Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Моноклональные антитела к О-антигену возбудителя холеры

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Моноклональные антитела к О-антигену возбудителя холеры"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЗДиРАЦШ Роотоюкий ордене Дружбы вэродоя иодицинокий институт

ШНОКЛНАЛЫШЕ АНТИТШ К 0-АКТИГШ ЮЗБУДЙТШ ХОЛЕРЫ

03.00.07 - микробиология

Аэторефвра I

дноовргации ва соиовааив ученой отедапи кандидата медицински'* паук

На првжвх рукописи

БУРЛАНЭВА

Ольга Спармкоана

Госюз-нй-Дону 19 9 2

Работа выполнена в Ростовском-на-Дону государственном научно-исследовательском цротивочуыном институте ПХЖОМИТЕТЛ 110 САН-ЭШЩНАДЗОРУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор НОВОХАТСКИЙ А.С. ' кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

АЛЕКСЕЕВА 'О.

Ск'-ициальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Гамлешко Х.П.-доктор медицински наук, старший научный сотрудник

Карницкая Н.В.

(

Ведущая организация:

Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт

Залдета состоится "*3 п1932 г. в часов

на заседании специализированного совета Д 064.53.01 при . Ростовском ордена Дружбы народов медицинском институте (344700 г.Ростов-на-Дону, Иахичеэанский пер. 29).

Автореферат разослан 1992 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ростовского медицинского института.

Ученик с.е1сретарь с не циплкяиро во иного со зет доцент

Ы.Я.КОРГАНОВ

ОБЩА ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТУ

Автеальлооть темы. Проблема холеры,- особенно оотро воевавшая я начале 7-й паядсыдл, яе утратяла овоеА автуал»ноотя до яаотоящего вреыеня. Виоовая вчболвьаемоогь продолжает ежегодно регяотряроватхоя s 20-30 отравах мяра (Г.М.МедяповяЗ, 1989} С.М.Нухаыедов, В.Г.Соредяя, 1990; Бол, ВОЗ, 1969-1992).

Холера проявила ва вое воятдяаяты я шэвала тан ваш;сел в опядемня разлйчной интевоявноотя. Это объясняется зиаянтел»-вш увелдчвяааы ва последило деояталотяя о вязе Я nezij гооудар-отвяыя, небывялим до этого объемом ыеждуяародлоЯ ынграцяя па-оаленяя, яятеяоявяим загрлзяоаяеи оврухаощев ореды, предде всего гидроофери, что г вонечяом агоге обусловило увеличение потенциально!! воаыожноотя ааражаняя лпдеЯ при заново холеры. За время последней паядемдл холера неоднократно завозялаоь в Япояяг, Англию, Нападу, Авотряо, СНГ, Чехооловавяо я другяе отрани. Роооял поддержявает янтеяоявпые аяояокячесвяе я вуля-туряые о алая оо отранамя Юго-Вооточной Азия, Индяя, Афрадя, Блпхяего я Среднего Воотов», что воздает реалмуи угрозу аано-оа холеры я нашу отрану. Поэтому в СНГ постоянно проводятоя аяачигедшшЯ объем ыеропряятяА, направленных на предупреждена ваяооа я раопроотрананял итого особо опааяого заболеваяял. Средя яях одно яа нервах чеот вешхваг овоевреыеяная дяагяоо-тдяа холер».

\

Для дяагноотячеовях лабораторяй не тодыго отечественных, во я зарубежных веобходямн выаововачеотвеявмв оавцяфювсвяв препарата для диагяоотява я вдеятяфивация возбудигеля холеры. Коммерчеовяе яядо- я тяпоопецяфачеовяе поллвлояальдае оыворот-яя, яополмуемм для сералогячеоиях рвавадй, обладают рядом яедоотатво», оредя ноторых оояовнымя яяяяююя вязвяе титры дяагяоотячеояях препаратов, неполная воопроязводяяооть я гете-

рогеняоогь оывороточных иммуноглобулинов, обусловливающая по-рвврсотнуп реавтииюоть о близвородсгвеншмя мяироорганяямами, что существенно снижает вероятность обнаружения холерного вибриона в яооледуемок материале < T.Y.Uorovnn , 1982} j.c.îoo-ley# 1969{ s.u.win''.lo » 1972). Следует оообо подчеркнут*, что возбудитель холеры хараятерявуегоя вкракенной изменчив ооты>, что танхв затрудняет правильную a tíi'Otpyn диагяоотяву в той ия-фввцпя я отражаэтоя на эффективности профилавтячеових л проти-воэпвдемячеовях мероприятия.

Преодоление указанных препятствий возможно ери использовании моноопевдфачеових иммуноглобулинов. Пути в оозданяп . теот-сготев нового поведения для диагяоотяня и ядентифивация возбудителя холеры отврывапт уопехя а облаоти гябрвдомной технология (Р.В.Петров, 1982; А.С.Новохатовяй, 1983; s.Chooh , А.и,саярЪе11 * 1986). В доступной литературе предотовлены ois дельные работы зарубежных ясоледоватслоЯ, в воторых опиоано получение МКА в антигенам холерного вябриона 01 группы я использование их в оеродиагяоотиве (B.GuatafBoon , 1984; T.ito, T. Yokota • 1987} zhu Zan » Shu-bo Ziiane, 1988).

В 1986 г. во время эпидемия холеры а Бангладеш в солевых уоловяях были яопытаны вольететы ыоновлоналышх антител в ЛИС холерных вибрионов о яаотяоцианатом ¿гдюореоцена для обнаружения возбудителя холеры в питьевой я речной воде после вонцент-рирования и подращивания в навопятельной ореде. Полученные данное флвореоцеятной мявросвоппя о помощью МКА во воех олуча-ях полноотыэ оовпадали о результатами более трудоемвях традиционных методов ( r.JUBrayton» Ы.Ь.Тогplin» 1987). С помощью ИФЛ о моновяональяымя антителами, опецифечнши в холерному товоину, товоия был обнаружен в пробах отула холерных больных.

Дроби били доотавлены яа Бангладеш я Швеции на льду пря -4 °С, Я яоследованы в течение 5 днвО пооло отбор». В 13-тя яа 17-т« □pod товояя был обнаружен des предварительного выоева пробы ( A.M»3vennariaoinf u.wiicutrom , 1986). Тавпм образом, очевидно, что МКА в одлу своей уникальной направленности а индивидуальным антигенным детериянантам позволяет разработать на лх ооновв уоовершенотвовашше дяагноотячеовив препараты для оеро-логячеовой идентификация и ди^орендиацяв возбудителя холера, яовлючять лохяополохятелънив реанадя, в ото pue воаяяваю* пря работе о нолявлоналышыя оиворотваня.

Важное теоретячеовое л правтячеовое значение яиевт дальне {toe е изучение антигенного отроения 0-спеця?ичеового вочплев-оа холерных вибрионов, выделение яыыуногенншс антигенных детерминант ЛПС я пояов «олевуллряых отрувтур, пригодных для вонотруированля оантетичвових вавциа ва оодово воыплевоа про-тевтявяых антигенов.

Каотоявдя работа выполнена s рамвах плановой теки * 144-2-88 "Антигенный аяслиз холерных вибрионов о яопользопа-яяем набора ноновлональяюс аятятел, регяограцаонпый номер 063374 01.88.0.

Цель работа. Получе/ше волловция ыоновлодальних аятлтел в антигенным детераняаяим ЛПО холерного вибриона, изучение о их поыоздо яаиунобйояогячесвдх свойств антигенов лабораторных иганцов choioraoOI я ооадание на лх ооновв теог-ояоте* 4 дал диагноотявл я ядентяфявации холерных вибрионов 01 группы,

Ооновние задачи яоолсдоваии^»

1. Разработать оптимальные уоловяя получения гибридом, оевретярующах ыоновлоиалыше антателя в О-антягеяу холерного всбряояа.

2. Создать яоллеедию гибридом, отобпльпо продуцярукгдах

моаовловалыше антитела в антигенным детвриявавтам Q-спецафанового вомолевоа холерного яябряова.

3» Ивучят» сао2отва, антигенную опецяфячноот» я ялшуно-бяологячеовуп автижнооть оянтезяруемнх гябрвдонаия ыоиовло-вальных иммуноглобулинов.

4. Изучить вЯЛевтявнооть использования воллевцая ЫКА при антигенном анализа ткгшчншс л атипичных штаммов холерных яиб-ряонов я препаратов ЛПС.

5. Получи г к опецяфячяпо я v.choioruo 01 яовъвгяроваянна о ШЦ препараты !iKi для прямого ятуяофяворвоцевтяого метода.

6. Получить опецифичеовяе я v.cholera« 01 стафялояов-яовы» реагенты ва .оонове ыоноопецифячеових яиыуяоглойулядов для реакция воагглютянацая ва стезла.

Научная яовязла я теоретдчеовая значяцооть работы.

В результате проведенных исследований получав набор гибридом» продуцирующих моновлональныв антитела я различным антигенным детерминантам 0-вомплевоа v. с^легао 01.

Получены гябрядомн, продуцирующие !Ш Icq , выявляющие яядоопецифичеовяе в оеровароопецяфячеовяв детерцяшшта, sbo-преооярованяые ва мявробвнх влетвах возбудителей холеры, а также гябрядоми - продуценты ЫНА я эпитопам, обусловливающим пврекреотные раавция о блязпородотвешшмя мявроорганвамамя.

Установлено, что яоследоваяяыо ноновловалыше антитела ваправлевы я ЛПС холерного аибриона. Определено чяоло в примерная проотранотвешшя легализация антигенных детерминант ЛПС, распознаваемых моновлоаальвымя антителами.

Изучена фунациональная автявяооть моновлональных аптятел в рввличввм антигенным детерминантам О-внтягева холерного вибриона. Проведав о помощи» яоллевцяв ЫКА анализ антигенов тя-

отшшх и атипичных пташов, грапоформаии», храпаконьюгэнтох я йндуцир018нних иугапгов холорных вибрионов. Уоганоллэпо, ч?о атипичные шгашш и ыутанти, полученные в процеоое генэгичэокой оалокции чаогично уграчивасг О-антиганнуп апаци^ичносгь, а дэ-»врыинаяш, о кохориии взвииодаймяуют монокяоиальвыо он^ито— ла, представлены на клеточной поверхности воопачительныи чш-лом повторов антигенных догариинант.

Установлено, что опещ1;ичес1Ш октизиооть моноклонэльяшс антител 1 роэкциях агглютинации, прсшишшшш и иицуно$лвореа-ценции значительно вше диагностических агглютинирующих холерных сигарою и.

Практическая ценность роботы.

Полученная коллекция атабилыых гибридиих культур, продуцирующих Ш к онзигвншш детериинантзи юзбудягеля холори, аопольэоааны а иачоотзе источников отандортних ионоолвщфгаоо-Ш1х иммуноглобулинов дли разработки усозоршенотвоЕинных диагностических пропарато».

Гибридный ююн ГХ-га/01 » продуцирую^ ииюклоиольныо

в 2ИДОС17ОЦЩШиОКОЦ/ 8НГИГ0НУ V.о1ю1вгао 01 , Дбноикро-

ван в специализированной коллекции поравиваошх соуитичеокиг ИЛОТОВ ГОЗЗгОМОЧЯШС ВООСОЮЗНОИ коллекции КЛОТОЧН.ЧЭС ку.чьчур гад номером ВСКК (И) 386 Д.

Габридоиз ГХ-В7/0Г , продуцидоювдя ьоноклонзлыщв 1^0 к озроаароопощиХнчоокоиу антигену и)абудитоля холори» зпопрооои-роааниому иа клетках вюшоз холерных вкбрпонга» только ооровз-ро Огоээ, ¡защищена азтороиии свидетельством *г ог 8 ок-

тября 19 ЬЭ года.

Получены и иопнмли диагностические препарлхы МКА, копхы-гироаанвих о СШ'Ц длп диагностики и идонтификоция яоабудигокя

- в -

холери а ягашгоэ T.ohoXtre« , охлооящнхоя в cepoiapy Orase, s прямом иимувофлюореоцватном методе.

Doлучев я иопыгеи огафило кокковый мовокловалавый кошг-

ГЯЭгОТИДОЮЩИЙ ДИ8ГЯ001ИКУ11 ДЛЯ ИД0ВгйфИК8ЦИИ' ЮТ81Ш0В V.oholera* 01 i реакция коаггл»1иаации из агекле.

По ревудиагеи жышляенвой работы Сшя раарабохавы "Ижлрукпня по изготовлении и контролю ко-роагевгов двигвоо-евчзоких холерных юиокловалышх сухих для реакции коагглюги-- вации ва отекло", которая одобрева Учении Советом Рост oso«) гола-Дону вэучно-исоледогагельокого противочумного ИВОТИТуТв £ марта 1990 г., протокол й "Экоперимеимльво-проиаводот-веввый регламевт tío иагоююовию и контролю иинусоглобуливов диагностических холервих ионокловельпых люмиаеоцирующих оу-хих" бил утвержден Учепыи Созетом Роотоаокого-на-Допу ваучно-ИОодедоватвльокого протйгочуыяого ивотитута шзя 1988 г., • протокол fe 9.

Иопытания препараmi во освозе ИСА лрозедоны ва баае Ростовского и Иркутского иаучно-исслодозагельокях протквочумных институтов.

Предо га плавные в октябре 1990 г. во ек с позиции "Програо-оии8я технология в произюдотве лекаротвеивнх средств" препараты "Ишфноглобулини д1'.огиоатичоокио холерные моиокло-вэльные люиинооцирующиоп огыечовд серебряной медалью ДДНХ СССР.

Препараты видо- и соровароапэцифичоских (Огова) ША ио-толадупхся я иаучзо-иослодоватольонах разработках в лаборатории гибридом, ишупооорбоптов, МОПОКУДЯрйОЙ биологии и говети-кя холор-i, отдела шшциаливзцяи врачей Ростова ко го-на-Дону ва-

УЧИО-ИОСЛОДОТ.аЮЛЬОГ.ОГО ШОТИУуТВ, 8 ТОНКО И ЬОбООЮЗЯО« НИПЧИ

nlim;potî" и 1ШПЧИ Оибирп и Двльясто Еооюкэ.

Осаоя.чиа по подобия, уцдвигаошди по яапиу.ч

1. Гнбридош, получению nysau соиотичасшой 1'ис)р«;з13!>-шш цшулпш: опяояоцигов а гслогкаии utaroi'« шел, кродуапру»-цио ш?ю гаонэлышз овтигола к О-аигигану холоугаго вибрвояв, являягоп паточншсом атоидчргних, шпоютглш'.иху cnotircîtnwa-ïax антител;'

2. Гибрпдош, продуцируячна ЖЛ к O-snsnreny возбудителя холори, облздаищга различной оптаи'л1Ч1шст5а:

- поре кроет но raa0pociiomi''K4soovïn о бдйэюродогвелвшщ шкрооргзиизмашл

ОбцЗИ ВИДОЕОЁ да.. 208Х (JQpO-fipOS v. chol«raa ot J

- оврогзрной (Огэяа) ппациТичкоотьв, поэгаляздм про годить идвитп5'икашга возбудителя холера, его заугрнвядо^уп ов-рологнчпокуи дк^^еранамацпп,

3. Видоопвавдичеакиа к 0 га 1><з -а п еци h; ч а а кн и габридош, продуцирующие цоноклоиьлышв пнгцгола к О-аитигвпу хо лир how явбрйойо, ояукот нсточншои биологически вктн&ных вшуиогяойу-дпноз, прз добавляющих ообой цанпиИ иносруиект для ansrurei '«го анализа штампов холерных шЗриогов различного про!:оло:дашш,

о Tájese установления икмуяохямчеокой екнтоотн отдельных фракций ДЛС,

k, С ПСШОЦЬЯ 03TOp31îOtt КОЛДОКЦЙП ШСА к ЛИС XOJi'lptOi'O su б—

рйоао виявлевы б влдоспвцийичмкт: а + серомроспэшфтокях (Oroia) ûtîciti'SïiPfix дотерминанг»

3. Высокая опацп5ачяосу&, чуз<?тзит'?л»«00ть и сгибши»-ноогь sacr-оиогем яа оолоза ыо поило га лдаа овгитоя norm лл es нополкаоватк кх для дпягясоткш» к идшигиЗяяатэд ааабудиголя х» лорыi

б. Получошшэ диагностические препараты швоклональвых иммуноглобулинов, копыогировзншх о ФИТЦ, превооходят по активности в 4-8 раз коыыерческие голиклональные лЕшщеоцоитные сыяорэтки, предназначенные для серологической идентификации возбудителя холоры.

Аггпобакия работы. Результаты исследований были доловопы но научных конференциях молодых учета РПЧИ в 1987 и 1988 гг., ав Вооооюзиоц оонинэрэ по МКЛ в апреле 1988 г., Росюв-йа-До-ну; нз Всесоюзной научной конференции "Лктуалыше вопросы микробиологии, лабораторной диагностики и профилактики холс-рип, Ростов-на-Дону, 1988 г.; на Всесоюзной конференции "Современные направления создания ыедициноких Д11агнос1тсуиовп, Ыосква, 1983 г. и ва отрэолокш Всесоюзной оовецатш "Состоя-0иэ проблемы и явропоквииг развития диагностики бактериальных инфекций", Оболенок, 1989 г. Материалы диооортации обоуждош на общоиБститутской конференции РПЧИ в апрало 1992 г.

Публикация результатов исслодоганий. Оановпыо шлоаония диосертзции о г ранены в 10 опубликованных научных роботах.

Структура диссертации. Диссертация излевона на 160 страницах ыашшюпионого тобою и ооотоит из введения, обзора литературы,. опиоания иагеркзлоз и истодов исследования, результатов собственных исследований, аашшчеяия, выводов и у газ зато лл литературы, включающего работы 50 отечественных и 135 сорубежных авторов. Рабою иллюстрирована 5 рисунками, 15 таблицами и 7 фотографиями;

- Ii -

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Нагариалы в метода

Бактериальные пгашш и ашигопы. В рябого били попользованы 312.типичных шгаишов холерных вибрионоз бко воров 0l_ torH choleras оороворов Огавэ, Инабэ ц Гшюиииэ, Вб asii-пнчяых ciïqumob v.cholerae слабоагглютинидоюсипсоя холоршши диаглоочичаоюти сыворогкаш; индуцировоинио 0~~иутайги, акспорииенгально полученные a И1Ч11 о использование!! супвриу-;оratio в - jf -имтроэоиопшючалшы ч . pu от и л- íf ji и г ро - ц -:¡ розохуэниднна (21 uirauu); apjuoijppauKSu и трамкопгдгаати (5 птошоэ)! 7 итаиыоз ¿-фри холаряих гибркокоа; ходорнио snö— риоии по OI i'pynnu ргэ личных оорэвиров (6^ !■:?;) )j прадога-ВНУОЛИ OQUoiloXB Vibrlonaoeuo « Vooudoitioiiadtioeaa • Kntc-ro-buctorlaooao t 0 икйо прзлаpa tu ЛПС, подучониио по похода O.We3tphftl9t al, (1965).

Клгаш. Еополмощш laiauhuo швлошшо клаточша лииии X.653à клетки парввиэосшой i"jnhrj[)n шиишх £аброблзсгов т-929 и оварнэлышо кдчгки китайского хомяка CHO-KI,

Емготниа. Использоьели илбредяих иш)?. липяч вгдъ/о 0 ÏJQG00S1 16-20 St'.

H яму и о ло ru ч о о ки а р а о к и i а, К о год иалряаоИ «¡^уяй^жор^о-циндип осуществляли па ^иксщте.чтшх иэакз^, ириго^оьлишшх isa I млрд оуопонзи! башориалышх клеток,

Нкмувойорийнтяи!! G!ío.-.'iig проюднли на азордоИ иэзо оорби-роминшс з дуниах полпотороловшс гаitо:шП цольщх кчяон бактериальных птспнов «та пропоротой ЛПС,

Копкуреийиуо jwomi«a пир НКА для онридедвпнч иидакоа ид-Д!1ТП2'.1005И _ПР0МДИЛ!1 ООГЛПСЯО НОТОдШМ, ПрОДЛОайПИОЙ I'-i^js},

В. 04 а1.» 1933.

Конкуренция аититол, намеченных ферментом, о антителами, вокъпгировашши о перовоядаэой хрена, проводили по оледующзй охеыв! на шшотияу адсорбировали антиген, затем внооили препарату МКА, раотитровашше двуяратными разведениями. Добавлением МКА, меченного $ермеятом, определяли воняуреяцяю пары ЫКД 8а центры связывания на антигене.

Иммуяоблотянг осуществляли по методу н.топыа вt &1. (1979).

Репяцию агглютипации, двойной иммунодиффузии проводили по общепринятым методивом.

Определение влаоео иммуноглобулинов, продуцируемых гибри-домамя, проводили о помощьзэ иммуноформентного язотжшрущего набора фирмы ссаъаосЬсп (ШвоЕцарил) по инотрувцди изготовителя.

Статиотдчесют обработку результатов оерологичеовях анализов проводили по И.П.Аошарину и А.А.Воробьеву, 1962.

Доотгюпнпе грзг'пиов. Графячеовуп обработяу данных проводила на вокпшгоре М-290 &ирмы «оцуот" о использование« гра^чеового навета "игаг-ъох"» яятерантявном режиме.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Получение гибридных влонов, продуцируащих 1Ш Я антигенам у.с'ао1огас о") • В результате проведенных гибридизаций влетав мквломн мыса X 663 со сплелоцитани мкшей, иммунизированных убитой кипячением бавтериальлой взвгоьо холерных вибрионов, в общей сложности било получено и исследовано на ая-титолообразуэти(ую автивнооть 1610 первичных гибридных вультур. При первхчном тейтдроканйи обнаружено 947 позитивных влонов,

. \

овяретярующих ¡шмуяоглобудивы в Онаягягвяу возбудяталл холери, В процеоов вультиаяровандл гдбрядон было.установлено, что 40 % габрядашх вультур яеогабялмы по антятедообраэупдиц овоПогван. СвоРотаа МКА в вятигенам возбудителя рсолори, В результате тщательного отбора гибрвдных культур, стабильно продуцирующих оцецяфнчеоняв димуноглобуляяи о доо та точно suooHofl аятявяоотью а оерологячеовях роаяцалх я не обладающих паревреотной реввтавноотьо о родотвавлкыя ыянрооргаийзнаия, для детального яооледоааяял балл отобраны 14 гдбряд/шх клоноз, Попоя МКА, вэайыодайотвующах о иояоерватяэяшш детерцлппнтгща 0-аятягвна холерных вябрвояоа, бил ооущвогалоа на наборе да 287 штомноэ Y.cholerao 01 я '/-olt or » выделенных в различных опядочагах (табл, I),

По харавтэру взаянодвАотазл Ш(А о поворхяоопшил аптдго-íiafia холерных зшбриопоа видела ни 2 трупом моноллональяих иммуноглобулинов* вддоодйпД'Тячеояяе я Огава-спсцп'-нчеовке,

Поовольну изучаемые МГА ment одянавову» янтягеннув яа-правлвяяооть, для решвкдя вопроса о раопозяавашш ысновлокаль-дц«я аятдтелакд одного аятлгбииого сайта для различных аитп-ганпых детярмилзят, лоиадязохяялкх яя поверхности мякробиоП племя, бил применен Б1(13А-йдцитяяный теот. Вря анализе результатов получоллнх пря поотановвв яядевоа яддатяаяоотя и золнурзлтяого USA в рзаяцяя пеиэчншшх Вермонтом Ъ'КА о ыечзп-яияа пэроаоядззой хрэга МКА удалось уотапоаигь, что иооладо-гаяше паиуноглобултш распознай« различные 6-эдо и 4-аэрова-роспапяйичзойдх (Огава) апгягснлыв двтзрминангы я показать 20ЕИСтлоот7» пзучашя яг проотралотиякой оргапяасщяи яя онтя~ гопо о поиокдаэ набора !Щ.

Сразлятельпов яооладоганяэ (шгягаяшя отруитур ялатоя хо-

Табляца I

Автавяость я спецврачнооть MEA в О-аятягеву V.oboleme oí в реанцая нёпряаой

яянуно-ТшюореоцзЕция

{Калаче-

jcïi-о со-¡слсд022п-

}£шх атаа-

jjíoe

Ш т а а м ы

M К А гябрядок

Огава-юпецп-^ичесвях

глдоопсппТдчзсЕЯХ ¡

T^iа ¿3115 ЫФхИа VH¿303J4 ЦЬ*тД ixmà v'l bb ! uá i üid uj ! ¿10 ; ;_; ; i t t t ! ! 1 ? ?

лслерлие адбзкояа CI ГГ^г-Е; CSr-0£3i-CIÍ Огсга

'Лзаба

ГйЕоаяаа Холерние

'C Z'- /. ',10 lilí

Ol группы:

ирсдставягаля ccaei'cïB: Viûrioniooae

Entsrobaote-

riacsas

ISO 34 2C

S3 IQ 2

42

14

21

+ + + +

+

+ + +

+

•f

+ + + + + +

4-+

♦ + +

+ + + + ♦ +

+ + +

* + ♦

♦

+

+ + +

+

♦ ♦ + + + + + ♦ -

+

♦ +

■«■ + + + - ♦ ♦

- отрицательная реавцяя.

- опецй ачесаое свечение на 3+ я 4+.

лорншс вибрионов я препаратов ЛЕС методом перевреотяого тну-иоолевтрофорвза пояазало, что оня образую» идэнтичяыа линия прецяпятпта со яовмя МКА ж видг одного пива, воторнй ооответ-отаувт аналогичной антигенной детерминанте, выявляемо? ж влет-ве я очищоняоы ЛПС, соответствующим иммуноглобулином.

Ивученяе э$[*втяаяоогя использования полученного набора МКА я целях антигенного анализа атипичных штампов холерных вибрионов было проведано ва 86 штаимох 7.сЬо1агав о различной агглптяяабельяоопя холерными диагяоотячеоякмя оыворотвамя. Бое иооледоваяяыа вультуры вибрионов била разделены на б групп (табл.2),

. В первую вошли ал .^агглютинирующие холвряыия дичгяоогя-чвовямя оыворотвамя (от до тятра) влбряояы, которые ай-тяано взаимодействовали оо воемя яооладовзшшмя Ш. Во вторую - холерные влбряояы, воторыа олабо агглюгяяпромлгч* 01-видо-опацифичоояой, типоопацпфичоовой Огава в одновременно но -онао-ротвой в малых ее разводпаях. Шта?лш эчой группы взавыода^от-воваля Т0Л1В0 о Мк гябридоы 1*801^ В10312 , ВЗН5 , Ы Я 07 , Третью группу ооотавяля шташы,агглютинирующиеся тольво яо-оы-воротвоЗ до полного яла до татра. В 4 группу ввлхтаиш вааг-глютшшруюциеоя вультуры холерных вибрионов. В пятую группу вопля природные штаммы холерных вябриояоя не 01 группы, воторне олаб"9гглютяяировалиоь вядоопвцяф&чвовоа холерной сывороть-л а я» реагировали о воолэдоваяпымя моноялояальннмя иммуноглобулинами, что дяшшй раз подтварвдавт отрогую спацяфичяость полученных явмя ИМ.

Наиболее янтервоншд при апаляае полученных данных овзга-лдвь, о точвя зрения антигенного ооотам, штаммы 3 я 4 групп. Из воех яооладоввнкнх итекнов втях групп, гольяо 6 вультур холерных вибрионов, 8гглгтяяяроаа»гзя.хоя о ко -спаоротяой я 2

M

к

g

о

в

g

64 в

M

a

й

H

s

я

£88

♦ » »' »I »!

+ « ♦ Il •

+ «♦<♦•■ I

+ « I * • I

+ • I I I

♦ « ♦ • I I

♦ • ♦ . 4- « I

+ '

I I

I 4-.

♦ •III +< I I I I

I I

I I

♦ • I

I I

I I

I I

+ • +

I I

I I

I I

I I +

H fl 0

fe

штамма 27 груша взяямодэпатвоаалд о WKA гибридом СЗВ4, biobis a D7 При о том следует отметя«, что реавцял огглптияагия происходила паоводьяо вамедяеяво, Остальные штаммн втях групп ив взаямодоРотговаля о UKA,

Это подтаервдеяо гаи» методом точечного яммуноблотинга а поназапо, что аятигеви в воторым получены МКА присутствует в сопоставимых волачвотапх вая у типичных, тя* я атипичных штан-«ов холеряых вибрионов*

Опредалаяпый аптерэо првдотамяпт ъ -форт холенных вяб-рионо». В основе этой фзраы азмапчавоотз лежат отрувтуряи». аз-йвлвЕзя балтериал&ноа влагая, овязояшв о частичной или полное утратой способности s стазу ялаточяоИ отенвя. Кооледованяе 7 музейных птаккоа. х. -форм холерных вибрионов методом непрямой вымуяофдюорвоцеяция повязали, что воыплем^ятарнш опйтспн для Ш(А яооледоваяных гибридом были утрачены веема хзятшя дал аяалява штаммами ь -фзря холерных вибрионов а толь ¡а Ш Огс-аа-опецяфачвйной гибрлдойи q? .идентифицировала гомологичную антигенную детерминанту в состав* лзмлявняых баитериальянх -влетов. Следует отметить, что ин наблюдали дяоярэтяуп опз1гифв-чаокую фшорвецанцвв поверхаоота ыивробных влетов ь -форм в виде пзнвтирного ожечепяя отдельных фрагментов ялеточной отенвя.

Наряду о атдпячящд пряродшзд ивамкама холерных вябрлл--поэ 6iOa изучены йутантпна вультура двух бяоваров, подучашша в лабораторных условиях а утратлкаяа О-аятягеняуи апвциЖяч-ность.

Трака форманты а транааоиыэгааты сохраняла отдельные детерминанты О-антигена, выявляемые ННА гибридом 755,2 , ВЗН5> Г11В5 »07 й 07 • Одяаво яя одно ив лоолвдовашшх МКА не про-

являло автивнооть о индуцированными мутантами.

Результат иооледованял протввтааной & нейтрализующей аа-«внооти МКА в опытах ln vivo я in vitro поваааля различную роль отдельных антигенных детерминант G-антитела в развитая инфевциояного процеоса при холере. Наиболее аыоовой автив-яоотыо в втих тзотлх облили Ш(А гибридом СЗВ4, BIQBI2, B3II5 и воторые хоролтно направлены в фунвциональяо важным епи-топам Л11С, При егом результаты, иолучвкяьв m vive* даходятоя в прямой зависимости о? иягибируюэдй автивноста ЫКА ln vitro, Ыоновлоналыша иммуноглобулины, воторио вызывают наиболее вн-оовай процент гибели холерных вибрионов ln vltro, обладает оущвотвенлой антицаютоисичзодой автиалоотью, и оли еэ облзачло? тяаиота заболевания у белых «шей, уволичивая продолжи- * толыюоть шали овопаримеитальных лшаотшя.

Диах'лоотичесвио 5мох-ояотемы па осшова Ш(А в О-антягалу.

Y.oholerao 01

Коагглитлнаиионныо диагноогияуыи для идеити^ивацаи еос-будисодя холара в реакция йоахтдютиишущ на о тс ало била полу-Ч61Ш на 00Í10X.Í5 ГДбрИДОй ЕИДООПвЦИфИЧООВИХ 18012 , ВЮВ12Л

Оглва-споцифичаових щ , 07, продуцяругдах Ш1А ллаооо igO , направленных в О-аитигвяу холерного пибрионя. Для приготоило-1шя иоагглямшацаоияого poarenwj бил попользован цотод Q.iu-oa-. valí (1973), Приготовленный upo пара'i хранили при -Ц °С или яяо$йлиаировали. Ниднио ирапараш оохрашшя ошо автиваооть в

«ечзияе полугода, лиофализировашшо - в течодиа» 2 лэг (оров

*

Шбладедвл),

Постановку реовцил проводили в ада обычной рзавции вггля-силдции ни отекле но «рвхбальнэй оиотвце. Положительным рэоудь-итом считали образование аггдзхшшго о полним просветлением

омзся.

Результаты охядзтельотвуют о строгой опвцяфачяоатя воаг-глютилацаошшх даагносгяпуноя на основ® МКА в отноиапчи возбудителя холэры. Вядоопвцнфячвояяв яоагглятядируЕэдив монояло-пальпыэ дяэгностивуын позволяют идентифицировать холаряно вяб-ряопы обоях оаротяпов, а вореагенты оэрогарбопвдифлчесяяе (Огава), тольно гомологичный серотяп,

, Чувогвятельпооть рзавция соотавлязт 10^-Ю3 ц.вч/'ня пря учете иеаоорупапшы глазом я не завяопт от диагноотянуяоя, приготовленных о яопользоюзшшн пптлвной аоцптячвоной яядзоотя для очищенных препаратов нмкупоглобуляноз. Э^оятляно9 дспользова-ня8 воагглютяпациошисс дяпгиоотявуиов на основе НКА для ивдд-яацая холерных аябрлопоа в натявноц материала вяоряоноодталей я обьевтах оярукавдей орадц, всзноано посла предварительного подращяваняя исследуемого натэряала в I % пвптопно 1 вода.

!' .ум у л оТ'.тоо р-з оно пт нка дяагпоотяяунн. В результата проведенных иослздованяЛ повазана возмоашость использования МКА для яонотрудрованая войыогяровашшх а ШЩ препаратов, предаазпа-чашшх для видовой я Огава-оероварпой дяфйвреящацаи холер,-чх аибряоиоз 01 группы методом пряной яшунофгоореоцэяцяи.

Кояъюгацяю оподаТячеовях лкмуноглобуланов о ШЦ ооущаот»-ляля по а.Соопя. a ».Kaplan (ISD0) а ыодяфдяацял J.Ripfr^ (196..). Прягоговлэняыо препарата тчзптгх. 4'ИЩ ГШ, содараащЕО а начэотве воноорваята мертяодат натрия а разведения 1:Ю ООО, ляофилдзяровзм л хранили пря +4 в течение 2 лат (сроя наблюдения).

Результата исследования в яямуяофлоорвоцвнцяи аптявпостя и специфичности яоиьюгатов МКА о ®Щ свидетельствуют, что полученные препараты являются высовоспецнфачякмя а стноиеаяя ая-

«■шчиоа аовбудямдя ход&рн и на даот шроарзоишх рсаьцаВ о гетвродогашщи видами ыяЕрооргопяаыов,

Двдийооцируодаа ырнонлояалыше аынуноглобулшш обоопвча-ааяй дао® опвцвфичэоЕоз овечаяие во&х штаыыоа У.окоХвгав 01 ь тятрв I; 128 - 1;2Б6, Пра оравиеаяи янтвиоявнооти опещфто-пого 0Е5ча1шя швврхяоота ыивробоз, овраиошых ыояовлояалшат ирам ратаци, в бодьшшотве ожучааа иравооходат иохнерчвсЕио, Тивьу обх«аоы, илыунофдвораоцантаая оиетэыа на основа ЫКА, цока!? оущготвеняо опхяцйзароаать оероддагяоотиау холеры я ооита-Еагь ыоинуронцшэ даагпоотяч&ояин холерным лщиааоцируащц ок-аоротваи, рабочее рааводоша которых составляет: 1:$ н 1:Хб.

Крои» втого, оущеотввяяыа иравиущвотгом ноиоклоялаьинх реагентов ощьшг аозаошооть отаадартйаацая а получения а достаточный яодачвотаах а аоротзяэ орова, а уаш» отоутотьдо иеобходаыоои адоорбцяи, ван это пряяято в производстве поля-юлонадьянх диагностических выворотов.

Выгоды

I, Иолу чаны 6 стабильных габридшх яультур, ироду дируюцдх в О-штгаяу хоязрша вибрионов, обяадяющях вядоопецафй-чоовой активностью,

2,.Получены 4 адояа габрадцых влвтов-ародудвятов ыоноело-»адышх шшуногдобуяияоа'в О-аятигову холаряых вябраояов, вво-враоояроваавш: на иавробных влвтвах штдыыоа у.око1егаа «одь-со оератипа ОгвЕв.

3, Вадоопецафачвоаве моиовдояальиыв антитела в А-еитдгаяу холерных анбрионоа реогювЕавт а «го о октава 6 аитигешшх да« мраанап«. Огааанзпвца^ичеовае «ононлопальпые иыкуяогяобулииы 8 В-чштигеяу холерных аябряояов выявляю* в его ооотпае 4 опта-

Гввше декзриишны.

4. Моноклопалышв иммуноглобулины гибридом real г, В1СЭН2 ( D7 м 07 взаимодействуй? о юнсервативнымя дэторюг-ввнгамя О-эптигонв ховерных вибрионов и выявляет повэрхиоот-выо ввтигены типичных штаммов T.oboleret 01« »типичных щвммов в i -форм холерных вибрионов.

5* НКА 03X4 , nií3»B3H5,aiC®12tD7 «07 напоевлеш к функционально важным ентигевнынн детерминантам, угьегзю* poos холорных вибрионов &а vitro « обладаю« ентицитотокои-чеакой активностью, я они же облегчают тяхэот» аабохаванмя у белых мыпев, увплпчивая продолжительность жизни ввоперямен-

тэяьных жывояш*

6. На оонове Ш к виде» <Г8012 t ВЮВ12 ) и Огэва-спе-щфичееккы (от »07 ) антигенам холерных вибрионов получеви коагглютинаииопные дпвгноатикуиы, позволяющие ндевтпфпияро-в?т» V* cholera« ОХ в простой« общедоотупной реакция к> агглютинации на ст eiote.

7. Полупони активные в раакотга прямой шыунофяюоресцав-цни диагностические прегервты юнютировэпвых о ФИТЦ шнокдо-нальны;: ишувоглобулпнов ( гва12 «S10B12 ,1>7 и 07 )« арод-навначзлныо для ускоренного шявдония тез будит о ля хояеры.'

Спасов работ, опубликованных по теме диосертешга

X. Влияний резличных хишпоокнх во^естэ нэ стонсобрвзо-вапио гогаэыоцитом/Л.П.Алекоеевв, О.К.Бичуль, В.Н.Козлоэохий/. «//Мотэриалы П ваучяо-практичвокой пввфорзнпяи "Актуелшые вопросы ишуновогш и ишунопатоштт в ыедяцяио и курортоло-гиия{ Тез. докл; КОЕф. - Пятигорск, 1987. - С.45.

2» Огава-споци&вчоакий Ко-рэагент для обнаружения вов-вудитаяя хоаори/Л.П.АиокоеиБа, А.С.Шшхатский, Г.И.Орлова/;-//Актуальные вопросы разработки препаратов ыедицинокой биотехнологии: Tes. докл. конФ. - Махачкала, 1988. - С.237.

5. Диагиоогичаокио препараты »8 основе UKA для идентификации возбудителя холоры 01 группы в роакцвд коаггдютиноцпи Н ораыой ичиуиофдшриицоиции/Л.П.Адшшиава, А.С.Иовохатокий, А .А .Поляков, Г.и.Орлова/.-//Современные на яра в линия ооадання медициноких диагнсогикуиов! Tus. докл. Воееоюав. конф. - U., 19ВД. - С.ЗЙ.

4. Изучении овойотв шиокаоиалышх онтитея к О-антигеиу холерных вибрионов оороваров Oraва и Штба/Л.И.Алакоаева, А.С.Иовохатокий, К.Г.Бичудь/. -//Актуальные вопросы лабораторной диагиосуиим и профилактики хояорыа Tas. Воеооюан. юнф. -Роогов-на-Дону, 1968, - 0.152-1545. Ионоююиалышо антигела и детаршишвтви Онзнтигоио ааояариого вибриона 01 группы и норсшокхиш их иопользоваыш /Л.П.Аааиоаавэ, А.С.ИовохитикиЙ/.-// Той жо. - C.I4Q-X45,

6. иоиокдоиаяышо Ш1титила и еитигинаы хонорних вибрионов оеровара Огава/Л.И.А.'ишооова, А.О.Ноиохахоítuü, К.Г.Ба-чуль, 15.Ю.Дринов/.-//Украинский иикробиологичеокин курная. ■» Клев, 1ЭЮ. - Т.51, te 3. - C.56-É0.

7. Esaus гибридоишх культиьируаышс квиток шг? ouaoulus, Иопольвувши для получения ыоновдолальных вшеияел н sapuoose-Шигьиоиу О-внгигеиу холерного вибриона оеровара Огаьа/Л.П, Asukouuüü, А.С.НовохааошИ, КД'.Еичупь/.-//Амороюа свидетельство Ш 1541254 от в октября 1989.

&. Мозоклонзльпые антитела к 0-§ятигету вовбудэтаиа хо-жври М/Л.П.Аавкоаввв, Н,И.Винокур/.-//состояние проблемы я пиропектявы развития диагностики бактериальных ипфекциахТаэ. докд. Воеоовви. оонвщ» * ОСЬясяои» - С.69.

9. Ионоклоиельвыа 8Н9И'?оя9 к О-ангвгеяу Т»оЬо1вгао 01. Перспективы их иоотлмоетния/Л.11.Ал9кеавв8/»-//В80*пик вовоо-вап;- никробяол. об-ва. - Росгов-по-Дону, 19(19. Вия. I» •

10. Накопление ЫКА в беооывороточной ородо/Л.П.Аяв?1св»~ В9, В.В.Бвл8П!0М/.-//ПИТ5ГЭЛ»ПНе среди п <гнго розга дхя этширования кяетомТез» Всеоовзн. копф. - Иовоонбарсв, 1991* -С.61.

Подписано к печати /Л. {О. 9Я. г.

Формат бумаги 60 х 84. 1Д6, Бумага офсотпзя. Пгча-гъ офсетная. Псч. лист - 1

Заказ -Н99 тира а - ЮО Тин. РОДШИ