Молекулярный и микробиологический мониторинг становления микрофлоры кишечника новорожденных

Донских, Екатерина Евгеньевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярный и микробиологический мониторинг становления микрофлоры кишечника новорожденных
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярный и микробиологический мониторинг становления микрофлоры кишечника новорожденных"

На правах рукописи

'->^ о у

Донских Екатерина Евгеньевна

г05

Молекулярный и микробиологический мониторинг становления микрофлоры кишечника новорожденных

03.02.03.- микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

9АПР2д

МОСКВА-2010

004601705

Работа выполнена в Государственном Образовательном Учреждении Высшего профессионального образования «Российский Государственный Медицинский Университет Федерального агентства по здравоожранению и социальному развитию».

Научные руководители:

доктор медицинских наук,

профессор Кафарская Людмила Ивановна

доктор медицинских наук,

профессор Ефимов Борис Алексеевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор Л.П. Блинкова

доктор медицинских наук,

профессор Ю. В. Несвижский

Ведущая организации:

ГОУ ВПО Московский медико-стоматологический университет Роездрава.

Защита диссертации состоится «7^ » МХ\л*к 2010 г. в час.

на заседании диссертационного совета Д 208.046.01 при Федеральном Государственном учревдении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук

О.Ю. Борисова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Поверхность слизистых оболочек является местом наиболее тесного взаимодействия

организма хозяина с колонизирующими его микроорганизмами, причем слизистая кишечника представляет собой наиболее значительную область такого контакта. Являясь местом обитания многочисленного бактериального сообщества, отделенного от внутренней среды организма только монослоем эпителиальных клеток, кишечник адаптирован для двусторонних обменных процессов хозяин-микрофлора. Количество резидентных бактерий, обитающих в кишечнике, десятикратно превосходит число человеческих соматических клеток, а совокупный микробный геном намного превышает геном человека (Shanahan F., 2002). Структура и состав кишечной микрофлоры отражает процессы естественного отбора, протекающие как внутри самого микробного сообщества, так и на уровне его взаимодействия с организмом хозяина (Palmer С., 2007)

Роль нормальной индигенной микрофлоры все еще недостаточно изучена, но одна из наиболее важных ее функций, вероятно, заключается в поддержании колонизационной резистентности против внешней паразитарной экспансии, а также в контроле над чрезмерным ростом потенциальных патогенов, уже присутствующих в кишечнике (Гончарова Г.И., 1982). Антагонистическая активность индигенной микрофлоры обусловлена различными механизмами, прежде всего биохимическими: способностью продуцировать органические кислоты, бактериоцины и другие антимикробные субстанции (Лянная A.M., 1975; Johnson M.G., 1998; Walker W.A., 2008).

Формирование нормальной микрофлоры кишечника человека начинается еще на самых ранних этапах жизни. Считается, что первичным источником бактерий, колонизирующих пищеварительный тракт ребенка, являются родовые пути матери, во время прохождения которых новорожденный заглатывает их содержимое вместе с бактериями вагинальной микрофлоры. После рождения колонизация кишечника ребенка продолжается не только штаммами бактерий поступающих от матери, но и микроорганизмами от других источников находящихся во внешней среде (Fanaro S., 2003). Однако указанные предположения, касающиеся участия материнских штаммов бактерий в первичной колонизации гастроинтестинального тракта ребенка, до последнего времени остаются недостаточно подтвержденными научными данными. Это, в свою очередь связано с малой информативностью используемых для решения данной задачи микробиологических методов, которые основаны, прежде всего, на изучении

морфологических, физиолого-биохимических и кулыуралькых свойств бактериальнь штаммов, изолируемых из материнских и детских источников.

Активное внедрение молекулярно-генетических технологий в практик} микробиологических исследований позволило получить новую информацию о составе свойствах интестинальной микрофлоры у людей разного возраста (Favier C.F., 2002 Furrie Е., 2006; Амерханова A.M., 2009). В последние годы был разработан целый арсен методов с использованием полимеразной цепной реакции, позволяющих не только быстр и достоверно определить видовую принадлежность выделяемых микроорганизмов, но проводить их количественную оценку непосредственно в исследуемом материале бе этапа культивирования.

Среди большого разнообразия бактериальных видов, колонизирующих толсты" кишечник, особого внимания заслуживают бактерии рода Bifidobacterium. В толсто" кишке у детей раннего возраста бифидобактерии являются основной группой составляют до 95% от общей популяции микроорганизмов (Гончарова Г.И., 1986; Таппос G.W., 1994; Reuter G., 2001; Shanahan F., 2002; Tapianinen Т., 2006; Gronlund M.M., 2007).

Благодаря исключительно позитивному воздействию бифидобактерий на локальный статус пищеварительного тракта, а также их системному иммуномодулирующем эффекту, бифидобактерии стали объектом многочисленных научных исследований, и широко используются в качестве пробиотических препаратов (Гончарова Г.И.,1989; Бондаренко В.М., 1995).

Вместе с тем, до последнего времени данные о видовых и штаммовых изменениях, происходящих в составе бифидофлоры у людей по мере взросления, остаются ограниченными.

В этой связи, очевидна актуальность проведения сравнительного мониторинга нормальной микрофлоры толстого кишечника у клинически здоровых детей в динамике с привлечением методов молекулярно-генетической идентификации и типирования штаммов бифидобактерий.

Цель исследования

С использованием бактериологических и молекулярно-генетических методов провести мониторинг становления видового состава бифидобактерий у детей, а также путем сравнительного генетического анализа штаммов бифидобактерий, выделенных в парах мать-ребенок, вьивить особенности транслокации материнских штаммов бифидобактерий кишечного происхождения к ребенку.

Задачи исследования 1. Изучить в динамике качественный и количественный состав микрофлоры толстого

кишечника у клинически здоровых детей разного возраста.

2. Создать коллекцию штаммов бифидобактерий, выделенных из кишечника детей разных возрастных групп и провести их видовую идентификацию при помощи молекулярно-генетических методов.

3. Создать коллекцию штаммов бифидобактерий, выделенных из кишечника детей раннего возраста и их матерей, и провести сравнительный анализ при помощи метода ЯЕР-ПЦР и ЯАРО-ПЦР для установления их генетической идентичности. Научная новизна исследования

Идентификация бифидобактерий проведена с использованием ПЦР с видоспецифичными бифидобактериальными праймерами. Проведено частичное секвенирование 168 рДНК бифидобактерий, выделенных из кишечника детей разного возраста и взрослых женщин, что позволило провести оценку динамики возрастных изменений бифидофлоры.

Впервые с использованием метода ИЕР-ПЦР проведен сравнительный анализ штаммов бифидобактерий в парах мать-ребенок для установления их генетической идентичности. Полученные результаты свидетельствуют в пользу существующей гипотезы о ранней колонизации детей материнскими штаммами бифидобактерий.

Впервые исследовано субвидовое штаммовое разнообразие кишечных бифидобактерий у детей раннего возраста методом ЯАРО-ПЦР и получены данные о транслокации материнских штаммов ог матери к ребёнку.

Практическая значимость

Создана коллекция штаммов бифидобактерий, выделенных из кишечника здоровых детей и взрослых людей, включающая практически все виды микроорганизмов данного рода, обитающие в интестинальн ом микробиоценозе. Видовая принадлежность полученных штаммов определена при помощи высокочувствительных молекулярных методов, что повышает ценность этой коллекции. Часть штаммов бифидобактерий была подвергнута генетической паспортизации методами ЯЕР-ПЦР и ЯАРО-ПЦР фингерпринтинга.

Полученные данные о качественном и количественном составе бифидофлоры у детей различного возраста и взрослых людей могут быть использованы как критерии нормы при оценке различных нарушений микрофлоры кишечного тракта, а также для подбора оптимального видового (штаммового) состава бифидобактерий, включаемых в пробиотические препараты и используемых с целью купирования нарушений кишечной микрофлоры.

Внедрение результатов работы в практику

В настоящее время штаммы из созданной коллекции используются сотрудниками кафедры микробиологии и вирусологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава для изучения разнообразных биологических свойств бифидобактерий (акт от 17 февраля 2010 г.)

Результаты исследования включены в материалы лекционного курса для студентов, врачей-интернов и клинических ординаторов, проходящих обучение на кафедре микробиологии и вирусологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава.

Положения, выносимые на защиту

1. На протяжении-первых лет жизни в популяции бифидобактерий микрофлоры кишечника у здоровых детей наблюдаются выраженные качественные и количественные изменения. В ранние периоды физиологической адаптации для микрофлоры кишечника у детей характерны высокие популяционные уровни и частота выделения бифидобактерий видов В. bifidum, В. longum и В. breve. Кроме того, у детей в первые шесть месяцев после рождения к этой группе относятся и бифидобактерии В. longum bv. infantis. У детей в возрасте 6 лет и у взрослых бифидофлора, в основном, представлена видами В. longum, В. adolescentis, В. catenulaíum и В. bifidum.

2. Молекулярно-генетические методы, основанные на амплификационной технологии (REP-ПЦР и RAPD-ПЦР), позволяют эффективно решать задачи по молекулярно-генетическому тшмрованито бифидобактерий с целью установления уровня их внутривидовых вариаций в микрофлоре кишечника у детей и взрослых людей.

Апробация работы

Апробация диссертационной работы состоялась на научной конференции кафедры микробиологии и вирусологии ГОУ ВПО РГМУ протокол № 3 от 07 октября 2008 года. Основные положения работы были доложены на заседаниях секции гнотобиологии Московского отделения Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов им. И.И. Мечникова в 2005 и 2008 гг., на практической конференции «Тимаковские чтения», проводимой секцией гнотобиологии 24.12.2002 г. в ГОУ ВПО РГМУ.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 15 научных работ, в том числе 3 статьи - в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ, в сборниках научных трудов - 6, в других журналах -1, в материалах конференций - 5.

Объём и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на русском языке на 95 страницах машинописного текста, состоит из введения, 4 глав, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Библиография включает 213 источников, в том числе 33 работы отечественных авторов и 180 работ зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 6 таблицами и 4 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

С целью решения поставленных задач нами была проведена оценка состояния кишечной микрофлоры у 62 клинически здоровых детей обоего пола, из которых пятеро -дети в возрасте от 1 до 3 дней, четверо - в возрасте от 14 до 16 дней, 12 - в возрасте от 1 до 6 месяцев и 28 - в возрасте от 8 до 16 месяцев. Все эти дети (первая группа) были рождены от здоровых матерей в срок. Семеро детей, из группы 8-16 месяцев, были повторно обследованы в возрасте 6-ти лет. Кроме того, одновременно с исследованием микрофлоры кишечника у 13 детей, возраст которых составлял от 2-х до 11 месяцев, было проведено изучение кишечной флоры и у их матерей.

Вторая группа обследуемых включала 16 недоношенных детей (гестационный возраст - 28-36 недель), родившихся от матерей с дородовым излитием околоплодных вод. Дети находились в палате интенсивной терапии и получали антибактериальную терапию и препараты пробиотики (ампициллин, гентамицин + линекс и бифидумбактерин). Исследование микрофлоры кишечника у детей этой группы было проведено первично в первые трое суток жизни, затем в возрасте 2-х недель, и в возрасте 1 -2-х месяцев. Также было проведено изучение кишечной микрофлоры у 12 женщин с дородовым излитием околоплодных вод.

Материалом для исследования являлись фекалии. Выделение микроорганизмов проводили на следующих питательных средах: Бактофок (Гидробиос, Россия) - для бифидобактерий, MRS (Охoíd, Англия) - для лактобактерий, Columbia agar Base (BBL, США) с добавлением канамицина (100 мг/л), витамина К (1,5 мг/л) и крови (5%) - для выделения неспорообразующей облигатно-анаэробной флоры, TSN - agar (Serva, США) с добавлением эмульсии яичного желтка (50 мл/л) - для клостридий, Staphylococcus agar (Difco, США) - для стафилококков, Enterococcus agar (Serva, США) - для энтерококков, Sabouraud Dextrose agar (Serva, США) с добавлением ампиокса (100 мг/л) - для дрожжеподобных грибов рода Candida. Микроорганизмы семейства Enterobacteriaceae выделяли на среде Endo agar (Serva, США) и Brain Heart Infusion agar с добавлением 5% крови. Чашки Петри с посевами инкубировали при 37°С в течение 48 часов. Для

культивирования облигатно-анаэробных микроорганизмов использовали микроанаэро-статы (Oxoid,Англия), заполненные газовой смесью (85% N2, 10% С03,5%Н2) (Постникова Е.А., 2006).

Первичный скрининг штаммов бифидобактерий осуществляли на основании изучения морфологических свойств выросших колоний и окраски материала из них по Граму. Все колонии, подозрительные на принадлежность к роду бифидобактерий, были отсеяны для получения чистой культуры сначала на плотную питательную среду, а затем в жидкую питательную среду TPY для последующего приготовления лиофилизированных стоков. Лиофилизацию чистых культур бактерий проводили в растворе сахарозы (10%) и желатина (1%) в- лиофильной сушке SB1 (Chemlab, Англия). Все последующие манипуляции с чистыми культурами бифидобактерий осуществляли после их выделения из лиофилизированных стоков.

Геномную ДНК из чистых культур бифидобактерий, выделяли с использованием «Genomic DNA Purification Kit» («Fermentas», Литва) в соответствии с рекомендациями изготовителя. Качество и количество ДНК оценивали при помощи электрофореза в 1% агарозном геле.

Видовую идентификацию штаммов бифидобактерий проводили методом ПЦР с девятью парами видоспецифичных праймеров, комплементарных гену 16S рРНК (Bifidobacterium longum, В. bifidum, В. infantis, В. adolescentis генотипы А и В, В. catenulatum, В. angulalum и В. dentum) (Matsuki Т., 2003) (таблица №1). Видовую принадлежность не идентифицированных методом ПЦР штаммов определяли путем секвенирования фрагмента гена 16S рРНК. Продукты секвенирования анализировали при помощи автоматического секвенатора ABI 3100 GeneticAnalyzer («Applied Biosystems», США) и набора программного обеспечения к нему.

Для обнаружения межштаммовых геномных различий у бифидобактерий одного вида был использован метод RAPD-PCR (Bassam et al., 1992) с использованием протокола Jeff Broadbent из Университета штата Юта, США (личное сообщение). Амплификация осуществлялась с использованием амплификатора МС-2 «Терцин» (ЗАО «ДНК-Технология») и следующей программы: I) первоначальная денатурация 95°С 3 мин; 2) 35 циклов: 94°С 20 сек, 58°С 20 сек, 72°С 30 сек; 3) финальная элонгация 72°С 5 мин; 4) охлаждение до 4°С.

Генотипирование бифидобактерий методом REP-ГПДР проводили с использованием праймера BOXA1R по методу Masco L. (Masco L, 2003), установленная температура отжига 52°С.

Продукты ПЦР были визуализированы при помощи гель-электрофореза 10 мкл образцов в 1,5% агарозном геле, приготовленном на буфере IX ТАЕ, содержащем 0,5 мкг/мл бромистого этидия.

Таблица №1

Набор олигонуклеотидных праймеров, использованных для видовой идентификации бифидобактерий с помощью ПЦР

Вид Праймер Последовательность Длина праймера, пн Размер ПЦР-продукта, пн

В. adolescentis BiADO-1 CTCCAGTTGGATGCATGTC 19 279

BiADO-2 CGAAGGCTTGCTCCCAGT 18

В. angulatum BiANG-1 CAGTCCATCGCATGGTGGT 19 275

BiANG-2 GAAGGCTTGCTCCCCAAC 18

В. bifidum BiBÍF-I CCACATGATCGCATGTGATTG 21 278

BiBlF-2 CCGAAGGCTTGCTCCCAAA 19

В. breve BiBRE-1 CCGGATGCTCCATCACAC 18 288

BiBRE-2 ACAAAGTGCCTTGCTCCCT 19

группа В. catenulatum BiCAT-1 CGGATGCTCCGACTCCT 17 285

BiCAT-2 CGAAGGCTTGCTCCCGAT 18

В. longum BiLON-1 TTCCAGTTGATCGCATGGTC 20 831

BíLON-2 GGGAAGCCGTATCTCTACGA 20

В. infantis BiINF-1 TTCCAGTTGATCGCATGGTC 20 828

BiINF-2 GGAAACCCCATCTCTGGGAT 20

В. denlium BiDEN-1 ATCCCGGGGGTTCGCCT 17 387

BiDEN-2 GAAGGGCTTGCTCCCGA 17

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием общепринятых статистических методов на IBM совместимом персональном компьютере с применением программ "Microsoft Excel" и «Biostat». Для проведения статистического анализа полученные результаты представляли в log числа микробов на 1 г исследуемого материала. Для каждой таксономической группы микроорганизмов в каждой обследуемой группе детей считали среднее значение концентрации, стандартное отклонение, частоту встречаемости. Для определения достоверности различий в количественных показателях

микроорганизмов между возрастивши группами использовали многофакторный дисперсионный анализ и t-критерий Стьюдента (Гланц С., 1998)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ Микробиологический мониторинг интестииальной микрофлоры у детей Исследование микрофлоры кишечника здоровых детей, проведённое на третьи сутки жизни, выявило отсутствие у них облигатно анаэробных бактерий (таблица №2).

При этом у 60% детей были выявлены лактозопозитивные кишечные палочки, среднее количество которых составило 7,3±1,5 log КОЕ/г исследуемого материала. Кроме того, у 80% обследуемых детей этого возраста присутствовали стафилококки (4,9±2,3 log КОЕ/г) и энтерококки (8,1±2,0 log КОЕ/г).

Исследование кишечного содержимого у детей на 14-16 день жизни выявило, что бифидобактерии в толстой кишке определялись в 100% случаев, а их среднее количество составляло 9,1±0,5 log КОЕ/г исследуемого материала. Также у 100% детей были выявлены лактобактерии (8,2±0,9 log КОЕ/г), лактозопозитивные эшерихии (7,3±1,3 log КОЕ/г) и энтерококки (7,6±0,5 log КОЕ/г), у 50% - коагулазонегативные стафилококки (6,1 ±0,02 log КОЕ/г) и бактероиды (7,9±0,4 log КОЕ/г). У 28% детей этой группы в кишечнике были обнаружены лактозонегативные Е.соЧ (6,4±1,3 log КОЕ/г).

В микробиоценозе кишечника детей в возрасте от 1 до 6 месяцев по-прежнему преобладали бифидобактерии, определявшиеся со 100% частотой, в количестве, составлявшем 10,1±0,6 log КОЕ/г. Лактобактерии выделялись у 75% детей (8,3±0,8 log КОЕ/г), бактероиды - в 50% случаев (9,8±0,9 log lg КОЕ/г). У всех детей были обнаружены типичные лактозопозитивные эшерихии и энтерококки в среднем количестве, составившем 8,5±0,9 log КОЕ/г и 8,1±1,0 log КОЕ/г исследуемого материала соответственно. Кроме того, в кишечной микрофлоре детей этой возрастной группы было выявлено разнообразие факультативно анаэробных микроорганизмов. Так, у 58% детей выделены S. aureus, количество которых достигало 5,3±1,6 log КОЕ/г, в 42% случаев были обнаружены цитробактеры (6,3±0,3 log КОЕ/г), у 58% были выделены клебсиеллы (8,3±0,9 log КОЕ/г) и у 17% детей определялись Enterobacter cloacae (6,4±2,8 log КОЕ/г). Грибы рода Candida были обнаружены у 42% детей в среднем количестве, составившем 3,7±1,8 log КОЕ/г.

Исследование микрофлоры детей в возрасте от 8 до 16 месяцев показало, что у 100% детей сохранялся высокий уровень бифидобактерии, среднее количество которых достигало 10,2±0,7 log КОЕ/г. Частота выделения лакгобактерий сохранялась на уровне 79%, в среднем составляя 7,2±1,2 log КОЕ/г, а бактероидов, напротив, повысилась до 86%, при этом их уровень достигал значения 10,4±0,5 log КОЕ/г. В 93% случаев уровень

Таблица №2

Динамика формирования кишечной микрофлоры здоровых детей

Качественный состав микрофлоры 1-3 дня (n=5) 14-16 дней (n=4) 1-6 месяцев (n=12) 8-16 месяцев (n=29) 6 лет (n=7)

Кол-во/% M+m log KOE/r Кол-во/% M±m log KOE/r Кол-во/% M+m log KOE/r Кол- во/% M+m log KOE/r Кол-во/% M±m log KOE/r

Бифидобактерии 4/100 9,1 ±0,5 12/100 10,1±0,6 29/100 10,2+0,7 7/100 9,5±0,9

Лактобактерии 4/100 8,2±0,9 9/75 8,3±0,8 23/79,3 7,2±1.2 3/42,8 5,7±0,8

Бактероиды 2/50 7,9±0.4 6/50 9,8+0,9 25786,2 10,4+ 0,5 7/100 10,1 ±0,4

Клостридии(Н28+Яес+) 1/25 8,4 4/33,3 5,6±0,6 15/51,7 5,1± 0,75 4/57,1 5,8±0,8

КлостридииЩгЗ+Лес-) 1/25 6,6 9/75 6,9+1,1 25/86,2 7,8+1,1 5/71,4 6,9±1,9

Клостридии(Н25-) 1/8,3 8,6 14/48,3 9,2±0,8

Клостридии (суммарное кол-во) 10/83,3 7,1+1,1 27/93,1 8,5±1,2 7/100 7,3±1,5

Энтеробактерии: 4/80 8,8±0,5 4/100 7,7±0,9 12/100 8,9±1,1 29/100 8,6±0,8 7/100 7,6±0,5

E.coli(lac+/hem-) 3/60 7,3±1,5 4/100 7,3±1,3 8/66,6 8,5+0,9 27/93,1 7,9±1,1 6/85,7 7,6±0,6

E.coli(lac+/hem+) 7/58,3 8,5±1,1 11/37,9 8,4±0,75 3/42,8 6,6±0,5

E.coli(lac-/hem+) 1/8,3 8,7 3/10,3 7,5+1,3

Е. coli(lac-/hem-) 1/20 9,4 3/75 6,5±1,3 3/25 7,7±1,3 5/17.3 7,2±0,9 1/14,3 7,5

E.coli(cуммарное кол-во) 8,4±0,7 8/66,6 8,6+1,1 29/100 8,4±0,8 6/85,7 7,6±0,5

Kpneumoniae 1/20 9,4 7/58,3 8,5±0,6 13/44,8 6,7±1,4 1/14,3 6,6

K.oxytoca 4/33,3 6,8±1,2 14/48,3 6,7±1,3

Клебсиеллы (суммарное кол-во) 1/20 9,4 7/58,3 8,3±0,9 22/75,8 7,2±1,25 1/14,3 6,6

Е. cloacae 2/16,6 6,4+2,8 6/20,7 6,64+1,6

C.freundii 5/41,6 6,3±0,3 4/13,8 7,6±0,8 1/14,3 7,5

Прочие: P. aeruginosa 3/10.3 3,31 ±0,6

S. aureus 7/58,3 5,3±1.6 24/82,7 4,9±1,3 2/28,6 2,8±0,1

Staphylococcus spp 4/80 4,9±2,3 2/50 6.1 ±0,02 11/91,6 5,1±1,4 21/72.4 4,1 + 1,3 4/57,1 4,0±0,5

Enterococcus spp 4/80 8,1 ±2,0 4/100 7,6±0,5 12/100 8,1 ±0,96 27/93.1 7,8±0,8 7/100 6,1±0,6

Candida spp 1/25 6,2 5/41,6 3,7+1,8 19/65,5 4,8+0,8 3/42,8 2,9±0,8

типичных эшерихий составлял 7,9±1,1 log КОЕ/г, а энтерококков - 7,8±0,8 log КОЕ/г. У 86% детей были выявлены лецитиназонегативные клостридии при среднем показателе количественного уровня 7,8±1,1 log КОЕ/г, лецитиназопозитивные клостридии были обнаружены у 52% детей при среднем показателе 5,1±0,8 log КОЕ/г. Частота выделения, клебсиелл увеличилась до 76%, коагулазопозитивных стафилококков - до 83%, грибов рода Candida - 66%.

Таким образом, микрофлора кишечника здоровых детей в возрасте от 8 до 16 месяцев характеризуется высоким содержанием облигатно анаэробных микроорганизмов. Наряду с бифидобактериями, у большинства детей выделяются бактероиды и лецитиназонегативные клостридии. Бифидобактерии играют существенную роль в поддержании колонизационной резистентности, на фоне избыточной колонизации кишечника условно-патогенными микроорганизмами они, возможно, препятствуют их транслокации в другие экологические ниши организма.

В шестилетнем возрасте у всех обследованных здоровых детей (100%) сохранялся высокий уровень бифидобактерий, средний показатель которых составил 9,5±0,9 log КОЕ/г. При той же частоте бактероиды выявлялись в количестве 10,1±0,4 log КОЕ/г, энтерококки - 6,1±0,6 log КОЕ/г. Однако частота выделения и количественный уровень лактобактерий снизились, причем снижение второго показателя носило достоверный характер (р<0.05). Частота выявления лецитиназопозитивных клостридий сохранялась в тех же пределах (57%), а их количественный уровень несколько снизился (5,8±0,8 КОЕ/г). При этом отмечено снижение как частоты выделения лецитиназонегатввных клостридий (71%), так и количественного показателя их уровня (6,9±1,9 log КОЕ/г). На фоне высокой концентрации бифидофлоры выявлено разнообразие энтеробактерий: у 86% детей определялись типичные эшерихии (7,9±1,1 log КОЕ/г), у 43% - гемолитические эшерихии (6,6±0,5 log КОЕ/г), у 57% - лактозонегативные гемолитические эшерихии (6,8±0,6 log КОЕ/г). Стафилококки, средний показатель которых составил 4,0±0,5 log КОЕ/г, выявлены у 57% детей, у 29% из них обнаружены 5. aureus (2,8±0,1 log КОЕ/г). В 43% случаев были выявлены грибы рода Candida (2,9±0,8 log КОЕ/г).

Таким образом, необходимо отметить, что достаточно высокие количественные показатели бифидофлоры сохранялись у здоровых детей при неизменно высокой частоте встречаемости (100%). Однако доминирующее положение в микробиоценозе кишечника большинства детей в возрасте от 8 месяцев и старше стали занимать облигатно анаэробные грамотрицательные бактерии рода Bacteroides.

Частота встречаемости лактобактерий у детей различных возрастных групп значительно варьировала: от 100% у детей в возрасте 14 дней до 43% у детей 6 лет.

Количественный уровень лактобактерий в этот временной период также снижался от 10s КОЕ/r до] О6 КОЕ/г.

Качественно-количественное разнообразие энтеробактерий достигало максимума к 1-6 месяцам. Типичные эшерихии доминировали среди энтеробактерий у большинства детей в течение всех периодов наблюдения. Частота встречаемости лактозонегативных E.coli у детей в возрасте 14-16 дней составляла 75%, и в последующем снижалась до 28% у детей в возрасте 1-6 месяцев, и 17% у детей 8-16 месяцев. Частота встречаемости клебсиелл к 8-16 месяцу возрастала до 76%, но в последующем к 6-ти годам снижалась до 14%.

Вторая группа обследуемых состояла из 16 недоношенных детей, родившихся от матерей с дородовым излитием околоплодных вод. Дети с рождения находились в стационаре, где получали необходимую терапию, включая антимикробную, а также биотерапевтические препараты («Бифидумбактерин» и «Линекс»), Дети находились на искусственном вскармливании.

Исследование микрофлоры кишечника недоношенных новорожденных показало, что на 3 день, на фоне полного отсутствия облигатно анаэробных бактерий, у половины детей микробный состав кишечника был представлен лактозопозитивными штаммами эшерихий. Кроме того, у небольшой части детей этой группы в кишечнике определялась грамположительная кокковая флора, включавшая стафилококки и стрептококки (таблица №3).

Особенности микробного пейзажа у данной группы детей, вероятно, обусловлены применением с момента рождения антибактериальных препаратов широкого спектра действия.

На 14-16 день доминирующими микроорганизмами оставались энтеробактерии. Так, в 88% случаях у детей высевались типичные эшерихии, в 19% - лактозонегативные эшерихии и в 25% - энтеробактеры. У 75% детей высевались энтерококки (7,8±1,2 log КОЕ/г), а у 25% - другие стрептококки. В 13% случаев были выявлены грибы рода Candida, средний показатель количества которых составил 6,4±0,8 log КОЕ/г, таким образом, значительно превышая норму. Количество бифидобактерий было снижено, и они обнаруживались только у 56% детей этого возраста. Лактобактерии были выделены у 38% детей, бактероиды - у 44%. Микробная флора 56% детей была представлена высоким уровнем анаэробных кокков - 8,2±1,0 log КОЕ/г. У 31% детей выделены негемолитические стафилококки (5,87±0,87 log КОЕ/г) л бациллы (6,78±0,97 log КОЕ/г).

В интестинальной флоре недоношенных детей в возрасте 1-2 месяцев выявлено нарастание уровня бифидобактерий до 9,2±0,7 log КОЕ/г у 60% детей и лактобактерий до

Таблица №3

Динамика формирования кишечной микрофлоры у недоношенных детей

1-3 день(п=16) 14 дней(п=16) 1-2 мес. (n=10)

Качественный M±m log Кол-во/ % M+m log Кол-во/ % M+m log Кол-во/ %

состав микрофлоры KOE/r KOE/r KOE/r

Бифидобактерии 9,2±0,7 6/60

Лактобактерии 5,1±1,0 6/38 7,9±1,3 10/100

Бактероиды 7,2±1,5 5/31 7,9±1,1 3/30

Clostridium !ес+ 4,0 1/6

Clostridium lec- 5,5±0,2 2/13

Пептококки 8,2±1,0 9/56 8,5±0,6 6/60

E.coli Iac+ hly- 6,6±3,0 7/47 8,7±0,8 14/88 7,5±1,0 8/80

E.coli lac+ hly+ 8,2 1/10

E.coli lac-hly- 9,Oil,2 3/19 7,4±0,7 3/30

Klebsiella spp 6,2±1,3 4/25 7,7±1,1 5/50

Klebsiella oxytoca 7,8 1/5

Enterobacter cloacae 9,6±0,3 3/15

Proteus vulgaris 6,0 1/6

Acitietobacter sp 5,7 1/6

Staphylococcus epidermidis 2,3±0,01 mi 5,9±0,9 5/31 6,0±1,1 6/60

Staphylococcus aureus 2,6±0,6 2/13

Стрептококки 3,8±1,1 3/20 7,5±0,5 4/25 8,5 1/10

E.faecium 5,9±3,8 2/13 7,8±1,2 12/75 7,3±],0 10/100

Bacillus sp 6,8±0,97 5/31 7,9 1/10

Candida sp 6,4±0,8 2/13 5,4±1,5 2/20

7,9±1,3 log КОЕ/г у 100%. Средний уровень бактероидов составил 7,9±1,1 log КОЕ/г, также сохранился высокий количественный уровень пептококков равный 8,5±0,6 log КОЕ/г, обнаруженных у 60% детей. Клебсиеллы были выделены у 50% детей (7,7±1,1 log КОЕ/г). Типичные эшерихии выявлены у 80% детей (7,5±1,0 log КОЕ/г), негемолитические лактозонегативные эшерихии (7,4±0,7 log КОЕ/г) - у 30%, гемолитические - у одного ребёнка (8,2 log КОЕ/г). У всех детей обнаружены энтерококки в количестве 7,3±1,0 log КОЕ/г. В 20% случаев были высеяны грибы рода Candida.

Таким образом, проведённое исследование показало, что у недоношенных детей назначение антимикробных препаратов широкого спектра действия приводит к процессу патологической колонизации кишечника, выраженному дефициту бифидофлоры, избыточному увеличению уровня энтерококков и стафилококков и в целом нарушению формирования индигенной анаэробной флоры.

Исследование интестинальной микрофлоры матерей Исследование микрофлоры кишечника проводили у 26 здоровых женщин (возраст от 19 до 42 лет). Было показано (таблица №4), что доминирующей группой у них являлись бифидобактерии, определявшиеся со 100% частотой, в среднем количестве, составившем

9,0±0,4 log КОЕ/г исследуемого материала. У 92% женщин выявлялись лактобактерии и бактероиды. Другие группы строго анаэробных бактерий определялись с меньшей частотой. У 100% женщин выявлялись типичные эшерихии. Лактозонегативные кишечные палочки были обнаружены в одном случае (7,4 lg log КОЕ/г), клебсиеллы у 8% женщин (6,4±0,01 log КОЕ/г). У всех обследованных выявлены энтерококки в количестве б,9±0,13 log КОЕ/г. Staphylococcus aureus (5,6±I,8 log KOE/r) у 15%, коагулазонегативные стафилококки - у 50% (4,3±0,5 log КОЕ/г). У 46% женщин выявлены грибы рода Candida при среднем показателе 4,1±0,5 log КОЕ/г, у одной женщины - филаментозные грибы в количестве 2,3 log КОЕ/г. Кроме этого у 12% обследуемых были выявлены аэробные спорообразующие бациллы (5,1±2,0 log КОЕ/г). Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о высоком уровне и частоте обнаружения бифидобактерий у всех обследованных женщин.

Таблица №4

Сравнительная характеристика интестинальной микрофлоры у здоровых женщин и женщин с дородовым излитием

Качественный состав микрофлоры здоровые жен. (n=26) жен. с дород. изл (п=12)

M±m log KOE/r количество/% M±m log КОЕ/г количествс/%

Бифидобактерии 9,0±0,4 26/100 8,4±0,9 12/100

Лактобактерии 6,4±0,9 24/92 7,5±0,5 10/83

Бактероиды 8,9±0,9 24/92 8,8±1,0 9/75

Clostridium !ес+ 5,2±0,4 3/12

Clostridium lec- 7,7±0,9 11/42 8,7 1/8

Пептококки 7,3±0,8 7/27 8,1±0,4 4/13

E.coli lac+ hly- 7,1 ±0,9 26/100 8,3±0,9 11/92

E.coli lac+ hly+ 7,1±0,04 4/15

E.coli lac- hly- 7,4 1/4 6,4±1,5 3/25

Klebsiella spp 6,5±0,01 2/8

Staphylococcus spp 4,4±0,6 13/50 6,0±0,9 6/50

Staphylococcus aureus 5,7±1,8 4/15

Streptococcus faecalis 6,9±0,1 26/100 6,5±0,9 9/75

Bacillus spp 5,1±2,0 3/12

Candida spp 4,2±0,6 12/46 6,9±0,9 3/25

Достоверных отличий в частоте обнаружения определяемых кишечных микроорганизмов у женщин с дородовым излитием по сравнению со здоровыми женщинами обнаружено не было. Однако у женщин этой группы наблюдалось достоверное снижение количества бифидобактерий и напротив статистически значимое увеличение количества эшерихий, стафилококков и дрожжелодобных грибов рода Candida (р<0,05).

Сравнительный анализ видового состава бифидобактерий у людей различного возраста.

Результаты исследования видового состава кишечной бифидофлоры у здоровых детей и женщин различного возраста представлены в таблице №5. В результате проведенного исследования было установлено, что частота обнаружения бифидобактерий вида B.longum в интестинальной микрофлоре грудных детей составляла 50% и была статистически значимо ниже (р< 0,05), по сравнению с частотой их обнаружения у людей остальных возрастных групп. Однако количество бифидобактерий этого вида у детей раннего возраста была достоверно выше по сравнению с детьми младшего возраста и со взрослыми (р< 0,05). B.bifidum с высокой частотой встречались у людей всех возрастных групп, но наибольшей частота их встречаемости была у грудных детей (66,6%). И хотя имело место снижение частоты встречаемости бифидобактерий этого вида с увеличением возраста человека, статистически оно не было значимо. Концентрация B.bifidum находилась в пределах 109 КОЕ/г и статистически значимо в группах не отличалась. В. breve были обнаружены только у детей раннего возраста в высокой концентрации, превысившей 109 КОЕ/г исследуемого материала,. У детей в возрасте 6 лет бактерии этого вида обнаружены не были, а в группе взрослых людей В.breve были обнаружены только в одном случае в концентрации, не превысившей 108 КОЕ/г исследуемого материала. Наоборот частота встречаемости бифидобактерий вида B.caíenulatum имела тенденцию к росту с увеличением возраста. Так, у грудных детей данный вид бифидобактерий обнаружен не был. В дальнейшем у детей в возрасте от 8 до 16 месяцев и у детей 6 лет бактерии этого вида были обнаружены с частотой 20,7% и 57% соответственно. У взрослых частота обнаружений B.catenulatum составила 31%. Среднее значение концентрации бифидобактерий этого вида у детей раннего возраста была статистически значимо выше (р< 0,05), чем у детей 6-ти лет и у взрослых. Частота встречаемости B.adolescentís у детей раннего возраста была статистически значимо ниже, чем у детей 6-ти летнего возраста и у взрослых (р<0,05). Вид B.longum bv. infantis встречался только у детей 1-6 месяцев с частотой равной 33,3%. B.dentium с низкой частотой были обнаружены только у детей раннего возраста. Также с низкой частотой, но в концентрации превышавшей 109 КОЕ/г исследуемого материала у детей в возрасте 1-6 месяцев и 6-ти лет, в испражнениях были обнаружены бифидобактерии вида B.angulatum, а у детей в возрасте 8-16 месяцев - B.animalis.

Таким образом, в наших исследованиях по изучению видового состава кишечных бифидобактерий у здоровых детей и женщин различного возраста было выявлено, что у детей раннего возраста доминирующими таксонами являются бифидобактерии видов В.

Ы/н]ит, В. \ongum и В.Ьгеуе. Кроме того, у детей в возрасте от 1 до 6 месяцев к этой группе относятся и бифидобаюрии B.longum Ьу. т/апЧз. У детей в возрасте 6 лет и у взрослых бифидофлора в основном была представлена видами В. \ongum, В. ас1о1а-сепи$, В. сшепиШит и В. Ъфйит. Частота встречаемости других видов бифидобактерий заметно уступала этим доминирующим видам.

Таблица №5

Результаты качественного н количественного состава бифидобактерий у здоровых детей и женщин различного возраста

Качественный состав бифидофлоры 1-6 месяцев (n -12) 8-16 месяцев (n=29) 6 лет (п=7) 19-42 года (п=13)

M±m log КОЕ/г Кол-во/% M±m log КОЕ/г Кол-во/% M±m log КОЕ/г Кол- во/% M±in log КОЕ/г Кол-во/%

B.bifidum 9,610,7 8/66,6 9,6±0,75 14/48,3 9,2±0,05 3/42,8 8,9+0,6 6/50

В Jon gum 9,7±0,8 6/50 9,8+0,7 23/79,3 8,9+0,7 7/100 8,5±0,8 12/92,3

В.breve 9,5±0,9 2/16,6 9,711,4 5/17,3 8,6 1/7,6

B.caienulalum 10,1 ±0,5 6/20,7 9,2 ±0,6 4/57,1 8,8±0,8 4/30,7

B.adolescentis 9,8±I,2 2/16,6 10,1 ±0,3 4/13,8 9,1+1,7 5/71,4 9,4±0,4 10/76,9

B.íongum bv. infantis 9,7+0,6 4/33,3

B.denlium 8,3 1/8,3 9,7+0,2 2/6,9

B.angulatum 9,75 1/8,3 9,9 1/14,3

B.animalis 9,8+0,2 4/13,8

Низкие значения частоты обнаружения у группы детей 8-16 месяцев В. ас1о1езсеп115, в совокупности с небольшой частотой выявления бифидобактерий группы В. сМепиШит, указывает на то, что и к 16 месяцу жизни процесс реколонизации кишечника новыми видами бифидобактерий в основном не завершен и, таким образом, интестинальный микробиоценоз продолжает оставаться в состоянии динамического развития, отличаясь от микрофлоры детей более старшего возраста и взрослых людей, характеризующейся стабильностью.

Сравнительный анализ штаммов бифидобактерий кишечной микрофлоры матерей и детей грудного возраста при помощи молекулярно-генетических методов

Изучение качественного и количественного состава кишечной бифидофлоры

проводили в группе включавшей 13 пар мать-ребенок. Возраст двух обследованных детей составлял 11 и 9 месяцев, возраст остальных детей варьировал от 2 до 5,5 месяцев и в среднем составил 3,2 месяца. Возраст двух матерей составлял 19 и 42 года, возраст остальных варьировал от 24 до 30 лет и в среднем составил 26,2 года. Все дети и матери на момент обследования были клинически здоровы и не имели в анамнезе инфекционных заболеваний желудочно-кишечного тракта. Дети с момента рождения находились на грудном вскармливании.

Видовую идентификацию штаммов бифидобактерий проводили методом ПЦР с девятью парами видоспецифичных праймеров. Видовую принадлежность не идентифицированных методом ПЦР штаммов определяли путем секвенирования фрагмента гена 16S рРНК. Ген оптирование бифидобактерий - методом REP-ПЦР.

В результате первичного скрининга от 13 пар мать-ребенок было получено 104 изолята бифидобактерий (61 и 43 от матерей и детей соответственно). Частота встречаемости бифидобактерий составила 100% в обеих группах. Среднее количество бифидобактерий у обследуемых детей составило 10,2+0,6 logKOE/r исследуемого материала, у матерей 9,4+0,6 logKOE/r. Для изучения видового состава выделенных штаммов был использован описанный выше подход. Каждый штамм тестировали с девятью парами видоспецифичных праймеров. Этот метод позволил идентифицировать большинство штаммов. ДНК из 12 штаммов не дали положительных реакций ни с одной парой праймеров. Для трёх из них видовая принадлежность была установлена путем частичного секвенирования 16S рДНК. Для 9 изолятов бифидобактерий видовая принадлежность осталась не установленной. Среднее количество видов бифидобактерий в одном образце, с учетом выбранного уровня разрешения, составило 2,7±1,1 у матерей и 1,9+1,0 у детей.

Таким образом, из 104 изолятов были успешно идентифицированы 95, из которых 17 относились к виду В. longum, 29 - В. adolescentis, 4-5. catenulalum, 7 - В. bifidum и 1 -В. breve у матерей и 13 - к виду В. longum, 13 - В. bifidum, 4 - В. longum bv. infantis, 2 - В. breve, I - В. angulatum, 2 - В. adolescentis и 2 - В. dentium у детей. Встречаемость различных видов бифидобактерий в группе матерей была следующей: наиболее часто встречающимися оказались виды В. longum и В. adolescentis, определявшиеся с частотой 92,3% и 76,9% соответственно, виды В. bifidum, В. catenulatum и В. breve встречались реже, с частотой 46,2%, 30,8% и 7,7% соответственно. В группе детей распределение видов бифидобактерий оказалось иным. Наиболее часто встречающимися видами были В. bifidum и В. longum, определявшиеся с частотой 61,5% и 53,8% соответственно. Реже встречались В. longum bv. infantis и В. breve с частотой встречаемости 30,7% и 15,4% соответственно. В. adolescentis и В. dentium выявлялись с одинаковой частотой составившей 15,4%. Реже других обнаруживался вид В. angulatum, частота встречаемости которого составила 7,7%. Определение видовой принадлежности выделенных бифидобактерий выявило, что некоторые из обследуемых были источниками двух или большего количества изолятов одного вида.

У 9 (из 13) пар мать-ребенок были выявлены совпадающие по видовой принадлежности штаммы бифидобактерий (всего 34 штамма). Видами, которые встречались и в группе матерей и в группе детей были В. longum в шести парах мать-ребенок, В. bifidum - в четырех парах, В. adolescentis и В. breve - в одной паре. Для того чтобы установить, являются ли данные штаммы матерей и детей генетически идентичными, был использован метод REP-ПЦР. В тех случаях, когда REP-ПЦР профили изучаемых бифидобактерий, выделенных от матери и ребенка, имели 100% идентичность по числу, а также массе электрофоретических полос, они, рассматривались, как принадлежащие одному штамму соответствующего вида бактерий, и, наоборот, когда продукты ПЦР при их электрофоретическом разделении давали различные профили полос, изоляты рассматривали как различные штаммы одного вида бифидобактерий (рисунок №1). В результате исследования было выявлено, что у пяти пар мать-ребенок (38,5%) в кишечнике присутствуют идентичные штаммы бифидобактерий. В трех случаях идентичные штаммы бифидобактерий относились к виду В. bifidum, в одном случае - к виду В. longum, и в одном случае - к виду В. adolescentis. Причем в четырех случаях возраст детей колонизированных бифидобактериями, генегически идентичными материнским штаммам, варьировал от 2 до 5,5 месяцев, а в одном случае составил 11 месяцев. Таким образом, более трети детей были колонизированы кишечными штаммами бифидобактерий генетически идентичными штаммам выделенных от их матери. Полученные нами результаты свидетельствуют в пользу существующей гипотезы об участии материнских штаммов бифидобактерий в ранней колонизации кишечника детей. С другой стороны, у большей части детей в составе микрофлоры, бифидобактерий, генетически идентичных материнским штаммам обнаружено не было и источник их происхождения остался неизвестен. Это может быть связано с тем, что настоящее исследование было сосредоточено на сравнительном анализе в кишечнике у матерей и их детей только доминирующих штаммов бифидобактерий, концентрация которых составляла не менее 108 КОЕ/г исследуемого материала, в то время как популяции бактерий, колонизирующих кишечник в более низких концентрациях, не учитывались. Кроме того, как уже было отмечено выше, источником первичной колонизации кишечника ребенка бактериями, являются родовые пути матери, в состав микрофлоры которых наряду с доминирующими в этой экологической нише лактобациллами входят и бифидобактерии.

Рисунок №1. Гель-электрофорез продуктов REP-ПЦР геномной ДНК штаммов бифидобактерий, выделенных из испражнений у пар мать-ребенок.

Примечание: звездочками обозначены идентичные профили электрофоретических полос продуктов REP-ПЦР ДНК детских (Р) и материнских (М) штаммов.

A. Пара №1, штаммы B.longum. 1 - М7; 2 - Р22; 3 - Р29; 4 - М1; 5 - Р18; 6 - МЗ; 7 -Р23; 8 - Р19; 9 - Р25.

Б. Пара №9, штаммы В. bifidum. I - MI 1; 2 - М15; 3 - Р2. Пара №9, штаммы B.longum. 4 - М13; 5 - Р1. Пара №10, штаммы В.bifidum. 6 - М2; 7 - Р8. Пара №12, штаммы В.adolescentes. 8 - М2; 9 - Р11.

B. 1 - пара №1, штамм В. Iongum Р17; 2 - пара №8, штамм В.bifidum Р.; 3 - пара №10, штамм B.longum М:. Пара №13, штаммы В. bifidum. 4 - М5; 5 - Р2. Пара №13, штаммы В.breve. 6 - Р4; 7 - Р1.

В совокупности полученные результаты свидетельствуют о том, что -последующие исследования в этом направлении должны быть проведены не только путем сравнения штаммов, доминирующих в кишечнике, но и минорных групп бифидобактерий, | а также с привлечением большего количества потенциальных источников колонизации детей бактериями нормальной микрофлоры. к

Изучение штаммового разнообразия в популяции бифидобактерий кишечной микрофлоры детей раннего возраста при помощи молекулярно-генетическш методов исследований

Изучение параметров состава бифидобактерий проводили у 29 детей обоего пола (12

мальчиков и 17 девочек), проживающих в ЮЗАО г. Москвы. Возраст детей варьировал от 8 до 16 месяцев и в среднем составил 11 месяцев.

В результате первичного скрининга чашек с посевами испражнений от 29 детей было получено 84 изолята бифидобактерий. Частота встречаемости бифидобактерий с учетом избранного уровня их выявления составила 100%. Среднее количество бифидобактерий у обследуемых детей составило 10,2±0,7 log КОЕ/г исследуемого материала. Видовой состав бифидобактерий этих детей обсуждался в предыдущем разделе и представлен в таблице № 5.

Определение видовой принадлежности бифидобактерий, выделенных от детей, выявило, что некоторые из них были источниками двух или большего количества изолятов одного вида. Для выявления возможного субвидового отличия бактерий мы осуществили титрование выделенных изолятов при помощи метода RAPD-ПЦР. Данный метод зарекомендовал себя в качестве быстрого и надежного средства для межштаммовой дифференцировки прокариот, в том числе и молочнокислых бактерий. RAPD-ПЦР профили, которые были получены путем амплификации бактериальных ДНК с использованием избранного праймера, позволил получить большую базу данных в виде наборов различных по числу и массе электрофоретических полос, характеризующих изучаемые изоляты (рисунок №2). В тех случаях, когда RAPD-ПЦР профили тестируемых бифидобактерий, выделенных от одного ребенка, имели 100% идентичность по числу и массе полос они рассматривались нами, как принадлежащие одному штамму.

На основании данных видовой идентификации бактерий и анализа профилей RAPD изучаемых штаммов, в совокупности с данными изучения культуральных и морфологических свойств изолятов бифидобактерий, был определен качественный состав бифидобактерий у обследованных детей. Доминирующими видами бифидобактерий в кишечной микрофлоре детей оказались виды В. longum (79,3%) и В. bifidum (48,3%). При использованном уровне количественной детекции, кроме того, изредка определялись бактерии группы В. catenulatum (20,7%) и В.breve (17,3%). Ни в одном случае не было обнаружено бифидобактерий видов В. longum bv. infantis и В. angulatum. Среднее число видов, выявленных у одного ребенка, составило 1,6±0,15, в то время как среднее число штаммов, на один образец было статистически значимо выше и составило 2,3±0,2 (р=0,02).

Рисунок №2. Образцы электрофоретнческих профилей КАР1)-ШЦ\ характерных для изученных штаммов бифидобактерий.

Примечание: В, С - профили бифидобактерий, под каждым ЯАРО-ПЦР профилем указан соответствующий вид бифидобактерий и шифр ребенка. Линиями сверху объединены схожие профили. А - Для сравнения приведены профили лактобацилл, выделенных от детей. РЖ - ребенок женского пола. РМ - ребенок мужского пола.

Таким образом, среднее количество колонизирующих кишечник предоминантных штаммов бифидобактерий статистически значимо превышает количество видов этого рода. Полученные данные свидетельствуют о высоком субвидовом разнообразии бактерий, представителей мутуалистической части микрофлоры кишечника, что может иметь значение для поддержания их стабильно высокого популяционного уровня в меняющихся условиях среды и оптимального выполнения ими своих биологических функций.

Ребенок 1

Ребенок 2

Ребенок 3

Изменения в видовом и штаммовом составе бифидобактерий у детей через пятилетний период (в возрасте шести лет)

При повторном исследовании 7 детей из предыдущей группы, проведенном через 5

лет, от них было выделено 35 доминантных штаммов бифидобактерий. Видовой состав бифидобактерий, определенный путем ПЦР с видоспецифичными бифидобактериальными праймерами или путем анализа частично секвенированной последовательности гена 16Б-рРНК, представлен в таблице № 5. Среднее количество видов бифидобактерий в одном образце составило 2,85±0,34.

В ходе нашей работы было выделено всего 23 штамма различных видов бифидобактерий, преимущественно В. ¡ongum, которые встречались у одних и тех же детей, как при первичном, так и при вторичном исследовании. Для того чтобы установить, являются ли данные штаммы генетически идентичными, был применен метод ЯЕР-ПЦР фингерпринтинга. Было обнаружено, что в большинстве случаев произошла смена доминантных штаммов. Только две пары штаммов, выделенные в различные временные периоды от двух детей, были неотличимы друг от друга согласно их геномным отпечаткам (рисунок №3). По нашим данным, это является первым сообщением о длительной персистенции штаммов бифидобактерий в кишечнике человека и свидетельствует о целесообразности дальнейшего изучения на большей выборке и с применением более детального анализа.

Рисунок №3. Сравнение доминирующих штаммов ВЛопцит,выделенных от одних и тех же детей в возрасте 1 года и 6 лет.

Примечание: КЕР-ПЦР профили, цифра указывает возраст детей. Идентичные штаммы выделены прямоугольниками.

Выводы.

1. Микробиоценоз толстого кишечника клинически здоровых детей раннего возраста характеризуется высоким уровнем содержания бифидобактерий, превышающим значение 1010 КОЕ/г исследуемого материала, и, наряду с этим, присутствием условно-патогенных микроорганизмов, в т. ч. клебсиелл, золотистых стафилококков, лецитиназопозитивных клостридий и дрожжеподобных грибов рода Candida.

2. У недоношенных новорожденных на фоне лечения антибактериальными препаратами процесс колонизации кишечника бифидофлорой замедляется, а преобладающими микроорганизмами являются энтеробактерии, энтерококки и стафилококки.

3. Идентификация бифидобактерий, проведенная с использованием ПЦР с видоспецифичными праймерами и путем частичного секвенирования I6S рДНК, показала, что в ранние периоды физиологической адаптации для микрофлоры кишечника детей характерны высокие популяционные уровни и частота выделения бифидобактерий видов В. bifidum, В. longum и В. breve. Кроме того, в первые шесть месяцев после рождения выявляются бифидобактрии В. longum bv. infantis. У детей в возрасте 6 лет и у взрослых людей бифидофлора, в основном, представлена видами В. longum, В. adolescentis, В. catenulatum и В. bifidum.

4. В составе кишечной микрофлоры более трети детей (38,5% случаев) содержатся штаммы бифидобактерий, генетически идентичные материнским штаммам. Эти результаты свидетельствуют об участии материнских штаммов бифидобактерий в ранней колонизации кишечника детей.

5. Обнаружение генетически идентичных штаммов бифидобактерий, относящихся к виду В. longum, в микрофлоре кишечника у детей при повторном исследовании, проведенном спустя 5 лет после первичного исследования, свидетельствуют о том, что бифидобактерии этого вида могут длительно колонизировать кишечник индивидуального хозяина.

Практические рекомендации

Полученные данные о формировании кишечной микрофлоры у детей свидетельствуют о необходимости внедрения в педиатрическую практику методов генотипирования для определения видового и штаммового состава бифидобактерий.

При этом идентификация бифидобактерий может быть осуществлена с использованием ПЦР и видослецифических бифидобактериальных праймеров быстро, прецизионно, обеспечивая экономичность исследования.

Обнаружение в кишечнике детей раннего возраста штаммов бифидобактерий, идентичных материнским, а также способности штаммов некоторых видов бифидобактерий длительное время доминировать в кишечнике людей, позволяет в будущем развивать научно-практическое направление исследований, целью которого должно стать изучение возможности создания и применения пробиотических препаратов. Пробиотические препараты, приготовленные на основе донорских материнских штаммов, а также аутоштаммов бифидобактерий, могут использоваться для коррекции дисбиотических нарушений микрофлоры кишечника у детей, вызванных продолжительной антибиотикотерапией.

Список опубликованных работ:

1. Лянная A.M. Биологические и экологические особенности микробов рода Bifidobacterium / Лянная A.M., Интизаров М.М., Донских Е.Е. // сб. МИИЭМ - М., -1986,- С. 32-38.

2. Гончарова Г.И. Бифидофлора человека, её нормализующие и защитные функции /Гончарова Г.И., Семенова Л.П., Лянная A.M., Козлова Э.П., Донских Е.Е. // Антибиотики и медбиотехнология. -М., - 1987. - T.XXXII - С.179-183.

3. Донских Е.Е. Кислотообразующая активность бифидобактерий. // Сб.2-го МОЛГМИ -М„ - 1987. - С. 63.

4. Донских Е.Е. Качественный и количественный состав кислот, образуемых бнфидобактериями. / Донских Е.Е., Гончарова Г.И. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - М., -1987. - №7, С. 11-15.

5. Гончарова Г.И. Количественный уровень бифидофлоры в кишечнике и его коррелятивная связь с состоянием здоровья человека. / Гончарова Г.И., Лянная A.M., Семенова Л. П., Донских Е.Е. // Труды МНИИЭМ.-М., - 1988. -С. 118-124.

6. Козлова Э.П. Клинико-микробиологическая оценка эффективности сухих и жидких бифидосодержащих продуктов при искусственном вскармливании у детей. / Козлова Э.П., Груздева Т.А., Кулеш Е.М., Донских Е.Е. // Вопросы детской гастроэнтерологии. - М„ - 1988. - № 5, С. 106-117.

7. Тюрин М.В. Выделение плазмидной ДНК из бифидобактерий. / Тюрин М.В., Донских Е.Е., Гончарова Г.И., Шендеров Б.А. // Антибиотики и химиотерапия. -М., - 1990.- №7 - С. 23-25.

8. Гончарова Г.И. Характеристика и использование бифидобактерий, выделенных от взрослых и детей. / Гончарова Г.И., Лянная A.M., Бевз Н.И., Груздева Т.А., Донских Е.Е. // Сб. МНИИЭМ. М„ -1990. - С. 48-53.

9. Гончарова Г.И. Защитная роль бифидофлоры в организме новорожденных. / Гончарова Г.И., Чистякова В.И., Лянная A.M., Донских Е.Е., Бевз Н.И., Козлова Э.П. // Сб. МНИИЭМ. -М„ -1991. - С. 92

10. Ефимов Б.А. Микрофлора кишечника у населения разных стран. / Ефимов К.А., Коршунов В.М., Кафарская Л.И., Пикина А.П., Донских Е.Е. // Тезисы докладов Всероссийской научно-практической конференции «Дисбактериозы и эубиотики». - М. 1996. - С. 12.

11. Ефимов Б.А. Влияние микробной контаминации окружающей среды на колонизацию кишечника детей раннего возраста. / Ефимов Б.А., Кафарская Л.И., Донских Е.Е. // Материалы конференции дня специалистов ЦФО: «Эпидемиологи^ диагностику профилактика и лечениеагауаш№кинфеи1ионнькзабояеваний>)-М, -19-20оюября, 2004.-С.34-36.

12. Ван Ликуй. Молекулярный мониторинг микрофлоры кишечника недоношенных новорожденных. / Ван Ликуй, Кафарская Л.И., Шкопоров А.Н., Донских Е.Е // В материалах IV конгресса педиатров-инфекционистов России «Актуальные вопросы инфекционной патологии у детей». - М., -14-16 декабря, 2005. - С. 127

13. Кафарская Л.И. Локальный иммунитет кишечника. / Кафарская Л.И., Володин Н.Н., Ефимов Б.А., Донских Е.Е., Шкопоров А.Н. // Вопросы практической педиатрии. - 2007. - Т.2 - № 4 - С. 46-50.

14. Goncharova G.I. Characteristic of Bifidobacterium isolated from feces of infant adults. / Goncharova G.I., Ljannaja A.M., Donskikh E.E. // Abstracts. 10th International Bifidobacterium Conference. - Tokyo, Japan. - Sept. 12-13,1990. - P. 51

15. Kulagina E.V. Comparative study of species and strain distribution of bifidobacteria in the breast-fed infants and thier mothers /Kulagina E.V., Shkoporov A.N., Donskikh E.E., Khokhlova E.V., Kafarskaya L.I., Efimov B.A. // Abstract book The 9th Biennial Congress of the Anaerobe Society of the Americans. - Long Beach, California USA, - June 24-27, 2008. - P. 27.

Список сокращений:

1. КОЕ - колониеобразующая единица

2. ПЦР - полимеразно-цепная реакция

3. М - среднее значение величин

4. т - стандартное отклонение от средней величины

5. п - количество образцов

6. ЯЕР-ПЦР - амплификация повторяющихся элементов геномной ДНК

7. ИАРО-ИЦР - случайно амплифицированные полиморфные ДНК

8. (Н23+/1ес+) - сероводородпродуцирующие, лецитиназопозитивные

9. (НгЭ+Лес-) - сероводородпродуцирующие, лецитиназонегативные

10. (1ас+Лет+) - лактозопозитивные, гемолизин продуцирующие

11. (1ас+/Ьет-) - лактозопозитивные, гемолизин не продуцирующие

12. (¡ас-Лет-) - лактозонегативные, гемолизин не продуцирующие 13 (1ас-Л1ет+) - лактозонегативные, гемолизин продуцирующие

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Донских, Екатерина Евгеньевна

Оглавление стр.

Список сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Нормальная микрофлора кишечника и её значение для здоровья ребёнка

1.2. Бифидобактерии и их значение для здоровья человека

1.3. Молекулярно-генетические исследования микрофлоры

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Пациенты, методика забора и транспортировки материала. Бактериологическое исследование микрофлоры кишечника

2.2. Выделение штаммов бифидобактерии из клинического материала

2.3. Выделение тотальной ДНК из штаммов бифидобактерии и идентификация изолятов

2.4. Методы статистической обработки

Глава 3. Результаты собственных исследований

3.1. Микробиологический мониторинг интестинальной микрофлоры у детей

3.2. Исследование интестинальной микрофлоры матерей

3.3. Сравнительный анализ видового состава бифидобактерий у людей различного возраста

3.4. Сравнительный анализ штаммов бифидобактерий кишечной микрофлоры матерей и детей при помощи молекулярно-генетических методов

Глава 4. Обсуждение результатов

Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярный и микробиологический мониторинг становления микрофлоры кишечника новорожденных"

Поверхность слизистых оболочек является местом наиболее тесного взаимодействия организма хозяина с колонизирующими его микроорганизмами, причем слизистая кишечника представляет собой наиболее значительную область такого контакта. Являясь местом обитания многочисленного бактериального сообщества, отделенного от внутренней среды организма только монослоем эпителиальных клеток, кишечник адаптирован для двусторонних обменных процессов хозяин-микрофлора. Количество резидентных бактерий, обитающих в кишечнике, десятикратно превосходит число человеческих соматических клеток, а совокупный микробный геном намного превышает геном человека (171). Структура и состав кишечной микрофлоры отражает процессы естественного отбора, протекающие как внутри самого микробного сообщества, так и на уровне его взаимодействия с организмом хозяина.

Роль нормальной индигенной микрофлоры все еще недостаточно изучена, но одна из наиболее важных ее функций, вероятно, заключается в поддержании колонизационной резистентности против внешней паразитарной экспансии, а также в контроле за чрезмерным ростом потенциальных патогенов, уже присутствующих в кишечнике (8). Антагонистическая активность индигенной микрофлоры обусловлена различными механизмами, прежде всего биохимическими: способностью продуцировать органические кислоты, бактериоцины и другие антимикробные субстанции (24; 197).

Формирование нормальной микрофлоры кишечника человека начинается еще на самых ранних этапах жизни. Считается, что первичным источником бактерий колонизирующих пищеварительный тракт ребенка являются родовые пути матери, во время прохождения которых новорожденный заглатывает их содержимое вместе с бактериями вагинальной микрофлоры. После рождения колонизация кишечника ребенка продолжается не только штаммами бактерий поступающих от матери, но и микроорганизмами от других источников находящихся во внешней среде (103). Однако, указанные предположения, касающиеся участия материнских штаммов бактерий в первичной колонизации гастроинтестинального тракта ребенка, до последнего времени остаются не достаточно подтвержденными научными данными. Это, в свою очередь связано с малой информативностью используемых для решения этой задачи микробиологических методов, основанных, прежде всего, на изучении морфологических, физиолого-биохимических и культуральных свойств бактериальных штаммов изолируемых из материнских и детских источников.

Активное внедрение молекулярно-генетических технологий в практику микробиологических исследований позволило получить новую информацию о составе и свойствах интестинальной микрофлоры у людей разного возраста (66, 68). В последние годы был разработан целый арсенал методов, основанных на полимеразной цепной реакции, позволяющих не только быстро и достоверно определить видовую принадлежность выделяемых микроорганизмов, но и проводить их количественную оценку непосредственно в исследуемом материале без этапа культивирования.

Среди большого разнообразия бактериальных видов, колонизирующих толстый кишечник, особого внимания заслуживают бактерии рода Bifidobacterium. В толстой кишке у детей бифидобактерии являются основной группой и составляют до 95% от общей популяции микроорганизмов (7, 187,

Благодаря исключительно позитивному воздействию бифидобактерий на локальный статус пищеварительного тракта, а также их системному иммуномодулирующему эффекту, бифидобактерии стали объектом многочисленных научных исследований, и широко используются в качестве пробиотических препаратов (9, 3).

Вместе с тем, до последнего времени данные о видовых и штаммовых

157, 171, 189, 78). изменениях, происходящих в составе би фи до флоры у людей по мере взросления, остаются ограниченными.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

С использованием бактериологических и молекулярно-генетических методов провести мониторинг становления видового состава бифидобактерий у детей, а также путем сравнительного генетического анализа штаммов бифидобактерий, выделенных в парах мать-ребенок, выявить особенности транслокации материнских штаммов бифидобактерий кишечного происхождения к ребенку.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Изучить в динамике качественный и количественный состав микрофлоры толстого кишечника у клинически здоровых детей разного возраста.

3. Создать коллекцию штаммов бифидобактерий, выделенных из кишечника детей раннего возраста и их матерей, и провести сравнительный анализ при помощи метода КЕР-ПЦР и КАРБ-ПЦ? для установления их генетической идентичности.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ Идентификация бифидобактерий проведена с использованием ПЦР с видоспецифичными бифидобактериальными праймерами. Проведено частичное секвенирование 168 рДНК бифидобактерий, выделенных из кишечника детей разного возраста и взрослых женщин, что позволило провести оценку динамик" возрастных изменений бифидофлоры.

Впервые с использованием метода КЕР-ПЦР проведен сравнительный анализ штаммов бифидобактерий в парах мать-ребенок для установления их генетической идентичности. Полученные результаты свидетельствуют в пользу существующей гипотезы о ранней колонизации детей материнскими штаммами бифидобактерий.

Впервые исследовано субвидовое штаммовое разнообразие кишечных бифидобактерий у детей раннего возраста методом ЛАРО-ПЦР и получены данные о транслокации материнских штаммов от матери к ребёнку.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Создана коллекция штаммов бифидобактерий, выделенных из кишечника здоровых детей и взрослых людей, включающая практически все виды микроорганизмов данного рода, обитающие в интестинальном микробиоценозе. Видовая принадлежность полученных штаммов определена при помощи высокочувствительных молекулярных методов, что повышает ценность этой коллекции. Часть штаммов бифидобактерий была подвергнута генетической паспортизации методами ЫЕР-ПЦР и КАРБ-ПЦР фингерпринтинга.

В настоящее время штаммы из созданной коллекции используются сотрудниками кафедры микробиологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава для изучения разнообразных биологических свойств бифидобактерий.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

ПУБЛИКАЦИИ

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Донских, Екатерина Евгеньевна

выводы

1. Микробиоценоз толстого кишечника клинически здоровых детей раннего возраста характеризуется высоким уровнем содержания бифидобактерий, превышающим значение Ю10 КОЕ/г исследуемого материала, и, наряду с этим, присутствием условно-патогенных микроорганизмов, в т. ч. клебсиелл, золотистых стафилококков, лецитиназопозитивных клостридий и дрожжеподобных грибов рода Candida.

3. Идентификация бифидобактерий, проведенная с использованием ПЦР с видоспецифичными праймерами и путем частичного секвенирования 16S рДНК, показала, что в ранние периоды физиологической адаптации для микрофлоры кишечника детей характерны высокие популяционные уровни и частота выделения бифидобактерий видов В. bifidum, В. longum и В. breve. В первые шесть месяцев после рождения выявляются бифидобактерии B.longum bv. infantis. В возрасте 6 лет и у взрослых людей бифидофлора, в основном, представлена видами В. longum, В. adolescentis, В. catenulatum и В. bifidum.

Практические рекомендации

При этом идентификация бифидобактерий может быть осуществлена с использованием ПЦР и видоспецифических бифидобактериальных праймеров быстро, прецизионно, обеспечивая экономичность исследования.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Донских, Екатерина Евгеньевна, Москва

1. Амерханова A.M. Научно-производственная разработка новых препаратов синбиотиков и клинико-лабораторная оценка их эффективности. Автореф. Докторской диссертации. М. 2009г.

2. Бондаренко В.М., Учайкин В.Ф. и др. Дисбиоз: современные возможности профилактики и лечения.// М., 1995; 22 с.

3. Воробьев A.A., Абрамов H.A., Бондаренко В.М. и др. Дисбактериозы -актуальная проблема медицины.// Вестн. РАМН, 1997; 3, с. 4-7.

4. Володин H.H., Коршунов В.М., Гладько И.А., Кафарская Л.И., Сидоров A.A., Ахметова Л.М. Влияние микрофлоры родовых путей беременных на течение периода новорожденное™ недоношенных детей. //Вопр. охр. мат. и дет. 1986; 3: 53-55.

5. Гланц С. Медико-биологическая статистика. //Пер. с англ. Практика, М., 1998; с.459

6. Гончарова Г.И. Бифидофлора человека и необходимость ее оптимизации. //В сб.: Бифидобактерии и их использование в клинике, медицинской промышленности и сельском хозяйстве. М., 1986; с. 10-17.

7. Гончарова Г.И. Бифидофлора человека, ее защитная роль в организме и обоснование сфер применения препарата бифидумбактерина. // Автореф. докторской диссертации. М., 1982.

8. Гончарова Г.И., Дорофейчук В.Г., Смолянская А.З., Соколова К.Я. Микробная экология кишечника у детей в норме и при патологии. //Антибиотики и химиотерапия, 1989; 34 (6), с. 462-466.

9. Имнадзе Н.Г. Изучение кишечной микрофлоры здоровых новорожденных в возрастном аспекте. //Тезисы доклада на научной конференции молодых ученых Грузии, Тбилиси, 1981; с.211.

10. Козлова Э.П. Микрофлора кишечника новорожденных детей в норме и патологии, ее восстановление бифидумбактерином.// Дисс. канд. мед. наук, М., 1978; 147 с.

11. Козлова Э.П., Гончарова Г.И., Семенова Л.П. и др. Динамика становления микрофлоры кишечника здоровых доношенных новорожденных детей. //ЖМЭИ, 1977; 2, с. 73-79.

12. Коршунов В.М. Проблема регуляции микрофлоры кишечника.// ЖМЭИ, 1995; 3, с. 48-55.

13. Коршунов В.М., Поташник Л.В., Ефимов Б.А., Володин H.H., Коршунова О.В., Gyr К., Frei R., Reber Н., Ierendorg D. Микрофлора кишечника у детей Монголии, России и Швейцарии. //ЖМЭИ, 2001; 2, с. 61-64.

14. Куваева И.Б. Обмен веществ организма и кишечная микрофлора.

15. Медицина, М., 1976; 210 с.

16. Леванова Л.А. Алешкин В.А., Воробьев A.A. и др. Становление микрофлоры кишечника у детей первого года жизни. //Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол., 2001; №4, с. 47-50.

17. Ленцнер A.A. Лактобациллы микрофлоры человека.// Автореф. дисс. докт. мед. наук, Тарту, 1973.

18. Луговская Р.К. Влияние различных видов вскармливания на физическое развитие и состояние здоровья детей первого года жизни. //Педиатрия, 1982; 7, с. 30-33.

19. Луговская Р.К., Ладодо К.С., Барашнева С.М., Паберза Р.Я. Сравнительная оценка состояния микрофлоры кишечника у детей первых месяцев жизни при искусственном вскармливании различными молочными смесями. //Вопросы питания, 1984; 4, с. 29-33.

20. Лянная A.M., Гончарова Г.И. Кислотообразующие и антагонистические свойства бифидобактерий. // В кн.: Эпидемиология, диагностика и профилактика кишечных, респираторных и природно-очаговых инфекций. Сб. науч. раб. М., 1975; с. 92-93.

21. Мальцева H.H. Стимуляция местного иммунитета с помощью микробов-представителей нормальной микрофлоры и их компонентов. //Автореф. дисс. канд. мед. наук, М., 1987; 25 с.

22. Постникова Е.А., Кафарская Л.И., Ефимов Б.А., Пикина А.П. Изучение качественного и количественного состава микрофлоры кишечника у клиническиздоровых детей в раннем возрасте. //ЖМЭИ, 2004; 1, с.62-67.

23. Тарабрина Н.П. Взаимодействие лактобацилл со слизистой оболочкой кишечника. //ЖМЭИ, 1980; 2, с. 89-93.

24. Холодова И.Н. Микрофлора кишечника новорожденных при различных видах родоразрешения и пути ее коррекции.// Автореф. дисс. канд. мед. наук, М., 1990.

25. Яцык Г.В. Особенности пищеварительной системы у недоношенных детей. //Автореф. дисс. докт. мед. наук, М., 1980.

26. Aguirre М., Collins M.D. Lactic acid bacteria ahd human clinical infections.// J. Appl. Bacterid., 1993; vol. 75, p. 95-107.

27. Ahmed M, Macfarlane GT, Fite A, McBain AJ, Gilbert P, Macfarlane S. Mucosa-associated bacterial diversity in relation to human terminal ileum and colonic biopsy samples. //Appl. Environ. Microbiol., 2007; 73:7435-7442.

28. Backhed F, Ley R.E, Sonnenburg J.L, Peterson D.A, Gordon J.I. Host-bacterial mutualism in the human intestine. //Science, 2005; Mar 25; 307(5717):1915-20.

29. Backhed F., Ding H., Wang Т., Hooper L.V, Koh G.Y, et al. The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage. //Proc Natl Acad Sci USA, 2004; 101:15718-15723.

30. Bai A.P. Ouyango Q., Zhang W. et al. Probiotics inhibit TNF a- induced in terleukin-8 secretion of HT29cell.//J.Gastroenterology.2004;V. 48(2).P.75-82.

31. Ballongue J., Schumann C., Quignon P. Effects of lactulose and lactitol on colonicmicroflora and enzymatic activity.//Scand. J.Gastroenterol., 1997;(suppl.222): p.41-44.

32. Bennet R., Nord C.E. Development of the fecal anaerobic microflora after caesarean section and treatment with antibiotic in newborn infants.// Infection, 1987;, 15, p. 332-336

33. Benno Y., Sawada K., Mitsuoka T. The intestinal microflora of infants: composition of fecal flora in breast-fed and bottle-fed infants.// Microbiol. Immunol., 1984; 28, p. 975-986.

34. Berg R.D. The indigenous gastrointestinal microflora.// Trends in Microbiol., 1996, 4, p. 430-435.

35. Berg R.D. Translocation and the indigenous gut flora.// In: Fuller R. ed. Probiotics, the scientific basis. London: Chapman and Hall, 1992; p. 55-85.

36. Bezirtzoglou E., Romond M.B., Romond C. Modulation of Clostridium perfringens intestinal colonization in infants delivered by caesarean section. //Infection, 1989; 17, p. 232-236

37. Bik E.M, Eckburg P.B, Gill S.R, Nelson K.E, Purdom E.A, et al. Molecular analysis of the human stomach. //Proc Natl Acad Sci USA., 2006; 103:732-737.

38. Bashir MEN, Louie S, Shi HN, Nagler-Anderson C. Toll-like receptor 4 signaling by microbes influences susceptibility to food allergy .//J. Immunol.,2004; 172:6978-87.

39. Brandzaeg P., Bjorbe K. Production and secretion of immunoglobulins in the gastrointestinal tract. //Ann. Allerg., 1987; v.59, N5, Pt. 2, p. 21-39.

40. Brook I., Barett C., Brinkman C., Martin W., Finegold S. Aerobic and anaerobic bacterial flora of the maternal cervix and newborn gastric fluid and conjunctiva: a prospective study. //Pediatrics, 1979; 63, p. 451-455.

41. Cebra J.J. Influences of microbiota on intestinal immune system development.

42. Am. J. Clin. Nutr., 1999; 69, p. 1046-1051.

43. Cheikhyoussef A, Pogori N,Chen W, Zhang H. Antimicrobial proteinaceous compounds obtained from bifidobacteria: from production to their application, //int. J. Food Microbiol., 2008; Jul 31, 125(3): 215-22.

44. Claud EC, Savidge T, Walker WA, Modulation of human intestinal epithelial cell interleukin-8 secretion by human milk factors. // Pediatr.Res., 2003; 53:419-25.

45. Clement BG, Kitts CL. Isolating PSR-quality DNA from human feces with a soil DNA kit,//Bio Techniques., 2000; 28:640-646.

46. Coyne MJ, Reinap B, Lee MM, Comstock LE. Human symbionts use a host-like pathway for surface fucosylation. Science. 2005 Mar 18; 307(5716): 1778-81.

47. Coyne MJ, Weinacht KG, Krinos CM, Comstock LE. Mpi recombinase globally modulates the surface architecture of a human commensal bacterium. Proc Natl Acad Sci USA. 2003 Sep 2; 100(18):10446-51. Epub 2003 Aug 12.

48. Cross M.L., Gill H.S. Can immunoregulatory lactic acid bacteria be used as dietary supplements to limit allergies? Int. Arch. Allergy Immunol., 2001, 125(2), p. 112-119.

49. Cummings J.H., Macfarlane G.T. The control and consequences of bacterial fermentation in the human colon. J. Appl. Bacteriol., 1991, 70, p. 443-459.

50. Cunningham-Rundles S., Lin D. Nutrition and the immune system of the gut. Nutrition, 1998, 14, p. 573-579.

51. Dehpande G, Rao S, Patole S. Probiotics for prevention of necrotizing enterocolitis in preturm neonates with veiy low birth weight: a systematic review of randomized control trials.//Lancet, 2007; 369:1614-20.

52. Destoumieux-Garzon D, Peduzzi J, Rebuffat S. Focus on modified microcins: structural features and mechanisms of action. //Biochimie, 2002; 84:511-519.

53. Diaz RL, Hoang L, Wang J, Vela JL, Jenkins S, Aranda R, Martin MG. Maternal adaptive immunity influences the intestinal microflora of suckling mice. //J. Nutr., 2004; 136:2359-2364.

54. Dietch E.A., Hempa A.C., Specian R.D., Bery R.D. A study of the relationshipamong survival gut origin, sepsis, and bacterial translocation in a model of systemic inflammation.//J. Trauma., 1992: vol. 32, p. 141-147.

55. Eckburg P.B., Bik E.M., Bernstein C.N., Purdom E., Sargent M., Gill S.R., Nelson K.E., Relman D.A. Diversity of the human intestinal microbial flora. //Science, 2005; 308:1635-1638.

56. Erickson K.L. and Hubbard N.E. Probiotic immunomodulation in health and disease. //J. Nutr., 2000: v.130, p. 403-409.

57. Erika C, Lei Lu, Pauline M. Anton, Tor Savidge, Bobby J. Cherayll Developmentally regulated IkB expression in intestinal epithelium and susceptibility to flagellin-induced inflammation. //PNAS, 2004; 101:19, 7404-7408.

58. Favier CF, Vaughan EE, De Vos WM, Akkermans AD. Molecular monitoring of succession of bacterial communities in human neonates. //Appl Environ Microbiol., 2002; 68:219-226.

59. Fukushima Y., Kawata Y., Hara H., Terada A., Mitsuoka T. Effect of a probiotic formula on intestinal immunoglobulin A production in healthy children.// Int. J. Food Microbiol., 1998; vol.42, p. 39-44.

60. Furrie E. A molecule revolution in the study of intestinal microflora. //Gut, 2006; 55:141-143.

61. Gasser F. Safety of lactic acid bacteria and their occurrence in human clinical infections. //Bull. Inst. Pasteur., 1994; vol. 92, p. 45-67.

62. George M., Nord C.E., Ronquist G., Hedenstierna G., Wiklund L. Fecal microflora and urease activity during the first six months of infancy. //Uppsala J. Med. Sci., 1996; 101, p. 233-250.

63. Gibson G.R. and Fuller R. Aspects of in vitro and in vivo research approaches directed toward identifying probiotics and prebiotics for human use. //J. Nutr., 2000; vol. 130, p. 391-395.

64. Gill SR, Pop M, Deboy RT, Eckburg PB, Turnbaugh PJ, Samuel BS, Gordon JI, Relman DA Fraser-Liggett CM, Nelson KE. Metagenomic analyses of the humandistal. //Science, 2006; 312:1355-1359.

65. Goldin B.R. Intestinal microflora: metabolism of drugs and carcinogens.// Ann. Med., 1990; vol. 22, p. 43-48.

66. Goldin B.R., Gorbach S.L., Saxelin M.,Barakat S., Gualtieri L., Salminen S. Survival of Lactobacillus species (strain GG) in human gastrointestinal tract. //Dig. Dis. Sci., 1992; vol. 37, p. 121-128.

67. Goldman A.S. Modulation of the gastrointestinal tract of infants by human milk. Interfaces and interactions. An evolutionary perspective.// J. Nutr., 2000; 130 (2), p. 426-431.

68. Gronlund M.M., Lehtonen O.P., Eerola E., Kero P. Fecal microflora in healthy infants born by different methods of delivery: permanent changes in intestinal flora after cesarean delivery. //J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr., 1999; 28, p. 19-25.

69. Guarner F. The colon as an organ: habitat of bacterial flora.// Nutr. Hosp., 2002; 17 (2), p. 7-10.

70. Guarner F, Malagelada JR. Gut flora in health and disease. //Lancet, 2003; 361:512-519.

71. Guenmonde M, Tolkko S, Korpimaki T, Salminen S. New real-time quantitative PCR procedure for quantification of bifidobacteria in human fecal samples.//Appl.Environ.Microbiol., 2004; 70:4165-4169.

72. Guerin-Danan C., Andrieux C., Popot F., Charpilienne A., Vaissade P., Gaudichon

73. C. Pattern of metabolism and composition of the fecal flora in infants 10 to 18 months old from day care centers. //J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr., 1997; 25, p. 281-289.

74. Hattori K, Yamammoto A, Sasai M, et al. Effects of administration of bifidobacteria on fecal microflora and clinical symptoms in infants with atopic dermatitis.//Allergi, 2003; 52:20-23.

75. Hayashi H, Sakamoto M, Benno Y. Phylogenetic analysis of the human gut microbiota using 16S rDNA clone libraries and strictly anaerobic culture-based methods.//Microbiol., Immunol., 2002; 46:535-548.

76. He F, Ouwehand AC, Isolauri E, et al. Comparison of mucosal adhesion and species identification of bifidobacteria isolated from healthy and allergic infants. //FEMS Immunol.Med.Microbiol., 2001; 30:43-47.

77. Hentges D.J. Human intestinal microflora in health and disease. //Academic press, New York, 1983; p. 129-305.

78. Hooper L.V., Wong M.H., Thelin A., Hansson L., Falk P.G., Gordon J.I. Molecular analysis of commensal host-microbial relationships in the intestine. //Science, 2001; 291, p. 881-884.

79. Hopkins MJ, Macfarlane GT, Furrie E., Fite A, Macfarlane S. Characterization of intestinal bacteria in infant stools using real-time PCR and northern hybridization analyses. //FEMS Microbial Ecol., 2005; 54:77-85.

80. Kaila M., Isolauri E., Soppi E., Virtanen E., Laine S., Arvilommi H. Enhancement of the circulating antibody secreting cell response in human diarrhea by a human Lactobacillus strain. //Pediatr. Res., 1992; vol. 32, p. 141-144.

81. Kassinen A, Krogius L, Makivuokko H, et al. The fecal microbiota of irritable bowel syndrome patients differs significantly from that of healthysubjects.//Gastroenterology, 2007; 133:24-33.

82. Kawai T, Akira S. TLR signaling. //Cell Death Differ., 2006; 13:816-825.

83. Kay B., Fuller R., Wilkinson A.R., Hall M., McMichael J.E., Cole C.B. High levels of staphylococci in the faeces of breastfed babies. //Microb. Ecol. Health Dis., 1990; 3, p. 277-279.

84. Kim W.J. Bacteriocins of lactic acid bacteria: their potential as food biopreservative. //Food Rev. Intern., 1993; 9, p. 299-313.

85. Klaenhammer T.R. Probiotic bacteria: today and tomorrow.// J. Nutr., 2000; v. 130, p.415-416.

86. Kleessen B., Bunke H., Tovar K., Noack J., Sawatzki G. Influence of two infant formulas and human milk on the development of the faecal flora in newborn infants. //Acta Pediatr., 1995; 84, p. 1347-1356.

87. Kohler H, McCormick BA, Walker WA. Bacterial-enterocyte crosstalk cellular mechanisms in health and disease.//J.Pediatr.Gastroenterol.Nutr.,2003; 36:175-185.

88. Lammers K.M., Brigidi P., Vitali B. et al. Immunomodulatory effects of probiotic bacteria DNA: IL-1 and IL 10 response in human peripheral blood mononuclear cells.//FEMS immunol. Med. Microbiol., 2003; v. 38(2).p.694-700.

89. Langhendries J.P., Paquay T., Hannon M., Darimont J. Intestinal flora in the neonate: impact on morbidity and therapeutic perspectives.// Arch. Pediatr., 1998; 5 (6), p. 644-653.

90. Lejuune C., Bourrillon A., Boussougant Y., de Poillerets F. Sequential development of the intestinal flora in newborn infants: a quantitative differential analysis. //In: Dev. Pharmacol, and Ther., 1984; 7, 1, p. 138-143.

91. Ley RE, Backhed F, Saunier K, Turnbaugh P, Lozupone CA, Knight RD, Gordon JL Obesity alters gut microbial ecology. //Proc. Natl. Acad Sci USA, 2005; 102:11070-11075.

92. Ley RE, Peterson DA, Gordon JI. Ecological and evolutionary forces shaping microbial diversity in the human intestine. //Cell, 2006; 124:837-848.

93. Ley RE, Turnbaugh P, Klein S, Gordon JI. Microbial ecology: human anaerobic microflora. //Nature., 2006; 444:1022-1023.

94. Lidbeck A., Nord C.E. Lactobacilli and the normal human anaerobic microflora. //Clin. Infect. Dis., 1993; 16 (4), p. 181-187.

95. Lidbeck A., Nord C.E., Gustafsson J.A., Rafter J. Lactobacilli, anticarcinogenic activities and human intestinal microflora.//Eur. J. Cancer. Prev.,1992;l(5),p.341-353.

96. Lievin-Le Moal Y, Servin AL. The front line of enteric host defense against unwelcome intrusion of harmful microorganisms: mucins, antimicrobial peptides, and microbiota.//Clin.Microbio 1 .Rev., 2006; 19:315-337.

97. Lin HC, Su BH, Chen AC, et al. Oral probiotics reduce the necrotizing enterocolitis in very low birth weight infants. //Pediatrics, 2005; 115:1-4.

98. Lindberg E., Nowrouzian F., Adlerberth I., Wold A.E. Long-Time Persistence of Superantigen-Producing Staphylococcus aureus Strains in the Intestinal Microflora of Healthy Infants. //Pediatric research. 2000; 48 (6): 741-747.

99. Ling W.H., KorpelaR., Mykkanen H., Salminen S., Hanninen O. Lactobacillus strain GG supplementation decreases colonic hydrolytic and reductive enzyme activities in healthy female adults. //J. Nutr., 1994; vol. 124, p. 18-23.

100. Link-Amster H., Rochat F., Saudan K.Y., Mignot O., Aeschlimann J.M. Modulation of a specific humaral immune response and changes in intestinal flora mediated through fermented milk intake.//FEMS Immunol. Med. Microbiol., 1994;v.10, p.55-63.

101. Lopez-Alarcon M., Villalpando S., Fajardo A. Breast-feeding lowers the frequency and duration of acute respiratory infection and diarrhea in infants under six months of age.// J. Nutr., 1997; 127, p. 436-443.

102. Lundequist B., Nord C.E., Winberg J. The composition of the faecal microflora in breastfed and bottlefed infants from birth to eight weeks.// Acta Pediatr. Scand., 1985; 74, p. 45-51.

103. MacDonald TT, Gordon JN. Bacterial regulation of intestinal immune responses. //Gastroenterol Clin North Am., 2005; 34:401-412.

104. MacDonald TT, Monteleone G. Immunity, inflammation, and allergy in the gut. //Science, 2005; 307:1920-1925.

105. Mackowiak P.A. The normal microbial flora. //The New England J. Med., 1982; vol. 307, p. 83-93.

106. Malin M., Suomalainen H., Saxelin M., Isolauri E. Promotion of IgA immune response in patients with Crohn's disease by oral bacteriotherapy with Lactobacillus GG.// Ann. Nutr. Metab., 1996; vol. 40, p. 137-145.

107. Masco L., Huys G., Gevers D., Verbrugghen L., and Swings S. Identification of Bifidobacterium species using rep-PCR fingerprinting. //Systematic Appl. Microbiol., 2003; 26(4):557-563.

108. Matto J., Malinen E., Suihko M.L., Alander M., Palva A., Saarela M. Genetic heterogeneity and functional properties of intestinal bifidobacteria.// J. Appl. Microbiol., 2004; 97: 459-470.

109. Matsuzaki T., J. Chin. Modulating immune responses with probiotic bacteria. Immunol. //Cell Biol., 2000; 78(l):67-73.

110. Matsuki T., Watanabe K., Fujimoto J., Takada T., Tanaka R. Use of 16S rRNA gene-targeted group-specific primers for real-time PCR analysis of predominant bacteria in human feces. //Appl. Environ. Microbiol., 2004; 70 (12), 7220-7228.

111. Mazmanian SK, Liu CH, Tzianabos AO, Kasper DL. An immunomodulatory molecule of synbiotic bacteria directs maturation of the host immune system. //Cell, 2005; 122:107-118.

112. McCartney A.L., Wenzhi W., Tannock G.W. Molecular analysis of the composition of the bifidobacterial and lactobacillus microflora of humans. //Appl. Env. Microbiol., 1996; 62, (12), p. 4608-4613.

113. McGarr SE, Ridon JM, Hyleomon PB. Diet, anaerobic bacterial metabolism, and colon cancer: a review of the literature.//J Clin Gastroenterol., 2005; 39:98-109.

114. McNabb P.C. and Tomasi T.B. Host defence mechanisms at mucosal surfaces. //Ann. Rev. Microbiol., 1981; vol. 35, p. 477-496.

115. Macpherson AJS, Lamarre A, McCoy K, et al. IgA production without or 5 chain expression in developing B cells. // Nat Immunol., 2001; 2:625-631.

116. Moore W., Cato E.P., Holdeman L.V. Some current concepts in intestinal bacteriology. //Am. J. Clin. Nutr., 1978; 31, p. 33-42.

117. Mountzouris K.C., McCartney A.L., Gibson G.R. Intestinal microflora of human infants and current trends for its nutritional modulation.// Br. J. Nutr., 2002; 87, p. 405-420.

118. Muriana P.M. and Klaenhammer T.R. Conjugal transfer of plasmid-encoded determinants for bacteriocin production and immunity of Lactobacillus acidophilus 88. //Appl. Envir. Microbiol., 1987; 53: 553-560.

119. Murray P.R., Baron E.J., Pfaller M.A., Tenover F.C., Yolken R.H. Manual of Clinical Microbiology. //ASM Press, Washington, D.C., 1995.

120. N. Nanda Nanthakumar, Robert D. Fusunyan, Jan Sanderson, W. Allan Walker. Inflammation in the developing human intestine: A possible pathophysiologic contribution to necrotizing enterocolitis. //PNAS, 2000; 97:11, 6043-6048.

121. N. Nanda Nanthakumar, Young C, Ko JS, et al. Glucocorticoid responsiveness in the developing human intestine: possible role in the prevention of necrotizing enterocolitis. //Am.J.Physiol,Gastrointest. Liver Physiol., 2005; 288:85-92.

122. Neish A.S., Gewirtz A.T. Procariotic regulation of epithelial responses by inhibition oflkB ubiquitination. //Science, 2000;289 (5484):1560-1563.

123. Neutra M.R., Kraehenbuhl J-P. Regional Immune Response to microbial pathogens. In: Edds. S.H.E. Kaufmann, A. Sher, R. Ahmed. Immunology of Infectious Disease.// ASM Press USA Washimgton, 2002; p.495.

124. Newburg D.S. Do the binding properties of oligosaccharides in milk protect human infants from gastrointestinal bacteria? //J. Nutr., 1997; 127, p. 980-984.

125. Orrhage K. and Nord C.E. Factors controlling the bacterial colonization of the intestine in breastfed infants. //Acta Pediatric. Suppl., 1999; 430, p. 47-57.

126. Orrhage K., Sillerstrom E., Gustafsson J.A., Nord C.E., Rafter J. Binding of mutagenic heterocyclic amines by intestinal and lactic acid bacteria. //Mutat. Res., 1994; vol. 311, p. 239-248.

127. Ott SJ, Musfeldt M, Wenderoth DF, Hampe J, Brant O, et al. Reduction in diversity of the colonic mucosa-associated bacterial microflora in patients with active inflammatory bowel disease. //Gut, 2004; 53:685-693.

128. Palmer C, Bik EM, Gigiulio DB, Relman DA, Brown PO. Development of the human infant intestinal microbiota. //PloS Biol., 2007; 5:177.

129. Park HK, Shim SS, Kim SY, Park JH, Park SE, et al. Molecular analysis of colonized bacteria in a human newborn infant gut. //J Microbiol., 2005; 43: 345-353.

130. Parrett A.M. Development of colonic fermentation in early life.// PhD Thesis, Glasgow University, 2001.

131. Perdigon G., Alvarez S., Nader de Macias M.E., Savoy de Giori G., Medici M., Nunez de Macias M.E. Behaviour of natural and heated yogurt in the immune system and preventive on enteric infections. //Milchwissenshaft, 1991; v. 46, №7, p. 411-416.

132. Perdigon G., Alvarez S., Pesce de Ruiz Hologado A.A. Immunoadjuvant activity of oral Lactobacillus casei: influence of dose on the secretory immune response and protective capacity in intestinal infections.// J. Dairy Res., 1991; vol. 58, p. 485-496.

133. Perdigon G., Alvarez S., Rachid M., Aguero G., Gobbato N. Immune system stimulation by probiotics.// J. Dairy Sci., 1995; vol. 78, p. 1597-1606.

134. Perdigon G., de Macias M.E., Alvarez S., Oliver G., de Ruiz Hologado A.A. Effect of per orally administered lactobacilli on macrophage activation in mice. //Infect. Immunol., 1986; vol. 53, p. 404-410.

135. Pouwels P.H., Leer R.J., Boersma W.J. The potential of Lactobacillus as a carrier for oral immunization: development and preliminary characterization of vector systems for targeted delivery of antigens.//! Biotechnol.,1996; v.44,p.l83-192.

136. Rachmilewitz D., Katakura K., Karmeli F et al. Toll-like receptor 9 mediates the anti-inflammatory effects of probiotics in murine experimental colitis. //Gastroenterology, 2004; v. 126, p.520-528.

137. Rammelsberg M. and Radler F. Antimicrobial polypeptides of Lactobacillus species. //J. Appl. Bacteriol., 1990; vol. 69, p. 177-184.

138. Rautava S., Kalliomaki M., Isolauri E. Probiotics during pregnancy and breastfeeding might confer immunomodulatory protection against atopic desease in the infant. //J. Allergy Clin. Immunol., 2002; vol. 109 (1), p.l 19-121.

139. Reuter G. The Lactobacillus and Bifidobacterium microflora of the human intestine: composition and succession. //Curr. Issues Intest Microbiol., 2001; vol. 2 (2), p. 43-53.

140. Rinne MM, Gueimonde M, Kalliomaki M, et al. Similar bifidogenic effects of prebiotic-supplemented partially hydrolyzed infant formula and breastfeeding on infant gut microbiota. // FEMS Immunol Med Microbiol., 2005; 43:59-65.

141. Rolfe R.D. The role of probiotic cultures in the control of gastrointestinal health.// J. Nutr., 2000; vol. 130, p. 396-402.

142. Rose J.H., Heedham J.R. Genital flora during pregnancy and colonization of the newborn.// J. Roy. Sos. Med., 1980;73, 2, p. 105-110.

143. Rossetti L., Giraffa G. Rapid identification of dairy lactic acid bacteria by M13-generated, RAPD-PCR fingerprint databases. // J. Microbiol. Methods., 2005.

144. Rotimi V.O., Duerben B.I. The development of the bacterial flora in normal neonates. //Med. Microbiol., 1981; 14, p. 51-62.

145. Rowland I.R.,Grasso P. Degradation of N-nitrosamines by intestinal bacteria. //Appl. Microbiol., 1975; vol. 29, p. 7-12.

146. Rubaltelli F.F., Biadaioli R., Pecile P., Nicoletti P. Intestinal flora in breast- andbottle-fed infants. //J. Perinat. Med., 1998; 26 (3), p. 186-191.

147. Saavedra JM. Clinical applications of probiotic agents. //AmJ.Clin Nutr., 2001;73:1147-1151.

148. Sakata H., Yoshioka H., Fujita K. Development of the intestinal flora in very low birth weight infants compared to normal full-term newborns. //Eur. J. Pediatr., 1985; 144, p. 186-190.

149. Satokari JM. Molecular approaches for the detection and identification of bifidobacteria and lactobacilli in the human gastrointestinal tract. //Syst.Appl.Microbiol., 2003; 26:572-584.

150. Savage D.C. Microbial ecology of the gastrointestinal tract. //Ann. Rev. Microbiol., 1977; 31, p. 107-133.

151. Sekine K., Watanabe-Sekine E., Ohta J., Toida T., Tatsuki T., Kawashima T. Induction and activation of tumorocidal cells in vitro and in vivo by the bacterial cell wall of Bifidobacterium infantis. //Bifidobacteria and Microflora. 1994; 13, p. 65-77.

152. Sepp E., Juloge K., Vasar M., Naaber P., Bjorksten B., Mikelsaar M. Intestinal microflora of Estonian and Swedish infants. //Acta Pediatric., 1997; 86, p. 956-961.

153. Shanahan F. The host-microbe interface within the gut. Best. Pract. Res. Clin. Gastroenterol., 2002, № 16, 915-931.

154. Schell MA, Karmirantzou M, Snel B. The genome sequence of Bifidobacterium longum reflects its adaptation to the human gastrointestinal tract. //Proc Natal Accad Sci USA, 2002; 99:14422-14427.

155. Schkoporov AN, et al. Comparative study of species and strain distribution of bifidobacteria in the breast-fed infants and their mothers. The 9-th Biennial Congress of Anaer Soc of the Americans, 2008; p.27.

156. Sinkiewiez GNE. Occurrence of Lactobacillus reuteri, lactobacilli and bifidobacteria in human breast milk.//Pediatr Res., 2005; 58:415.

157. Sonnenburg JL, Chen CT, Gordon JI. Genomic and metabolic studies of the impact of probiotics on a model gut symbiont and host. //PloS Biol., 2006; 4:413.

158. Stahl M., Molin G., Persson A., Ahrne S., Stahl S. Restriction endonuclease patterns and multivariate analysis as a classification tool for Lactobacillus spp. //Int. J. Syst. Bacterid., 1990; №40, 189-193.

159. Stark P.L., Lee A. Clostridia isolated from the feces of infants during the first year of life.//J. Pediatr., 1982a; 100, p. 362-365.

160. Stark P.L., Lee A. The bacterial colonization of the large bowel of pre-term low weight neonates. //J. Hyg (Lond), 1982; 89, p. 59-67.

161. Stark P.L., Lee A. The microbial ecology of the large bowel of breast-fed and formula-fed infants during the first year of life. //J. Med. Microbiol., 1982c; 15, p. 189-203.

162. Stewart JA, Vinton SC, Murrey A. Investigations into the influence of host genetics on the predominant eubacteria in the fecal microflora of children. //J. Med.Microbiol., 2005; 54:1239-1242.

163. Sydora BC, Tavernini MM, Doyle JS, Fedorak RN. Association with selected bacteria does not cause enterocolitis in IL-10 gene-deficient mice despite a systemic immune response. //Dig Ds Sci., 2005; 50:905-913.

164. Takada t, Matsumoto K, Nomoto K. Development of multi-color FISH method for analysis of seven Bifidobacterium species in human feces. //J. Microbiol.Methods, 2004; 58:413-421.

165. Tancrede C. Role of human microflora in health and disease. //Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 1992; 11, p. 1012-1015.

166. Tannock G.W. Normal microflora. An introduction to microbes inhabiting the human body. //Chapman and Hall, London, 1995.

167. Tannock G.W. and Savage D.C. Influence of dietary and environmental stress on microbial populations in the murine gastrointestinal tract.// Infect. Immun., 1974; vol. 9, p. 591-598.

168. Tannock G.W. Molecular assessment of the intestinal microflora. //Am. J. Clin. Nutr., 2000; 73, p. 401-414.

169. Tannock G.W. The acquisition of the normal microflora of the gastrointestinal tract. //In: S.A.W. Gibson (ed.), Human health: the contribution of microorganisms. Springer-Verlag, London. 1994; p. 1-16.

170. Tannock G.W., Fuller R., Smith S.L., Hall M.A. Plasmid profiling of members of the family enterobacteriaceae, lactobacilli and bifidobacteria to study the transmission of bacteria from mother to infant. //J. Clin. Microbiol., 1990; 28, p. 1225-1228.

171. Tapianinen T., Ylitalo S., Eerola E., Uhari M. Dynamics of gut colonization and source of intestinal flora in healthy newborn infants. //APMIS, 2006; 114 (11), 812-17.

172. Tlaskalova-Hogenova H. et al. Commensal bacteria (normal microflora), mucosal immunity end chronic inflammatory and autoimmune diseases. //Immunology Letters, 2004; 93: 97-108.

173. Turroni F, Ribbera A, Foroni E, van Sinderen D, et al. Human gut microbiota and bifidobacteria: from composition to functionary. //Anthonie van Leeuwenhoek, 2008; 94:35-50.

174. Uhlemann M., Heine W., Mohr C., Plath C., Pap S. Effect of oral administration of bifidobacteria on intestinal microflora in premature and newborn infants. //Z. Geburtshilfe Neonatol., 1999; vol. 203, p. 213-217.

175. Van der Waaij D. Colonization resistance of the digestive tract- mechanism and clinical consequences. //Die Nahrung. 1987; 31:507-517.

176. Ventura M, van Sinderen D, Fitzgerald GF, Zink R. Insights into the taxonomy, genetics and physiology of bifidobacteria. //Anthonie van Leeuwenhoek, 2004; 86:205-223.

177. Ventura M, Canchaya C, Fitzgerald GF, Gupta RS, van Sinderen D. Genomic as a means to understand bacterial phylogeny and ecological adaptation: the case of bifidobacteria. // Anthonie van Leeuwenhoek, 2007; 91:351-372.

178. Ventura M, Canchaya C, Tauch A, et al. Genomics of Actinobacteria: tracingthe evolutionary history of an ancient phylum. //Microbiol Mol bBiol Rev., 2007b; 71:495-548.

179. Walker WA. Mechanisms of action of probiotics.// Clin Inf Dis.,2008;46:87-91.

180. Wang X, Heazlewood SP, Krause DO, Florin TH. Molecular characterization of the microbial species that colonize human ideal and colonic mucosa by using 16S rDNA sequence analysis. // J Appl Microbiol., 2003; 95:508-520.

181. Wang X, Ahrne S, Jeppsson B, Molin G. Comparison of bacterial diversity along the human intestinal tract by direct cloning and sequencing of 16S rRNA genes. //FEMS Microbiol Ecol., 2005; 54:219-231.

182. Westerbeek EAM, van der Berg A, Lafeber HN, et al. The intestinal bacterial colonisation in preterm infants: a review of the literature. //Clin Nutr.,2006; 25:361368.

183. Wharton B.A., Balmer S.E., Berger H.M., Scott P.H. Protein nutrition, fecal flora and iron-metabolism the role of milk-based formulae.// Acta Pediatric., 1994; 83, p. 24-30.

184. Wharton B.A., Balmer S.E., Scott P.H. Sorrento studies of diet and fecal flora in the newborn. Acta Pediatric. Jpn., 1994, 36 (5), p. 579-584.

185. Wold A.E., Adlerberth I. Breast feeding and the intestinal microflora of the infant implications for protection against infectious diseases. //Adv. Exp. Med. Biol., 2000; 478, p. 77-93.

186. Xu J. Microbial ecology in the age of genomics and metagenomics: concept, tools, and recent advances. //Mol Ecol., 2006; 15:1713-1731.

187. Yamazaki S., Kamimura H., Momose H., Kawashima T., Ueda K. Protective effect of Bifidobacterium-monoassociation against lethal activity of Escherichia coli.// Bifidobacter. Microflora, 1982; v. 1, p. 55-59.

188. Yamazaki S., Machii K., Tsuyuki S., Momose H., Kawashima T., Ueda K. Immunological responses to monoassociated Bifidobacterium longum and their relation to prevention of bacterial invasion. //Immunology, 1985; v. 56, p. 43-50.

189. Yamazaki S., Tsuyuki S., Akashiba H. et al. Immune responses of Bifidobacterium-monoassociated mice.// Bifidobacter. Microflora, 1991;v. 10,p. 19-31.

190. Yasui Hisako, Kan Shida. Immunomodulatory function of lactic acid bacteria. //Antonie von Leeuwenhoek, 1999; 76,83-389.

191. Yildirim Z., Johnson M.G. Characterization and antimicrobial spectrum of bifidocin B, a bacteriocin produced by Bifidobacterium bifidum NCFB 1454.// J. Food Protect., 1998; 61, p. 47-51.

192. Yoshioka H., Fujita K., Sakata H., Murono K., Iseki K. Development of the normal intestinal flora and its clinical significance in infants and children. //Bifidobact. Microflora, 1991; 10, p. 11-17.

193. Yuhara T., Isojima S., Tsuchiya F., Mitsuoka T. On the intestinal flora of bottle-fed infants. //Bifidobacteria Microflora, 1983; 2, p. 33-39.

194. Zoetendal EG, Collier CT, Koike S, et al. Molecular ecological analysis of the gastrointestinal microbiota: a review. // J Nutr., 2004; 134:465-475.

195. Zoetendal EG, Vaughan EE, de Vos WM. A microbial word within us. //Mol Microbiol., 2006; 59:1639-1650.95j-3

Информация о работе

Донских, Екатерина Евгеньевна
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.02.03

Диссертация

Молекулярный и микробиологический мониторинг становления микрофлоры кишечника новорожденных - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы