Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярный механизм действия фармакологических препаратов на биологические и модельные мембраны

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярный механизм действия фармакологических препаратов на биологические и модельные мембраны"

П 'ff

,1 ° " v • МЮ "СОРЖ*

АГЕНСГВО S-ЮИНЗСРМАТИКИ И ЭКОЛОГИИ Ч5Л0ВШ

На прагах рукописи

УДК: b77.352.26.56;GI5.2I4.2.

ХАЕАКВ £аур Хз.дой.урадсЕИч

ШБКШРННЛ 1ЖШШ.1 ДЕЙСТВИЯ ФШАКОЛОППЕСККХ ПРЕПАРАТОВ KA. ШШСПКЕС1Ж,

н шеяыые мндалву

03.00.16. - экология

ДИССЕРТАЦИЯ

па соискаяяе ученой стеяиня дохстсра йиологачпсхих наук в tow научного доклада

Москва - 1992

' Рай от (i выполнен'Лв Институте проблем передача информации '.Российской Академик Ilayif

Офздаалъшы оппоненты: доктор физико-математических наук Ком Ю.Л.

доктор биолэгэтаских наук Таирбеков f.!.Г.

доктор биологически наук Львов K.M.

Ведущая ергэнизедгя - Институт прзгралмп-тх систем ТАН.

■ Исследовательский центр искусственного

рпктелекта г> Переславль-ЗалосскиП

Защита диссертации состоится У^ " 1992 г.

на заседания споцшишзлроЕалкого Совэта Д.170.01.01 щи Агентстве бюзчфорыаттш п экологии человека Международной неправительственной организации "Форум" по адресу: II7342, Москва, ул.Бутлерова, 15.

С диссертацией ьотлю ознакомиться в библиотеке Агенства биоин-форметихя и экологии человека.

Я Г___

Ддсеер-гмскк раус слана " </ /' Uly^wQ 1992 г.

Учзннй секретарь Специализироганвото Совета, доктор физико-математических наук

С. II. Добряков

.Актуальность' темы. Деятельность человека прямо или косвенно , сщ£зйна с влиянием на.организм множества химических препаратов, производящихся в большее количествах, необходимых народному хо-, зяйству. К таким препаратам можно отнести, к примеру, - ядохимикаты, используемые в сельском хозяйстве, лакокрасочные агенти, фармакологические вещества, детергенты, биологически активные вещества растительного происхождения, широко используете в легкой промышленности, медицине и др.' видах труда. При этом нельзя не учитывать л такио факторы экологии человека, как выделение в с к-' рухающул сроду•больного количества токсических агентов при произ-. водстзо активных соединений,, необходимых для здоровья и -тизш лю-

дел. Непрерывное увеличение нагрузки па окруиамцуи среду, без . учета воацеЙстБпл на биосферу, может вызвать опасность экологической катастрофа. .. 1

Производство феиолышх соединений растительного происхозде-

■ ния невозыозно без выбросов вредаых агентов в округающуп среду. Поэтому, в целях-защитно-охранительных мер от загрязнения среды

■ обитания человека, могло бы явиться выяснение роли биологических . мембран/.как систеш, участвующей в процессах обмена мевду клетками и окруньвдвй оо средой/Практическое применение е клинике большого спектра фарткологических-препаратов, как природном происхождения, так и синтезированных, требует создания стабильных условий, ' которые' необходимы лечащему врачу при проведении все более усложняющихся ступеней-вмешательегза человека во взаимодействие

. среда я :ишого организма. Неизбежным следствием применения лекарственных препаратов без учета механизма, действия на структурно-функциональные свойства меШршшых взаимодействий, является развитие побочных реакций, отличающихся по своей природа, тяжести Клинических проявлений и скорости нарастания. На одно из первых • мест по выбору: лечебных средств выдвигается проблема наркомании н тсксикокашш, привлекаиц-гя в после,инее время.внимание специалистов и. обв;ественности ¿сего мара; Широкое, при мнение наркотических я знестезируипЗк веществ при хирургических вмешательствах, а тайке в псстоперационных ■ периодах требует внимательного отношения к дозировка:/, к частоте приема- и целесообразности выбора того или иного препарата, с целью имшэчения привыкания пациента - основного-лобачяого эффекта, вызываемого ими. С момента открытия морфина в начала аровшогб столетия, неатугшла эра бендушюго применения этого зелья с отягчающая госледс-гвюаш, принесшего горе мшлио-нам дадей. Наряду с соверзрнстБОванием лечеСаых своЧств .морфина, а именно синтезированием его п|юизшднах, ссверденотвсталось я

производство и сигтезпрование новых синтетических галлюциногенов, вызывающих грубые нарушения психической деятельности.

Со времени внздрения d лечебную практику обезболивающих : средств центрального действия, медицинская наука обогатглась многочисленными данными о влиянии этих препаратов на центральную нервную систему, однако действие наркотических и местноанастазирую-щих средств на периферический рецвпторный аппарат еще недостаточно изучено. Первопричиной действия многих лекарственных веществ, ' является взаимодействие их с макромолекулам возбудимых мембран ■ клеток.

Однако, для более полного представления о механизме действия : исслэдусмых веществ, недостаточно экспериментальное проведение непосредственно на биологических мембранах ввиду невозможности разделения эффектов взаимосвязанных Докторов, определяющих вэа- . имодейстше, я во-вторых, отсутствие методов прямого изучения взаимодэйс-твия'клеточных мембран в процессах, секреции медиаторов, адгезии клеточных структур, транспорта лекарственных препаратов ; п ионов через слой клетокJ Эти затруднения мозно преодолеть методом моделирования взаимодействия платочных мембран, с сомопдао искусственных бислойних лшшдных мембран (ЕШ) с их обширным диапазоном вариаций состава, структуры и внешней среда.

Цел Ti работы заключалась е поисках мер запиты человека от влияния эагрязштднх окружающую среду факторов путем комплексного изучения молекулярного механизма действия некоторых химических агентов на биологические и модельные мембраны.

Основные задачи. Б соответствии с целью определены задачи исследований:

1. Изучить освобождение медиатора из нервных окончаний нервно-мышечного соединения кожной мыпцы груди лягушки и диафрап.и крксн в присутствии разобщителей окислительного фосфорштрованш:, местноанастазирующих средств, анальгетиков наркотического типа, алкалоидных препаратов п некоторых других лекарственных соединений.

2. Исследовать вмбркотокическсе действие локальных анестетиков на внутриклеточный рН и томп развита sapoаышей морских засей.

3. Действие фармакологических препаратов на агдезшз в присутствии и отсутствие двухвалентных катионов на слияние мембран.

4. Модификация фармакологическими препаратами проницаемости мембран душ ионов и.макромолекул.

Научная новизна тзаботн. Нервно-мкшэчное соединение является удобной моделью для изучения влияния фармакологических препаратов обладатели различным физиологическим действием. С момента открытия спонтанных миниатюрных потенциалов концевой пласт-нкн (ШЛ) началось детальное изучение в этой направлении . Работы, проведенные на нэрвно-шшечпнх соединениях холоднокровных п теплокровных животных показали очень высокую чувствительность концевой пластинки к дсйстг-ш химических препаратов. 3 работе представлены данные по изучена) механизма действия фармакологических веществ различного проксхо:эдеши, по относянс-хся структурно к гл-кому-то одному классу соединений, но имепдяе характерные функциональные группы (ÜH./flíg, Mí). При изучении этих веществ был выявлен Сходный механизм освобождения порций медиатора из нервных окончаний нервно-мышечных соединений.

Впервые на нервно -мшечном соединении изучалось комбинированное взаимодействие фармакологических препаратов по елияниэ их на процесс секреции медиатора. С помощью методики внутриклеточного отведения МПШ1 проводились исследования по выяснению молекулярного механизма Действия некоторых представителей фанольных соединений, относяещхся' к группе РОФ, а таккз некоторых местноана-стезирущих алкалоидных препаратов.

■ На 'зародьпиах плоских морских ежей показано, что обработка локальными'анестетиками вызвала увеличение рН цитоплазмы (рНц) неошгодотворенных яиц ir изменяла величину прироста рНц в ответ на оплодотворение по сравнению с контролем. У обработанных зародышей было заторможено начато выселения клеток первичной мезенхимы, но ускорено вылуплевие. .

На искусственных фосфолипидных мембранах впервые было по-icaaano, что слияние двух ЕИ.1 в одну происходит при подаче напряжения-на обе мембраны от 150 до 200 мВ и рто эти величины подазав-мого напряжения. зависят от поверхностного натяжения Ый. Было .также установлено, что слияние мембран в-"цилиндр" удается получить при воздействии малых доз ингаляционного аиестетица-фторота-ка. Показано также, что ингаляционные' анестетики, разязжая мембраны, увеличивай!эффективность действия ГОО, сниташда сопротивление мембран л в несколько раз ускоряют их слияние.

Экспериментально доказано, что заряженные чэтвбртичные аммониевые аналоги ладо ката- й тримекаина могут проникать через клеточные и липйдг-ше мембраны,' а также что локальные анестетики способствуют увеличению потока анионов через капал, образованный а\фэтеряци;гом г..

Научпо-гоакпгеская ценность. Результаты проведенных райог позволяют дать практические рекомендации, связанные с использованием изученных веществ в клинической медицине и биологических исследованиях. Изучение механизма слияния карточных и модельных мембран ьажно для разработки методов введения в клетки белков, ; липидов, модификаторов клеточного метаболизма и что Еажнее всего, для лечебной медицины - это возможность доставки лекарственных ... препаратов с помощью ляпосом непосредственно в места локализации патологического процесса в том или ином органе. Наши рекомендации могут оказаться полезными и для химиков, синтезирующих новые ле-карственкне препараты, и для лечащих врачей, применявших анесте-.. зию и обезболивание в своей практике. . ■'

Изучение механизма действия анальгетиков наркотического ти-' па на молекулярном уровне мояет облегчить понимание патогенеза наркоманий по стадиям заболеваний, прогнозирование рели,газ введения лекарств в организм, контроля аффективности и безопасности лекарственных средств,' и т.д. Понимание сложных физиологических, процессов, происходящих в:организме■позволит более рационально применять лекарственные вещества, наблюдать па их действием в ус-..' . ловиях целостного организма к на основании этого изменять в необходимом направлении структуру молекул создаваемых новых препаратов с целью получения желаемого фарлакологичеегюго эффекта. , '

Алто батя тзаботн. Основные результаты работи докледашалрсь на Есесошном симпозиуме по мембранам (Пущино, 1967); Всесоюзном еимтознуме "Биофизика мембран" (Паланга, 1969); II биохимическом съезде (Ташкент,.1969); Всесоюзном симпозиуме "Биофизика.мембран" (Каунас, 1972); Ш Всесоюзной конференции "Физиология медиаторных процессов" (Москва, 1980); I Всесойзном биофизическом съезде (Москва, 1982); .ТУ Всесоюзной конференции "Физиология и биохимия.. , иедиаторшх процессов" (Москва, 1Э85); Всесоюзном СЕШОэйуке "№>•- ' ханизыУ действия вопизирущих азлу^шнзй" (Львов, 1986); У Всасо- -юзном симпозиуме по фенольным соединениям (Таллинн. 1987); .Т Международной иэнферевдии "Здектроматнягнае колоба "¿а г биомембраны" : в Болгарии (Плевен, 1986); Международной конференции "Рагул>1ция свободных-радикалов (биомедицинсюьэ аспекты)" в Болгарии (Верна,

1989); II Международней.конференции "Элетасомагнйгные.колебания ■ и биокембраны" в Болгарии (Плевен, 1Э89); ? Всесоюзной конференции "Физиология а биохимия медиаторных процессов" (Москва, 1990);

X Международном биофизическом конгрессе в Канаде (Ванкувер,. 1990);

XI Международном конгресса по нейтроштологии в Японии.(Киото,

1990); ХУ Меадуларо,гапм ояохши-.эском конгрессе т. 'Лзраяле (Иеру-

салим, 1991).

I. ВЛИЯНИЕ НЕКОТОРЫХ ФАНШЮЛСГИЧЕСИК ПРЕПАРАТОВ ' НА ОСВОБОЖДЕНИЕ ПОРЦИЙ АЦЕТИЛХОЛЙНА ИЗ НЕРВНЫХ ОКОНЧАНИЙ."

Б качестве исследований на биологических мембранах билл использованы изолированные нэрвно-мышечнна про параты, лягуаси и диафрагма белей крьсн.

Для отведения М'ТКП использовалась стоклялнно микреэлектрода с диаметром кончика 0,5-1 мк и сопротивлением 10-15 МОм, эапол- ' нбнные трехмолярнык KCl.

Регистрация (ШКП производилась с помощью нродусилителя переменного тока и осцилогра1а. От мышечных волокон, имеющих диаметр от 120 до 40 мк. Потенциал покоя (ПП) ложечного эолокна регистрировался отводящим микрозлектродом, соединявшегося через катодный повторитель с входом усилителя тостоянкого тока тша "УППП-2П. Измерялась частота и амплитуда ШКП.

В данной работе приводятся только результаты гех опытов, ь которых параметры МПКП измерялись до и после введения фармакологических веществ в раствор, омывающий нервно-мышечный препарат. При измерении параметров №31' для получения статистически достоверных результатов определяли обычно среднее значена амшштуды для 100 МШШ, а при измерении частоты - время за которое возникало IG0 импульсов..Ошибка измкрения била не выпе 20% от измеряемой величины.' • '

В опытах на когной мышца груди лягушки были использованы следуедие «фармакологические вещестза:карбонкл-к-хлорфенилпщра-зок (F-CCP), дикумарол (ДИК), твтр9хлор-2-трифтормотилбанэки1да-зох (ТТФБ), 2,4-динитрофенсл (№), 2,4-дахлорфенол (Дй>), 2-ме-у тил-4-хлорфенол (МХБ), метанптрофенол (Hí), пентахлорфенол (ПХФ), 2,4,5-трюслорфзнол (TXi), пзрфторцлнако*: (ТСШ), дэцшиша, дека-ме.тонйй, морфолин, пйкриновая-кислота, госсипол, виалрил, солаяиа аминазин, тофранил, некоторые меотноанестсзирувдке препарзты (анестезин,-прокоин, лидока&н, три та каин), ейелгезирующие пре Мараты нарктоичоского Tima (премедол, тёкоднн, эстоили), алкалоидные ооедикения (борберин, глауцин, стэфаглабрин, сангвиритрш), На изолированной диафрагме белой крыси Рыли использованы оладушке POS: 2,4-д,шитрсТюкол (ЛЧФ), тетрахлор 2-грпфторметилдснзвмвда-зол (ТТФБ) j 2,4,5-Трихлорфенол (17.0) и перфторпичькол (ПИ).

Изменения частоты и амплитуда МПКП в присутствии наследуемых фармакологических препаратов дают воз:та:юсть получить сведения с локализации л механизме действия вещества з пирвпо-гчзечком

соединении. В даннЯ работе ш пытались выяснить механизм действия некоторых фармакологических ьетеств, обладающих различной степенью влияния на центральную нервную систему (ЦНС), но сход-' них по характеру действия на параметры МШЛ.

1,1. плиянио разобщителей огаслительного гноойотзютированяя на виход асе'пглхолкнц из нерг.ншг окончаний.

Изучалось влияние различных РОЗ на параметра МШИ нервно- -мишенного соединения травяной лягушки.

Частота освобождения порци,1 медиатора из нервных, окончаний в нервно-мышечном синапсе зависит от присутствия ионов Са'"'+ в окрудмщек растворе. У' кшщ, выдержанных длительнее время в растворах без ионов Са2+, частота ЬШКП значительно понижается. .

Согласно гипотезе Е.А.Либермана, выдвинутой п.! ь 1966 г., частота МПИ1 зависит не от^поляризпции мембраны, а только от её . проницаемости для ионов Са"+ к от их концентрации внутри пресп-надтических волокон. В тех услозиях, где большое количество си-наптическдх пузырьков находится на расстоянии 100 Я от мембраны должны возникать Еан-дер-заальсоьы силы, которые стремятся свести пузырек с мембраной нервного окончания. Кроме Ван-дер-вааль-сэвях сил существуют и силы отталкивания из-за наличия одноименных (отрицательных) зарядов на поверхности мембран синагтических. пузырьксв и мембран нервшх окончаний. Увеличение кснцентрацаи • ионов Са2+ приводит к экранизации поверхностного отрицательного заряда мембран и к увеличен::» секреции ацетллхолина. Данная ги- • потоза дала объяснение и тому факту, тоторый наблюдали Хаббард (1961) и Катц (1965), что вход ионов Са2+ в деполяризованное волокно, а не деполяризация дает резкое увеличение частоты ЫШП, т.к. эти ионы повышают вероятность слияния синоптических пузырьков. Вскоре было показано, что деполяризация в сроде без ионов Са?+ не приводит к увеличению частоты секреции оцетшшшша и синаптическая передача блокируется, хотя нервный импульс распространяется вдоль нервных окончаний. Прямой проверкой выдвинутой гипотезы было бы введение ионов Са2+ внутрь немного окончания. Однако осуществить внутриклеточную инъекпаю иоьов в нервно-ш-печном соединении дягупки трудно из-за малых размеров нервных окончаний, имеющих диаметр менее одного ь/:;;т>она.

Концентрация ионов Са2+ внутри нервного окончания в нормальных условиях очень низка, вероятно, как и в саркоплазме

Ю-7 М (Гоггг.еЫ.~ 1964). Такая низкач концентрация поддергивается, по-видимому, митохондриями и ретикулумом, которые поглощают избыток ион-лл Сал+, проникающих через наруленуо мембран/

клетки. По-ввдаыолу, в нормальных условиях митохондрии нервных окончаний долины содержать некоторьгл"залас" иоаол Са2+. Если этот запас будет осзобозден, 'частота ШЛ возрастет. Известно, что митохондрии, инкубированные в среде с исками Са2+, вкде.чяют калыгай при добавлении в среду РОЭ (Льнивдиер, I'JGG). Было доказано, что активное зоглощение Са^5 и ¿4 89 митохондриями ii ' освобождение этих конов из митохондрий под вчиянигм P0Í- действительно происходит ir. iñ vivoj Татра: образом, можно бьло ели-• дать сильного увеличения частоты МПКП в растворах с F00. ,

I.T.I. В.таянта •рпгобплггелей окислительного етосЗхгрилиро-ззнил на частоту т.знгзтюрних готешшалоз концевой пластинки.

Все исследованные РОФ вызывали при введении ь о^фуламций мшцу раствор Рпнгера резкое повышение частоты ЫЖП (на 2-3 порядка) (рис.2). Эффективность псслзг'танных РОФ оказалссь весьма различной. Из рис.2 видно, что концентрации веществ; при которых удалось наблюдать одинаковое увеличение частоты ¡/ЛЕЯ, у разных разобщителей отличаются на несколько порядков. По эф- . фектлвности действия на освобождение порций медиатора исследованные РОЗ располагаются з следующий ряд: Е-ССР CI-CCP ТТ5Б

ДШС да Кг. Такая же последовательность была обнаруаене (рис.1) при исслздовании действия разобщителей на дыхание митохондрий, инкубированных в соответствуйте;* среде при физиологических значениях рН 7,5, и яри исследовании действия РОФ па проводимость искусственных бимолекулярных мембран, получевных из фосфолгагадов митохондрий. Так, Е-ССР, С1-ССР ч 7Т2В оказались •болеэ чем на два порядка эффективнее Л©, дикумарол занимает промежуточное положение, и менее эффективным оказался метани- ., трофеяол. Особого .внимания заслуживает то? факт, что в опытах с МПКП дикумарол оказался достаточэ эффективным. Показано (Лн-берман, I9VC), что этот разобщитель не ачияет на сопротивления ЬМ из фосфолииидсж мозга н создает протонную проводимость только у мембран из митохондркальных фоефолипэдов. Ото дае.т оснсва-ние думать, что увеличение частоты МПКП в присутствии ДИК, а твкже других F00, возникает из-за влияния их на проводимость • именно мембран митохондрий, а не ыембрглш нервного окончания. Кик видно из рис.1, рабочие концентрации всех исслбдопашых ра-зобиштелей оказались примерке на порядок ешие розобадющи;: концентраций для митохондрий и'концентраци!, вызывающих понижение сопротивления в опытах с БД; (кривые зависимости "асточы МПКП от .концентрация РОФ сдвинуты впраЕо). Это различие, вероятно, С1Л-

эано с тем, что проникновение РОЗ внутрь нервного окончания затруднено, и их концентрация в районе митохондрий отзывается -да ' порядок ниже. Увеличение частоты МНКП в присутствии РОФ возника- ; ло через некоторое время после введения разобщителя в раствор Риягера. Это время зависит' от природы псслодуемого вещества и . от концентрации его в наруяном растворе. На рис.1 приведены ве-л1Т1гаш относительного увеличения частоты ШКП через 30 мин пос-'. л<5 введения различных Р05 в окруяандий мышцу раствор.

trt I—1-1->-1-1-1.

Рис Л. Влияние ТОФ на npf водимость БШ из фосфолишдов митохондрий А (Либерман, I9V0), на дыхание митохондрий Б . (Скулачев, IS68) и на частоту МПКИ В. Ось абсцисс: ' концентрация РОО. Ось ординат: А - проводимость искус-ствонних мембран; Б - потребление кислорола (субстрат-сукцинет+ротекон); В - относительная ч^:тста МПКП; 4 - частота з растворе Рингеры; / - частота через 30 №1 после введения в оасгвзр Рингр-п? PCO. Г - ТИБ, 2 - ДЛК, 3 - Д'Ф, 4 -• , Рис.2 на примере F-CCP показывает типичную зависимость частота ШП от времени и от разных концентраций разобщителя. Видно, чте при увеличении концентра^; Р05 нарастание частоты до максимум вдет круче, и гораздо раньеш и резче происходит спад частоты МПКП. .В прксутстви-.; .1'0Ф ваходг МыШво всех случаях был щшер-

не пропорционален начальной частоте МПКП и при увеличении концентрации РОФ существенно не менялся.

Максимум на криви зависимости частоты ШЖП от Бремени действия РОЗ определяется, пэ-видплэму, количеством иокэз Са"+, вшиедтах из митохондрий в протоплазм нервного окончания. При одной и той ке концентрации РОО ото количество у разных препаратов, вероятно, зависит от "кальциевого запаса" митохонд'жй. Следующий за. максимумом спад частоты ШМ1 мокст объясняться правде всего уменьшением количества еннаптпчеекпх пузырькоз, содерг.шщпа порции зцотплхолпнз. Именно с этим гокет бьть связано резкоз падение частоты ГЯЖЛ в присутствен высоких коэдентрацпй РОЗ, вызывающие первоначальное быстрое л очень сильное повышение частоты ИЖП. Такое не изменение частоты МЬХП во времени наблюдается после увеличения осмотического давления окружающего раствора в 2,5-3 раза (Елиох, 1938). Замена изотонического раствора Ринге-т ра с разобщителем на гипертонический раствор (за счет добавления знхарези) с такой ко концентрацией РОФ в то время, когда частота ЛКП уае существенно попцзпязсь ( f всегс в 5-10 раз большз-У^), вызывала увеличение частоты 1Ш в первыР. момент, а затем частота резко снизилась. Увеличение было не таким значительным, хеше з гтаертоничзском раствора без разобщителя. В растворе с осмотичз-!кш давлением, вдвое превипающьм норму, у препаратов, подверг-шхея предварительному действию разобщителя, частота 1.ШКП повышается всего в 10-30 раз вместо 100-300 раз в обычных условиях.

Постепэнноэ пад_адие частоты ШШЛ в присутствии Р05, ютет, 1ероятно, в какой—то степени пропоходить Еследствке поглощения

п.

ццеливипхся из митохондрий ионов Са саркошгазкаткческим рети-улумом, В нормальных уеловиях з неповрежденных клетгах печени .Carafoii, 1967) н в диафрагме крысы ( Сага/о1\, 1Э38) оо-овнзя роль в поглощении кальция пркна.гугеглт ¿ктохоыдриам и го-аздо мепкпая - чгикросоуам ретпкулума. Одаз:«? и ирису гг. j вил концентрации, вызывающей разобщение окисления и фссфорильрога-. :ся, количество е митохондриях заметно гадаем, а количество а , свяигнпого с гтакросга/.пет, напрег.га, гоегх'лько рлзряотазг. го ?.«асг прогсуодпгь как вс.-^дстБ.ге адссг2г:г:, т<.л: л лелллетт:.^ пгглгцл;лл ::оняг т.к. гглгсссга-^нлн

х ьааегая. помпа гело пугп-пп^лчл к допетого I--. 3L- в "ра?о>5~ псилсптрзкмх из чдакс? ш связузьыгз лояог Са~+ i.ru:poci-Г.Л' ( otpuV.n,' 1с;'оГ>; IOtb), а тслсЛ тяг-ооситель,

Ряс.2 Зависимость изменения частоты , МШШ от концентраций и времейй-; действия.Р-ССР. Ось абсцисс: - время после введения разобщтелй-в раствср Рингера; ось ординат:;' относительная частота ЫПКП;^0 и (. - частота до: и после введения; соответственно: I г 5. . 2 - 1С-5М, 3 - ЗЛСПЧ', 4 - 10"?

■ ы р.сср. : ■ . .. • '

' я

г/.

Рис.3. Влияние ТТФБ (А). / и;ДЕ5 (Б) на частоту МПКП в ра-, ствсре с1 нсри. содержанием ионов Са2+ (2) и в отсутствие ионов Са2+{2).Обозначения по осям ор-. дкяат такие .-е, как на рис.1, В.

А

щ

Шйа» 11Т1

и».

V V

•яг

еГ

ТТ

Ьиих —-ф

¡Ы;.4. Изменение во времени средней частота (график) и распреде-■'ления ШКП по амплитудам (шетогралйм) в присутствии 5.10"7М Т'ГОВ в растворе с'ез ионов Сз?,+(А) и 3,3,10"%! Ш •в нормальном раствора Рингера (Б;. Обозначения по осям координат телеге же, как на рис.2; для гистограмм: по осп абоцисс-амплктт,'дч МПКП в м, по пси ордннет-чпело ЩЩ!.'

"ёмкость" шшросошльной фракции мозга существенно больше,' чем "у шкросом юхеток печени « почек ( ('2«тгзгьо',^ •. хэев;, а количество ионов Са~л', поглощаемое шкросомальрой фракцией периферических нервных волокон'краба, только на порядок ниже, чем у -ишкросом скелетных мышц млекопитающих и сравнило с количество;.» Са2*,"поглощаемого микросомаш сердечных мшщ млекопитающих ' <ыёьогпглТ19С7). . , • ' ",'"'.■ ';

1.1.3. Влияние разобщителей окислительного Дюсйогилитора-. ния'пд частоту Т.СГГКП с пз.лшдн-чим котшри (■¡потягом/

Если исходное предположение о том, что увеличение частоты МЖП л присутствии РОЗ происходит вследствие появления большого колзгсзства "ионов Са2+ внутри нервного окончания, тс этот эффект не до.таен зависеть от присутствия ионов Сай+ В( пар^кнзм раствора. Исследование влияяия.-ГЙ на. частоту 1ДИКП в бескальциеьых 'растворах у мышц, выдерглпных предварительно в течение 30-90 минут в растворе Рпкгера без ионов Са^*, показало, что этот эффект разобщителен действительно не зависит от "парутздых" поноз Си , Относительное увеличение частоты ШКП в растворах, не содораящгх ионон оказывается даже более сильным по сравнению с "каль-

цневтя" растворами, по-видимому, из-за более низкого первоначального уровня частоты ШИШ (рис.3). "Латентный период" действия разобщителей оказывается в этом случае также более коротким,

: " Для того,'чтобы исключить возможность изменения частоты. ШКЛ в присутствии Р05 за счет поступления иопов а+ снарулш, были поставлены опыты в условиях почти пел:! о го отсутствия этих ионов в окружающем растворе. В таких растворах потенциал покоя (ШТ) у большинства волокон ученыяается до 5-15 мВ, а в некоторых волокнах. (с исходны},) ЕИЗК1ЭЛ ГШ) удается долучигь временное обд^и-щелне знака ПП а ШЖП; И в этих условиях в присутствии Д13 тадоз : наблюдалось значительное увеличение частоты МШСЯ обратного знака, которое, по-эвдтсму, могло быть связано только с выходом в протоплазму лопоз За""1' из цнгохондриА.

На основания гипотезы о том, что ионы Со~ вызывают слетало мембран, • экр.снаруя иг иоя^рлсстш'й огрвдс.тельк'# ипряд, исязя было думать, ':то рсзг:о; узелкчепзе.хоще-атрпциа колон Сь^ л лрь--тсп/а: глутря пергстс ж.кчэжи т Г-рлзут'Пч-;д ГМ- мс.:от но тольк'З чя<ип?у ол.'-'Шгл сл.лшглче-.ш ¡\...1гримь о IV ь-.-

о!1.ао;'. и' р'ллх. о;хь :;п;-1Г (:: соотвг-.-оть^шх пс.яьл;ик>г

1.я130, но гс-сл прниодлт.ъ л "склспегл-:;^;" -ллзлиглх елнпгтг-'.'в-с?:н" яузл-рт-коз ;!,гл с ,!Г|Г"':.'М. ¡лл* о .-о; • долхл; ;. л. -.л у; слл-л"ГЬ-л V'.'."'"": ' г.т.'Ч""-:" • •.■■^■¡"..•холл:'. .

Действительно, в присутствии РОО кабллдаетоя пометный рост амплитуды Ш1КЛ. Во время максимального увеличения частоты ЦПКП средняя амплитуда увеличивается в 2-3 раза. На рис.4 пока-, зало исзмекение во времени характера распределения амплитуд .\ЖП в присутствии ТТ5Б и НФ. Из рисунка, видно,, что во время •-• -максимального увеличения частоты МПКП распределение амплитуд становится более размытым, появляется новые классы амплитуд. Такое изменение распределения амплитуд ШКП, по-видимому, связано с увеличением числе молекул ацетплхолина з порции, £ не с уве--. личением чувствительности постсинаттлческой мембраны.

Приведенные результаты могут, по-видимому, слудигь дополнительным доказательством того, что и в нерзном окончании мнто-. хондрии являются достаточно мощным кальцпевш депо. Вопрос о роли эндочлазматического рзтикулума в поддержании постоянной низкой концентрации зсноз е протоплазме нервных окончаний эв-г слуккзает дальнейшего изучения, и существенную информацию об этом модно будет получить, изучая параметры ШКП в присутствии, веществ, заметно подавляющих активное и пассивное связывание поноз Са2+ миьрссокЕШ. К таким веществам мскно отнести местно-., анестезирующие препараты, некоторые алкалоиды и биологически активные вещества.'

1.2. рлпяние разобщителе?! окислительного Фооборилптюзанпя освобождение квантов медиатора, из нервных оконча-н'дй тепло кровные пгвотнь'Х.

Данная работа является продолжением придидущэй. По характеру возникновения, величине п форме импульсов, ЫТКП оказались очень сходными мекцу такими различными типами нерачо-ккпзчных соединений как у холоднокровных, так и у теплокровных икеотньх I», исходя из' этого мокло было предположить, что действие РОФ iw еыгсд квантов ацетилхопина будет одинаковым.

И, действительно, посла замены опрзшзпцего изолированную дпафрагму раствора Pnnrepa-JIotica раствором РОФ нг.блдцяди резкое увеличение частоты 1ЖП на 2-3 пор-гдка. Б опытах были использовали - Дгй>, ТТОБ и ТХФ. Иг рис.5 видно, что при одана-, косом увеличении частоты ШЛ ТК'Б эффекгч-чеа ДО на два порядка, что согласуется с данными, полученными на грудной ыницо лягушки. Опыты показьтают, что увеличение частоты 1.ЧПЯ у теплокровных под действием Р05 происходит бистрое, чем у холоднокровных. Интересно отметите, что действие разобщителей на частоту ?АЖЯ проявляется г заметно мрчьинх концентрациях на диафрг.гглз Kpi-'cii, чем но К'Тгж-л '.пг.эде груди ля1упхп Па нервно-мыгаечном

Рис. 5. ¿таяние тётрахлор-2-три$ториетилбенз~ имидазбла (•) и 2,4-динитрофенола (х) на частоту МПКП

Ось абсцисс - концентрация Рр^, ось ординат -относительная частота МШШ.^,- частота в растворе гангера-^окка, Л - частота'через 30 мин после введения' разорителя. •

препарате лягушки эффект увеличения частоты МПКП под действием ТТФБ и: да проявляется при концентрациях 4,0.10"^ и 2,0.10-5М соответственно, й на диафрагме 1фасы такое же увеличение частоты ЩШП наблюдается при концентрациях 1,0.10^ и 1,0.пЛ; . Время повышения частоты ШТКП на диафрагме та*же ускоряется под действием Р05. ■ ■ ' .

Из исследованных нами разобщителей на диафрап.га крысы бсь. лее слабым по эффективности действия оказался ТХФ. Так же кал н Д1Ф действие ТХФ начинает появляться при'концентрации, равной •1,0.Т0~%. Однако в отличие от Йй увеличение частоты МПКП в присутствии ТХФ при :той же,концентрации происходит несколько • быстрее. Но при. постепенной увеличении концентрации это различие начинает'сглаживаться. Так яри концентрации ТХФ, равной 3,0-5,0.10~®М, увеличение частоты ЫПКП щкзйсходе за то вре~' мя. что и в присутствии да при!концентрации З.О.Ю-6^.

На диайэахмё гсрысы бало изучено, еше 'одно вещество - П5П, ,, разобщайте свойстве, которого онлиязучаж щ искусственных ЙЕМ (Лкберкая,11968,; Борисова, 1970). •■Действие ПШ на ЩКП начинает • проявляться при концентрации г.О.КГ5!.!. В этой концентрации ПОП дает небольшое' увеличение частоты Т.ЯЖП в дза раза толы» через 30 минут. При уйеличэаиз концентрации время' наступления эффекта укорачивается. Максимальнее урёличдние частоты МПКП' в' 300 раз .получено при концентрации 6,0.10~%. В йрисутствии ТйП, теуда . ■

как й в присутствг.т других РОФ, наблюдается четная зависимость частоты МГПСП от времени.. .. . . ■;,:.„'*'

Все опыты на диафраше крнсы проводились в растворах с не-', ' измененным ионным составом, т.к. модно (Зало Ожидать, что и при•;■' изменении ионного1 состава мы получили бк те же далныз, которые ' наблюдались на нервно-мылечном препарат-э лягушки.

'„1.3. Влияние ампназима и тоДгоанила на частоту миниатюрных : ; потенциалов концевой пластинки.

В'процессе изучения механизма действия аминазина и.тофра- ' иила.'гшроко применяющихся в психиатрии как успокаивающие средства при депрессивных состояниях, мы обратили внимание, что эти. . вэщасгва, подобно всем исследованным наш РОФ повышают'частоту МПШ1. Полученные данные 'свидетельствуют о том, что аминазин и ■ . тофранил обладают сложным действием на синапсы. В малых концентрациях (порядка М^-ТО^М) вызывают понижение частоты ЫПКП., По-видимому, аминазин и тофранил в таких концентрациях,каким-то'. ■ .образом препятствуют выходу порций ацетжяхолина (АХ) из преоина-птическлх окончаний. Возможно, что этот эффект аминазщш и тоф-ранила лежит .в основе их успокаивающего действий. .'■■',"' ' . ' ■ .,. ... ¡Большие концентрации аминазина !'<

и тофранила (порядка 1-5.10"%) вызывают повышение частоты ЫШШ.,' Этот эффект имеет, по-видимому,,другуа природу. Можно думать,-например, что эти вещества подобно РОФ 'увеличивают выход ионов Са?д из»митохондрий внутри нервного окончания. Косвенным.доказательством правильности такого предположения служат розультаты опытов, в которых исследовалось действие аминазина и тофранила ;. на частоту МШШ в бескальциевых растворах. Нага показано, что повышение частоты ШКП в присутствии этих двух веществ, не зависит от присутствия ионов Са в окружающем кожную грудную кш1:-. цу'лягушки в растворе.

1.4. Изменение параметров миниатюрных потекпиьлов конце- ' . вой пластинки в присутствии .акаете о,, оуших веществ . . наркотического действия.

' , Со времени введения в лэчеоьую прак. "шу. обезболивающих • препаратов наркотического действам медицакокая наука обогатилась I :ного численными данными о влиянии этих средств на ЦНС. Су-' щестзует ынзни«, что происходит воздействие на синапсы промежуточного мозга, которое ве„;от к ослаблен:» передачи импульсов. Сднакс действие анальгетиков на периферический рецеаторннй аппарат еще недостаточ;!'. изучено. 16

.В данной■ работа сделана попытка изучить механизм действия • некоторых анальгетиков, обладающих всеми свойствен,л морфина е достикешш обезболивающего эффекта, но в то ;<се время не визит-, ющих многих побочных реакций организма, характерных для послед-'; него. Из анальгетиков наркотичёского 'лпш наш были исследовши. следующие препараты: Промедол (гидрохлорид 1,2,5~трик2?ил-4- . пропиопилокся-4-фенилпипери.ч:ша); Теподин (гидро^Огорэд 14-окси-' 7,0-дегидрокодеинонп, тригддрат); Эстоцин (гадрохлорвд дцд'.ше-.'¿'идаьшноэтиловогр.э$1гра дифекилэтоксиуксусной кислоты).

Все исследованные енальгетпт при ввидешш е окрул:алциЙ ' мыпщу раствор Рингера вызывал!: уменьшение амплитуды ШКЛ. Иолу-• чанкне данные показали, что изменение параметров МПКП иод действам анальгетиков зависит 'сан-от химической природы вещества,-так и ст их концентрации в наружном растворе, а также от врема-! ни действия. Так, вер три анальгетика, в марле концентрациях ■ дают незначительное уменьпйние амплитуды МПКП. При повышении, концентраций наблюдается более быстрое уменьсение амплитуды. На рис.б показано изменение амплитуды ШКП под действием исоле-, дованньх препаратов в различных концентрациях. Как видно из рисунка, эффективность действия разных анальгетиков за одинаковое .время различно. Так, уменьшение амплитуда под действием иромедо-ла проявляется в таких дозах, прп ксторцх теподин и эстоцин да-вч' лишь незначительный эффект. Восстановления первоначальной ' ,

Рис.6. Изменение амплитуды МПКП в присутствии анальгетиков. I - эстоцин (Ю-5Н), 2 - теко-.дин (1СГ'5М), 3 - промедол . (5,0.10"%). По оси ординат ->"' относительная амплитуда ШКЛ (норме 100$), по оси абешюс г ■ '.врекч действия вещества. . ■

величины амплитуды ШКЛ, после отшвшшя раствором Ринисра не наблюдали/Частота МПКП род-действием исследосанных препаратов не менялась. Уменьшение амплитуды ИНН при нэпзмененпой'частоте ' об поетекнаптяческом влиянии этих гэществ. По всой видимости, , акальгегош взаимодействуют с рецепторами иосгс.тиацтхг.аской мембраны, в ,результате чего часть рецепторов ог-рэчва&тся занятой и недоступной для Возможно, что в основе этого лв-

'ления лел-лт конкуренция'с ацатглхофчюм за активное месте б мо-г

лэкула мллотеого рецептора.

1.5. Изучение влияния некоторых алкатоидных препаратов на нервко-мншечнто передает.

В настоящей работе исследовалась активность четырех алкалоидных препаратов, применяемых в практической медкщше: бербйг рина бисульфата, глауцина гидрохлорида,.отефаглабрйна (сгефари-на сульфата) и сангвпритина (смесь бисульфатов сангвинарцна а хелерптина). Берберин используют в качестве желчегонного-и гипотензивного средства, однако он такге замедляет сердечную деятельность и вызывает сокращение матки. Глаушзд - пративскашгсвый препарат, одновременно обладающий щеренной гипотензивной актк- -вностью. Стефаглабрж и сангвирптрпн - ингибиторы холинэстеразы - применяются :гри заболеваниях периферической нервной системы; сангвириткн, кроме того, используется-как антимикробный агент. . Описываются результаты изучения воздействия перечисленных препаратов на частоту й амплитуду МШШ нервно-мышечного соединения лягушки, ПП мышечной мембраны и сократимость мышцы. Представлены, такта данные о влиянии эт^х веществ на дыхание митохондрий.-

1.5.1'. Действие алкзлоклов на амплитуду' к- частоту МПКП.

Все исследованные алкалоиды вызывали умэньпекио амплитуда МПКП. Величина эффекта коррелировала с концентрацией вещест- -. ва к продолжительностью его воздействия. Наибольшую активность ; проявлял Сангвиритин - он втрое сшгаал указанный параметр в концентрации 4 мкг/мл, тогда как остальные алкалоида обеспечи- . вали тот же эффект при концентрации 40-50. мкг/юг. Известно, что. . ингибиторы холЕНэстеразы,- как правило,-увеличивает адаяитуду МПКП. тем но менее в проведенных нами экспериментах сангвирит-рин и стефаглабрин обнаружили противоположный эффект. Таким образом, действие этих веществ на сияалтическую передачу не ограничивается антихолинэстеразнэй активностью. Достаточно'очевидно, . что одновременно функционирует иной механизм воздействия, с противоположным влиянием на амплитуду МПКП. В частносч'И, он молет ' заключаться в деполяризации постсинаптической • мбранн или в гюнкуренции алкалоидов с ацетплхслпюм зе связуЕание с холино- • рецепторами. В малых кондентрсдлях исследоЕанкге алкалоиды ока'. бывали практичзски одинаковое влияние на льготу ИШП, снижая её на 10-60/5, причем и б этом отношении. сангаирктрзн был наибо-. лее активным. Повышение концентрации веществ, приводило, к увеличению частоты 1Д1КП. Особенно отчетливо это проявлялось в опытах с саягвпрптрино;.;, где частота ЫИЛ возрастала почти в 100 раз, причем в последующие .''.5-30 мин с :а уменьшалась до первоначаль-

но а величины. Снижение частоты ШКП, возможно,- связано с уменьшением примеыбрапной концентрации Са**"1" за счет взаимодействия алкалоидов с пресинантичёской мембраной, однако данное лредпо-. ложение трэбует дальнейшего исследования. Как известно (Eirox, 1968), при падения прлмембранной концентрации частота МДЯП уменьшается. Увеличение частоты ШКП с ростом концентрации ад, калоидов может быть обусловлено либо пх иснофорными свойствемп и связанной с ними деполяризацией пресиноптической мембраны (Кастилло, Катц, 1954), либо действием этих соединений как Р0'2; • и освобождение Са^+ из митохондрий нервного окончания. ■ ...

' Дня выяснения вопросов, возникших в связи с подученными - результатами, было, изучено влияние алкалоидов на 1Ш мембран мышцы и на дыхание' митохендряй.

'1.5.2. Действие алкагоидов на иотешша^ покоя мембран шшы и Нервного оконч"чия.

Берберин, глауцин и стефаглайрин в концентрации 100 мкг/ ' мл, кал в сангвиритрш з концентрации 16 мкг/ил (т,е. в концентрациях, превшеавднх те,-которые обычно использовались в описанных выше экспериментах), еншкали Ш мышечной мембраны на более чем на 15$. Отсюда следует, что перечисленные алкалоиды не доказывают существенного влияния на проницаемость постсиналти-ческоЗ. мембраны и не вызывают её выраженной деполяризации, а уменьшение амплитуды'ШКП обусловлено иными процессами. Сравнительно малое изменение частоты ШКП под действием берберина, глауцина и стофеглабрпна при их невысоких концентрациях свидетельствуют об их незначительном влияпии на ПП мембраны пресина-птического окончания а исключает-вероятность деполяризации этей мембраны.

1.5.3. Действие алкалоидов на днкание митохонлржЦ.

Из рис.7 видно, что берберин, глауцин и стсфаглаорин в . концентрации до 100 мкгДи не влияли на скорость дыхания í^ktü— хендрий в четвертом состоянии (скорость окисления в присутствии только-субстрата, состояние покоя). Указашше алкалеццы не ока-si-вали воздействие гакае на дыхание в присутствии адзнозивдкфо-сфата или ДПФ, т.о. иг величину дыхательного контроля и индекса разобщения. Иными словами, дыхание мктсхоядрл2 пул использов^-нли оухцтнета в качестве субстрата но регулируется вьяяепазвая-иыш1 соединениями. Напротив, саягвЕритгнк в концер^рэлш до 100 мкг/iuw ускорял дыхв-ние, прлчем величина ьффекта возрастала

с увёличэнйем кой'- нтрайии алкйлоида. При дальнейшем повышении • концентрации сангвиритрина скорость дыхания уменьшалась:до ис~ ; ходной величины (в отсутствии алкалоида) и,ниже. После рведеюя< й среду инкубации митохондрий 4мкг/мл сангвиритрина величина : дахательного контроля падала , до единицы. Таким образом* очевидно что действие сангвиритрина состоит э разобщении окислитель-."; пэго фОсфррилирования (Николе, 1985). Приведенные результаты, ; . во-первых, согласуются с дёнными, полученными ранее для одного, ." из компонентов саагвгфитрина - хелорктява, а, зо-вторих, указы-,.' жфт. ка то,' что увеличение частоты МПКП вод действием сангви- . рнтрина (в отличие от трех других алкалоидов) сшгэапо, 'в перзув • • очередь, о его1 разобщагнцим аффектом в отношении митохондрий чер4 вного окончания* Можно полагать ¿ что антимикробная и вртостатп-.сткческая активность этого алкалоида такке обусловлена разобща-' ювдм действием. Такой механизм влияния характоренй для многих : Других цитостатиков, в том числе о противоопухолевым действием.

«."«ей

Рис.?. Действие алкалоидов на" / " частоту ШКП; V ■

■ а - ири использовании V ' 4.10 (I) и 4.10"2(2)

мг/мз берборана, а таюко 3( '.'■ 2.1<Г3(3) и 5.10~2(4)

мгДи стефаглабрина; > -. б - при использовании ' " к . 5.10 (I) и 5Л0"2(2).

мг/мл глауцина, в тагай ' 4Л0"4(3) И.4Л0-3(4) . сангвиритрина. По оси . абсцисс -> врет действа: вещества, мен.; по оси ординат - 6те. изменений честог_- .МКП (ва единицу принята частота перед до-, бавлекие« вещества..

Рис. 8. Зависимое гь скорости митохондрий -. в 4 состоянии от концентрации алкалоидов. 1-глаушга,2-стефагла-! брин, З-берберин, 4-сангвиритран.

Ось адсщсс - концентрация вещества (ЬГ/ш), еиь ординат~относ. изменение екбрестп даедняэ гатзх.

.> . . . 1.5.4. Влияние аткалоидов на докгатимость'ммшн, . .

>- Стефаглабрин и сангвиритрин в концентрациях свышз 2 и 4

ккг/мл соответственно вызвали повторяющиеся сокращения мышцы, •. ¡Что свидетельствует о сшсюния порога возбудимости'мышечного »от : докна. Этот эффект согласуется о наличием антихолянэотерпзно!: активности алкалоидов и подтверждает противопоказания к' гас прит ■ .менениюв случаях эпцлепешг, гтаерклнезоз и сердечной патологии : (Ыашковсклй,198б)* Еерберин и глауцин в концентрациях до ,50 и • ЮО мкг/мл соответстванно не индуцировали мьпзешшх сокращений, ' однако введение; в' средуглауцива в' концентрации 2 да/мл вызьза-, ло .контрактуру. •

. .Описанные выше результаты позволяют сделать вцвод, что . все * исследованные■ алкалоиды воздействуют нанервно-мышечную передачу, щячеы, тс аклшность (по ет^йией мере глауцява, сте-'фаглабрина "и сангвиритрина носит- комплексный характер. Основной эффект сшггаарптргка - уволпчениа частоты ЩШП за счет разэбще-. ше! окислительного фррфорютровадшя в митохондриях нервного чв окончания - дополняется аятихолинэсторазкым действием и сниже-;'нйем"ампл1ггуды ШКП. Ашфёноыиметйтгеским свойствам глауцина 'сопутствует способность снижать амплитуду ШКП, а при высоких ^ концентрациях -. выз1хвать: кЬнтрактуру :мышцы, Только 7у берберана наблюдается 'относительно простое дейтсвио— уменьшение амцлцту-' ды'МПКП, согласующееся б его миорелаксантной активностью. Сложность физиологической-активности рассмотренные алкалоидов ре . обходило учитывать, при. их использовании, Гт.к. в зависимости от ' епбеоба введейия, а "также концентрации одно и то же вещество , мо'же? улучшать, или у^да&ть перэдачу возбуащення в нервно-м»-ше*шых синапсам. . : ■

1.6. Изучэдае вл^шия локальных анестетиков рр освобоз-: денид' по1ямй: медиатор из нервных окончаний.-

Исследовано влияние некоторых .'ыестноаяестезирующю; веи^г. стЕ. (норкаин, новокаин, виадршг, трпйекалн/ лидокашгй"его аналога ОХ-314 и- ОХ-572).. Бса они' обладают1 постсшцштическил дой^ " станем, о чей свидетельствует уменьрзеаке тпшкуды ЩВД, -Из- ■'; веетво,- что маетные анестетики (НА) вызывают уменьшение воабу-.1 димости мышечных я нерзш'х волокон (Шенпс, 1958). Под влияние^ • анестетиков уменьшается, ашугзтудз. потенциатов действия, (ИД) при неизменённой величине. ПЛ. . •

-Умонменяэ яшляуды 1.ЙПШ в присутствии норкадна -1' новока-

ша наступает в первые же минуты после смены растворов и уже через 30 мин МШШ на уровне шума. Более, слабым гостсиналтичес-,;,. киг.1 эффектом обладают трямекаин и дидокаиз. В опытах, с этимй . ; веществами удается проследить характер их воздействия на освобождение медиатора в течение длительного времени (более I часа);

В присутствии тримзкаина (1,0.Ю~Б-5,0.10"%) скорость ' уменьшения амплитуда ИШП зависит от его концентрации. Так, при концентрации 1,0.10"% незначительное уменьшение амплитуды наг' блюдается после 50 минут. А при увеличении концентрации на; по- : рядок, уменьшение амплитуды в два раза наблвдается уна через 5 мин и к 30 шн эксперимента ЬШКП полностью исчезает.•,

Лицокаин в изначальной концентрации 1,0Л0~% на окаэыланл никакого влияния на частоту. МШШ. Амплитуда также остается без ., изменения, однако наблюдается незначительный рост средней вели-- -, чины за счет исчезновения ЫПКП ,с большей амплитудой и- появления потенциалов меньшей величина. При увеличении концентрации ладо-., каина до 5,5.10"% уменьшение' амплитуда происходит быстрее. •"•• Если принять величину амплитуда МШП за I, то в присутствии ли--'. докаина амплитуда уменьшается в 1,5 раза. Причем, такое умень- . . шение наблюдалось в тетгение. всего опыта (бОмин). ЧастотаШКП., остается без изменения. При концентрациях 3,7.Ю~^-1,0Л0**4Ы ■ наблюдаются изменения уде через 5 мин - частота уменьшается в 2,5 раза и к концу эксперимента значительно увеличивается ко-. ' личество МПКП с меньшей амплитудой. .

Б "последнее время некоторые ЫА стали широко применяться 1 при лечениях различных нарушений сердечного ритма. Например, . лздокаин является наиболее часто применяемым препаратом йри острорэзвивапцихся желудочковых аритмиях; используется для пре-дупрсвденпя внезапно возникающих фибрилляций и остановки сердца после инфаркта миокарда. Для избегания побсчных явлений, возникающих нередко при использовании лидокаина и увеличения времени действия антиаритмпческого эффекта в последнее время стали при-;, меняться четвертичные аммониевые аналоги триме^лна и лидокаина. Показано, что производные лидокаина - СД-ЗТ.4 и <2Х-572, также как и лвдсшаин, в малых концентр:-ц1Ях вызреют незначительное Езмэнениз со стороны амшттудн МПКП. Прс ¿хсличении концентра- • ции <5Х-57Я наблюдается уменьшение амплитуды через 30 мин пссле добавки почти Едвое от первоначального уровня, а в присутствии ЧХ-314 такие же изменения саступают через 10 мин, но при концентрациях гораздо меньших, чем у лидокаина и ОХ-Б^г (1,0-10"%)

Б присутствии 0Х-5Г2 в течение 40-50 шш наблюдалось уменьшение 22

частоты ШШ1/ а затем, наступало медленное нарастание частоты ' . на 0,5 порядка с последуюцим спадом. - ' ,

На нервно-шшечшм препарате последовало также влияние синтетического стероидного, анестетика - впвдрилв, .получившего наибольшее распространение в качество снотворного'во врещ ояе-■ рацаЗ, проводимых под мастнш обезболиванием.- Таюто, как и под действием друпьг МА, виадрил в малых концентрациях не влияет :на частоту ШЗП. Агщлитуда, уменьшается, вдвое. ,С увеличением ■кон-*"-.. . дентрацик наблюдается .повышение частоты до максголума, с "послед 1 дувдим медленным .спадом. Одновременно о увеличением частоты на. бяюдалопь ■ уменьшение га-шлзггуды в 2-3 раза по сравнению о раствором Рингера, В период "стабилизации" а стадии уменьшения частоты. МПКП- наблюдался-Ейброс отдельных потенциалов, которые дало отнести к разряду так называемых "гигантских" МПКП (рис.5).

г*>

Рас^Э.. Изкенепие во временя оредней частоты-(график) и распре-т деление МПКП по амплитудам (гкотогрглща) в присутствии виадрила Г (3,10~2мг/ил). Двя графяка: ось абсцисс впемя'поете введения виадрила в,раствор Рингера; 005 , \ ординат - относительная частота ШП-Д, Для гистограммы; ,, ссь абсцисс - агоштауда ИЦКЦ в юиличолмах; ось орди-' пат - тлело МПКП-.

Исхода из по-г^ченных данных, монно заключить, что нсследо-' ванные МА обладают двояким способом влияния на кервно-мшечщю передачу. Наблюдаемое увеличение -частоты МПКП в присутствии не-, которых МА можно объяснить тем, что они, подобно РОЗ, способствуют, по-видимому, выбросу ионов Са2+ в протоплазму нервного окончания. Однако механизм действия Мк лельзяобъяснкть выдвинутой ранее Е.А.Либермапом (1968) гипотезой о том, что взаимодействие кальция с мембраной йервного окончания возникает только замечет простой э!фанировки заряда. По-ввдпмому, все же ионы Сай+ вступают во взаимодействие внутри клетки со специфическими белками и ионными каналами. '

Блокирующее влияние МА на порог возбуждения увеличивается при повышении концентрации Са2+, в то время как их постсинапти-чбекий эффект не амплитуду и скорость развития восходящей фазы ПД ослабляется избытком кальция. Вызываемый новокаином блок усиливается при недостатке ионов yfa+. Предполагается, что угнетение электровозбудимых элементов развивается вследствие угнетения способности мембраны повышать избирательную прошщве-мость к ионам j/в? (Шаповалов, 1966). Исследования» проведанные на гигантских аксонах кальмара, показали, что новокаин угнетает не только нетриевый ток, направленный внутрь через мембраны, но также в проницаемость для ионов К* (1 Hodgkin, Huxley»: 1952). По-видимому, угнетающее воздействие МА на возбудимую мембрану связано.с каким-то химическим взаимодействием мегду ними, причем для*этого взаимодействия анестетику необходимо находиться.....

на наружной поверхности мембраны. Показано-» f-D»i c&etillo, KaU,i 1957), что инъекция анестетика внутрь нервного волокна не вызывает угнетения холинорецегторов концевой шшетинки.

Объясняя механизм действия МА надо исходить превде Bcei'o из особенностей их химической структуры» физико-химических свойств и, что они представляют собой ионизирующие соединения, влияние которых на мембрану зависит как от наличия свободного основания, так и катиона. Степень ионизации К,'., обычно представляющих собой третичные амины в водной с\ пде, зависит от их констенты ионизации (рКа) и заа1сния рЬГ виды. Лропзводные новокаина и лндокаяна бло:<ируют воротный ге .-низм обращенного внутрь аксона устья натриевого канала. Это происходит благодаря взаимодействию катиенной группы (т.е.. четвертичного амина) МЛ с анионными рецепторами углтл. Диффузия МЛ к внутренне?.^- усть-о натриевого канала через лппидный метрике мембраны осуществляет-

2 л

ся благодаря электрически нейтральной третичной аыинной группировке МА. Анестетики блокируют повышение натриевой проводимости мембран, ведущее к генерации ПД, Среди третичных шинов катионы обладают более высокой активностьп, чем нейтральные фор.ш л незаряженные молекулы. В опытах с фиксацией напряжения на одиночных аксонах обнаружено прямое взаимодействие третичных и четвертичных VA с натриевыми каналами. При этом' происходит обратимых блог. воротного механизма,. который регулирует отзыва-' ние п закрызанна канала. 1.IA предпочтительно -связываются с от,- • крытыми натриевыми каналами. Этим объясняется углубление блока проведения при повышении частоты раздракения в присутствии ill (i Strichart z7 1276).

Высказано предположение ([Akutagawa} 1984), что ионы усиливают блок проведения МЛ в седалищном нерзе лягушки. Повышение концентрации ионов Н^* в бескальциевом растворе Рингера от 3,0 до 20,0 Ш в отсутствии IIA усиливает частотонезависимый . блок проведения суммарного ПД н не влияет на частотозавнсимый блок. Бензокаин (снн.норкаина), лвдокаин и его четвертичное производное - QX-572 усиливают оба типа проведения суммарного ПД. Увеличение концентрации Мо2+ в присутствии МА усиливает как частотозависжлый, так и чаототонезаЕисимый блок, вызываемый QX-572 и лидокакнсм. Полученные результаты указывают на существование взаимодействия между ионами Мо?* и МА в седалищном нерве лягушки.

Г.7. Изучение влияния некоторых других йатыакологичаоцЕХ препаратов на освобождение квантов медиатора из нервных окончаний.

В данной работе изучалось влияние на синалтическую передачу соланина, децшгамина, декамбтонкя морфолпна, пикриновой кислоты и госсапола. Эти препараты по сзсэй химической структуре имеют общие характерные функциональные группы, хотя и отно-^ сятся к различные классам соединений. Tai: как изучение механизма действия исследуемых веществ тлеет большое значение'доя практической медицины и для понимания происходящих процессов ъ периферической нервной система, нами и была предпринята погал;са раскрыть характер их влияния на осЕобоздоние ацетилхолина из нервных окончаний грудной мыпцы лягушки.

I.7.I. Изучение влияния соланина на а'псгтлческур

тушть

Соланин принадлежит к группе стероидных глико£..*тсглоидог.

Представление о характера действия этого биологически,активного вещества весьма противоречивы. Сходство структуры соланина о ; 1'ликокортико стероидами и сердечншк гликозвдамн явилось основа-^ аием для изучения его фармакологического • действия. С другбЗ-' ; стороны, солайян привлекает зкспвримейтзторбв в связи с его'.тератогенным и токсичным действием на раадичные организмы. Хлог ; риотоводородную соль соланина в растворе Рингера применяли в ' опытах при концентрациях I? 2; 5.10~7М и 5.10^1. Полученные _>' данные показывают, .что соланин в концентрациях I и 2 Л0~7М не оказывают никакого влияния на параметры МПКП. С увеличением концентрации до 5.10т7М набЛццается небольшое повышений частоты' ;. МПКП (в 1,5 раза), которое через Ю мин после сменыраствбров . понижается до нормальной величины и остается такой, в теченйе.:. : всего опыта. Однако величина амплитуды МПКП уменьшается сразу 7: же после земены раствора Ршгера раствором соланина. При повы- ■ шекии концентрации соланина на порядок наблюдаетсй резкое. уиепь-шение амплитуды МПКП, тогда как их частота остается <3ез измене-' кий.,"- •• '.■'*.' - -■-'■

Исходя из этих данных моляо предпсхйожеть. что присутствие . ; . соланина в окружащек нервно-мышечный препа^т лягушки растворё . не препятствует выбросу. квантов медиатора из прэсинаптичееккх •/■■' окончаний нервного волокна, но уменьшает, по-видашму, количеств .., во молекул ацетилхолина в зтих порциях. '

■ 1;7.2. Изучение влияния комбинированных лекврствишнх

сгёдотв на параметры Минватйтанх потенциалов - . ' . КдтеврЙ ¡ТОШРМ.'

Из описанных ранеэ дашшх.следует, что такие; вещества, V как Р0«, при введении в окружающий нервно-мышечный препарат ра-. створ Рингера вызывают разкое повышение частоты МПКП. При изучении механизма действия децюшмина бклиполучены данные, пока- • зывающие влияние на параметры ШКП дедиламийа и РСФ. Однако, по характеру действия имеются существенные различ е. Во-первых, РОФ увеличиваю!- частоту ШКП не сразу после. см;;лы растворов, а • "'• чорез определенный промежуток времени. . Во-вторых, в присутствии . РОФ по мере нарастания частоты. МЛКП увелг _-вается Я их амшштуг . , да. В случае же с децпламином наблюдается обратное.явление - по мере увеличения частоты МПКП происходит резкое уменьшение их амплитуда и через небольшой промежуток времени наблюдается Исчезновение МПКП. Такая же,.картина наблюдается и в бескальциэвых •. растворах. •

Дециламин- при концентрации Г,С.10~5 Мне оказывает .влет-, ния на параметра МПКП. Повышение частот в 15-20' раз черео .15 /' .минут после, смены растворов удалось наблюдать при концентраций Г,ОЛб_4М. При этом наблюдалось резкое угнетение со сторонн амплитуды МПКП. Ввиду последнего обстоятельства, была предпринят^ поййиса пролонгирования действия дециламина в смеси с Езерином способного в точение длительного времени сохранять величину- амплитуда МШИ. ( Зкклз,) .1966). В описываемы: Ниже опытах

смесь раствора децпламгна с эзорином (ДЭ) использочалась В'1'• .'концентрациях.1,0; 2,С; 5,0.10~®М в нормальной растворе Рингерэ < и 3,0.10"^ в бёскальциевой сфедв.ЕЭ в концентрации 1,0.10"% ■ увеличивает частоту в два раза и во столько ке раз уменьшав:?,/ шшитуду .ШШ. Такой эффект наблюдался в течение длительного . времени. При увеличении концентрация до 2,0.Ю~®М частота МПКП увйАичиваетсй в пйТь раз-ухе через 5 мин посла смены растворов;:, а при концентрации 5,0.10"% частота увеличивается за то жа вра-. мя почти на порядок, б. бескал^циевой среде при. концентрации ДЭ; 3,0: КГЧ! ужв через минуту послз смены растворов частота 1ШКП ' увеличивается в ,трй. раза с одновременным уменьшением амшштуды;1 ; В дальнейшем на фоне повышения адстотн МПКП наблюдалось умень--. ~ шение их омшштуды до з^вйй шума. • •

Пикриновая кислота (ПК) По.эффективности дойствля на па-, раметрн МПКП занимает в рйду йсследаванных нш.О! РОФ последнее место и.относится .поэтому условно к "слабни" разобщителям. Но. ц отличие от "сильшлс" РОФ ПК проявляет свое действие яа частоту МПКП почти «разу же после смежна растворов, но в концзнтращт гораздо больГ'х, чем 1,0110"%; Смесь дециламина с пикриновой кислотой (ЩДд) б малых концентрациях1, так же каа и дешвгамин без прйлеся не влияет на частоту МПКП. Увеличение частоты ШШ1 сраау же посла добавки наблюдается в присутствии ПКЛЛ при конц. 5,0.ХО"5!,!. Здесь также,, как и в опытах с децяламтшом, без при-кеол 2 в ДЭ наблюдается уменьшается .величины амшштуды '.ШКП. Ео вЬе* опытах в растворах, с нормальным донным составом и в бес- " кальциевом растворе ПП не изменялся. Эффект дей гвия дециламина как в чистом виде, так и в смеси легко устранятся стмнваняем нервно-мышечного препарата лягушки раствором Рз:нгера.

Сравнивая эффзкт повышения частоты ИПШ, и в растворах ПКДА и в ДЭ,. мояно предПолояйть, что децилвмин подобно РОФ спо-сойствует выбросу ионом Са из юггохондрий и саркоплазматиче-ского репкулума. Уменьшение величины амплитуды МПКП объясняется, по-видимому, постсиналтичесысл свойством дециламина.

1.7.3. Изменение параметров миниатюрных потенциалов концевой пластинки поп влиянием декаметония.

Один из синтетических заменителей кураре - декаметоний, стойко деполяризует концевые пластинки и мышечные мембраны. По ' влиянию на нервно-мышечную передачу декаметоний в несколько раз' превосходит c¿ -туОокурарин. В практической медицине де&етоний применяется для расслабления скелетной мускулатуры. В опытах были использованы растворы декаметония в концентрациях, равных i от 2,0.Ю-7 до 6,4.1o-7.',! и 2,0.10"%. При повышении концентраций вещества частота МПКП повышалась вдвое уде через две минуты поело добавки (2,7.10"%) в в 4 раза при кош.5,0.10"7!! за то .же время. Показано, что степень повышения частоты ШКП зависит от времени действия декаметония. Амплитуда ШКД при данных ков-¡ центрациях не меняется. При увеличении концентрации аа Т,5-2. ;порядка уже в первые же минуты после смену растворов наблюдается уменьшение амплитуды МПКП вдвое, хотя частота при атом значительно выше, чем в растворе Рингера. Такая картина наблюдает-.ся в течение короткого времени (5 мин), а затем 1ЮКП полностью ■исчезают. Величина ПП при этом падает с 65 до 5 мВ. В этих у_:-'довиях наступало блокирование нервко-мшэчной- породачи. После отмывания раствором Рингара наблюдалось восстановление параметров ШЭД.

Из полученных данных следует, что высокие концентрации декаметония реагируют;' по-видимому, подобно кураре, с рецепторами постсинадтической мембраны, в результате чего выделившийся . медиатор не может с ними взаимодействовать. Предполагается, что холинорецепторы поперечно-полосатых мшщ заняты ионами Са^+ или и, что декаметоний взаимодйствует с рецепторами путем вытеснения ионов (Тейлор, 1973). Высказано предположение, что молекула декаметония (в своей химической структуре) одним концом взаимодействует с активным центром рецептора, другим с дополнительным анионным участком, при этом от монет вытеснять два . иона. ,

1.7.4. Изучение влцянил на синаптичеcirro передачу госсипо-ла и горФрчина. . *

При изучении влияния РОФ на освобождение квантов ацетилхо-лкна из нервных окончаний был исследован-продукт, получаемый при переработке хлопчатника - гсссипол /2-2-Ди(1,6,^-тркокси-3-метршг-5-изопропил-8-альдегидонафт1ш/, относящийся к группе фенолов, и который был ранее изучен на Ш.1 (Касуков, 1969).

25

Под действием госсипола наблюдалось повышение частоты . . МПКП, однако, в отличие от всех исследованных РОФ, госсипсл вы-", знвал уменьшение амплитуда МПКП так же, как и дециломин, с той лишь разницей, что это уменьшение наступало в первые же шнуты после смены растворов. Время действия госсипола на частоту МПКП, исчислялось от одной минуты до 25 при концентрации 1,0. КГ^ и до 5 мин при концентрациях 2,0-5.0.Ю-5!.?. Такое действие госсипола, когда частота МПКП увеличивается лишь в 70 раз, а амплл- • туда уменьшается до уровня ниже, чем в растворе Риггера, объясняется, по-видимому, непосредственным его воздействием на поот-синантпческую мембрану.

Таким гее постсинаптическим свойством обладает, по-видамо-му, и корфоллн - представитель РОФ, содержащий аминогруппы. В первыа же минуты после добавления морфолин вызывает уменьшение амплитуда МПКП, тогда как их частота остается без изменений; • ; затш через 15 кик после добавки наблюдается незначительное . кратковременное увеличение частоты МПКП, которое остается ноиз-мэненннм 15-20 кия, а в дальнзйшем происходит спад до первона- ' чального уровня. Как ввдно из рис., амплитуда ШКП за это же время уменьшалась вдвое.

2. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ МЕСТНЫХ АНЕСТЕТИКОВ НА ТШШ РАННЕГО РАЗВИТИЯ ЗАРОД ШЕЯ МОРСКИХ ЕЖЕЙ.

Одной из важных проблей клинической фармакология являются нежелательные эффекты от применяемых лекарственных средств.. Для успешного предупреждения нежелательных реакций организма необходимо как м/шо более четкое представление о механизмах развития таких реакций. Некоторые лекарства (цитостатики, антибиотики, наркотики и анестетики и др.), назначаемые беременной жедаттче, могут оказывать действие на будущего ребенка. Исходя из с ■ :„?о и были проведены нами эксперименты с целью обнаружения эмбр;: : токсического воздействия некоторых МА на ранних стадиях развития зародышей морских елей, легко наблюдаемых визуально.

Плазматическая мембрана яйца морского ена участвует в активации делений посла оплодотворения посредством установления определенного уровня рН цитоплаз?® (рНц) за счет стимуляции Ма+/Н+-обмена. Очевидно, что изменение рНц является только одним из многих процессов, к которым приводит взаимодействие спе-рлия с рецепторам яйца (Волкова, 1986). К числу немногочисленных агентов, обработка несплодотБорекнкх ягод которыми сспровол-

дается изменением темпа эмбриогенеза морских ежей ь период от оплодотворения до шлушеция,-относятся M ( Kojma. , 1985). С целью, еыяснзния механизма действия I.IA нами проведено измере-кие рНц зародышей поело их обработки новокаином (НК) и лидокаи-

Hçu (ЛК). " ' . - : ; ' ',.

'Л1-.. Икру.и сперму плоских морских ежей •

долученную стимуляцией 0,5 M KCI, трпдды отмывали фильтрованной морской водой .-..Икру обрабатывали в течение 10 мин MA (НК в конц, I,$.10.20 мУ, ЛК и тримекаин СПЯ) - 1,5,10 мМ), трижды отмывала; фильтрованной морской водой, осеменяли интактной спермой, ' шювь стмыв&ли, а затем инкубцровалИ в чалщах Петри при тех же условиях, что и в контроле (температура-.20-23^0). Прй такой процедуре отмывки достигалось разведение агентов более чем в .500 раз. Стадии развития устанавливали по таблицам. (Еузников, 1975), длительность отдельных стапов определяли по времени до. стиж'зния данной стадии ',0^ зародышей в чашке . рНц измеряли с помощью лшмшкецэнтного микроскопа с измерительной фотрнасад^ой 'ЙШ-1 цо спектру свечения в^трщ^еточкогефлуора едина. Работа проводилась на побережье-Японского'моря на морской базе "Ви- . тязь" ТСИ ДВО АН-СССР, '. ' ■ . '■'"" ■

•<, , 2.2. Влияние частных анестетиков на тнний рмбшбгеназ. :":

• Обработка новокаином и другими исследованными MA в течение 10 мил не вызывала в яйцах изменений, свидотельствуиоих об их активации. Ни в одном случае нэ обнаружено ртделения оболе--чек юш дробления. йвщетвеввкм' oiraséinaarо?дшздеи'<$кио изме- , аение поверхности от склццанной до болеегладкой, характерной ' для оилодотворешшх яиц,:Оплодотворение ародобрабсташшх НК:'.' ' яиц сопровождалось появлением различных'отклонений : в развитии.• . Во-первых, {Ж в высоких концентрациях {I0-2CL2.Î) црепятствов,ал отделению оболочек. îjtot эффект связан, по-видаа!р;.1уг.,с-торможением кортикальной роакцки вследствие нарудешш взаимодействия плазматической-мембраны.с Мембраной кортикальных гранул. Около '

зародышей, не отделшзигих "оболонки, качиналид ежиться, мно-j :q из них были полкспермными.' Заррдыпш, не .отдалившие; оболочки' "и •■ не ' дробившиеся, вероятно, ;.бшш нершюдатвореннш.а, ' хотя .у ча-. ста из них наблюдали множественные цитастеры. другой1 эффект НК при конц. 10-20 ni! - снятие блока полиспермии. Полиспермия наблюдалась у зародышей с неотделившииюя' или частично отделившимися

■ оболочками,' что.и могло бкть причиной наблюдавшегося'эффекта,'.■.} В нескольких опит ах ;.ты наблюдали ICO^-ную полиспорсию прь час-? -тичном отделении оболочек. С другой стороны, при концентрации" , НК 10 Ш полиспермныш оказывались п 10-40$ зародышей, отделивших оболочки'. Полиспаршше зародыши посла вылушгонкя дегралпро^ вали. При низких концентрациях НК (1-5 liA) зародыши после . оплодотворений, как правило, отделяли оболочки и нормально развива-'лись; число полиспертых яиц нэ превышало 10$. 'Три обработке .., I Ш НК полиспермия могла быть индуцирована потпганяем рН глор-' ской воды до 9,0, в то врзмя как концентрация НК 10 Ш при -рН • 7,0 в тех же партгах икры полиспермии Не вызывала.. У

- Гидокаин в концентрации 1-10 Ш не пнгибировая отдедащя ; 'оболочек, однако мог-вызывать полисвермш. При-кощ.10-МЫ--15-'-'. 30$ зародышей оказшижсь полиспериными, а около Ъ% зародышей '. пё дробились. Остальныэ зародыш развивались нормально, но, каг.^ правило, их Ёйлуплояиё наступало раньше, чем в контроле, как в -в случае НК; Было обнаружено; что при обработках НКи Ж в конц, 5-Ю iH I деление начинается несколько раньше, чем в контроле. По результатам более десятка 'опытов среднее ускорение в периоде-0-1 (от осеменения до I дэлендя) у обработанных зародышей соо-:. тввило 4(й±°>9 мин до сраввенйр с контролем, развиванзицся пра: той же температуре; Во всех случаях, когда I деление после об- ■ -работки наступало раньше, чем ь контроле. Среднее ускорение зы-лупленин в этих опытах составило 44+5 мин. Наблюдалась обратная зависимость длительности периода 0-1 и времени внлупления от-конц.НК и Ж в диапазоне 1-10 Mi-

Что йасгется начала выселения клеток первичной Мезенхимы, то оно не только на ускорялось при обработке, но л часто несколько тормозилось. Выселение клеток первичной мезенхимы з норме начиналось в среднем за 30 мин до лылуплення. После обработки МА с зозраотаняем их конц. сокращался интервал времени между U начали выселения меэенхшгшх iuibtok и вылупленгем. Часто мезенхима начинала выселяться уже после внлупления. Этот результат связано не только с более ранним наступлещ и вылуиления, но и с некоторым торможением начала Быпеления мезенхимы. Таким образом, высокие конц., НК и ЛК нарушают эмбриогенез, знгибируя оплодотворение и дробление и способствуя полиспермии, возможно, в результате нарушения процесса отделения оболочек. При болео низRiix концептрацг'ях ошт не только не препятствуют эмбриогенезу, но и ускоряют наступление некоторых стадий развития: I деления дробления п вылуцленал. На скорость последующего развития, за

исключением отдаления начала гаспруляции, анестетик? существэя-. дш.образом не .влияют. ;..;■ , •. ' :. 1 -

V2.3. Влияние местных анестетиков на рН питогртазмн яи^ . \ зародышей'. "■• Уу -

Новокаин в конц, 5-20 iM вызывая увеличение рНц неоцподо-терренних яиц в среднем на 0,09 эд. - от 6,4I¿G,Q3 до 6,60+9,03 .ед,. а ЛК в конц, I—10 til па 0,06 ед. -г от 6,42+0,01 до 6,48+ .'!"' V0.03 ед. У обработанных НК яиц обнаруженаз&вискмооть степени. ' ^увелачеачя рНц от исходного значения рНц неоплодотворешшх яиц,' 'а тоща увеличение рНц под влиянием НК бцдо большим при более'-ни^скх исходных pHL, Как правило наблюдалось изменение иорфоло-' ' гии .обработанных Ж яиц. Изменение рНц неодлодотворениш: якц ■ .

влиянием НК.было,необратимым.. • ' ч .''■'.' уУ После одлодствррения р^ обработачных ШС яйц была ниже. , ¡«ормы, при этом увеличение рНц во время оплодотворения составн- ,. до в нор«? 0,2Э+0,U3 ец., а пселе обработки --0,14+0,03 ед. Lo-, лее слабый; в среднем оТвзт обработанных ящ на оплодотворение -■был .связая с практически' подои ш^ибированием изменениям рЬ*'у 'щвд, не отделявших оболочки. /. : " ' . ; ' .., '7,

Но^чешшр при обрабог/.е Ж результаты позволяю?.утверк-/дать, что в конц.-, нарушающих развитое, HKj 'вогпервых, увели- • чивоет рНд аеошюдотворе'ннцх яиц, а во-вторых, вдгибкру'ет уве-' лишение p^j в ответ на. оплодотворение,. Тарим'.о6щ$ои, обрабог-. ка НК в тех случаях, когда она не-нарушала эмбриогенез,.могла сопровождаться нэ только увэлаче5:ием р1;ц- яиц до оплодотворения, " 'но и установлением белое высокого рНц цослз оплодотворения.' ;

. Лздокаин, не ^зшгавдий в • Ьспользошцшх -рянц.' 'аямюлйй развития, но стимулируюци£ ускорение вшгупяршш зародышей, был ': исследован на'прздмет стзирНус ускорением эмбриогенеза. Пс-сле обработки I и 10 мМ1К внлушеаие наступало на 30:ман, а. • • при 3 и 6 мМ на 15 мш1ральше, чем в контроле. Теяим образов, после обработку ЛК в тех конц., которое на нарушают нормального эмбриогенеза, средние значения ; рН^ после оцлодотверения были •' '. ваше нормы. -Эт9 yaajfaemefKj&swi>usa¡u?i .лвлявтся'-в .перадв-оад-редь результатом увеличения рНц веойло^л'ворегшых ялц.под. азд-JT-.юм обработки..', . .■.•-.-_ •-;•'.. .'.'.'.. .'-.. 'pHj, оилодотвоенных после обработки, яиц молет оказаться как -нижа, так я рышз нормы, Повшзецие .р{1ц у оылодйтворешшх яиц, как коказывают «зазрения, связано с тем, что узеличенню рНц яеоплодогверешых яиц шд влиянием обработки добавляется ана-

' логичное нормальному згвеличенпп рК^ после оплодотворения. В .fe

■ se..случаях, когда pIL оплодотворенных после обрсботки яиц ока-.' : зывается ниже, чем plL в контроле, это, по-видимому, сачзано с

пнгйбпрованием изменения рНц обработанных яиц при бплодотвсрэ- ' нии. Йогда же значения рРц после оплодотворения были увеличив' ны, били ускорены и некоторые процессы эмбриогенеза, в частно-стинаблюдалось более раннее вылупяенне зародышей. Уменьшение plijj у оплодотворенных яиц после обработки, кш:' правило, коррелировало с полной остансвкой развития, начиная с моганта отде-' лети оболочек. Возможно, различия в ответе.яиц на обработку Щ' связаны со степенно изменения Ими плазматической мембраны neo- . плодотзоронного яйца. 3 одних случаях вызванные изменения «4« . нарушают процессов, связанных соплодотвореаием, в других se ах:' ; ипгибируют.- Однигл из возьюнннх механизмов, изменения хода разви-' тия зародышей после предобработки LÍA может быть непосредственное '.увеличение рНц этими агентами как слабыми основаниями. Однако, они могут такзге влиять; на Аосфолипидное окрунение мембранных белков, за счет увеличения текучести мембраны : ,1972)

'.'иля, скорее всего, на взаимодействие мембранных и цитоплйаш.ти-; чёских белков ( Posf* > 197$). ■ ' ,

."' 3, ИЗУЧЕНИЕ »МАНИЗМ ЛТЙСТИЙ ФАКШСОЛОШЕСКИХ ПРЕЛА-' ' ,'.';':. PATÓB НА .ДОДОЬЙЯ ЬГШЕРАНЛХ.

Одной из актуальнейших проблем современной биологии является пбнгмание таких ванных биофизических процессов как обмен . веществ"я.йояоз между клеткой и средой, синалтическпе проведение , генерегрч нервного импульса, мешембр8нноо взашодействиэ ' л т.д. Однако'молекулярные механизмы этих процессов остаются . неясными из-за недостаточной информации о структуре и функция биологических мембран. Воздаяний путь выяснения механизмов про-ниг,йа'гбстг мёмбрад с ионойорама и каналообразутацими веществами, • Бй.'с-.онпе Процессов адгезии, измерения физических сил и парамэ-

■ тров мелсмембррнных взаимодействий, определяющий эти силы - моделирование контактов на' бислойных лишусмх мемб'тнах. Эти исследования могут помочь в поисках путей направленного синтеза лекарственных веществ для использования их'в клинической медици-

■ не и экспериментальной биологии.

3.1. Слияние модельных метлбрап.

■ Непременным звеном многих процессов .жизнедеятельности клеток яелязтся слияние клеточных мембран друг с другом, а рэ-

з ульт&те чего образуется единая непрерывная мембрана со всеми ей свойственными функциями. Однако, сложность выяснения мехшшт зма слияния клеточных мембран заключается в , наличии большого ■ числа взаимосвязанных факторов, ответственных за структурно- ; 'функциональные свойства мембранных взаимодействий. Поэтому изучение молекулярных механизмов слияния мембран удобно проводить на более простой системе - модельных мембранах искусственных ' , ¿ислойчых липидных мембран (ЫЬО.

- ,. Для получения двух ЕШ на отверстиях в тефгоновых ячейках . наносится пленка из растворов липидов в органичзском раствори- ■ т«|ге;. В- результате образуются два изолированных отсека, каждый из которых соединен с внешней средой. Пленка на отверстиях са-мопроизводльно истснчается до толщины 4-7 ям, образуя бислой, , состоящий из двух монослоев липидов. Затем мембраны о помощью .'Шприцев раздувалисьдо полусфер и приводились в контакт путем '. ,- облщенЕя Еплоиую. При этом образуется контактная область с 'водной щелью между ЕЕ.!, ширина которой варьирует от Десятков ., до сотен, нм. Ширина щели уменьшается с увеличение ионной концентрации водного раствора и растет с увеличением поверхностного заряда (Ненашев, 1984). Измерялось время слияния мембран, изучалось действие двухвалентных катионов и ингаляциошшх анс-'стетиков и некоторых датерг^нтов на проводимость и время слия- . няя мембран. !;■'..'■■•.' ' '

' '<; '3.2. ЛВУ^бйТнн,х Щиор9й Щ

мембран.

; Известно, что двухвалентные катионы, экранируя отрицательные поверхностные заряды, способствуют слиянию мембранных частиц и выпаданию их в осадок, причем катионы по эффективности располагаются в ряд Ва>Л>Са>

Однако, цри работе с Ее2+, который в таблице Менделеева возглавляет II группу л: располагается вкше Ы^ оказалось, что его соли в сравнительно низких концентрациях (I ¡¿.О за несколько' мг<шут> осаждают митохондрии, субмитохондриальные частицы (СЩ) и лкпосо1щ. Ионы Са~+ в концентрации 10 и.' за эхе же время еще не осахдеют митохондрии и С.Л, а М^ 2+ в концентрации •умК является нормальной составной частью сред, в,которых митохондрии и СМЧ находятся ео взвешенном состоянии длительное время, Ыокно было думать, чго такое действие Ва2+ вызвано том, что оз прочно связывается о фосфатными группами. В связи с этим было проведзно сравнительное исследование действия ряда хлоридов

двухвалентных катионов на скорость слияния искусственных мемб-\ ран из фосфолипидов мозга и из окисленного холестерина, на со-." дер^ищего фосфатных групп. ,.>

Работу проводили по методике,, описанной Е.А.Хпбермаком,; (1968)'с использованием 10 Ш гнстидинового буфера, рК которого-; ' был равен 6,0, так гак при более щело-шкх рН Ве^+ выпадает в . осадок. Соли двухвалентных металлов добавляли в раствор глстп-двна между Мембранами. Время слияния мембран ;■••■•• гистидиновом буфере принято за I, Как ^вдно из опытов, показнващгх относи- . ' ' тельное изьхнениё скорости слияния КШ, при действии на евдшио '• искусственных мембран из фосфолипидов мозга двухвалентные ката^' она расположились в следувдиЗ ряд: >Ве>5>?>Са> М^-, а ''

при дейстзпи на мембраны из окисленного холестерина.- Ва>,Ве>' А > Са > Хм>к« . ,, ,. , ' -

Как можно, ввдвть, независимо от присутствия э мембранах?, фосфатных групп, Вэ2+ более эффективно ускоряет слияние мембран;; чем Са2+ и Кроме того следует отметить, что на мембраны .

из фосфолипидов мозга двухвалентные катионы .действуй? в шньщтс концентрациях, чем на мембраны из окисленного холестерина. • •'

3.3. Изучение влияния детергентов на контактные взаимо- ■

. действия б&осДолишшных мембран.

■ >

Детергенты воздействуют над на поверхностное яатянение и устойчивость, так я на поверхностный зарвд липидных мембран.. В 'связи с этим интересно было исследовать в присутствии да тор- -гентов контактнЬе взаимодействие ЕШ, зависящее от ртих параметров. Исследовано взаимодействие цветных мембран, приготовленных. из оби;лс фоофолипадов мозга быка в водных растворах дэ- > тергентов: Тритона Х-100 (неисникй), цетюггриметияаммоний бро-мвда (ЦТАБ, катионный), додеЦпЛзульфата натрия (ДДС.ЛЪ, анионный).' Измеряли время слияния мембран - промежуток времени от. свс л тля мембран вплотную-До момента слияния. Обнаружено,. чаю " ЦГАГ з концентрациях 5,0.Ю~7М; 1,0.10"%*; 5,0.10"%; 1,0.10_5М резко снижает время слияния мембран, техда кал ^ДС. а (5,0.КГ7 ни 1,О.ГО~%; 5,0Л0~%1) .г Тритон Х-100 (1,0.10"%! а 5,0.10"%) оказывает гораздо меньший эффект. При использовании двух последних время'слияния мембран остается значительным вплоть до концентрации детергентов, разрушающих мембраны.

Полученные данные позволяют сделать вывод, что уменьшение поверхностного заряда является домянируяпгал фактором в увелкче-кпп едгезпвнооти мембран по сравненсэ с изменением поверхност-

rúofo натякения. Таким образом, влияние детрегентов за взаимодействие ЕЛМ определяется степенью уменьшения детергентом поверхностного заряда.. ■ ,

3.4. Лействие шг-'аляционштх'анестетиков на гтиоводгюсть и premi слияния БИЛ.

р . На биологических и искусственных мембранах в опыта?, со . спинмечанымп соединениями было .установлено, что нзкоторые соэ- ; ^здёния, в том.числе местные и обида анестетики вызывают уменьшение фактора упорядоченности или, другими словами, разжигают . ■'мембраны. Было показано, что дая нормального функционирования- ■ (м^йрака должцэ находиться в некотором оптимальном состоянии. ' Расчеты Миллзра (1974) показали, что разжижение мембраны на 1,1$. вызывает наркоз, уплотненна еЗ не 0.85JS влечет за собой конву-льоки. В работах со спиновыми метками на искусственных липочо- ■• «ильных мембранах были использованы такие общие анестетики, -как' фхоротаи'Метоксифлюран и н-спирты (бутанол, пентанол и'др.), ; В опытах с мпкросомамп ¿¿аченя крыс в приоутстЕ'Си фторотана и ; мотрксифлюрана наблюдалось ускорение окислзния восстаноьлеы-;'Яотр НАД.Н цитрохрома 5 на 20-30$. Эти данные легко объяснились' тем, что вследствие- различения мембран увсл!1чивается частота столкновений между молекулами, что приводит к ускорению ркхсления ци'х'охрома g. ■,

Можно оыло ожидать, что анестемкг иудут увеличивать эффективность действия иоасфорных модификаторов фосфолштсдных , ,догмбран. На ТЩ1 были исследованы H-cinipvu, и действительно, в' их присутствии проводимость мембран возрастала, причем тем бо-... лыпе, чем длиннее были молекулы спирта..'

1?

,.' . . рис.10. :

aauiuc ««стлмов м вь ■рот»меи»е' 6»ючк^шршх ■ щаб,»« И фоефелышнло»

»»г» г р«а»о?« 10 «м ка *

иод*ум«о»»- ' — !'10"* ФК4>+ию[юф°Р«. 1 — »> • Ю-4 М -»КФ+фиг«»". * —

ч т- М ТТФБ+фторот»*. 4

^ * S — 1 »19-*,' граней«Д*** A+^TupotíE. Сггелч"» щчсии hokuitu *о£и<ж «мг.

с.*1иков ...

Враббте била.использована стандартная методика получения;, БЛМ. Сопротивление их измеряли с помощью электрометра УА-51 Я; регистрировали потенциометром КСП-4. После полной стабилизации черной мембраны в раствор с T0Q добавляли 1-2 капли анесгзгтка. Так как растворимость анестетиков очень мала, можносчитать,:'., что концентрация их была близкой к насыщению. Вскоре после до- ., бавкп анестетика сопротивление мембран начинало падать и епуб-тя 15-20 глин достигало нового уровня. При этом проводимость ув'э-г-личивалась ещЗ Hä 1,5-2 порядгш (рис.9). В работе брли испсл^-// зованы разобщителн-протонофоры ТТОБ в концентрации 1-2. Т0-% ,'' ' и карбснилцианид-м-трифтор.гатоксифенилгидразон (ФК5) в кош,ей-' трации 1,0.10"%!, а тагже анестетики фторотан, метоксигЕшора!^,,. „хлороформ и бутакол. Однозначные результаты были получены на \ мембранах из разных липвдов: фссфолпшдов мозг?'иЧштохснщ>й2:£-• шкробактерий и азолсктина в растворах KCl или трис-HCI. ' ,' •

л В присутствии грамидицина А, который создает в мембранах-. , канальную проводимость, добавка анестетиков не меняла сопротивления мембран. Можно было бы думать, что в условиях, когда cb-'> 'протлвлед.че мембран сильно снижено грамидицином А, эффект: ане-' ' стетиков просто трудно обнаружить. Но в специальных спитах'. в '„ которых анестетак добавляли к мембране. сопротивление которой1/-было снижено ТТФЕ примерно до тех же величин, что и .гремициди- ' ном А, (до 10 ?-Х0® Ом), фторотаН все же снижал сопротивление;д-:. . еще в три раза. И наоборот, пря малых концентрациях,гремзщэди-. на А, ксгла сопротивление мембран еще сравнительно вчсоко (10®« Ом)» фторотан по-прежкему был неэффективен (рис.10). Эти результаты согласуются с данными Красне (1971), полученными на 1 мембранах лз лелидов б насыщенными жирными: кислотами, которые, ■ при тегйературах ниже 4?.° были тзэрдыми. Сопротивление таких ^ 'мембран и присутствии нонактина и валиномицина, которые явля- ' . ютсч ;й>нофорами, зависело от. температуры: выше '42е проводимость мембран была очень высока, при "замерзании" мембран она падала Г' до уровня без антибиотиков. В присутствии грамицидина А иезалп-сиго от физического состояния мембран их провор ность была поп-., ти одинаково высокой. Это означает, что если у ж ..каналы провой-мости образовались, то разжижение мэмбрян, вызванное ачестети-1:в:.т или повышением температуры, не атаяет ча дпфйузкю ионов ■ чзреэ них, а следовательно, к на сопротивление мембраны. Рсл-Еижепие мембран должно ускорять их взаимодействие. Это предположение бчле проверено при определении времени слияния сводея-ных двух KTÎ.1, когда в раствор Î0 irf.î KCl, в котором проводили ••

¡работу, добавляли анестетик. Результаты приведены в таблице. Действительно, слияние двух мембран в присутствии анестетиков фторотана, мэтохсфлирана, хлороформа и бутанола ускорялось в несколько раз. Снижение сопротивления мембран, которое происхо-, дат-в присутствии анестетиков, само по себе не влияэт на их . слияние. Так, в растворе 10"% 1ТФБ, когда сопротивление мем- * срая снижено на два порядка, время слияния остается таким же, ' как-и в чистом растворе КС1. В работе (Цофина, Халасв, 1978) 'приведены тыкга данные с,фенилбареном. Видно, что это соедини-' 'ни а, добавленное к липидаы, также ускоряет слияние мембран.; Эти данные, могут служить косвенным указанием на то, что фешшбарен, . ыскет быть, также разжижает мембраны. А увеличение эффективное-., ти действия РОЭ в присутствии фенилбарена, можно объяснить его разжижающим действием на мембраны, сходным с действием анзсте- . .т^ков. ' .._,'. _ ••' ' .

V,.....3,5. Бактериальные глкилрэзормшы -- регуляторы структуры ■■

' биологических мембтоп. '''"■"''- ' •

.' ,г '. Бактериальные 5-лкилреэорцкны (5-АР), несмотря на простое химлчеокое строение, привлекают внимание ыцогих исследователей, причиной тому - своеобразная биологическая активность этих ве- ; ществ и их биологические, функция, весьма необычные для соединений подобной структуры. Установлено, что 5-АР (главным образом) и их Производные составлягт более 80%. сушарных лшщдов мембран р цистах азотфиксирунцей бактерии ^0^оЬасй1Гу1де1апа11. хотя ' л5 вегетативных клетках оби не синтезируются ЯеиосЬ, .Заао**|979, .1981), 5-АР являются доминирувдими клеточт-нмйГлшщд'ами'^'АГсЬгоососодаГ (Батраков и Ю77, 1584), вы- . ' дэлены из культыркой среды бактерии РаецЗойопав сагЬсхуЗойГвуа . (Осипов и др.', 1985) и есть основания полагать, присутствуют во : внеклеточных липидах »Шфоорганизмов различных таксономических групп (Зль-Рег.ютан и др., 1979; 1983), Показано, что 5-АР об-1 ладают яятдокисдауельнм®: свойствами,« стабилизируют, биолсглча-

ские мембраны в условиях перикисного окисления (Ерин, 1987), . ' индуцируют переход зегетатизных клеток в гипомзтаболическое и -антибиотическое состояние -и вызывают- образование покоящихся ^ри (Эль-Регистан, 197Э; Пронин, 1981, 19С2; &строкнутова, ' 198?.). Показано такие \ что 5-АР и их производные образую? весьма гидрофобную, е. вязкую ыэибранную структуру , котсрал м^ет' ыре-: дохранить. цкст'ч от 'выСцхйнль ,(, ■ , 1032 ). ■

В данной работе для'исследования влияния 5-АГ на струк'тур-

ьую и берьернуэ-функцию клеточных мембран в качестве модели использовали плоские ЕШ, приготовленные, как из чистых 5-АР, так и смесей последних с одним или двумя. фосфолллвдамп. Получаны 'устойчивые ЕЛМ как из 5-АР, так л их смесей о фОсфолшпдами.: Удельная электрическая емкость £ЛМ из 5-АР, оказалась рагноЧ 0,50+.О,03 шЗ/с^, а удельное' электрическое сопрс">итвле:-шэ - . 2.10^-4.Ю^Ом/'см2, что примерно вЮ рас :ппе.сопротивления из чистого фосфатидашланолампна - доминирующего ^осфолтп<да: азотобактера. Это различие че настолько велико. ■ чтобы *.!0.тнс был6.: говорить о существеннее изменении проницаемости клеточной ти-'. брани за счет замены фосфатвдилэтштоламлна 5-АР- (при образовапгЬ .цист). Большинство клеточных мекбряя дмбет удельное сапроятйле--. ние j"02-I05Cm/cm'' ( , 1971). На основе зависимости уде-

льного сопротивления БЛМ, приготовленных из 5-ДР и фосфелипидов, от'соотношения компонентов изучено, взаимодействие 5-AF с ОЭЛ, 5оо>фетадилглицэрзпсм ($Г).и дифосфатздалглицерзнотл (1ФГ)'(ка*и диолипином) - типичными «змбраккши фосфолишдаш грам--отрипа-тэльных бактерий (в т.ч. рода Azoh&idtt). с увэличением мольной" доли 5-АР электропроводность Ж! из 5-АР и Ф?А сначала.растет,-': (максимум при 5 АР/ОЭА-1:1), а затем надает (».пшйкуч.при 5-АР/--. 5ЭА=2:1). Электропроводность то ЕЖ из смеси 5-АР и 5Г о ростом доли 5-АР скачала падает (минимум три эквнгклкюм соотношений),-а затем вновь растет. В случае ЕШ из смеси 5--АР л Д5Г мипкнум ,, электропроводности наблюдается при соотношении 5-АF/Д: Анализ полученных и литературных данных свидетельствует с тсч, ч?о_ вклпчекпи Ь-Л? в фосфолипиднум мембрану приводит к образованию оллгомерЕгх к полпке'ршис ассоцпатов. Это подтрерядают а опы™' ты с метилированным о-АР (1,'АР), имеющим только одну гягрокешц-нув группу (в отличие от 2-х из 5-АР) и не способными играть, ••*• роль сглзуюгэго звена.

В целях проверял воздействует црпродних 5-АР на функции Мем-бра'» т бол с о олошюй системе было последовало действие воданх сусггепзий 5-А? на дхичтяи шиохоядрпй, выделенных чз печени r.vuc. 5-А? ипгчбпровали разобщенное дыхание мигохондр Jl па /ЗД-завпс::-мых субстрата:: (калат, птувпт, глутака? и сЛ -кгуоглутарат) к увгл1гпп.оли скорость обеления сугциката. МА.Р з ?рх хе.концап-ipwz>aL не оказир.ал елгдал на. окисление перечпслонинх субстратов. ?зкк;л сбразоы, ¡лотло сделать вывод о том, что, с одной стороны, 'замена фосфгллпидов на 5-АГ в мембранах цист гложет служить стрбэтгакрующям фактором, с другой - включение G-AP г. перерань гедпт у. струк^урпш изменениям, шторме могут •^•иг'ччеглта ибре.-

OU

:?;®м оовдинть да функции «выбрей, в частности," на активность бер--'швтшгх систем связанных с мембраной..

',/ 4. ИССЛЕДОВАНИЕ ДЕЙСТВИЯ МЕСТНЫХ АНЕСТЩКОВ НА 4ООЮШ-. ' 13ЩШЙ МЕМБРАШ С АШЮНСЕЛШИВНШИ ОБРАЗО-

| " ЛВА1ШЯ АМФОТЖЦЕОМ В.

, Изучение проницаемости мембран для ненов и нейтральных уо-< ^екул'в присутствии полценовых антибиотиков прнвзло.к предооло-\-что эти. вещества, взаимодействуя с холистзрином .образует: , на-' обета сторонах иембрашгдвеполуопорц, которые, располагаясь. " ;ПОЙерзк мембраны, могу? образовать заверяемую водную пору, про-» к,;пнзиваз>щую мембрану насквозь. Через такую пору 'проникают вода," -' ,:'И0Щ1 аеадегагролиту •{•/•й4«об- ,1573; '•, 1974). -Б^

'■да. пр&длоаена гипотетическая' молекулярпцг иодель такой поры, для образования которой необходимо стехиске трл чв оно и, соотношение ме->зду молекулами амЛ^ерпцзна/Б и холестерина. Гидрофобная' часть • ■ ''адфтерцина Б, саданваясь с холестерином, образует взаимный ком-; '' ш^еко, а гпдроксашше группы в сегменте 03-С15 выстад&ют водпую ■пору внутри мзыбршш. Полупора формируется из восьми взапмоком-; плекссв. .Оясигруппа в молекула холестерина и ,го.отрнче группы г -. ..делекулах азфтерцина Б локализуется на - поверхности мембраны и • обрацень в воду. Каадая окмеруппа ври С3д.в молекуле; ам$отери-цдаа.1-взатюдайствуитх ОН-трулцами другой "полупоры, образуя полную лровэдявую пору с эффективным радиусом 4 X. .

4Л. Изучение ^зататодейотвия шетннх анестетиков с бис-доДни.га фосфолттидныш мямбшнамя.'

Проведено сравнительное исследование действия МА- (кокаина", лкдокачяа и новокаина) •на фосфолипддрые мембраны с анконселек- . тевнши каналами, образованными ам$оторцшюм Б. Установлено, что 5.10"4 Ь кокаина удваивали проводимость таких мембран, но елияя на провоедплооть нешди^ицпроьанннх .фосфолшоадщлс биоюэев. Показано, что по эффективности'действия ча модифщ'провашше бкеле« ' анветеглка расположены б ряд - кокаш,. лндокаян, новокаш;, сое^' падагациП г. рядом га фармакологического действия. Ярехдододепо, что иолзкулярный мсупнизм обнаруженного эффекта сач'зен с воздай-Г чт\:с!М инлсгеУЕкэг. па псворхпостний г,арац лличгиого б:":лоя. Рз-юнгтг.ршк- белки югеточннх иекброн окру^эни лмгчу-пп: ь.я.тркксо:;, поэте,:,-у при исследовании ь.слекулярисго црхшшмр действия Ш-. кои: паевого- ряда било бы интересно оорелелит&елияшк этих опес-г.а п£саиотр.: ллип/счого сислж, в частное;;; «а ¿го про-

Сводимость. .

'*.. -. Наши опыты с нембди§лцьфовянпшлт бислоями фосфолгпидов > не : дата нолонгтельвых'результатов. Ксш-тшпме MA даяо при кояцен- ; грации 0,7 M в водном растворе, омывающем бнслой, нэ меяйля aro проводимости.-- Тогда был предложен молекулярный механизм Действий .зтях веществ,, согласно.которому они, сорбируясь на поверхности 'Лкйидлого матрпкса^,' пзмейпат."величину цсверхнбстаого заряда/' . "Дтм проверки зтого предположения была провэденк:,'эксперименти'до; действию некоторых MA на проводитлость лшшдных библсгг с анкон-•св'леяиаяшли каналами, образовашшш подяоновш антибиотиком ";. шлйстертцпном Б,'вледе.чнм б водный раствор по обе стороны меч-Яроводишсть а1.фтеррицпновсгс канала пропорциональна'*, ^г,..., ^'0'рации Ссноюшх. носителей токау входа в какал' (ионов СП в хешем случае ), т. о. определяется : их. пркмэмбранвой, кощинтра-" ' цией. При концентрациях''электролита (КП1) от 20 до tOO.ii! кон- ■ ценграции ионов CI" вблизи отрицательно зароенной поверхности мембраны уменьшена по сравнении с концентрацией их.в основной ■ :.*ассе электролита и являетсй в первом приближении линейной функцией величины поверхностного заряда бислоя. Таким образом, емт

■ йоТеркциновый канал служит-хорошигл-зондом зарядового состояния ..'-

■ поверхности мембраны. Оказалось,'что .проводимость такого, бислоя сильно изменялась, под'действием.даже шдлимолгтрных концентраций,

, Ш кокаинового ряда.- ■ l '■■

. Для фор.йршзанш БШ.1 стандартным методом'(.'Tien, ,1967) брался раствор общих фобфолппиДов мозга, растворенных в гептане! .'(М.мг/мл), Мембраны фондировались на круглом отверстий дишет-ь ром'0,3 ш й tkIviohobom стайснчикв. В качестЕаэ'лсктрзлита, от-' Бающего бислой,- использовался раствор,. содеряапдаД, 40 t&! КСЛ г. - ■■ 20 !ЛМ-ржЯ1С1 при рЕ=7,0. -""'■ . ?

. Л.лл введения в раствор кокаина проводимость мембран дово-' далее .'^о 3.ÏO~3-3. ICT^Cm--' с помощы, полиеяовоги антибиотика ' В, KOTripîrîî, как известно, йормяруот шшопселектпвнке траясием- . бранные ганала (Ррмкньлн и др.; 1976). При этом .концентрация . антибиотика в обоих объемах бЕла равна 1.10"%. Яосле фсрг,-31рсвл-кип меыбрэны в растворе, содержащим антабиотик', её проводамостг. .' нар£с?егг со временем, выхедй на стандартный уровенъпосле 3-5 юи с момента■ образовании черной мембраны. Из рте. 10 видно, что ' ток на участке а-б нэ меняется со временем. На этом заканчивалась подготовка бяслоя дал экспериментов с l'A. Йодаый раствор . нвпр-эргано перемешивается в течение - эксперимента с помощью магниткой *'.*езлЕй. В момент, указонцнЯ на рис.10 стрелкой, зо

. 41

¡внешний-объем стеклянной кюветы (10 ш) вводился анэстетик. Ка-дерл:а между моментом введения испытуемого вещества в раствор ¿1 .. моментом нарастания това. обязана с конечной скоростью лэремеши-вяпич электролита. Па рис. 10 показано увеличение тока меш'раш После введения 30 и 40' мкл 2$-ного раствора когягае ь моменты, .отмеченные стрелкой. Ввдцо", что ток потле первой до?аькн увели: чгвается па е. общее увеличение тоги после суммарной дооав-

г.

и а

У

/

pjtq.il,

Изменение тога мембраны Рис.12. Завиопчость проводть..-под Действием кокаина в ' мости мембраны (отн.ед.)

растворе -¿0 мМ КС1, 20 г-йЛ от концентрации кокай-'

ТРИС-ПС1, ¿1=7,0. Моменты на в растворе, омываа-

добавки кокаина 30 и 40 мъл щем мембрану, Провода-

оглечены стрелками, напря-- ■ мостг мембраны в отсут-

жение па „юкбреве 30 мЗ ствие кокзлнц принята'

за единицу

ки 70 икл кокаина (что соответствует концентрации в растзоре, ровной 3,5.10"4.1) - 631.' Кривая зависимости величины прироста .проводимости мзыбрачы'от концентрации кокаина (рис II) имеет форму кривой адсорбщш -г изотермы Ленгмюра. Ряд эффективности испытанных веществ имеет вид: кокаин лидокаин новокаин. При . этой! когаин сказался почти на два порядка более эффективным, чем новокаин; Наблюдаемое увеличение тока мембран, т.е. потока ионов хлора через злорселективные амфотерищшовые каналы, можно объяснить следуюццз.! образом. Как известно, мембраны из общих лыщов мозга еар^эны отрицательно (¡1вков, 1551), поэтому при-гембранная концентрация ионов хлора - основных носителей тока чзреь ам.|отер;'ЦЕНоы.'"! канал - уменьшена ао оравиок:к с их кон-цеатрациеЛ в основном объшг электролита. Есрслтю, при адсорб-г, ;и'на иоаерхьоотл ь:о:.;5раш. глтгонов аызстотпха, о .рвпитс.шшй поыI хноогный заряд бислоя частично кошовсирустод, что чедет :: у.: сличен;;*) концентрации ионов хлора у поверхности мяЛраш к, гло-ойс'.'слию, у вчода в аи^отгршршош;?. канат, т.е. к увгли>:о-н!и чз-.зз

4.2. Измерение токов короткого замыкания бчслойннх ли-г.идзых мзмбван при действии аналогов местних анестетиков.

Четвертичные аммониевые производные "Л широко используются для исследования функционирования конных каналов в нервных и. . . мышечных клетках. Показано, например, что такие соединения способны подавлять ионные токи в возбудимых мембранах, взашодей-■ 01'руя с каналами с цитоплазмати'геской стороны -летоиной мембраны (Ходоров, I9CO). Однако механизм прошщазмости четвертичных гажониезьх произзоданх MA через клеточные и лтпздьые мембраны оставался невыясненных'. Пели не предполагать существоБС-ние специальных переносчиков, четрертпчнке аммониевые соедясе -. ния могу? проходить черзз мембрану либо в видз полошкельво за-' ртгенних ионов по градиенту концеьтргции и потенциала, либо в ' электрснейтральном Едде вместе с пон&ми. Чтобы оценить реаль-ноотьобоих механизмов, мы измеряли коэффициенты к проницаемость Б® для четвертичных. аммониевых аналогов лидскаина и тршекаипа в виде понов. Четвертичной аммониевые производные I/A, вазимо-действуя с канала»® о цитоплазштпческой стороны клеточ-

ных мембран, занчительно увеличивают время их реактивации ( Kille, 1077). Поэтому о проницаемости клеточных мечйран судлли по изменению реггракторностг изолированных препаратов сердечной ткани. Проницаемость БИЛ длч исследуемых веществ ъ виде нейтральных соединений (конных пар) оценивали, предполагая, что Tai; жй как и для неэлзктроллтов, пронпцаемсоть лшщц-пого бислоя определяется гидрофобностыэ соединения. Ба меру ги-дрсфобностью соединения. За меру гидрсфобности принимали коэф- ; фициен'т экстракции соединения из водного раствора в сктанол

V

-ob'

4.5. Изтчениэ механизма проницаемости лигдднчх мембран четвертичных аммониевых аналогов лтаокг.ика' и три-мекаина.

В работе использованы четвертичное), аммолг^выэ аналоги лицокаина QX-572 и тртме каина: G-87, £-39, и С- -104. БШ фор-мтоовалн из раствора cöqnx £ос'$олшп1дов мозга.: ыка в гептане (20 мг/мл) на отверстия диаметром 0.8 мм в гефзоновом стаканчике. Мембрана разделяла два одинаковых водных раствора, сэдер-вдих 90 li.; УаС1 и 5 мЫ трис-HCI, pH 7,5.

Проницаемость ПИ дня ионов - амненаемих аналогов триме-kohhü h лцдокапна - определяли по величине тога короткого м1-

;лик£нкя, возникающего в ответ-яг. добавление агента о одной ссо-_ ' ронн'мембраны. Значения коэффициента проницаемости .ЕЕ1 (Р+) Вл-

, чесляле по формуле

Р+= 1/Р 5с, ' <

где I - ток короткого замыкания, У - число Сарадея,^1 -площадь черной мембраны, о - концентрация .соединения, добавленного в раствор с цпс-стороны мембраны. Коэффициент экстракции ■исследуемых соединений мепду сктанолом и водяным раствором, со' дзркалдам 90 мУ У^аСГ и 10 ыМ трис-НСИ, рН 7,5 определяли по равновесному распределении соединения между двугся фазами при комнатной температуре (20±2°С). Отношениз объемов октансла и , электролита брали близким к Т/Ков (от 3:1 дс 1:10). Кснцектра-

циисоедшшния в' ведпой фазе определяли спектрофстометрически '' по поглощению.в ультрафиолетовой области, концентрации в скта-... ноле - по убыли соединения из водной фазы после установления г .равковисия.

В использованных концентрациях все соединения (кроне С~37) после часа перфузии заметно увеличивали ре£рактэрность с' сэрдечной ткани. Видно, что через 60-80 глин, поело качала пер- • фузии тртге1аином, &-Ю4, ($-572 {рис. 12, а, в, г) значения ре-фрачтернэсти возрастали Ь 1,5-2 раза и для трше каина и 0-104 выходили на етшвд*он£ркый уровень. За тоже время рефрактерность под действием &-87 повышалась в среднем лишь ка 2С% (рис.12,6).

При использовании в 3 раза большей концентрации С-87 (1,5.10"%) рефракгерно.сть увеличилась в существенно большей степени. Однако эти изменения, как правило, были необратимы, значена реорактерности не возвращались к исходно:! величине даже после нескольких часов отмывки.'

. На рис.14 показаны примеры изменения тока короткого за-. . мыкания ЕШ з отвит на. добавление четвертичных аммониевых сое-динекзй о цисстороны мембрага в растворе, содержащем £0 М

А'аСХ, 10 ыМ трлс-Н'Л, рН 7,5. При концентрации добавленного соединения больше 0,2 мЫ наблюдается медленная релаксация тока и эффект насыщения зависимости тока короткого замыкания ст кон-цьктраь-ии алтиаритаика. По этой прич;ше иэьлренля норффпциенхоа-проницаемости Рт проводили при концентрациях исследуемого кое-•:кеная 0,05-0,2 1.1'.

Такт* образом, опиты показали, что ионная проницаемость ддк исследозалшсс соединений (Я$ЕГ® см/с существенно '• ;/енше Б№гажы, получаемых из экспериментов на сердечной ткани ( ;(Р^Ю-5 сы/с) л что Э1И ^етпертлчкпе аихнпевы э аналоги лидо-

каина, к трлмэкегяа могут проникать через клеточные и липидные бпслойн^е мембраны в электронейтральном виде.

ее

го

а я

ш

50

т[ в ' £ I5

л У

и

1---' ' ■ '

го чо со /о

• е

и

III

20 НО 11 мин

Рас.13. Относительное увеличение рефрактерностд ткакч желудочка сордца кролика под действием: 15 мй! тримекаина (а), 50 шМ С--37 (б), 5 мкМ С-104 (В), ч 30 жМ <?У.-5?2 (г). Приведены средние значения и среднеквадратичные отклонении. Светлыс кружки - контроль.

о

г-

0,г 0,1

0,6

1, я*

т

V*

1тх-лг}

Би .1'4. Примеры изменения тока короткого замыкания' ЕШ в ответ на добавление (<х-572 е с--10д в кслщентранли с,т >61. Стрелками указаны моменты добавления (вверх) к отмывки соединения (зааз).

- о

выводы

1. Разобщители окислительного фосфорилированпя б зава-'старости от концентрации и времени вызывают резкое повышение

частоты миниатюрных потенциалов концевой пластинки ка 2-3 порл-дка и увеличение средний ведищаш амшптудк в два-три раза, ■ как в нервно-шлшчном соединении холоднокровных животных, тек • и у теплокровных.

.• а), Аьлназин и тофранил в больших концентрациях, подобно разобщителям окислительно1'о фосфорилирования повышают частоту 1 шгнлатгрных потенциалов концевой пластинки увеличивают выход . и ионов Са"+ из митохондрий внутри нервного окончания.

, б). Показано, что анальгетики наркотического типа уменьшают глидигуду миниатюрных потенциалов концевой шгастинкз. Воз-иожно, что в основе этого явления лепит конкуренция с'ацетилу, ¡клином за активное место в молекуле мышечного рецептора.

в). Действие алкалощщых препаратов - глауцина, стефа-глабрина и сангвлритрина - на параметры миниатюрных потенциалов концевой пластинки имеет сложый характер. Увеличение ча^-

' тоты ШКН обусловлено, вероятно, разобщают™ действием препа-' ратов аа окислительное фосфоршгировакие в митохондриях нервных окончаний, а снияение амплитуды МИКП можно объяснить га анти-холинэстеразным воздействием.

г). В присутствии некоторых локальных анестетиков показе но , что стзпень воздействия локальных анестетиков на негвко-

,*ммпочную передачу зависит от их константы ионизации (рКа) к значения рЯ среды. Некоторое увеличение частоты МШШ а присутствии локальных анестетиков могло отнести за счет :гх влияния на освобождение влутрзшитохондриального кальция, а уменьшение амплитуды за счет блокирования воротного механизма натриевого . капала в результате взаимодействия катионной группы местных. анестетиков с аяиошшш рецепп)ра1лп каьала,

2. Обработка локгльанш анестетикаш визывала увеличение р!1ц (цлтошхзмц) несплодотз.орзннпх яиц'морских er.sK. У обработанных гародкш-эй наблюдается заторможенность начала выселения клеток перв1гчной мезенхимы; при зтом наблюдается ускорение зы-д,;. : из пая зародышей.

3. Впервые показано, что по оффектизности действия, на скорость слияния искусственных бислойних лшшдяыу мембран из фэс$олкпидов мозга двухзалентние глтчоы' располагаются в ряд:

Ра> 5^>Вс>Л>Са>Н^ , а при дсйотвиина мембраны из окислен- ; ного холестерина - Вл> Ве>5? > Са^лМ!^, ,

а). Уменьшение поверхностного заряда является доминирующим фактором в увеличении адгезигности мембран по сравнению с ■ изменением поверхностного натяжения в присутствии детергентов/

б). Впофизичзсксш методами показано, что ингаляционные апзст'етики, раззспая мембраны, увеличиваю? эффективность- дей- -' ствся разобпрггелей окислительного фосфорилировгг;®:, снижающих . сопротивление мембран. В присутствии исследованных анестетЕгав в несколько раз ускоряется слияние мембран. ■/''.•

4. В результате проваленного исследования установлено', .что.., кокаин.удваивал проницаемость фосфолипидных мембран с енионс4лв-■ ктивпкмп каналами, образованны!,к^терпшшом Б. Ряд эффэктзв-. ности -пгаттаяшх веществ гагззт вад: кошш лшгокаии ■ новокаин,

а). Проведен анализ возмссйапс механизмов клеточрпх- и ли- \. водных мембран для' заряженных четвертичных амсниевых аналогов лидокаипа я тримекапна. Показало, что исоледованнияэ гоединения могут проникать через клеточные и лишкные бпслойнкс мембраны в виде электроиейтральных ионных пар.•'

Основные публикации по теме г-аботы:

Т. З.Х.-М.Хаиаев, Е.А.Яибершн. Влияние аминазине и тофранпла

..; на частоту миниатюрных потенциалов, Биофизика, 13,3,54.8-550, 1968'

2. И.К.Глаголева, З.Х.'-М.-Хшпаев. Изучение биохимического механизма. действия разобщителей окислительного фосфорклнрованля на секрещсо медиатора. Тезпс^ 2 Всесоюзного биохимического съезда. 21 секреция. Биохш. фармаколога«. Тешкеьт, 69-70, ' 1969.

:3, И.М.Глаголева, Е.А.ЛибЗрыан, З.Х.-К.Хашанв. Влияние попов сЯ* на освобождений квантов ацетилхолина в нервно-?,¡ииечноц соединения. В сб. Биофизика мембран. Палатка, 78-81, 1969.

4. И.М.Глаголеза, Е.А.Либерман, З.Х.-М.Хашаев. Елляиие разоо-. щителей окислительного фосоориллровакия на выход ацетилхо-дица из нервных окно чаши!. Биофизика. 15.1.76-СЗ. 1570.

р, .З.л.Хаааев. Изучение влияния разобщителей охшелктельного ' фосфорильфования на освобождение квантов ацетилхолина из • нервных окончаний. Азтореф.канд.дисс., М., 1970. 6. З.Х.-М.Хашаев. Изучение влияния разобщителей опислительпо-' го фосфоршшрования на освобождение порций медиатора из нер-. еных окончаний теплокровных жизотннх. В сб.Биофизика мембран, ■ ч,2, Каунас, 504-511, 1Э72.

7. З.Х.-М.Хаиаез',, Н.И.ч'ачанидае. Изменение амплитуды миниатюрных потенциалов под действием анальгетиков. Биофизика. 20.1 156-157,1975.

' Б. З.Х.-М.Хашаев, Л.Ы.Цофина. Действие двухвалентных глтионов на слипание мембран. Биофизика. 22,2,366-337, 1977.

9. Л.М.Цофина, Б.Х.-М.ХаоаеЕ, Ы.А.Дада&н. Действие ингашзционше анестетиков на проводимость и время слипания лтапдных.мемб.-, ран. Биофизика. 2^,2,257-260, 1978. '

10. З.Х.-М.Хашаев. Изучение влияния локальных'анестетиков на освобождение перций медиатора ее- нервных окончаний."Тэзи-. сы ЗБоесоюыю,! конф. "Наука", 207, 1Ш).

II, З.Х.т-М.Хашаов, Е.В.Троикз. Изучение влиянья соланина на синаптическую передачу, йюфизпка. £§,1,136, 1031. ¡С'.Е.Шмуклэр, Л.М.Ч&Ялаяа, В.В.Скояяненов, .И.Л.Птиох, А.Л. Карпович, £,В.Гусарева, Т.Х.Кайденко, З.Х.-М.Хашаав, Т.Д. Медведева. Межклеточные аваиисдействпя у ранних зародышей морских елей. Онтогенез. 12,4,338-403, 19П1.

13. З.Х.-М.Хашаев. Изучение механизма взаилоцействяя бислойкнх лшгадньс: мембран. Тез.докл.1 Всееоюз.биофизического съэзда,. I, 169, _ 1932.

14. З.Х.-М.Хашаез, Е.В.Троико. Измзнение параметров спонтанных' биопотенциалов в присутствии некоторых фармакологических веществ. Тез.докл. I Всесовз.биофизического съезда, I/., 3, 63, 1982.

1'5. З.Х.-Ы.Халгаев, Е.В.Трошко. Изучение влилн^. некоторых фар-' макологическкх препаратов на осЕобоздешге корци"! медиатора из нервных окэнчгяй!. Биофизика. .29,3,504-505, 1904.

IG. З.Х.-МЛашасв- Е.В.Троапсс. Изучение влияния некоторых фар-'' мак.препаратов на освобождение порций медиатора из нервных окончаний. ?&т.В!СШТИ 1147-84 , 30 стр. Н.', 1904. .

17. Е.Е.Тро'хкс,З.Х.-!,!.Ханаев. Изучэлпз механизма действия сте-^ роидкого анестетика на секрепта медиатора. Тезисы 4 Бсесо-1 юз.кснш. "Биохимия и физиология иедиаторных процессов", И.",. 4.2,321,1955.

13. А.Ф.Коаолару, М.Г.Фомкина, Т.К. Капустина, З.Х.-М.Хашаев. - ' Изменение проницаемости лнпидных мембран, модифицированных протоноформата, с помощи белков. В сб. Всесоюз.спмп."Механизмы деЗстзия ионизирующего излучения на структуру м ■ функции белков" во Львове. Цутшо40-50. 198_6._

Z.Kh.-К.Khaahaev. Effect of divalent cations and inhalation anaesthetioa on the conductivity and time of adgeaion og1 lipid membrenea. Abatr. Pirst. international 3cfcool "Electro. aagnetic fields p-nct МояетЪгапев". Pleven, 113» 19S6. -

■v

20. А.К.Гревадер, А.Я.Зилъберзтейн, 5>.Э.Ильясов, В.М.Пономарева, З.Х.-М.ХаЕ'аев. О механизме проницаемости клеточных и лиотдных мембран для четвертичных ажонпевкх .аналогов ли-"окатаа и трпуекаина. Биологическое мембраны. 4,1,77-83,-:;J87.

21. З.Х.-М.Хашаев, П,А.Григорьев. БзашодаЯствие локальных'анестетиков с бислойными фосфолпгадшдаи мембран ма. Биофизика. 32,2,347-348,1987. '

22. А.Ф.Кожокару, З.Х.-Н.Хаиаэз. Изучение дойслвия фенолышх сое.длнений на освобокдение порций медчатсра из нервных окончаний. Тез.докл. 5 Зсесовз.симп.по фянольяым соеданепи-ям. Таллинн, F9-60, Г987.

23. А.Ф.Кожокару, З.Х.-М.Хашаев, М.Г.Фомгоша. Изменение пронпца"

бмости биологических мембран под дейстивем некоторых фарм.про-• паратов.Тез.докл.Б Всесоюз.симп.по фенолышм соединениям. Таллинн, 61, 1987.

24. Б.П.Волкова,Л.В.Шарова, В.Е.Петровская, Д.А.Козлов, Ю.Р. л . Хруст, 3_Х.-Ы.Хашаэв. ?лпяние локальных анестетиков 2 фор-болового эфхфа на внутриклеточный рН и тете 'развития заро-' 'далей морских едай. Онтогенез, 19, 1,73-81,- IS88. ' 25, В.Е.Битков, В.А.Пеназев,.З.Х.-К.Хашаев, Н.П.Прддачина, Ю.В. . Ьишлов, С.Г.Бктраков. Мембрако'образушие свойства 5-н-аляш:-резорцинов с длинной углеродной целыо. Биологические мембра-

:' ' jn;. Л055-1060,1988. - '■ "■_______ .._

г A.J'.CoJocaru, M.U.i'omkina, Z.Kh.-U.Khaahacv'. Investigation 'of the action Mechanisms oi ооше entiozidanta on neribrene )': systems. Abstr. International conference cn "Regulation of ! free radical reactions (Biomedical aspects), Bulgaria,Varna,

i" 1989. ■ _ . '______.'__' '."' ■'

£7. Z.Kh.-ll.Khashaev, A.F.Cojocajni. A study of the biocheiaical 'i I action of pharmacological agente cn the neurotransmitter I Xroa nervous terminals. Abstr.International conference on. *Hegultion of free radical reactions. {Biomedical aspects), " Bulcarla, Varna, 73, 1S&9. - ' _____ _________

Z.ilh.-U.Khadhaev, V.A.Nenaahev. The offset of ¿«tsreents on the phospholipid membrane fusion. Abetr. Second Int.School ',"'. "Blsotromagnetic-'Xields and Ь1оиедЫаивви. Pleven, 92, 19H9.

JSU E.B,Битков, Б.А.Нзнглзв, З.Х.-М.Хашаев. 'Н.Н.ПрпдачнЕа,: . С.Г.Батраков. -5-н-аЛкилрезорщшы с .длинной углеродной цепью регуляторы структуры липидных- мембран. Биологкчосгае

, мембраны,. 7,2,135-139,1990. - • ' ' ■'-.•. ' • ' _______

30. .".Khi-M.Xbashaer, A.F.CcJocaru. The effect oX local aaeaihe tioa on the release of ne*rotranamittere.from noi-ve tonai- . , nala. Abatr. 10ta International Biopliyaiios Congress, Van-. . ecuver, Canada, 341, 1990.

3j A.P.Cojocaru, Z.Kh.-M.KLashaev, U.a.iomkina, E.K.HuzRiarov. • Effect of ralural and ayntetic pb«no3ic coupouh'lo o:: meia-brane systeaa. Abstr. }0 Intermtipnal'Biophysics Congress, ..;;' Vancouver, Canada, 450, 1990. "

32, A.y^Coiooani, ¿^Kh.-M.Kheshaev. Study of the biochemical

aotion oí зове local anaesthetics and tv-o-baaed acida, on. iieurotrans<ais3lon. ATiatr. 11th International Ccagrons oí ireuropathology. Kyoto, Japan, ffo-2-c-17, 1990". . ^ ^ . 33^ U.Kli.-ZJ.Khaahaev, A.?.Cojocaru. On the aecharían oí notion of decaaothouiua on tha nedlator releace troa narre teroii-; > nala. A'ontr. 11th International Congrega oí neuropathology. Kyoto, Japan, Iío-2-c-i3, 199C. ,

34. З.Х.-М.ХсЕазв. Изучение влияния 'лпдокаиноГи ere производка:^ па освобождение порций медиатора зп нерпшх окончаний. Тзз. докл. 5 Всесоззз.конф. "Физиология и биохимия кедкзтерных

: процессов", К., 314, 1990. ' ' > ^

35. З.Х.-М.Халгаев, В.В.Б^ткое, .Т.А.Дроневдч, В.А.Ненадюв, С.Г, Батраков. Действий некоторых алкалоидных препаратов на си-, наптпческуга передачу. Тео.докя.5 Всесояз.нонф."Фпгиолоигя и биохимия медпаторных процессов", Ы., 315, 1990. ■ -

36. Б.В.Битков, З.Х.-Н.Хасаэз, Л.А.Пропевлч, Т!.Л.Ненапевг С.Г. Батраков. Действие бэрберлна, глауцина, стедаглабрина и сангвиритрлпа на кервно-гядцачвуи передачу. Нзйрофкздологзя. 23,2,131-135,1391. . ' '37. В.Е.Битков, В.А.Нэнапэь, Н.Н.Прпцачпна, Л.А.Яэонзеич'

З.Х.-М.Хешаев, С.Г.Батраков. Еактзрпалъныб алтсигроиорцины -регуляторы етрукт./ры биологических мембран. Известия'AH CCCV, Copra биологическая. - 2,182-193,1591.