Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Мониторинг состояния биотканей методами поляризационно-отражательной и флуоресцентной спектроскопии
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика
Автореферат диссертации по теме "Мониторинг состояния биотканей методами поляризационно-отражательной и флуоресцентной спектроскопии"
На правах рукописи
ОВЧИННИКОВА ИРИНА АЛЕКСЕЕВНА
МОНИТОРИНГ С0СТ01ШЯ БИОТКАНЕЙ МЕТОДАМИ ПОЛЯРИЗАЦИОННО-ОТРАЖАТЕЛЬНОЙ И ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ
СПЕКТРОСКОПИИ
03.00.02 - биофизика
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук
Саратов - 2005
Работа выполнена на кафедре оптики и биомедицинской физики Саратовского государственного университета
Научный руководитель: доктор физико-математических наук,
профессор Синичкин Ю.П.
Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук,
профессор Скрипаль A.B. кандидат физико-математических наук, Мельников А.Г.
Ведущая организация: Саратовский государственный
медицинский университет
Защита диссертации состоится «iS »Л 2005 г. в на
заседании диссертационного совета Д 2l2.243.05 в Саратовском государственном университете (410012, г. Саратов, ул. Астраханская, 83).
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке СГУ.
Автореферат разослан « /О » ¿Md/SlJ 2005 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, д. ф.-м. н., профессор CA В .Л. Дербов
Zoob-Ч
\ЪЧЬ2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы
В настоящее время активно развиваются и находят широкое применение оптические методы исследования, диагностики и визуализации состояния биотканей in vivo. К наиболее распространенным оптическим методам диагностики биотканей можно отнести методы отражательной и флуоресцентной спектроскопии, которые успешно используются в диагностических целях в различных областях медицины. Диффузно отраженное биотканью излучение и автофлуоресценция (АФ) биоткани несут информацию о поглощающих и излучающих свойствах среды, особенностях структуры биоткани.
Исследования спектрального состава диффузно отраженного света и АФ биоткани позволяют качественно оценить ее морфо-функциональное состояние и выявить наличие патологии. Однако, помимо качественной оценки морфо-функционального состояния биоткани, необходимо выяснить причины возникновения ее патологических изменений, для чего необходимо получение информации о количественных изменениях, происходящих в структуре и биохимическом составе биоткани. Большинство исследуемых методами отражательной и флуоресцентной спектроскопии биотканей представляет собой сложные по структуре многокомпонентные многофункциональные среды, поэтому количественная оценка по спектрам диффузного отражения и АФ содержания в биотканях биохимических компонентов является достаточно сложной задачей, прежде всего из-за ограниченности измеряемых параметров (коэффициента диффузного отражения и интенсивности АФ). В связи с этим разработка спектральных методов анализа структуры биоткани и оценки содержания в ней биохимических компонентов представляет определенный интерес
Спектр диффузного отражения биоткани позволяет определить спектральный состав «эффективной оптической плотности» исследуемого объекта - параметра, который является источником получения количественной информации о поглощающих свойствах биоткани. Рассеяние света в биоткани приводит к тому, что характер спектра «эффективной оптической плотности» часто отличается от спектра поглощения компонентов биоткани, что приводит к ошибке в количественной оценке содержания в ней хромофоров. Поэтому важной является задача выяснения условий, при которых различия между данными спектрами минимальны.
Так как спектральный состав диффузно отраженного света и АФ биоткани определяется одними и теми же поглощающими и рассеивающими свойства среды, то комбинированное использование результатов измерений спектров диффузного отражения и АФ биоткани в значительной мере расширяет возможности диагностики биоткани и получения информации о ее структуре и количественном содержании в ней биохимических компонентов. Поэтому перспективным методом исследования биотканей является комбинированный метод отражательной и флуоресцентной спектроскопии, который в настоящее время недостаточно развит.
Если источником АФ биоткани являются флуорофоры, расположенные в глубине среды, то спектральный состав измеряемой АФ биоткани искажается по сравнению с истинным спекхром флуоресценции из-за рассеяния и частичного поглощения выходящего из среды излучения (эффект внутреннего фильтра). Так как для получения дополнительн инах возникновения
патологических изменений биоткани необходимо знать, содержание каких флуорофоров изменилось в результате возникновения патологии, то такую информацию может дать истинный спектр АФ биоткани, который может быть получен из наблюдаемого путем коррекции проявления эффекта внутреннего фильтра в спектре АФ биоткани. В связи с этим представляет интерес разработка метода коррекции АФ биоткани, основанного на комбинированном использовании результатов измерений спектров АФ и диффузного отражения.
Патологические изменения в биотканях, связанные с изменениями в ее структуре или биохимическом составе, проявляются в спектральных изменениях АФ биоткани в тех или иных спектральных диапазонах. Для диагностики происходящих в биоткани морфо-функциональных изменений перспективно использование многоволнового метода флуоресцентного анализа, основанного на сравнении интенсивности АФ нормальной и паюлогической биоткани, измеренной на нескольких длинах волн. Выбор соответствующих длин волн, на которых максимально проявляются различия в АФ нормальной и патологической биотканей, очень важен не только с точки зрения флуоресцентной диагностики биоткани, но и с точки зрения ее приборного воплощения.
Одним из путей решения данной задачи являются исследования флуоресценции и диффузного отражения света искусственно созданных структур (фантомов), которые по своей структуре и биохимическому составу подобны реальным биологическим объектам. Такие исследования позволяют сформулировать так называемое «корреляционное выражение», включающее в себя комбинации измеренных на выбранных длинах волн интенсивностей АФ и коэффициентов диффузного отражения объекта, которое дает возможность оценивать состояние биоткани.
Одним из преимуществ оптических методов исследования биологических сред является возможность получения информации о среде путем анализа поляризационных характеристик рассеянного средой излучения. В биомедицинских приложениях использование поляризованного излучения в основном связано с детектированием обратно рассеянного света. Особенности формирования поляризационных характеристик обратно рассеянного света с начальной линейной поляризацией приводят к эффекту остаточной поляризации, степень которой зависит от рассеивающих свойств среды. Однако практически не исследовано влияние поглощающих свойств среды на спектральное распределение степени остаточной поляризации обратно рассеянного биотканью поляризованного излучения. Такие исследования представляют интерес, поскольку могут явиться основой нового поляризационного метода оценки количественного содержания хромофоров в биоткани.
Эффективность поляризационного метода диагностики биоткани обусловлена различным вкладом рассеяния света в ее поверхностных и глубинных слоях в спектральный состав ортогонально поляризованных компонентов обратно рассеянного света. Исследования разностного спектра интенсивностей ортогонально поляризованных составляющих обратно рассеянного биотканью света позволяют получить информацию о наличии хромофоров в ее приповерхностном слое, исключая глубинные. Такие исследования не проводились и являются актуальными, так как на их основе возможна разработка нового метода исследования приповерхностных слоев биотканей, толщины которых сравнимы с длиной деполяризации в среде зондирующего света.
Во многих биотканях, имеющих фиброзный характер, в том числе в дермальном слое кожной ткани, имеет место определенная оптическая анизотропия. Более того, оптическое двулучепреломление на микроскопическом уровне обнаружено в роговом слое кожной ткани. Флуктуации анизотропии среды не только дают вклад в рассеяние распространяющегося в ней света, но и определенным образом влияют на поляризационные свойства рассеянного излучения. Адекватная интерпретация результатов поляризационных измерений кожной ткани требует исследований влияния оптической анизотропии кожи на поляризационные характеристики рассеянного средой света.
Вышеперечисленные факты и обстоятельства позволяют сформулировать основную цель диссертационной работы и определить круг задач, не затронутых другими исследователями и решаемых в данной работе.
Цель и основные задачи работы
Основной целью диссертационной работы является развитие оптических методов диагностики и мониторинга состояния биотканей, основанных на анализе спектрального состава диффузно отраженного биотканями света и их автофлуоресценции, а также состояния поляризации обратно рассеянного биотканями линейно поляризованного света.
В рамках работы решались следующие задачи:
1. Исследование возможности использования спектрального состава параметра «эффективной оптической плотности» биоткани для количественной оценки содержания в ней хромофоров. Определение условий, при которых различия между спектрами поглощения и «эффективной оптической плотности» биоткани минимальны.
2. Исследование влияния поглощающих свойств биоткани на спектральную зависимость степени поляризации диффузно отраженного света с начальной линейной поляризацией и разработка на основе полученных результатов методики количественной оценки содержания в биоткани хромофоров.
3. .Исследование спектрального состава разностного спектра ко- и кросс-поляризованной составляющих диффузно отраженного биотканью линейно поляризованного излучения и разработка на основе полученных результатов методики определения структуры ее приповерхностного слоя.
4. Разработка поляриметрической методики определения оптической анизотропии рассеивающих сред, в том числе биотканей, и исследование на основе разработанной методики оптической анизотропии кожной ткани.
5. Разработка метода коррекции спектра АФ кожной ткани, основанного на комбинированном использовании результатов измерений спектров АФ и диффузного отражения биоткани.
6. Исследовать УФ возбужденную флуоресценцию модельных образцов, адекватно отражающих структуру и биохимический состав цервикальной ткани В норме и патологии, и на основе полученных результатов сформулировать корреляционное выражение, позволяющее оценивать происходящие в биоткани морфо-функциональные изменения.
Научная новизна работы
Научная новизна работы определяется комплексом впервые выполненных in vivo и in vitro исследований и впервые полученных результатов, которые сводятся к следующему:
1. Впервые исследовано влияние поглощения рассеивающей среды на степень остаточной поляризации обратно рассеянного излучения при зондировании среды линейно поляризованным светом.
2 Разработан новый метод ш vivo количественной оценки содержания в биоткани поглощающих компонентов, основанный на измерении спектральной зависимости степени остаточной поляризации диффузно отраженного биотканью линейно поляризованного света.
3. Разработан новый метод in vivo оценки толщины эпидермиса кожной ткани, основанный на измерении разностного спектра интенсивностей ортогонально поляризованных составляющих диффузно отраженного кожей линейно поляризованного света.
4. На основе разработанной поляриметрической методики впервые выявлена оптическая анизотропия кожной ткани на макроскопическом уровне.
5. Разработан новый метод получения истинного спектра АФ кожной ткани путем коррекции проявления в наблюдаемом спектре эффекта внутреннего фильтра, основанной на комбинированном использовании результатов измерений спектров АФ и диффузного отражения кожи.
6. Сформулировано новое корреляционное выражение для оценки морфо-функциональных изменений в цервикальной ткани, включающее в себя комбинации интенсивностей флуоресценции и коэффициентов диффузного отражения биоткани, измеренных на определенных длинах волн.
Практическая значимость
Результаты, полученные в процессе проведенных исследований, существенно расширяют представления о комбинированном методе флуоресцентной и отражательной спектроскопии ш vivo биотканей, что в свою очередь может иметь значение для целого ряда применений. Полученные результаты найдут практическое применение в биологии и медицине, в частности, в результате выполнения работы разработан комплекс методик для оценки морфо-функционального состояния биотканей человека, позволяющий в условиях in vivo получать объективную информацию о степени выраженности патологических и функциональных изменений, а также оценивать эффективность лечения.
Полученные в работе результаты использованы в учебном процессе, а также при выполнении исследований по следующим грантам:
• INCO-COPERNICUS (проект № 1С 15-СТ96-0815);
• Грант РФФИ «Государственная поддержка ведущих научных школ РФ» (проект № 96-15-963 89);
• Грант РФФИ «Государственная поддержка ведущих научных школ РФ» (проект № 00-15-96667);
• Грант АФГИР «Научно-образовательный центр нелинейной динамики и биофизики» (проект № REC-006);
• Грант Президента РФ на поддержку ведущих научных школ № НШ-25.2003.2;
• Грант Министерства образования Российской Федерации № 01.2003.15221;
• Грант Министерства образования РФ по Программе "Фундаментальные исследования в области естественных и точных наук" № Е02-3.2-498;
. Грант РФФИ № 04-02-16533.
Достоверность результатов диссертации
Достоверность экспериментальных результатов обеспечивается использованием современной измерительной аппаратуры, апробированных экспериментальных методик, воспроизводимостью результатов экспериментов, а также их согласованием с экспериментальными результатами, полученными другими авторами.
Основные положения и результаты, выносимые на защиту
1. Степень остаточной поляризации обратно рассеянного биотканью света с исходной линейной поляризацией зависит от поглощающих свойств рассеивающей среды, при этом спектральная зависимость степени остаточной поляризации качественно совпадает со спектральной зависимостью параметра «эффективная оптическая плотность», определяемого по спектрам диффузного отражения биоткани.
2. Наличие хромофора в приповерхностном слое биоткани толщиной, сравнимой с длиной деполяризации линейно поляризованного света, проявляется в уменьшении интенсивности разностного спектра ортогонально поляризованных составляющих диффузно отраженного биотканью линейно поляризованного света в спектральной области поглощения хромофора.
3. Результаты исследований оптической анизотропии кожной ткани. Цельная кожная ткань крысы обладает оптической анизотропией на макроскопическом уровне, при этом средняя разность показателей преломления среды для обыкновенного и необыкновенного лучей в спектральном диапазоне 550-700 нм составляет величину порядка 0,00023.
4. Метод коррекции проявления в измеряемом спектре АФ кожи эффекта внутреннего фильтра. Корректирующим фактором служит спектр (Л),
при этом истинный спектр флуорофора кожной ткани определяется путем деления измеренного спектра на фактор коррекции.
Апробация результатов
Основные результаты работы докладывались и обсуждались на
международных и российских конференциях:
1. Всероссийском семинаре «Проблемы и достижения люминесцентной спектроскопии», (Саратов, 1998 г.);
2. Международном междисциплинарном научном семинаре и осенней школе молодых ученых «Методы светорассеяния в механике, биомедицине, материаловедении», (Саратов, 1998 г.);
3. Международной школе для молодых ученых и студентов по Оптике, Лазерной физике и Биофизике (Saratov Fall Meeting SFM'99) (Саратов, 1999);
4. Международной школе для молодых ученых и студентов по Оптике, Лазерной физике и Биофизике (Saratov Fall Meeting SFM'2000) (Саратов, 2000);
5. Первом Евразийском конгрессе по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика - 2001» (Москва, 2001);
6. Международной школе для молодых ученых и студентов по Оптике, Лазерной физике и Биофизике (Saratov Fall Meeting SFM'2001) (Саратов, 2001);
7. 6-ой Путинской школе-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века», (Пушино, 2002);
8. Международной школе для молодых ученых и студентов по Оптике, Лазерной физике и Биофизике (Saratov Fall Meeting SFM'2002) (Саратов, 2002);
9. Международной школе для молодых ученых и студентов по Оптике, Лазерной физике и Биофизике (Saratov Fall Meeting SFM'2004) (Саратов, 2004);
и на научных семинарах в Саратовском государственном университете.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 11 работ (9 статей и 2 тезисов
докладов на научных конференциях).
Личный вклад соискателя
Личный вклад соискателя заключался в участии в постановке задач, проведении экспериментальных исследований, обработке и обсуждении полученных результатов.
Структура и объем работы
Диссертация состоит из введения, основной части, содержащей 3 главы, заключения, списка цитируемой литературы из 106 наименований. Текст диссертации изложен на 148 страницах машинописного текста, содержит 64 рисунка.
Краткое содержание работы
Во Введении обоснована актуальность темы, сформулирована цель и задачи работы, ее научная новизна и практическая значимость, сформулированы основные результаты и положения, выносимые на защиту, отмечена апробация работы, публикации и личный вклад автора, определена структура и объем диссертации.
В Главе 1 рассматривается возможность проведения количественной оценки содержания хромофоров в биотканях методами отражательной, поляризационной и флуоресцентной спектроскопии.
В первом подразделе рассматривается вопрос, касающийся количественной оценки содержания хромофоров по спектрам Такая оценка проводилась
путем анализа величины «эффективной оптической плотности» среды OD, связанной с коэффициентом диффузного отражения Rd соотношением:
OD = -lg(/?¿). (1)
В отличие от прозрачных или слабо рассеивающих сред, для которых величина оптической плотности D(X) пропорциональна поглощению среды,
величина эффективной оптической плотности рассеивающей среды зависит как от поглощающих, так и рассеивающих свойств среды. Проведенные модельные исследования на водно-молочных растворах крови и меланина показали, что в случае однородного распределения хромофоров по объему среды рассеяние света приводит к искажениям измеряемых спектров эффективной оптической плотности по сравнению с истинными спектрами поглощения содержащихся в среде хромофоров (рис. 1). Эти искажения проявляются в увеличении СШ(Л) по сравнению с 0(Х) с ростом длины волны. Анализ полученных экспериментальных данных, проведенный на основе диффузионного приближения теории переноса излучения, позволил сделать вывод, что спектры поглощения и «эффективной оптической плотности» биоткани качественно совпадают в спектральной области, где транспортный коэффициент рассеяния биоткани слабо зависит от длины волны зондирующего излучения.
НО 9» «О «0 700 по
Рис. 1. Спектры оптической плотности водных растворов крови (а) и эффективной оптической плотности растворов крови в молочной суспензии (б), полученные из измерений коллимированного пропускания и диффузного отражения, соответственно.
1 - С= С0; 2 - С = 0.5 С0; 3 - С = 0.25 С„; 4 - С = 0.125 С0; 5 -С = 0.0625 Со (Со - базовая концентрация).
В случае локализации хромофоров в приповерхностном слое биоткани это ограничение снимается, и величина эффективной оптической плотности линейно зависит от концентраций содержащихся в биоткани хромофоров. В частности, in vivo оценка хромофорного состава кожной ткани (меланина и гемоглобина) возможна на основе простой феноменологической модели для анализа спектра Rj(X), при этом величина OD определяется следующим образом:
OD = 21g{exp[(CfCme/¿2) + (£°jCmyd,) + (^rCdeoxyd3)]} - lg(^4), (2)
где e"exJ¡ и £f,"¡xy - коэффициенты экстинкции хромофоров; Cme¡, Cme¡ и
Сте1 - концентрации хромофоров в соответствующих слоях кожной ткани толщиной d2 и d3 ; Rd 4 - коэффициент диффузного отражения дермы.
Во втором подразделе рассматривается вопрос, касающийся возможности оценки содержания хромофоров в биоткани по спектрам степени остаточной поляризации Pl(X) обратно рассеянного линейно поляризованного излучения, которая в случае изотропной среды без двулучепреломления определяется следующим образом:
Р-ШЫ (3)
1 </„> + </х>
где (/ц) и - средние значения интенсивности линейно поляризованных
составляющих рассеянного поля с взаимно ортогональными направлениями вектора поляризации (ко-поляризованной и кросс-поляризованной составляющих).
Кратко изложена феноменологическая модель релаксации линейной поляризации света, распространяющегося в многократно рассеивающей среде Степень поляризации может быть представлена в виде интегрального преобразования функции плотности вероятности р(й) эффективных оптических путей парциальных составляющих для заданных условий наблюдения рассеянного поля:
Jexpj^-^ \p(s)ds
Р=6----, (4)
где Çp - длина деполяризации рассеивающей среды, контролирующая скорость релаксации исходного состояния поляризации зондирующего пучка при его распространении в среде. Длина деполяризации зависит от оптических свойств и размеров рассеивающих центров. В режиме многократного обратного рассеяния максимальное значение 41* наблюдается в случае изотропного рассеяния (g» 0); с ростом параметра анизотропии длина деполяризации монотонно убывает до значений Г при g «0,91-Я),93.
Далее в главе приведены результаты исследования влияния поглощения многократно рассеивающих сред на степень остаточной поляризации обратно рассеянного излучения. Получено приближенное выражение, описывающее зависимость степени остаточной линейной поляризации обратно рассеянного излучения от оптических характеристик (поглощения ^ и рассеяния ц'г) среды:
00 ж 1.5 ехр
л/зО
(5)
где I - средняя транспортная длина рассеяния.
Соотношение (5) показывает, чю селективное поглощение рассеивающей среды, обусловленное наличием определенных хромофоров, должно приводить к возрастанию степени остаточной поляризации обратно рассеянного излучения в спектральных интервалах, соответствующих полосам поглощения хромофоров.
Данный факт был экспериментально проверен на модельных средах (молоко с введенными пищевыми красителями) (рис. 2).
Далее в главе приведены результаты ln vivo поляризационных измерений кожи человека с УФ-наведенной эритемой разной степени. Возрастание степени эритемы Е отражает факт увеличения поглощающих свойств кожной ткани, обусловленного ростом концентрации крови в папиллярной дерме, что приводит к увеличению степени остаточной поляризации в полосах поглощения гемоглобина.
Спектры степени остаточной поляризации и эффективной оптической плотности кожи, определяемой из спектра диффузного отражения кожи, (рис. 3) качественно совпадают, что позволяет путем измерения спектров степени
остаточной поляризации отраженного кожей излучения селективно отслеживать изменение концентрации хромофоров в кожной ткани.
Рис. 2. Спектральные зависимости степени остаточной поляризации для цельного молока при различных
концентрациях красителя (1-4 - увеличение поглощения)
530 «00
Длина волны, нм
а б
Рис. 3. Спектры степени остаточно поляризации отраженного излучения (а) и эффективной оптической плотности (б) кожи человека с эритемой разной степени. 1 -£= 157; 2 -£ = 223; 3 -£ = 249; 4 -£ = 275; 5 -£ = 290
Таким образом, спектральный анализ степени остаточной поляризации, в том числе и с использованием технологии введения в исследуемые среды пробных веществ с селективным поглощением, может быть предложен в качестве нового метода исследования оптических свойств многократно рассеивающих сред, включая биоткани.
Далее в главе рассматривается возможность оценки по спектрам АФ содержания хромофоров. Приведена феноменологическая модель кожи, позволяющая ввести в качестве характеристики поглощающих свойств кожной ткани величину «эффективной оптической плотности» кожи (Ю*, которая определяется концентрациями хромофоров:
СЮ' ,Хп) = Х^ЬЩ^^^ = 18^^^) + (Дд)]сд}], (6)
где /0(Я£у) и 1Лр(&р1) ' интенсивности возбуждающего излучения и АФ;
А^) - квантовый выход флуоресценции кожи (коллагена дермы); е,{Хо) и " коэффициенты экстинкции хромофоров кожи на длинах волн
возбуждающего излучения и флуоресценции, С, - концентрация, d, - толщина слоя, где они залегают, а(/- коэффициент поглощения возбуждающего света флуорофорами. Изменение концентрации хромофоров приводят к изменению интенсивности АФ кожи и, соответственно, величины OD .
В заключительной части главы 1 приведены результаты сравнительного анализа оценки хромофорного состава биоткани с использованием величин эффективной оптической плотности, полученных из спектров диффузного отражения и АФ биоткани, а также степени остаточной поляризации. Данные величины наиболее эффективны для определения относительного изменения поглощающих свойств биоткани, при этом методы дают практически одинаковые результаты. Для абсолютных измерений концентраций хромофоров в кожной ткани наиболее перспективными являются измерения OD, так как в расчетное соотношение входят величины, которые можно либо рассчитать, либо получить в результате дополнительных измерений (в частности, измерения кожи vitiligo).
В Главе 2 рассматриваются возможности оценки состояния биоткани с помощью метода разностной поляризационной спектроскопии.
Метод основан на особенностях формирования поляризационных характеристик обратно рассеянного света: отраженный приповерхностным слоем свет сохраняет состояние поляризации зондирующего света, в то время как свет, рассеянный глубинными слоями, полностью деполяризован. В результате интенсивность ко-поляризованной составляющей рассеянного света превышает интенсивность кросс-поляризованной составляющей, при этом в разностном спектре содержится информация о хромофорах, содержащихся в приповерхностном слое биоткани.
Согласно используемой в работе феноменологической модели релаксации состояния поляризации распространяющегося в рассеивающей среде линейно поляризованного света толщина приповерхностного слоя, дающего вклад в величину остаточной поляризации обратно рассеянного света, сравнима с длиной деполяризации :
где /0 - интенсивность зондирующего света.
Эксперименты с модельными объектами, представляющими собой кювету с рассеивающей средой (суспензия молока разной концентрации), внутри которой параллельно передней стенке помещался плоский светофильтр (ЗС-7), показали, что в отличие от спектральных распределений степени остаточной поляризации обратно рассеянного средой линейно поляризованного излучения разностный спектр ко- и кросс-поляризованных составляющих позволяет получить данные о глубине локализации поглощающего компонента. По мере увеличения глубины локализации поглотителя его местоположение переходит из области малократного в область диффузного рассеяния света, при этом в разностном поляризационном спектре теряется информация о поглощающих свойствах фильтра (рис. 4). Потеря информации происходит при глубине локализации фильтра свыше Ь > 12 мм, которая сравнима с длиной деполяризации среды с объемной концентрацией молока С » 3%, характеризующейся коэффициентом рассеяния д, а 0.24 мм'1
Аналогичный эффект наблюдался и при увеличении концентрации молока в модельной среде.
Дпмаопм >м
Рис. 4. Изменение разностного поляризационного спектра отражения модельного образца при изменении глубины I расположения фильтра. Объемная концентрация молока в модельной среде С= 3.2%.
1-1 = 4 мм; 2 - £ = 8 мм; 3-1=12 мм, 4 -Ь = 16 мм; 5 - спектр оптической плотности светофильтра ЗС-7 (отн. ед.)
ln vivo измерения кожной ткани показали, что для нормальной кожи в разностном поляризационном спектре кровь папиллярной дермы не проявляется. Это связано с тем, что для кожной ткани длина деполяризации £/> сравнима с транспортной длиной /\ которая для кожи составляет величину порядка 100 мкм, что сравнимо с толщиной эпидермиса. Уменьшение толщины эпидермиса в результате его послойного удаления приводит к тому, что свет сохраняет свои поляризационные свойства в области папиллярной дермы. Это проявляется в появлении полос поглощения гемоглобина в разностном поляризационном спектре (рис. 5).
Количественную оценку толщины эпидермиса (глубины залегания кровеносных сосудов) возможно осуществлять с помощью параметра V, который показывает контраст проявления полос поглощения гемоглобина в разностном спектре:
v _ ЛД650-ДЛ545,575
К - ДЛ650 +ДД545,575 ' (8)
где индексы обозначают длины волн в нм, соответствующие полосам поглощения оксигемоглобина (545 нм,575нм) и области, где поглощение гемоглобина мало (650нм). Величина контраста увеличивается с ростом толщины удаленного слоя эпидермиса, т.е. с увеличением содержания крови в приповерхностном слое кожи.
МО 560 «я «да МО ДПМЯПЦИ1
Рис. 5. Изменение разностных поляризационных спектров кожи
по мере послойного удаления поверхностных слоев эпидермиса: 1 - нормальная кожа; 2-40 мкм; 3 50 мкм; 4-60 мкм; 5-70 мкм
Во втором подразделе второй главы рассматривается влияние анизотропии кожной ткани на состояние поляризации рассеянного света с исходной линейной поляризацией.
Некоторые ткани (в частности, дерма кожной ткани), имеющие фиброзный характер, обладают оптической анизотропией. Флуктуации анизотропии среды дают вклад не только в рассеяние распространяющегося в ней света, но и влияют на поляризационные свойства рассеянного излучения.
Исследования оптической анизотропии биотканей проводились на основе разработанной методики, которая заключалась в измерении спектральной зависимости параметра Р, определенного соотношением (3), при разных углах ср ориентации исследуемого образца относительно плоскости поляризации падающего линейно поляризованного света. В рамках обычных методов, применяемых при рассмотрении оптики двулучепреломляющих сред, показано, что для рассеивающей среды толщиной L с деполяризационной эффективностью D зависимость Р(<р) имеет вид
Р = ( 1 - D)[cos2 j+sin2 (л ^ jcos4cp J, (9)
где Ал - оптическая анизотропия среды, X - длина волны падающего света. Методика апробирована на модельных образцах, представляющих собой фторопластовые пленки разной толщины.
Проведенные исследования с in vitro образцами цельной кожи крысы показали наличие в образцах оптической анизотропии на макроскопическом уровне (размеры детектируемых участков были порядка 5 мм), при этом средняя разность показателей преломления среды для обыкновенного и необыкновенного лучей в спектральном диапазоне 550 - 700 нм составила величину порядка 0.00023. Увеличение толщины образца приводит к увеличению параметра AnL: для образца толщиной 300 мкм параметр AnL < У4 (значения Рт;п положительны), в то время как для образца толщиной 500 мкм параметр AnL > А/4, следствием чего является переход значений Ртт в область отрицательных величин. С другой стороны, увеличение толщины образца приводит к увеличению доли рассеянного света, вследствие чего уменьшается максимальное значение параметра Рп]ях.
Эффект влияния рассеивающих свойств образца на зависимость Р(ф) продемонстрирован также на рис. 6, где приведены зависимости Р(<р), измеренные в процессе просветления кожной ткани. Просветление образца (уменьшение величины деполяризационной эффективности среды D) приводит к увеличению максимальных значений параметра Ртш, что следует из соотношения (9).
Рис. 6. Зависимости Р(ф) для образца цельной кожи крысы, измеренные в
процессе просветления образца. Толщина образца 400 мкм. А = 675 нм
». пид
07.
ов.
1'
S
а 04.
г 04.1 i
-20 0 20 40 60 М 100 120 140 100 100 200
Для отрывов эпидермиса человека, взятых с разной глубины эпидермального слоя, выявлено отсутствие оптической анизотропии. Так как для кожи человека релаксация поляризации происходит в пределах эпидермального слоя, то можно утверждать, что вкладом оптической анизотропии в поляризационные характеристики рассеянного кожей света видимого диапазона можно пренебречь.
Глава 3 посвящена некоторым применениям комбинированного метода отражательной и флуоресцентной спектроскопии для исследования биотканей.
В первом подразделе обсуждаются методы коррекции проявления эффекта внутреннего поглощения в спектрах АФ биоткани. Причиной искажения спектра является рассеяние и частичное поглощение излучения флуоресценции биоткани по мере выхода его наружу.
На основе феноменологических моделей диффузного отражения и АФ кожной ткани получено выражение, связывающее истинный спектр АФ
кожи с наблюдаемым Ipii ЛFL):
тШП -у hl^Fi) ~ hS^-Fi) nm
FL {Лп)-Т3(ЛГ1)Т2(Л,г)Г:(Лп) (10)
где Г,, Ti и Ту коэффициенты пропускания света тремя верхними слоями (эпидермисом и папиллярной дермой) кожной ткани Фактором коррекции является спектр y¡Rd (Я).
Проведенные модельные исследования подтверждают возможность осуществления коррекции спектров флуоресценции кожи человека предложенным методом. Результат применения разработанного метода коррекции к in vivo измерениям АФ кожи приведен на рис. 7.
Рис. 7. Измеренный (1) и скорректированный (2) спектры АФ кожи. Хех = 337 нм
Длине волны t
Во втором подразделе главы рассмотрено применение комбинированного метода отражательной и флуоресцентной спектроскопии для диагностики состояния многослойных биологических структур, в частности, цервикальной ткани.
Приведен литературный обзор по применению многоволнового спектрального метода в целях дифференцирования нормальной биоткани и патологической. Метод позволяет не только отличить нормальную биоткань от патологической, но также дает возможность осуществлять количественную оценку патологических изменений биоткани Такая оценка возможна на основе выбора соответствующих критериев, являющихся комбинацией интенсивностей возбуждающего излучения и флуоресценции, а также коэффициентов диффузного
отражения на длинах волн, где вариации биохимического состава и структуры биоткани приводят к наибольшему изменению в спектрах возбуждения и эмиссии флуоресценции, а также диффузного отражения.
Цервикальная ткань является многослойной структурой; ее основными флуорофорами, определяющими УФ-наведенную флуоресценцию, являются различные формы кофермента НАД-Н, содержащегося в эпителиальных слоях и отражающего метаболизм клеток ткани, коллаген и эластин, содержащиеся в субэпителиальных слоях (ламина, строма) и отражающие структурную организацию биоткани. В формирование спектра флуоресценции вносит также вклад кровь (гемоглобин), поглощающие свойства которой существенно искажают измеряемый спектр.
В подразделе представлены результаты исследований флуоресценции модельной среды, представляющей собой трехслойную структуру, состоящую из слоев, имитирующих «эпителий», «базальную мембрану» (ламину) и «субэпителиальный слой» (строму) при вариациях ее структуры и биохимического компонентного состава. Модельные образцы разработаны и изготовлены А.Б. Правдиным и С.П. Черновой.
Структурной матрицей фантома являлся желатиновый гель, в качестве рассеивателей использовались кварцевые частицы микронных и субмикронных размеров. В верхний слой фантома, толщина которого 1г\ варьировалась от 300 до 1800 мкм, добавлялся кофермент НАД-Н. Базальная мембрана имитировалась пленкой высушенного желатина толщиной /¡2=50 мкм. В нижний слой фантома толщиной Лз=5 мм добавлялась кровь. Возбуждение флуоресценции осуществлялось Ы2 лазером (А.Ех=337 нм).
На основе анализа изменения спектров АФ модельных объектов при изменении их структуры (толщина «эпителиального слоя», наличие слоя «ламина») и биохимического состава (содержание НАД-Н в «эпителиальном слое» и крови в «строме») сформулировано корреляционное выражение, связывающее параметры измеряемого спектра флуоресценции с морфофункциональными изменениями в биоткани:
(Лзо; 1У415; {'¡ю) V 550 / V 480 415) lЛ480/55oJ
В этом выражении слагаемые (А)-(С) отражают структурные изменения в модельных образцах: они увеличиваются при увеличении толщины "эпителиального" слоя, при увеличении содержания крови в "субэпителиальном" слое и в случае разрушения "базальной мембраны". Увеличение содержания НАД-Н также ведет к увеличению этих слагаемых. Слагаемое (Б) зависит от содержания крови в "строме": при увеличении ее содержания оно увеличивается. Слагаемые (Е) и (Р) ведут себя аналогично (В) и (С), но они не чувствительны к содержанию крови.
Таким образом, любые отклонения в структуре и биохимическом составе модельного образца от нормы приводят к увеличению параметра 8. Весовые коэффициенты (А) - (Р) должны быть выбраны, исходя из количественных соотношений (значений) слагаемых, водящих в 5 и результатов клинических исследований для различных патологий.
В Заключении сформулированы основные результаты работы и выводы.
Основные результаты н выводы:
1. Исследована возможность и выявлены условия применимости спектральной зависимости параметра «эффективная оптическая плотность», определяемой по спектру диффузного отражения биоткани, для количественной оценки содержания в биоткани хромофоров. Показано, что в случае однородного распределения хромофоров по объему биоткани спектры поглощения и
* «эффективной оптической плотности» биоткани качественно совпадают в спектральной области, где транспортный коэффициент рассеяния биоткани слабо зависит от длины волны зондирующего излучения В случае локализации
* хромофоров в приповерхностном слое биоткани это ограничение снимается, и величина «эффективной оптической плотности» линейно зависит от концентраций содержащихся в биоткани хромофоров.
2. Исследовано влияние поглощения рассеивающей среды на степень остаточной поляризации обратно рассеянного излучения при зондировании многократно рассеивающих сред линейно поляризованным светом. В рамках феноменологического подхода, основанного на статистике оптических путей парциальных составляющих рассеянного света, получено приближенное выражение, описывающее зависимость степени остаточной линейной поляризации обратно рассеянного излучения от оптических характеристик (поглощения и рассеяния) многократно рассеивающей среды, в том числе биоткани. Показано, что спектральная зависимость параметра «степень поляризации» обратно диффузно рассеянного биотканью света с исходной линейной поляризацией зависит от поглощающих свойств среды аналогично спектральной зависимости параметра «эффективная оптическая плотность», определяемой из спектра диффузного отражения биоткани.
3. Количественная оценка содержания основных хромофоров кожной ткани по спектрам АФ кожи возможна путем анализа параметра «эффективная оптическая плотность». В отличие от используемых во флуоресцентном анализе биотканей параметров, введенная величина имеет конкретный физический смысл: она пропорциональна суммарному поглощению биоткани на длинах волн возбуждающего излучения и флуоресценции.
4. Для кожной ткани определяемые по спектрам диффузного отражения и АФ параметры «эффективная оптическая плотность» зондируемой среды и «степень остаточной поляризации» рассеянного средой линейно поляризованного света
У эффективны для измерения относительного изменения поглощающих свойств
среды, где они показывают практически совпадающие результаты.
5. Разработан новый метод оценки состояния приповерхностных слоев биотканей, основанный на анализе контраста полос поглощения в разностном спектре интенсивностей ко- и кросс-поляризованных составляющих диффузно отраженного биотканью линейно поляризованного света. Показано, что наличие хромофора в приповерхностном слое толщиной порядка длины деполяризации линейно поляризованного света приводит к уменьшению разности интенсивностей ко- и кросс-поляризованных составляющих диффузно отраженного средой света в спектральном диапазоне поглощения хромофора.
6. Разработана простая поляриметрическая методика определения оптической анизотропии рассеивающих сред, в том числе биотканей, основанная на измерении зависимости параметра Р рассеянного света от угла ориентации
исследуемой среды относительно плоскости поляризации зондирующего излучения. Показано, что разработанная методика позволяет оценивать оптическую анизотропию среды и при детектировании обратно рассеянного средой света.
7. Цельная кожная ткань крысы обладает макроскопической оптической анизотропией, при этом средняя разность показателей преломления среды для обыкновенного и необыкновенного лучей в спектральном диапазоне 550 - 700 нм составляет величину порядка 0.00023. Для кожи человека основной вклад в оптическую анизотропию дает дермальный слой. Отсутствие оптической анизотропии в живом эпидермисе позволяет сделать вывод о правомерности использования феноменологической модели релаксации поляризации в рассеивающей среде, основанной на статистике оптических путей рассеянного света, в целях поляризационной диагностики кожи человека.
8. На основе феноменологических моделей для анализа спеюров диффузного отражения и АФ кожи предложен и апробирован метод коррекции проявления эффекта внутреннего поглощения в спектрах АФ кожи. Корректирующим фактором служит спектр д/ЯДА) : истинный спектр флуорофора кожной ткани определяется путем деления измеренного спектра на фактор коррекции.
9. На основе проведенных экспериментальных исследований УФ (А.ЕХ=337 hm) возбужденной флуоресценции модельных образцов, адекватно отражающих структуру и биохимический состав цервикальной ткани в норме и патологии, определены параметры, являющиеся комбинацией интенсивностей флуоресценции и коэффициентов диффузного отражения на определенных длинах, зависящие от изменений структуры биоткани и содержания в ней биохимических компонентов. Сформулировано корреляционное выражение, позволяющее оценивать морфо-функциональные изменения в цервикальной ткани.
Основные результаты диссертационной работы изложены в следующих
публикациях:
1. Киселева И.А, Синичкин Ю.П., Тучин В.В. Возбужденная УФ - лазерным излучением флуоресценция многослойных рассеивающих сред. / Проблемы оптической физики: Материалы международной молодежной научной школы по оптике, лазерной физике и биофизике. - Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2000. С.125-128.
2. Киселева И.А., Синичкин Ю.П. Оптическая плотность рассеивающей среды / Проблемы оптической физики: Материалы 4-й международной молодежной научной школы по оптике, лазерной физике и биофизике. - Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2001. - С. 57-59.
3. Синичкин Ю.П., Киселева И.А. In vivo отражательная и флуоресцентная спектроскопия кожи человека. // Медицинская физика. 2001. № 11. С. 46.
4. Kiseleva I.A., Sinichkin Yu.P. The apparent optical density of the scattering medium: influence of scattering // Proc. SPIE. - 2002. - Vol. 4707. - P. 223-227.
5. Kiseleva I.A., Sinichkin Yu.P., Zimnyakov D.A. Polarization reflectance spectroscopy of human skin in vivo // Proc. SPIE. - 2002. - Vol. 4707. - P. 228-235.
6. Зимняков Д.А., Синичкин Ю.П., Киселева И.В., Агафонов Д.Н. О влиянии поглощения многократно рассеивающих сред на степень остаточной
поляризации обратно рассеянного излучения // Оптика и спектроскопия. - 2002. -Т. 92.-5.-С. 848-855.
7. Киселева И.А., Синичкин Ю.П., Утц С.Р. Применение in vivio отражательной поляризационной спектроскопии кожи человека.// БИОЛОГИЯ - наука XXI века, Пущино, - 2002. - Т.1, С. 93 [сборник тезисов 6-ой Пущинской научной школы-конференции молодых ученых],
8. Tuchin V.V., Zimnyakov D A., Ryabukho V.P., Sinichkin Yu.P., Simonenko G.V., Fedosov I.V., Bashkatov A.N., Genina E.A., Perepelitsina O.A., Ulianov S.S., Galanzha E.I., Kiseleva I.A., Kochubcy V.l., Pravdin A.B., Chernova S.P. Special training laboratory on optical biophysics // The Seventh International Conference on Education and Training in Optics and Photonics, Tuan-Kay Lim, Arthur H Guenther, Eds. Proc. SPIE Vol. 4588. 2002. P. 258-269.
9. Sinichkin Yu.P., Dolotov L.E., Kiseleva I.A., Zimnyakov D.A., Tuchin V.V. Special training laboratory on optical biophysics. In vivo reflectance and fluorescence spectroscopy of the human skin // The Seventh International Conference on Education and Training in Optics and Photonics, Tuan-Kay Lim, Arthur H. Guenther, Eds. Proc. SPIE Vol. 4588. 2002. P. 453-464.
10. Dolotov L.E., Kiseleva I.A., Sinichkin Yu.P., Zimnyakov D.A. Digital imaging of the human skin // Proc. SPIE. -2003. - Vol. 5067. - P. 139-147.
11. Ovchinnikova I.A., Sinichkin Yu.P., Spivak A.V., Yakovlev D.A., Zimnyakov D.A. Effect of the skin optical anisotropy on the polarization state of transmitted light with initial linearly polarization // Proc. SPIE. - 2005. - Vol. 5772. - P. 114-121.
Подписано в печать 6.10.05 1. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать трафаретная. Объем 1,0 усл. печ. л. Тираж 100 экз. Заказ 81 Типография АВП «Саратовский источник»
Лиц. ПД № 7-0014 от 29 мая 2000 г. г. Саратов, ул. Университетская, 42, оф.22 т. 52-05-93
»18334
РНБ Русский фонд
2006-4 13728
Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Овчинникова, Ирина Алексеевна
Введение.
Глава 1. Количественная оценка содержания хромофоров в биотканях методами отражательной и флуоресцентной спектроскопии.
1.1. Количественная оценка содержания хромофоров в кожной ткани по спектрам диффузного отражения.
1.1.1. Эффективная оптическая плотность рассеивающей среды.
1.1.1.1. Среда с однородным распределением хромофоров.
1.1.1.2. Тонкий поглощающий слой, помещенный в рассеивающую среду.
1.1.2. Феноменологическая модель кожи для анализа спектров диффузного отражения.
1.2. Количественная оценка содержания хромофоров в кожной ткани по спектральным распределениям степени поляризации диффузно отраженного излучения.
1.2.1. Феноменологическая модель релаксации линейной поляризации света, распространяющегося в неупорядоченной многократно рассеивающей среде.
1.2.2. Влияние поглощения многократно рассеивающих сред на степень остаточной поляризации обратно рассеянного излучения с исходной линейной поляризацией.
1.2.2.1. Феноменологическое описание.
1.2.2.2. Модельные эксперименты.
1.2.3. In vivo поляризационная отражательная спектроскопия кожи человека.
1.3. Количественная оценка содержания хромофоров в биоткани по спектрам ее автофлуоресценции.
1.3.1. Эффективная оптическая плотность тонкого поглощающего слоя, помещенного в рассеивающую среду.
1.3.2. Феноменологическая модель для анализа спектров АФ кожной ткани.
1.4. Сравнительный анализ оценки хромофорного состава биоткани с использованием разных спектроскопических методов.
1.5. Выводы.
Глава 2. Поляризационная визуализация биотканей.
2.1. Разностная поляризационная спектроскопия биологических тканей.
2.1.1. Феноменологическая модель формирования разностного поляризационного спектра обратно рассеянного биотканями света.
2.1.2. Модельные измерения в условиях in vitro.
2.1.3. In vivo разностная поляризационная отражательная спектроскопия кожи человека.
2.2. Влияние анизотропии кожной ткани на состояние поляризации рассеянного света с исходной линейной поляризацией.
2.2.1. Методика определения оптической анизотропии в рассеивающих средах.
2.2.2. Измерения поляризационных характеристик прошедшего света.
2.2.2.1. Модельные измерения.
2.2.2.2. Измерения на образцах кожной ткани in vitro.
2.2.3. Измерения поляризационных характеристик обратно рассеянного света.
2.2.3.1. Модельные измерения.
2.3. Выводы.
Глава 3. Исследование биотканей комбинированным методом отражательной и флуоресцентной спектроскопии.
3.1. Коррекция проявления эффекта внутреннего поглощения в спектрах АФ биоткани.
3.1.1. Метод коррекции АФ кожной ткани.
3.1.2. Модельные измерения в условиях in vitro.
3.2. Комбинированный метод отражательной и флуоресцентной спектроскопии как метод исследования многослойных биологических структур.
3.2.1. Многоволновый метод диагностики биотканей.
3.2.2. Модельные исследования флуоресценции многослойной рассеивающей среды.
3.2.2.1. Модельная среда.
3.2.2.2. Результаты экспериментов.
3.2.3. Корреляционное уравнение для модели многослойной среды.
3.2.3.1. Влияние толщины «эпителиального» слоя фантома.
3.2.3.2. Влияние содержания крови в «субэпителиальном» слое фантома.
3.2.3.3. Влияние изменения биохимического состава фантома.
3.2.3.4. Корреляционное выражение для дифференциации патологических изменений цервикальной ткани.
3.3. Выводы.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Мониторинг состояния биотканей методами поляризационно-отражательной и флуоресцентной спектроскопии"
Актуальность темы
В настоящее время активно развиваются и находят широкое применение оптические методы исследования, диагностики и визуализации состояния биотканей in vivo. К наиболее распространенным оптическим методам диагностики биотканей можно отнести методы отражательной и флуоресцентной спектроскопии, которые успешно используются в диагностических целях в различных областях медицины. Диффузно отраженное биотканью излучение и автофлуоресценция (АФ) биоткани несут информацию о поглощающих и излучающих свойствах среды, особенностях структуры биоткани.
Исследования спектрального состава диффузно отраженного света и АФ биоткани позволяют качественно оценить ее морфо-функциональное состояние и выявить наличие патологии. Однако, помимо качественной оценки морфо-функционального состояния биоткани необходимо выяснить причины возникновения ее патологических изменений, для чего необходимо получение информации о количественных изменениях, происходящих в структуре и биохимическом составе биоткани. Большинство исследуемых методами отражательной и флуоресцентной спектроскопии биотканей представляет собой сложные по структуре многокомпонентные многофункциональные среды, поэтому количественная оценка по спектрам диффузного отражения и АФ содержания в биотканях биохимических компонентов является достаточно сложной задачей, прежде всего из-за ограниченности измеряемых параметров (коэффициента диффузного отражения и интенсивности АФ). В связи с этим разработка спектральных методов анализа структуры биоткани и оценки содержания в ней биохимических компонентов представляет определенный интерес.
Спектр диффузного отражения биоткани позволяет определить спектральный состав «эффективной оптической плотности» исследуемого объекта - параметра, который является источником получения количественной информации о поглощающих свойствах биоткани. Рассеяние света в биоткани приводит к тому, что характер спектра «эффективной оптической плотности» часто отличается от спектра поглощения компонентов биоткани, что приводит к ошибке в количественной оценке содержания в ней хромофоров. Поэтому важной является задача выяснения условий, при которых различия между данными спектрами минимальны.
Так как спектральный состав диффузно отраженного света и АФ биоткани определяется одними и теми же поглощающими и рассеивающими свойства среды, то комбинированное использование результатов измерений спектров диффузного отражения и АФ биоткани в значительной мере расширяет возможности диагностики биоткани и получения информации о структуре биоткани и количественном содержании в ней биохимических компонентов. Поэтому перспективным методом исследования биотканей является комбинированный метод отражательной и флуоресцентной спектроскопии, который в настоящее время недостаточно развит.
Если источником АФ биоткани являются флуорофоры, расположенные в глубине среды, то спектральный состав измеряемой АФ биоткани искажается по сравнению с истинным спектром флуоресценции из-за рассеяния и частичного поглощения выходящего из среды излучения (эффект внутреннего фильтра). Так как для получения дополнительной информации о причинах возникновения патологических изменений биоткани необходимо знать, содержание каких флуорофоров изменилось в результате возникновения патологии, то такую информацию может дать истинный спектр АФ биоткани, который может быть получен из наблюдаемого путем коррекции проявления эффекта внутреннего фильтра в спектре АФ биоткани. В связи с этим представляет интерес разработка метода коррекции АФ биоткани, основанного на комбинированном использовании результатов измерений спектров АФ и диффузного отражения.
Патологические изменения в биотканях, связанные с изменениями в ее структуре или биохимическом составе, проявляются в спектральных изменениях АФ биоткани в тех или иных спектральных диапазонах. Для диагностики происходящих в биоткани морфо-функциональных изменений перспективно использование многоволнового метода флуоресцентного анализа, основанного на сравнении интенсивности АФ нормальной и патологической биоткани, измеренной на нескольких длинах волн. Выбор соответствующих длин волн, на которых максимально проявляются различия в АФ нормальной и патологической биотканей, очень важен не только с точки зрения флуоресцентной диагностики биоткани, но и с точки зрения ее приборного воплощения.
Одним из путей решения данной задачи являются исследования флуоресценции и диффузного отражения света искусственно созданных структур (фантомов), которые по своей структуре и биохимическому составу подобны реальным биологическим объектам. Такие исследования позволяют сформулировать так называемое «корреляционное выражение», включающее в себя комбинации измеренных на выбранных длинах волн интенсивностей АФ и- коэффициентов диффузного отражения объекта, которое дает возможность оценивать состояние биоткани.
Одним из преимуществ оптических методов исследования биологических сред является возможность получения информации о среде путем анализа поляризационных характеристик рассеянного средой излучения. В биомедицинских приложениях использование поляризованного излучения в основном связано с детектированием обратно рассеянного света. Особенности формирования поляризационных характеристик обратно рассеянного света с начальной линейной поляризацией приводят к эффекту остаточной поляризации, степень которой зависит от рассеивающих свойств среды. Однако практически не исследовано влияние поглощающих свойств среды на спектральное распределение степени остаточной поляризации обратно рассеянного биотканью поляризованного излучения. Такие исследования представляют интерес, поскольку могут явиться основой нового поляризационного метода оценки количественного содержания хромофоров в биоткани.
Эффективность поляризационного метода диагностики биоткани обусловлена различным вкладом рассеяния света в ее поверхностных и глубинных слоях в спектральный состав ортогонально поляризованных компонентов обратно рассеянного света. Исследования разностного спектра интенсивностей ортогонально поляризованных составляющих обратно рассеянного биотканью света позволяют получить информацию о наличии хромофоров в ее приповерхностном слое, исключая глубинные. Такие исследования не проводились и являются актуальными, так как на их основе возможна разработка нового метода исследования приповерхностных слоев биотканей, толщины которых сравнимы с длиной деполяризации в среде зондирующего света.
Во многих биотканях, имеющих фиброзный характер, в том числе в дермальном слое кожной ткани, имеет место определенная оптическая анизотропия. Более того, оптическое двулучепреломление на микроскопическом уровне обнаружено в роговом слое кожной ткани. Флуктуации анизотропии среды не только дают вклад в рассеяние распространяющегося в ней света, но и определенным образом влияют на поляризационные свойства рассеянного излучения. Адекватная интерпретация результатов поляризационных измерений кожной ткани требует исследований влияния оптической анизотропии кожи на поляризационные характеристики рассеянного средой света.
Вышеперечисленные факты и обстоятельства позволяют сформулировать основную цель диссертационной работы и определить круг задач, не затронутых другими исследователями и решаемых в данной работе.
Цель и основные задачи работы
Основной целью диссертационной работы является развитие оптических методов диагностики и мониторинга состояния биотканей, основанных на анализе спектрального состава диффузно отраженного биотканями света и их автофлуоресценции, а также состояния поляризации обратно рассеянного биотканями линейно поляризованного света.
В рамках работы решались следующие задачи:
1. Исследование возможности использования спектрального состава параметра «эффективной оптической плотности» биоткани для количественной оценки содержания в ней хромофоров. Определение условий, при которых различия между спектрами поглощения и «эффективной оптической плотности» биоткани минимальны.
2. Исследование влияния поглощающих свойств биоткани на спектральную зависимость степени поляризации диффузно отраженного света с начальной линейной поляризацией и разработка на основе полученных результатов методики количественной оценки содержания в биоткани хромофоров.
3. .Исследование спектрального состава разностного спектра ко- и кросс-поляризованной составляющих диффузно отраженного биотканью линейно поляризованного излучения и разработка на основе полученных результатов методики определения структуры ее приповерхностного слоя.
4. Разработка поляриметрической методики определения оптической анизотропии рассеивающих сред, в том числе биотканей, и исследование на основе разработанной методики оптической анизотропии кожной ткани.
5. Разработка метода коррекции спектра АФ кожной ткани, основанного на комбинированном использовании результатов измерений спектров АФ и диффузного отражения биоткани.
6. Исследовать УФ возбужденную флуоресценцию модельных образцов, адекватно отражающих структуру и биохимический состав цервикальной ткани в норме и патологии, и на основе полученных результатов сформулировать корреляционное выражение, позволяющее оценивать происходящие в биоткани морфо-функциональные изменения.
Научная новизна работы
Научная новизна работы определяется комплексом впервые выполненных in vivo и in vitro исследований и впервые полученных результатов, которые сводятся к следующему:
1. Впервые исследовано влияние поглощения рассеивающей среды на степень остаточной поляризации обратно рассеянного излучения при зондировании среды линейно поляризованным светом.
2. Разработан новый метод in vivo количественной оценки содержания в биоткани поглощающих компонентов, основанный на измерении спектральной зависимости степени остаточной поляризации диффузно отраженного биотканью линейно поляризованного света.
3. Разработан новый метод in vivo оценки толщины эпидермиса кожной ткани, основанный на измерении разностного спектра интенсивностей ортогонально поляризованных составляющих диффузно отраженного кожей линейно поляризованного света.
4. На основе разработанной поляриметрической методики впервые выявлена оптическая анизотропия кожной ткани на макроскопическом уровне.
5. Разработан новый метод получения истинного спектра АФ кожной ткани путем коррекции проявления в наблюдаемом спектре эффекта внутреннего фильтра, основанной на комбинированном использовании результатов измерений спектров АФ и диффузного отражения кожи.
6. Сформулировано новое корреляционное выражение для оценки морфо-функциональных изменений в цервикальной ткани, включающее в себя комбинации интенсивностей флуоресценции и коэффициентов диффузного отражения биоткани, измеренных на определенных длинах волн.
Практическая значимость
Результаты, полученные в процессе проведенных исследований, существенно расширяют представления о комбинированном методе флуоресцентной и отражательной спектроскопии in vivo биотканей, что в свою очередь может иметь значение для целого ряда применений. Полученные результаты найдут практическое применение в биологии и медицине, в частности, в результате выполнения работы разработан комплекс методик для оценки морфо-функционального состояния биотканей человека, позволяющий в условиях in vivo получать объективную информацию о степени выраженности патологических и функциональных изменений, а также оценивать эффективность лечения.
Полученные в работе результаты использованы в учебном процессе, а также при выполнении исследований по следующим грантам:
• INCO-COPERNICUS (проект № IC15-CT96-0815);
• Грант РФФИ «Государственная поддержка ведущих научных школ РФ» (проект № 96-15-96389);
• Грант РФФИ «Государственная поддержка ведущих научных школ РФ» (проект № 00-15-96667);
• Грант АФГИР «Научно-образовательный центр нелинейной динамики и биофизики» (проект № REC-006);
• Грант Президента РФ на поддержку ведущих научных школ № НШ-25.2003.2;
• Грант Министерства образования Российской Федерации № 01.2003.15221;
• Грант Министерства образования РФ по Программе "Фундаментальные исследования в области естественных и точных наук" № Е02-3.2-498;
• Грант РФФИ № 04-02-16533.
Достоверность результатов диссертации
Достоверность экспериментальных результатов обеспечивается использованием современной измерительной аппаратуры, апробированных экспериментальных методик, воспроизводимостью результатов экспериментов, а также их согласованием с экспериментальными результатами, полученными другими авторами.
Основные положения и результаты, выносимые на защиту
1. Степень остаточной поляризации обратно рассеянного биотканью света с исходной линейной поляризацией зависит от поглощающих свойств рассеивающей среды, при этом спектральная зависимость степени остаточной поляризации качественно совпадает со спектральной зависимостью параметра «эффективная оптическая плотность», определяемого по спектрам диффузного отражения биоткани.
2. Наличие хромофора в приповерхностном слое биоткани толщиной, сравнимой с длиной деполяризации линейно поляризованного света, проявляется в уменьшении интенсивности разностного спектра ортогонально поляризованных составляющих диффузно отраженного биотканью линейно поляризованного света в спектральной области поглощения хромофора.
3. Результаты исследований оптической анизотропии кожной ткани. Цельная кожная ткань крысы обладает оптической анизотропией на макроскопическом уровне, при этом средняя разность показателей преломления среды для обыкновенного и необыкновенного лучей в спектральном диапазоне 550-700 нм составляет величину порядка 0,00023.
4. Метод коррекции проявления в измеряемом спектре АФ кожи эффекта внутреннего фильтра. Корректирующим фактором служит спектр определяется путем деления измеренного спектра на фактор коррекции.
Апробация результатов
Основные результаты работы докладывались и обсуждались на международных и российских конференциях:
1. Всероссийском семинаре «Проблемы и достижения люминесцентной спектроскопии», (Саратов, 1998 г.);
2. Международном междисциплинарном научном семинаре и осенней школе молодых ученых «Методы светорассеяния в механике, биомедицине, материаловедении», (Саратов, 1998 г.);
3. Международной школе для молодых ученых и студентов по Оптике, Лазерной физике и Биофизике (Saratov Fall Meeting SFM'99) (Саратов, 1999);
4. Международной школе для молодых ученых и студентов по Оптике, Лазерной физике и -Биофизике (Saratov Fall Meeting SFM'2000) (Саратов, 2000);
5. Первом Евразийском конгрессе по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика-2001» (Москва, 2001);
6. Международной школе для молодых ученых и студентов по Оптике, Лазерной физике и Биофизике (Saratov Fall Meeting SFM'2001) (Саратов, 2001); этом истинный спектр флуорофора кожной ткани
7. 6-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века», (Пущино, 2002);
8. Международной школе для молодых ученых и студентов по Оптике, Лазерной физике и Биофизике (Saratov Fall Meeting SFM'2002) (Саратов, 2002);
9. Международной школе для молодых ученых и студентов по Оптике, •
Лазерной физике и Биофизике (Saratov Fall Meeting SFM'2004) (Саратов, 2004); и на научных семинарах в Саратовском государственном университете. Публикации
По теме диссертации опубликовано 11 работ (9 статей и 2 тезисов докладов на научных конференциях).
Личный вклад соискателя
Личный вклад соискателя заключался в участии в постановке задач, проведении экспериментальных исследований, обработке и обсуждении полученных результатов.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, трех глав и заключения. Содержит 148 страниц машинописного текста, включая 64 рисунка, и список используемых источников, насчитывающий 106 наименований.
Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Овчинникова, Ирина Алексеевна
Основные результаты и выводы работы можно кратко сформулировать в следующем виде:
1. Исследована возможность и выявлены условия применимости спектральной зависимости параметра «эффективная оптическая плотность», определяемой по спектру диффузного отражения биоткани, для количественной оценки содержания в биоткани хромофоров. Показано, что в случае однородного распределения хромофоров по объему биоткани спектры поглощения и «эффективной оптической плотности» биоткани качественно совпадают в спектральной области, где транспортный коэффициент рассеяния биоткани слабо зависит от длины волны зондирующего излучения. В случае локализации хромофоров в приповерхностном слое биоткани это ограничение снимается, и величина «эффективной оптической плотности» линейно зависит от концентраций содержащихся в биоткани хромофоров.
2. Исследовано влияние поглощения рассеивающей среды на степень остаточной поляризации обратно рассеянного излучения при зондировании многократно рассеивающих сред линейно поляризованным светом. В рамках феноменологического подхода, основанного на статистике оптических путей парциальных составляющих рассеянного света, получено приближенное выражение, описывающее зависимость степени остаточной линейной поляризации обратно рассеянного излучения от оптических характеристик (поглощения и рассеяния) многократно рассеивающей среды, в том числе биоткани. Показано, что спектральная зависимость параметра «степень поляризации» обратно диффузно рассеянного биотканью света с исходной линейной поляризацией зависит от поглощающих свойств среды аналогично спектральной зависимости параметра «эффективная оптическая плотность», определяемой из спектра диффузного отражения биоткани.
3. Количественная оценка содержания основных хромофоров кожной ткани по спектрам АФ кожи возможна путем анализа параметра «эффективная оптическая плотность». В отличие от используемых во флуоресцентном анализе биотканей параметров, введенная величина имеет конкретный физический смысл: она пропорциональна суммарному поглощению биоткани на длинах волн возбуждающего излучения и флуоресценции.
4. Для кожной ткани определяемые по спектрам диффузного отражения и АФ параметры «эффективная оптическая плотность» зондируемой среды и «степень остаточной поляризации» рассеянного средой линейно поляризованного света эффективны для измерения относительного изменения поглощающих свойств среды, где они показывают практически совпадающие результаты.
5. Разработан новый метод оценки состояния приповерхностных слоев биотканей, основанный на анализе контраста полос поглощения в разностном спектре интенсивностей ко- и кросс-поляризованных составляющих диф-фузно отраженного биотканью линейно поляризованного света. Показано, что наличие хромофора в приповерхностном слое толщиной порядка длины деполяризации линейно поляризованного света приводит к уменьшению разности интенсивностей ко- и кросс-поляризованных составляющих диффузно отраженного средой света в спектральном диапазоне поглощения хромофора.
6. Разработана простая поляриметрическая методика определения оптической анизотропии рассеивающих сред, в том числе биотканей, основанная на измерении зависимости параметра Р рассеянного света от угла ориентации исследуемой среды относительно плоскости поляризации зондирующего излучения. Показано, что разработанная методика позволяет оценивать оптическую анизотропию среды и при детектировании обратно рассеянного средой света.
7. Цельная кожная ткань крысы обладает макроскопической оптической анизотропией, при этом средняя разность показателей преломления среды для обыкновенного и необыкновенного лучей в спектральном диапазоне 550 - 700 нм составляет величину порядка 0.00023. Для кожи человека основной вклад в оптическую анизотропию дает дермальный слой. Отсутствие оптической анизотропии в живом эпидермисе позволяет сделать вывод о правомерности использования феноменологической модели релаксации поляризации в рассеивающей среде, основанной на статистике оптических путей рассеянного света, в целях поляризационной диагностики кожи человека.
8. На основе феноменологических моделей для анализа спектров диффузного отражения и АФ кожи предложен и апробирован метод коррекции проявления эффекта внутреннего поглощения в спектрах АФ кожи. Корректирующим фактором служит спектр ^JR^(Я): истинный спектр флуорофора кожной ткани определяется путем деления измеренного спектра на фактор коррекции.
9. На основе проведенных экспериментальных исследований УФ возбужденной (ЯЕХ=337 нм) флуоресценции модельных образцов, адекватно отражающих структуру и биохимический состав цервикальной ткани в норме и патологии, определены параметры, являющиеся комбинацией интен-сивностей флуоресценции и коэффициентов диффузного отражения на определенных длинах, зависящие от изменений структуры биоткани и содержания в ней биохимических компонентов. Сформулировано корреляционное выражение, позволяющее оценивать морфо-функциональные изменения в цервикальной ткани.
Автор выражает глубокую признательность и благодарность научному руководителю профессору Синичкину Юрию Петровичу за практическую помощь в процессе подготовки диссертационных материалов, многолетнюю наставническую деятельность, внимание и поддержку на протяжении всех лет обучения.
Автор также выражает благодарность педагогам и сотрудникам кафедр оптики и биомедицинской физики и лазерной и компьютерной физики СГУ за оказанную помощь, советы и консультации в ходе работы, в особенности профессорам Валерию Викторовичу Тучину и Дмитрию Александровичу Зимнякову, Вячеславу Ивановичу Кочубею; Алексею Николаевичу Башкато-ву, Правдину Александру Борисовичу, Элине Алексеевне Гениной, Черновой Светлане Павловне, Леониду Евгеньевичу Долотову.
Заключение
Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Овчинникова, Ирина Алексеевна, Саратов
1. Jacques S.L. The role of skin optics in diagnostic and therapeutic uses of lasers // Lasers in Dermatology / Ed. R. Steiner Berlin: Springer-Verlag, 1991. -P. 1-21.
2. Dawson J.B., Barker J. W., Ellis D.J. et al. A theoretical and experimental study of light absorption and scattering by in vivo skin // Phys. Med. Biol. 1980. -Vol. 25. - P. 695-709.
3. Meglinski I. V., Matcher S.J. Quantitative assessment of skin layers absorption and skin reflectance spectra simulation in visible and near-infrared spectral region // Physiological Measurement. 2002. - Vol. 23. - P. 741-753.
4. Andersen P.H., Bjerring P. Non invasive computerized analysis of skin chromophores in vivo by reflectance spectroscopy // Photodermatol. Photoimmunol. Photomed. 1990. - Vol. 7. - 6. - P. 249-257.
5. Тучин В.В. Лазеры и волоконная оптика в биомедицинских исследованиях. Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 1998.
6. Farrell T.J., Patterson M.S., Wilson В. A diffuse theory model of spatially resolved, steady-state diffuse reflectance for the noninvasive determination of tissue optical properties in vivo // Med. Phys. 1992. - Vol. 19. - P. 879-888.
7. Liu H., Boas D. A., Zhang Yu. et al. Determination of optical properties and blood oxygenation in tissue using continuous NIR light // Phys. Med. Biol. -1995.-Vol. 40.-P. 1983-1993
8. Andersen P.H., Bjerring P. Spectral reflectance of human skin in vivo // Photodermatol. Photoimmunol. Photomed. 1990. - Vol. 7. - P. 5-12.
9. Van Gemert M.J.C., Jacques S.L., Sterenborg H.J.C.M., Star W. Skin optics // IEEE Trans. Biomed. Eng. 1989. - Vol. 36. - P. 1146-1154.
10. Fitzpatrick T.B. The validity and practicality of sunreactivity skin types I through VI // Arch Dermatol. 1988. - Vol. 124. - P. 869-871.
11. Синичкин Ю.П., Утц С.Р. Яп vivo отражательная и флуоресцентная спектроскопия кожи человека, изд-во Сар. Ун-та, Саратов, 2001.
12. MacKintosh F.C., Zhu J.X., Pine D.J., Weitz D.A. Polarization memory of multiply scattered light // Phys. Rev. B. 1989. - Vol. 40. - P. 9342-9345.
13. Prahl S.A., van Gemert M.J.C., Welch A.J. Determination the optical properties of turbid media by using the adding-doubling method // Appl. Opt. 1993. -Vol. 32. - P. 559-568.
14. Anderson R.R. Optics of the Skin // Clinical Photomedicine / Eds. Lim H.W., Soter M.A. New York: Marcel Dekker, 1993.
15. Prahl S.A., van Gemert M.J.C., Welch A.J. Determination the optical properties of turbid media by using the adding-doubling method // Appl. Opt. 1993. -Vol. 32. - P. 559-568.
16. Graaff R., Dassel A.C.M., Koelnic M.H. et al. Optical properties of human dermis in vitro and in vivo // Appl. Optics. 1993. - Vol. 32. - 4. - P. 435-446.
17. Roggan A., Minet O., Schroder C., Muller G. The determination of optical tissue properties with double integrating sphere technique and Monte Carlo simulations // Proc. SPIE. 1994. - Vol. 2100. -P. 42-56.
18. Bicout D., Brosseau С., Martinez A.S., Schmitt J.M. Depolarization of multiply scattering waves by spherical difusers: influence of size parameter // Phys. Rev. E. 1994. - Vol. 49. - P. 1767-1770.
19. Kaplan P.D., Kao M.H., Yodh A.G., Pine D.J. Geometric constraints for the design of diffusing-wave spectroscopy experiments // Applied Optics. 1993. -Vol. 32. - P. 3828-3836.
20. Sinichkin Yu.P., Zimnyakov D.A., Giterman V. V. Direct polarization imaging of turbid tissues with CW laser source: potentialities and restrictions // Proc. SPIE. 1999. - Vol. 3598. - P. 258-268.
21. Sankaran V., Walsh J.T. //Proc. SPIE. 2000. - Vol. 4001. - P. 54-62.
22. Saulnier P.M., Zinkin M.P., Watson G.H. // Phys. Rev. B. 1990. - Vol. 42. -P. 2621-2626.
23. Зимняков Д.А., Синичкин Ю.П. О предельном значении степени остаточной поляризации некогерентно обратно рассеянного излучения при многократном рассеянии линейно поляризованного света // Оптика и спектроскопия. 2001. - Т. 91. - 1. - С. 113-119.
24. Zakharov P.V., Zimnyakov D.A., Sinichkin Yu.P. Residual polarization of the backscattered coherent light: the role of effective path statistics // Proc. SPIE. -2001.-Vol. 4242.-P. 66-71.
25. Тинекое Г.Г., Тинеков В.Г. Микроструктура молока и молочных продуктов. М.: Пищевая промышленность, 1972.
26. Van Staveren H.J., Moes C.J.M., van Marie J., Prahl S.A., van Gemert M.J.C. Light scattering in Intralipid-10% in the wavelength range of 400-1100 nm // Appl. Opt. 1991. - Vol. 30. - 31. - P. 4507-4514.
27. Утц C.P., Синичкин Ю.П. Портативный эритемо-меланинометр для дерматологии и косметологии // Вестник дерматологии и венерологии. -1997.-5.-С. 48-54.
28. Knudsen A. Prediction of later hyperbilirubinemia by measurement of skin colour on the first postnatal day and from cord blood bilirubin // Dan. Med. Bull. 1992. - Vol. 39. - P. 193-196.
29. Prahl S. Optical spectra // http://omlc.ogi.edu.
30. Tyo J.S., Pugh E.N., Engheta N. IIJOSA. A. 1998. - Vol. 15. - P. 36740. Schnorrenberg H.J., Hassner R., Hengstebeck M et al. I I Proc. SPIE. - 1994. -Vol. 2326.-P. 113
31. Anderson R.R. Polarized light examination and photography of the skin // Arch. Dermatol. 1991. - Vol. 127. - P. 1000-1005.
32. Kollias N. Polarized light photorgaphy of human skin // Bioengineering of the Skin: Skin Surface Imaging and Analysis / Eds. K.-P. Wilhelm, P. Eisner, E. Berardesca, H. I. Maibach New York: CRC Press, 1997. - P. 95-106.
33. Jacques S.L., Roman J.R., Lee K. Imaging superficial tissues with polarized light // Lasers Surg. Med. 2000. - Vol. 26. - P. 119-129.
34. Jacques S.L., Ramella-Roman J.C., Lee K. Imaging skin pathology with polarized light // J. Biomed. Opt. 2002. - Vol. 7. - 3. - P. 329-340.
35. Bilden P.F., Phillips S.B., Kollias N., Muccini J.A., Drake L.A. Polarized light photography of acne vulgaris // J. Invest. Dermatol. 1992. - Vol. 98. - P. 606. (Abstract).
36. Phillips S. В., Muccini J. A., Bilden P. F. et al. Spectroscopic evaluation of the change in erythema accompanying treatment of psoriatic plaques with a topical steroid // J. Invest. Dermatol. 1993. - Vol. 100. - P. 543. (Abstract).
37. Muccini J.A., Kollias N., Phillips S.B., Anderson R.R. et al. Polarized light photography in the evaluation of photoaging // J. Am. Acad. Dermatol. 1995. -Vol 33.-P. 765-769.
38. Andersen P.H. Reflectance spectroscopic analysis of selected experimental dermatological models with emphasis on cutaneous vascular reactions // Skin Research Technology. 1997. - Vol. 3. - 1. - P. 5-58.
39. Борен К., Хафмен Д. Поглощение и рассеяние света малыми частицами. -М.: Мир, 1986.
40. Nickell S., Hermann М, Essenpreis М., et. al. Anisotropy of light propagation in human skin // Phys. Med. Biol. 2000. - Vol. 45. - P. 2873-2886.
41. Everett M. J., Schoenenberger K., Colston B. W., Da Silva L. B. Birefringence characterization of biological tissue by use of optical coherence tomography // Opt. Lett. 1998. - Vol. 23. - P. 228-230.
42. Yao G., Wang L. V. Two-dimensional depth-resolved Muller matrix characterization of biological tissue by optical coherence tomography // Opt. Lett. 1999. - Vol. 24. - P. 537-539.
43. Delby D.T., Cope M, van der Zee P., Arridge S. et al. Estimation of optical pathlength through tissue from direct time of flight measurement // Phys. Med Biol. 1988. - Vol 33. - P. 1433-1442.
44. Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я. Физико-хмические основы фотобиологических процессов. — М.: Высшая школа, 1989.
45. Lakowicz J.R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. 2nd ed. New York: Plenum Press. - 1999.
46. Zhadin N.N., Alfano R.R. Correction of the internal absorption effect in fluorescence emission and excitation spectra from absorbing and highly scattering media: theory and experiment // J. Biomed. Opt. 1998. - Vol. 3. -P. 171-186.
47. Coremans J.M.C.C., Ince С., Bruining H.A., Puppels G.J. The NADH fluorescence/UV Reflectance Ratio provides a semi-quantitative measure for NADH fluorometry of blood perfused rat heart // SPIE. Vol.2927. -P.180-190.
48. Jobsis F.F., O'Connor M., Vitale A., Vreman H. Intracellular redox changes in functioning celebral cortex. I. Metabolic effects of epileptiform activity // J. Neurophysiol. 1971. - Vol. 34. - P. 735-749.
49. Kobayashi S., Nishiki K., Kaede K., Ogata E. Optical consequences of blood substitution on tissue oxidation-reduction state fluorometry // J. Appl. Physiol. 1971.-Vol.31.-1.-P. 93-96.
50. Ji S., Chance В., Stuart B.H., Nathan R. Two dimensional analysis of the redox state of the rat celebral cortex in vivo by NADH fluorescence photography // Brain Res. 1977. - Vol. 119. - P. 357-373
51. Ji S., Chance В., Nishiki K., Smith Т., Rich T. Micro-light guides: a new method for measuring tissue fluorescence and reflectance // Am. J. Physiol. -1979. Vol. 236. - 3. - P. 144-156.
52. Richards-Kortum R„ Rava R.P., Petras R.E. et al. Spectroscopic diagnosis of colonic dysplasia// Photochem. Photobiol. 1991. - Vol. 53. - P. 777-786.
53. Bottiroli G., Croce A. C., Locatelli D., et al. Natural fluorescence of normal and neoplastic human colon: a comprehensive "ex vivo"study // Lasers Surg. Med. 1995. - Vol. 16. - P. 48-60.
54. Sterenborg H.J.C.M., Motamedi M., Wagner R.F., et al. In vivo Fluorescence Spectroscopy and imaging of Human Skin Tumours // J. Lasers in Med. Sciece. 1994.-P.191-201.
55. Sterenborg H.J.C.M., Motamedi M., Wagner R.F. et al. In vivo fluorescence spectroscopy for diagnosis of skin diseases // Proc SPIE. 1995. - Vol. 2324. -P. 32-38.
56. Kapadia C.R., Cutzuzolla F.W. et al. Laser-induced fluorescence spectroscopy of human colonic mucosa// Gastroenterology. 1990. - Vol. 99. - P. 150-157.
57. Schomacker К. Т., Frisoli J. К., Compton С. С., et al. Ultraviolet laser-induced fluorescence of colonic tissue: basic biology and diagnostic potential // Lasers Surg. Med. 1992. - Vol. 12. - P. 63-78.
58. Cothren R.M., Richards-Kortum R., Sivak M. V. et al Gastrointerstinal tissue diagnosis by laser-induced fluorescence spectroscopy at endoscopy // Gastrointest. Endosc. 1990. - Vol. 36. - P. 105-111.
59. Bottiroli G., Marchesini R., Croce A. C., Dal Fante M., Cuzzoni C., Di Palma S., Spinelli P. Autofluorescence of normal and tumor mucosa of human colon, a comprehensive analysis // SPIE Proc. 1993. - Vol.1887. () 205-212.
60. Gillies R., Kollias N. An endogeneous dermal fluorescence band that may serve as a quantitative marker of aging and photoaging // Biomedical Optical Spectroscopy and Diagnostics, Spring Topical Meetings, Abstracts. Orlando, Florida, 1998. - P.79-81.
61. Galeotti Т., Van Rossum G. D., Mayer D. H., Chance B. On the fluorescence of NAD(P)H in whole-cell preparations of tumors and normal tissues // Eur. J. Biochem. 1970. - Vol. 17. - P. 485-496.
62. Sterenborg H.J.C.M., Saarnak A.E., Frank R., Motamedi M. Evaluation of spectral correction techniques for fluorescence measurements on pigmented lesions in vivo // J. Photochemistry&Photobiology. 1996. - Vol. 35. -P. 159-165.
63. Leffell D.J., Stetz M.L., Milstone L.M., Deckelbaum L.I. In vivo fluorescence of human skin // Arch. Dermatol. 1988. - Vol. 124. - 10. - P. 1514-1518.
64. Yang Yu., Katz A., Celmer E. J., et al. Zurawska-Szczepaniak M., Alfano R. R. Fundamental differences of excitation spectrum between malignant and bening breast tissues // Photochem. Photobiol. 1997. - Vol. 66(4). P. 518-522.
65. Bottiroli G., Balzarini P., Croce A. C., et al Autofluorescence properties of colonic mucosa: dependence on excitation wavelength // Proc. SPIE 2927, ( ) 173-179.)
66. Galeotti Т., van Rossum G.D., Mayer D.H., Chance B. On the fluorescence of NAD(P)H in whole-cell preparations of tumors and normal tissues // Eur. J. Biochem. 1970. - Vol. 17. - P. 485-496.
67. Andersson P.S., Montan S., Svanberg S. Multispectral system for medical fluorescence imaging // IEEE J. Quant. Electr. 1987. - Vol. 23. - P. 1798-1805.
68. Andersson-Engels S., Johansson J., Svanberg S. Medical diagnostic system based on simultaneous multispectral fluorescence imaging // Appl. Optics. -1994. Vol. 33(34). - P. 8022-8029.
69. Bigio I.J., Bown S.G., Briggs G. et al. Diagnosis of breast cancer using elastic-scattering spectroscopy: preliminary clinical results // J. Biomed. Opt. -2000.-Vol. 5.-2.-P. 221-228.
70. Chernova S.P., Pravdin A.B., Sinichkin Yu.P., Tuchin V.V., Vari S.G. Physical modeling of tissue fluorescence: phantom development // Proc. SPIE. 1999. Vol. 3568. P. 66-71.
71. Чернова С.П. Исследованиеспектров флуоресценции многослойных биотканей ex vivo и на физических моделях: Дис. . канд. физ.-мат. наук. Саратов, 2002. 196с.
-
Овчинникова, Ирина Алексеевна
-
кандидата физико-математических наук
-
Саратов, 2005
-
ВАК 03.00.02
- Развитие методов оптической томографии для медицинских и биологических применений
- Флуоресцентная и спектрально-поляризационная диагностика биологических тканей in vivo
- Исследование анизотропных оптических свойств и динамики иммерсионного просветления различных биотканей
- Исследование взаимосвязи между эффективностью лазерного фототермолиза с участием золотых наночастиц и оптическими характеристиками биотканей
- Развитие спектрально-поляризационных и когерентно-оптических методов зондирования фиброзных биотканей
