Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфофункциональное исследование гуморального иммунитета птиц в онтогенезе

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Морфофункциональное исследование гуморального иммунитета птиц в онтогенезе"

■ АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН лП ИНСТИТУТ БИОХИМИИ

р^ од

У. .)'■"' На правах рукописи

ИИОГАМОВА РАНО ЗАКМРОВНА

МОРФОФУНКЦИОНАЛЫЮЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА ПТИЦ В ОНТОГЕНЕЗЕ

(03.00.25 — клеточная биология)'

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ташкент — 1993

Работа выполнена в лаборатории радиационной биотехнологи н Института биохимии АН РУ и лаборатории патологической анатомии Научного Центра Хирургии МЗ РУ".

Научный руководитель:

доктор биологических наук,

профессор К. Н. Иишанбае»

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор Э. А. Турсуиов

кандидат биологических наук А. С. Ушакова

Ведущая организация: 2-oíi Ташкентский Государственный Медицинский Институт.

Защита диссертации состоится « .i »Cj¿Tfi¿)Jl¿¡ 1993 г. в «/У*» часов на заседании специализированного совета Д 015.16.21 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте биохимии Академии< Наук Республики Узбекистан по адресу: 700143, Ташкент," ул. X. Абдуллаева, 56.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии АН РУ..

Автореферат разослан « ^ Ju>lie 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

Актуальность проблемы. Иммунная система интегрирует реакции систем организма на безграничное число экзо- я эндогенных факторов и тем. самым поддерживает гомеостаа в постоянно меняющейся среде. Расстройства этой системы приводят к снижению защитных сил организма и повышенной заболеваемости.

Производство пищевых яиц и птичьего мяса в больших масштабах требует получения огромного количества яиц с высокими инкубационными качествами. Для правильного выбора технологии инкуба-дан яиц, выращивания молодняка и содержания взрослой птнцн помимо знаний физиологии, биохшм образования яйца, необходимо знать механизма влияния различных факторов на развитие птицы, механизмы иммунологических- процессов, источников заболевания домашней ггошц. Исследования в этом направлении позволили бы решить проблему увеличения продуктивности птицеводства.

Иммунная система птиц представляет собой качественно новый этап филогенетического развития с четкой дкффзренцировкой морфологического субстрата для созревания В-лимфоцитов. Изучение последовательных этапов дифферешдаровки В-лимфоцитов птиц является одним из подходов к раскрытию механизма иммуногенеза Известно, что в процессе дифференцировки бурсы Фабрициуса птиц по мере становления иммунной функции в эмбриогенезе образуются и развиваются фолликулы. Диффэренщфовка последних зависит от пролнфэ-рации к днффарэнцироют! В-лимфоцитов, которые детерминируют развит из и сохранение гуморального иммунитета. А поскольку известно, что доинкубацконное облучение малыми дозами радиации сткму-дарующз воздействует на рост и развитие птиц, то исследовании, посвященные изучен«» гуюрмльного иммунитета при облучении пред*: ставляет теоретический и практический интерес. Особое эначекиз -при этой приобретают формирование и дифференцировка фолликулов бурсы, тек как именно в них происходит дифференцировка В-лимфо- : цитоз (61ау1Ьз еЬ а1., 1983). у"

Одной из важных проблем в изучении иммунной системы птиц является, идентификация лимфоцитов, имеющих поверхностные имму*. ноглобулиновыэ рецепторы, дающие возможность полнее изучить механизмы иммунных реакций. Исследование В-лимфоцитов, различающихся по набору поверхностных рецепторов, применяется для оценки функционального состояния организма (Мо^ак <эЬ а!., 166?).

Исследование трансформирующей актимюоти лимфоцитов в культуре с различными стимуляторами в сопзстрвлении го спонтанной трансформацией лтж'оцмтпч используется в число пгп'мг клкш*-

[

ко~ла5ораторных показателей для оценю! степени выраженности активности процесса и состояния гуморального иммунитета. Именно на данных, полученньк в таких экспериментах, основаны представления о ранних биохимических процессах при активации лимфоцитов (Б. В. Хоробрых, 1983). Шэгому реакция бласттрансформацш лимфоцитов (РБТЛ), стимулированных различными ыитогенами, является показателем функциональной активности ишунокомпетентных клеток in vitro, который в свою очередь позволяет судить о состоянии гуморального иммунитета in vivo.

11а основании результатов выпеуказашшх реакций можно судить об изменениях физиологического статуса лимфоцитов иммунных органов и лкмфокдной системы в цело«. Бесспорна, на наа взгляд, важность и необходимость такой информации при проведении исследований, связанных с изучением механизмов становления иммунной системы в процессе онтогенеза.

Дели и задачи работы. Целью настоящего исследования явилось сравнительное изучение шр4огенеза фолликулов бурсы Фабрициуса, дифференцировки Б-лимфоцитов, а таккз анализ митоген-индуцированной активности Оурсальных лим$шдиых клеток у кур а онтогеие-ае и при доинкубацжлшом воздействии малой дозы ионизирующей радиации.

Соответственно решались следующие задачи:

1) исследование морфологических, морфометрических и Функциональных характеристик 4©брициевоП сумки в эмбриональном и постэмбриональном периодах развития в норме я при доинкубациоином воздействии малой дозы ионизирующей радиации;

2) определение сроков появления и плотности локллигации поверхностных иммуноглобулинов на В-лимфоцитах бурсы Сабриниуса в онтогенезе кур инта!стних и доинкубацимшо облученных малой дозой радиации;

3) изучение качественных и количественных изменений В-лимфоцитов, несущих поверхностные IgM;

4) определение интенсивности блзсттрансформации лимфоцитов бурсы Фабрициуса кур нн'гактиызс и доинкубационно облученных малой довоЯ ионизирукадэп радиации в онтогенезе и при изменении концентрации митогенов.

Научная новизна и практическая ценность работы. Показано, что даеЭДеренцировва фолликулов бурсы Забрициуса доинкубационно

облученных 1сур происходит с опережением на 1 сутки, чей у нитак-тных и подразделяется на -1 этапа К 18 суткам эмбрионального развили фолликулы им-эот признаки завершшиих диф$<?ренцировку «»левых структур.

Методом персксвдаза-антипероксидааа (ПАП) впервые шпвлены 1<гМ-пололггельвив В-лаафадсы в бурсе «Забридауса кур, причем» у доинкубзционио облученных птиц поверхностные 1дМ определяется на 2 суток раяьшэ, чем у нлтактннх (иа 9 сутки у опытных, на 11 сутки у контрольна). Отмечено увеличение плотности лскэднаацил 1дМ ¡¡а кембраяе в процессе д^йзренцпровки ¡меток. По степени плотности поверхностных IгМ на шмбракэ показано 3 типа клеток В-лтафсцитоз: с точечной'штксй на одном из полисов клетки, с прернвистой и сплошной линией продукта реавди на ПАП-кошлекс.

В бурсе Забрициуса обнаружены 2 типа л;»4оцитов, различающихся по !<ор<$ологически!4 признакам: "темные" и "свэтлш" клетки, "Теьные" лшфоцнты определены как Т-лш4оциты, а "светлые" - г:ак

В~ лимфоциты.

Впервые изучена спонтанная проли^еративная активность лимфоцитов Оурсы интактиых и доинкубационно облучениях малыми дсэа->,51 эмбрионов и цыплят по включений 311-тимидина, которая представлена 2 цикада на 11 и 17 сутки эмбрионального развития. Отмечено, что пролиферативная активность клею:-: бурен интозггньа еыю, чем у доинкубационно облученных.

Определена оптимальная концентрация ЖС (лштополисаяарида), сш!лзающая бласттрансфсрмацию лимфоцитов бурсы Сабрициуса, что дает основание рекомендовать ее для сценки иммунного статуса птиц а промышленном птицеводстве.

Ешвлена неотоцвчивоеть бурсальннх клеток на 2ГА (фитоге-ыагглютинин), тогда как на ЛПС пролиферативнШ ответ обнаружен только с 30 суток постэморионального развития.

Результаты исследований вносят существенный вклад в изучение проблемы меточной дифференцировки и ее активации, что дает возможность получить дополнительную информацию о функциональном состоянии•клеток и способствует раскрытию механизма действия ио-нивирущей радиации в малой дозе на развивающийся организм.

Публикации и апробация работа По материалам диссертации опубликовано 6 работ. Основные положения диссертации доложрны но: I Всесоюзной конференции молоды* ученых по еедьскохо-

аяйотвенной радиологии (Обнинск, 1963) •, Второй Всесоювной конференции по прикладной радиобиологии (Киев, 1985); Европейском конгрессе по радиобиологии (Прага, 1985); Международном конгрессе по радиационным исследованиям (Торонто, 1991).

Структура диссертации. Диссертационная работа включает сле-душале разделы; "Введение", "Обзор литературы*' (4 главы), "Материалы и методы исследований", "Результата и обсуждение" (3 главы) , "Заключение", "Выводы". Диссертация изложена на страницах, иллюстрирована 3 таблицами и 43 рисунками. "Список исполь-еованной литературы" содержит 152 наименования ( 51 отечественных, 101 иностранных).

ИАТБРИАШ И У2Г01Ш ИССЛЕДОВАНИЙ Объектом исследования служили эмбрионы (с S по £0 сутки инкубации) и цыплята (в возрасте от 1 до 90 суток) породы кур белый леггорн кросс "Янтарь". Есего било использовано 8000 эмбрионов и 500 цыдлят с ПГО им. Линча Талхентской области. Облучение яиц проводили на гамаа-установке 0Я-01 (источник излучения -bücó'^ , 0. ,011 Л/кг; мосугость дозы - 0,029 ГрЛши.). Облученные и необдученные яйца инкубировались совместно в выводных шкафах.

Световая и электронная микроскопия бурон Фабрициуса Образцы бурсы (не. более 3 куб. мы) Фиксировали 2,5% раствором глута-равдегада ("Шгск") на 0.1 М фосфатном буфгре (рН 7,4). Дофик-сирсвали IX растворов тетраокиси осьш, оСезроживаси в спиртах восходящей крепости и ацетоне и валивали в сшсь эпон-аралдит.

Подутонкле срезы толщиной 1-2 ыкы, изготовленные на удьтра-микрою^ LKB-8800 (Швеция), окрашивали штиленовоП синь» и фукс,шок по методу Humphrey (1974). Препарату просматривали на световой микроскопе.

удьтратонкие.срееы контрастировали 2,5S раствором уксуснс-кислого ypssniax по Vatson (1958) и цитратом свинца по Reynolds (1081). Ультраструктуру клеток бурсы Сабривдуса изучали под электронным микроскопом Hitachi Н-ВОО ("Hitachi", Япония).

Морфэ метрический анализ и и?тематическая обработка ревуль-татсв, Линейные размеры фолликулов измеряли окулярной вставкой с ценой деления 2,6 мкм, при увеличении об :<40, ок Х1Г.5.

Данные обрабатывали методами вариационной и альтернативной статистики (^втандилов и др., 1681).

Получение комплекса пероксидаза-ангипарокскдада (ПАП). Комплекс ПАП получали по методу Sternberg (1S74). Для получения пероксидазы 'с еысокой степенью чистоты препарат фирмы "Reanal" с RZ 0,6 очигдли ионообменной хромотографией на СМ-52 целлюлозе ("Whatman") в градиенте ацетатного буфера по методу Комиссаренко (1979).

Электронная микроскопия суспензии клеток бурсы Оабрициуса. Суспензию клеток бурс« Фабрициуса, полученную обычным способом. Фиксировали в 0,5% глутаральдегид? ка трис-Физиологическом буФз-рв (рН 7,4) и инкубировали триады: а) в кроличьей сыворотке против куриных IgM: б) в ослиной сыворотке против кроличьих иммуноглобулинов; в) в пагькомллэкс?.

Ультрацитохимичесгсос выявление пероксидазы производили по методу Graham, Karnovsky (1966). После обработки клетки вторично фиксировали 1,6% глутаральдегидом на 0,1 М фосфатном буфере С рН 7,4), и инкубировали в среде Грехема-Карпове кого. Дофиксировали тетраогасью осшя, обезволивали в спиртах восходящей крепости и заключали в скесь эпон-аралдит.

Иммунофлуоресцектное выявление позерхностныя иммуноглобулинов с помоеьо ФОТЦ проводили по методу Куне (1955).

Определение спонтанной и шгогек-тдуцироваиной активности лимфоцитов бурсы Дабриииуса Клетки бурсы СаЗрици/са, выделенные в градиенте плотности фиколла-верографина, культивировали в среде RPMI-1640 с бикарбонатом натрия , содержапей 10% инактивиро-ванную куриную сыворотку, 5xl6°M 2-меркалтоэтанола, 100 мкг/мл гентамицина, 10 мМ Hopos, ¿ мМ-глутамлка, 2 ЕД/ мл инсулина. Клетки культивировали в 96-луночных планшетах в термостате при 39° С во влакной атмосфере с 5Х COg.

В работе использовали митегены - ФГА в концентрации '20 мкг/на лунку и ЛПС - 50 мкг/на лунку. Лимфоциты культивировали 72 часа. За 4 часа до окончания инкубации добавляли ЗН-тинидин в дозе 1 мкКи на лунку (удельная активность 20 мБК), После инкубации клетки церекосили на-фильтры с помощью аппарата "Харвестер" ("Titertek").

Фильтры супили, помещали во флаконы со сцинтилляционной жидкостью и подсчитывали абсолютное число импульсов в минуту на счетчике ("LKB Rack Beta 1217")

Полученные результаты подвергали статистической обработке.

Достоверность разницы сродник (значений определяли по критерию Стьюдента

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Бзрфогенез фолликулов бурсы Фабрициуса кур при действии малой дозы радиации.

Каш установлено, что диффоренцировка фолликулов бурсы е&5-рицкуса в эмбриональный период развития подразделяется на 4. этапа:

1 этап - появление зачатков фолликулов в эпителии ( в конт-

роле - ла 12 супи|, в опыте - нз 11 сутки);

2 зтая - засоление» зачатков фолшихулов Л1М$ощгга\;п С в гакт-

рот - на 13 сутки, в опыте - на 12);

3 этап - разяеяеикз фояжшулов на корковый и ювгоасй слон

( в контроле - на 14 сутки, в опыте - на 13);

4 зтш1 - переход фолликулов из зачаточной формы в функцио-

нально зрелую (б коцтрол-з и в опыте - ¡¡а 18 сутки).

Значит, на четвертом критическом пориоде развития кур (18 еупш инкубации) происходит соэресанкз и дкффэренцпревка лзвфэ-питов 5! фолликулов бурсы. Именно этот период является п&релокнкм моментом, связанным с подготовкой эмбриона к выводу.

В результате назнх исследований и в контроле, н в опыте прослеживается динажта увеличения относительного объема фолликулов при одновременном укеиыкнии эпителиальной и стромзльпоП частой бурсы. Относительный объем эпителия в обоих исследуелш группах резко увеличивается на 11 и 12 сутки, затем к 13 суткам он ум&ньезстся. Далее вновь увеличивается на 14 и 15 сутки и уме к 18 суткам наблюдается его спад.

Относительный объем стромм бурсы, наоборот, уменьшается и к 13 суткам увеличивается, видимо, за счет уменьшения эпителия, 8атем вновь по мере развития эмбтдаона эпителий .уменьшается.

При анализе средней величины диаметра фолликулов бурсы в онтогенезе кур прослеживается закономерная динамика увеличения этого показателя как в контрольной, так и в.опытной группах. Протеи с 18 по 18 сутки инкубации наблюдаются достоверные различия (Р < 0,01) в размерах фолликулов между опытом и контролем. Яостонерная рашшца по всем перечисленным параметрам обнарузчива-

- С -

ется только в эмбриональном периоде. А о 18 суток и далее з постэмбриональном периоде развития морфологическая картина бурсы Фабрициуса опытных птиц выравнивается о таковой интактных.

На основании полученных данных ¡южно заключить, что появление лиыфоидных фолликулов в бурсе Фабрициуса птиц связано с ускорением становления иммунной системы а онтогенезе птвд. Поэтому фолликулы бурсы можно рассматривать как ыорфофункционадьныа (анатомические) единицы, которые отражают степень зрелости иммунной системы птиц.

Такиы образом, малые дозы радиации оказывают стимулирующий эффект, который проявляется в опережении развития органа и его структур на 1 сутки. Причем опережение наблюдается только в эмбриональном периоде растущего организма.

, 2. Экспрессия поверхностного 1гМ на В-лимфоцитах бурсы Фабрициуса кур в онтогенезе и при действии малой дозы радиации.

Исследования проводили с помощью метода ПАП, который оказался информативным для выявления и характеристики субмикроскопической организации различных видов лимфоцитов, несущих поверхностные иммуноглобулины, и исследования локализации и плотности последних (БЬегпЬегеег е1 а1,. 1970).

Анализ электронных микрофотографий показал, что эдекгронно-микроскопически продукт реакции выявляется на поверхности лимфоцитов, зкспрессируших ишу?.оглобулины. Под большим увеличение метка имеет вид тесно прилегающих друг к другу темных полигональных верен. На эпителиальных клетках и лимфоцитах, .не акспрессирувдкх иммуноглобулины, метка не выявлялась,

В бурсе 9-10 суточных интактных эмбрионов лимфоцитов, имеющих на своей поверхности пероксидаэную метку, не наблюдается. Начиная с 11 суток -инкубации встречаются единичные клетки, -иа плазмолемме крторых выявляется продукт реакции в виде электронно-плотных гранул. Для этих клеток (размером 7-9 мкм) характерно высокое ядерно-цитоплазмагическое отношение. В цитоплазма обнаруживаются многочисленные свободные рибосомы, единичные митохондрии различных размеров и форм, короткие канальцы гранулярного

энлоплавматическог'о ретикулума, Ядра с глубокими иньагннациями

- ** -

содержат хроматин сетчатого строения к 1-2 ядрышка.

У облученных эибрионои клетки, маркированные ПАЛ-комплексом, выявляйся на 9 сутки эмбрионального развития. Штт представляется в виде прерывистой линии или в виде точек ка одной из полисов клетки. На 10-11 сутки продукт реакции на ШЬкошшжс обнаруживается как и у S суточных зыбрлонов или в виде небольших прерывистых участков. Особенно отчетливо она выявляется ка ыик-роЁорсикках. В процессе дальнейшего развития эмбрионов количество картированных клзток увеличивается. Причем, более отчетливо это увеличение прослеживается у эмбрионов, развивающихся иг яиц, облученных до инкубации, tía 17-1.S сутки и в ранке и постзыбрио-нальноы периоде (2 суточные цыплята) большинство клеток имеют натку по всей окружности мембраны. Режа встречаются клетки с дискретным ободком электронно-плотного материала. Шесте с тем в исследуемых препаратах, как. отмечалось выше, встречаются клетки, на поверхности которых ыетка не выявляется. Среди них преобладает клетки различных разыеров с высоким ядерно-цитоплазматическиы отношением и гэтерохромнш ядро« с одним, pese с несколькими инвагинациями. В узкой ободке цитоплазмы с плотным ыатриксом обнаруживаются Ш5Т0Х0НДР5Ш и свободные рибосомы. Данные клетки по своей ультраструктурисй организации соответстЕуит "теыным" аш-фоцитам бурсы Йабрицпуса куриных эмбрионов (Kilibarda ,et al., 1979j. "Темные" метки соответствуют Т-лимфоцитам крови, человека (Torra et al., 1977; Еак и др., 1985), Присутствие еначмтольнЬго количества Т-димфоцитов в бурсе зьйрионо» кур, начиная с 12-х суток инкубации, было показано с работе Бранда и соавторов (Вгаг4 ot el. , 1983). .

Лим$оцнти, несущие поверхностные IgW, аналогичны "светлш" клогкаы бурсы (Klllbarda ot al., 1979), а такяэ В-димфоцитаи крови ч&довека (Toma et al., 1S77) и селезенки шдой (Зак и др., 1935). Возшдмо,обнаруженные нами изменения в субыикроскопи-чеокой структуре 1г).!-полои1телышх клеток в эмбриональном и раннем постзмбрионельном онтогенезе отражает динамику прохождения предшественниками В-лимфоцитов бурсы йабрицйуса различных стадий дифференцировочного процесса, в этой свяеи необходимо отметить гакло, что по мере развития куриных вародшзюй наряду с изменениями'ультраструктуры IeM-подогштедшых клеток наблюдается увеличение интенсивности иммуноаероксидагного екршзивамия их иднвма-

- -

тичесгаос мембран.

В таблице 1 представлены результаты изменения содержания в бурсе Фабрициуса куриных эмбрионов В-клетск, несущи поверхностный з динамике развития и при доинкубационном облучении, полученные при имчуяофлуорэсцонтном исследовании.

Таблица 1.

Соотношение В-клеток бурсы СвЗрицкуса интшггкых я докккубаииоино облученные эмбрионов и ишяг,

несущих поверхностные 1?М (2)

I Сроки I

! развития I

I з>/5р;юна !

I (сутки) I

Контроль

Огня

10 » - -

И 1 - 1 ( -

12 1 .1 - 5,51 + 2,25

13 » » - ! 5,59 + 2,31

14 1 5,64 + 1,71 ; 8,55 + 2,67

15 ! 7,58 + 1,53 I 7,83 0,63

16 1 19,13 + 3,15 : 18,60 + 1,83

17 1 27,93 + 3,88 ! 35,52 + 3,41

18 1 33.56 1,23 1 33,47 + 1,89

10 1 35,1<3 + 1,23 ! 57,98 + 2,15

СО 1 40,55 4- 2,57 1 41,68 г 2,43

2 дня I 1 !

после еы-луплекид

39,16 -« 1,95 ! 39, КС 2,05

Как видно из результатов, в процессе эмбрионального развития лимфоциты, несущие на своей поверхности вперЕке обнаруживаются у ннтактних эмбрионов на 14, у облученных - на 12 сутки развития • (ПАП-методом - на 11 и 9 сутки развития соответственно), что указывает на Сольную чувствительность ПАП-метода со сравнению с иммунофлуоресцентным.

Начиная с 15 до 18 суток развития в бурсе наблюдается прогрессивное уЕелу.ченяе 1гМ-положительных лимфоцитов (с ?Z на 15-е

и 33£ на 18-е сутки) с нееначительным падением на 19 сутки. Ш-вышеше обнаружено у 20 дневных эмбрионов, однако у вновь вылупившихся " цыплят количество этих клеток снижается до уровня 18 дневных.

У дошкубационно облученных эмбрионов доля ^^положительных клеток имеет тенденции к увеличению, начиная с .момента их появления до 18 суток развития эмбриона, также как и у ннтакт-ных; Далее, на 19 сутки эмбрионального развития и у вновь вылупившихся цыплят количество этих клеток уменьшается, то есть, на 4 критический период развития приходится максимальное количество 1йМ-положительных клеток.

Сравнительный анализ количества 1гЬ!-пололэдтельнш клеток бурсы Фабрициуса у интактных и доинкубационко облученных эмбрионов в возрастном аспекте не выявил достоверных различий.

Исследуя клетки бурсы куриных эмбрионов в различные сроки развития на наличие поверхностного иммунофлуоресцентным методом, выявлено насколько типов свечения клеток:

- клетки, имеющие по краю участки локального свечения в виде одной или нескольких линий;

- клетки со свечением по периметру всей клетки в виде непрерывного кольца;

- клетки, имеющие локальное свечение в виде точек, расположенных по периметру;

- клетки, где одновременно с более ярким свечением по периметру, имеет место также дифйганое свечение всей цитоплазмы или ее части.

Таким образом, в- результате проведенных исследований нами обнаружено, что поверхностные иммуноглобулины на В-лимфоцитах бурсы Фабрициуса интактных эмбрионов выявляются в 3 критическом периоде развития кур, то есть на 11 сутки эмбрионального развития, тогда как у доинкубационно облученных эмбрионов - на 9 сутки. Это подтверждают ранее проврденные исследования стимулирующего влияния малых доз ионизирующей радиации на развитие иммунной системы. Причем доля клеток, экспрессирующих поверхностные

увеличивается с возрастом эмбриона, а затем постепенно снимется после вылупления.

Вдавлена прямая корреляция медау интенсивностью цитохими-

ческой реакции на плазматической мембране лимфоцитов бурсы и возрастом разоиващихся птиц, г. е. чем визе степень зрелости клетки, тем интенсивней кглчунопероксвдазное окрашивание.

Не исключено, что выявление 1гМ-полодительных В-лимфоцитов у доинкубяционно сблучемпых эмбрионов на 2 суток раньня, чем у интакгных, свидетельствует о более раннем станорлзнии у них систр™, ответственной за л№Н»реицировку клеток бурен <1аСрип,иуса.

3. Спонтанная и милогеи-ивдуцировавнач активность лимфоцитов бурсы '?о.бря1муса кур в онтогенезе и при действии малых доз ионизгругепей радиации.

Для стимуляции В-лимфоцитов мч использовали фитогемагглхггп-:шн (ФГА)■ и липополисахарид (ЛПС). Последний является поликло-налъннм стимулятором В-лимфоцитов, вызывает синтез ДНК и пролиферацию, кроме того, образование плазматических клеток, синтезирующих я выделяющих антитела с яироким спектром специфичностей.

Для начала мы исследовали спонтанную пролиферативяуп астив-кость лимфоцитов бурсы Фабрициуса китактних и доннкубашонмо облученных малыми дозами радиации эмбрионов и чьшдлт(по включению ЗН-тимидина).которая характеризовалась 2 пиками: на 11 и 17 сутки эмбрионального развития в обеих .экспериментальных группах (рис. 1). Это соответствует 3 и 4 критическим периодам развотия кур. В остальных исследованных сроках наблюдается тенденция к снижения индекса включения метки по мера увеличения сроков развития. Наиболее выраженное снижение импульсного включения метет в период инкубационного развития на 13, 16 и 19 сутки наблзодзет-ся как в контроле, тач и в опыте, с той лишь разницей, что уровень ЗН-тимидина ни?« у опытных. Видимо, это объясняется тем, что к 15-17 суткам заканчивается фага гранулошяопоэза в фолликулах бурсы (Darby et al., 1682), а к 19 суткам завершается полная колонизация этого органа (Firth,1977; Glick, 1979; Slavits et al. , 1983).

Начиная с 19-х суток эмбрионального развития в опытной группе уровень меченого тимидина остается постоянным и не изменяется в процессе дальнейшего развития., А в контрольной такая

имп/мин

11' 13 15 17 19 1 10 ги 30 60 90 120

сроки развития (сутки) Рис. 1. Динамика включения ЗН-тимидика в лимфоциты бурсы Сабрициуса интактних и доинкубаодоино облученных эмбрионов и цыплят. В - бурса (контроль); ОВ - бурса (опыт).

картина наблюдается только с 10 суток постэмбрионзльного развития, • что указывает на раннее функциональное становление бурсы ■Хабрициуса у доинкубацяонно облученных птиц и снлдашш в свяги с этим пролиферативной активности ткачи.

Таким образом, при сравнении динамики спонтанной пролифера-тирной активности клеток бурсы Фабрициуса, интагсгных и доинкуба-цискно. облученных эмбрионов и цыплят обнаружено, что включение тимидина в бурсальные лимфоциты опытных эмбрионов ниже по сравнена с контрольными. Это, по-видимоыу, свидетельствует о том, что популяции лимфоцитов бурсы облученных эмбрионов более зрелые, сравнению с контрольными. Необходимо обратить внимание на то,

что все раялитая по включению меченого тимидина в клетки бурсы наблюдаются только в эмбриональном пернодо. Начиная с 19-х суток и далее с ьоврастом птицы сравнительные показания реакций недостоверна

Далее проводилось сравнительное изучение функционального состояния В-лимфоцитов бурсы Фабрициуса кур интактных и доинку-Сационно облученных малыми дозами радиации с использованием реакции бластной трансформации в ФГА и ЛГО-стимулированных культурах. Оказалось, что митоген-индуцированная стимуляция на ФГА не выявляется в ¡культуре бурсальных клеток у эмбрионов и цыплят как интактных, так и доиикубацконно облученных малыш доаами радиации.

В исследованиях по влияния ЛГО на пролиферацию В-клеток выявлена неотзывчивость на этот митоген бурсальных лимфоцитов в эмбриональный и ранний посгэыбриональный периоды развития.

Властогенный эффект на ЛПС наблюдается только начиная с SQ дневного возраста цыплят при оптимальной концентрации митогена 50 икг/ил (рис. 2). Установлено, что степень бластной трансформации и включение ЗН-тимидина в культурах облученных пищ несколько отличалась от этих показателей у контрольных.

Начиная с SO суток постэмбриональвого развития наблюдается увеличение активности лимфоцитов бурсы по мера развития птиц в обеих исследуемых группах. Это совпадает с периодом интенсивного роста цыплят (15-60 сутки). Однако, начиная с 60-х суток, у интактных цыплят обнаруживается ■ небольшой спад активности лимфоци- , тов. Видимо, это связано г началом периода ювенильной линьки (61-150 сутки). ; ,

У доинкубационно облучэнны:: птиц подобных резких спадов пролиферативного ответа не наблюдается, что говорит в пользу того, что эти птицы более приспособлены к влиянию факторов ркруда* ющей среда Следовательно, доинкубациэнное облучение куриных-яиц гамма-лучами в малой дове (0,029 Гр) оказывает влияние на ин тенсивность бластообразования бурсальных лимфоцитов in vitro с нееиачительной разницей этих показателей. ..

Таким образом, показано, что доинкубационное облучение яиц малой' дозой радиации стимулирует биосин?етичаски& ■ процессы иммунных органов, а такхе увеличивает дифференцировочный потенциал .№>.1ф011ИТ0В в процесс? становления кккуяноя систем».

- J4 ,

тт/тн

iyxi

УМ.

--OB+LP —e+LPs

SO 120 сроки развития (сутки)

Рис, г. Штоген-иидуцирояаднея активность бурсалькых лимфоцитов интбктных и доинкубащонно облученных цыплят (по включению &Ч-тимияина). дзва Ж 50 иет/ыд, В + LPS - контроль с Ж; OB + .Lf?S - опыт с ЛПС,

. •'. ' выводы • ""

. 1.'- Впервые покаеат, что однократное доинкубационное облучение яиц малыми дозами радиации (0,029 Гр/мин.) стимулирует гуморальный иммунитет кур в эмбриогенезе, Мэрфогенетические процессы фолликулов бурсы Фабрициуса ускоряются по сравнению с ин» тактныш ив 1 сутки. Дифференцировка фолликулов Сурсы Фабрициуса проходит в 4 атапа: а) обраьование зачатков фолликулов; б) миграция лимфоцитов в фолликулы бурсы; в) раеделение фолликулов на корковую и моеговую еоны; г), вавериениэ дифференцировки фолликулов. .

2. Однократное облученио яиц в малой доее сопровождается опережением секреции поверхностного 1гМ на Б-лимфоцитах на 2 суток ( норма - 9 сутки, опит - 11 сутки). По мэре диффереишровки возрастает плотность логсализацин поверхностных IgM на мембране В-лимфоцитов.

3. Покззако, что ПАП-штод является более чувствительным и информативным для характеристики суОмикроекопической организации различных видоп лл^цитов, несущ« поверхностные иммуноглобулины, и исследования их локализации и плотности, чем иммунофлуо-рэсцэнтн'Л.

<1. Установлено присутствие п Суре о Собрлциуса "светлых" и "темны;:" лимфоцитов, различающихся по юрфмогичесюш признака«. "Сзетлы?"- клетст - маркированные ПАП-комплексом В-лп!фоциты с поверхностная иммуноглобулинами, "темные" клетки бурея Азбрици-уса это Т-лпмфстгги

5. Еиючение »¡еченого тимдагаа ползало, что спонтанная пролифоратизиая актганость лтфоцитов бурен <Габриииуса интаетннх и доинкубационно облучении змбпионов характеризуется 2 шзсачи ( 11 и 17 суп« инкубация) п oöeirx исследуемых группах. Причем, популяции еурсальнь:-: лимфоцитов доинкубационно облученных пт1гд более диЗЗерекшроголккз по сравнению с интакгпюгл

6. Определена оптимальная концентрация ЛИС для бурсальных лимфоцитов Izyp (50 жг/мл) и неотзывчивость последних на ФГА. Установлено, что бластогенный эффект на ЛПС не обнаруживается в эмбрионально» и раннем постэмбриоиальном периодах. С 30 суток развития цыплят появляетег. митогешшдуцироЕпнный ответ в обеих исследуемых группах с недостоверной разницей о Tin-: показателей.

7. Процессы пролиферации, дифференцнроЕКИ лимфоцитов и морфогенеза бурсы Фабрициуса в эмбриогенезе более интенсивны у до-инкубационно облученных птиц, чем у интакгяых.

Список работ,■опубликованных по теме диссертации.

1. Выявление иммуноглобулиннесуших лимфоцитов бурсы «Хабри-циуса куриных эмбрионов методом ПАП ( пероксидаза-антипероксида-за ) / Р. 3. Рустамова, Г. Я Аллаярова. КХ R Шполянский, К IL Нишач-баев, С. В. Комиссаренко // ДАН УзССР 1983.- N 12. - С. 37-39 .

2. Руста),'сва Р. 3., Шполянский Ю. В. Экспрессия мембраносвя-занных иммуноглобулинов лимфоцитов бурсы Фабрициуса куриных эмбрионов при действии малых доз радиации /Тезисы докладов второй

всесоюзной конференции по прикладной радиобиологии. - Киев. -1985. - Ч. III.- С. 1-2.

3. The effect of small doses of .irradiation on lymphocyte receptors of chicken eirbryos / K. N.Nishanbaev, Ju. V.Shpoljansky, G. I. Allajarova, R.Z. Rustaruova//Europen society fox4 radiation biology. 19th Annual l&etlng, Prague. 26-30 August. - 1985.-P.103.

4. Цитофункцкональньй анализ становления ишунной системы птиц в процессе онтогенеза / Ю. В. Шаолякский, Г. Ходкихмздоп, Т. М. Есламов, Т. Е Штрухша, Г. И. Аллаярова, Р. 3. ИногашЕа // Онтогенез..- 198В.- Т. 19,- Н 4,- С.44Б.

5. Электронная тамукогистохишш поверхностных ш.г>г/ноглобу-линов лимфоцитов бурсы Фабрициуса в пре- и раннем постнатальнон онтогенезе кур / Р. 3. йиогашва, Ю. Е. Споллнский, K.IL Кпсанбазв, Д. X Хашдов, 3. Е Ккогаыов // Цитология. - 1988. - Т. XXX. - К 2. -С. 170-174.

"Онтогенез гараенида парраида гукорал ишукитетиникг корфофункционал тад^кртк" мавэусидаги диссертация ишининг киска мазмуяи

Гамма нурлари таъскр эттиршшаган паррандалардан фарфгя улароц, иккубацияга ^адар нурлантирилган товук, эмбриоки <1аб'рулк-ус бурсаси фолликулалари дифференциациясининг бкр кеча-кундуага олдикга сурилюш ва бу караённинг 4 боскичда бориши курсатнлган. Или маротаба, пероксвдаза-пероксидаза акси усули ё'рдамкда, Фоб-ртциус бурсасида IgM-мусбат лимфоцитларнинг мавкудлиги аник^лан-ган; инкубацияга ^адар нурлантирилган эмбрионларда бу лимфоцит-лар 2 кун олдинрог, намоён булади. В-лимфоцитлар дифференциация жараенида, улар мэмбраналарида IgM ки^дорининг ошкши аник^ланган.

Бурса лимфоцитлари табиий пролифератив фаоллигининг тадк»и-крти шкуСадаяга к/здар нурлантирилган товуг> лимфоцитлари популя-шясининг нурлантирилмаганлариникига нисбатан етукро^ эканлигини ангараб берди.

Бурса лимфоцит ларининг. ФГА таъсирига сезгир- эмаслиги аниг,-ланди. Шу билан бирга, постэмбриояал риволиашшшинг 30 кунидан Оош^аОгина, митогеннинг 50 мкг/ылга тенг оптимал миедорида, Л11С-нинг про.«'ферацияга таъсири аниклана бошланган.

Тову^ гузумлариии кичик доэадагл нояловчи радиация билан инкубацняга 1$адар нурлантирипшинг бурса морфогенеэи ва лимфоцит-лар пролиферацияси ва даф&еренциацияси караёнларига таъсири ри-во.тланишнинг £акуат эмбрионал давридагина кузатилиши исботлаб бе-рилдн.

"i.brfcfijnk 11 cnal study с Г chicken hun-oral lrcmnlty in ontogonosis".

Somrary

Follicula dlfforontlatlcn of bursa of Febriclus in preincubation irradiated chickens . has boon shovm to take place twenty four hours early than In intact ones and can be divided Into 4 stages.

By means of poroxidase-antipsroxidase (PAP) rathod for the first tlrra Ig!,t-positive lymphocytes have been discovered in chicken bursa of Fabrlclus, surface IeM in preincubation irradiated chickens being determined 48 hours earlier than in intact onos. IgM localization density increase ha3 been discovered on B-lypphocyte гюглЬгаш in tho process of their' differentiation.

Upon Investigation cn spontaneous proliferation activity of bursal lymphocytes it has been established that lymphocyte populations of bursa in preincubation irradiated chickens are того mature than in intact ones.

FGA ncn-responseveness of bursal lymphocytes has been discovered, whereas LPS proliferation response has been only discovered beginning from tho 30th day of postembryonal devolopsrent upon c-plmal mltogene dose of Б0 mkg/ml.

Proincubative irradiation with low doses of .onizing radiation hits been proved to affect the processes of morfoffsnesls, proliferation and cells differentiation only durina the embryonal period of develcpimnt. ■■■■ •

Соискатель