Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярный механизм взаимодействия антибиотиков антрациклинового ряда с двухспиральными фрагментами ДНК

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярный механизм взаимодействия антибиотиков антрациклинового ряда с двухспиральными фрагментами ДНК"

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ УКРАЇНИ ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

. о

г 0;

їм. ІЗ.Н. ІСАРАЗША

Осстроп Сергій Гріь ^ровнч (2і

УДК

ГЛОЛІГІГУЛЛРШЇЙ МЕХАНІЗМ ВЗАЄМОДІЇ АНТИБІОТИКІВ ЛНТРЛЦЯКЛНЮВОГО РЯДУ З ДСОХСШРАЛЬШШЇІ. ФРАГМЕНТАМ’! ДНК

03,00.02-ГІЬфЬкгсй

Лктопгфср:гтдпгспт:ні;і :;п г;* Jyrni паукового ступгз;;: ;:г.шт;;:гг:5 г:::;т:ічішх наугс

Робота виконана в Севастопольському державному технічному університеті Міністерства освіти України • '

Науковий керівник : aoktov ^ізіїко-математичних наук, професор

Веселков Олексій Никонович, Севастопольський державний технічний університет, завідувач кафедрою фізики .

Офіційні опоненти:

1. Доктор фізико-математичних наук, старший науковий співробітник Семенов Михайло Олексійович, Інститут радіофізики та електроніки НАН України, провідний науковий робітник (м. Харків)

2. Кандидат фізико-математичних наук Зозуля Віктор Миколайович, Фізико-технічний інститут низьких температур НАН України, старший науковий співробітник (м. Харків)

Провідна установа: Інститут теоретичної фізики НАН України, м. Київ

Захист дисертації відбудеться QS 2000р. о годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.64.051. ІЗ у Харківському національному університеті ім. В.Н. Каразіна за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4

3 дисертацією можна ознайомитися у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна за адресою: 61077,

' м. Харків, тіл. Свободи, 4

Автореферат розісланий "'2.0'’' 2000 року.'

Вчений секретар Спеціалізованої вченої ради

]

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ Актуальність темн. Відомо, що ароматичні антибіотики антрациклінової упи широко використовуються при лікуванні пухлинних захворювань, крема, у хіміотерапії лейкозів, ідо збільшилися після аварії на Чорнобильській імній електростанції. Так, антибіотик дауноміцин є одним з найбільш ективних сполук, що застосовуються при лікуванні гострої форми мієлоїдної їкемії. Вважається, що медично-біологічна активність таких антибіотиків тосередньо зв’язана з їхньою специфічною спорідненістю та типом «ування з молекулами дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК) та 5онуклеїнової кислоти (РНК). У зв'язку з цим з'ясування природи ■{молекулярних сил, відповідальних за сіхвенс - селективне іплексоутворепня того чи іншого антибіотику та специфіку взаємодії ■ибіотик - ДИК, представляє виключно важливу задачу.

Відомо, що антрациклінові антибіотики не проявляють настільки явної й юзначної сікиенс - специфічності при взаємодії з ДНК, як це має місце для у інших інтеркаліруючих лігандів. Дані про селективне зв'язування рациклінових антибіотиків з синтетичними дезоксиолігонуклеотидами ить суперечливі. Складність будівлі, конформаційна мінливість натнвних іекул нуклеїнових кислот, велика різноманітність місць зв'язування ліганду в імершш ланцюзі обмежують можливості встановлення молекулярного анізму дії антибіотиків, селективності їхнього зв'язування 'з певними інками молекул ДНК і РНК. Разом з тим експериментально встановлено, що їктивність, яку виявляють ліганди, спостерігається вже на коротких пеотидних послідовностях, включаючи відповідний сайт. Найбільш повну -ину про природу фізичних взаємодій при утворенні молекулярних плексів можна одержати, якщо поряд з вивченням структурних эливостен молекулярних комплексів проводити відповідні дослідження ■іодинаміки комплексоутворення молекул у розчині. Зокрема, висновок про ктивність зв'язування того або іншого низькомолекулярного сполучення з іим сайтом нуклеотидної послідовності можна зробити на підставі вняльного аналізу величин рівноважних констант взаємодії лігандів з знуклеотидами різної довжини, складу та послідовності основ у ланцюзі, цьому вивчення процесів комплексоутворення у різних молекулярних емах повинно проводитися в однакових експериментальних умовах. Однім з ільш ефективних експериментальних методів для вивчення процесів ілексоутворення молекул у розчині є ЯМР - спектроскопія, що була ристана в дисертаційній роботі.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалася за планом НДР кафедри фізики Севастопольського державного технічного університету: “Специфіка взаємодії лікарських речовин з ДНК. Встановлення природи фізико-хімічних факторів, відповідальних за ефективність зв'язування лікарських речовин, що мають різну біологічну активність, з заданими послідовностями ДІЖ” (1997-99 p., координаційний план №16 Міносвіти України), а також у рамках держбюджетній НДР “Комплекс” (“Дослідження взаємодії лігандів з фрагментами нуклеїнових кислот”) Міносвіти України, за програмою Міжнародного Наукового Фонду Сороса) - Грант Лг« UD 7200, за міжнародною програмою INTAS - Грант №97-31753 та договорів про науково-технічну співдружність на 1993-98 p.p. та 1998-2003 p.p. між Беркбек коледжем Лондонського університету (Великобританія) та СевДТУ.

Мета та задачі доєліджсішн. Метою роботи являється встановлення основних закономірностей взаємодії антрациклінових антибіотиків ногаламіцину та дауноміцину з двохланцгоговими дсзокситетрануклеотидами різної послідовності основ у водно-соляному розчині; з'ясування впливу нуклеотидного складу та послідовності основ у ланцюзі на особливості процесів комплеіссоутворстія антрациклінових антибіотиків з ДНК. Для досягнення поставленої мети вирішувалися задачі: розшифровки та віднесення сигналів протонів і фосфору у спектрах ЯМР водних розчинів антибіотиків дауноміцину та ногаламіцину з самокомплементаршши дсзокситетрануклеотидами різного нуюіеотидного складу та послідовності основ у ланцюзі; вивчення закономірностей самоасоціації антрациклінових антибіотиків дауноміцину та ногаламіцину в водно-соляному розчині; розробки методик визначення структурних і термодинамічних параметрів асоціації та комплексоутворенш: антибіотиків з самокомплементаршши олігонуклеотидами на основі концентраційних і температурних залежностей протонних хімічних зсувів; вивчення комплексоутворення дауноміцину та ногаламіцину з двохланцюговими тетрануклеотидами, встановлення основних типів комплексів, що утворюються, їхньої структури та термодинамічних характеристик; аналізу характеру фізико-хімічних взаємодій, відповідальних за селективність зв'язування антрациклінових антибіотиків із двохланцюговими компонентами нуклеїнових кислот. х\

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше на основі використання методів одномірної та двомірної гомо - та гетероядерної .ЯМР - спектроскопії проведено комплексне та систематичне дослідження взаємодії у водному розчині антибіотиків антрациклінової групи дауноміцину та ногаламіцину зі

з

(іально синтезованими самокомплементарними дезокситетрануклеотидами ої послідовності основ у ланцюзі. Показано, що зміст різного типу плексів у розчині суттєво залежить від співвідношення вихідних дентрацій взаємодіючих молекул і послідовності основ у ланцюзі ^комплементарних дезокситетрануклеотидів. Встановлено, що дауноміцин і шаміцин не проявляють явної сіквенс - специфічності зв'язування з одно -двохспіральними дезокситетрануклеотидами, при цьому стабілізація плексів “антибіотик -ДНК” здійснюється головним чином, за рахунок юцукерних залишків, що розташовуються у малій канавці подвійної спіралі, юблено методика розрахунку структур комплексів антибіотиків з спанцюговими тетрануклеотидами по лімітним значенням протонних чних зсувів взаємодіючих молекул і двомірних спектрів ЯМР. Визначено ггорові структури 1:2 комплексів дауноміцину з дезокситетрануклеотидами, зедений порівняльний аналіз конформаційних параметрів подвійної спіралі в ркальованих комплексах молекул у розчині. Розроблено методика іачення термодинамічних параметрів комплексоугворення антибіотика з іксиолігонуклеотидами, грунтована на температурних залежностях гонних хімічних зсувів у водному розчині, що дозволить диференційоване іачити внески різного типу реакцій у сумарні теплові й ентропійні ефекти, начено термодинамічні параметри^ (вільна енергія Гіббса, ентальпія й >опія) реакцій комплексоугворення дауноміцину з

ікситетрануклеотидними дуплексами сІ(ТССА), с!(СССС), сі(ОССС), СОТ), сі(ЛССТ) у водному розчині.

Практичне значення одержаних результатів. Результати, одержані в їртаційній роботі, поглиблюють знання й уточнюють існуючі представлення особливості процесів взаємодії нуклеїнових кислот з антибіотиками зациклінового ряду, що широко використовуються у хіміотерапії при ванні деяких видів ракових захворювань. Розроблені у дисертації методики, >ритми та програми аналізу концентраційних і температурних залежностей іериментальних даних ЯМР - спектроскопії дозволяють проаналізувати іномірності рівноваги “антибіотик - олігонуклеотид” у розчині, знайти зтанти утворення різного виду комплексів і, відповідно, зробити висновки сіквенс - специфічність зв'язування антибіотиків, визначити структури екулярних комплексів, диференціювати внески різних реакцій плексоутворення в сумарні тепловий та ентропійний ефекти при взаємодії ібіотика у розчині. Одержані результати та висновки роботи можуть бути

використані у галузі розробки нових біологічно активних речовин і лікарських препаратів. ,

Особистий внесок здобувана. В роботах [1,5] - підбір, обробка й аналіз літературних даних. В роботах [2-4] - постановка наукової задачі, вибір і реалізація аналітичних і чисельних методів її рішення; розшифровка та віднесення сигналів протонів і фосфору в одномірних та двомірних спектрах розчинів дослідних молекул, участь у розробці методик визначення структурних і термодинамічних параметрів асоціації та комплексоутворення молекул на основі концентраційних і температурних залежностей протонних хімічних зсувів. У роботах [6,7] розрахунок структур інтеркальованих комплексів "антибіотик - ДНК". У роботах 8-14- аналіз та інтерпретація одержаних результатів.

Апробація результатів дисертації. Основні результати дисертаційної роботи було представлено й обговорено на: ХШ Національній школі-семінарі з міжнародною участю "Спектроскопія молекул і кристалів" (Суми, 1997); 13-th International Meeting on NMR Spectroscopy (Exeter, UK, 1997); British Biophysical Society Meeting on Structure, Function and Dynamics of Nucleic Acids (Guildford, UK, 1998); 14-th European Experimental NMR Conference (Bled, Slovenia, 1998); II з'їзді Українського Біофізичного Товариства (Харків, 1998); International conference "Physics of Biological Systems" (Kyiv, 1998)

Публікації. Результати роботи опубліковано в 14 наукових працях, у тому-числі 7 статей у наукових журналах і в 7 тезах доповідей, з'їздів, конференцій.

Структура й обсяг дисертації. Робота складається з вступу, п'яти розділів, висновків. Повний обсяг дисертації складає 159 сторінок, 41 рисунок, з них 24 рисунка займають повні сторінки, 26 таблиць, з них 20 займають повні сторінки. Список використаних джерел (187 найменувань), займає 16 сторінок. Додаток А займає 17 сторінок.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ У вступі обгрунтовується актуальність теми, визначені мета та задачі досліджень, вказано наукова новизна одержаних результатів, наведені основні V ^положення, що відбивають наукове та практичне значення роботи. Дані відомості про апробацію роботи.

! У розділі 1, що має оглядовий характер, наведено експериментальні та / теоретичні дані про структуру та конформаційні стани нуклеїнових кислот та

І, їхніх компонентів, рівноважної самоасоціації молекул ароматичних лігандів і коротких нуклеотидних послідовностей, комплексоутворення олігонуклеотидів з

элекулами ароматичних барвників та антибіотиків. У першому підрозділі іведено прийнята на цей час номенклатура, необхідна для опису шформацішшх параметрів подвійної спіралі ДНК і окремих пар основ. Другий дрозділ містить огляд літературних даних по параметрам самоасоціації юматачних молекул лігандів і олігонуклеотидів, відомості про структурні '.обливості утворгоючихся асоціатів та їхньої стабільності. Представлено ізультати досліджень конформації асоціатів олігонуклеотидів різних )слідовностей основ у ланцюзі, одержаних методами ЯМР- спектроскопії Гі шими (оптичними, реіптеноструктурними та т.д.) методами досліджень. У >єтьому підрозділі розглянуто результати робіт по комплексоутвореншо оматичних лігандів зі двохланцюговими олігонуклеотидними )слідосностями у розчині. Проаналізовано наявні в літературі дані про лективне зв'язування антрациклііювих антибіотиків з молекулою ДНК. юблений висновок про те, що питання про сіквенс - специфічну взаємодію трациклінових антибіотиків з ДНК у водному розчині можна вирішити на цставі порівняльного аналізу величин рівноважних констант взаємодії лігандів алігонуклеотидами різноманітної довжини, складу та послідовності основ у нцюзі.

У розділі 2 стисло розглянуто фізичні основи спектроскопії ядерного ігнітного резойансу, питання, зв'язані з експериментальною технікою ержання, обробкою й інтерпретацією одномірних і двомірних спектрів отонного магнітного резонансу. Показано доцільність використання у цій боті методик гомоядерної (2M-TOCSY, 2M-ROESY) та гетероядерної (метод ЗМС) спектроскопії. Розглянуто можливості розрахунку структур геркаляційних комплексів по двомірним спектрам ядерного ефекту іерхаузера (NOE) та обертальної спектроскопії (ROE). Наведено відомості про азки, методиці приготування розчинів та умовах проведення експерименту.

У розділі 3 для з'ясування детального молекулярного механізму 'еркаляційного зв'язування ароматичних анграциклінових антибіотиків з ДНК, ло досліджено самоасоціація молекул дауноміцину (DAU) та ногаламіцину OG) у водному розчині. Ототожнення резонансів протонів DAU та NOG було золено на основі аналізу гомоядерних TOCSY та NOESY експериментів.

Аналіз концентраційних залежностей хімічних зсувів необмінюваючихся отоиів антибіотиків, проведений з використанням безконечномірної кооперативної та кооперативної моделі самоасоціації молекул. Середні по всім отонам значення рівноважних констант асоціації для DAU та NOG наведено в 5л. 1.3 таблиці видно, що значення рівноважної константі! самоасоціації NOG

приблизно на порядок вище від величини константи для БАЦ, що зумовлене суттєво більшим внеском гідрофобних взаємодій в агрегацію молекул ногаламіцину, що підтверджується термодинамічним аналізом. Параметр кооперативності для ногаламіцину в межах погрішності співпадає з величиною, розрахованою для самоасоціації антибіотика дауноміцину в аналогічних експериментальних; умовах.

Таблиця 1

Параметри самоасоціації молекул дауноміцину та ногаламіцину у водному розчині (0.1 М фосфатній буфер, р0=7,0 Т=303 К)

Антибі- отик Некоопера- тивна модель Кооперативна модель -де, кДж/ моль -МІ, кДж/ моль кДж/К/ моль

к, л/моль АГ, л/моль а

йди 580±110 470+ 1,34±0,06 16,3± 34± 59±

110 0,5 6 15

N00 5900+1200 4100± 1,37+0,21 21,9± 30± 27±

1600 0,4 4 4

Це дозволяє зробити припущення, що ногалозний цукор у 'молекулі ногаламіцину та аміноцукор в антибіотикі дауноміцину, приєднані однаковим чином до агліконовому хромофору, створюють основні стерині перешкоди при утворенні пошарових асоціатів у розчині. Величини параметру о більші одиниці, свідчать про антикооперативний процес самоасоціації молекул цих антибіотиків.

Аналіз структур димерів у водному розчині зроблений на підставі розрахованих значень індукованих хімічних зсувів протонів антибіотиків А5 -5ІП - ба, і спектрів 2М - МЭЕБУ. У димерах дауноміцину та ногаламіцину, не спостерігається антипаралельна орієнтація (кут закручування ~ 180°) плоїцін хромофорів молекул. По-видимому, це зв'язано з особливостями хімічно структури та гідрофобними взаємодіями в димерних комплексах, а також і: розподілом електричних зарядів в антрацикліновнх антибіотиках.

Термодинамічні параметри самоасоціації визначалися на основ експериментальних температурних залежностей протонних хімічних зсувії розглядуваних молекул з використанням адитивної моделі та формалізму Вант Гоффа. Усередненні значення термодинамічних характеристик самоасоціаці антрацикліновііх антибіотиків наведено в табл. 1. Більш низьке значення ЛІ

кції самоасоціації DAU в порівнянні з NOG, очевидно, зв'язано з суттєве ішнм перекриттям ароматичних кілець ногаламіцину в агрегаті із-за наявності яженого з хромофором антибіотика непланарного бициклічного позитивно адженого аміноцукру, що створює стерині перешкоди для паралельної :нтації хромофорів при утворенні пошарового асоціату в розчині. Щодо зміни ропії AS; значеній цього термодинамічного параметру при самоасоціації аламіцину та дауноміцину розрізняються ще в більшої мірі, ніж ентальпії, іьшення ентропії реакції самоасоціації ногаламіцину в порівнянні з AS для U зумовлено, по-видимому, більшим витисненням молекул розчинника круги асоціатів ногаламіцину при утворенні молекулярних комплексів.

У розділі 4 досліджено процеси комплексоутворепня антрациклінових ибіотиків з самокомплементарішми дезокситеарануклеотидами різної лідовності основ у ланцюзі d(CpGpCpG), d(TpGpCpA), d(GpCpGpC), pCpGpT), d(ApGpCpT) і проведений порівняльний аналіз селективного зувания антибіотика з різними сайтами пуклеотидшіх послідовностей. Аналіз оядерних 'Н і гетероядерних ’Н - 31Р спектрів ЯМР розчинів DAU та NOG з рануклеотидами показав, що місцем переважного зв'язування антибіотика є йнііі сайт, незалежно від послідовності основ у тетрамері.

Для кількісної оцінки взаємодії антибіотика з дезокситетрануклеотидом ропоновано наступна схема утворення молекулярних комплексів:

D + D<r^->D2 N + N<^l^N2 D + N^->DN D + N2 <---—> DN2 D + DN <-^-> D2N D+B\f2 /V2 (i)

rQ, K*r рівноважні константи димерізації антибіотика та тетрануклеотиду в чині; К], К2, Кз, Кг рівноважні константи утворення комплексу 1:1 ибіотика з одиночною ниггю (DN), 1:2 комплексу антибіотика з дуплексом І2) тетрануклеотиду, комплексу 2:1 двох молекул антибіотика з одиночною тю (D2N), а також утворення 2:2 комплексу двох молекул антибіотика з лексом тетрамеру (.D?A^) відповідно.

При розрахунку по цій схемі протонній хімічній зсув, що сґюстерігається в іекулах антибіотика, представляється в виді:

8=(D/D0)(8m+2Kl!DS^Kj№]+KNK2N282+2K1K3DN53+2K/K2KjDN2O4), (2)

де Do, - вихідна молярна концентрація антибіотика; D,N - рівноважні молярні концентрації мономерів антибіотика та телгрануклеотгнда відповідно. Величини 6„„ 5а Kd можна вважати відомими. Вони визначаються шляхом дослідження самоасоціації антибіотика, виходячи з концентраційних залежностей протонних хімічних зсувів ароматичного ліганду в тих же експериментальних умовах (см розділ 3). Рівноважні константи КГК4 та лімітні значення хімічних зсувів 8Г54 відповідних комплексів знаходились як параметри рівняння (2) методом послідовного ускладнення моделі. Процедура знаходження параметрів заснована на мінімізації квадратичного функціонала нев’язки з використанням експериментальних залежностей хімічних зсувів протонів антибіотиків.

Розраховані значення констант утворення комплексів, що дозволяють зробити укладення про виборче зв’язуванім актрациклінових антибіотиків з тим або іншим сайтом нуклеотидної послідовності, наведені в табл. 2.

Таблиця 2

Параметри комплексоугворення DAU та NOG {К„ л/моль) з тстрануклеотидами різної послідовності основ у ланцюзі (Т=308 К, 0. ЇМ, pD=7. 1)

Тип комплексу 1:1 1:2 2:1 2:2

Антибіотик +тетрамер K,.10J K2.10J K3.10J К4.Ю3

DAU+d(GpCpGpC) 31+9 520+100 7.4+2.3 1112

DAU+d(CpGpCpG) 35+10 5801160 5.9±2.5 35+12

DAU+d(TpGpCpA) 30+8 430±100 5.4+0.4 12.5+0.5

DAU+d(ApGpCpT) 33+11 415+110 1.410.5 21+8

DAU+d(ApCpGpT) 37+12 440+110 1.810.7 23+9

NOG+d(T pGpCp A) 120+30 20501420 2.7Ю.6 170+30

NOG+d(ApGpCpT) 90±20 2130±460 3.010.7 100+30

NOG+d(ApCpGpT) 160+30 2490+420 3.010.8 150+90

Порівняння розрахованих рівноважних констант Kj-K4 утворення комплексів 1:1, 1:2, 2:1 і 2:2 DAU та NOG з дезокситетрануклеотидами різної послідовності основ у ланцюзі показує, що якісно вони відносяться друг з другім приблизно однаковим чином, причому, імовірність утворення в розчині комплексу 1:2 антибіотика з будь-якої з розглянутих послідовностей, що характеризується константою К2, суттєво вище, ніж других комплексів у водному розчині. З табл. 2 видно, що рівноважна константа К2 комплексоугворення NOG з дуплексами тетрамерів суттєво більше константи

юрешш аналогічних комплексів з DAU, що зв'язане зі структурними мінностями розглядуваних ашрациклінових антибіотиків. .

Відмінності у значеннях рівноважних констант К2 реакцій утворення 1:2 лплексів антибіотиків з дуплексом розглянутих дезокситетрануклеотидів не >евищуготь 30% (табл. 2), тобто дауноміцин не проявляє явної сіквенс -:цифічності при заміні АТ-пари на GC-napy в триплетної послідовності, поважні константи IQ, К4 що характеризують зв'язування другої молекули ибіотика з тетрамерамн в мономерної, також як і в дуплексної формі, досіггь іькі, що вказує на явно аіггикооперативніи характер утворення цих комплексів чевидно, зв'язано з наявністю у хромофорів антибіотиків масивних цукерних ишків, що створюють визначенні стерині перешкоди при посадці другої пекули антибіотика на коротку тетрануклеотидну послідовність. Рівноважна істанта Kt для DAU з тетрамерами співпадає в межах погрішності для всіх :лідовіюстєґі, що досліджувалися. Разом з тим для NOG спостерігаються тєві розбіжності у значеннях Kt (до 40%). Це зв'язано як із великою (формаційною свободою одноланцюговій молекули та меншою імовірністю орення специфічних водневих зв'язків у такіїі послідовності між основами К і антибіотиками, так із відсутністю ефекту, що стабілізує за рахунок іадки аміноцукерного залишку в малій канавці, що має місце в подвійною ралі ДНК.

Аналіз одержаних результатів дозволяє зробити висновок про те, що цями переважної посадки антибіотиків є триплетні нуклеотидні ;лідовності. DAU та NOG не проявляють явної сіквенс - специфічності при ізуванні як з одно так і з двохланцюговими тетрануклеотидішми ;лідовностямн.

Розрахунки' показують, що внесок у загальну рівновагу різного типу тлексів суттєво залежить від співвідношення вихідних концентрацій рануклеотиду та антибіотику (рис. 1).

Аналіз структур 1:2 комплексів дауноміцину з дезокситетрануклеотидними (лексами проведений на підставі розрахованих лімітних значень протонних ічних зсувів та даних 2М - NOESY. При розрахунку комплексів 1:2 DAU з рамерами використовували модифіковану модель еквівалентних магнітних юлів, одержану в результаті апроксимації квантово-механічних кривих анування для азотистих основ нуклеїнових кислот. Наявність у хромофорі ибіотика NOG, у відміну від DAU, суттєво меншої кількості ібмішоваючихся протонів, не дозволяє провести строгий розрахунок

структури інтеркалірованих комплексів 1:2 антибіотику з дезокситетрануклеотидами з використанням даної методики.

Рис. 1. Залежності відносного вмісту мономерів дауіюміцину та комплексів антибіотика з 5'-с1(ТССА) у водному розчині від концентрації £>о=0.783 ммоль/л, Т=303 К: 1-БМ, 2-02К 3-ІЖ2, 4-ОгМг, 5-В, 6-02

На рис. 2 представлено найбільш імовірна структура комплексу 1:2 дауноміцину з тетрануклеотидом сЦАССГ), що відповідає інтеркаляції хромофора антибіотику в кінцевий сайт тетрамеру.

Результати розрахунку параметрів спіралі для всіх інтеркалірованих комплексів дауноміции - тетрануклеотид наведені утабл. 3.

У розділі 5 з метою визначення термодинамічних параметрів реакцій комплзксоутворення вивчено температурні залежності хімічних зсувів протонів молекул І)/\и у змішаних розчинах з тетрануклеотидами сі(СрСрСрСі), сі(ТрСрСрА), с!(ОрСрСрС), сі(ЛрСрСрТ), сі(ЛрСрСрТ) в тііх же умовах розчинника, що і при концентраційних вимірах. ■

Рис. 2. Розрахована просторова структура 1:2 - комплексу дауноміцину з 5'ч1 (АССГ), вид па комплекс збоку

Таблиця З

Параметри спіралі для интеркальованних комплексів БАи з тетрануїспеотидами різної послідовності основ у ланцюзі

’етрамер Параметри спіралі

Оу,нм IX, нм 0,,нм к,° -оз,° о,° х,° Р,°

І(СССС) 0.10 0.07 0.69 3.0 4.5 34 3.5 3.5 110

І(СССО) 0.19 0.08 0.67 2.0 6.0 34 -6.0 3.5 90

;Сгсса) 0.15 0.08 0.70 -2.0 6.0 35 7.8 3.5 110

!(АСОТ) -0.13 0.07 0.71 4.5 7.0 32 12.0 4.5 100

КАЄСТ) -0.04 -0.02 0.71 4.5 9.0 35 -3.2 4.5 140

Це було зроблене з використанням адитивної моделі, в якої хімічні зсупи отонів антибіотику, що спостерігаються, визначаються сумою внеску від номерної та димерної форм, а також від внеску молекул у складі 1:1, 1:2, 2:1, : комплексів з тетрануклеотидами.

4

: <>7(Т) - їщітт+*ЖЗД/ + Е ‘КВДа (3)

к=1

У моделі (3) вплив температури на значення 5, враховується тим, що мольні ггки (/с—1,2,3,4), однозначно зв'язані з рівноважними константами Кі-К,

утворення комплексів, є функцією температури. Визначення температурних залежностей для констант рівновага дозволило знайти термодинамічні параметри комплексоутворення - ентальпію (АЯ) та ентропію (А5) для різних типів комплексів. Величини розраховувались двома засобами.

У першому засобі, розрахункова методика передбачає застосування параметричних регресійних рівнянь для опису залежності мольних часток від температури. Рівноважні константи комплексоутворєння - КГК4 при різних температурах були розраховані з знайдених значень мольних часток з використанням закону збереження маси та законів дії мас для розгляданих реакцій. Для оцінки реакцій АН і утворення комплексів О А І/ з

самокомплементарними тетрануклеотидами у розчині використовували формалізм Вант - Гоффа.

У другому засобі для розрахунку термодинамічних параметрів асоціації використовуються співвідношення (2) для хімічного зсуву протонів антибіотика, що спостерігається у розчині з самокомплементарним тстрануклеотидом, в якому константи реакцій комплексоутворення КГІ(4, а також реакцій димерізації антибіотика Кд, що входять в (2), визначаються через відповідні термодинамічні параметри &Н° і А3°:

ІД7)=ехр[(А5°/ЛК АН°тТ)] (4)

у припущенні, що величини АН° і А6'° не залежать суттєвим чином від температури в досліджуваному діапазоні температур. З табл. 4 видно, що всі розглядувані реакції комплексоутворення БАТІ з дезокситетрануклеотидами є екзотермічними.

Таблиця 4

Рівноважні значення термодинамічних параметрів АС, АЯ, А8 реакцій

утворення комплексів дауноміцину з дезокситетрануклеотидами

Комплекс -Аб’зм, -АЯ, -А^зоз,

л кДж/моль кДж/моль Дж/(моль -К)

^ . дауноміцин+5’-с1(СрСрСрС)

1:1 26,1±0,б 76±10 164±23

/ 2:1 22,4+0,7 38±13 53±18

/ 1:2 33,1+0,5 48+7 49+7

2:2 23,4+0,4 44±14 67±22

продовження таблиці 4

Комплекс -ЛСзоз, кДж/моль -ля, кДж/моль ■А^зоз> Дж/(моль -К)

дауноміцин +5’-с1(СрСрСрО)

1:1 26,4+0,6 92±9 217+22

2:1 21,9±0,9 46+15 79+25

1:2 33,4±0,6 48±8 47+8

2:2 26,3+0,8 51+17 83+27

дауноміцин +5’-(і(ТрСрСрЛ)

1:1 26,0+0,6 82+8 183±18

2:1 21,6+0,2 48±10 85+17

1:2 32,7+0,9 39+7 21 ±4

2:2 • 23,8±0,2 59±14 116±29

дауноміцин +5’-сі(АрОрСрТ)

1:1 26,3+0,7 86+8 196+23

2:1 18,2+0,8 51+10 ї07+26

1:2 32,6+0,9 43±7 33+7

2:2 25,1+0,8 63+15 126+34

дауноміцин +5’-сІ(АрСрСрТ)

1:1 26,5+0,7 82+8 183±22

2:1 18,9+0,5 45±9 88+21

1:2 32,7+0,6 37+6 15±3

2:2 25,2+0,9 62+15 122±34

Проведений термодинамічний аналіз дозволяє зробити висновок, що ювиий вклад у від’ємні значення термодинамічних параметрів іплексоутворення дауноміцину з дезокентетрануклеотидамп вносять (молекулярні взаємодії - водневі зв'язки та сили Ван-дер-Ваальса. Гідрофобні ємодії, ідо вносять позитивний вклад в ДБ, відіграють важливу роль при оренні комплексу антибіотика (1:2) з дуплексом тетрануклеотиду.

ВИСНОВКИ

Вивчена самоасоціація антрациклінових антибіотиків дауноміцину та -аламіцину в водно-соляному розчині методами одномірної та двомірної ]Н [Р спектроскопії (500/600 МГЦ).

Визначено рівноважні константи самоасоціації молекул дауноміцину та 'аламіцину в водному розчині, що рівні відповідно КВАи=580±110 л/моль,

и

Kn<x;=5900±12G0 л/моль при Т=ЗОЗК, і значення термодинамічних параметрів агрегації'антибіотиків: АНоли= -(34±6) кДж/моль, ASdait3 -(59+15) кДж/(моль-К), AGDAu= -(16.3+0.5) кДж/моль, і ДНКоо= -(30±4) кДж/моль, ASnog= -(27±4) кДж/(моль-К), AGlN(xr" -(21.9+0.4) кДж/моль. Величина параметру кооперативиості при самоасоціації NOG рівна cKog=1-37±0.21 і cDAlf=1.34±0.06 для DAU.

Вперше побудовано найбільш імовірні структури димерів DAU та NOG на підставі розрахованих значень індукованих хімічних зсувів протонів антибіотиків і даних 2М - NOESY спектрів,- Структури днмерних комплексів дауноміцину та ногаламіцину мають паралельну орієнтацію хромофорів при різноманітному куту закручування площин хромофорів антрациклінових антибіотиків.

Досліджено комплексоутворення антрациклінових антибіотиків

дауноміцину та ногаламіцину з самокомплементарними

дезокситетрануклеотвдами різної послідовності основ у водно-соляному розчині методом одномірної та двомірної !Н-ЯМР спектроскопії (500 МГЦ).

Показано, що DAU та NOG здебільшого інтеркалірують у кінцеві сайти кожного з вивчених тетрануклеотидіь. Аміноцукор антибіотика DAU та ногалозне цукрове кільце NOG розташуються в малій канавці дуплекса тетрамсру та фактично блокують третю пару основ, бициклічний цукровий залишок NOG розташується в великій канавці подвійній спіралі.

Визначено параметри комплексоутворення антибіотиків з

дезокситетрануклеотидами: рівноважні константи реакцій, лімітні значення протонних хімічних зсувів молекул і термодинамічні параметри ентальпії (АН) та ентропії (AS) утворення різних типів комплексів антибіотик - ДНК (1:1, 1:2, 2:1 та комплекси 2:2) в водному розчині.

Показано, що місцями переважної посадки антрациклінових антибіотиків є триплетні нуклеотидні послідовності, при цьому антибіотики не проявляють явної сіквенс - специфічності зв'язування з одно - або двохсиіральшши дезокситетрануклеотидами. Наявність в NOG бициклічного цукрового залишку, що при зв’язуванні антибіотика з ДНК розташується в великій канавці подвійної спіралі, призводить до додаткової, у порівнянні з DAU, енергетичної стабілізації інтєркалірованого комплексу.

Вперше побудовано найбільш імовірні структури 1:2 комплексів DAU з дезокситетранукпеотидними дуплексами d(TGCA), d(CGCG), d(GCGC), d(ACGT), d(AGCT) у водному розчині на підставі розрахованих індукованих

нічних зсувів протонів антибіотика в інтеркаліроваїшх комплексах і даних 2М-ЭЕБУ. Структури комплексів 'ОАІІ - олігонуклеотидний дуплекс у водному 'Зчині знаходяться в доброму згоджені з результатами реитгеноструктурігого алізу подібних комплексів у кристалі.

Виявлено, що конформаційні параметри подвійної спіралі та орієнтація омофора БАІІ в інтеркаліроваїшх комплексах залежать від послідовності нов в сайті інтеркаляційного зв'язування антибіотика.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ГГРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Веселков А.Н., Барановский С.Ф., Дымант Л.Н., Петренко Н.В., Осетров Г., Веселков Д.А., Паркес X., Дэвис Д.Б. Исследование комплексообразования іоматического красителя бромистого зтидия с одноцелочечным комплементарным дезокситетрануклеотидом 5’ё-(СрТрОрА) в водном ютворе методом !Н ЯМР спектроскопии // Биофизика,- 1998,- Т.43, N2,- С.205-

4.

2. Итон Р.Дж., Веселков Д. А., Пахомов В.И, Барановский С.Ф, Болотин .А., Осетров С.Г., Дымант Л.Н., Дэвис Д.Б., Веселков А.Н. Исследование гквенс - специфичносг:' комплексообразования антибиотика дауномицина с юмерными дезокситетрануклеотидами 5'-сі(АрСрОрТ), 5'-<і(АрСрСрТ) и 5'-ТрврСрА) методом ЯМР спектроскопии//Молекуляр. биология,- 1999 - Т.33,

5,- С.803-813. 1

3. Итон Р.Дж.., Веселков ДА., Барановский С.Ф., Осетров С.Г., Дымант .И., Дэвис Д.Б. Веселков А.Н. Исследование самоассоциации молекул гграциклиновых антибиотиков в водном растворе методом ^-{-ЯМР іектроскопии // Хим. физика,- 2000 - Т. 19, N2,- С.98-104.

4. Веселков А.Н., Болотин П.А., Осетров С.Г. Комплексообразование гграциклиновых антибиотиков с изомерными дезокситетрануклеотидами 5’-;АССТ), 5’-с1(АССТ) и 5’-с1(ТССА) в водном растворе // Вісник ХДУ,- 1999,450, Біофізичний вісник. Вип.4. - С.23-30.

5. Итон Р.Дж., Веселков ДА., Дымант Л.Н., Барановский С.Ф., Осетров .Г., Дэвис ДБ., Веселков А.Н. Рісследование комплексообразования сридинового красителя профдавина с дезокситетрарибонуклеозндтрифосфатом 1-с1(ТрСрСрА) в водном растворе методом 'Н ЯМР спектроскопии'// Биополим. клетка,- 1998.-Т. 14, N2.-С. 117-126.

6. Веселков А.Н., Итон Р.Дж., Барановский С.Ф., Осетров С.Г., Пахомов .И., Болотин П.А., Дымант Л.Н., Дэвис Д.Б. *Н-ЯМР анализ

комплексообразования антибиотика дауномицина с дезокситетрануклеотидом 5'-d(TpGpCpA) в водном растворе // Биополим. и клетка - 1999. - Т. 15, N2,- С. 8796. . '

7. Веселков А.Н., Итон Р. Дж., Барановский С. Ф., Осетров С.Г., Болотин П.А., Дыманг JI.H., Пахомов В.И., Дэвис Д.Б. Комплексообразование антибиотика дауномицина с дезокситетрарибонуклеозидтрифосфатом 5’-d(CpGpCpG) в водном растворе // Ж. структ. химии.-1999. -Т.40, N2.-С. 276-286.

8. Eaton R.J., Osetrov S.G., Djimant L.N., Davies D.B., Veselkov A.N. ’H NMR analysis of sequence selective binding of antracycline drug daunomycin with DNA oligomers // 13-th Intern. Meeting on NMR Spectroscopy.-Exeter.- 1997,- P. 59.

9. Eaton R.J., Osetrov S.G., Djimant L.N.,Davies D.B., Veselkov A.N. 'Н NMR analysis of sequence-selective binding of the anthracycline drugs daunomycin and nogalamycin with DNA oligomers It British Biophysical Society Meeting on Structure, Function and Dynamics ofNucleic Acids.-1998,- Guildford.- P.20.

10. Davies D., Eaton R., Osetrov S., Baranovsky S., Pahomov V., Veselkov A. 'Н-NMR investigation of sequence-specific binding of antibiotic daunomycin with deoxytetranucleotides in aqueous solution // 14-th Europ. Experim. NMR Conf.-199S.-Bled.-i". 198.

11. Осетров С.Г., Димант JI.H., Болотін П.А., Веселков O.H. Дослідження сіквенс - специфічності комплексоутворення антибіотику дауиоміцину з олігомерами ДНК методом ЯМР- спектроскопії // Тези доповідей П з’їзду Українського біофізичного товариства (УБФТ-98).- Харків.-1998,- С. 22.

12. Барановський С.Ф., Осетров С.Г., Димант JI.H., Веселков О.Н. 'Н-ЯМР аналіз самоасоціації антрациклінових антибіотиків // Тези доповідей II з’їзду Українського біофізичного товариства (УБФТ-98).- Харків.-1998,- С. 63.

13. Djimant L.N., Baranovsky S.Б., Osetrov S.G., Pahomov V.I., Bolotin P.A., Veselkov A.N. NMR structural and thermodynamical analysis of complex formation between antibiotic daunomycin and deoxyoligonucleotides of different base sequence // Book of Abstr. of the conf. Physics of Biological Systems (PBS-98).- Kyiv.- 1998.-P. 71.

14. Baranovsky S.F., Osetrov S.G., Bolotin P.A., Djimant L.N., Veselkov A.N. ‘Н NMR analysis of self%ssociation of anthracycline antibiotics daunomycin and nogalamycin in aqueous soluti6n П Book of Abstr. of the conf. Physics of Biological Systems (PBS-98).-Kyiv.- 1998.-P.106.

АНОТАЦІЯ

Осетров С.Г. Молекулярний механізм взаємодії антибіотиків грациклінового ряду з двохспіральннми фрагментами ДНК,- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фізико-математичних /к за спеціальністю 03.00.02- біофізика- Харківський національний іверситет ім. В.Н. Каразіна, Харків, 2000.

Методами одномірної та двомірної (2М-ЯОЕ5У та 2М-ТОС8У) 'Н-ЯМР їктроскопії (500 МГЦ) у розчині вивчено комплексоутворення

грациклінових антибіотиків дауноміцину та ногаламіцину з двохланцюговими локомплементарними дезокситетрануклеотидами різного нуклеотидного іаду та послідовності. Розроблено методика розрахунку параметрів взаємодії гибіотиків з тетрануклеотидами у водному розчині та визначено шодинамічні та структурні параметри комплексоутворення молекул,

гановлено відсутність явної сіквенс - специфічності зв'язування антибіотиків з одно -, так і з двохспіральннми дезокситетрануклеотидами. Розроблено годика розрахунку структур і побудовано найбільш імовірні просторові

>уктури 1:2 комплексів антибіотика дауноміцину з дуплексами

'рануклеотидів у водному розчині. Визначено термодинамічні параметри -гальпія, ентропія та вільна енергія Гіббса для комплексів 1:1, 1:2, 2:1 і 2:2 к.и з дезокситетрануклеотидами. |

Ключові слова: ЯМР - спектроскопія, комплексоутворення, дауігоміцин, галаміцин, інтеркаляція, структура комплексів, термодинамічні параметри.

Осетров С.Г. Молекулярный механизм взаимодействия антибиотиков грациклинового ряда с двухспиральными фрагментами ДНК,- Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата I физико-гематических наук по специальности 03.00.02 - биофизика. - Харьковский диональный университет им. В.Н. Каразина, Харьков, 2000. ,

Методами одномерной и двумерной (2М-1ЮЕ5У и 2М-ТОС8У) !Н- ЯМР гктроскопии (500 МГц) в растворе изучено комплексообразование грациклиновых антибиотиков дауномицина и ногаламицина с ,'хцепочечными самокомплементарными дезокситетрануклеотида\1и (личного нуклеотидного состава и последовательности. Разработана методика ;чета параметров взаимодействия антибиотиков с тетрануклеотидами/ в дном растворе и определены термодинамические и структурные параметры

кшлексообразования молекул. Установлено отсутствие явной сиквенс -

специфичности связывания антибиотиков как с одно - так и с двухспиральными дезокситетрануклеотидами. Разработана методика рарчета структур и построены наиболее вероятные пространственные структуры 1:2 комплексов антибиотика дауномицина с дуплексами тетрануклеотидов в водном растворе. Определены термодинамические. параметры - энтальпия, энтропия и свободная энергия Гиббса для комплексов 1:1, 1:2, 2:1 и 2:2 DAU с дезокситетрануклеотидами.

Ключевые слова: ЯМР - спектроскопия, комплексообразование,

дауномицин, ногаламицин, интеркаляция, структура комплексов, термодинамические параметры. .

Osetrov S.G. Molecular basis of interaction of anthracycline antibiotics with double-helical DNA fragments. - Manuscript.

Thesis for candidate’s degree by speciality 03.00.02- biophysics— V.N. Karazin Kharkiv National University, Kharkiv, 2000.

500 MHz NMR spectroscopy has been used to investigate the complexation of the anthracycline antibiotics daunomycin (DAU) and nogaJamycin (NOG) with self-complementary deoxytetranucleotides, 5’-d(CGCG), 5’-d(GCGC), 5’-d(TGCA), 5’-d(ACGT) and 5’(AGCT), of different base sequence in aqueous salt solution. 2D homonuclear *H NMR spectroscopy (TOCSY and’ROESY) and heteronuclear !H-31P NMR spectroscopy (HBMC) have been used for complete assignment of the nonexchangeable protons and the phosphorus resonance signals, respectively, and for a qualitative determination of the preferred sites of;the drug. Analysis shows that DAU intercalates preferentially into the terminal sites of each of the tetranucleotides and that the aminosugar of the antibiotic is situated in the minor groove of the tetramer duplex, partly eclipsing the third base pair. [

A quantitative determination of the complexation of DAU and NOG with the deoxytetranucleotides has been made using experimental concentration and temperature dependences of the drug proton chemical shifts; these have been analysed in terms of the equilibrium reaction constants, limiting proton chemical shifts and thermodynamical parameters (enthalpies AH, entropies AS) of different drug DNA complexes (1:1, 1:2,2:1,2:2) in aqueous solution. It is found that antibiotics DAU and NOG interact with sites containing three adjacent base'pairs but do not show any significant sequence specificity of binding with either single or double-stranded tetranucleotides, in contrast with other intercalating drugs such as proflavine, ethidium bromide and actinomycin D. The most favourable 'structures of the 1:2 DAU -

ranier complexes have been derived from the induced limiting proton chemical ifts of the drug in the intercalated complexes with the tetranucleotide duplex, in ujunction with 2D NOE data. It has been found that the conformational parameters the double helix and the orientation of the DAU chromophore in the intercalated mplexes depend on base sequence at the binding site of the tetramer duplexes in ueous solution. Thermodynamic analysis has shown that hydrophobic interactions ly a substantial role in 1:2 complex formation of DAU with double-stranded oxytetranucleotides.

Key words: NMR spectroscopy, complexation, daunomycin, nogalamycin, ercalation, molecular structures, thermodynamical parameters.