Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Моноклональные антитела к антигенам CHLAMYDIA TRACHOMATIS и разработка на их основе диагностических препаратов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Моноклональные антитела к антигенам CHLAMYDIA TRACHOMATIS и разработка на их основе диагностических препаратов"



РОССИЙСКАЯ А1ОДЕМШ 1ЩЩШЖИ2 ЕШ ЯАУЭДЮ^СЩОТАТШСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ Э1ЩЕМИОЛОГИИ И МИКРОШОЛОШИ имени ПОЧЕТНОГО ЖАДШША Н.Ф;ГАМАЛЕй

На правах рукописи

КУТЛИН Андрей Валерьевич

МОНОКЯОНАЛЫШ АНТИТЕЛА К АНТИГВНАМ сшимп51а trachomatis И РАЗРАБОТКА НА ИХ ОСНОВЕ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

: 03,00.07 - микробиология, 14;00.36 - аллергология и пшунология )

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учено? степени кандидата медицинских наук

Москва - 1292

Работа выполнена в Научно-исследовательском Ордена Трудового Красного Знамени институте эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф .Гамалеи Российской Академии медицинских наук

Научные руководители?

догагр медицинских: наук, профессор А.А.Шаткин кандидат медицинских наук Э.И.Дробшиевская

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор В Л.Коршунов доктор биологических наук А ►В .Пронин

Ведущее учреждение: Институт вирусологии ем .Д.И.Ивановского Российской Академии медицинских наук •

Защита диссертации состоится . ... 1992 г.

в "Л г часов на заседании специализированного совета К 001.07.01 в ШИЭМ ш.Н.Ф.Гамалеи РАМН ( 123098, Москва, ул.Гамалеи 18 )

С диссертацией могло озяакоглиться в библиотеке НИИЭМ ш.К.Ф.Гамалеи РАМН

Автореферат разослан п<Л.. чТГт;... 1292 г.

Уче.шй секретарь специализированного совета, доктор медицинских наук

Е.И.Коптело!

- 3 -

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. Облигатные внутриклеточные бактерии родл Chlamydia вызывают широкий спектр патологических процессов у человека и животных.

В настоящее время известны три вида хламидий: С. psittacl - возбудитель разнообразных зоонозных хламидиозов, способных передаваться и человеку; С. trachomatis - возбудитель антропо-нозкых хламидийкых инфекций, первично поражающих слизистые оболочки человека (тоахома.урогекитальные хламидиозы и др.); и С. pneumoniae - возбудитель респираторных заболеваний человека (Saikku Р. ,1985,8rayston J. ,1989).

Наибсльпее распространение имеют актропоноанке хламидиозы, вызываемые С. trachomatis. Так, по данным ВОЗ до настоящего времени в мире определяется более 400 млн. случаев трахомы (Levitt D. , Barol J. , 1987).

В последние годы С. trachomatis признана самым распространенным возбу*,лтелем болезней передающихся подовым путем, превышая заболеваемость гонореей в 2-6 раз (Mardh Р. А., Tayloi-Robinson D., 1984). По данным Европейского общества по изучению хламидий урогенитальными хламидиозами в мире поражено более 50 млн человек (Mardn Р. А. ,1991). В нашей стране, заболеваемость урогенитальными хламидиозами превышает 1,5 млн случаев ежегодно (!1!аткин А. А., 1990). Установлено, что более 50 % случаев трубного бесплодия у женщин и около 20 2 инфекционной патологии у новорожденных имеют хламидийную природу (Шаткин А. А., 1990).

Отличительной особенностью урогенитальных хламидиозов яз-вдется отсутствие выраденкюй и патогяомоничной симптоматики. Эти заболевания у большей части больных проходят под другими

диагнозами или протекают практически бессимптомно, вследствие чего не подвергаются научно-обоснованной этиотропной терапии и профилактике (Шаткин А. А. , Ь1авров И. II1963, Schachter J. ,1987).

Отсутствие в практическом здравоохранении надежных и доступных диагностических тест-систем и препаратов затрудняет этиологическую диагностику и эг*'демиологический надзор за хла-ыидиозами, что привоя, .г к развитию хронических форм хламидий-ных .лфек"чй, тяжелым осложнениям и дальнейшему росту заболеваемости. Наиболее специфичный и чувствительный метод диагностики - выделение хламидий в куль уре клеток -• представляет

Сз

трудоемкую, технически сложную и длительную процедуру, что де-«

лает его недоступным для большинства клинических лабораторий и затрудняет использование в качестве средства скрининга.

В связи с этим, совершенствование лабораторной диагностики хламидиозов является актуальной задачей научных исследований, направленных на оздоровление населения и обеспечение научно-обоснованной зтиотропной терапии.

В последние годы в нашей стране и за рубежом показано, что решение данной проблемы : зжет быть значительно облегчено путем разработки иммунодиагностических тестов, использующих вксокоспецифичкые моноклональные антитела (м-AT); ряд зарубежных фирм ("Abbott", "Syva","Orion" и др.) выпустили коммерческие наборы, в составе которых используются м-AT, предназначенные для диагностики урогенитальных хламидиозов, вызываемых С. trac'omatis. Аналогичные диагностические тесты на основе м-VT ранее в нашей стране не разрабатывались.

Цель диссертационной работы. Получение м-ЛТ к различным антигенным детерминантам С. rachomatis, изучение некоторых иммуно-химических и биологических свойств, и их использование

конструированиии высокочувствительных и специфичных диаг-зстиче^ких препаратов.

Основные задачи исследования.

1. Отработка оптимальных схем иммунизации Baib/c мышей >епарата».м антигенов С-. trachomatis и условий для скрининга !бридом непрямым иммунофэрментным и иммунофлуоресцентным мерами.

2. Получение серии гибридом, стабильно продуцирующих м-AT различном антигенным детерминантам С. trachomatis.

3. Изучение ряда иммунохимических и биологических свойств •лученных м-АТ, характеристика соответствующих им антигенных терминант.

4. Получение в препаративном количестве, выделение и :истка м-АТ, направленных к родо- и видоспецифическим антиге-л С. trachomatis.

5. Конструирование на основе м-АТ, конъюгированных с флу-охромом и г роксидазой, экспериментальных диагностических епаратов для определения хламидий прямым иммунсфлуоресиент-м и иммуноферментным методами,

6. Апробация и оценка эффективности полученных диагности-мов в эксперименте и клинике.

Научная новизна Впервые получены оригинальные отечест-

--------4 f. ■

нные м-АТ к различным антигенам С. trachomatis, в том числе и особные нейтрализовать инфекционную активность этого микро-ганизма, что позволит их использовать для анализа антигенной руктуры хламидий и углубления знаний об особенностях взаимо-йствия этого микроорганизма с клеткой-хозяином. Выделение этек^иъных антигенов хламидий с помощью м-АТ может оказаться ;дуктивным и при создании новых вакцинных препаратов. Уста-

- б -

новлена корреляция между иммунологической специфичностью п< ченных м-АТ и характером их взаимодействия с антигенами С.1 chomatis. Разработан первый высокоэффективный отечественны! иымунофлуоресцентный диагностикум для прямого i .ределения г тигенов С. trachomatis в клинических и экспериментальных мат риалах и апробирован в эксперименте иммунофермэнтный диагностический препарат Установлено значительное увеличение чу; твительности прямого иммуноферментного метода (ИФМ) npi предварительной термообработке исследуемого материала, соде жащего С. trachomatis.

Практическая ценность работы. Получение тнокдональнш антител к родоспецифическим и видоопецифическим детерминант С.trachomatis явилось основой для создания отсутствующей в стране современной иммунодиагностики хламидиозов.

Клинические испытания, проведенные в лабораториях ряде НИИ и клиник венерологического й акушерско-гинекологическог профиля, показали, что разработанный экспериментальный имму кофлуоресцентный диагностикум по своей чувствительности и с цифичности не уступает заруб жным аналогам при диагностике урогенитальных хламидиозов, вызываемых С. trachomatis.

В настоящее время производится коммерческий выпуск экс риментальных партий этого диагностикума ч^рез СП "Nearmed при ГОГОЭМ им. Е Ф. Гамалеи.

Апробация диссертации состоялась на научной гюнференции отдел' медицинской микробиологии НКИЭМ им. К. Ф. Гамалеи ШН СССР 16 октября 1391 года. Основные положения работы долоте на Советско-французском симпозиуме по хламидчоьами (1989 г. на Всесоюзном Совещании по х шдоозам (1990 г.)

По теме диссертации опубликовано б печатных работ. Msu

риалы диссертационной работы отражены в 2 методических реио-мендацк х.

Обьем и структура работы. Диссертация изложена на 145 страницах машинописного текста (включая 6 таблиц и 18 рисунков) и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литератур; По ледний включает 20 отечественных и 150 зарубежных источников.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы.

Штаммы микроорганизмов. В работе использованы следующие згсаммы разных видов хлашдкй из коллекции лаборатории хлзмиди-ззов НШ1ЭМ им. Н. Ф. Гамалеи : С. trachomatis - штамм HAR-1 (серо-гип А), игами Ар-2 (серотип Еа),стамм UW-1 (серотип С), штамм IcCai-8 (серотип 0), гатал/и Bour (серотип Е), штамм IcCal-3 [серотип F), штамм Ш-4 (серотип Н), яталы 870 (серотип I), втамм UV-3G (серотип J), штамм UW-31 (серогип К), ягами LY-440 ;серотип L1), гтамм Ви-434 и штамм LB1 (серотип L2), итамм Л'-404 (серотип L3); С. psittasi - штамм Lory, еге-чы Loth, ггамч СМ; С. pneumoniae - штамм TV-133, игамм I0L-209 .

Антигены, Корпускулярный ант'.гген штамма Й1 (НА), в красного в культуре клеток -1-929, получали ультра® лггрифупфо-¡анием в градиенте платности радиоселектана ; кспольгепали ' акже частично очищенные 5%, 20% суспензии оболочзк желточных ¡эшков развивающихся куриных эмбрионов. инфицированных разными гтаммами хламкдий; препараты антигенов других видов ыигсрэорга-иэмор: Legionella pneumophila, Riikett^ia prcwazekii, R. ty-

phi, Streptococcus группы A, E. coli» Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, Neisseria gonorrhoeae, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum.

Животные. В работе использовали самок 2-3-х месячных мышей линии BAL8/0 весом 18-20 г.

Схемы иммунизации животных. Для получения первичного и вторичного ответа н' антигены С. trachomatis животных иммунизи-pOL ли различными дезами корпускулярного антигена (20-600 мкг) и суспензией инфицированных оболочек желточных мешков (10 -10 микробных клеток) вну*рибрюшитю, внутривенно и внутрикожно 2-7 раз с иктерваЗГом в 1-2 недели. На 7-е сутки после последней иммунизации у мышей брали кровь из хвостовых сосудов.

Получение моноклональных антител. Гибридизацию клеток ми-еломы мыши со спленоцитами иммунизированных мышей проводили пс общепринятой методике Kohler и Mi Istein (1975). Для гибридизации использовали линию миеломы BALB/c мышей - Sp2/0-Agl4 (Sp-2/0) и 50% полизтиленгликоль мол. весом 4000 (Serva, ФРГ).

Иммунологические методы. Иммуноферментный метод (ИФМ) проводили по Engvall, Perlmnn (1971). Реакцию непрямой микро-иммунофлуоресценции (рНмИФ) ставили по Vang, Gravston (1970). Вертикальный электрофорез проводили в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия по методу.Laemmli (1970). Иммуноблотинг выполняли по методу Towbin et al. (1936)

Рротективную активность мококлоначьных антител оценивали по их способности нейтрализовать in vitro ичфекционнноеть штампа Bu-434 С. trachomatis (серовар L2) при заражении культуры клеток L-929.

Очистка моноклональны/ антител. Выделение ч очистку моноклональных антител проводили каприлатно-сульфатным методом

- 9 -

по bfcKinney, Parkinson (1987).

Приготовление конъюгатов моноклональных антител. Конъюгацию м-АТ с пероксидазой хрена проводили перийодатным методом по Nacane (1974). Метку м-АТ флуоресцеипа изстиоцианатом осуществляли по Шгорц (1987).

Диагностику хламидийной инфекции в клинике проводили прямым иммунофлуоресцентным мьгодо» (ПЙФ) путем выявления С. trachomatis в соскобных препаратах (Шаткин, Ковров, 1983). В качестве контрольных диагностикумов использовали коммерческие иммунофлуоресцентную тест-систему ''Chlamyset"(фирма Orion Diagnostica) и иммуноф$рментные тест-системы "Chlanydiazyrrs" и "TestPack" (фирма "Abbott") в соответствии с рекомендациями фирм-изготовителей.

Статистические методы обработки данных. Достоверность результатов оценивали согласно t-критерию Стыодекта. Разбрг-данных охарактеризован с помогаю стандартной ошибки средних величин.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

При первичном скрининге 864 гибридом в И<Ш выявлено 154 (17,8 %) клона, положительно реагирующих с КА С. trachomatis. Повторный скрининг клонов проведенный через две недели показал, что шгеителосинтеаируюшую активность сохранили только 63

■ 4 ■

гибоидомы, что составляло 40,9 Z от положительно реагировавших гибридом и 7,3 % от всех полученных.

Тестирование 63 гибридом в рНмИФ на антигенах трех штаммов, относятся к разным визам Chlairydia позволило 'отобрать гибридомц стабильно синтезирующие м-АТ к штамму Bu-434 С. tra-cnonv-it is (сэрозар L2), из которых два клона синтезировали м-А'Г, реагирующие с антигенами С. trachomatis только в Ш-М.

• - 10 - •

Определение субклассовой принадлежности м-АТ показало, что 5 клонов (¿2АЗ, А2В1, А2/3, С2В2, и БЗР1) продуцировали ентктела субкласса, два клона (В4ВЗ и Е5012) -субкласса,один клон (С6С5) - субкласса и о^лн клон (В2/1) - антитела 1бС2Ь субклосса.

Иммунологическое типирова. га м-АТ в рНаКФ на антигенной панель, состоящей из ¿2 серовариантов СЛгасЬота^з, двух штаьмов Г рэШас! и двух штаммов С.рпэшвоп1ае, показало, что

Таблица I.

Иммунологическая специфичность и-АТ, получанных к СЛг&с)юта11в, в реакции непрлиой ыикроныыунофлуоресценции

Антитела СЬ1алуй1а ■ЬгаоЬ.о1ъа1;1в С.рпешюп1ае C.pвittaoi

А Вз 0 И Е Р Н Ь2 ТТГ-183 ЮЬ** Ьо«1 сы*

А2В1 + + + + 1- + + + + + + + . + •+ + +

С2В2 + + + + + + + + + + + + + + + +

С6С5 ' + + + + 4. + 4- + + + + + + ■ + + +

ВЗР1 + + + + 4 + + + + + + + + + "Г

С1Р1 + + + + + + + + + + + + - - -

Е5012 + + + + + + + ± + + + + - ' - -

В4ВЗ - + - + + - - + + + + - - -

Е41"2 - + - + + + - - + т + - - - -

А2АЗ - + - + + ± - - - + - " . . - - -

Примечание: * - сероаарианти О.'ЬгаоЬотг'Ьэв »* - штаммы С.рпешюш.ае »*« - штаммы 0.pвittaoi

м-4Т А2Б1, С6С5.С2В2 и БЗР1 направлены К общему, родосиецифи-ческому антигену СП1ыпус11а (таб.1}. М-АТ С1Л п Е5С12 реагировали только со всеми испытан '¿ми серовариантами С.ЪгаспотаИч, что свидетельствовало о направленности этих м-АТ к ьидоспе у.-

ескому антигену хламидий. Три м-АТ А2АЗ, В4ВЗ и Е4Г2 взаи-.ейстьовпли с разными группами серовариангов С.гга^го.иаИа, по-видимому, направлены к подвидоспецнфическсй детерминанта. т образом, 6 м-АТ обладали "широким" спектром спэцифич-™и (рода и вида) к 3 м-АТ были неправлены к детерминантам с < кой" (подвидовой) специфичностью. Изучение направленности родоспецифических м-АТ, пропедек-в реакции ксшсурентнсй иггиОищга антител в ИИ с м-АТ 5, меченными пвроксэдазой хрена показало, что м-АТ А2В1, ¡5, С232, и ЮП направлены к одному и тому же (или несколь-

ОП 492 ни 1.00 п

• - ргакциг кечентапс м-АТ ССС5 (кочтралъ)

ОвСбО - иньубодия

— «ГЗЗГубЫОГЯ

ЯЯВХЯ - инжуйэцяя евеьо - чнкуЯйди!;

ЛАЧ^Л — Етасубатщя

— инкубация

СВеОО - инкубация

м-АТ СбСЬ а-АТ С2В2 м-АТ СЗГ1 м-АТ А201

ЮШуняОЙ смв откоЗ иориь-чьяым 1аС М-АТ 0403

»¿о ело

— 1д раэяедеяяч

; I. Ингибииия реакции м-АТ С5С5, меченных' пероксидазой на, с КА СЛтсЬотпаИв

I рядом расположенным) эпитопам родосшцифическогс антигена, ' как полностью кнгибировали взаимодействие с К4. О.Ига->т.а1;1з меченных м-АТ С6С5 (рис I).

Дня выяснения направленности м-АТ к различным антигенам гаоаол1зЬ1з проведено их испытание в Ш1 на модифицированном

кл (прогретом при ЮОоО, обработанном протвиназой к и периода том Na). Показано, что родосгоцифические м-АТ реагировали с термостабильным ангигеном, резистентным к протеиназе и чувствительным к. периодату, то есть были, по-видимому, направ лены к липополисахариду Chlamydia. Видо- и подвкдоспецифи-ческие м-АТ взаимодействовали термостабильными детерминанта ми, резистентными к периодату и чувствительными к протеиназе, что указ1 ;ает на их белковую природу. Два м-АТ А2/3 и В2/1 оказались направлены к термолабильному протеину, так как реак ция с КА С.trachomatis устранялась прогреванием и обработкой

о

протеиназой К.

Сравнительное изучение взаимс эйствия м-АТ в ШМ с модифицированным КА С.trachomatis позволило выявить никоторые осо бенности протекающих реакций, отразившиеся в характере кривых титрования (рис 2). Так, прогревание КА увеличивало интенсивность реакции с родо-, видоспецифическими и подвидосго-цифическими м-АТ А2АЗ и D4B3, причем кривые титрования деух последних м-АТ приобретали более крутой характер. Обработка к, щютеиназой К полностью устраняла реакцию м-АТ, направленных ] белковым детерминантам.

Следует отметить, что характер кривых взаимодействия м-А' с КА 0.trachomatis не зависел от их принедлеззгасти к определенному субклассу IgG.

Электрофорез антигенов С.trachomatis показал, что препараты iA содержали серию компонентов различного молек/лярно: ве а (от 14 до I5Q к,")» среда которых преобладала Фракции ( моп.весом 40 кД, соответствующая сонорном/ белку нарукко! мембраны хламидий - ¡/ОМР.

Метолом эле^трофоретическою иммуноблттянга установлено,

о—ц

А

ас» iso хб9 хм

сп 492 са »£0 1

tQ р8»»вдг??хэ

i {Я Т" 11 м m 11 ч I I'fiWfySfrr^flVrrffiri ^СН'ТО'Я 1,7.3 ■' I

1.М 1 КЗ 2JO IW < CO ч^-j 6.W bio

— 1} р«|МД«С11

сп 402 m

1 JO

b.(G "So tg

1iC 1 no 1.

— fcg рммдлкт

--AC

TJS*" Vvi.....1 isc.....W) TJO

~ '7 P«iMA«m

» J»,

(ге^эя — натвзкый ItA, GGS3C3- прогретый НА,

mnrvi - !tA, обработанный протгинвзсй К, лаааа, - НА, обреботпшшЯ периодатеа Na.

Рис ?,. Взаимодействие получениях u-АТ с модифицированным КА С.trachomatis

А ~ м-АТ С6С5, В - м-АТ c1f1 , Е - м~АТ А2АЗ, Г - ы--АТ s4f2, Д - м-АТ А2/3, S - иглмутиая мптиная сыворотка

M I 2 3 4 б 6 7 8 9 10 II 12 13

ИИ —. — --

ZS

и Е® QQ

Рйп. 3. ИшуноОлотанг и-AT различной специфичности с ICA C.traciiomatie.

Трек 1 - иммунная сыворотка мыши, 2 - м-АТ СбС5, 3 - м-АТ С2В2, 4 - м-АТ A2D1, 5 - м-АТ D3F1, 6 - м-АТ 01F1, 7 - м-АТ А2АЗ, S - м-АТ E4F2, 9 - м-АТ D4B3, 10 - надосадочная жидкость при культивированид миеломшг. клеток, 11 - м-АТ АЗ/2, 12 - м-АТ В2/1, 13 - м-АТ Е5С12, H - стандартный набор маркер ® м.ь.. 94, 67, 43, 30, 20 и 14,5 кД.

что родоспецифические м-АТ выявляли ассоциированный с протеином Л1Ю 0.trachomatis» представленный компонентом мол.весом IU-I2 кД. Видо- и подвидоспецифическио м-АТ реагировали преимущественно о МОМР мол. весом 4L1 кД, при этом реакция некоторых м-АТ наблюдалась также с целым спектром компонентов различного мол.веса (наиболее выраженно с фракциями 36 кД, 44 кД и 49 кД). Два подвидоспецифичоских м-АТ А2А2 и E4F2 взаимодействовали исключительно только с MGMP (рис 3). М-АТ 42/3 реоги-ровали преимущественно о белком мол. весом около 32 кД. Г AT

:/1 не взаимодействовали с КА 0.trachomatis в имукоблотинге, роятно в связи с разрушением этой лабильной детерминанты з юцессэ постановки fie то да.

Исследование протективных свойств полученных м-АТ даказа-, что подвидоспецифичеекив м-АТ А2АЗ (IgG3) и Б4БЗ (IgG2a) азались способными нейтрализовать инфекционную активность 0. schomatis In vitro, что выражалось в снижении показателя IFU nclusion forming units) более чем в 2 разэ (таб.И). Кромэ го, было отмечено что м-АТ А2АЗ не только снижали показатель

Таблица 2.

Результаты нейтрализации ц-АТ пггаыиа Ru-434 C.trachoimtiB in vitro.

■гитела Специфичность IFU0 Индекс нейтрализацж

С6С5 родо- 228,67 + 23,44 0,99

A2D1 родо- 23ч,15 + 19,72 0,97

C1F1 ЕИДО- 272,33 -г 23,86 0,83

E5G12 ЕИДО- 182,33 ± 29,13 1,24

E4F2 подвидо- 174,67 + 17,21 1,30

D4B3 ПОДВИДО- 83, СО + 25,36 -|67

А2АЗ ' подвидэ- 51,67 + 3,06 4,39

КАЖ3 - 226,67 + 20,31 1 ,0

КСЬ - 16,33 -f 5,18 13,за

га.:ечанне: ? - нормальная ьсцятнвя кэдлость, пол>чеЕкая при кулитигироьакиа in vivo мкеломинх клеток t - сыворотка мыин, иммунизированной ис~одним штаммок»

0 - среднее число IPU (inclusion forming ui 4s)

трех пзраллслышх опытов

1 - Ш ^ 1 - отсут'твие ьф^зкта

1 < ИН ^ 2 - слабовирркенный е^фект Ш{ 5> 2 - выраженный еффэкт

1Ги но и тормозили репродуктивный цикл хламидай. Отмечено, что обе 01их м-АТ, несмотря на принадлежность к р .зным субк-лассак 1бС, .Лладали сходным характером кривой при титровании о юдифицированным КА СЛгскАотаИн. :

Таккм сбразог в результате проведенной експерш.,читальной работы получена серия мышиных стабильных гибридом, секретирукь щих м-АТ к раз."гчным антигенам С. 1га~ЬотаИз (таб.3). Часть

Таблг^а 3.

Характеристика и-ЛТ и выявляемых иди антигенов и.ггас1ютаг1в.

г*

Антитела сус;-класг м- .Т Специфичность м-АТ (рКМФ) Взаимодействие м-АТ с модифлцирозашшм КА в ИМ Нейтрализующая активность Мэл.вес а генов СЛ являе)л2х

прогревание протеи— паза К перио-дат На

с л C.p O.pn ...-АТ в иммуноб тинге

А201 Irfi'J + 1 + + + - - 10—12 к

сгВг. + 4 + + 1 + - . 10-12 к,

06^5 + + + + + - - 10-12 К

Ю11 ipG3 4- + + + - 10-12 к,

С1Г1 JgGOa v - - + - - 40 кД*

25012 IgG2a 4 - f - + - 40 кД*

А2АЗ -Г^З + - - + - + + только 4:

Б4ВЗ IgG2a + - - + - Ч + 40 кД*

Е4^2 I6G3 + - - н- - + - только 4'

А2 П 1езз _ - - - - + . 32 кД

В2/1 IgG2a - - - + -

Приис-чмше: С. с - штамме хлэмидкй еиди С.traohor.iatiB С.р - штаммы хлалстдий видя O.pBit'Laoi O.pn - штьммы хлэмидий вида С.pneumonias м-АТ -• >'оноклональш?-> внтлтела рШТ - реакция кепрямей иммунсфлуоресцеяции M'Xil - кумуниферментний мзтод КА - кортускуляридй антиген 0.trachomatis + -. наличие реау.о.ик - - отсутствие ::4ф-кта . - иголедсяьние не прсаодк^ось « - выраженная реакция Ниблшдалась тякже с компонент^« 34. 44 и 49 кД

м-АТ (А2В1, С2В2, С6С5 и D3F1) направлена к поверхостному термостабильному родоспецифическому липополис&хариду Chlamydia. Другие м-АТ (А2АЗ, C1J1, D4B3, E4F2 и E5GI2) взаимодействовали с термостабильными к резистентным к пэриодату натрия видо- и подвидостацифическими детерминантами основного белка нрругзюй мембраны ("ОМР) 40 кД С.trachomatis. Две гибркдокы (А2/3 u В2/1) продуцировали м-АТ, направленные к термолабилии: белковым антигенам.

Для конструирования диагностических препаратов били отобраны родоспецифические м-АТ G5C5 и видогаецнфпческие м-АТ

с»

C1F1. Данные м-АТ не проявляли перс-крестной реактивности с препаратами антигенов ряда других видов микрэаргяш^м^ь (Legionella pneumophila, Hlcketisla prowaaeMi. II.typhi, ¿¡.eol^., Mycoplasma liominia, Streptococcus группы к, Neisseria gonorrhoeae, Salmonella typhimurium, Shigella fi-xncri, Ureaplasina ureali-tycuni).

Изучение активности диагностических препаратов на основе родоспецифкческих и ридоспецифических м-АТ ъ6С5 к C1F1 меченных ФИТЦ, показало, что конъюгат м~АТ С6С5 - СИТЦ выявлял штампы Clilamydia в титрах 1:640 - 1:5120, причем нзиболэе интенсивно реагировал со штаммами C.psittaci (в титрах до 1:5120). Этот факт, может быть, связан с Оолышм удельным весом или данной детерминанты, или самого липополисахар"да у представителей вида C.psittaci. Активность г.Оиьюг&та ь-Д.Т СШ-ЖГЦ так?:е впрьировала. Пропарит в высоких т»!трЗл (1:25ь1 -1:5Т2Ь) еуявлял сэроварнзнтк С. tracheitis "В'" комлл?1 ja, к которому относился штамм лепол* эвзнянй д.:я икм/кизецк: f.r-:c:e?.. Активность пр'йпасатз при выайл-;кии штаммов "О" : гмиле-к^а бчлз очень шпкой, что обусловлено. по-в;:днмочу, резней экспресс?. .Я

этой детерминанты и фиксацией ФИТЦ на Fab -фрагменте молекулы антитела. Поэтому, видоспецифическне м-АТ 01F1 целесообрэЕЖ) немо/ зоза'хь либо в смеси с родоспецифическими м-АТ, либо в непрямом методе иммукофлуорвсценции.

Диагностический препарат на основе м-АТ С6С5, меченных пэроксидазой хрена, был использован для определения чувстви-телбнос~и прямого ИФМ при выявлении антигенов С.trachomatis.

ОП Я4

inyVn

Oil 492

ОСЭОО- кативлые ЭТ

АА-^АД - патианые РТ

ГУ Н 1-1 - натиЕнал смесь ОТ и РТ

»»•О» — прогрет е ЭТ

- прогретые "Т

- прогъетпя сиесь Э'Г п FT ----- фоноьый уросень

I.

1'ио. 4. Чувстии?елы1сстъ прямого при гариделении l.tra-

OllOJlK xt 1 В .

Л- пги ггрогр<?оннчи проСм, С и В - trpvi эпредолегсш различных морфологических форм хламидой.

вми выявлена зависимость порога определения Ентигенов от тор-зльной обработки тестируемых проб (рис 4 А,5,В). Установлено, то диагностический препарат выявлял нативные микробные клет.'си hlaraydia в дозе 72-120 иг, а при лрогрвваиии пробы (при ООоС, 60 мин) в дозе 4-14 нг. Таким образом, термообработка робы увелччивзла чувствительность метода, в среднем, в 13 аз. Установлено, что препарат м-ЛТ 06С5, меченных пер кспдс-ой, более аффективно определял элементарные тельца С. trachorra-1з (ЭТ) как нативные, так и прогретые. Показано, что чуЕсавк-эльность прямого И2М при прогревании проб увеличивалась з 27 аз, когда пробы содержали одни ЭТ я только в 3,6 pss - при □следовании образцов, содержащих только ретикулярные юльца • .trachomatis (РТ). Такая разница чувствительности АШ, версию, является отражением изменения антигенной структуры (ilamydia в процессе ээ репродукций, то есть при пресбразсва-ни размножающихся РТ в ЗТ нсвто поколения микроорганиЕмз.

Диагностический препарат на основе флуоресцирующих ро-зспецифических м-АТ G6G5 был испытан на клиническом í зтеркале г 323 больных. Параллельно провбдено тестированы проб с спользоввЕпегл зарубежных коммерческих тестов "Clilamyset Anti-зп" (фирма "Orion"), "Ghlainydlazyme" (фирмв "Abbott") и Te3tPack" (фирма "Abbott"). Полная корреляция результатов зы-влена при параллельном тестировании проб диагностическим прокатом на основе м-АТ G5C5, меченных ФИТЦ, и коммерческими «мунофдуоресиэнтным тостом "Cblarcytfet Antigen" и икмунофер-энтным набором "ChlaT-ydiazyroe". При исследованы! клзплг.зскчх Зразцсв иммукофлуоресцонгннм ш:спериментьльнкм диагно. летут/см коммерческим мкмузофэрментякм тестом "Test Ра-ре?"льтаты эвпадвлч в 76.9 % случаев. При этом установлено что, в 23,1 %

Таблице 4

Диагностика урогенятальной гпвыидийяой инфекции ПИ® катодом при ислользояании диагностического препарата, созданного на основе ы-АТ С6С5.

Диагноз Обследовано Выявлены хламидии %

НГУ, ИГУ 836 514 61,5

Хронический вднекеит 83 7 •8,4

Ко-пплт 65 3 4,6

Первичное бесплодие 67 5 Г ' 9,0

Вторичное бесплодие 45 1 2,2

Дисплззия 43 9 20,9

Беременность -1S0 11 5,8

КеыгаЕшнзанив 153 13 8,5

Прочие из kííi 45 25 55,6

ОАА* 12 4 33,3

Лейкоплакия 8 8 100

Острей уретрит а • • J 37,8

Хронический уретрит 3 2 66,7

К.йтаральннй ppOGTiJMT 4 1 25

2 , 1 50

Кандаломатоз 2 о 100

Иос-п1; родовое *.>бс.Л5доь arate 3 . J 100

Конъюнктивит ноБорогхдеичУТ 3 л 33,3

ЕСЕГО ' 1527 5ЬЭ 30,6

Прлмечаш:*. * - острый акуиерский ana.wiF.s

лучаях расхождения результатов, экспериментальный диагности-ум выявлял хламидии, тогда как икмунофзрментный набор 'Те.^ аск" давал отрицательные результаты. Получэнкые данные овиде-эльствуют о большей чувствительности ¡экспериментального пре-арата на основе флуоресцируяцих м-АТ С605.

Данные результаты позволили провести обследование 1527 ольных с различной патологией (венерические и акушерст'о-пгае-ологические заболевания) на наличие СЛгасЬспа^з в уретра и врвикальном канале с помощью экспериментального диагностикума а основе флуоресцирующих м-АТ С6С5. Хламидии выявляли ГНИ ме-

с»

одом в соскобшх препаратах из уретры или цврзякса (таб 3). ри этом, наиболее инфицированными группами обследован, .х были ольные негокококковым и постгонококкоеум уретритом (гнф-широ-анность 31.5 %), дисплазией шейки матки (инфицированность 0,9 %), женщины с первичным бесплодием (9,0 %) и кендиш, традащие невынашиванием беременности (8,5 %).

Таким образом, использование ижуяофлуоресцчнтного диаг-остикумс позволило выявить инфицированное^ О.ггаоИогпч^я рогениталий у 33,6 % обследованных пациентов.

вывода:

1. Получены II стабильных мышиннх гибридом, продуцирующих оноклональные антитела к различным ангагенам СЫатусПа Ьга-hoшatiз, что познс лет проводить их дифференциальную ияенти-икацию.

2. Изучение иммунологиче склй специфичности полученных м:-оклонзлыых антител с антигенами различных сергЕаризнг-"?■ С. гас^ста^з, двух штачмо? С.рз1иас1 и двух штаммов С.^пеоглс-1ае выявило их различие по родо-, ьядо- и подв"цоспециф;:-еской активности.

3. Установлено, что четыре моноклональных антитела реагируют с поверхостным, термостаблльнкм, чувствительным к перио-дат*' родоспецкфическгал ^шополисахеридом СЫ.оту<11а; пять моноклональных антител реагируют с видо- и подЕидоспоцифическими тормост^илышьсг да тврмшантсми основного «'"-лка наружной мембраны (ЫОМР) 40 кД С.и-аспс.пгШ.а; два моноклональных антитела рэагапуш с термолаолльным протеином 32 кД и высоколабильнш неидентифЕстрэвнннкм белком 0.1;гве!юя)а1;18.

4. При изучении бютгагкчвских свойств Полуниных моноклональных ачтктал, спэооСпость нейтрализовать инфекционную активность С.ъга£11о:па1;1з и тормозить цикл ее размножения выявлена только у двух мойоюганалышх антител, направленных к подеи-дпиюцкфкчесхим детерминанты« М0;ЛР.

5. На ос.чово рано- и видоссоцифичоских моноклональных. вн-■гител получены г.эрвь-э вксчерншнталыше серии отечественных дчвгноогйчвсчзге препаратов для выявления антигенов СЛгасЬо-плИэ тгряь-ым игл.^'нсфг.уорвсцзатнш и шмунофэрмбнткь'м методами, которые по лв-:;эй'чувствительности 11 слзцнфичносги не уступают зарубежным коммерческим аналогам.

6. Исзользовазма экспериментального даапюстикума на основе флуорооикрукеих мспкнглокьлытх антител к С.1;гас1юпт1а при исследовании клинических материалов, получег.шх от 1527 больных с рп&личюмл венерическим;: и акуаэрско-гинекологи-чес-кики аебалаввнал?.^, выязйлэ гсгфищфованность уроге*згеолий у 30,6 % обслодовякршс пациентов.

7. Результат лабораторного изучения кллнячеокой. апробации нррвых отвч-эстьвяквх дзагкос^оо}и-ь, разработали«» па ссно-1,ь полученных коаоклоаашяис я/ггиглл, позволяю? рекомендовать кх дзя внедрения г. чргьгсод ,чр£зе-охрл:.'ояйя дли диагностика

инфекций, вызываегах С.trachomatis.

1. Зотова И.Ф.,Кутлич /.В., Орлова O.E. Персисгентнея хламидайная инфекция в моделях "in vitro" // Tea. докл. 12 Мечникопсой конф. молодых ученых-медиков "Современные вопросы вирусологии, микробиологии и иммунологии"- Одесса, 12-14 сент. 1933 г.

2. Зотова И.Ф., Кутлин A.B., Орлова O.E. Совершенствование метода диагностического выделения хламидий в культуре клеток // Тез. докл. обл. научи. конф. молоды:; уезнх "Эпидемиология, микрсбио тогия и иммунология бактериальных и вщ снах инфекций"- Ростов-на-Дону, 17-20 октЛРвЭ г., С.12У-122

3. Клиническое использований моноклокальных аг-тктел плотив .ЧПО Chlanydia для диагностики -"огоннтального хлсмкдиоза / Мильтккьга А.П., Кутяин Л,В., Яилевнч А.З. и совет.// Тез. докл. 9 Всесоюзн. съезда дерматс-венэпологов -Алма-Ата, 23-27 сент. 1991 г., -С.62.

4. Моноклоьвльные антитела различной специфичности к Chlamydia / Кутлнн А.В, ДробышеЕская Э.И., Шаткин A.A., IlecTS-ренко В.Г. // Актуальные вопросы диагностики и лечения тлями-дийных инфекций / Мат. В^есоюз.Сов. -V.,-1990.-С.61-62.

5. Получение р"тихламидийных моноклинальных антител / Кутлин A.B., Дробкшенская З.К., Паткин A.A. и соазт. Л' Актуальные микробиологические и клинические проблемы хлгмндийнкх инфекций: Сб.тр./ Под ред. Шзткгаа A.A., Ор$илы К. -М., -1990.-с.23-25.

•л. Monoclonal antitoc'iaa to CiLiamydia trachomatis for the development of expeiv.icrtal diagnostic tests / KutlinA.7.,

DrobyshevsKaya E.I., Schatkin A.A. et al. // Proc.Intera.Ccnf. on Med. Biotechnol.,Immun. ,AID3, Lenlnp'ad, USSR, June 12-18, -1"91. -F2-G. '

7. Кутлин A.B., Панкратова B.H., Дробышевскоя З.И. Шат-кин А.' Методкчоские рекомендации "Опред ление хламидий с помощью флуоресцирующих монсклонзльнкх антител". Утверждены на заседании Ученого Совета НИИЭМ им. К.Ф.Гамалеи 21 марта 19Э1 г. -М-, -1991, -6с.

8. Панкратова В.Н., Орлова O.E., Кутлин А В., Горовиц 3.0., ТимшчбЕЭ O.A., Маликова М.В., Нехороших З.Н. Методические рекомендации "Лабораторная диагностика хламидиозов". Утверждены Минздравом СОСР 26 декабря 1990 г. -М.,-1991,-43с.