Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфо-функциональная характеристика гемолимфы Littorina littorea (Gastropoda:Prosobranchia) в норме и при заражении партенитами трематод

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Морфо-функциональная характеристика гемолимфы Littorina littorea (Gastropoda:Prosobranchia) в норме и при заражении партенитами трематод"

На правахрукописи

ЯКОВЛЕВА Надежда Владимировна

Морфо-функциональная характеристика гемолимфы Littorina littorea (Gastropoda: Prosobranchia) в норме и при заражении партенитами трематод

03.00.25. Гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт- Петербург 2005

Работа выполнена на кафедре цитологии и гистологии биолого-почвенного факультета Санкт-Петербургского государственного университета

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор

Александра Давидовна Харазова,

Санкт-Петербургский Государственный Университет

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Георгий Петрович Пинаев

Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

кандидат биологических наук, доцент

Андрей Александрович Добровольский

кафедра зоологии беспозвоночных, Санкт-Петербургский Государственный Университет

Ведущее учреждение: ГУ НИИ Экспериментальной медицины РАМН,

Санкт-Петербург

«о

Защита состоится 20 мая 2005 года в ^ часов на заседании Диссертационного совета Д.002.230.01. Института цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Института цитологии РАН. Автореферат разослан апреля 2005 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

. Каминская

Общая характеристика работы

Актуальность исследования. Исследование эволюции тканей внутренней среды, обеспечивающих реализацию защитных реакций, является одной из центральных проблем сравнительной гистологии. По сравнению с огромным объемом данных о морфологических, физиологических и биохимических аспектах функционирования иммунной системы позвоночных животных, и в особенности млекопитающих, сведения о клеточных элементах и гуморальных факторах гемолимфы - основной ткани внутренней среды беспозвоночных, осуществляющей защитные реакции, представляются скудными и фрагментарными. Некоторые таксономические группы, имеющие важное значение для познания путей и закономерностей эволюции Ме1агоа, в том числе моллюски, остаются относительно неизученными в этом плане. Практически все сведения, затрагивающие вопросы о механизмах реализации этими клетками своих функций, получены при изучении представителей всего лишь нескольких видов, имеющих медицинское (Вютрка1агш, ВыИпш, Ьутпагй) или экономическое значение (мидии, устрицы). Однако, данные о механизмах осуществления внутренних защитных реакций у других представителей этого таксона, в том числе наиболее архаичных морских Ргсво-ЪгапсЫа, отсутствуют.

Помимо неполноты и фрагментарности данных о многих аспектах биологии гемоцитов моллюсков, необходимо отметить и слабую разработанность методологических подходов к исследованию защитных реакций беспозвоночных в целом и моллюсков в частности. Очевиден тот факт, что исследование механизмов, лежащих в основе реализации защитных функций тканями внутренней среды, невозможно без анализа особенностей ответа эффекторных клеток на контакт с патогеном. При этом, наиболее адекватных результатов можно ожидать при использовании в экспериментальных исследованиях паразитических организмов, являющихся природными патогенами для изучаемой группы животных. Такой подход к изучению защитных функций тканей внутренней среды представляется нам более продуктивным по сравнению с исследованием реакций амебоцитов на контакт с «искусственными» патогенами (эритроцитами, некоторыми видами бактерий и грибов, не характерных для местообитаний изучаемых животных), широко используемым в практике иммунологических исследований. В связи с этим, определенное внимание в данной работе уделено анализу особенностей морфо-функциональных изменений гемоцитов, индуцируемых трематодами - паразитическими червями, являющимися наиболее распространенными патогенами для брюхоногих и, в частности, переднежаберных моллюсков.

Цели и задачи исследования. Целями настоящей работы являлись:

- морфо-функциональная характеристика клеточных элементов и оценка активности некоторых гуморальных факторов гемолимфы морского переднежаберного моллюска LU-torina littorea;

- сравнительная характеристика некоторых морфологических и функциональных параметров внутренней защитной системы у незараженных моллюсков и особей, зараженных Himasthla elongata (Trematoda: Echinostomatidae) и Renicolaparvicaudata (Trematoda: Reni-colidae);

Соответственно были определены следующие задачи исследования:

- исследование морфологической организации гемоцитов L. littorea и параметров популяции клеток гемолимфы (гемограммы) у интактных моллюсков и животных после инъекции ряда факторов, а также особей зараженных Я. elongata или R. parvicaudata;

- анализ гистогенетических взаимоотношений между гемоцитами различных субпопуляций;

- изучение основных проявлений функциональной активности гемоцитов (адгезия, фагоцитоз, выработка активных радикалов кислорода, продукция цитотоксических факторов) незараженных L. littorea и моллюсков, зараженных Я. elongata;

- исследование основных групп гуморальных защитных факторов L. littorea (агглютинины, лизины, опсонины);

- изучение влияния секреторно-экскреторных продуктов трематод на фагоцитарную активность гемоцитов моллюсков in vitro;

- сравнительное исследование углеводных детерминант поверхности трематод Я. elongata на разных стадиях жизненною цикла и гликокаликса гемоцитов моллюсков L. littorea и Mytilus edulis (Bivalvia, Eulamellibranchia).

Научная новизна работы. Проведена адаптация ряда методов клеточной биологии и гистологии для исследования клеток гемолимфы морских моллюсков. Впервые выполнена морфо-функциональная характеристика гемоцитов L. littorea - представителя морских Proso-branchia. Выявлена субпопуляция гемобластов - делящихся клеток, за счет которых происходит обновление клеточного пула гемолимфы литторины, проведен анализ распределения гемобластов в тканях моллюска. Впервые обнаружена сезонная динамика пролиферативной активности гемоцитов Llittorea, а также сезонные изменения основных характеристик популяции клеток гемолимфы - концентрация гемоцитов и соотношение клеток различных мор-фотипов. Для обозначения указанных характеристик гемолимфы предложен термин «гемо-

грамма». Впервые выявлена зависимость между гемограммой моллюсков и интенсивностью некоторых проявлений функциональной активности клеток гемолимфы литторин.

Впервые предложена культуральная система, обеспечивающая выживание клеток гемолимфы L. littorea в условиях in vitro в течение, по крайней мере, одного месяца. Впервые обнаружено, что клетки гемолимфы моллюсков-доноров, зараженных H.elongata, выживают in vitro в течение более длительного времени по сравнению с гемоцитами незараженных особей.

Впервые выявлены значительные морфо-функциональные модификации гемоцитов L.littorea при заражении партенитами трематод H.elongata и R.parvicaudata. При этом обнаружены значительные различия в изменениях характеристик клеток гемолимфы, индуцируемых двумя указанными видами паразитов.

Теоретическая и практическая значимость работы. Адаптированные методы исследования и предложенные методологические подходы могут быть применены при изучении механизмов реализации защитных реакций других видов беспозвоночных. Предложенный метод анализа гемограммы моллюсков может быть использован для мониторинга физиологического состояния особей в природных популяциях. Также результаты работы могут быть использованы в исследованиях, направленных на получение клеточных линий гемоцитов морских моллюсков.

Теоретические результаты исследования могут быть использованы как в курсах сравнительной гистологии, сравнительной иммунологии, так и зоологии и паразитологии. Данные о биологии трематод H.elongata и R.parvicaudata могут быть использованы в паразитологиче-ских исследованиях, направленных на борьбу с трематодозами человека и домашних животных.

Положения, выносимые на защиту.

1. Клетки гемолимфы L. littorea представлены тремя субпопуляциями гемоцитов (юве-нильными, переходными и зрелыми), соответствующими различным этапам внутри одной линии дифференцировки.

2. Гемоциты Llittorea являются основными эффекторными элементами внутренней защитной системы моллюска, гуморальные факторы гемолимфы литторины задействованы только на этапе распознавания потенциального патогена.

3. Естественные патогены Llittorea - партениты трематод R.parvicaudata и H.elongata способны влиять на процессы регуляции пролиферации и дифференцировки клеток гемолимфы моллюска-хозяина.

Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ. Материалы диссертации были представлены на первой, второй, третьей, пятой и шестой Научных сессиях морской биологической станции СПбГУ (2000, 2001, 2002, 2004, 2005), XII Международном совещании и V школе по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2001), Всероссийском симпозиуме «Клеточная биология на пороге XXI века» (Санкт-Петербург, 2000), научных семинарах кафедры цитологии и гистологии СПбГУ и Отдела клеточных культур ИНЦРАН.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 167 страницах машинописного текста и состоит из введения, глав «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», выводов и списка цитируемой литературы, включающего 397 публикаций. Иллюстративный материал представлен 41 рисунком и 3 таблицами.

Содержание работы Обзор литературы

В главе рассмотрены особенности морфологии и основные проявления функциональной активности клеток гемолимфы двустворчатых и брюхоногих моллюсков, а также гистогене-тические взаимоотношения между гемоцитами различных морфотипов. Особое внимание при этом уделено различным биотическим и абиотическим факторам, вызывающим изменения основных характеристик популяции клеток гемолимфы моллюсков. Одновременно с этим приведена характеристика основных функциональных групп гуморальных факторов гемолимфы этих животных (агглютинины, лизины, опсонины, цитокиноподобные медиаторы). Также в главе «Обзор литературы» обобщены современные данные о модификациях морфо-функциональных характеристик гемоцитов брюхоногих моллюсков при заражении различными видами трематод и основных путях воздействия партенит на активность внутренней защитной системы хозяев.

Материалы и методы.

Объекты исследования. Основным объектом исследования являлся морской переднежаберный моллюск Littorina littorea (Gastropoda: Prosobranchia). В некоторых сравнительных экспериментах дополнительно исследован двустворчатый моллюск - мидия (Mytilus edulis). Улитки L. littorea собраны во время отлива на литорали острова Большой Горелый (губа Чу-па, Кандалакшский залив Белого моря). Мидии были собраны на плантациях в губе Никольская. В качестве патогенов, потенциально способных оказать влияние на морфофункцио-

нальные характеристики гемолимфы моллюсков, исследованы партениты трематод Renicola parvicaudata, Himasthla elongata,H. militaris, Cryptocotyle lingua и С. cancavum.

Гемолимфу L. littorea получали из буккального синуса при помощи стерильных игл для одноразовых шприцов. Гемолимфа мидий получена из заднего аддуктора животных с использованием стерильных одноразовых шприцов.

Морфо-функциональная характеристика гемоцшов. Оценку концентрации клеток в пробах гемолимфы проводили при помощи камеры Горяева. Морфологические исследования распластанных гемоцитов проводили с использованием метода фазово-контрастной микроскопии на неокрашенных монослоях клеток гемолимфы, а также после стандартного гистологического окрашивания красителем Гимзы-Романовского (НПФ «Абрис+», СПб). Изучение морфологии клеток в суспензии было проведено с использованием проб гемоцитов, фиксированных сразу после получения гемолимфы 4 % параформальдегидом (ПФА) на морской воде. Для этого, гемолимфу собирали непосредственно в фиксатор. После фиксации клетки окрашивали гематоксилином Майера.

Для описания ультраструктуры циркулирующих клеток L. littorea гемолимфу моллюсков собирали непосредственно в охлажденный на льду фиксатор (1,5 % глютаральдегид и 1 % ПФА в какодилатном буфере (рН 7,3, 750 mOsm)). Затем после ряда промывок буфером и постфиксации 2 % четырехокисью осмия, гемоциты обезвоживали в серии спиртов возрастающей концентрации и заливали в смолу Спурра (Sigma, США). Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца по Рейнольдсу. Исследование морфологии гемоцитов в составе мантии вокруг дочерних спороцист R. parvicaudata проводили путем изучения полутонких срезов фрагментов ткани гепатопанкреаса зараженных моллюсков, фиксированных в 2,5 % глюгаральдегиде на какодилатном буфере (рН 7,3,750 mOsm) и залитых в Эпон-Аралдит.

Цитохимические исследования. ШИК-реакция была выполнена с использованием набора реактивов для выявления гликогена в лейкоцитах (НПФ Абрис-плюс, СПб) согласно инструкциям, прилагаемым производителем. Выявление активной пероксидазы проводили путем инкубации предварительно фиксированных монослоев клеток в растворе, содержащем 0,1 % диаминобензидина (DAB) и 0,02 % перекиси водорода. Для окраски гемоцитов на кислую фосфатазу использовали методику с применением нафтол-А8-фосфата в качестве субстрата. Для проведения реакции использовали реагенты из набора для выявления кислой фосфатазы в лейкоцитах (НПФ Абрис-плюс, СПб).

Исследование поверхностных маркеров гемоцитов L. littorea и M.edulis. Исследование поверхностных маркеров гемоцитов моллюсков включало два рода экспериментов: ок-

7

рашивание гемоцитов лектинами мечеными флуорохромом (FITC; Sigma) и выявление СБ34-подобных детерминант на поверхности клеток гемолимфы L. littorea с использованием двух типов моноклональных антител специфически распознающих CD34 стволовых клеток крови человека. В экспериментах были протестированы следующие лектины: конканавалин А, лектин зародышей пшеницы (WGA), лектин виноградной улитки (ОТА), лектин Wisteria floribunda (WFL), лектин Bandeiraea simplicifolia (BSL).

Исследование пролиферативной активности и гистогенеза клеток гемолимфы L. littorea. Для выявления субпопуляции пролиферирующих клеток и определения гистоге-нетических взаимоотношений внутри популяции гемоцитов был использован метод иммунохимического выявления клеток, находящихся в S-фазе клеточного цикла, при помощи 5-бром-2'-деоксиуридина (БрДУ). Исследование распределения гемобластов в тканях моллюсков выполнено с использованием окрашенных гематоксилином и эозином парафиновых срезов через органы реноперикардиального комплекса моллюсков. Выявление БрДУ-позитивных клеток на парафиновых срезах через область почки и перикарда моллюсков, зафиксированных через 12 часов после инъекции БрДУ, также проведено с применением иммуногистохимической методики.

Исследование фагоцитарной активности гемоцитов in vitro. Все эксперименты по оценке фагоцитарной активности гемоцитов были выполнены с использованием монослоев гемоцитов, приготовленных на пластиковых чашках Петри. В качестве частиц-мишеней применяли зимозан A (Sigma). Для оценки влияния секреторно-экскреторных продуктов (СЭ-продуктов) редий //. elongata, H. militaris, С. linguaи С. cancavum на скорость фагоцитоза зимозана гемоцитами литорин и мидий на монослои клеток наносили суспензию частиц в культуральной среде L-15 (Leibovitz) полученной после культивирования партенит в течение суток в соответствии с ранее описанной методикой (Gorbushin, Shaposhnikova, 2002). Для определения минимальной эффективной концентрации СЭ-продуктов редий Н. elongata были протестированы растворы этих факторов в среде L-15 (разведения 1:1,5; 1:3; 1:6; 1:12).

НСТ-тест. Оценка способности гемоцитов литторины продуцировать активные формы кислорода была выполнена при помощи НСТ-теста - методики, основанной на оценке скорости восстановления солей нитросинего тетразолия (НСТ) до диформазана в присутствии клеток моллюсков. В качестве индукторов синтеза активных радикалов кислорода были использованы форболовый эфир (РМА) - 5 мкг/мл, липополисахарид клеточной стенки Escherichia coli штамм В 055 (LPS) - 0,25 мг/мл, маннан из клеточной стенки дрожжей Saccharomyces cerevisiae - 10 мг/мл, зимозан А - 3,5х107 мл-1. Параллельно проводили контрольные измерения двух типов - оценку фоновой продукции активных форм кислорода гемоцитами in vitro и

8

интенсивности восстановления НСТ в присутствии фермента, улавливающего супероксида-нион - супероксиддисмутазы (СОД, Sigma, США).

Исследование клеточной цитотоксичности Исследование цитотоксических свойств гемоцитов L. littorea было выполнено с использованием эритроцитов человека (группа крови АВ) в качестве клеток-мишеней. Монослои гемоцитов, приготовленные в лунках стрипов и отмытые от белков плазмы, инкубировали в суспензии эритроцитов в течение 2 часов, по окончании эксперимента оптическую плотность супернатанта измеряли на фотометре EL301 (Bio-Tek) используя фильтр 490 нм.

Культивирование in vitro гемоцитов L. littorea Для культивирования гемоцитов L. littorea использовали среду L-15, модифицированную для работы с клетками морских организмов. В нескольких экспериментах в смесь добавляли телячью эмбриональную сыворотку (FBS, Sigma) в конечной концентрации 1 — 5 %. Культивирование клеток гемолимфы проводили при нормальных атмосферных условиях при температуре 14-15 °С. Смену половины объема среды осуществляли еженедельно.

Исследование влияния цитокинов млекопитающих на пролиферативную активность гемоцитов L. littorea в условиях in vitro вьшолняли путем оценки уровня включения БрДУ в ядра культивируемых клеток. В ходе исследований были протестированы следующие факторы - интерлейкины 1L-1J3 (Беталейкин, «Цитокин», Санкт-Петербург), IL-2 (Ронколейкин, ООО «Биотех», Санкт-Петербург), фактор некроза опухоли TNF-a (Sigma), фактор роста фибробластов FGF- p (Sigma). Стоковые растворы цитокинов готовили в соответствии с инструкциями, прилагаемыми производителями, конечные концентрации для указанных факторов составляли: 25,50 и 100 нг/мл.

Исследование гуморальных факторов гемолимфы LJittorea. Белковый состав плазмы L. littorea был проанализирован при помощи SDS-электрофореза по Лэммли (Laemmli, 1970), общую концентрацию белка в плазме оценивали по методу Бредфорд (Bradford, 1976). Титры агглютининов в плазме моллюсков оценивали при помощи стандартной реакции агглютинации с использованием серий двукратных разведений бесклеточной гемолимфы животных. В качестве тестовых частиц использовали бактерий Lactobacillus sp., Staphylococcus aureus, Escherichia coli (Ml7) и дрожжи Saccharomyces cerivisiae, а также эритроциты шести видов млекопитающих - коровы, свиньи, собаки, кролика, мыши, крысы и эритроциты человека (группы крови А и В). Исследование гемолитических факторов в плазме проводили в соответствии с той же базовой методикой, что и для реакции агглютинации.

Исследование углеводных детерминант поверхности Himasthla elongata на разных стадиях жизненного цикла. Для исследования поверхностных углеводных структур

9

H. elongata на разных стадиях жизненного цикла были использованы меченые флюорохро-мом лектины, перечисленные выше. Для этой серии экспериментов использовали редий, церкарий и метацеркарий Н. elongata.

Экспериментальная индукция изменения концентрации гемоцитов и клеточного состава гемолимфы. Улиткам каждой экспериментальной группы был введен один из потенциальных индукторов изменений клеточных параметров гемолимфы. Среди протестированных соединений были растворы лектинов, митогенов для лимфоцитов млекопитающих: конканавалин А (1 мг/мл в морской воде), лектин Phytolacca americana (1 мг/мл), а также суспензии живых грам-положительных бактерий Lactobacillus sp.

частиц зимозана и СЭ-продукты редий Н. elongata, полученные

после культивирования партенит in vitro в течение суток (концентрация белка около 10мкг/мл). Каждому моллюску инъецировали 150 мкл одного из указанных препаратов в мышцы ноги. Литторинам контрольной группы вводили 150 мкл фильтрованной морской воды. Исследование концентрации циркулирующих гемоцитов и клеточного состава гемолимфы проводили на 1,3,5 и 7 дни после инъекции.

Методы статистического анализа. Статистический анализ экспериментальных данных проведен с помощью программы Statistica 6.O. Использован двусторонний Т-критерий для зависимых и независимых выборок, а также непараметрический U-тест. На всех диаграммах, за исключением тех, где это указано особо, в качестве показателя варьирования признака приведены 95 % доверительные интервалы. Расчет доверительных интервалов и сравнение средних оценок долей проведены на агсм'и-нормализованных данных. В этом случае на диаграммах приведены ре-трансформированные значения средних и доверительных интервалов.

Результаты

Характеристика основных элементов гемолимфы L. littorea

Клеточные элементы гемолимфы

Морфология гемоцитов L. littorea (Яковлева и др., 2001а; Яковлева, Горбушин, 2005а). Концентрация гемоцитов в гемолимфе незараженных литторин составляет около 1800 мкл-1 (n=250). При контакте гемоцитов с поверхностью стекла или пластика происходит адгезия и распластывание клеток по субстрату с формированием монослоя. При исследовании монослоев гемоцитов L littorea, полученных на пластиковых поверхностях, методом фазово-контрастной микроскопии не было обнаружено различий в характере распластывания клеток, за исключением небольших вариаций в числе и форме псевдоподий. На светооптиче-

ском уровне никаких цитоплазматичсских включении в гемоцитах литторины не выявлено. Исследование монослоев гемоцитов, окрашенных гематоксилином и эозином, показало, что большинство клеток имеет активные ядра с глыбками гетерохроматина. Цитоплазма гемоцитов Ь IШогеа слабо эозинофильна.

Анализ морфологических особенностей гемоцитов Ь. ¡Шогеа, зафиксированных непосредственно после получения и окрашенных в суспензии, позволил выделить три группы клеток среди циркулирующих гемоцитов литторины: 1) относительно мелкие клетки (диаметр 5-6 мкм) с круглым центрально расположенным ядром и небольшим объемом цитоплазмы; 2) клетки с более высоким относительным объемом цитоплазмы и ацентрично расположенным ядром правильной формы и 3) крупные гемоциты (диаметр около 8 мкм) часто овальной формы с ядром, еще более смещенным к одному из полюсов клетки по сравнению с гемоцитами предыдущего типа. Цитоплазма клеток последнего типа прокрашивлась красителем Гимзы-Романовского неравномерно - на полюсе клетки противоположном ядросо-держащему располагалась светлая зона не содержащая структур, связывающих краситель. Гистохимическое исследование (ШИК-реакция) обнаружило, что светлая зона крупных гемоцитов соответствует скоплению гранул гликогена в цитоплазме клетки. Отложения гликогена были также выявлены и в клетках второго (переходного) морфогипа, но для этой группы гемоцитов характерно рассеянное распределение гранул гликогена в цитоплазме.

Сезонная динамика клеточного состава гемолимфы Ь. ИПогеа (Яковлева и др., 2004; Яковлева, Горбушин, 2005а). Обнаружены сезонные колебания общей концентрации клеток в гемолимфе Ь ¡Шогеа, а также пропорций клеток различных морфотипов в крови незара-

женных моллюсков этого вида (Рис. 1). На протяжении летнего сезона 2003 года зарегистрированы два пика концентрации циркули-

рующих гемоцитов — в июне и в августе. Относительные количества клеток различных морфотипов среди цир-25 июня 6 июля 19 июля 3 августа 19 августа кулирующих гемоцитов также

Рис 1 Сезонная динамика клеточного состава гемолимфы были подвержены значитель-Ь ¡Шогеа. По левой оси ординат - доли клеток разных морфотипов, по правой - общая концентрация циркулирующих ным изменениям в течение се-гемоцитов

зона (Рис. 1). Количество крупных зрелых клеток в гемолимфе незараженных L. littorea возрастало к концу августа и достигало 34 % (п=18), тогда как в июне средняя доля клеток этого морфотипа составляла всего 0,1 % (п=41).

Параллельно с возрастанием количества зрелых гемоцитов, происходило уменьшение доли клеток переходного морфотипа в гемолимфе литторин. Количество ювенильных гемоци-тов находилось на относительно постоянном уровне в течение всего сезона, и составляло около 13 % от всех циркулирующих клеток гемолимфы, незараженных трематодами литорин.

Исследование поверхностных маркеров гемоцитов литторин ы (Яковлева, Горбупшн, 20056). Исследование гликокаликса гемоцитов L littorea при помощи меченых лектинов показало, что с поверхностью клеток гемолимфы исследуемого моллюска взаимодействуют СопА, НР А, WFL. Проведенные контрольные эксперименты по ингибированию связывания лектинов с клетками соответствующими моносахарами показали, что во всех трех случаях связывание является специфичным. Исследование поверхностных углеводных детерминант гемоцитов L. littorea не выявило гетерогенности популяции клеток крови моллюска по этому признаку, все гемоциты литторины имеют на поверхности сайты связывания для трех исследованных лектинов. При обработке гемоцитов литторины моноклональными антителами к СБ34 клеток, несущих на поверхности, структуры, сходные с этим маркером стволовых клеток млекопитающих, не выявлено.

Исследование гистогенеза клеток гемолимфы (Яковлева, Горбушин, 2005а). Через 12 часов после введения моллюскам бромодезоксиуридина наблюдается его включение в ядра циркулирующих гемоцитов. Клетки, включающие БрДУ, обладают морфологическими чертами ювенильных гемоцитов - крупным ядром правильной формы со структурированным хроматином, расположенном в центре клетки, а также высоким ядерно-цитоплазматическим соотношением. Процент клеток, находящихся в 8-фазе клеточного цикла, среди циркулирующих гемоцитов варьирует в зависимости от времени проведения экспериментов. Максимальные значения количества клеток, включающих БрДУ, были зарегистрированы у моллюсков, собранных в июне (3,2 %; п=16), тогда как в июле и августе наблюдалось статистически достоверное (Р<0,05) снижение пролиферативной активности клеток гемолимфы L. littorea. Доли меченых клеток в это время составляли около 1 % (п=16) и 0,56 % (п=15), соответственно. Среди циркулирующих гемоцитов L. littorea встречаются клетки, находящиеся в стадии митотического деления.

Гистологическое исследование тканей реноперикардиального комплекса L. littorea, включающего почку, перикард и нефридиальную железу выявило повышенную плотность

12

гемоцитов, несущих морфологические черты ювенильных клеток, в лакунах почки и нефри-диальной железы. Большинство клеток внутри таких скоплений представлено крупными ге-моцитами с высоким ядерно-цитоплазматическим отношением. В то же время, большая часть гемоцитов, обнаруживаемых внутри крупных звеньев циркуляторной системы литто-рины, представлена зрелыми клетками. Несмотря на внешнее сходство организации ткани нефридиальной железы L. littorea с амебоцит-продуцирующим органом других моллюсков, проведенное иммуногистохимическое исследование распределения БрДУ-позитивных клеток не выявило скоплений гемобластов в тканях этой части почки. Также, в гемоцитах, находящихся в лакунах нефридиальной железы, не было обнаружено фигур митозов, которые иногда встречались в циркулирующих клетках внутри крупных синусов почки.

Функциональные характеристики гемоцитов L. littorea

Фагоцитарная активность (Яковлева и др., 20016). Гемоциты L. littorea способны фагоцитировать in vitro эритроциты человека группы крови А, Грам-положительные бактерии Staphylococcus aureus, Lactobacillus sp., частицы зимозана. Динамика фагоцитоза частиц зимозана гемоцитами L. littorea в морской воде и в плазме сходна: в течение первых 30 минут инкубации монослоев гемоцитов с частицами-мишенями доля фагоцитировавших клеток (фагоцитарный индекс, ФИ) возрастает линейно, тогда как после этой временной точки скорость возрастания ФИ снижается (Рис. 2).

рис 2. Динамика фагоцит°за тастщ ж- Уровень фагоцитарной активности гемоцитов мозана гемоцитами L. httorea в плазме и

морской воде. L. littorea зависит от присутствия в среде белков

плазмы. При прочих эквивалентных условиях, значения ФИ для монослоев гемоцитов, инкубируемых с частицами зимозана в присутствии собственной плазмы моллюсков оказываются значительно выше, чем при взаимодействии клеток крови с мишенями, суспензированными в морской воде. При этом различия являются статистически достоверными (Р<0,05) для всех проанализированных временных точек, за исключением первой (10 минут после внесения суспензии частиц зимозана).

Синтез ферментов. В гемоцитах L. littorea, предварительно инкубированных в суспензии зимозана, обнаружена активная кислая фосфатаза (КФ). Доля КФ-позитивных клеток состав-

ляет около 8 % от всех гемоцитов. Клетки, содержащие пероксидазу, среди циркулирующих гемоцитов L. littorea выявить не удалось.

Продукция активных форм кислорода. Все четыре протестированных индуктора респираторного взрыва - РМА, LPS E coli, маннан S cerivisiae и зимозан достоверно (Р<0,05) стимулировали выработку активных радикалов гемоцитами L. littorea (Рис. 3). Скорость восстановления НСТ оказалась максимальной при обработке клеток форболовым эфиром, остальные три индуктора обладали гораздо более низкой способностью стимулировать продукцию активных форм кислорода в клетках гемолимфы литторины и наблюдаемое количество восстановленного НСТ в экспериментальных лунках превышало контрольные значения всего в 1,2-1,5 раза. Присутствие в среде супероксиддисмутазы достоверно (Р<0,05) снижало скорость восстановления НСТ гемоцитами L. littorea при контакте клеток со всеми типами индукторов.

Цитотоксичпость. При инкубации гемоцитов L. littorea свободных от белков плазмы с эритроцитами человека наблюдались разрушение клеток-мишеней и высвобождение гемоглобина. Количество пигмента, перешедшего в раствор в результате лизиса эритроцитов в течение двух часов взаимодействия гемоцитов с клетками-мишенями, достоверно коррелировало с количеством гемоцитов в лунке (г: 0.90 - 0.98;

Р«0.001). При инкубации эритроцитов в

Рис 3. Синтез активных форм кислорода гемоцитами

Lhttorea в присутствии индукторов респираторного течение такого же времени в морской во-взрыва (И) (маннана Scerevisiae, липополисахарида

Kcoli (LPS), зимозана А и форболового эфира Де или плазме литторин, гемоциты кото-(РМА)) или совместном действии индуктора и су- рых были использованы в эксперимен-пероксиддисмутазы (И+СОД). Пунктирная линия

указывает базальный уровень синтеза активных ра- тах, никаких признаков гемолиза не вы-дикалов кислорода гемоцитами.

явлено.

Культивирование in vitro гемоцитов L. littorea.

Предварительные эксперименты обнаружили, что добавление в культуральную среду эмбриональной сыворотки даже в минимальной концентрации (1%) приводит к быстрой (на

протяжении трех суток) гибели 100 % гемоцитов литорин. Вследствие этого обстоятельства все дальнейшие культуральные эксперименты проводились в бессывороточной среде.

При культивировании in vitro гемоцитов, полученных от незараженных моллюсков, срок выживания клеток составляет не более полутора месяцев. При этом в первые сутки после инициации культуры гемоциты формируют монослой на дне лунки. Затем, вплоть до 10-х суток культивирования наблюдается округление большинства клеток и формирование некоторого количества агрегатов различных размеров. При этом, клетки сохраняют подвижность и мигрируют из одного скопления к другому. Дальнейшие культуральные события сводятся к постепенному снижению мобильности гемоцитов, вакуолизации части клеток, потери ими целостности мембраны и неизбежному лизису. Как правило, к концу первого месяца культивирования, около 90 % клеток погибает. При переносе клеток, сохранивших жизнеспособность к этому сроку, на поверхность стекла, происходит их прикрепление и распластывание. При этом, гемоциты приобретают полигональные очертания. Ядра таких клеток обычно правильной формы с хорошо структурированным хроматином.

Гемоциты, полученные от моллюсков, зараженных Н. elongata, выживают in vitro в течение гораздо более длительного времени. При наблюдении за такими культурами были выявлены еще две морфологических модификации клеток гемолимфы - гигантские полиядерные клетки и гранулярные клетки. Для цитоплазмы полиядерных клеток характерна выраженная зональность цитоплазмы (наличие четко очерченных зон экто- и эндоплазмы) и гетерогенность ядер по размеру и плотности упаковки хроматина. Другая морфологическая разновидность гемоцитов, формирующаяся при культивировании in vitro, представлена гранулярными клетками. Основным признаком таких клеток является присутствие в их цитоплазме большого количества пигментированных включений, имеющих желто-коричневую окраску. Гранулярные клетки обычно не распластываются на поверхности пластика, а сохраняют округлую форму, часто собираясь в агрегаты. Продолжительность переживания этих клеток в условиях in vitro достигает 6 месяцев. В использованной культуральной системе увеличение количества клеток (роста культуры) нами не зарегистрировано.

Ни один из протестированных цитокинов млекопитающих не обладал митогенной активностью для гемоцитов L. littorea в условиях in vitro. Через сутки после инициации культуры, число клеток, включивших БрДУ, было чрезвычайно мало (<0,01%) и не изменялось при внесении в культуральную среду

Гуморальные факторы гемолимфы L. littorea: сравнительная характеристика

Белковый состав плазмы. Концентрация белка в плазме незараженных животных варьирует от 3 до 23 мг/мл, среднее значение (n=15) 12,5 мг/мл. Анализ белкового состава бесклеточной гемолимфы L. littorea методом SDS-электрофореза показал, что плазма этого моллюска содержит около 40 белков, имеющих молекулярный вес от 270 до 20 кДа.

Агглютинины (Яковлева, Горбушин, 2000; Яковлева и др., 20016). В плазме L. littorea отсутствуют факторы, обладающие агглютинирующей активностью в отношении бактерий Lactobacillus sp., S. aureus и Е. coli, клеток грибов (S. cerevisiae). Концентрация агглютининов для восьми видов эритроцитов позвоночных животных в плазме литторин также чрезвычайно низка. Медианы титров плазматических агглютининов для эритроцитов позвоночных составляют 0 (эритроциты быка, собаки, человека) или 1 (эритроциты мыши, кролика, крысы). Максимальные значения титров, зарегистрированные при постановке реакции агглютинации с эритроцитами млекопитающих, не превышают 2.

Лизины (Яковлева, Горбушин, 2004). Плазма L. littorea не содержит факторов, обладающих гемолитической активностью. Ни у одной из протестированных особей (п=45) в плазме не обнаружено лизинов, способных разрушать мембраны эритроцитов млекопитающих

Морфо-функциональные модификации элементовгемолимфы Litton па littorea при заражении партенитами трематод

Морфологическая организация мантии вокруг дочерних спороцист R. parvicaudata

Мантия, образуемая гемоцитами вокруг партенит этого вида трематод, представляет собой двуслойное образование, наружный слой которого формируют сильно уплощенные «фиброцитоподобные» гемоциты с удлиненными ядрами, а в состав внутреннего слоя входят гранулярные клетки, формирующие структуру по виду напоминающую эпителий. Клетки внутреннего слоя мантии крупнее свободных гемоцитов, имеют кубическую или слегка вытянутую форму, их цитоплазма прокрашивается неравномерно, ядра часто незаметны.

Гранулярные клетки сохранили некоторые черты сходства с циркулирующими гемоци-тами, в частности эти клетки способны к распластыванию с образованием множества узких ламеллоподий. Однако по специфическому характеру распластывания и по содержанию достаточно крупных гранул в цитоплазме эти клетки существенно отличаются от свободных гемоцитов, находящихся в циркуляции.

Влияние заражения Н. elongata на характеристики гемолимфы L. littorea

Белковый состав плазмы. Общая концентрация белка при этом количество белка в плазме зараженных животных была достоверно (Р<0,05) ниже, чем у незараженных особей. Средние оценки этого параметра плазмы, полученные по методу Брэдфорд, составляли 2,9 мг/мл и 36 мг/мл, соответственно.

Клеточный состав гемолимфы (Яковлева, Горбушин, 2005а). Концентрация гемоцитов в гемолимфе моллюсков, зараженных Я. elongata (3300 мюГ "'), статистически достоверно выше, чем у незараженных особей (1882 мкл-1). Другой особенностью клеточного состава гемолимфы L. littorea, зараженных Н. elongata, является достоверно более высокий процент ювенильных гемоцитов (Р<0,05) у моллюсков этой группы (около 40 %) по сравнению с не-зараженными особями (14,5 %). При исследовании интенсивности включения БрДУ циркулирующими гемоцитами незараженных и зараженных L. littorea обнаружено, что клетки моллюсков второй группы обладают более высокой пролиферативной активностью (Р<0,05).

Сравнительная характеристика функциональной активности гемоцитов неза-раженныхХ. littorea и моллюсков зараженных Н. elongata (Яковлева, Горбушин, 2005а)

Клетки, полученные от незараженных моллюсков, обладают более высокой фагоцитарной активностью по сравнению с гемоцитами особей, зараженных Я elongata (p<0,05). Исследование способности клеток моллюсков обеих групп продуцировать активные радикалы кислорода показало, что этот тип активности гораздо более выражен у клеток гемолимфы не-зараженных литгорин. При этом обнаруженные различия между скоростью восстановления НСТ гемоцитами, полученными от зараженных и незараженных L littorea, были статистически достоверны (Р<0,05). Гемоциты незараженных моллюсков обладают также повышенной способностью к выработке цитотоксических факторов по сравнению с клетками гемолимфы литторин, зараженныхН. elongata.

Влияние СЭ-продуктов партенит трематод на активность гемоцитов моллюсков in vitro (Яковлева и др., 2001а)

Присутствие в среде СЭ-продуктов, выделяемых редиями четырех исследованных видов трематод (Я. elongata, С. lingua, H. militaris, С. cancavum), достоверно (Р< 0,05) снижало фагоцитарную активность гемоцитов незараженных L. littorea (Рис. 4). В то же время, при исследовании влияния СЭ-продуктов трематод на фагоцитарную активность гемоцитов двустворчатого моллюска М. edulis снижения ФИ гемоцитов в присутствии этих факторов не обнаружено.

При исследовании инги-бирующей активности

среды, кондиционированной редиями Н. elongata,

обнаружено, что по мере снижения концентрации СЭ-

Рис. 4 Фагоцитарная активность гемоцитов Llittorea в интактной возрастание средних вели среде L-15 (контроль) и в среде, содержащей СЭ-продукты трема- чин фИ гемоцитов. Одаако, тод H. elongata, С. lingua, H.militaris, C. cancavum.

даже при минимальной исследованной концентрации СЭ-продуктов (12-кратное разведение стоковой среды, концентрация белка около 0,7 мкг/мл) их ингибирующая активность сохранялась. При этом, различия между фагоцитарной активностью клеток в присутствии СЭ-продуктов Н. elongata и контрольных экспериментах статистически достоверны (Р<0,05).

В ходе разделения белковых компонентов СЭ-продуктов Н. elongata получено пять фракций, содержащих белки различных молекулярных весов, а именно фракция белков с молекулярным весом более 100 кДа, от 50 до 100 кДа, от 30 до 50 кДа, от 10 до 30 кДа и меньше 10 кДа. Последующие исследования влияния этих фракций на фагоцитарную активность гемоцитов L. littorea, показали, что только две высокомолекулярные фракции, включающие белки с молекулярным весом более 100 кДа и от 50 до 100 кДа, способны подавлять фагоцитоз частиц зимозана гемоцитами как незараженных литторин, так и моллюсков, зараженных Н. elongata (Рис. 5).

Анализ зависимости между клеточным составом гемолимфы L. littorea и интегральной активностью внутренней защитной системы моллюска

Анализ способности клеток гемолимфы Ь. НМогеа синтезировать активные кислородные радикалы, а также цитотоксические факторы выполнен параллельно с исследованием клеточного состава гемолимфы животных. Была обнаружена достоверная отрицательная корреляция между долей ювенильных клеток в популяции гемоцитов Ь. НМогеа и, с одной стороны, интенсивностью синтеза клетками гемолимфы активных радикалов кислорода (г= - 0,43; Р<0,05) (Рис. 6А), а с другой - количеством продуцируемых ими цитотоксических факторов (г= - 0,66; Р<0,05) (Рис. 6Б). При этом, интегральная активность эффекторных клеток внутренней защитной системы (ВЗС) оказалась выше у особей с минимальным содержанием ювенильных клеток в гемолимфе.

i гемоцитов (

Рис 6. Зависимость межу долей ювенильных гемоцитов и способностью клеток гемолимфы к выработке активных радикалов кислорода (А) и их цитотоксическими свойствами (Б).

Искусственная индукция изменений клеточного состава гемолимфы

У литторин контрольной группы (после введения морской воды) не отмечено никаких модификаций гемограммы, концентрация клеток была стабильной и находилась в пределах от 2017 до 2550 мкл-1. Никаких изменений в концентрации циркулирующих гемоцитов и пропорции клеток разных субпопуляций не вызывало также введение моллюскам конканава-лина А и лектина Phytolacca americana.

У улиток, которым были инъецированы живые бактерии Lactobacillus sp., наблюдалось достоверное (Р<0,05) снижение концентрации циркулирующих гемоцитов по сравнению с контролем на пятый и седьмой дни после инъекции. В то же время, на первый день после инъекции лактобацилл наблюдалось возрастание доли зрелых гемоцитов в циркуляции, затем на третьи сутки - увеличение количества клеток переходного морфотипа, и далее на седьмой день после начала эксперимента доля зрелых клеток у моллюсков этой группы была значительно ниже, чем у контрольных особей. Введение литторинам другого корпускулярного индуктора - зимозана, влекло за собой лишь незначительные изменения клеточного состава гемолимфы, приуроченные только к первым дням после инъекции. В гемолимфе ули-

ток, которым вводили суспензию зимозана, через сутки было отмечено снижение доли клеток переходного морфотипа, но, затем, на третий день численность этой субпопуляции превышала контрольные значения.

Инъекция СЭ-продуктов редий Я elongata вызывала изменения клеточного состава гемолимфы другого характера - на первый день после введения литторинам этих соединений наблюдалось снижение доли зрелых клеток и параллельное возрастание количества гемоци-тов переходного морфотипа. Через неделю после инъекции СЭ-продуктов было отмечено значительное и достоверное возрастание относительного количества ювенильных гемоцитов в циркуляции экспериментальных моллюсков (34 %) по сравнению с контрольными животными (5,7 %). Возрастания общей концентрации гемоцитов в этом случае не наблюдалось.

Сравнительный анализ поверхностных углеводных структур Н. и

гемоцитов моллюсков Ь. ¡Шогеа и М. ейиШ (Яковлева, Гсрбушин, 2002; 20056)

Результаты этой серии экспериментов суммированы в Таблице 1. Гемоциты M.edulis значительно отличаются от гемоцитов Llittorea по видам моносахаров, входящих в состав гликокаликса. Подавляющее большинство терминальных углеводов гликокаликса гемоцитов мидии представлено М-ацетилированными сахарами, специфически распознаваемыми НРА и WGA. Однако, существенно отметить и другой факт - гетерогенность популяции гемоцитов мидии в отношении их взаимодействия с лектинами. Только часть популяции гемоцитов мидии имеет на своей поверхности рецепторы для связывания НРА.

Таблица 1. Взаимодействие лектинов с поверхностью гемоцитов Ь. littorea и М. edulis, а также с поверхностью тегумента Я elongata на разных стадиях жизненного цикла паразита

Лектин WGA НРА Соп A Б8Ь WFL

Специфичность GlcNAc GalNAc Б-Мап Б^1с Ga1NAc Ga1NAc

Гемоциты М. edulis + + — — —

Гемоциты Ь. IШогеа — + + — +

Редии Н. е}оща(а — + + — +

Церкарии Н еЬ^а1а +* +* +* + —

Метацеркарии Н. еЪ^а1а — — — — —

Примечание: «+»и «—» наличие или отсутствие связывания лектина с поверхностью гемоцитов или покровами трематод; * Лектин связывается с покровами личинки преимущественно в определенных зонах около ротовой присоски

На протяжении цикла развития Я elongata происходят значительные изменения углеводного паттерна поверхности тегумента. При этом при переходе от редии к церкарии изменяется как число лектинов, способных к связыванию с поверхностью тегумента, так и харак-

тер их связывания с поверхностью паразита. По типам моносахаров, экспонированных на поверхности гликокаликса, редии Н. elongata оказываются чрезвычайно сходны с гемоцита-ми литторины. Три лектина - WFL, НРА и СопА взаимодействуют как с поверхностью редий так и с мембраной гемоцитов L. littorea, тогда как на мембранах гемоцитов двух исследованных видов моллюсков (L. littorea и М. edulis) имеются общие сайты связывания только для НРА.

Заключение

В результате проведенных исследований изучена гемолимфа L. littorea - основная ткань, принимающая участие в реализации внутренних защитных реакций моллюска. Основной отличительной чертой этой ткани является высокая пластичность, выражающаяся как в наличии сезонных изменений ее клеточного состава, так и в широком спектре возможных диффе-ренцировок циркулирующих гемоцитов, наблюдаемых при заражении партенитами трематод (эпителиоподобные и фиброцитоиодобные клетки мантии) и при культивировании in vitro (полигональные, многоядерные, гранулярные клетки).

Анализ особенностей гемолимфы моллюсков, зараженных Н. elongata, выявил значительные модификации процессов, связанных с регуляцией обновления клеточных элементов этой ткани, а также функционирования зрелых гемоцитов. Обнаруженные изменения, очевидно, являются отражением воздействия паразита на внутреннюю защитную систему хозяина. Дальнейшие исследования тонких механизмов взаимодействий в этой паразито-хозяинной системе могут прояснить особенности регуляции пролиферативной активности камбиальных элементов гемолимфы у брюхоногих моллюсков.

Обнаруженная зависимость между клеточным составом гемолимфы и интегральной активностью внутренней защитной системы L. littorea делает метод анализа гемограммы моллюсков пригодным для оценки физиологического статуса животных в природных популяциях. Предложенный методологический подход может оказаться подходящим и для исследования других видов беспозвоночных животных.

Выводы

1. Основными эффекторными элементами ВЗС L. littorea являются подвижные клетки гемо-

лимфы - агранулярные гемоциты, представленные тремя субпопуляциями - ювениль-ными, переходными и зрелыми клетками.

2. Основными камбиальными элементами клеток гемолимфы L. littorea являются ювениль-

ные диффузно распределенные гемобласты. При этом пролиферация гемоцитов осу-

ществляется внутри лакун и синусов циркуляторной системы животного. Все клетки гемолимфы L. littorea представляют собой одну линию дифференцировки.

3. Основные характеристики популяции клеток гемолимфы (гемограмма) L. littorea, а также

пролиферативная активность гемоцитов существенно варьируют в течение летнего сезона. Изменения гемограммы L. llttoгеа могут быть индуцированы экспериментально путем инъекции моллюскам суспензий бактерий, клеточных стенок грибов или секре-торно-экскреторных продуктов партенит трематод.

4. Гемоциты L. littorea способны к адгезии к чужеродным поверхностям, агрегации,

фагоцитозу, синтезу активных радикалов кислорода и цитотоксических факторов. Наличие зависимости между клеточным составом гемолимфы моллюсков этого вида и интенсивностью основных проявлений активности гемоцитами позволяет использовать параметры гемограммы для оценки статуса ВЗС моллюсков.

5. В плазме гемолимфы L. littorea присутствуют факторы, обладающие опсонизирующей ак-

тивностью по отношению к клеткам грибов. Факторов, обладающих агглютинирующей и гемолитической активностью в плазме литторины не обнаружено. Сравнительный анализ двух последних групп плазматических факторов у представителей Gastropoda и Bivalvia выявил значительные различия в организации гуморального звена ВЗС у представителей этих таксонов.

6. Основные механизмы воздействия партенит трематод на клетки гемолимфы L. littorea сво-

дятся к нарушению нормальных процессов пролиферации и дифференцировки гемо-цитов. Спороцисты Rparvicaudata способны измененять пути дифференцировки гемоцитов. Редии H.elongata индуцируют «ювеншшзацию» клеточной популяции гемолимфы, а также оказывают прямое ингибирующее влияние на проявление активности зрелых клеток. Из пассивных стратегий взаимодействия с внутренней защитной системой хозяина редии трематод этого вида используют углеводную мимикрию.

Список работ опубликованных по теме диссертации

Яковлева, Н.В., Самойлович, М.П., Горбушин А.М. 2001 Поливариантность стратегий защиты от патогенов у моллюсков. Журнал Эволюционной Биохимии и Физиологии, т. 37, №4, с. 270-277.

Яковлева Н.В., Самойлович М.П., Горбушин А.М. 2001 Некоторые особенности внутренних защитных реакций морского переднежаберного моллюска Littorina littorea. Цитология, 43 (4), 417-418.

Яковлева Н.В. Горбушин А.М. 2002 Углеводная мимикрия паразита в системе Littorina littorea — Himasthla elongata. III научная сессия морской биологической станции Санкт-Петербургского государственного университета. Тезисы докладов, 80-82.

Яковлева Н.В, Горбушин A.M. 2004 Сравнительная оценка цитотоксичности плазмы морских моллюсков: I- гемолитический тест. Сборник тезисов докладов V научной сессии морской биологической станции СПбГУ, с. 87-88.

Яковлева Н.В., Климович А.В., Климович Б.В., Горбушин A.M. 2004 Динамика гемограммы четырех видов беломорских моллюсков. Сборник тезисов докладов V научной сессии морской биологической станции СПбГУ. с. 88-89.

Яковлева Н.В., Горбушин, A.M. 2000 Агглютинины гемолимфы Littorina littorea. Вестник СПБГУ, сер.З (Биология), вьга.2, №1, с. 60-65.

Яковлева Н.В., Горбушин A.M. 2005 Углеводная мимикрия паразита в системе Himasthla elongata (Trematoda: Echinostoraatidae) - Littorina littorea (Mollusca: Prosobranchia). Журнал Эволюционной Биохимии и Физиологии, т.41, №2, стр.114-118.

Яковлева Н.В., Горбушин A.M. 2005 Гемограмма Littorina littorea. VI научная сессия морской биологической станции Санкт-Петербургского Государственного Университета, Тезисы докладов, с. 93-95.

Список цитированной литературы.

Яковлева Н.В., Горбушин, A.M. 2000 Агглютинины гемолимфы Littorina littorea. Вестник СПБГУ, сер.З (Биология), вып.2, №1, с. 60-65.

Яковлева Н.В., Самойлович М.П., Горбушин А.М. 2001а Некоторые особенности внутренних защитных реакций морского переднежаберного моллюска Littorina littorea. Цитология, 43 (4), 417-418.

Яковлева Н.В., Самойлович М.П., Горбушин A.M. 20016 Поливариантность стратегий защиты от патогенов у моллюсков. Журнал Эволюционной Биохимии и Физиологии, т. 37, №4, с. 270-277.

Яковлева Н.В., Горбушин А.М. 2002 Углеводная мимикрия паразита в системе Littorina littorea - Himasthla elongata. Ill научная сессия морской биологической станции Санкт-Петербургского государственного университета. Тезисы докладов, 80-82.

Яковлева Н.В, Горбушин A.M. 2004 Сравнительная оценка цитотоксичности плазмы морских моллюсков: I- гемолитический тест. Сборник тезисов докладов V научной сессии морской биологической станции СПбГУ, с. 87-88.

Яковлева Н.В., Климович А.В., Климович Б.В., Горбушин A.M. 2004 Динамика гемограммы четырех видов беломорских моллюсков. Сборник тезисов докладов V научной сессии морской биологической станции СПбГУ. с. 88-89.

Яковлева Н.В., Горбушин А.М. 2005а Гемограмма Littorina littorea. VI научная сессия морской биологической станции Санкт-Петербургского Государственного Университета, Тезисы докладов, с. 93-95.

Яковлева Н.В., Горбушин А.М. 20056 Углеводная мимикрия паразита в системе Himasthla elongata (Trematoda: Echinostomatidae) - Littorina littorea (Mollusca: Prosobranchia). Журнал Эволюционной Биохимии и Физиологии, т.41, №2, стр. 114-118.

Bradford, M.M. 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 72,248-254.

Gorbushin A.M., Shaposhnikova T.G. 2002 In vitro culture of the avian echinostome Himasthla elongata: from redia to marita. Experimental Parasitology, 101,234-239.

Laemmli U.K. 1970 Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227, 680-685.

Подписано в печать 19.04.05. Формат 60*84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Печ. л. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ 24.

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии Издательства СПбГЭТУ "ЛЭТИ"

Издательство СПбГЭТУ "ЛЭТИ" 197376, С.-Петербург, ул. Проф. Попова, 5

19 МАЙ 2005

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Яковлева, Надежда Владимировна

Введение.

Обзор литературы.

I Организация внутренней защитной системы (ВЗС) моллюсков.

Клеточные элементы гемолимфы моллюсков.

Морфология гемоцитов.

Двустворчатые моллюски (Bivalvia).

Брюхоногие моллюски (Gastropoda).

Функции гемоцитов.

Изменения характеристик популяции клеток гемолимфы под воздействием различных факторов

Гуморальные факторы гемолимфы моллюсков.

Пектины, вовлеченные в реализацию защитных реакций.

Антибактериальные факторы.

Цитотоксические факторы.

Факторы «свертывания» плазмы.

Цитокиноподобные медиаторы защитных реакций.

Медиаторы стрессового ответа.

II Иммунологические аспекты взаимоотношений в системе моллюск-партениты трематод

Специфичность в системе моллюск-трематода.

Проблема резистентности и чувствительности моллюсков к заражению трематодами.

Стратегии, используемые трематодами для воздействия на ВЗС моллюсков.

Пассивные стратегии взаимодействия с ВЗС хозяина.

Извращение защитных реакций хозяина.

Модуляция активности ВЗС хозяина.

Изменения характеристик популяции клеток гемолимфы хозяина.

Изменение адгезионной способности клеток гемолимфы.

Изменения фагоцитарной активности гемоцитов.

Модуляция других проявлений функциональной активности гемоцитов.

Механизмы воздействия СЭ-продуктов трематод на клетки гемолимфы моллюсков.

Прямое воздействие.

Воздействие, опосредованное через нейрогуморальную систему.

Влияние заражения трематодами на активность гуморальных факторов ВЗС моллюска.

Материалы и методы.

Объекты исследования.

Сбор и содержание моллюсков. Получение гемолимфы. морфо-функциональная характеристика гемоцитов.

Приготовление монослоев гемоцитов.

Исследование морфологии гемоцитов.

Цитохимические исследования.

Мониторинг клеточного состава гемолимфы L. littorea.

Исследование поверхностных маркеров гемоцитов L. littorea и M.edulis.

Исследование пролиферативной активности и гистогенеза клеток гемолимфы L. littorea.

Исследование фагоцитарной активности гемоцитов in vitro.

НСТ-тест.

Исследование клеточной цитотоксичности.

Исследование клиренса бактерий.

Культивирование in vitro гемоцитов L. littorea.

Исследование гуморальных факторов гемолимфы L.littorea.

Реакция агглютинации.

Реакция гемолиза.

Культивирование in vitro партенит трематод.

Исследование углеводных детерминант поверхности Himasthla elongata на разных стадиях жизненного цикла.

Экспериментальная индукция изменения концентрации гемоцитов и клеточного состава гемолимфы.

Комментарий к методам статистического анализа.

Результаты.

Особенности методик получения гемолимфы и манипуляций с гемоцитами L. littorea.

Характеристика основных элементов гемолимфы L. littorea.

Клеточные элементы гемолимфы.

Морфология гемоцитов L. littorea.

Сезонная динамика клеточного состава гемолимфы L. littorea.

Исследование поверхностных маркеров гемоцитов литторины.

Исследование гистогенеза клеток гемолимфы.

Функциональные характеристики гемоцитов L. littorea.

Фагоцитарная активность.

Синтез ферментов.

Продукция активных форм кислорода.

Цитотоксичность.

Клиренс чужеродного материала.

Культивирование in vitro гемоцитов L. littorea.

Гуморальные факторы гемолимфы L. littorea: сравнительная характеристика.

Белковый состав плазмы.

Агглютинины.

Лизины.

Исследование основных механизмов воздействия партенит трематод на активность ВЗС

Littorina littorea.

Морфологическая организация мантии вокруг дочерних спороцист R. parvicaudata.

Влияние заражения Н. elongata на характеристики гемолимфы L. littorea.

Белковый состав плазмы.

Клеточный состав гемолимфы.

Сравнительная характеристика функциональной активности гемоцитов незараженных

L. littorea и моллюсков зараженных Н. elongata.

Фагоцитарная активность.

Синтез активных кислородных радикалов.

Цитотоксические свойства гемоцитов.

Анализ зависимости между клеточным составом гемолимфы L. littorea и интегральной активностью ВЗС моллюска.

Влияние СЭ-продуктов партенит трематод на активность гемоцитов моллюсков in vitro.

Искусственная индукция изменений клеточного состава гемолимфы.

Сравнительный анализ поверхностных углеводных структур Н. elongata и гемоцитов моллюсков l. littorea и м. edulis.

Обсуяедение.

Особенности методики получения гемолимфы L. littorea.

Морфология и гистогенетические отношения клеток гемолимфы L. littorea.

Культивирование in vitro гемоцитов L. littorea.

Функциональные характеристики гемоцитов L. littorea.

Гуморальные факторы гемолимфы L. littorea.

Изменение морфо-функциональных характеристик гемоцитов L. littorea при заражении моллюсков партенитами трематод.

Выводы:.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Яковлева, Надежда Владимировна

Выводы:

1. Основными эффекторными элементами ВЗС L. littorea являются подвижные клетки гемолимфы - агранулярные гемоциты, представленные тремя субпопуляциями — ювенильными, переходными и зрелыми клетками.

2. Основными камбиальными элементами клеток гемолимфы L. littorea являются ювенильные диффузно распределенные гемобласты. При этом пролиферация гемоцитов осуществляется внутри лакун и синусов циркуляторной системы животного. Все клетки гемолимфы L. littorea представляют собой одну линию дифференцировки.

3. Основные характеристики популяции клеток гемолимфы (гемограмма) L. littorea, а также пролиферативная активность гемоцитов существенно варьируют в течение летнего сезона. Изменения гемограммы L. littorea могут быть индуцированы экспериментально путем инъекции моллюскам суспензий бактерий, клеточных стенок грибов или секреторно-экскреторных продуктов партенит трематод.

4. Гемоциты L. littorea способны к адгезии к чужеродным поверхностям, агрегации, фагоцитозу, синтезу активных радикалов кислорода и цитотоксических факторов. Наличие зависимости между клеточным составом гемолимфы моллюсков этого вида и интенсивностью основных проявлений активности гемоцитами позволяет использовать параметры гемограммы для оценки статуса ВЗС моллюсков.

5. В плазме гемолимфы L. littorea присутствуют факторы, обладающие опсонизирующей активностью по отношению к клеткам грибов. Факторов, обладающих агглютинирующей и гемолитической активностью в плазме литторины не обнаружено. Сравнительный анализ двух последних групп плазматических факторов у представителей Gastropoda и Bivalvia выявил значительные различия в организации гуморального звена ВЗС у представителей этих таксонов.

6. Основные механизмы воздействия партенит трематод на клетки гемолимфы L, littorea сводятся к нарушению нормальных процессов пролиферации и дифференцировки гемоцитов. Спороцисты R.parvicaudata способны измененять пути дифференцировки гемоцитов. Редии H.elongata индуцируют «ювенилизацию» клеточной популяции гемолимфы, а также оказывают прямое ингибирующее влияние на проявление активности зрелых клеток. Из пассивных стратегий взаимодействия с внутренней защитной системой хозяина редии трематод этого вида используют углеводную мимикрию.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Яковлева, Надежда Владимировна, Санкт-Петербург

1. Галактионов К. В., Добровольский А. А. 1998 Происхождение и эволюция жизненных цикловтрематод. Санкт-Петербург, «Наука»

2. Горбушин, A.M. 2000 Сравнительный морфо-функциональный анализ взаимоотношений в системемоллюск-трематода. Паразитология, 34, №6, 502-514.

3. Добровольский А.А Жизненный цикл Paralepoderma cloacicola (Luhe, 1909) Dolfus, 1950, (Trematoda,

4. Plagiorchiidae). Вестник ЛГУ, №9, с. 28-38.

5. Добровольский А.А., Райхель А.С. 1973 Жизненный цикл Haplometra cylindracea Zeder, 1800

6. Trematoda, Plagiorchiidae). Вестник ЛГУ, №3, с. 5-17.

7. Худолей, В.В., Сиренко, О.А. 1977 Возникновение опухолей у двустворчатых моллюсков Uniopictorum под влиянием N-нитрозосоединений. Бюллетень Экспериментальной Биологии и Медицины, №5, с. 577-579.

8. Яковлева, Н.В., Самойлович, М.П., Горбушин А.М. 2001 Поливариантность стратегий защиты отпатогенов у моллюсков. Журнал Эволюционной Биохимии и Физиологии, т. 37, №4, с. 270-277.

9. Abdul-Salam, J.M., Michelson, Е.Н. 1980а Biomphalaria glabrata amoebocytes: assay of factors influencingin vitro phagocytosis. J Invertbr Pathol, 36, 52-59.

10. Abdul-Salam, J. M., Michelson, E. H. 1980b Biomphalaria glabrata amoebocytes: effect of Schistosomamansoni infection on in vitro phagocytosis. J Invertebr Pathol, 35,241-248.

11. Abrous, M., Rondelaud, D., Dreyfuss, G., Cabaret, J. 1999 Infection of Lymnaea truncatula and Lymnaeaglabra by Fasciola hepatica and Paramphistomum daubneyi in farms of central France. Vet Res, 30, 113-118.

12. Adams, M.D., Celniker, S.E., Holt, R.A., Evans, C.A., Gocayne, J.D., Amanatides, P.G., Scherer, S.E., Li,

13. Adema C.M., van Deutekom-Mulder E.C., van der Knaap W.P., Sminia Т. 1993 NADPH-oxidase activity:the probable source of reactive oxygen intermediate generation in hemocytes of the gastropod Lymnaea stagnalis. J Leukoc Biol, 54, 379-383.

14. Adema, C.M., van Deutekom Mulder, E.C., van der Knaap W.P., Sminia T.S. 1994a Schistosomicidalactivities of Lymnaea stagnalis haemocytes: the role of oxygen radicals. Parasitology, 109,479-85.

15. Adema, C.M., Mohandas, A., van der Knaap, W.P.W., Sminia, T. 1994c Separation of Lymnaea stagnalishemocytes by density gradient centrifugation. Dev Comp Immunol, 18, 25-31.

16. Adema, С. M., Harris, R. A., van Deutekom-Mulder, E. C. 1992 A comparative study of hemocytes from sixdifferent snails: morphology and functional aspects. J Invertebr Pathol 59,24-32.

17. Adema, С. M., Hertel, L. A., Loker, E. S. 1999 Evidence from two planorbid snails of a complex anddedicated response to digenean (echinostome) infection. Parasitology, 119, 395-404.

18. Adema, C. M., Hertel, L. A., Miller, R. D., Loker, E. S. 1997 A family of fibrinigen-related proteins thatprecipitates parasite-derived molecules is produced by an invertebrate after infection. Proc Natl Acad Sci USA, 94, 8691-8696.

19. Adema, C.M., Loker, E.S. 1997 Specificity and immunobiology of larval digenean-snail associations. In

20. Advances in Trematode Biology, Fried B., Graczyk T.K. (eds.), CRC Press, 229-263.

21. Adema, C.M., van Deutekom-Mulder, E.C., van der Knaap, W.P.W., Meuleman, E.A., Sminia, T. 1991

22. Generation of oxygen radicals in hemocytes of the snail Lymnaea stagnalis in relation to the rate of phagocytosis. Dev Comp Immunol, 15, 17-26.

23. Allam, B., Ashton-Alcox, K.A., Ford, S.E. 2001 Haemocyte parameters associated with resistance to brownring disease in Ruditapes spp. clams. Dev Comp Immunol, 25, 365-375.

24. Alvarez, M.R., Friedl, F.E., Johnson, J.S., Hinsch, G.W. 1989 Factors affecting in vitro phagocytosis byoyster hemocytes. J Invertebr Pathol, 54,233-241.

25. Amen, R.I. Baggen, J.M., Bezemer, P.D., De Jong Brink, M. 1992 Modulation of the activity of the internaldefence system of the pond snail Lymnaea stagnalis by the avian schistosome Trichobilharzia ocellata. Parasitology, 104, 33-40.

26. Amen, R.I. Baggen, J.M., Bezemer, P.D., De Jong Brink, M., 1992 Modulation of the activity of the internaldefence system of the pond snail Lymnaea stagnalis by the avian schistosome Trichobilharzia ocellata. Parasitology, 104, 33-40.

27. Amen, R.I., Tijnagel, J.M.G., Van der Knaap, W.P.W., Meuleman, E.A., de Lange-de Klerk, E.S.M., Sminia,

28. T. 1991 Effects of Trichobilharzia ocellata on hemocytes of Lymnaea stagnalis. Dev Comp Immunol, 15,105-115.

29. Anderson, R. S. 1994 Hemocyte-derived reactive oxygen intermediate production in four bivalve mollusks.

30. Dev Comp Immunol, 18, 89-96.

31. Anderson, R.S. 1987 Polycaryon formation by Mercenaria mercenaria hemocytes. Biol Bull, 173, 236-245.

32. Anderson, R.S. 1981 Inducible hemolytic activity in Mercenaria mercenaria hemolymph. Dev Comp1.munol, 5, 575-585.

33. Anderson, R.S. 1988 Effects of anthropogenic agents on bivalve cellular and humoral defense mechanisms.

34. Amer Fish Soc Spec Publ, 18,238-242.

35. Anderson, R.S. 1996 Interactions of Perkinsus marinus with humoral factors and hemocytes of Crassostreavirginica. J Shellfish Res, 15, 127-134.

36. Anderson, R.S. Brubacher, L.L., Ragone Calvo, L.M., Burreson, E.M., Unger, M.A. 1997 Effects of in vitroexposure to tributiltin on generation of oxigen metabolites by oyster hemocytes. Environ Res, 74, 84-90.

37. Appleton, C.C. 1983 Studies on Austrobilharzia terrigalensis (Trematoda: Schistosomatidae) in the Swanestuary, Western Australia: frequency of infection in the intermediate host population. Int J Parasitol, 13, 51-60.

38. Arimoto, R., Tripp, M. R. 1977 Characterization of a bacterial agglutinin in the hemolymph of the hard clam

39. Mercenaria mercenaria. J Invertebr Pathol, 30,406-413.

40. Aufiret, M. 1988 Bivalve hemocyte morphology. Amer Fish Soc Spec Publ 18, 169-177.

41. Aufiret, M. 1989 Comparative study of the hemocytes of two oyster species: the European flat oyster Ostreaedulis Linnaeus, 1750 and the Pacific oyster,Crassostrea gigas (Thunberg, 1793). J Shellfish Res, 8, 367373.

42. Auzoux, S., Domart-Coulon, 1., Doumenc, D. 1993 Gill cell cultures of the butterfish clam Ruditapesdecussatus. J Mar Biotechnol, 1, 79-81.

43. Babior, B. 1999 NADPH-oxidase: an update. Blood, 93, 1464-1476.

44. Balouet, G., Poder, M., Cahour, A., Auffret, M. 1986 Proliferative hemocytic condition in European flatoyster (Ostrea edulis) from Breton Coasts: a 6-year survey. J Invertebr Pathol, 48,208-215.

45. Barker, C.M., Calvert, R.J., Walker, C.W., Reinisch, C.L. 1997 Detection of mutant p53 in clam leukemiacells. Exp Cell Res, 232,240-245.

46. Barraco, M.A., Steil, A.A., Gargioni, R. 1993 Morphological characterization of the hemocytes of thepulmonate snail Biomphalaria tenagophila. Mem Inst Osw Cruz, 88, 73-83.

47. Basch, P.F., DiConza, J.J., 1975. Predation by Echinostome rediae upon Schistosome sporocysts in vitro. J.1. Parasitol. 61,1044-1047

48. Bayne C. J., Stephens J. A. 1983 Schistosoma mansoni and Biomphalaria glabrata share epitopes: antibodiesto sporocysts bind host snail hemocytes. J Invertebr Pathol, 42,221-223.

49. Bayne, C. J., Hahn, U. K., Bender, R. C. 2001 Mechanisms of molluscan host resistance and of parasitestrategies for survival. Parasitology, 123 (Suppl), S159-167.

50. Bayne, C. J., Loker, E. S., Yui, M. A. 1986 Interactions between the plasma proteins of Biomphalariaglabrata (Gastropoda) and the sporocyst tegument of Schistosoma mansoni (Trematoda). Parasitology 92, ^ 653-664.

51. Bayne, C.J., Buckley, P.M., DeWan, P.C. 1980 Schistosoma mansoni: cytotoxicity of hemocytes fromsusceptible snail hosts for sporocysts in plasma from resistant Biomphalaria glabrata. Exp Parasitol, 50, 409-416.

52. Beckeman, N., Morse, M. P., Moore, C. M. 1992 Comparative study of phagocytosis in normal and diseasedhemocytes of the bivalve mollusc Mya arenaria. J Invertebr Pathol, 59, 124-132.

53. Bender, R.C., Bixler, L.M., Lerner, J.P., Bayne, C.J. 2002 Schistosoma mansoni sporocysts in culture: hostplasma hemoglobin contributes to in vitro oxidative stress. J Parasitol, 88, 14-18.

54. Beschin, A., Bilej, M., Magez, S., Lucas, R., De Baetselier, P. 2003 Functional convergence of invertebrateand vertebrate cytokine-like molecules based on a similar lectin-like activity. Prog Mol Subcell Biol, 34, 145-163.

55. Bey, E.A., Xu, B., Bhattacharjee, A., Oldfield, C.M., Zhao, X., Li, Q., Subbulakshmi, V., Feldman, G.M.,

56. Wientjes, F.B., Cathcart, M.K. 2004 Protein kinase C delta is required for p47phox phosphorylation and translocation in activated human monocytes. J Immunol, 173, 5730-5738.

57. Boswell, C. A., Bayne, C. J. 1984 Isolation, characterization and functional assessment of a hemagglutinin £ from the plasma of Biomphalaria glabrata, intermediate host of Schistosoma mansoni. Dev Comp1.munol, 8,559-568.

58. Boswell, C. A., Yoshino, T. P., Dunn, T. S. 1987 Analysis of tegumental surface proteins of Schistosomamansoni primary sporocysts. J Parasitol, 73, 778-786.

59. Bradford, M. M. 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of proteinutilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 72,248-254.

60. Bramble, L.H., Anderson, R.S. 1997 Modulation of Crassostrea virginica hemocyte reactive oxygen speciesproduction by Listonella anguillarum. Dev Comp Immunol, 21,337-48.

61. Bramble, L.H., Anderson, R.S. 1998 A comparison of the chemiluminescent response of Crassostreavirginica and Morone saxatilis phagocytes to zymosan and viable Listonella anguillarum. Dev Comp Immunol, 22,55-61.

62. Brewer C. F., Marcus D. M., Grollman A. P., Sternlicht H. 1974 Interactions of saccharides withconcanavalin A. Relation between calcium ions and the binding of saccharides to concanavalin A. J Biol Chem, 249,4614-4616.

63. Brown, A. C. 1967 Elimination of foreign particles by the snail, Helix aspersa. Nature, 213, 1154-1155.

64. Brown, A. C., Brown, R. J. 1965 The fate of thorium dioxide injected into the pedal sinus of Bullia

65. Gastropoda, Prosobranchiata) J Exp Biol 42, 509-519.

66. Brown, D. 1994 Freshwater snails of Africa and their medical importance. London: Taylor and Francis.

67. Busson, P., Busson, D., Rondelaud, D., Pestre-Alexandre, M. 1982 Experimental data on the infestation ofthe young of 5 species of Lymnaea by Fasciola hepatica L. Ann Parasitol Hum Comp (Abstract), 57, 555-563.

68. C. elegans Sequencing Consortium 1998 Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform forinvestigating biology. Science, 282,2012-2018.

69. Cajaraville, M. P., Pal, S. G., Robledo, Y. 1995 Light and electron microscopical localization of lysosomalacid hydrolases in bivalve haemocytes by enzyme cytochemistry. Acta Histochem Cytochem, 28, 527536.

70. Cajaraville, M.P., Olabarrieta, I., Marigomez, I. 1996 In vitro activities in mussel hemocytes as biomarkers ofenvironmental quality: a case study in the Abra estuary (Biscay Bay). Ecotoxicol Environ Saf, 35,253260.

71. Cajaraville, M.P., Pal, S.G. 1995 Morphofunctional study of the haemocytes of the bivalve mollusc Mytilus galloprovincialis with emphasis on the endolysosomal compartment. Cell Struct Funct, 20, 355-67.y

72. Carballal, M. J., López, C., Azevedo, C., Villaba, A. 1997 Enzymes involved in defence functions ofhemocytes of mussel Mytilus galloprovincialis. J Invertebr Pathol, 70,96-105.

73. Carballal, M.J., Villalba, A., Lopez, C. 1998. Seasonal variation and effects age, food availability, size,gonadal development, and parasitism on the hemogram of Mytilus galloprovincialis. J Invertbr Pathol, 72,304-312.

74. Cheng, T. C., Downs, J. C. U. 1988 Intracellular acid phosphotase and lysozyme levels in subpopulations ofoyster, Crassostrea virginica, hemocytes. J Invertebr Pathol, 52, 163-167.

75. Cheng, T.C. 1992 Selective induction of release of hydrolases from Crassostrea virginica hemocytes bycertain bacteria. J Invertebr Pathol, 59, 197-200.

76. Cheng, T.C., Auld, K.R. 1977 Hemocytes of the pulmonate gastropod Biomphalaria glabrata. J Invertebr1. Pathol, 30, 119-122.

77. Cheng, T.C., Cali, A. 1974 An electron microscope study of the fate of bacteria phagocytosed bygranulocytes of Crassostrea virginica. Contemp Top Immunol, 4, 25-35.

78. Cheng, T.C., Foley, D.A. 1975 Hemolymph cells of the bivalve mollusc Mercenaria mercenaria: an electronmicroscopical study. J Invertebr Pathol, 26, 341-351.

79. Cheng, T.C., Guida, V.G. 1980 Hemocytes of Bulinus truncatus rohlfsi (Mollusca: Gastropoda). J Invertebr1. Pathol, 35,158-167.

80. Cheng, T.C., Mohandas, A. 1985. Effects of high dosages of bacterial challenge on acid phosphatase releasefrom Biomphalaria glabrata hemocytes. J Invertebr Pathol, 45,236-241.

81. Cheng, T.C., Yoshino, T.P. 1976. Lipase activity in the hemolymph of Biomphalaria glabrata (Mollusca)challenged with bacterial lipids. J Invertebr Pathol, 28, 143-146.

82. Chu, F. E. 1988 Humoral defence factors in marine bivalves. Amer Fish Soc Spec Publ, 18, 178-188.

83. Chu, F.E., La Peyre, J.F. 1989 Effect of environmental factors and parasitism on hemolymph lysozyme andprotein of american oysters Crassostrea virginica. J Invertebr Pathol, 54,224-232.

84. Cima, F., Matozzo, V., Marin, M. G., Bailarín, L. 2000 Haemocytes of the clam Tapes phillippinarum

85. Adams and Reeve, 1850): morphofunctional characterization. Fish Shell Immunol 10, 677-693. '0 84. Combes, C., Despres, L., Establet, D., Fournier, A., Jourdane, J., Mone, H., Morand, S., Theron, A. 1991

86. Schistosomatidae (Trematoda): some views on their origin and evolution. Res Rev Parasitol, 51,25.

87. Connors, V. A., Lodes, M. J., Yoshino, T. P. 1991 Identification of a Schistosoma mansoni sporocystexcretory-secretory antioxidant molecule and its effect on superoxide production by Biomphalaria glabrata hemocytes. J Invertebr Pathol, 58, 387-395.

88. Connors, V.A., Yoshino, T.P. 1990 In vitro effect of larval Schistosoma mansoni excretory-secretoryproducts on phagocytosis stimulated superoxide production in hemocytes from Biomphalaria glabrata. J Parasitol, 76, 895-902.

89. Conté, A., Ottaviani, E. 1995. Nitric oxide sunthase activity in molluscan hemocytes. FEBS Lett. 365, 120124.

90. Cooper, K.R., Brown, R.S., Chang, P.W. 1982 The course and mortality of a hematopoietic neoplasm in thesoft shell clam Mya arenaria. J Invertebr Pathol, 39, 149-157.

91. Coppin, J.F., Lefebvre, C., Caby, S., Cocquerelle, C., Vicogne, J., Coustau, C., Dissous, C. 2003 Geneexpression changes in Schistosoma mansoni sporocysts induced by Biomphalaria glabrata embryonic cells. Parasitol Res, 89, 113-119.

92. Cosson-Mannevy, M. A., Wong, C. S., Cretney, W. J. 1984 Putative neoplastic disorders in mussels (Mytilusedulis) from Southern Vancouver Island waters, British Columbia. J Invertebr Pathol, 44, 151-160.

93. Couch, L., Hertel, L.A., Loker, E.S. 1990 Humoral response of the snail Biomphalaria glabrata to trematodeinfection: observations on a circulating hemagglutinin. J Exp Zool, 255, 340-349.

94. Coustau, C., Ataev, G., Jourdane, J., Yoshino, T.P. 1997 Schistosoma mansoni-. In vitro cultivation ofmiracidium to daughter sporocyst using a Biomphalaria glabrata embryonic cell line. Exp Parasitol, 87, 77-87.

95. Coustau, C., Yoshino, T. P. 1994a Surface membrane polypeptides associated with hemocytes from Schistosoma mansoni- susceptible and -resistant strains oí Biomphalaria glabrata (Gastropoda). J Invertebr Pathol, 63, 82-89.

96. Coustau, C., Yoshino, T. P. 1994b Schistosoma mansoni: modulation of hemocyte surface polypeptidesdetected in individual snails, Biomphalaria glabrata, following larval exposure. Exp Parasitai, 79, 1-10.

97. Coustau, C., Yoshino, T.P. 2000 Flukes without snails: advances in the in vitro cultivation of intramolluscanstages of trematodes. Exp Parasitai, 94, 62-66.

98. Cribb, T.H., Bray, R.A., Littlewood, D.T. 2001 The nature and evolution of the association among digeneans,molluscs and fishes. Int J Parasitai, 31, 997-1011.

99. Dam, T. K., Bandyopadhyay, P., Sarkar, M., Ghosal, J., Bhattacharya, A., Choudhury, A. 1994 Purification ^ and partial characterization of a heparin-binding lectin from the marine clam Anadara granosa. Biochem

100. Biophys Res Commun, 203,36-45.

101. Dam, T. K., Sarkar, M., Ghosal, J., Choudhury, A. 1992 A novel galactosyl-binding lectin from the plasma ofthe blood clam Anadara granosa. Mol Cell Biochem, 117, 1-9.

102. Davey, J.T., Gee, J.M. 1988 Mytilicola intestinalis, a copepod parasite of blue mussel. Am Fish Soc Special1. Pub, 18, 64-73.

103. Davids, B., Xia-Jun, W., Yoshino, T. P. 1999 Cloning of P integrin subunit cDNA from an embryonic cellline derived from the freshwater mollusc Biomphalaria glabrata. Gene, 228, 213-223.

104. Davids, B.J., Yoshino, T.P. 1998. Integrin-like RGD-dependent binding mechanism involved in the spreadingresponse of circulating molluscan phagocytes. Dev Comp Immunol, 22, 39-53.

105. De Gaffé, G., Loker, E. S. 1998 Susceptibilityof Biomphalaria glabrata to infection with Echinostomaparaensei: correlation with the effect of parasite secretory-excretory products on host hemocyte spreading. J Invertebr Pathol, 71, 64-72.

106. De Jong-Brink, M. 1995 How schistosomes profit from the stress response they elicit in their hosts. Adv1. Parasitai, 35, 177-248.

107. De Jong-Brink, M., Bergamin-Sassen, M., Solis Soto, M. 2001 Multiple strategies of schistosome to meettheir requirements in the intermediate snail host. Parasitology, 123 (Suppl), S129-S141.

108. DeLeo, F.R., Allen, L.H., Apicella, M., Nauseef, W.M. 1999 NADPH oxidase activation and assemblyduring phagocytosis. J Immunol, 163,6732-6740.

109. DeLeo, F.R., Quinn, M.T. 1996 Assembly of the phagocyte NADPH oxidase: molecular interactions ofoxidase proteins. J Leuc Biol, 60, 677-691.

110. Deme R., Horak P., Zelck U. 1995 Hemocyte surface saccharides of Lymnaea stagnalis, the intermediate hostof Trichobilharzia szidati. Helminthologia, 33,83.

111. Dikkeboom R., Van der Knaap W.P., Meuleman E.A, Sminia T. 1985 A comparative study on the internal £ defence system of juvenile and adult Lymnaea stagnalis. Immunology, 55, 547-553.

112. Dikkeboom, R, van der Knaap, W. P. W., Meuleman, E. A., Sminia, T. 1984 Differences between blood cellsof juvenile and adult specimens of the pond snail Lymnaea stagnalis. Cell Tissue Res 238,43-47.

113. Dikkeboom, R., Tijagel, J.M.G.H., Van der Knaap, W.P.W. 1988a Monoclonal antibody recognizedhemocyte subpopulations in juvenile and adult Lymnaea stagnalis: functional characteristics and lectin binding. Dev Comp Immunol, 12,17-32.

114. Dikkeboom, R., van der Knaap, W.P.W., Van den Bovenkamp, W., Tijnagel, J.M.G.H., Bayne, C.J. 1988b

115. The production of toxic oxygen metabolites by hemocytes of different snail species. Dev Comp Immunol, 12, 509-520.

116. Dikkeboom, R., Tijnagel, J.M.J.H., Mulder, E.C., van der Knaap, W.P.W. 1987 Hemocytes of the pond snail1.mnaea stagnalis generate reactive forms of oxygen. J Invertbr Pathol, 49, 321-331.

117. Dissous, C., Grzych, J.M., Capron, A. 1986 Schistosoma mansoni shares a protective oligosaccharide epitopewith freshwater and marine snails. Nature, 323,443-445.

118. Donald, K.M., Kennedy, M., Poulin, R., Spencer, H.G. 2004 Host specificity and molecular phylogeny oflarval Digenea isolated from New Zealand and Australian topshells (Gastropoda: Trochidae). Int J Parasitai, 34, 557-568.

119. Dreyfuss, G., Vignoles, P., Rondelaud, D. 2000a Variability of Fasciola hepatica infection in Lymnaea ovatain relation to snail population and snail age. Parasitai Res, 86, 69-73.

120. Dreyfuss, G., Abrous, M., Rondelaud, D. 2000b The susceptibility of Lymnaea fuscus to experimentalinfection with Fasciola hepatica. J Parasitai, 86, 158-160.

121. Dreyfuss, G., Vignoles, P., Abrous, M., Rondelaud, D. 2002 Unusual snail species involved in thetransmission of Fasciola hepatica in watercress beds in central France. Parasite, 9, 113-120.

122. Duclermortier, P., Lardans, V., Serra, E., Trottein, F., Dissous, C. 1999 Biomphalaria glabrata embryoniccells express a protein with a domain homologous to the lectin domain of mammalian selectins. Parasitai Res, 85,481-486.

123. Duvaux-Miret, O., Stefano, G. B., Smith, E. M., Dissous, C., Capron, A. 1992a Immunosuppression in the ¡\ defensive and intermediate hosts of the human parasite Schistosoma mansoni by release of

124. T* immunoactive neuropeptides. Proc Natl Acad Sci USA, 89,778-781.

125. Duvaux-Miret, O., Stefano, G. B., Smith, E. M., Mallozzi, L. A., Capron, A 1992b Proopiomelanocortinderived peptides as tools of immune evasion for the human trematode Schistosoma mansoni. Acta Biol Hung, 43,281-286.

126. Dyrynda, E. A., Pipe, R. K., Ratcliffe, N. A. 1997 Sub-populations of haemocytes in the adult and developingmarine mussel, Mytilus edulis, identified by use of monoclonal antibodies. Cell Tissue Res, 289, 527536.

127. Farag, H.F., ElSayad, M.H. 1995 Biomphalaria alexandrina naturally infected with Fasciola gigantica in

128. Egypt. Trans R Soc Trop Med Hyg, 89, 36.

129. Feng, S.Y. 1965 Heart rate and leukocyte circulation in Crassostrea virginica (Gmelin). Biol Bull, 128, 198210.

130. Feng, S.Y. 1988 Cellular defense mechanisms of oysters and mussels. Amer Fish Soc Spec Pub, 18, 153-168.

131. Feng, S.Y., Feng, J.S., Burke, C.N., Khairallah, L.H. 1971 Light and electron microscopy of the hemocytes of

132. Crassostrea virginica (Mollusca-Pelycopoda). Z Zellforsch Mikr Anat, 120,225-243.

133. Fisher, W. S., DiNuzzo, A. 1991 Agglutination of bacteria and erythrocytes by serum of six species of marinemolluscs. J Invertebr Pathol, 57, 380-394.

134. Fisher, W.S. 1988 Environmental influence on bivalve hemocyte function. Amer Fish Soc Spec Publ 18, 225237.

135. Fisher, W.S., Newell, R.I.E. 1986 Salinity effects on the activity of granular hemocytes of american oysters,

136. Crassostrea virginica. Biol Bull, 170, 122-134.

137. Flower, R.L., Wilcox, G.E., Pass, D.A., 1985 Detection of two lectins in haemolymph from the oyster

138. Pinctada maxima. Aust J Exp Biol Med Sci, 63, 703-707.

139. Foley, D.A., Cheng, T.C. 1972 Interaction of mollusks and foreign substances: the morphology and behaviorof hemolymph cells in the American oyster Crassostrea virginica, in vitro. J Invertbr Pathol, 19, 383394.

140. Foley, DA., Cheng, T.C. 1974 Morphology, hematological parameters and behavior of hemolymph cells ofquahog clam, Mercenaria mercenaria. Biol Bull, 146,343-356

141. Ford, S.E. 1986 Comparison of hemolymph proteins from resistant and susceptible oysters, Crassostreavirginica, exposed to the parasite Haplosporidium nelsoni (MSX). J Invertbr Pathol, 47, 283-294.

142. Ford, S.E., Kanaley, S.A., Littlewood, D.T.J. 1993 Cellular responses of oysters infected with

143. Haplosporidium nelsoni: changes in circulating and tissue-infiltrating hemocytes. J Invertebr Pathol, 61, 49-57.

144. Franchini, A., Ottaviani, E. 1990 Fine structure and acid phosphatase localization of hemocytes in thefreshwater snail Viviparus ater (Gastropoda, Prosobranchia). J Invertebr Pathol, 55,28-34.

145. Franchini, A., Ottaviani, E. 2000 Repair of molluscan tissue injury: role of PDGF and TGF-p. Tissue Cell,32,312-321.

146. Fretter, V. 1980 Observation on the gross anatomy of the female genital duct of British Littorina spp. J

147. Mollusc Stud, 46, 148-153.

148. Friebel, B., Renwrantz, L. 1995 Application of density gradient centrifugation for separation of eosinofilicand basophilic hemocytes from Mytilus edulis and characterization of both cell groups. Comp Biochem Physiol A, 112,81-90.

149. Fryer, S. E., Bayne, C. J. 1990 Schistosoma mansoni modulation of phagocytosis in Biomphalaria glabrata. J1. Parasitol, 76,45-52.

150. Fryer, S. E., Bayne, C. J. 1996a Host-parasite interactions in molluscs. Prog Mol Subcell Biol, 15, 131-153.

151. Fryer, S. E., Hull, C. J., Bayne, C. J. 1989 Phagocytosis of yeast by Biomphalaria glabrata: carbohydratespecificity of hemocyte receptors and a plasma opsonin. Dev Comp Immunol, 13, 9-16.

152. Fryer, S.E., Bayne, C.J. 1996b Phagocytosis of latex beads by Biomphalaria glabrata hemocytes is modulatedin a strain-specific manner by adsorbed plasma components. Dev Comp Immunol, 20,23-37.

153. Gibson, D.I., Bray, R.A. 1994 The evolutionary expansion and host-parasite relationships of the Digenea. Int

154. J Parasitol, 24,1213-1226.

155. Gorbushin A. M., Shaposhnikowa T. G. 2002 In vitro culture of the avian echinostome Himasthla elongata:from redia to marita. Exp Parasitol, 101,234-239.

156. Gourdon, I., Guerin, M.C., Torreilles, J., Roch, P. 2001 Nitric oxide generation by hemocytes of the mussel

157. Mytilus galloprovincialis. Nitric Oxide Biol Chem, 5, 1-6.

158. Granath, W. O., Yoshino, T. P. 1984 Schistosoma mansoni: passive transfer of resistance by serum in thevector snail Biomphalaria glabrata. Exp Parasitol, 58,188-193.

159. Granath, W.O. Jr, Spray, F.J. 1987 Analysis ofthe interacting components between larval Schistosomamansoni and schistosome-susceptible and resistant Biomphalaria glabrata. Mem Inst Oswaldo Cruz, 82 Suppl 4, 229-330.

160. Granath, W.O. Jr., Yoshino, T.P. 1983b Lysosomal enzyme activities in susceptible and refractory strains of

161. Haberl, B., Kalbe, M., Fuchs, H., Strobel, M., Schmalfuss, G., Haas, W. 1995 Schistosoma mansoni and S.haematobium-, miracidial host-finding behaviour is stimulated by macromolecules. Int J Parasitol, 25, 551-560.

162. Haberl, B., Korner, M., Spengler, Y., Hertel, J., Kalbe, M., Haas, W. 2000 Host-finding in Echinostomacaproni: miracidia and cercariae use different signals to identify the same snail species. Parasitology, 120,479-486.

163. Hahn, U., Bender, R.C., Bayne, C.J. 2000 Production of reactive oxygene species by hemocytes of

164. Biomphalaria glabrata: carbohydrate-specific stimulation. Dev Comp Immunol, 24, 531-541.

165. Hahn, U., Bender, R.C., Bayne, C.J. 2001a Killing of Schistosoma mansoni sporocysts by hemocytes fromresistant Biomphalaria glabrata: role of reactive oxygen species. J Parasitol, 87,292-299.

166. Hahn, U. K., Bender, R. C., Bayne, C. J. 2001b Involvement of nitric oxide in killing of Schistosomamansoni sporocysts by hemocytes from resistant Biomphalaria glabrata. J Parasitol, 87, 778-785.

167. Harm, H., Renwrantz, L. 1980 The inhibition of serum opsonins by a carbohydrate and the opsonizing effectof purified agglutinin on the clearance of nonself particles from the circulation of Helix pomatia. J Invertebr Pathol 36, 64-70.

168. Harper, D.M., Flessas, D.A., Reinisch, C.L. 1994 Specific reactivity of leukemia cells to polyclonal anti-PCBantibodies. J Invertebr Pathol, 64,234-237.

169. Harris, K.R., Cheng, T.C. 1975 The encapsulation process in Biomphalaria glabrata experimentally infectedwith metastrongylid Angiostrongylus cantonensis: enzyme histochemistry. J Invertebr Pathol, 26, 367374.

170. Haszprunar,G. 1996 The molluscan rhodocyte (pore-cell, blasenzelle, cellule nucale), and its significance forideas on nephridial evolution. J Moll Stud, 62, 185-211.

171. Hawkins, W.E., Howse, H.D. 1982 Ultrastructure of cardiac hemocytes and related cells in the oyster

172. Crassostrea virginica. Trans Amer Microsc Soc, 101,241-252.

173. Herskovits T.T., Hamilton, M.G 1991 Higher order assemblies of molluscan hemocyanins. Comp Biochem1. Physiol B, 99,19-34.

174. Herskovits, T.T., Guzman, A.E., Hamilton, M.G. 1989 The haemocyanin of the whelk, Busycon contrarium

175. Conrad): aggregation states and subunit structure. Comp Biochem Physiol B., 92, 181-187.

176. Herskovits, T.T., Mazzella, L.J., Villanueva, G.B. 1985 Light-scattering investigation of the dissociationbehavior of Lunatia heros and Littorina littorea hemocyanins. Biochemistry, 24, 3 862-3 870.

177. Herskovits, T.T., Zou, J., Hamilton, M.G. 1992 Physical studies of the hemocyanin of the marine gastropod,

178. Kelletia kelleti (Forbes). Comp Biochem Physiol B, 103,447-453.

179. Hertel, L.A., Adema, C.M., Loker, E.S. 2005 Differential expression of FREP genes in two strains of

180. Biomphalaria glabrata following exposure to the digenetic trematodes Schistosoma mansoni and Echinostomaparaensei. Dev Comp Immunol, 29,295-303.

181. Hertel, L.A., Strieker, S.A., Loker, E.S. 2000 Calcium dynamics of hemocytes ofthe gastropod Biomphalariaglabrata: effects of digenetic trematodes and selected bioactive compounds. Invertebr Biol, 119,27-37.

182. Hertel, L.A., Strieker, S.A., Monroy, F.P., Wilson, W.D., Loker, E.S. 1994 Biomphalaria glabratahemolymph lectins: binding to bacteria, mammalian erythrocytes, and to sporocysts and rediae of Echinostoma paraensei. J Invertebr Pathol, 64,52-61.

183. Hine, P.M. 1999 The inter-relationships of bivalve haemocytes. Fish Shell Immunol, 9, 367-385.

184. Hoek, R.M., Smit, A.B., Frings, H., Vink, J.M., de Jong-Brink, M., Geraerts, W.P. 1996 A new Igsuperfamily member, molluscan defense molecule (MDM) from Lymnaea stagnalis is down-regulated during parasitosis. Eur J Immunol, 26, 939-944.

185. Horak, P. 1995 Developmentally regulated expression of surface carbohydrate residues on larval stages oftheavian schistosome Trichobilharzia szidati. Fol Parasitol, 42,255-265.

186. Horak, P., Deme, R. 1997 Dual recognition system of Lymnaea stagnalis hemocytes. Dev Comp Immunol,21,231.

187. Horak, P., Kovar, L., Kolarova, L., Nebesarova, J. 1998 Cercaria-schistosomulum surface transformation of

188. Trichobilharzia szidati and its putative immunological impact. Parasitology, 116,139-147.

189. Horak, P., Van der Knaap, W. P. W. 1997 Lectins in snail-trematode interactions: a review. Fol Parasitol, 44,161.172.

190. House, M.L., Kim, C.H., Reno, P.W. 1998 Soft shell clams Mya arenaria with disseminated neoplasiademonstrate reverse transcriptase activity. Dis Aquat Organ, 34, 187-192.

191. Hubert F., Cooper E.L., Roch P. 1997 Structure and differential target sensitivity of the stimulable cytotoxiccomplex from hemolymph of the Mediterranean mussel Mytilus galloprovincialis. Biochim Biophys Acta, 1361,29-41.

192. Hubert, F., Noël, T., Roch, P. 1996 A member of the arthropod defensin family from edible Mediterraneanmussel (.Mytilus galloprovincialis). Eur J Biochem, 240, 302-306.

193. Huehner, M., Etges, F. 1981 Encapsulation of Aspidogaster conchicola (Trematoda, Aspidogastrea) byunionid mussels. J Invertebr Pathol, 37, 123-128.

194. Huffman, J.E., Tripp, M.R. 1982 Cell types and hydrolytic enzymes of soft shell clam (.Mya arenaria)hemocytes. J Invertebr Pathol, 40, 68-74.

195. Hughes, T. K., Jr, Smith, E. M., Chin, R., Cadet, P., Sinisterra, J., Leung, M. K., Shipp, M. A., Scharrer, B.,

196. Stefano, G. B. 1990 Interaction of immunoactive monokines (interleukin-1 and tumor necrosis factor) in the bivalve mollusc Mytilus edulis. Proc Natl Acad Sci USA, 87, 4426-4429.

197. Hughes, T. K., Smith, E. M., Leung, M. K., Stefano, G. B. 1992 Immunoactive cytokines in Mytilus edulisnervous and immune interactions. Acta Biol Hung, 43,269-273.

198. Hughes, T.K., Jr, Smith, E.M., Bamett, J.A., Charles, R., Stefano, G.B. 1991 Lipopolysaccharide and opioidsactivate distinct populations of Mytilus edulis immunocytes. Cell Tissue Res, 264, 317-320.

199. Humbert, E., Coustau, C. 2001 Refractoriness of host haemocytes to parasite immunosuppressive factors as aputative resistance mechanism in the Biomphalaria glabrata- Echinostoma caproni system. Parasitology, 122,651-660.

200. Iijima, R., Kisugi, J., Yamazaki, M. 2003 L-amino acid oxidase activity of an antineoplastic factor of amarine mollusk and its relationship to cytotoxicity. DevComp Immunol 27, 505-512.

201. Imase, A., Kobayashi, K., Ohmae, H., Matsuda, H., Iwamura, Y. 2001 Horizontal and vertical transmission ofmouse class IMHC sequence in Schistosoma mansoni. Parasitology, 123, 163-168.

202. Imase, A., Kumagai, T., Ohmae, H., Irie, Y., Iwamura, Y. 1999 Localization of mouse type 2 Alu sequence inschistosomes. Parasitology, 119, 315-321.

203. Imase, A., Matsuda, H., Irie, Y., Iwamura, Y. 2003 Existence of host DNA sequences in schistosomes-horizontal and vertical transmission. Parasitol Int, 52, 369-373.

204. Jacklet, J. W. 1997 Nitric oxide signaling in invertebrates. Invertebr Neurosci, 3, 1-14.

205. James, B.L. 1965 The effect of parasitism by larval Digenea on the digestive gland of the intertidalprosobranchLittorina saxatilis (Olivi) subsp. tenebrosa (Montagu). Parasitology 55, 93-115.

206. Jenkin, C.R., Rowley, D. 1970 The purification of a hemagglutinin to rat and rabbit erythrocytes from thehemolymph of the murray mussel ( Velesunio ambiguous). Aust J Exp Biol Med Sci, 47, 125-134.

207. Jeong, K. H., Sussman, S., Rosen, S. D., Lie, K. J., Heyneman, D. 1981 Distribution and variation ofhemagglutinating activity in the hemolymph of Biomphalaria glabrata. J Invertebr Pathol, 38, 256-263.

208. Jeong, K.H., Heyneman, D. 1976 Leukocytes of Biomphalaria glabrata: morphology and behavior ofgranulocytic cells in vitro. J Invertebr Pathol, 28,357-362.

209. Jeong, K.H., Lie, K.J., Heyneman, D. 1980 Leucocytosis in Biomphalaria glabrata sensitized andresensitized to Echinostoma lindoense. J Invertebr Pathol, 35,9-13.

210. Johnston, L. A., Yoshino, T. P. 2001 Larval Schistosoma mansoni excretory-secretory glycoproteins (ESPs)bind to hemocytes of Biomphalaria glabrata (Gastropoda) via surface carbohydrate binding receptors. J Parasitol, 87,786-793.

211. Johnston, L.A., Yoshino, T.P. 1996 Analysis of lectin- and snail plasma-binding glycoproteins associatedwith the tegumental surface of the primary sporocysts of Schistosoma mansoni. Parasitology, 112,469479.

212. Joky, A., Matricon-Gondran, M., Benex, J. 1985 Response to the amoebocyte-producing organ of sensitized

213. Biomphalaria glabrata after exposure to Echinostoma caproni miracidia. J Invertebr Pathol, 45,22-33.

214. Jourdane, J., Cheng, T.C. 1987 The two-phase recognition process of allografts in a brazilian strain of

215. Biomphalaria glabrata. J Invertebr Pathol., 49,145-158.

216. Kaestner A, 1993 in Lehrbuch der speziellen Zoologie, Jena, Stuttgart, New York, G.Fisher; Teil 4; s.1279.

217. Karre K. 1995 Express yourself or die: peptides, MHC molecules and NK-cells. Science, 267, 978.

218. Kechemir, N., Combes, C. 1982 Développement du trematode Schistosoma haematobium aprèstransplantation microchirurgicale chez le gastropode Planorbarius metidjensis. C.R. Acad Sci Paris, 295, 505.

219. Kent, M.L., Elston, R.A., Wilkinson, M.T., Drum, A.S. 1989 Impaired defense mechanisms in bay mussels,

220. Mytilus edulis, with hemic neoplasia. J Invertebr Pathol, 53,378-386.

221. Knight, M., Ongele, E., Lewis, F. A. 2000 Molecular studies of Biomphalaria glabrata, an intermediate hostof Schistosoma mansoni. Int J Parasitai, 30, 535-541.

222. Kobayashi, T., Robinson, J.M., Seguchi, H. 1998 Identification of intracellular sites of superoxide productionin stimulated neutrophils. J Cell Sci, 111,81-91.

223. Krupa, P.L., Lewis, L.M., Vecchio, P.D. 1977 Schistosoma haematobium in Bulinus guernei: electronmicroscopy of hemocyte-sporocyst interactions. J Invertebr Pathol, 30, 35-45.

224. Kurachi, S., Song, Z., Takagaki, M., Yang, Q., Winter, H.C., Kurachi, K., Goldstein, I.J. 1998 Sialic acidbinding lectin from the slug Limax flavus: cloning, expression of the polypeptide, and tissue location. Eur J Biochem, 253,217-222.

225. Laemmli U.K. 1970 Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.1. Nature, 227, 680-685.

226. Langand, J., Jourdane, J., Coustau, C., Delay, B., Morand, S. 1998 Cost of resistance, expressed as a delayedmaturity, detected in the host-parasite system Biomphalaria glabrata! Echinostoma caproni. Heredity, 80,320-325.

227. Laurensen, J.R., Yoshino, T.P. 1999 Biomphalaria glabrata embryonic (Bge) cell line supports in vitromiracidial transformation and early larval development of the deer liver fluke, Fascioloides magna. Parasitology, 118, 187-194.

228. Lemaitre, B., Reichhart, J.M., Hoffmann, J.A. 1997 Drosophila host defense: differential induction ofantimicrobial peptide genes after infection by various classes of microorganisms. Proc Natl Acad Sci U S A, 94,14614-14619.

229. Lie, K. J., Heyneman, D., Richards, C. S. 1977 Studies on resistance in snails: interference by nonirradiatedechinostome larvae with natural resistance to Schistosoma mansoni in Biomphalaria glabrata. J Invertebr Pathol, 29, 118-125.

230. Lie, K.J., Heyneman, D., Yan, P. 1975 The origin of amoebocytes in Biomphalaria glabrata. J Parasitai 63,574.576.

231. Lie, M.F., Flemming, C. 1967 Hemagglutinins from oyster hemolymph. Can J Zool, 45, 1225-1234.

232. Liu, W.S., Heckman, C.A. 1998 The sevenfold way of PKC regulation. Cell Signalling, 10, 529-542.

233. Lodes, M. J., Yoshino, T.P. 1990 The effect of schistosome excretory-secretory products on Biomphalariaglabrata hemocyte motility. J Invertebr Pathol, 56, 75-85.

234. Loker, E. S., Bayne, C. J., Yui, M. A. 1986 Echinostoma paraensei: hemocytes of Biomphalaria glabrata astargets of echinostome mediated interference with host snail resistance to Schistosoma mansoni. Exp Parasitai, 62,149-154.

235. Loker, E. S., Couch, L., Hertel, L. A. 1994 Elevated agglutination titres in plasma of Biomphalaria glabrataexposed to Echinostoma paraensei: characterization and functional relevance of a trematode-induced response. Parasitology, 108,17-26.

236. Loker, E. S., Hertel L. A. 1987 Alterations in Biomphalaria glabrata plasma induced by infection with thedigenetic trematode Echinostoma paraensei. J Parasitai 73, 503-573.

237. Loker, E.S. 1994 On being a parasite in an invertebrate host: a short survival course. J Parasitai, 80, 728-747.

238. Loker, E.S., Bayne, C.J. 1982 In vitro encounters between Schistosoma mansoni primary sporocysts andhemolymph components of susceptible and resistant strains of Biomphalaria glabrata. Am J Trop Med Hyg, 31, 999-1005.

239. Loker, E.S., Bayne, C.J., Buckley, P.M., Kruse, K.T. 1982. Ultrastructure of encapsulation of Shistosomamansoni mother sporocysts by hemocytes of juveniles of the 10R2 strain of Biomphalaria glabrata. J Parasitai, 68, 84-94.

240. Loker, E.S., Cimino, D.F., Hertel, L.A. 1992 Excretory-secretory products of Echinostoma paraenseisporocysts mediate interference with Biomphalaria glabrata hemocyte functions. J Parasitai, 78, 104115.

241. Loker, E.S., Cimino, D.F., Stryker, G.A., Hertel, L.A. 1987 The effect of size of M line Biomphalariaglabrata on the course of development of Echinostoma paraensei. J Parasitai, 73, 1090-1098.

242. Loker, E.S., Coustau, C., Ataev, G.L., Jourdane, J., 1999 In vitroculture of rediae of Echinostoma caproni.1. Parasite 6, 169-174.

243. L6pez, C., Carballal, M. J., Azevedo, C., Villalba, A. 1997 Morphological characterization of the hemocytesof the clam Ruditapes decussatus (Molluska, Bivalvia). J Invertebr Pathol, 69, 51-57.

244. Lopez, C., Carballal, M.J., Azevedo, C., Villalba, A. 1997 Enzyme characterization of the circulatinghemocytes of the carpet shell clam, Ruditapes decussatus (Mollusca: Bivalvia). Fish Shellfish Immunol, 7, 595-608.

245. Lopez, C., Villalba, A., Bachere, E. 1994 Absence of generation of active oxygen radicals coupled with A phagocytosis by the hemocytes of the clam, Ruditapes decussatus (Mollusca: Bivalvia). J Invertebr 'N1 Pathol, 64,188-192.

246. Loukas, A., Maizels, R.M. 2000 Helminth C-type lectins and host-parasite interactions Parasitol Today, 16,333.339.

247. Marsh, M. E. 1990 Immunocytochemical localization of a calcium-binding phosphoprotein in hemocytes ofheterodont bivalves. J Exp Zool, 253, 280-286.

248. Matricon-Gondran, M., Letocart, M. 1999a Internal defenses of the snail Biomphalaria glabrata. I

249. Characterization of hemocytes and fixed phagocytes. J Invertebr Pathol, 74,224-234.

250. Matricon-Gondran, M., Letocart, M. 1999b Internal defenses of the snail Biomphalaria glabarata. Ill

251. Observations on tubular helical filaments induced in the hemolymph by foreign material. J Invertebr Pathol, 74,248-254.

252. Matricon-Gondran, M., Letocart, M. 1999c Internal defenses of the snail Biomphalaria glabrata. II. Defensecells have different phagocytic responses to various injected foreign materials. J Invertebr Pathol, 74, 235-247.

253. McCarthy, A.M. 1990 Speciation of echinostomes: evidence for the existence of two sympatric siblingspecies in the complex Echinoparyphium recurvatum (von Linstow, 1873) (Digenea: Echinostomatidae). Parasitology, 101, 35-42. ,

254. McCormick-Ray, M.G., Howard, T. 1991. Morphology and mobility of oyster hemocytes: evidence forseasonal variations. J Invertebr Pathol 58,219-230.

255. McDade, J., Tripp, M.R. 1967 Mechanisms of agglutination of red blood cells by oyster hemolymph. J1.vertebr Pathol, 9, 523-530.

256. McKay, D., Jenkin, C. R, Rowley, D. 1969 Immunity in invertebrates. I. Studies on the naturally occurring £ haemagglutinins in the fluid from invertebrates. Aust J Exp Biol Med Sci, 47,125-134.

257. Michelson, E. H., Dubois, L. 1977 Agglutinins and lysins in the molluscan family Planorbidae: a survey ofhemolymph, egg-masses, and albumen-gland extracts. Biol Bull, 153,219-227.

258. Mitta, G., Galiner, R., Tisseyre, P., Allienne, J.F., Girerd-Chambaz, Y., Guillou, F., Bouchut, A., Coustau, C.2005 Gene discovery and expression analysis of immune-relevant genes from Biomphalaria glabrata hemocytes. Dev Comp Immunol, 29, 393-407.

259. Mitta, G., Vandenbulcke, F., Hubert, F., Roch, Ph. 1999a Mussel defensins are synthesized and processed ingranulocytes the released into plasma after bacterial challenge. J Cell Sci, 112,4233-4242.

260. Mitta, G., Hubert, F., Noel, T., Roch, Ph. 1999b Myticin, a novel cystein-rich antimicrobial peptide isolatedfrom hemocytes and plasma of the mussel Mytilus galloprovincialis. Eur J Biochem, 265, 71-78.

261. Mitta, G., Vandenbulcke, F., Noel, T., Romenstand, B., Beauvillan, J. C., Salzet, M., Roch, Ph. 2000a

262. Differential distribution and defence involvement of antimicrobial peptides in mussel. J Cell Sci, 113, 2759-2769.

263. Mitta, G., Vandenbulcke, F., Hubert, F., Salzet, M., Roch, Ph. 2000b Involvement of mytilins in musselantimicrobial defense. J Biol Chem, 25, 12954-12962.

264. Monroy, F., Hertel, L.A., Loker, E.S. 1992 Carbohydrate-binding plasma proteins from the gastropod

265. Biomphalaria glabrata: strain specificity and the effects oftrematode infection. Dev Comp Immunol, 16, 355-366.

266. Monteil, J. F., Matricon-Gondran, M. 1991 Interactions between the snail Lymnaea stagnalis and theplagiorchiid trematode Haplometra cylindracea. J Invertebr Pathol, 58,127-135.

267. Monti, D., Salvioli, S., Cossarizza, A., Franceschi, C., Ottaviani, E. 1992 Cytotoxicity and cell death: studieson molluscan cells and evolutionary consideration. Acta Biol Hung, 43,287-291.

268. Moore, J.D., Elston, RA., Drum, A.S., Wilkinson, M.T. 1991 Alternate pathogenesis of systemic neoplasia inthe bivalve mollusc Mytilus. J Invertebr Pathol, 58,231-243.

269. Moore, M.N., Lowe, D.M. 1977 The cytology and cytochemistry of the hemocytes of Mytilus edulis and theirresponses to experimentally injected carbon particles. J Invertebr Pathol, 29, 18-30.

270. Mounkassa, J. B., Jourdane, J. 1990 Dynamics of the leukocytic response of Biompharia glabrata during thelarval development of Schistosoma mansoni and Echinostoma liei. J Invertebr Pathol, 55, 306-311.

271. Mounkassa, J.B., Jourdane, J. 1990 Dynamics of the leukocytic response of Biomphalaria glabrata during thelarval development of Schistosoma mansoni and Echinostoma liei. J Invertebr Pathol, 55, 306-311.

272. Mount, A.S, Wheeler, A.P., Paradkar, R.P., Snider, D. 2004 Hemocyte-mediated shell mineralization in theeastern oyster. Science, 304,297-300.

273. Mulholland, D.S., Friedl, F.E. 1994 Cytometric analyses of oyster hemocytes from various body locations. J

274. Shellfish Res, 13,299-300.

275. Mullainadhan, P., Renwrantz, L. 1989 Comparative analysis of agglutinins from hemolymph and albumingland of Helixpomatia. J Comp Physiol B, 159,443-452.

276. Nakayama, K., Nomoto, A.M., Nishijima, M., Maruyama, T. 1997 Morphological and functionalcharacterization of hemocytes in the giant clam Tridacna crocea. J Invertbr Pathol, 69, 105- 111.

277. Nauseef, W.M., Volpp, B.D., McCormick, S., Leidal, K.G., Clark R.A. 1991 Assembly of the neutrophilrespiratory burst oxidase. Protein kinase C promotes cytoskeletal and membrane association of cytosolic oxidase components. J Biol Chem, 266, 5911-5917.

278. Noda, S. 1992 Effects of excretory-secretory products of Echinostoma paraensei larvae on the hematopoieticorgan of M-line Biomphalaria glabrata snails. J Parasitol, 78, 512-517.

279. Noda, S., Loker, E. S. 1989a Effects of infection with Echinostoma paraensei on the circulating haemocytepopulation of the host snail Biomphalaria glabrata. Parasitology, 98, 35-41.

280. Noda, S., Loker, E.S. 1989b Phagocytic activity of hemocytes of M-line Biomphalaria glabrata snails: effectof exposure to the trematode Echinostoma paraensei. J Parasitol, 75,261-269.

281. Nunez, P.E., Adema, C.M., De Jong- Brink, M. 1994 Modulation of the bacterial clearance activity ofhaemocytes from the freshwater mollusc, Lymnaea stagnalis, by the avian schistosome Trichobilharzia ocellata. Parasitology, 109,299-310.

282. Nunez, P.E., de Jong-Brink, M. 1997 The suppressive excretory-secretory product of Trichobilharziaocellata: a possible factor for determining compatibility in parasite-host interactions. Parasitology, 115, 193-203.

283. Olafsen, J. A. 1988 Role of lectins in invertebrate humoral defense. Amer Fish Soc Sp Publ, 18, 189-205.

284. Osman, A.M., Gomaa, M., Saad, A.H. 2003 Biomphalaria alexandrina: cellular responses of susceptible andresistant snails to Schistosoma mansoni infection. J Egypt Soc Parasitol, 33, 805-827.

285. Otsuka-Fuchino, H., Watanabe, Y., Hirakava, C., Tamyia, T., Matsumoto, J. J., Tsuchiya, T. 1992

286. Bactericidal action of a glycoprotein from the body surface mucus of giant african snail. Comp Biochem Physiol, 101C, 607-613.

287. Ottaviani E., Franceschi, C. 1996 The neuroimmunology of stress from invertebrates to man, 48,421-440.

288. Ottaviani, E. 1988 Surface markers on the haemocytes of the freshwater snail Planorbarius corneus (L.)

289. Gastropoda, Pulmonata). Acta Zool (Stokcholm) 69, 121-124.

290. Ottaviani, E. 1989 Haemocytes of the freshwater snail Viviparus ater (Gastropoda, Prosobranchia). J Moll1. Stud 55, 379-382.

291. Ottaviani, E. 1992 Presence of a memory-type response in the freshwater snail Planorbarius corneus (L.)

292. Gastropoda, Pulmonata). Zool Jb Physiol, 96,291-298.

293. Ottaviani, E., Caselgrandi, E., Fontanili, P., Franceschi, C. 1992 Evolution, immune responses and stress:studies on molluscan cells. Acta Biol Hung, 43,293-298.

294. Ottaviani, E., Caselgrandi, E., Kletsas, D. 1998 The CRH-ACTH-biogenic amine axis in invertebrateimmunocytes activated by PDGF and TGF-beta. FEBS Lett, 427,255-258.

295. Ottaviani, E., Cossarizza, A. 1990 Immunocytochemical evidence of vertebrate bioactive peptide-likemolecules in the immuno cell types of the freshwater snail Planorbarius corneus (L.) (Gastropoda, Pulmonata). FEBS Lett, 267,2510-2512.

296. Ottaviani, E., Franchini, A. 1995 Immune and neuroendocrine responses in molluscs: the role of cytokines.

297. Acta Biol Hung; 46, 341-349.

298. Ottaviani, E., Franchini, A., Caselgrandi, E., Cossarizza, A. 1994 Relationship between corticotropinreleasing factor and interleukin-2: evolutionary evidence. FEBS Lett, 351, 19-21.

299. Ottaviani, E., Malagoli, D., Franchini, A. 2003 Invertebrate humoral factors: cytokines as mediators of cellsurvival. Prog Mol Subcell Biol, 34, 1-25.1. B'

300. Ottaviani, E., Petraglia, F., Montagnani, G., Cossarizza, A., Monti, D., Franceschi, C. 1990 Presence of

301. ACTH and ß-endorphin immunoreactive molecules in the freshwater snail Planorbarius corneus (L.) (Gastropoda, Pulmonata) and their possible role in phagocytosis. Regul Pept, 21,1-9.

302. Oubella, L., Paillard, C., Maes, P., Auffret, M. 1994. Changes in hemolymph parameters in the in the manilaclam Ruditapesphillippinarum (Mollusca, Bivalvia) following bacterial challenge. J Invertebr Pathol 64, 33-38.

303. Ouwe-Missi-Oukem-Boyer, O., Porchet, E., Capron, A., Dissous, C. 1994 Characterization ofimmunoreactive TNF alpha molecules in the gastropod Biomphalaria glabrata. Dev Comp Immunol, 18, 211-218.

304. Pampanin, D.M., Marin, M.G., Ballarin, L. 2002a Morphological and cytoenzymatic characterization ofhaemocytes of the venus clam Chamelea gallina. Dis Aquat Org, 49, 227-234.

305. Pampanin, D.M., Ballarin, L., Carotenuto, L., Marin, M. 2002b Air exposure and functionality of Chameleagallina haemocytes: effect on haematocrit, adhesion, phagocytosis and enzyme contents. Comp Biochem Physiology, pt A, 131, 605-614.

306. Panara, F., Di Rosa, I., Fagotti, A., Simoncelli, F., Mangiabene, C., Pipe, R.K., Pascolini, R. 1996

307. Characterization and immunocytochemical localization of actin and fibronectin in haemocytes of the mussel Mytilus galloprovincialis. Histochem J, 28, 123-131.

308. Pauley, G.B., Krassner, S.M., Chapman, F.A. 1971a Bactereal clearance in the California sea hare Aplysiacalifornica. J Invertebr Pathol, 18,227-239.

309. Pauley, G.B., Granger, G.A., Krassner, S.M. 1971b Characterization of a natural agglutinin present in thehemolymph of the California sea hare, Aplysia californica. J Invertebr Pathol, 18,207-218.

310. Pauley, G.B., Heaton L.H. 1969 Experimental wound repair in the freshwater mussel Anodonta oregonensis.

311. J Invertbr Pathol, 13,241-249.

312. Pipe, R. K. 1990 Differential binding of lectins to haemocytes of the mussel Mytilus edulis. Cell Tissue Res,261,261-268.

313. Pipe, R. K., Farley, S. K., Coles, J. A. 1997 The separation and characterization of hemocytes from themussel Mytilus edulis. Cell Tissue Res, 289, 537-545.

314. Rasmussen, K. R, Hillyer, G. V., Kemp, W. M. 1985 Isolation and partial characterization of an antigenshared between Schistosoma mansoni, Fasciola hepatica, and Biomphalaria glabrata. J Parasitol, 71, 792-798.

315. Rasmussen, L. P. D., Hage, E., Karlog, O. 1985 An electron microscope study of circulating leukocytes of themarine mussel Mytilus edulis. J Invertebr Pathol, 45, 158-167.

316. Reade, P., Reade, E. 1976 Phagocytosis in invertebrates: studies of the hemocytes of the clam Tridacnamaxima. J Invertebr Pathol, 28, 281-290.

317. Reno, P.W., House, M., Illingworth, A. 1994 Flow cytometric and chromosome analysis of softshell clam,

318. Mya arenaria, with disseminated neoplasia. J Invertebr Pathol, 64, 163-172.

319. Renwrantz, L. 1979 Eine Untersuchung molekularer und zellularer Bestandteile der Hamolymphe von Helixpomatia unter besonderer Berücksichtigung immunobiologisch aktiver Komponenten. Zool Jb Physiol, 83, 283-333.

320. Renwrantz, L., Mohr, W. 1978 Opsonizing effect of serum and albumin gland extracts on the elimination ofhuman erythrocytes from the circulation of Helix pomatia. J Invertebr Pathol, 31, 164-170.

321. Renwrantz, L., Schancke, W., Harm,H., Liebsch, H., Gerken, I. 1981 Discriminative ability and function ofthe immunobiological recognition system of the snail Helix pomatia. J Comp Physiol, 141,477-488.

322. Renwrantz, L., Yoshino, T.P., Cheng, T., Auld, K. 1979 Size determination of hemocytes from the Americanoysters, Crassostrea virginica, and the description of a phagocytosis mechanism. Zool Jb Physiol, 83, 112.

323. Richards, C.S., Shade, P.C. 1987 The genetic variation of compatibility in Biomphalaria glabrata and

324. Schistosoma mansoni. J Parasitol, 73,1146-1151.

325. Riley, E. M., Chappel, L. H. 1992 Effect of infection with Diplostomum spathaceum on the internal defensesystem of Lymnaea stagnalis. J Invertebr Pathol 59, 190-196.

326. Rinkevich, B. 1999 Cell cultures from marine invertebrates: obstacles, new approaches and recentimprovements. J Biotechnol, 70, 133-153.

327. Robledo, J.A.F., Caceres-Martinez, J., Sluys, R., Figueras, A. 1994 The parasitic turbellarian Urastomacyprinae (Plathyhelminthes: Urastomidae) from blue mussel Mytilus galloprovincialis in Spain: occurrence and pathology. Dis Aquat Org, 18,203-210.

328. Roch, Ph. 1999 Defense mechanisms and disease prevention in farmed marine invertebrates. Aquaculture,172,125-145.

329. Roder, J. C., Bourns, T. K., Singhai, S. K. 1977 Trichobilharzia ocellata: cercariae masked by antigens of thesnail, Lymnaea stagnalis. Exp Parasitol, 41,206-212.

330. Rondelaud, D., Barthe, D. 1981 The development of amoebocyte-producing organ in Lymnaea truncatula

331. Muller infected by Fasciola hepatica. Z. Parasitenkd. 65, 331-341.

332. Ruddell, C.L., 1971a The fine structure of oyster agranular amebocytes from regenerating mantle wounds inthe Pacific oyster, Crassostrea gigas. J Invertebr Pathol, 18,260-268.

333. Ruddell, C.L., 1971b The fine structure of the granular amebocytes of the Pacific oyster, Crassostrea gigas. J.1.vertebr. Pathol, 18,269-275.

334. Rudolph, P. H. 1973 The occurrence of hemagglutinins in some basommatophora and stylommatophora.1. Malacol Rev, 6,48-49.

335. Russo, J., Lagadic, L. 2000 Effects of parasitism and pesticide exposure on characteristics and functions ofhemocyte populations in the freshwater snail Lymnaea palustris (Gastropoda, Pulmonata). Cell Biol.Toxicol 16,15-30.

336. Salzet, M., Capron, A., Stefano, G.B. 2000 Molecular crosstalk in host-parasite relationships: schistosomeand leech-host interactions. Parasitol Today, 16, 536-540.

337. Santarem, M.M., Robledo, J.A.F., Figueras, A. 1994 Seasonal changes in hemocytes and serum defensefactors in the blue mussel Mytilus galloprovincialis. Dis Aquat Org, 18,217-222.

338. Sapp, K. K., Loker, E. S. 2000 A comparative study of mechanisms underlying digenean-snail specificity: invitro interactions between hemocytes and digenean larvae. J Parasitol, 86,1020-1029.

339. Schmidt, J. 1995 Glycans with N-acetyllactosamine type 2-like residues covering adult Schistosoma mansoni,and glycomimesis as a putative mechanism of immune evasion. Parasitology, 111, 325-336.

340. Schnitzler, S., 1982 Histamine release from rat mast cells induced by the lectin from the snail, Cepaeanemoralis L. a counterpart to the triggering action of polycations? Acta Histochem, 71,43-45.

341. Scott, M.E., Rau, M.E., McLaughlin, J.D. 1982 A comparision of aspects of the biology of two subspecies of

342. Typhlocoelum cucumerinum (Digenea, Cyclocoelidae) in three families of snails (Physidae, Lymnaeidae, Planorbidae). Int J Parasitol, 12, 123-133.

343. Seiler, G.R., Morse, M.P. 1988 Kidney and hemocytes of Mya arenaria (Bivalvia): normal and pollutionrelated ultrastructural morphologies. J Invertebr Pathol, 52,201-214.

344. Sen, G., Manda,l C. 1995 The specificity of the binding site of Achatinin H, a sialic acid-binding lectin from

345. Achatina fulica. Carbohydr Res, 268, 115-125.

346. Sinha, D., Mandal, C., Bhattacharya, D. K. 1999 Identefication of 9-0 acetyl sialoglycoconjugates (9

347. OacSGs) as biomarkers in childhood acute lymphoblastic leukemia using a lectin, AchatininH, as a probe. Leukemia, 13, 119-125.

348. Sminia, T. 1972 Structure and function of blood and connective tissue cells of the freshwater pulmonate snail1.mnaea stagnalis studied by electron microscopy and enzyme histochemistry. Z Zellforsch 130, 497526.

349. Sminia, T., 1974 Haematopoiesis in the freshwater snail Lymnaea stagnalis studied by electron microscopyand autoradiography. Cell Tissue Res, 150,443-454.

350. Sminia, T., Barendsen, L.H. 1980 A comparative morphological and enzyme histochemical study on bloodcells of the freshwater snails Lymnaea stagnalis, Biomphalaria glabrata and Bulinus truncatus. J Morphol, 165,31-39.

351. Sminia, T., Borghart Reinders, E., van de Linde, A.W. 1974 Encapsulation of foreign materialsexperimentally introduced into the freshwater snail Lymnaea stagnalis. An electron microscopic and autoradiographic study. Cell Tissue Res, 153, 307-326.

352. Sminia, T., van der Knaap, W.P., Kroese, F.G. 1979 Fixed phagocytes in the freshwater snail Lymnaeastagnalis. Cell Tissue Res, 196, 545-548.

353. Sminia, T., Van der Knaap, W.P.W., Van Asselt, L.A. 1983 Blood cell types and blood cell formation ingastropod molluscs. Dev Comp Immunol, 7, 665-668.

354. Smit, A.B., De Jong-Brink, M., Li, K.W., Sassen, M.M., Spijker, S., Van Elk, R., Buijs, S., Van Minnen, J.,

355. Van Kesteren, R.E. 2004 Granularin, a novel molluscan opsonin comprising a single vWF type C domain is up-regulated during parasitation. FASEB J, 18, 845-847.

356. Smolowitz R.M., Miosky D., Reinisch C.L. 1989 Ontogeny of leukemic cells of the soft shell clam. J1.vertebr Pathol. 53,41-51'.

357. Soares-da-Silva, I.M., Ribeiro, J., Valongo, C., Pinto, R., Vilanova, M., Bleher, R., Machado, J. 2002

358. Cytometric, morphologic and enzymatic characterization of haemocytes of Anodonta cygnea. Comp Biochem Physiol, pt A, 132, 541-553.

359. Southgate, V.R., Brown, D.S., Warlow, A., Knowles, R.J., Jones, A. 1989 The influence of Calicophoronmicrobothium on the susceptibility Bulinus tropicus to Schistosoma bovis. Parasitol Res, 75, 225-229.

360. Sparks, A. K., Morado, J. F. 1988 Inflammation and wound repair in bivalve molluscs. Amer Fish Soc Spec1. Publ, 18, 139-152.

361. Stanislavski, E., Renwrantz, L., Becker, W. 1976 Soluble blood group reactive substances in the hemolymphof Biomphalaria glabrata. J Invertebr Pathol, 28,301-308.

362. Stefano, G. B., Leung, M. K., Zhao, X., Scharrer, B. 1989 Evidence for the involvement of opioidneuropeptides in the adherence and migration of immunocompetent invertebrate hemocytes. Proc Natl Acad Sci USA, 86, 626-630.

363. Stein, P. C., Basch, P. F. 1979 Purification and binding properties of hemagglutinin from Biomphalariaglabrata. J Invertebr Pathol,. 33,10-18.

364. Stumpf, J.L., Gilbertson, D.E. 1978 Hemocytes of Biomphalaria glabrata: factors affecting variability. J1.vertebr Pathol, 32, 177-181.

365. Stumpf, J.L., Gilbertson, D.E. 1980 Differential leukocytic responses of Biomphalaria glabrata to infectionwith Schistosoma mansoni. J Invertebr Pathol, 35,217-218.

366. Sullivan, J. T. Galvan, A. G., Lares, R. R. 1998 Comparison of several types of allografts in Biomphalariaglabrata (Mollusca: Pulmonata) J Invertebr Pathol, 71,1-8.

367. Sullivan, J. T., Cheng, T. C., Howland, K. H. 1984 Mitotic response of the anterior pericardial wall of

368. Biomphalaria glabrata (Mollusca), subjected to challenge. J Invertebr Pathol, 44, 114-116.

369. Sullivan, J. T., Spence, J. V., 1994 Transfer of resistance to Schistosoma mansoni in Biomphalaria glabrataby allografts of amoebocyte-producing organ. J Parasitol, 80,449-453.

370. Sullivan, J.T., Spence, J.V. 1999 Factors affecting adoptive transfer of resistance to Schistosoma mansoni inthe snail intermediate host, Biomphalaria glabrata J Parasitol, 85, 1065-1071.

371. Suresh, K., Mohandas, A. 1990a Number and types of hemocytes in Sunetta scripta and Villorita cyprinoidesvar. cochinensis (Bivalvia), and leukocytosis subsequent to bacterial challenge. J Invertebr Pathol, 55, 312-318.

372. Suresh, K., Mohandas, A. 1990b Effect of sublethal concentrations of copper on hemocyte number inbivalves. J Invertebr Pathol, 55, 325-331.

373. Suzuki, T., Mori, K. 1989 A galactose-specific lectin from the hemolymph of the pearl oyster Pinctada fucatamartensii. Comp Biochem Physiol B, 92,455-462.

374. Takamatsu, N., Shiba, T., Muramoto, K., Kamyia, H. 1995 Molecular cloning of the defence factor in thealbumen gland of the sea hare Aplysia kurodai. FEBS Lett, 377, 373-376.

375. Tarry, D.W. 1969 Dicrocoelium dendriticum: the life cycle in Britain. J Helminthol, 43,403-416.

376. Terahara K., Takahashi K. G., Mori K. 2003 Apoptosis by RGD-containing peptides observed in hemocytesof the Pacific oyster, Crassostrea gigas. Dev Comp Immunol, 27, 521-528.

377. Torreilles, J., Guerin, M.C., Roch, Ph. 1997 Peroxidase release associated with phagocytosis in Mytilusgalloprovincialis haemocytes. Dev Comp Immunol, 21,267-275.

378. Tripp, M. R. 1966 Hemagglutinin in the blood of the oyster Crassostrea virginica. J Invertebr Pathol, 8, 478484.

379. Tripp, M. R. 1992a Phagocytosis by hemocytes of the hard clam, Mercenaria mercenaria. J Invertebr Pathol,59,222-227.

380. Tripp, M. R. 1992b Agglutinins in the hemolymph of the hard clam Mercenaria mercenaria. J Invertebr1. Pathol, 59,228-234.

381. Tunkijjanukij S., Mikkelsen H. V., Olafsen J. A. 1997 A heterogeneous sialic acid-binding lectin with affinityfor bacterial LPS from horse mussel (Modiolus modiolus) hemolymph. Comp Biochem Physiol B, 117, 273-286.

382. Tunkijjanukij, S., Olafsen, J. A. 1998 Sialic acid-binding lectin with antibacterial activity from the horsemussel: further characterization and immunolocalization, Dev Comp Immunol, 22, 139-150.

383. Twomey, E., Mulcahy, M. F. 1984 A proliferative disorder of possible hemic origin in the common cockle,

384. Cerastoderma edule. J Invertebr Pathol, 44, 109-111.

385. Uchikawa, R., Loker, E. S. 1991 Lectin-binding properties of the surface of in vitro transformed Schistosomamansoni and Echinostomaparaensei sporocysts. J Parasitol, 77, 742-748.

386. Uchikawa, R., Loker, E.S. 1992 Echinostoma paraensei and Schistosoma mansoni: adherence of unaltered ormodified latex beads to hemocytes of the host snail Biomphalaria glabrata. Exp Parasitol, 75, 223-232.

387. Uhlenbruck, G., Karduck, D., Pearson, R., 1979 Different Tridacnins in different Tridacnid clams: acomparative study. Comp. Biochem. Physiol. B, 63, 125-129.

388. Van Dam G. J., Claas F., Yazdanbakhsh M., Kruize Y. C. M„ van Keulen A. C. I., Falcao Ferreira S. T. M.,

389. Van der Knaap, W.P.W., Boerrigter-Barendsen, L.H., van den Hoeven, D.S.P., Sminia, T. 19811.munocytochemical demonstration of humoral defense factor in blood cells (amoebocytes) of the pond snail, Lymnaea stagnalis. Cell Tissue Res, 219,291-296.

390. Van der Knaap, W.P.W., Doderer, A., Boerrigter-Barendsen, L.H., Sminia, T. 1982 Some properties of anagglutinin in the haemolymph of the pond snail Lymnaea stagnalis. Biol Bull, 162,404-412.

391. Van der Knaap, W.P.W., Meuleman, E.A., Sminia, T. 1987 Alterations in the internal defence system of thepond snail Lymnaea stagnalis induced by infection with the schistosome Trichobilharzia ocellata. Parasitol Res, 73, 57-65.

392. Vasquez, R.E., Sullivan, J.T. 2001a Effect of miracidial dose on adoptively transferred resistance to

393. Schistosoma mansoni in the snail intermediate host, Biomphalaria glabrata. J Parasitol, 87,460-462.

394. Vasquez, R.E., Sullivan, J.T. 2001b Hematopoietic tissue allografts in biomphalaria glabrata (Mollusca:

395. Pulmonata) induce humoral immunity to Schistosoma mansoni. Dev Comp Immunol, 25, 561-564.

396. Vasquez, R.E., Sullivan, J.T. 2001c Further characterization of passively transferred resistance to

397. Schistosoma mansoni in the snail intermediate host Biomphalaria glabrata. J Parasitol, 87, 1360-1365.

398. Vasta, G.R., Sullivan, J.T., Cheng, T.C., Marchalonis, J.J., Warr, G.W. 1982 A cell membrane-associatedlectin of the oyster hemocyte. J Invertebr Pathol, 40, 367-377.

399. Villalba A, Carballal, M.J., Lopez C. 2001 Disseminated neoplasia and large foci indicating heavyhaemocytic infiltration in cockles Cerastoderma edule from Galicia (NW Spain). Dis Aquat Organ, 46, 213-216.

400. Wen, C.M., Kou, G.H., Chen, S.N. 1994 Light and electron microscopy of hemocyte of the hard clam

401. Meretrix lusoria (Roding). Comp Biochem Physiol, 108A, 279-286.

402. Werding, В., 1969. Morphologie, Entwicklung und Ekologie digener Trematoden-Larven der Srandschnecke1.ttorina littorea. Mar Biol, 3,306-333.

403. Weston, D. S., Kemp, W. M. 1993 Schistosoma mansoni comparision of cloned tropomyosin antigensshared between adult parasite and Biomphalaria glabrata. Exp Parasitol, 76,358-370.

404. White, M.K., Miosky, D., Flessas, D.A., Reinisch, C.L. 1993 The expresion of an adhesion-related protein byclam hemocytes. J Invertebr Pathol, 61,253-259.

405. Williams, E.E., Al-Kufaishi, H. 1970 Seasonal variations in probable neurosecretory cells in the ganglia of1.ttorina littorea (L.). J Endocrinol, 48, 68-69.

406. Wittke, M., Renwrantz, L. 1984 Quantification of cytotoxic hemocytes of Mytilus edulis using a cytotoxicityassay in agar. J Invertebr Pathol, 43,248-253.

407. Wolmarans, C.T., Yssel, E. 1990. Use of SEM and lectins to study Bulinus africanus leucocyte groups andtheir in vitro behavior over a time period. J Invertbr Pathol 56, 1-7.

408. Wootton, E.C., Pipe, R.K. 2003 Structural and functional characterization of the blood cells of the bivalvemollusc, Scrobicularia plana. Fish Shellfish Immunol, 15, 249-262.

409. Wuhrer M., Berkefeld C., Dennis R. D., Idris M. A., Geyer R. 2001 The liver flukes Fasciola gigantica and

410. Fasciola hepatica express the leucocyte cluster of differentiation marker CD77 (globotriaosylceramide) in their tegument, Biol Chem, 382, 195-207.

411. Xue, Q., Renault, T. 2001 Monoclonal antibodies to european flat oyster Ostera edulis hemocytes:characterization and tissue distribution of granulocytes in adult and developing animals. Dev Comp Immunol 25, 187-194.

412. Yoshino T. P. 1983 Lectins and antibodies as molecular probes of molluscan hemocyte surface membranes.

413. Dev Comp Immunol, 7,641-644.

414. Yoshino, T. P. 1976 The ultrastructure of circulating hemolymph cells of the marine snail Cerithideacalifornica (Gastropoda, Prosobranchiata) J Morph 150,485-494.

415. Yoshino, T. P., Lodes, M. J. 1988 Secretory protein biosynthesis in snail hemocytes: in vitro modulation bylarval schistosome excretory-secretory products. Parasitology, 74, 538-547.

416. Yoshino, T. P., Tuan, T. L. 1985 Soluble mediators of cytolytic activity in hemocytes of the Asian clam,

417. Corbicula fluminea. Dev Comp Immunol, 9, 515-522.

418. Yoshino, T.P. 1988. Phospholipase C-like activity in phagocytic cells of the asian clam Corbicula fluminea,and its possible role in cell-mediated cytolitic reactions. J Invertebr Pathol, 51,32-40.

419. Yoshino, T.P., Granath, W.O., Jr. 1985. Surface antigens of Biomphalaria glabrata (Gastropoda) hemocytes:functional heterogeneity in cell subpopulations recognized by a monoclonal antibody. J Invertebr Pathol 45, 174-186.

420. Yssel, E., Wolmarans, C.T. 1989 Factors influencing the leukocyte concentration of the freshwater snail

421. Bulinus africanus. J Invertebr Pathol, 53,269-271.

422. Zelck, U., Becker, W. 1990 Lectin binding to cells of Schistosoma mansoni and surrounding Biomphalariaglabrata tissue, J Invertebr Pathol, 55, 93-99.

423. Zelck, U., Becker, W. 1992 Biomphalaria glabrata: influence of calcium, lectins, and plasma factors on invitro phagocytic behavior of hemocytes of noninfected or Schistosoma /иа/мол/'-infected snails. Exp Par, 75, 126-136.

424. Zelck, U.E. 1999 Glycosidase activities in plasma of naive and schistosome-infected Biomphalaria glabrata

425. Gastropoda). Parasitology,! 19, 563-568.

426. Zelck, U.E., Becker, W., Bayne, C.J. 1995 The plasma proteins of Biomphalaria glabrata in the presence andabsence of Schistosoma mansoni. Dev Comp Immunol, 19, 181-194.

427. Zhang, S. M., Leonard, P. M., Adema, C. M., Loker, E. S. 2001 Parasite-responsive IgSF members in the snail Biomphalaria glabrata: characterization of novel genes with tandemly arranged IgSF domains and a fibrinogen domain. Immunogenetics, 53, 684-694.

428. Zhang, S. M., Loker, E. S. 2003 The FREP gene family in the snail Biomphalaria glabrata: additionalmembers, and evidence consistent with alternative splicing and FREP retrosequences. Fibrinogen-related proteins. Dev Comp Immunol, 27, 175-187.

429. Zhang, S.M., Adema, C.M., Kepler, T.B., Loker, E.S. 2004 Diversification of Ig superfamily genes in an invertebrate. Science, 305,251-254.ci'