Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфофункциональные изменения двигательных единиц камбаловидной мышцы и ее антагониста в условиях постгипокинетической реадаптации.

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Морфофункциональные изменения двигательных единиц камбаловидной мышцы и ее антагониста в условиях постгипокинетической реадаптации."

На правах рукописи УДК: 611.018.6:612.766.2

Афанасьев Максим Александрович

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ДВИГАТЕЛЬНЫХ ЕДИНИЦ КАМБАЛОВИДНОЙ МЫШЦЫ И ЕЁ АНТАГОНИСТА В УСЛОВИЯХ ПОСТГИПОКИНЕТИЧЕСКОЙ РЕАДАПТАЦИИ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

г ь и:ол 2013

Москва-2013

005531676

005531676

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Первого Московского государственного медицинского университета имени И. М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущее учреждепие:

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Кузнецов Сергей Львович

доктор биологических наук, профессор Шенкмав Борис Стивович

Омельяненко Николай Петрович

доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией соединительной ткани с группой клинической генетики ФГБУ «ЦИТО имени Н.Н.Приорова» Минздрава России

Дубовая Татьяна Клеониковна

доктор медицинских наук, профессор, профессор кафедры гистологии

и эмбриологии ГБОУ ВПО «РНИМУ имени Н. И. Пирогова» Минздрава России

ФГБУ «Научно-исследовательский институт морфологии человека» РАМН

Защита диссертации состоится

2013 года

в 14 часов на заседай™ диссертационного совета Д. 208.040.01 при ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И. М. Сеченова Минздрава России по адресу: 119992, г. Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной медицинской библиотеке ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М.Сеченова Минздрава России по адресу: 117418, г. Москва, Нахимовский проспект, д. 49.

Автореферат разослан «_»

2013 года

Учёный секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Салтыков Борис Борисович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Как известно, мышечная система млекопитающих адаптирована к действию гравитационных сил, присутствующих на Земле. Устранение опорной нагрузки в условиях реальной невесомости или в эксперименте па Земле неизбежно ведёт к развитию гипогравитационного двигательного синдрома, проявляющегося мышечной слабостью, атонией, арефлексией, атрофией мышечных волокон. К настоящему времени показано, что в условиях микрогравитации происходят специфические изменения активности двигательных нейронов, иннервирующих тыльные сгибатели и разгибатели в голеностопном суставе, а также самих волокон, составляющих эти мышцы [И. Б. Козловская, 2007].

Несмотря на обширный раздел гистофизиологии, посвященный двигательным единицам, практически малоизученными остаются изменения, как в нервном, так и в мышечном звене их, происходящие в условиях краткосрочной микрогравитации и последующего кратковременного (до 7 суток) периода реадаптации. Так, например, до сих пор неизвестны «тонкие» морфофункциональные процессы, протекающие в соматических клетках мотонейронов, иннервирующих скелетные мышцы в указанных выше условиях. Кроме того, установив динамические изменения профиля метаболизма в мышечных волокнах, и сопоставив таковые с изменениями в мотонейронах, составляющих вместе с ними общие моторные единицы, можно проследить их взаимоотношения. Следовательно, изучив и, самое главное, поняв эти структурные и физиологические изменения (т.н. адаптационные перестройки) на ультраструктурном (гистологическом) уровне, появляются возможности влиять на эти процессы.

Таким образом, актуальность настоящего исследования - в необходимости получения новых фундаментальных знаний об активности спинальных мотонейронов и изменениях волокон скелетных мышц, иннервируемых ими в условиях постатрофического восстановления, путём изучения реакции этих морфологических структур.

Цель и задачи исследования. Целью работы является изучение изменений (реакции) мотонейронов и мышц, иннервируемых ими у крыс в условиях постгипокинетической реадаптации.

В связи с поставленной целью, возникает необходимость в решении следующих задач:

1) выявить динамику сырого и сухого веса мышц голени (камбаловидной и передней большеберцовой) в ответ на последующую после функциональной разгрузки реадаптацию;

2) определить изменения площади поперечного сечения волокон этих мышц в процессе антиортостатической гипокинезии и при восстановлении, и сравнить их между собой;

3) исследовать энергетические субстраты в волокнах указанных мышц, а именно - содержание полисахарида гликогена и триглицеридов;

4) оценить морфологические показатели мотонейронов (определить площадь перикариона мотонейронов; изучить ядерный аппарат мотонейронов на наличие c-fos белков);

5) выявить наиболее информативные (лабильные) для данных экспериментальных условий клеточные маркёры" мотонейронов и волокон мышц, иннервируемых ими.

Научная новизна. В настоящей работе впервые:

■ показано частичное восстановление как сырого, так и сухого веса камбаловидной мышцы {musculus solens) крысы за период 7-суточного восстановления;

■ обнаружено, что недельное восстановление сопровождается полным возвращением значений сырого веса передней большеберцовой мышцы (musculus tibialis cranialis) крысы к исходным;

■ показано значимое повышение содержания гликогена в мышечных волокнах I и II типа передней большеберцовой мышцы на третьи сутки реадаптации по сравнению с двухнедельным вывешиванием и 7-суточным восстановлением.

1 продемонстрировано, что содержание триглицеридов в волокнах обоего типа камбаловидной мышцы крысы в конце второй недели моделируемой гипогравитации не отличается значимо ни от контроля, ни от реадаптационного периода;

■ выявлено снижение содержания триглицеридов в быстрых и медленных волокнах передней большеберцовой мышцы по окончании 3 и 7 суток постгипокинетической реадаптации;

■ установлено отсутствие динамики содержания ядерных c-fos белков, а также

0 В настоящей работе под клеточными маркёрами, или маркерами функционального

состояния клеток, следует понимать изучаемые параметры (показатели), изменение

которых свидетельствуют о функпионалыюм состоянии клеток (мышечного волокна,

мотонейрона).

размера (площади) перикариона мотонейронов, иннервирующих мышцы голени у крысы после двухнедельного периода устранения опоры и на протяжении раннего периода реадаптации.

Научно-практическая ценность. Диссертациоииая работа относится к фундаментальным исследованиям.

Совокупность полученных в ходе проведённого экспериментального исследования данных и их анализ дают представление о характере метаболических изменений, происходящих в различных структурах двигательных (моторных) единиц в условиях моделируемой микрогравитации и восстановления после неё. Полученные данные являются важными для дальнейшего изучения механизмов метаболической регуляции, происходящих в двигательной системе в течение постгипокинетической реадаптации, что существенно для клеточной биологии, цитологии, гистологии.

В целом, результаты настоящей работы расширяют представления об особенностях нормальной гистологии нервной ткани спинного мозга и скелетной мышечной ткани, и могут послужить методологической основой для научного обоснования и разработки эффективных способов коррекции гипокинетических мышечных синдромов, профилактических мероприятий как в авиакосмической медицине, так и в клинике нервных болезней.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Постгипокинетическое восстановление (на сроках 3 и 7 суток) после двухнедельной функциональной разгрузки крысы, выполненной путём антиортостатического подвешивания их приводит к полному или почти полному восстановлению изученных параметров мышц-антагонистов области голени, а именно сырого и сухого веса мышц, внутриклеточного содержания энергетических субстратов - триглицеридов и гликогена.

2. Ни двухнедельный период гипогравитационной разгрузки, ни последующее краткосрочное восстановление не приводят к существенным изменениям в количестве мотонейронов, иннервирующих изученные мышцы, площади перикариона этих клеток и содержании ядерных с-/о5 белков, как индикатора клеточного стресса.

3. Изменения в мышечных волокнах являются более динамически выраженными, нежели таковые, происходящие в процессе эксперимента в мотонейронах, иннервирующих эти мышцы.

Апробация работы. Диссертация апробирована на заседании кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии Первого МГМУ имени И. М. Сеченова

07 мая 2013 года (Протокол № 5), рекомендована к защите. Результаты исследований и основные положения настоящей работы были представлены и обсуждены на: Конференции Общества молодых учёных и специалистов Первого МГМУ имени И. М. Сеченова: «Аспирантские и докторантские чтения: Дерзания нового времени - поиск инноваций» (Москва, Россия, 2012), VI Всероссийской конференции молодых учёных-медиков (Казань, Россия, 2012), 77-й Республиканской научной конференции студентов и молодых учёных с международным участием «Вопросы теоретической и практической медицины» (Уфа, Россия, 2012), XI Конгрессе Международной ассоциации морфологов (Самара, Россия, 2012).

Личный вклад автора. Вклад автора в данную научную работу является определяющим. Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования. Весь материал диссертации собран, обработан и проанализирован лично автором. Полученные результаты изложены в научных публикациях и докладах.

Публикации. Результаты настоящей диссертации изложены в десяти публикациях в научных журналах и сборниках (материалах) конференций, из них четыре - в ведущих российских рецензируемых журналах, входящих в Перечень Высшей аттестационной комиссии при Министерстве образования и науки Российской Федерации.

Внедрение. Материалы диссертации используются в учебно-педагогическом процессе при подготовке студентов на кафедре гистологии, цитологии и эмбриологии ГБОУВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И. М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (имеется акт внедрения) и в практической работе лаборатории миологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Государственного научного центра Российской Федерации - Института медико-биологических проблем Российской академии наук (ФГБУН ГНЦ РФ - ИМБП РАН), занимающейся проблемами адаптации двигательной системы к условиям невесомости.

Структура и объём диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания организации эксперимента и методик обработки биологического материала, изложения результатов проведённого исследования и их обсуждения, общего заключения, выводов, и указателя литературы; представлена в одном томе объёмом 104 страницы печатного текста, иллюстрирована 29 рисунками, 5 таблицами; библиографический

список содержит 204 цитируемых источника, из которых 61 - отечественный и 143 - зарубежных. Диссертация изложена на русском языке.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Практическая часть настоящего исследования проводилась на базе лаборатории миологии ФГБУН ГНЦ РФ - ИМБП РАН. Для эксперимента в лаборатории использовались интактные половозрелые белые крысы-самцы с массой перед экспериментом 250 - 280 г, выращенные в питомнике ФГБУН ГНЦ РФ - ИМБП РАН.

В экспериментальной серии использовали сорок восемь лабораторных животных, которых случайным образом распределили (рандомизировали) на группы (табл. 1).

Табл. ¿Распределение животных в эксперименте но группам

Название экспериментальной группы Количество животных

ш. soleus m. tibialis cranialis

контроль 6 6

14-сут. вывешивание 6 6

3-сут. восстановление после вывешивания 6 6

7-сут. восстановление после вывешивания 6 6

После транспортировки животных и периода их адаптации за 15, 18 и 22 дня (в зависимости от экспериментальной группы) до окончания эксперимента проводилось ретроградное мечение мотонейронов, иннервирующих изучаемые мышцы. Для этого за определённый промежуток времени всем животным под внутрибрюшинным наркозом непосредственно в брюшко одной из исследуемых мышц левой задней конечности вводили нейрональный флуоресцентный трейсер 1,1-дилинолеил - 3,3,3,3 - тетраметилиндо-карбоцианин (Invitrogen™ Corporation, Molecular probes, D7756, США), после чего рану ушивали, и животное выводили из наркоза в течение 1-2 сут.

В дальнейшем, животных из экспериментальных групп, за исключением группы контроля (находились в обычных клетках в течение 2 нед.), подвергали функциональной разгрузке с последующим восстановлением (3 и 7 сут.).

Гравитационную разгрузку задних конечностей крысы проводили вывешиванием за хвост в специальной клетке (боксе) по методу Ильина-Новикова в модификации Морей-Холтон [Е. А. Ильин и соавт., 1980; Е. R. Morey et al., 1979; Е. R. Morey-Holton et al., 1981, 2002; X. J. Musacchia et al., 1980] таким образом, чтобы задние конечности не касались земли, а передние опирались на пол; при этом животное могло свободно перемещаться

внутри клетки. Тело лабораторного животного располагалось при этом под углом 45° к полу клетки.

Перед взятием биоматериала определяли массу животного, и выполняли повторную наркотизацию. Материалом для микроскопического исследования послужили: поперечнополосатая мышечная ткань из правой (немеченной трейсером) конечности, а также образцы поясничного утолщения спинного мозга.

Меченные трейсером мышцы максимально полно выделяли (в пределах сухожилий), извлекали, определяли сырой, а через 24 часа экспозиции в термостате (при Т = 37 °С), и сухой вес каждой мышцы. Полученные мышечные пробы тотчас после извлечения фиксировали с использованием тканевого клея Tissue-Tek® (OCT™ Compound 4583) на специально подготовленной подложке из картона и в таком состоянии немедленно замораживали в жидком азоте.

Вслед за этим выполняли т.н. перфузионную фиксацию [спинного мозга], или последовательную транскардиальную перфузию: сначала - 150 - 200 мл изотонического раствора хлорида натрия, а затем - аналогичным объёмом 4 % раствора формальдегида. В процессе перфузии наркотизированного животного происходит вымывание всей крови и безболезненная гибель (эвтаназия) животного. По окончании перфузии извлекался спинной мозг из позвоночного канала на всём протяжении. До замораживания спинной мозг дополнительно фиксировали в 4 % водном растворе формальдегида на одни сутки, далее промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и погружали в 30 % раствор сахарозы на двое суток; оба раствора с пробами спинного мозга хранили в холодильнике. Впоследствии пробы - фрагмент спинного мозга на уровне поясничного утолщения - ориентировали на плотной бумажной подложке с помощью тканевого клея и также замораживали в жидком азоте.

Вплоть до обработки мышечные образцы и пробы спинного мозга хранили при температуре - 80°С.

На основе забранного мышечного материала и проб спинного мозга в дальнейшем изготавливались гистологические препараты (серийные криостатные срезы толщиной 10 мкм и 20 мкм соответственно) с использованием ротационного микротома-криостата.

Все процедуры, проводимые в данном эксперименте с участием животных, были одобрены Комиссией по биомедицинской этике ФГБУН ГНЦ РФ -ИМБП РАН

В итоге были проанализированы следующие параметры:

■ локализация и количество меченых мотонейронов, иннервирующих камбаловидную и переднюю большеберцовую мышцы,

■ площадь перикариона меченых мотонейронов,

■ количество мотонейронов, синтезирующих c-fos белки,

■ макроскопические для мышц: сырой и сухой вес, относительное содержание неводного компонента,

" микроскопические для мышц: площадь поперечного сечения быстрых и медленных мышечных волокон, содержание гликогена и триглицеридов (жиров) в них.

Для оценки функционального состояния мотонейронов, иннервирующих исследуемые мышцы, проводили: подсчёт общего количества меченых мотонейронов у каждой крысы; измерение площади перикариона этих клеток; определение числа с-/о.у-позитивных клеток среди популяции меченых мотонейронов. С этой целью использовался непрямой (высокочувствительный) метод детекции (непрямая иммуногистохимия) с применением антител двух типов: первичных моноклональных, обладающих высокой специфичностью, и вторичных поликлоналышх, связанных с флуорохромом. Для иммуногистохимического (иммуноцитохимического) окрашивания мотонейронов спинного мозга применялись антитела против ядерных c-fos белков. Окраска серийных замороженных поперечных срезов поясничного утолщения спинного мозга (уровень сегментов L4 - L5) проводилась по специфической методике, разработанной фирмой-производителем антител (Sigma Chemical, США). В качестве негативного (отрицательного) контроля антител использовались срезы, инкубированные в отсутствие первичных антител. Анализу подвергались только мотонейроны, меченные трейсером. В каждом случае на серии срезов была проанализирована популяция в 50 - 70 клеток передних рогов спинного мозга, взятого от каждого животного. Во избежание учёта нейронов, экспрессирующих c-fos белки, но не участвующих в иннервации исследуемых мышц, один и тот же срез фотографировали под разными возбуждающими светофильтрами флюоресцентного бинокулярного микроскопа при 20-кратном увеличении, и соединённого с персональным компьютером. Виртуально совместив полученные изображения одного и того же среза, подсчитывали количество меченых мотонейронов, ядра которых содержат c-fos белки, и измеряли площадь перикариона всех меченых мотонейронов.

Для определения содержания энергетических субстратов в волокнах криостатных поперечных срезов мышечной ткани использовались набор

реактивов и методика окраски, разработанные фирмой-производителем (SIGMA-ALDRICH). После гистохимического окрашивания мышечных срезов на гликоген / триглицериды (PAS-реакция / окраска OIL RED), на них наносили первичные моноклональные (после нанесения их на предметные стёкла помещали в термостат /37-38 °С/ на 1 час) и вторичные, связанные с флуорохромом FITC (на 30 мин в тёмное место) антитела против быстрых (MHCfcst) или медленных (MHCS|0W) тяжёлых цепей миозина с целью типирования мышечных волокон. Срезы, которые инкубировали без первичных антител, использовались как отрицательный, или негативный контроль антител. Таким образом, гистохимическое выявление полисахарида гликогена / триглицеридов осуществлялось методом т.н. двойного мечения (как в быстрых, так и в медленных волокнах). Непосредственно перед микроскопией исследуемые образцы заключали в 10 % водный раствор глицерола [G. Schaart et al., 2004; R. Koopman et al., 2001].

Один и тот же гистологический срез скелетной мышцы фотографировали сначала в видимом проходящем свете (для выявления гликогена) или под светофильтром с длиной волны 500-565 нм /зелёный спектр/ (для выявления уровня триглицеридов), а затем под светофильтром с длиной волны пропускания 440-480 нм /синий спектральный цвет/ (с целью дифференцировки типа волокон) флюоресцентного бинокулярного микроскопа, также при 20-кратном увеличении. Содержание энергетических субстратов в волокнах определённого типа (I или II) проводили, виртуально наложив изображения, полученные при разном освещении (обычном световом или определённом флуоресцентном) друг на друга. Все измерения (анализ срезов) проводили на микрофотографиях с помощью программного обеспечения анализа изображений Quantimet 500М производства Leica (Германия). Фотометрическую калибровку проводили на чистом поле. Определение содержания энергетических субстратов анализировали не менее чем в 20 волокнах мышцы, взятой от каждого лабораторного животного.

Математико-статистическая обработка полученных в ходе эксперимента данных была произведена на персональном компьютере, используя лицензионные пакеты статистических программ Microsoft Excel (Microsoft Office 2003) и SPSS for Windows (version 12) (SPSS Corp.). Для сравнения средних величин применяли однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA-test). При оценке достоверности выявленных различий между средними значениями выборок и достоверности полученной корреляции рассчитывалась вероятность ошибки р. В настоящем экспериментальном исследовании

результаты различия средних значений исследуемого показателя между группами были признаны статистически значимыми на уровне р < 0,05 [А. Е. Платонов, 2000].

Результаты собственных исследований и их обсуждение

Изменения сырого и сухого веса мышц голени, возникающие на фоне опорной разгрузки и в процессе восстановления после неё. После определения сырого и сухого веса каждой из исследуемых мышц, с целью устранения погрешности в оценке этих параметров, обусловленной различиями массы животного, вычисляли относительный вес данной мышцы, и на полученных итоговых графиках по оси ординат откладывались значения относительного сырого (сухого) веса мышцы, выраженные в т.н. условных единицах. Впоследствии производили сравнение полученных условных единиц веса данной мышцы между всеми экспериментальными группами.

При определении сырого веса камбаловидной мышцы оказалось, что двухнедельное вывешивание в антиортостатическом положении приводит к его снижению, что согласуется с данными многих исследователей [D. A. Riley et al., 1990], полученными ранее. В результате трёхдневного восстановления сырой вес изменился незначительно. К 7 суткам периода восстановления он увеличился. Таким образом, спустя 3 и, особенно, 7 суток периода реадаптации значения данного показателя стремились к контрольным (отмечена тенденция). Однако, как нами было показано, что одной недели периода постгипокинетической реадаптации недостаточно для возвращения сырого веса камбаловидной мышцы к исходным значениям (рис. 1 слева).

Изменение сухого веса этой мышцы происходило пропорционально изменению её сырого веса.

Сырой вес антагониста камбаловидной мышцы - передней большеберцовой, на протяжении всего эксперимента менялся следующим образом (рис. 1 справа). Показано, в частности, снижение сырого веса в группе двухнедельного антиортостатического вывешивания относительно контроля. Спустя 3 суток восстановления происходит незначительное увеличение веса. Через 7 суток реадаптационного периода вес мышцы восстанавливается до контрольных значений.

Динамика сухого веса передней большеберцовой мышцы изменялась почти пропорционально изменениям сырого веса. Так, через 2 недели периода функциональной разгрузки сухой вес этой мышцы снижается. По окончании 3 суток и, особенно, 7 суток восстановления различие между группами

постепенно сокращается. Однако достоверных изменений сухого веса данной мышцы на протяжении эксперимента не зафиксировано.

Рис. 1. Динамика относительного сырого и сухого веса камбаловидной (слева) и передней большеберцовой (справа) мышц (в условных единицах).

Примечание. Данные на графиках приведены в виде арифметического среднего и стандартной ошибки среднего; * - высокодостоверное отличие по отношению к контролю; # - высокодостоверное отличие по отношению к группе «14-сут. антиортостатическое вывешивание»

Кроме того, нами было посчитано соотношение сухого веса каждой из мышц к сырому, и таким образом показано, что содержание неводного (органического) компонента передней большеберцовой мышцы на протяжении всего эксперимента остаётся постоянным, и составляет в среднем 20 %, а в камбаловидной мышце поддерживается на уровне 25 %, и лишь по окончании седьмых суток периода восстановления оно незначительно снижается (рис. 2). Таким образом, установлена достаточно жёсткая корреляция между сырым и сухим весом обеих мышц, что может говорить о значительном вкладе в развитие дистрофических процессов в мышце водного компонента.

неводный компонент, %

-т. БсЯеиБ

—т. сгаЫаП5

14-сут. вывешивание

3-сут. оосстановл.

7-сут. восстанет л.

Экспериментальные группы

Рис. 2. Динамика относительного содержания (доли) неводного компонента камбаловидной и передней большеберцовой мышц (в процентах).

Примечание. Результаты приведены в виде арифметического среднего и стандартной ошибки среднего

Согласно литературным данным известно, что опорная разгрузка, возникающая как в реальной, так и при моделируемой невесомости, непременно приводит к уменьшению массы скелетных мышц [А. И. Григорьев и соавт., 1987]. Двухнедельная антиортостатическая гипокинезия крыс, осуществляемая путём подвешивания их за хвост, приводит к снижению сырого веса обеих исследуемых мышц-антагонистов голени [Е. И. Ильина-Какуева,1985], что может свидетельствовать о гипотрофии мышечных волокон, а также о снижении объёма жидких компонентов (плазмы и т.д.), возникающих вследствие расстройства микроциркуляции. Вместе с тем мы показали, что через 7 дней восстановления после 14-суточного вывешивания происходит полное (для передней болынеберцовой мышцы) или почти полное (для камбаловидной мышцы) восстановление сырого веса до контрольных значений. Наши данные согласуются с данными [X. I. МиэассЫа е! а1., 1983, 1990], которые показали, что при сравнении моделируемой гравитационной разгрузки с реальной масса указанных и смежно расположенных мышц восстанавливается через 7-14 дней после аналогичных сроков вывешивания животных.

После антиортостатического вывешивания, осуществляемого на протяжении двух недель, наблюдалось пропорциональное уменьшение и воды, и сухого (неводного) веса обеих исследуемых мышц, причём эта разница для камбаловидной мышцы была высокодостоверной. Потеря сухого веса мышцы косвенно может говорить о происходящей в ней гипотрофии. В конце третьих суток реадаптации и, главным образом, после семи суток данного периода наблюдается увеличение содержания воды в этих мышцах. Причиной этого, вероятно, является снижение уровня гидратации организма в ответ на краткосрочную микрогравитацию, возникающую как в реальных, так и имитируемых условиях невесомости. При этом происходит снижение объёма циркулирующей плазмы, внутри- и внеклеточной воды. Таким образом, важнейшую роль в потере сырого веса мышцы во время гипогравитации играет потеря жидкости, что согласуется с данными [У. ОЫга й а1., 1992, 2000, 2002]. Вместе с тем в этих наблюдениях потеря мышечного белка, а также воды в процессе антиортостатической разгрузки оказываются пропорциональными в камбаловидной мышце, и не меняет соотношение этих компонентов в её сыром весе. Кроме того, можно предположить, что снижение содержания жидкого компонента в волокнах обуславливает, как показано ниже, уменьшение их площади поперечного сечения в той и другой мышцах. Одновременно с этим вклад в восстановление сырого веса, а также площади поперечного сечения мышечных волокон вносят восстановление белкового

состава мышцы, её регидратация и др. В настоящей работе продемонстрировано очевидная асинхронность процессов восстановления для каждой из исследуемых мышц. На седьмые сутки периода реадаптации отмечалось восстановление как сырого веса камбаловидной мышцы, так и площади поперечного сечения её волокон за счёт восстановления преимущественно её водного компонента, на что в свою очередь указывает отсутствие значимого увеличения сухого веса данной мышцы по сравнению с его значениями полученными в группе реадаптации. Весьма сходные данные для камбаловидной мышцы крысы были получены в экспериментах проведённых группой авторов [К. Goto et al., 2003].

Влияние антиортостатического вывешивания и ностгипо-кинетической реадаптации на площадь поперечного сечения мышечных волокон (ППС MB). Четырнадцатисуточная антиортостатическая разгрузка приводит к статистически значимому снижению ППС MB обоих типов камбаловидной мышцы и MB 1 типа передней большеберцовой мышцы (рис. 3 слева). Таким образом, восстановление Г1ПС волокон типа II в условиях нашего эксперимента происходит медленнее, чем волокон типа I. Но и те и другие к 7-м суткам периода реадаптации не достигают нормальных значений.

Весьма похожие данные динамики площади поперечного сечения волокон после 16-суточной гипокинезии ранее было продемонстрировано в источнике [X. D. Wang et al., 2006]. В то же самое время достоверных отличий ППС быстрых волокон передней большеберцовой мышцы во всех подопытных группах от контроля отмечено не было (рис. 3 справа); одновременно с этим

контроль 14-сут. З-сут. 7-сут

вывешивание восстанови. восстанови. Экспериментальные группы

Экспериментальные группы

ППС Мвт,»1, m

3000

в MB I типа s MB |[ типа

nnCMSnitib., мим

2000 1500 1600 1400 1200 1000 800 боо

400 200 0

1М81типа

Рис. 3. Изменение площади поперечного сечения волокон камбаловидной (слева) и передней большеберцовой (справа) мышц (в мкм2) в течение эксперимента.

Примечание. Результаты на графике приведены в виде арифметического среднего и стандартной ошибки среднего; * - высокодостоверное отличие от группы «Контроль»; # - высокодостоверное отличие от группы «14-сут. антиортостатическое вывешивание»

было зафиксировано некоторое снижение ППС медленных волокон её после периода устранения опоры и на третьи сутки восстановления. В ходе трёхи семисуточной послеразгрузочной реадаптации отмечено постепенное увеличение ППС обоих типов волокон камбаловидной мышцы.

Таким образом, установлена тесная корреляционная зависимость между сырым весом мышцы и площадью поперечного сечения волокон, входящих в её структуру. Редукция ППС МВ, наблюдаемая параллельно с уменьшением сырого веса мышцы свидетельствует о том, что первая связана с дегидратацией (обезвоживанием) волокон. Сравнительная динамика площади поперечного сечения для каждого из типов волокон мышц-антагонистов наглядно иллюстрируют графики, изображённые на рисунке 4.

экспериментальных группах.

Примечание. Результаты на графике приведены в виде арифметического среднего и стандартной ошибки среднего

Весьма похожие динамические изменения, возникающие во время функциональной разгрузки и на ранних сроках восстановительного периода иллюстрирует ППС МВ, исследуемых в криостатных срезах. Эти данные корреспондируются с данными, полученными для камбаловидной мышцы, другими авторами [Е. И. Ильина-Какуева и др., 1976, 1981, 1985, 2005]. Восстановление площади поперечного сечения мышечных волокон и сырого веса передней болыпеберцовой мышцы, по-видимому, также осуществлялось с участием вышеуказанных механизмов, однако литературных данных по этому вопросу нам найти не удалось.

В настоящем исследовании, кроме того, было определено пропорциональное соотношение МВ I и II типа внутри каждой из изучаемых

мышц. Оказалось, что в камбаловидной и передней большеберцовой мышцах это отношение оставалось практически неизменным во всех экспериментальных группах. Для камбаловидной мышцы доля волокон типа I составила в среднем 87 %, для передней большеберцовой - 38 %. Таким образом, это может говорить о постоянстве сократительного фенотипа волокна, на возможность которого ранее указывали другие авторы [С. Л. Кузнецов, 1989; Y. Ohira et al., 1999; M. Zhou et al., 1995]. Тем не менее, в литературе имеются сведения о возможном сдвиге (трансформации) волокон во время экспозиции животного в условиях антиортостатичеекого вывешивании в быструю сторону [В. С. Оганов, 1982; T. P. Martin et al., 1988; R. R. Roy et al., 1996; R. J. Talmage et al., 1996; D. B. Thomason et al., 1990].

Содержание энергетических субстратов в волокнах камбаловидной мышцы после функциональной разгрузки и на разных сроках восстановления. При анализе внутриклеточного содержания гликогена в мышечных волокон обоих типов камбаловидной мышцы как одного из энергетических субстратов нами было обнаружено следующее. В условиях двухнедельной моделируемой микрогравитации в медленных волокнах мышцы в сравнении с контрольной группой не изменяется. Спустя 3 суток реадаптации концентрация этого субстрата в волокнах данного типа несколько снизилась. Наконец, по окончании недельного восстановления значение данного показателя нормализовалось. В свою очередь, в быстрых волокнах мышцы наблюдается схожая динамика содержания гликогена; на третьи сутки постгипокинетического восстановления разница снижается более значительно, чем в медленных. К концу 7-х суток этого периода уровень изучаемого полисахарида нормализовался (рис. 5 слева).

Предполагается, что отсутствие достоверных отличий уровня гликогена в волокнах мышцы в контроле и по окончании антиортостатичеекого вывешивания в течение двух недель, связано с тем, что волокна I типа, обладающие оксидативной метаболической активностью, мало зависят от источника энергии — гликогена. Данный факт отмечен и другой группой авторов [М. Г. Тавитова и соавт., 2011]. Кроме того, ими же были показаны активные изменения содержания гликогена в более ранние сроки (3 сут.) имитируемой невесомости. В мышечных волокнах II типа, имеющих как оксидативный, так и гликолитический тип энергетического обмена отсутствие изменений во внутриклеточном содержании исследуемого полисахарида, возможно, обусловлено изменением нервной активации, что, в частности, соответствует информации об отсутствии различий электромиографической

активности данной мышцы лабораторного животного спустя 12 суток моделируемой гипогравитации относительно группы контроля [Е. К. А1Сэгс1 <Л а1., 1987].

Одновременно с этим, содержание триглицеридов в различных волокнах камбаловидной мышцы на протяжении всего эксперимента менялось по-разному, в зависимости от их типа. Так, в волокнах типа 1 (медленносокращающихся) данный показатель оставался относительно постоянным: статистически значимых отличий между четырьмя группами эксперимента не отмечалось (рис. 5 справа).

5 I 0.40 ■ 2 ...

| 14-ф. 1-сут. ?-сут. вывешивание восстэноел, восстановп. Экспериментальные группы

Рис. 5. Динамика содержания гликогена (слева) и триглицеридов (справа) в волокнах камбаловидной мышцы.

Примечание. Результаты приведены в виде арифметического среднего и стандартной ошибки среднего; * - высокодостоверное отличие от группы «Контроль»; # - высокодостоверное отличие от группы «14-сут. антиортосгатическое вывешивание»

Иные изменения происходили в течение эксперимента в волокнах типа II (быстросокращающихся): спустя 14 суток аптиортостатического вывешивания отметилась тенденция к снижению внутриклеточного уровня триглицеридов. В дальнейшем, уже на третьи сутки восстановительного периода, этот показатель сравнялся со значением контрольной группы, оставаясь на том же уровне по завершении седьмых суток. В целом же, достоверных отличий по содержанию триглицеридов в быстрых волокнах не зафиксировано, что может быть обусловлено определённым типом метаболизма, свойственный им — гликолитического (при этом основным энергетическим субстратом выступают не жирные кислоты, а полисахариды).

Содержание триглицеридов в течение периода умеренной физической активности также меняется в обоих типах волокон мышц, однако более значимое их расходование происходит в мышечных волокнах с изоформой

тяжёлых цепей миозина I типа, о чём свидетельствуют данные из публикации [L. J. Van Loon et al„ 2003].

Таким образом, динамика содержания энергетических субстратов в волокнах камбаловидной мышцы, являющейся по своей природе антигравитационной, наблюдающаяся в процессе функциональной разгрузки и последующего восстановления, вероятнее всего, опосредована колебаниями внутриклеточного метаболизма.

Содержание энергетических субстратов в волокнах передней большеберцовой мышцы после моделируемой микрогравитации и на разных сроках восстановления. Двухнедельная опорная разгрузка (вывешивание) задних конечностей сопровождается значимым снижением внутриклеточного уровня гликогена преимущественно в медленных волокнах передней большеберцовой мышцы по сравнению с нормой (рис. 6 слева). В быстрых мышечных волокнах при антиортостатическом вывешивании содержание гликогена значимо не меняется. В дальнейшем, на третьи сутки периода восстановления, происходит значительное накопление этого субстрата и в быстрых, и, особенно, в медленных волокнах при сравнении со таковыми значениями, полученными у интактных животных. Наконец, к седьмым суткам реадаптации содержание гликогена в обоих типах волокон не отличалось от контрольных значений.

В мышечных волокнах медленного и быстрого типа было отмечено накопление триглицеридов спустя 2-недельный период устранения опоры (при р < 0,05; рис. 6 справа). Через 3 дня восстановления это различие сократилось. К седьмым суткам периода восстановления после функциональной разгрузки отличие данного показателя от контроля нормализовалось для обоих типов волокон. Увеличение содержания триглицеридов в конце периода функциональной разгрузки в волокнах I типа передней большеберцовой мышцы, на наш взгляд, обусловлено энергетическими затратами за счёт гликогена, а в мышечных волокнах II типа - резервным накоплением к последующей возможной нагрузке. Действительно, при дальнейшем восстановлении уровень триглицеридов в них падает, что наводит на мысль об интенсивном расходовании его.

Статистически значимое возрастание содержания гликогена в волокнах II типа в условиях раннего периода реадаптации происходит из-за возможного ускорения запасания его при внезапном функционировании (нагрузке).

14-СУТ. 3-С»1. вымшиванме восстанови.

Экспериментальные группы

Рис. 6. Динамика содержания гликогена (слева) и триглицеридов (справа) в волокнах передней большеберцовой мышцы.

Примечание. Результаты приведены в виде арифметического среднего и стандартной

ошибки среднего; * - высокодостоверное отличие от группы «Контроль»; # -высокодостоверное отличие от группы «14-сут. антиортостатическое вывешивание»

Следует сказать, что помимо сократительной активности скелетных мышц, на внутриклеточное содержание в них метаболических субстратов, безусловно, оказывает влияние активность некоторых гормонов и биологически активных веществ, таких как соматотропин, инсулин и др., как ранее было показано в работах [Е. .1. Неппкзеп й а1., 1988; М. Р. 0"К^е е! а1., 2004]

Так, на ранних сроках антиортостатического вывешивания происходит снижение концентрации гликогена в волокнах, обусловленное, по-видимому, развитием инсулинорезисгентности, что в свою очередь зависит от активности другого гормона — кортикостерона.

Отсутствие количественных изменений гликогена в конце второй недели непрерывного антиортостатического вывешивания в мышечных волокнах можно связать с тем, что, начиная с шестых суток антиортостатического вывешивания, по данным источника [Р. Калуапо е1 а!., 2002], активизируется транспорт молекул глюкозы в скелетных мышцах крысы и интенсифицируется биосинтез гликогена.

В то же время было показано накопление гликогена в обоих типах волокон мышцы, наблюдаемое в конце третьей недели вывешивания [Е. И. Ильина-Какуева и др., 1985].

Динамика количества и площади перикариона мотонейронов, иннервирующих мышцы голени во время разгрузки и на протяжении реадаптационного периода. Определение площади перикариона проводили

в меченых нейронах с видимым ядром, на уровне Ь4 и 1,5 сегментов спинного мозга, используя флуоресцентную микроскопию (рис. 7).

Количество мотонейронов, помеченное трейсером индокарбоцианином для контрольной и каждой из опытных групп приведено в таблице 1.

Табл. 1. Общее число мотонейронов, маркированных нейрональиым трейсером

Иннервируемая мышца Количество мотонейронов

контроль 14-сут. вывешивание 3-сут. восстановл. 7-сут. восстановл.

т. эокиз 56 ±5 56 ± 6 57 ±8 52 ±2

т. ШаШ сгашаИз 60 ¿4 58 ±7 55 ±5 65 ±5

Динамика площади перикариона мотонейронов, иннервирующих мышцы-антагонисты голени, представленные в таблице 2, демонстрируют следующее. У интактных крыс, а также у животных всех подопытных групп, меченные нейрональиым трейсером мотонейроны, определяемые на уровне Ь4 и Ь5 сегментов спинного мозга, которые иннервируют две мышцы-антагонисты голени, не показали каких-либо существенных изменений площади перикариона.

Табл. 2. Размеры перикариона меченых мотонейронов (мкм2), иннервирующих камбаловидную и переднюю большеберцовую мышцы в разных экспериментальных группах

Иннервируемая мышца Площадь перикариона мотонейропов (мкм2)

контроль 14-сут. вывешивание 3-сут. восстановл. 7-сут. восстановл.

т. 5о1еиз 1597 ±98 1430 ±89 1397 ± 109 1412± 116

т. ШнаНэ сгашаЯя 2125 ±119 1896±139 1907 ±105. 1933 ± 128

Отсутствие изменений в численности исследуемой популяции нервных клеток в условиях настоящего эксперимента может свидетельствовать о физиологических сроках воздействия гипокинезии на организм. Кроме того, отсутствие динамики величины площади перикариона указанной группы мотонейронов также указывает на консервативность этих клеток по отношению к мигрогравитационному влиянию на организм животного.

Таким образом, в настоящем исследовании демонстрируется отсутствие динамики как количества, так и площади сомы мотонейронов, иннервирующих мышцы-антагонисты голени. Полученные данные корреспондируются с таковыми исследователей из Японии [А. ГБЫИага, W. №зЫка\уа, й а!., 2002].

Это, по нашему мнению, может быть связано с тем, что мотонейроны, иннервирующие исследуемые мышцы не затрагиваются из-за уменьшенной нервно-мышечной активности в наземных условиях.

Влияние антиортостатической гипокинезии и последующей реадаптации на количество меченых мотонейронов, содержащих ядерные с-/£».у белки. Выявление экспрессии ядерных с-/об белков проводили по микрофотографиям, полученным с препаратов срезов спинного мозга, зафиксированным под разными светофильтрами флуоресцентного микроскопа с последующим наложением их друг на друга. При этом учитывали только меченые нервные клетки с видимым ядром. Если при совмещении одного и того же изображения среза спинного мозга, но выполненного под разными светофильтрами в области проекции ядра меченного трейсером нейрона обнаруживалась т.н. белая точка (пятнышко), то делали вывод о наличии экспрессии данной клеткой с-/оя белка (рис. 8).

Результаты измерения содержания с-/о.у белков в ядрах меченых мотонейронов, иннервирующих камбаловидную мышцу и её антагонист, переднюю большеберцовую мышцу, наглядно иллюстрирует таблица 3.

Табл. 3. Количество меченых мотонейронов, иннервирующих мышцы голени, ядра которых содержат с-/о.ч белки

Иннервируемая мышца Число о/ох-поттиппых мотоненронов

контроль 14-сут. вывешивание 3-сут. восстановл. 7-сут. восстановл.

т. 5о1еиз 2-3 2-3 2-4 1 -2

т. йЫаНз сгашаИэ 2-4 1-3 1-3 2-3

Количество меченых нейронов поясничного утолщения спинного мозга, содержащих ядерные с^/ау белки, иннервирующих камбаловидную мышцу и её функциональный антагонист в различных экспериментальных группах достоверно не отличалось как внутри этих групп, так и от контрольной группы.

Обобщив полученные экспериментальные данные, можно констатировать следующее. В сравнении с интактной группой 14-суточная антиортостатическая гипокинезия не оказала существенного влияния ни на общее количество меченых мотонейронов, иннервирующих обе исследуемые мышцы, ни на площадь их перикариона, ни на число клеток, ядра которых экспрессируют с-/оз белки. Спустя 3 и 7 суток восстановления после гипокинезии эти показатели также не имели значимых различий ни с интактной группой крыс, ни с группой животных, подвергнутых моделированной гравитационной разгрузке. Сказанное наводит на мысль, что функционально

мотонейроны, несомненно, реагируют на экспериментальные физиологические воздействия, однако морфологических изменений при этом не обнаруживается. Одновременно с этим, на наш взгляд, это может указывать на то, что сила тяжести крайне важна для поддержания метаболических свойств мотонейронов.

Рис. 7. Определение площади перикариона мотонейронов, иннервирующих камбаловидные мышцы в различных экспериментальных группах.

Примечание. На рисунке светятся за счёт флуоресцентной метки

Рис.8. Иммуногистохимическое выявление ядерных c-fos белков меченых спинальных мотонейронов, иннервирующих мышцы голени.

Примечание. На рисунке справа стрелкой в проекции ядра меченой клетки обозначен c-fos белок

Хотя до сих пор не проводилось исследования динамики приведённых показателей в процессе постгипокинетической реадаптации, наши результаты, свидетельствующие об отсутствии изменений упомянутых выше параметров в первую неделю реадаптации, согласуются с результатами измерений активности ряда цитоплазматических энзимов, полученными после моделируемой функциональной разгрузки [А. ЫнЬага е1 а!., 1991, 1995, 1996, 1997, 2006]. Кроме того, имеются сведения об иммуногистохимическом снижении цитоплазматического содержания (экспрессии) другого индикатора клеточной активности нейронов - холинацетилтрансферазы (энзима, участвующего в биосинтезе медиатора ацетилхолина) по окончании 35-дневного антиортостатического вывешивания крыс [Р. Р. Исламов и др., 2007], однако что происходит с этим ферментов в процессе восстановления группа авторов не продемонстрировала.

В настоящей работе было показано, что содержание ядерных с-/оя белков, иннервирующих мышцы голени крысы по окончании двухнедельного периода устранения опоры, а также в процессе реадаптации разной продолжительности (3 и 7 дней) практически не изменились по сравнению с группой «контроль», в связи с чем можно заключить, что их применение в роли клеточных маркёров функциональной активности в условиях антиортостатической гипокинезии (разгрузки) является нецелесообразным. Но в то же время можно говорить об устойчивости, резистентности популяции мотонейронов к подобного рода и продолжительности воздействиям. Несмотря на то, что ген с-_/оу относят к т. н. генам раннего реагирования (пик повышения экспрессии его, как показано большинством экспериментальных исследований, приходится на первые 24-48 часов с момента «экстремального» воздействия), в то же время описана более специфичная отсроченная экспрессия с-/оз, которая чаще связана с развитием патологического процесса, наблюдаемого при повреждающих и стрессорных воздействиях р>. Мо1щттасН ^ а1., 2009; К. в. БуЦисИзеп й а1., 1996] и может приводить к запуску апоптоза. Следовательно, результаты, полученные в нашем исследовании, говорят именно о физиологическом характере воздействия на организм, и, кроме того, о «консервативности» мотонейронов.

* * *

Полученные в эксперименте результаты могут свидетельствовать о следующем. Во-первых, двухнедельное антиортостатическое вывешивание (подвешивание) крысы' оказывает существенное влияние на изучаемые параметры двух скелетных мышц, одна из которых позпая (тоническая), вторая

- фазная, приводя к сдвигу этих показателей в ту или другую сторону на протяжении всего эксперимента. В условиях восстановления большинство исследуемых показателей стремится к исходным (контрольным) значениям, но к третьим суткам периода реадаптации этого не достигается, а к концу первой недели упомянутого периода большинство показателей полностью или почти полностью приближаются к таковым, определённым у интактных животных (группа «контроль»).

Во-вторых, отсутствие какой-либо динамики площади перикариона мотонейронов, иннервирующих волокна камбаловидной и передней большеберцовой мышц, общего числа этих нервных клеток, может указывать на толерантность их к четырнадцатисуточной моделируемой разгрузке и последующему постгипокинетическому восстановлению.

Наконец, низкую экспрессию с-/оя белка - индикатора клеточного стресса

- в ядрах изучаемой популяции мотонейронов можно объяснить отсутствием какого-либо реагирования этих клеток на функциональную разгрузку, проводимую путём антиортостатической гипокинезии, т.е. они, по-видимому, сохраняют свои структурные и, скорее всего, функциональные потенции. Поэтому, когда животное переводится из положения антиортостатического вывешивания в обычное, его скелетные мышцы задних конечностей, «не отказываются» выполнять присущие им обычные функции в наземных условиях — поддержание позы и движение.

Резюмируя сказанное выше, можно заключить: мотонейроны, как иерархически более высокостоящие структуры, одновременно в морфофункционалыюм отношении являются более «консервативными», нежели волокна скелетных мышц, иннервируемые ими, которые в свою очередь, тотчас же реагируют на экстремальные для них условия колебаниями своей метаболической активности. Таким образом, в настоящем экспериментальном исследовании получены новые данные, в частности, результаты, согласующиеся с литературными источниками, способствующие расширению понимания механизмов аккомодации моторных единиц (мотонейронов и скелетных мышц, иннервируемых ими) к воздействию микрогравитации, а также последующей реадаптации к наземным условиям, и способствующие достижению поставленных в работе цели и задач.

Общие выводы:

1. Послеразгрузочная реадаптация крысы в течение 3 и 7 суток после атрофических изменений, вызванных их четырнадцатисуточным экспериментальным вывешиванием сопровождается полным возвращением сырого и сухого веса передней большеберцовой мышцы к контрольным значениям и не приводит к полному восстановлению сырого и сухого веса камбаловидной мышцы.

2. Двухнедельная экспозиция крысы в условиях безопорности ведёт к снижению содержания гликогена в медленных волокнах передней большеберцовой мышцы и отсутствию изменений в быстрых её волокнах, а также в волокнах обоих типов камбаловидной мышцы.

3. Трёхсуточная реадаптация сопровождается снижением содержания гликогена в быстрых и медленных волокнах камбаловидной мышцы, а в волокнах передней большеберцовой мышце — его повышением.

4. К седьмым суткам периода реадаптации содержание гликогена в волокнах обеих мышц-антагонистов [голени] нормализуется.

5. При четырнадцатисуточной гравитационной разгрузке происходит повышение содержания триглицеридов в волокнах обоих типов передней большеберцовой мышцы и не происходит изменения его в волокнах камбаловидной мышцы.

6. Через трое суток последующей реадаптации содержание триглицеридов в волокнах передней большеберцовой мышцы нормализуется, оставаясь на том же уровне к седьмым суткам реадаптации; на 3 и 7 сутки периода реадаптации в волокнах камбаловидной мышцы не происходит изменения содержания данного субстрата в волокнах камбаловидной мышцы.

7. Исследование нейронов, иннервирующих как позную (камбаловидную), так и фазную (переднюю болыпеберцовую) мышцу методом катаболического маркирования, не выявило морфологических (количество мотонейронов, площадь перикариона) и гистохимических изменений (экспрессия ядерного c-fos белка) при антиортостатическом вывешивании и на ранних сроках реадаптации.

8. При оценке двигательных единиц в условиях двухнедельной моделируемой разгрузки, осуществляемой путём антиортостатического вывешивания, и дальнейшей постразгрузочной реадаптации были показаны морфологические и гистохимические изменения в мышечных волокнах, входящих в состав этих единиц при относительной стабильности изученных нами параметров функционального состояния нейронов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Афанасьев М. А. Маркёры функциональной активности спинальных мотонейронов и иннервируемых ими волокон мышц-антагонистов крысы на разных сроках периода послеразгрузочного восстановления. Морфологические ведомости, 2012. № 1. С. 19-23 .

2. Афанасьев М. А. Содержание энергетических субстратов волокон камбаловидной мышцы и её антагониста во время периода восстановления после моделируемой функциональной разгрузки. //Сборник материалов научно-практической конференции «Аспирантские и докторантские чтения: дерзания нового времени - поиск инноваций». Москва, 8 февраля 2012 г. / Под ред.

B. Н. Николенко и др. - М.: Изд-во Первого МГМУ имени И. М. Сеченова, 2012. -224 с.-С. 17-18.

3. Афанасьев М. А. Клеточные маркёры функциональной активности мотонейронов в условиях постгипокинетического восстановления. //Морфология, 2012. Т. 141, №3. Материалы докладов XI Конгресса Международной ассоциации морфологов. Самара, 29 мая - 1 июня 2012 г. -188 с. - С. 14-15.

4. Афанасьев М. А. Влияние повторной адаптации атрофированных мышц голени на их энергетический метаболизм. - Саратовский научно-медицинский журнал, 2012. Т. 8, № 2. С. 181-185.

5. Афанасьев М. А. Функционирование мотонейронов при восстановлении скелетных мышц после разгрузки. //Материалы VI Всероссийской научно-практической конференции молодых учёных-медиков, организованной воронежским, курским, казанскими медицинскими вузами. Казань, 27-28 февраля 2012 г. /Под. ред. К. Ш. Зыятдинова и др. - Казань: ИД «Меддок», 2012. - 288 с. -

C. 246-247.

6. Афанасьев М. А. Оценка эффективности некоторых параметров метаболической активности скелетных мышц при краткосрочном восстановлении после смоделированной разгрузки. //Материалы 77-й Российской научной конференции студентов и молодых учёных, посвящённой 80-летию БГМУ. Уфа, 26-27 апреля 2012 г. /Под. ред. В. Н. Павлова и др. - Уфа: Изд-во ГБОУ ВПО БГМУ, 2012. - Т. 1 - 338 с. - С. 45-47.

7. Кузнецов С. Л., Афанасьев М. А. Уровень триацилглицеридов как показатель метаболизма в волокнах гравитационно-зависимых мышц крысы на ранних сроках постгипокинетической реадаптации. //Морфология, 2012. Т. 141, №3. Материалы докладов XI Конгресса Международной ассоциации морфологов. Самара, 29 мая -1 июня 2012 г. - 188 с. - С. 87.

8. Шенкман Б. С., Афанасьев М. А. Роль иннервации гравитационно-зависимых мышц во время восстановления. //Морфология, 2012. Т. 141, № 3. Материалы докладов XI Конгресса Международной ассоциации морфологов. Самара, 29 мая -1 июня 2012 г.-188 с.-С. 178.

9. Афанасьев М. А., Кузнецов С. Л. Эффекты реальной и моделируемой микрогравитации на некоторые структурно-метаболические параметры скелетных мышц. - Вестник Российской академии медицинских наук, 2013. №1. С. 47-51.

ю. Кузнецов С. Л., Афанасьев М. А. Значение гена раннего реагирования с-/оз и продуктов его экспрессии в нейронах при различных воздействиях. -Биомедицина, 2013. № 1. С. 109-116.

Соискатель

М. А. Афанасьев

Подписано в печать:

16.07.2013

Заказ № 8627 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Афанасьев, Максим Александрович, Москва

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И. М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации

На правах рукописи УДК: 611.018.6:612.766.2

04201361280

Афанасьев Максим Александрович

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ДВИГАТЕЛЬНЫХ ЕДИНИЦ КАМБАЛОВИДНОЙ МЫШЦЫ И ЕЁ АНТАГОНИСТА В УСЛОВИЯХ ПОСТГИПОКИНЕТИЧЕСКОЙ РЕАДАПТАЦИИ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Диссертация на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Научные руководители:

Член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Кузнецов Сергей Львович

Доктор биологических наук, профессор Шенкман Борис Стивович

Москва - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение..........................................................................4

Глава первая. Обзор литературы...................................11

§1. Гистофизиология мышечных волокон.....................11

§2. Строение и классификация мотонейронов..............12

§3. Понятие о двигательных единицах........................14

§4. Принципы классификации мышечных волокон.......16

§5. Нагрузка и тренировка [скелетных мышц]..............19

§6. Изменения в двигательных единицах, происходящие во время функциональной (гравитационной)

разгрузки...........................................................21

§7. Постгипокинетическое восстановление: изменения в двигательных единицах, происходящие на разных

сроках реадаптации.............................................29

§8. Значение гена ЫЪэ и продуктов его экспрессии на

нейроны............................................................30

Глава вторая. Организация и методы исследования.......32

§1. Общая организация исследования.......................32

§2. Способы получения материала............................35

§3. Гистохимические методики....................................37

§4. Статистический анализ результатов.....................43

Глава третья. Полученные результаты и их обсуждение.45 §1. Изменения сырого и сухого веса мышц голени, возникающие на фоне опорной разгрузки и в

процессе восстановления после неё....................45

§2. Влияние антиортостатического вывешивания и постгипокинетической реадаптации на площадь поперечного сечения мышечных волокон...............51

§3. Содержание энергетических субстратов в волокнах камбаловидной мышцы после функциональной

разгрузки и на разных сроках восстановления........56

§4. Содержание энергетических субстратов в волокнах передней большеберцовой мышцы после моделируемой микрогравитации и на разных сроках

восстановления..................................................62

§5. Динамика площади перикариона мотонейронов, иннервирующих мышцы голени во время разгрузки

и на протяжении реадаптационного периода..........67

§6. Влияние антиортостатической гипокинезии и

последующей реадаптации на количество меченых мотонейронов, содержащих ядерные Ыоэ белки....70

Заключение....................................................................74

Выводы..........................................................................76

Благодарности.................................................................78

Список работ, опубликованных по теме диссертации......79

Указатель литературы....................................................81

Принятые сокращения и аббревиатуры........................104

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы.

Как известно, мышечная система млекопитающих адаптирована к действию гравитационных сил, присутствующих на Земле. Устранение опорной нагрузки в условиях невесомости или в эксперименте на Земле неизбежно ведёт к развитию гипогравитационного двигательного синдрома, проявляющегося мышечной слабостью, атонией, арефлексией, атрофией мышечных волокон. К настоящему времени показано, что в условиях микрогравитации происходят специфические изменения активности двигательных нейронов, иннервирующих тыльные сгибатели и разгибатели в голеностопном суставе, а также самих мышечных волокон, образующих эти мышцы [И. Б. Козловская, 2007].

Несмотря на обширный раздел гистофизиологии, посвященный двигательным единицам, практически малоизученными остаются их изменения в гравитационной среде и связанных с этим условиями. Так, например, до сих пор неизвестны «тонкие» биохимические процессы, протекающие в соматических клетках мотонейронов, иннервирующих скелетные мышцы в указанных выше ситуациях. Кроме того, установив динамические изменения профиля метаболизма в мышечных волокнах и, сопоставив таковые с изменениями в мотонейронах, составляющих вместе с ними общие двигательные единицы, можно проследить их взаимоотношения. Следовательно, изучив и, самое главное, поняв данные морфофункциональные изменения (т.н. адаптационные перестройки) на ультраструктурном (гистологическом) уровне, появляются возможности влиять на эти процессы с целью профилактики их неблагоприятного воздействия на организм, например -

предотвращать атрофию мышц, возникающую вследствие снижения функциональной нагрузки и т.д.

Актуальность настоящего исследования состоит в необходимости получения новых фундаментальных знаний об активности спинальных мотонейронов и изменениях мышечных волокон, иннервируемых ими, в условиях постатрофического восстановления путём изучения реакции этих морфологических структур в течение постгипокинетического восстановления.

Полученные результаты могут быть использованы для научного обоснования и разработки современных способов купирования проявлений гипокинетического мышечного синдрома, встречающихся в клинике нервных болезней, что, в конечном счёте, является важной частью в реабилитации таких больных. Кроме того, обнаружение адекватных клеточных маркёров активности мотонейронов, иннервирующих постуральные мышцы находит своё применение и в космической и авиационной медицине. Наконец, повышение длительности космических полётов и усложнение работы экипажа космических кораблей диктуют необходимость разработки новых средств и методов профилактики неблагоприятных последствий действия невесомости, а в случае их возникновения - способов коррекции. Базовые знания о механизмах постгипокинетической реадаптации являются неотъемлемым составным элементом теоретических основ разработки таких средств и методов. Вот почему одним из важных направлений космической медицины и биологии составляют исследования влияний невесомости на двигательный аппарат и системы двигательного регулирования.

В связи с вышеизложенным, изучение морфологических особенностей, происходящих во время восстановления после периода гипокинезии (функциональной разгрузки) как в нервной, так и в мышечной системе, имеет огромное научное и прикладное значение.

Цель и задачи исследования

Целью работы является изучение изменений (реакции) мотонейронов и мышц, иннервируемых ими (т.е. двигательных единиц), у крыс в условиях постгипокинетической реадаптации.

В связи с поставленной целью, возникает необходимость в решении следующих задач:

1) выявить динамику сырого и сухого веса мышц голени (камбаловидной и передней болынеберцовой) в ответ на последующую после функциональной разгрузки реадаптацию;

2) определить изменения площади поперечного сечения волокон этих мышц в процессе антиортостатической гипокинезии и при восстановлении и сравнить их между собой;

3) исследовать энергетические субстраты в волокнах двух мышц: камбаловидной и передней болыпеберцовой, а именно - содержание полисахарида гликогена и триглицеридов;

4) оценить морфологические показатели мотонейронов (определение площади перикариона мотонейронов; изучение ядерного аппарата мотонейронов на наличие белков);

5) выявить наиболее информативные (лабильные) для данных экспериментальных условий клеточные маркёры^ мотонейронов и волокон мышц, иннервируемых ими.

Методологической основой данного исследования являлись морфологические, морфометрические и гистохимические исследования нативного биологического материала, полученного в процессе экспериментального (наземного) моделирования микрогравитации и последующего периода реадаптации после него, и

В настоящей работе под клеточными маркёрами, или маркёрами функционального состояния клеток, следует понимать изучаемые параметры (показатели), изменение которых свидетельствуют о функциональном состоянии клеток (мышечного волокна, мотонейрона).

оценка их достоверности, что в свою очередь обеспечило оценку уровня функциональной активности мотонейронов, а также скелетных мышц-антагонистов, иннервируемых этими нейронами во время гипокинезии (14 суток) и в периоде раннего постгипокинетического восстановления (3 и 7 суток), и, кроме того, учёт зависимости степени изменения метаболизма в указанных структурах в ответ на обозначенные экстремальные влияния. Вышеописанная методология, несомненно, обеспечивает более глубокое понимание системных механизмов приспособления мышечных волокон и моторных нейронов к заданным экспериментом условиям, и, следовательно, в дальнейшем позволит разрабатывать новые подходы превентивных мероприятий.

Научная новизна В настоящей работе впервые:

■ показано частичное восстановление как сырого, так и сухого веса камбаловидной мышцы крысы за период 3- и 7-суточной реадаптации;

■ обнаружено, что недельное восстановление сопровождается полным возвращением значений сырого веса передней большеберцовой мышцы крысы к исходным;

■ показано значимое повышение содержания гликогена в мышечных волокнах I и II типа передней большеберцовой мышцы на третьи сутки реадаптации по сравнению с двухнедельным вывешиванием и 7-суточным восстановлением.

■ продемонстрировано, что содержание триглицеридов в волокнах обоего типа камбаловидной мышцы крысы в конце второй недели моделируемой гипогравитации не отличается значимо ни от контроля, ни от реадаптационного периода;

■ выявлено снижение содержания триглицеридов в быстрых и медленных волокнах передней большеберцовой мышцы по окончании 3 и 7 суток постгипокинетической реадаптации;

■ установлено отсутствие динамики содержания ядерных белков, а также размера (площади) перикариона мотонейронов, иннервирующих мышцы голени у крысы в условиях реадаптации после двухнедельного периода устранения опоры. Научно-практическая ценность

В данной работе продемонстрированы динамические колебания исследуемых параметров мышц - функциональных антагонистов голени (сырого и сухого веса мышц, площади поперечного сечения волокон, составляющих эти мышцы, внутриклеточный уровень некоторых энергетических субстратов) при относительной стабильности реактивных показателей мотонейронов, иннервирующих эти мышцы (площадь перикариона, содержание ядерных о/оя белков) на протяжении всего эксперимента.

В целом, полученные результаты диссертации расширяют представления об особенностях нормальной гистологии нервной ткани спинного мозга и скелетной мышечной ткани, и могут быть использованы для научного обоснования разработки новых методов коррекции гипокинетического мышечного синдрома, профилактических мероприятий в авиакосмической медицине.

Результаты выполненного в рамках диссертационной работы исследования могут оказаться полезными при разработке новых эргогенных технологий в спортивной и экстремальной медицине и новых программ тренировки спортсменов, в частности, как компонентов комплексных методов увеличения мышечной массы спортсменов при различных видах тренировок.

Таким образом, полученные данные, несомненно, представляют важное как клиническое, так и профилактическое значение.

Наконец, результаты настоящего экспериментального исследования используются в учебно-педагогическом процессе на кафедре гистологии, цитологии и эмбриологии Первого Московского государственного

медицинского университета имени И. М. Сеченова и в практической работе лаборатории миологии Института медико-биологических проблем.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Постгипокинетическое восстановление (на сроках 3 и 7 суток) после двухнедельной функциональной разгрузки крысы, выполненной путём антиортостатического подвешивания её приводит к полному или почти полному восстановлению изученных параметров мышц-антагонистов области голени, а именно - сырого и сухого веса мышц, внутриклеточного содержания энергетических субстратов - триглицеридов и гликогена.

2. Ни двухнедельный период гипогравитационной разгрузки, ни последующее краткосрочное восстановление не приводят к существенным изменениям в количестве мотонейронов, иннервирующих изученные мышцы, площади перикариона этих клеток и содержании ядерных с^оз белков, как индикатора клеточного стресса.

3. Изменения в мышечных волокнах являются более динамически выраженными, нежели таковые, происходящие в процессе эксперимента в мотонейронах, иннервирующих эти мышцы.

Общий алгоритм выполнения настоящей диссертационной работы включал в себя следующие три последовательных этапа программы исследования:

I. Изучение состояния вопроса (с исторических и методических позиций) и ретроспективный анализ данных научной литературы.

II. Получение и анализ собственных данных.

III. Формулирование выводов.

Для реализации первого этапа работы, помимо простого описания, использовался т.н. контентный анализ - для выделения содержащихся в источниках информации наиболее значимых в аспекте проводимого исследования сведений, собственно ставших предметом дальнейшего их углублённого изучения. Кроме того, здесь же применялся метод группировки, позволяющий всю изучаемую совокупность данных разделить на группы по отдельно выбранному признаку и обеспечить обобщение литературных сведений в более упорядоченном (структурированном) виде. Далее, на втором этапе исследования, применялся сравнительный метод с целью сопоставления (анализа) полученных данных с имеющимися литературными. Наконец, процедуры, используемые на первых двух этапах, позволили критически оценить качество поставленных экспериментов, сформулировать выводы по результатам проведённого исследования - аналитико-синтетический метод исследования.

Глава первая. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

§1. Гистофизиология мышечных волокон

Общеизвестно, что поперечнополосатые, или скелетные, мышцы (СкМ) позвоночных состоят из параллельно ориентированных пучков мышечных волокон. Каждое волокно окружено мембраной и содержит несколько ядер. Большую часть объёма волокна занимают миофибриллы, простирающиеся на всю его длину. Они являются специализированными органеллами, обеспечивающими главную функцию волокна - его механическое сокращение, главным образом, за счёт энергии, высвобождающейся при гидролизе высокоэргических связей молекулы аденозинтрифосфата (АТФ). Энергообеспечение волокна осуществляется посредством эндоплазматического (саркоплазматического) ретикулума и системы Т-трубочек [С. Л. Кузнецов и соавт., 2005]. Миофибриллы состоят из тонких (актиновых) и толстых (миозиновых) нитей, или филаментов. В свою очередь, миозиновые нити образованы, главным образом, из белка миозина, каждая молекула которого содержит две идентичные тяжёлые полипептидные цепи с молекулярной массой около 200 ООО и четыре лёгкие цепи (около 20 000) (рис. 1-1) [Н. В. Бойчук и др., 1997]. Лёгкий меромиозин обеспечивает агрегацию молекул миозина, тяжёлый меромиозин имеет связывающие актин участки и обладает активностью АТФазы. Методика специальной иммуногистохимической окраски на изоферменты тяжёлых цепей миозина, позволяющая типировать мышечные волокна, находит широкое применение при изучении композиции различных скелетных мышц организма животных и человека в различных экспериментальных условиях [С. Ю. Огнетов и соавт., 2002; V. 1. Саюгго ег а1., 1994; Я. Я. Яоу & а1., 1987; 8. 8сЫа£Гто

е1 а1., 1989; Э. А. БресШг, 1985; 8. Та£исЫ & а1., 1991]. Таким способом, например, был изучен состав камбаловидной мышцы голени и трёхглавой мышцы плеча млекопитающих: обе мышцы содержат преимущественно медленносокращающиеся волокна, или волокна типа I, причём от рождения и до определённого возраста (у крыс - до 7-8 месяцев) их количество в мышце относительно быстросокращающихся (тип II) волокон возрастает [Т. Апзуеё, Ь. ЬагББОп, 1989]. Кроме того, в этих работах авторами были установлены корреляционные связи между активностью тех или иных ферментов и функциональными характеристиками данного типа волокон. Так, С. Ю. Огнетов и соавт. показали, что высокая активность миофибриллярной АТФазы связана с более высокоскоростными свойствами волокна, т.е. встречается в составе быстрого миозина [С. Ю. Огнетов и соавт., 2002].

Головки миозина

Лёгкий Тяжёлый

меромиозин меромиозин

Рис. 1-1. Структура молекулы миозина

§2. Строение и классификация мотонейронов

В мотонейроне, как и во всякой нервной клетке, традиционно выделяют три части (отдела): перикарион, или собственно сома нейрона, дендриты и один аксон. Особенность и неповторимость нейроцитов заключается в чрезвычайно