Ы пссидоэо-лиюфильпыс, ПЯиЭ - наночкоядцрмыс нсевдоаозинофилы, СЯн!) ссгмеипюядерныс пссвдоэочннофилы. АГ - амфофильные гранулоциты, ПК - псиистыс клетки.

низма от инфекции, но и в других важных биологических и иммунологических процессах (Ломакин, 1990). Большая часть рыб (54%) имела лейкоцитарный состав крови, характерный для здоровых рыб (1 группа). У 21% карпов (111 группа) отмечен значительный лимфоцитоз, причем с преобладанием макролимфоцитов, и нейтрофилопения. Вторая группа рассматривалась как промежуточная между первой и третьей. Общее количество лейкоцитов в периферическом русле рыб III группы достоверно меньше на 29%, чем в первой. Снижение общего количества лейкоцитов у рыб III группы связано с угнетением гемопоэза, что подтверждается анализом отпечатков кроветворных органов (селезенки и головной почки). При сравнении условно выбранных групп рыб по морфологической характеристике клеток крови были выявлены различия в частоте встречаемости и степени развития в них патологических и дегенеративных процессов (табл 6).

Таол.6

Морфологические показатели красной кропи карпа , %

Показатели Группа рыб

I II III

Гипохромазия 17,1 20.0 83,3

Агглютинация 28.9 42.9 90.0

Пойкилоцитоз 2,6 8.6 10,0

Аиизоцитоз 51,3 60.0 93,3

Амитоз 0 8.6 6,7

Проведенный цитоморфологический анализ показал, что наиболее распространенными изменениями эритроцитов были агглютинация и аии-зонитоз, кроме того отмечались гипохромазия, пойкилоцитоз, в отдельных случаях - ШИСТОШ1ТОЗ и патологические амитозы. Отмеченные явления I! эритроцитах крови карпа относятся к дегенеративным и свидетельствую!

о функциональной недостаточности кроветворных органов (Житенева и др., 1989).

23. Патоморфологическая характеристика тканей карпа

Анализ состояния печени показал различную степень патологии от II-III до IV по классификации Л.А. Лесникова и И.Д. Чинаревой (1987). Общий характер нарушений сводился к нарушению балочной структуры органа, развитию мелкокапельной, затем крупнокапельной (жировой) дистрофии, разрастанию соединительной ткани. Изменения гепатоцитов сопровождались сосудистыми расстройствами органов в виде стаза сосудов, геморрагий и плазморрагий различной величины, локализации и времени возникновения, инфильтрации стенок сосудов и печеночных ходов лейко-цитами.'У половины рыб был выявлен амилоидоз стенок сосудов, что указывает на хронический воспалительный процесс (Давыдовский, 1961). При тяжелых поражениях печени (IV степени) развивались не только дистрофические процессы, но и возникали некротические изменения, охватывавшие более 30% ткани печени.

Патология туловищных почек карпа проявлялась в виде кровоизлияний в строму органа, отека стенок извитых канальцев. У части извитых канальцев в просвете наблюдался белок, в цитоплазме их эпителия отмечалась мелкокапельная дистрофия. В отдельных почечных капсулах отмечались эритроциты, что являлось симптомом геморрагического нефрита.

Патологические изменения селезенки характеризовались сосудистыми расстройствами и отсутствием видимых границ между белой и красной пульпой. В синусах селезенки отмечались обширные скопления дегенерирующих эритроцитов.

У 80% рыб паренхима головной почки была пропитана кровью, сосуды всех калибров были резко расширены, имелось множество массивных кровоизлияний.

к.

В органах с наиболее ярко выраженными патологическими изменениями отмечены отклонения от соотношения содержания в них металлов, характерных для относительно нормальных органов.

Действие хронических интоксикаций в первую очередь проявлялось изменениями ткани печени. Поражения других органов развивались позднее как вследствие непосредственного действия токсикантов, так и в связи с дисфункцией печени.

2.4. Иммунофизиологические показатели органов к крови карпа Наибольшее относительное содержание лизоцима отмечено в туловищной и головной почке, соответственно 2,93 и 52,02 усл.ед. Выявлено высокое содержание гемагглютининов в органах и сыворотке крови. Вместе с тем, отмечено отсутствие активности агглютининов к эритроцитам человека (АЭЧ) в туловищной почке в 45% проб, в головной почке - в 30%. в жабрах и селезенке соответственно в 20 и 60%. Активность агглютининов к эритроцитам кролика (АЭК) не обнаружилась в 5% головных и туловищных почек изучаемых рыб. По суммарному уровню содержания исследованных гуморальных факторов иммунитета выделяются головная и туловищная почки, затем следуют жабры и селезенка, меньше всего лизоцима и гемагглютининов отмечалось в сыворотке крови (табл. 7).

Таблица 7

Относительное содержание гемагглютининов и лизоцима

в органах и сыворотке крови карпа

Пил гуморального фактора содержание, усл.ед.

Туловищная почка Головная почка Селезенка Жабры Сыворотка

Лизоцим 52,93+11,5 52,02+7.62 38.02+12,0 37,07+6.23 4.5-1.55

АЭК 8,79+1.71 8,1+0.9 6.91+1.07 15,27+4.63 26.0+4.7

АЭЧ 4,36+0.56 5,28+0,76 3.01+0.43 2,3+0.6 4.45+1.4

Примечание: АЭК - агглютинины к эритроцитам кролика АЭЧ - агглютинины к эритроцитам человека.

Выявлено снижение активности лизоцима и гемагглютининов в органах со значительной степенью патологии. Активность лизоцима в селезенке и туловищной почке со степенью патологии III и более меньше соответственно в 1,7 и 3,8 раза, чем в относительно нормальных органах. Уменьшение активности гемагглютининов в туловищной почке и в селезенке было соответственно в 2,1 и в 1,2 раза. Иммунофизиологическая активность органов начинает заметно меняться при нарастании патологических изменений до III степени.

Изменения иммунологических показателей крови карпа представлены в табл. 8.

Табл. 8

Иммунофнзпологнческие показатели крови карпа

Группа рыб Сол. нейтрофилов. % СЦК Лизоцим. усл. ед./мл ФАН. % ФИ АЭК. \сл ел /мл

т 15,20 ± 0,29 1.01 ± 0,027 4,5± 0,14 60,2+ 2.7 7.5± 0.6 24.2± 2.2

11 11,16± 0,64 0.925+ 0.090 4,0+ 0,12 393± 2.2 10.1 + 0.5 27.5± 4.3

111 2,49± 0,12 0.895+ 0.106 10,2± 0,28 38.7+ 1.8 6.9+ 0.7 25.5± 3.5

СЦК - средний цветной коэффициент в лизосомально-катионном тесте:

ФАН - фагоцитарная активность нейтрофилов;

ФИ - фагоцитарный индекс;

АЭК - агглютинины к эритроцитам кролика.

Выявлено повышение активности гуморального фактора (лизоцима) в 2,3 раза при недостаточности клеточных факторов иммунитета - уменьшения относительного количества нейтрофилов в 6,1 раза при одновременном снижении их фагоцитарной активности в 1,6 раза.

3. Результаты экспериментальных исследований

При изучении влияния хронических интоксикаций на показатели крови, неспецифической резистентности и состояние внутренних органов

в качестве токсиканта использовался сульфат меди в количестве, необходимом для создания в аквариуме концентрации 0,25 мг/л в пересчете на ион металла.

Влияние интоксикации проявлялось в изменении поведения, сопровождавшееся снижением интенсивности питания в 1,5 - 2 раза по сравнению с контролем. Реакция крови карпа проявлялась в том, что количество лейкоцитов в течение первых 45 суток имело тенденцию к увеличению, и через полтора месяца отмечался лейкоцитоз, вызванный усиленным гемо-поэзом, на что указывало увеличение в периферической крови бластных форм клеток (гемоцитобластов, миелобластов), а также полихромато-фильных нормобластов. Кроме того, отмечалось увеличение доли суммарного количества нейтрофилов, моноцитов (главным образом, за счет моно-бластов), относительное же количество псевдоэозинофилов практически не изменялось. На 75 сутки эксперимента у опытных рыб наблюдалось резкое уменьшение количества лейкоцитов (18,7 тыс./мкл при 32,5 тыс./мкл в контроле), а также лимфоцитоз и нейтрофилопения. При цитоморфологиче-ском анализе клеток красной крови отмечались симптомы анемии: поли-хромазия, переходящая в базофилию, анизоцитоз. Выявлена значительная дегенерация эритроцитов в периферической крови: наблюдался кариорек-сис, кариолизис, пикноз ядер эритроцитов.

Динамика изменений клеточных и гуморальных факторов иммунитета представлена на рис. 1.

Гистологический анализ внутренних органов подопытных рыб показал, что хроническое токсическое воздействие в течение первого месяца вызывает сначала адаптивные реакции, сходные у всех органов, и проявляющиеся в расширении сосудов и усилении кровотока для активизации процессов метаболизма и поддержания юмеостаза. При дальнейшем действии токсиканта происходят патологические процессы та-

50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

15

30 45

ДНИ

60

75

20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

лейкоцитов дыс.шт/мкл

' к-во

нейтрофилов,%

1,2 1

0,8 0,6 0,4 0,2 0

15

30 45 дни

60

75

-СЦК, ед. -лизоцим, уел

Рис 1. Динамика и сопряженность изменений иммунофизиологических показателей крови при экспериментальной хронической интоксикации Си2+

кие, как некроз ткани печени, гиперплазия первичного и вторичного эпителия ламелл и филаментов жабр, фибропластический гломерулоне([)рит. сопровождающийся почечной недостаточностью, массовая дегенерация эритроцитов в синусах селезенки. Нарастание повреждений до степени IV ведет к снижению защитных сил организма, несмотря на имеющиеся компенсаторные механизмы в виде увеличения активности гуморальных факторов иммунитета карпа.

Проведенные исследования позволили установить, что для 2-3-летков карпа в водоемах дельты Волги нормой являются следующие значения иммунофизиологических показателей крови: содержание лизоцима -4,0 - 5,0 усл. ед./мл; содержание агглютининов к эритроцитам кролика - 20 - 25 усл. ед./мл; лизосомально-катионный тест (СЦК) - 0,9 - 1,0 ед.; относительное содержание нейтрофилов в крови - 10 - 15%; фагоцитарная активность нейтрофилов - 50 - 60%.

Недостаточно говорить о токсичности, если под влиянием загрязняющих веществ происходит достоверное отклонение функции от контроля, наблюдаемые изменения следует соотнести со "здоровьем" и выживаемостью гидробионтов (Флеров, 1989). В связи с этим, карпы, подвергнутые воздействию сульфата меди, были заражены условно-патогенной культурой Pseudomonas fluorescens. В контроле использовались рыбы, также зараженные данной культурой, но содержавшиеся в чистой воде. После внутрибрюшинного введения культуры бактерий в течение 11 дней погибло 56,6% подопытных рыб и 10% контрольных (не подвергавшихся интоксикации медью). Кроме того, контрольные рыбы характеризовались более длительным течением инкубационного периода заболевания. Таким образом, экспериментальные исследования свидетельствуют о том, что под влиянием токсиканта (ион меди) снижается сопротивляемость организма к инфекции.

Выводы

1. Концентрации ряда ионов тяжелых металлов (цинк, медь, марганец и кадмий) в изучаемых водоемах дельты Волги превышают предельно-допустимые значения соответственно в среднем в 5,0; 5,9; 2,2 и 1.07 раз. Имеется постоянное присутствие в воде ГХЦГ, ДЦТ и гептгхлора в концентрациях от 0,001 до 0,01 мкг/л (ПДК - отсутствие).

2. Установлено наибольшее содержание тяжелых металлов в метаболически активных органах карпа (печень, туловищная почка, селезенка), причем в каждом из них отмечается определенное соотношение различных элементов. Патологические изменения во внутренних органах степени III и более приводят к нарушению в них типичного баланса элементов.

3. Выявлено накопление хлорорганических пестицидов (ДДТ и его метаболитов, ГХЦГ и гептахлора) в органах и тканях карпа в концентрациях, достигаюших величин 280 мкг/кг в печени, 374 мкг/кг в жабрах, 190 мкг/кг в мышцах.

4. Установлено, что изменения белой крови карпа (лимфоцитоз и ней-трофилопения) связаны с развитием дегенеративных и патологических изменений в форменных элементах красной крови, таких, как гипохромазия. агглютинация анизоцитоз.

5. Патоморфологические изменения в тканях печени карпа под действием хлорорганических пестицидов и тяжелых металлов проявляются в большей степени, чем в других органах.

6. Обнаружено угнетение клеточных факторов иммунитета крови карпа в виде нейтрофилопнии и снижении активности фагоцитоза при хроническом воздействии изучаемых зкзотоксикантов. Одновременно происходит повышение активности гуморальных факторов, таких, как ли-зоцим и гемагглютинины.

7. Доказано, что изменение иммунологических реакций карпа пол влиянием изучаемых токсикантов приводит к снижению сопротивляемости организма к условно-патогенной культуре Pseudomonas fluorescens .

Практические рекомендации

1. В проведенном исследовании получены результаты, которые позволяют использовать такие тесты, как определение активности лизоцима, естественных гемагглютининов, фагоцитарной активности нейтрофилов и неферментных лизосомально-катионных белков, лейкоцитарного состава крови в качестве способа комплексной оценки морфофункционального состояния организма карпа, культивируемого в аквакультуре.

Предлагаемые показатели позволяют проводить прижизненный анализ, доступны в производственных условиях, при этом они объективно отражают состояние рыб.

Данный комплекс иммунофизиологических показателей применим для оценки условий содержания карпа и прогнозирования заболеваний рыб.

При применении предлагаемого метода рекомендуется предварительное проведение фоновых исследований для уточнения нормы реакции используемых показателей у изучаемых рыб.

2. Предлагаемый комплекс показателей позволяет осуществлять им-мунофизиологический мониторинг с целью оценки воздействия загрязнения воды на рыб в естественных ареалах их оби гания.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

I. Крючков В.Н., Андреев В.В., Григорьев В.А. Мониторинг загрязнения дельты Волги тяжелыми металлами // Экологические проблемы Волги: тез.докл. к региональной конференции. - Саратов, 1989. - С. 208 - 210.

2. Крючков В.Н., Григорьев В.А. Содержание тяжелых металлов в воде водоемов Водго-Ахтубинской поймы // Проблемы изучения, охраны и рационального использования природных ресурсов Волго-Ахтубинской поймы. - Астрахань, 1989. - С. 34 -35.

3. Земков Г.В., Крючков В.Н., Акберова Т.Р. Изменения клеточного фактора иммунитета в зависимости от морфофункциональных нарушений в печени и почках карпа под влияниям промышленных сточных вод // Вопросы экологии гидробионтов: Сб. научных трудов. - М.:

ВНИИПРХ, 1991.-Вып. 64.-С. 124 - 126.

4. Крючков В.Н., Земков Г.В. Оценка эффективности очистки сточных вод на основе традиционных гематологических показателей у рыб // Тез. докл. второй всесоюзной конференции по рыбохозяйственной токсикологии. - Санкт-Петербург, 1991.-Т. 1.-С. 306-307.

5. Крючков В.Н. Клеточный состав периферической крови .карпа на фоне накопления хлорорганических пестицидов // Водные биоресурсы, воспроизводство и экология гидробионтов: Сб. научных трудов. - М: ВНИИПРХ, - 1992.-Вып. 66. - С. 110-115.

6. Крючков В.Н., Антонова Л.А. Патогистологические изменения внутренних органов карпа в зависимости от содержания тяжелых металлов // Вопросы генетического и экологического мониторинга объектов рыбоводства. - М.: ВНИИПРХ, 1992. - Вып. 68. - С. 88 - 94.

7. Крючков В.Н., Нгуен Ван Хао, Мохамед Сайд Ахмед, Федорова H.H. Патологические изменения в почках карповых рыб при накоплении кадмия //Тез. докл. научно-практической конф. по экологическим проблемам сельского и водного хозяйства Поволжья. - Саратов, 1992. - С. 55.

8. Зайцев В.Ф., Григорьев В.А., Крючков В.Н. Особенности распределения тяжелых металлов в органах и тканях туводных видов ихтиофауны Волго-Ахтубинской поймы // Вестник Астраханского техн. ин-та рыбной пром. и хоз. - М, 1993. - С. 69 - 71.

9. Крючков В.Н., Антонова Л.А. Патоморфология тканей карпа при хронических интоксикациях в условиях прудового хозяйства // Вестник Астраханского техн. ин-та рыбной пром. и хоз. - М., 1993. - С. 104 - 106.

10. Антонова Л.А., Крючков В.Н. Морфофункциональные критерии оценки состояния туводных рыб Нижней Волги // Вестник АГТУ. Со. научных трудов. Вып. 2. - Астрахань: Астр. гос. техн. университет, 1996 - С. 89 -93.