Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярный анализ мутанта томата chloronerva с измененныл метаболизмом железа

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярный анализ мутанта томата chloronerva с измененныл метаболизмом железа"

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ Інститут клітинної біології та генетичної інженерії

МОЛЕКУЛЯРНИЙ АНАЛІЗ МУТАНТА ТОМАТА СНЮЯОЫЕтА ЗІ ЗМІНЕНИМ МЕТАБОЛІЗМОМ ЗАЛІЗА

03.00.25 - клітинна біологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Гирич Анатолій Михайлович

УДК 581.196; 581.146

Київ - 1997

Робота виконана у відділі цитофізіології та клітинної інженерії Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України. Частину експериментів було проведено в лабораторії генрегуляції Інституту генетики рослин та досліджень культурних рослин, Гатерслебен, Німеччина.

Наукові керівники: академік НАН України, професор,

Глеба Юрій Юрієвич,

директор Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України

доктор хабілітат природничих наук

Баумляйн Хельмут,

завідуючий лабораторією генрегуляції

Інституту генетики рослин та досліджень культурних рослин, Гатерслебен, Німеччина.

Левенко Борис Олексійович,

старший науковий співробітник,

завідуючий відділом генетичної інженерії Інституту фізіології рослин і генетики НАН України

кандидат біологічних наук Сорочинський Борис Володимирович,

старший науковий співробітник,

завідуючий лабораторією клітинної радіобіології Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук

Провідна установа - Інститут агроекології і біотехнології Української Академії Аграрних Наук.

Захист дисертації відбудеться " ^ " Сс-шл. 1998 р. о № год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.01.19.01 при Інституті клітинної біології та генетичної Інженерії НАН України за адресою: 252143, Київ-143, вул. Заболотного, 148ю.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України.

Автореферат розіслано " М" -_____________1997 р.

Вчений секретар спеціалізованої ради

кандидат біологічних наук

Л.В. Тарасенко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Збалансоване мінеральне живлення є необхідною умовою росту та розвитку рослин. Серед мінеральних елементів, необхідних для рослини, важливе місце посідають метали. Як кофактори вони входять до складу численних ферментів, впливаючи на фундаментальні процеси життєдіяльності рослинного організму. Особлива роль належить, зокрема, залізу. Координоване в активні сайти металопротеїнів, воно бере участь у більшості окисно-відновних реакцій, необхідних для процесів фотосинтезу, дихання тощо. Водночас хімічні властивості цього елемента, насамперед, здатність в присутності кисню виступати в ролі каталізатора утворення вільних радикалів, створюють обмеження для його акумуляції в клітині. Хоча фізіологічні аспекти адаптації рослин до змін у балансі металів-мікроелементів інтенсивно і плідно вивчаються, відносно мало відомо про молекулярні механізми цих процесів. Однак вивчення їх є актуальним з огляду на перспективи виявлення генів, включених у обмін цих елементів у рослині. Цінними моделями для таких досліджень є мутанти зі зміненим метаболізмом металів. Мутант томата chloronerva конститутивно активує специфічні реакції на дефіцит заліза, незважаючи на підвищені кількості Fe, які він накопичує у своїх органах. Зміни в метаболізмі заліза поєднуються зі змінами в обміні ряду інших металів: Cu, Mn, Zn. Такий фенотип пов'язаний з відсутністю у chloronerva небілкової амінокислоти нікоціанаміну, виявленої у всіх багатоклітинних організмів, що вивчалися з цією метою. Мутантні симптоми було охарактеризовано як "синдром видимого дефіциту заліза" ("apparent iron deficiency syndrome") (Scholz et al., 1988a). Вивчення даного синдрому є перспективним для розуміння механізмів адаптації рослин до змін у балансі металів-мікроелементів.

Мета І задачі дослідження. Метою даної роботи було виявлення і вивчення генів, що беруть участь у процесах адаптації рослин до змін у їх живленні щодо металів-мікроелементів, на прикладі мутанта томата chloronerva. Постулювавши, що, принаймні, частина генів, причетних до "синдрому видимого дефіциту заліза", має відмінний характер експресії в порівнянні між диким типом і мутантом, ми спрямували зусилля на виявлення і вивчення генів, індукованих у тканинах chloronerva.

Згідно поставленої мети до конкретних завдань експериментальної роботи входило:

1. Отримати методами диференцінного дисплею мРНК та субтрактивної гібридизації набір фрагментів кДНК, що відповідають генам, індукованим у тканинах мутанта.

2. Отримати кДНК повної довжини, що відповідають генам із диференційною експресією між сМогопеїча і диким типом та провести структурний аналіз даних кДНК.

3. Вивчити характер експресії відповідних генів у тканинах мутанта і дикого типу за нормальних фізіологічних умов та при дефіциті заліза.

4. Провести генетичне картування з метою визначення хромосомної локалізації даних генів у геномі томата.

5. Визначити ряд фізіологічних параметрів досліджуваних рослин (концентрації металів, вуглеводів, амінокислот) і проаналізувати їх зв'язок зі змінами у експресії генів, що вивчаються.

Наукова новизна одержаних результатів.

1. Було ізольовано і секвеновано більше 100 фрагментів кДНК, більшість з яких відповідає новим, ще не вивченим генам томата.

2. Вперше ізольовано родину генів, що кодують металотіонеїн-подібні білки томата, проведено їх генетичне картування, яке виявило диспергований характер їх розподілу у геномі томата. Вивчено експресію металотіонеїн -подібних генів у дикого типу і мутанта за різних умов постачання залізом. Продемонстровано тканино-специфічний хараістер експресії даних генів і показано комплексний, диференційний характер їх експресії під дією іонів важких металів та за умов оксидативного стресу, спричинюваного хімічними агентами.

3. Вперше ізольовано рослинний ген, що кодує лізил-тРНК синтетазу, вивчено його структуру і визначено хромосомну локалізацію. Показано тканиноспецифічний характер експресії даного гена і її залежність від стресових умов, викликаних змінами у постачанні рослин залізом.

4. Вперше ізольовано рослинний ген, що кодує Е1а-субодиницга 2-оксоізовалератдегідрогенази, вивчено його структуру і хромосомну локалізацію. Вперше показано індукцію експресії даного гена за умов дефіциту заліза.

5. Вперше ізольовано ген томата, що кодує глутатіонпероксидазу, вивчено його структуру і хромосомну локалізацію. Показано індукцію експресії даного гена при змінах у живленні рослин щодо металів-мікроелементів.

Практичне значення одержаних результатів, ізольовані кДНК можуть бути використані для подальших досліджень механізмів адаптації рослин до змін у їх живленні щодо металів-мікроелементів. Отримані теоретичні відомості є важливими для розробки біотехнологій отримання генетично модифікованих рослин, стійких до різних видів стресу, насамперед, стресу, пов'язаного із змінами у живленні металами-мікроелементами.

Отримані дані можуть бути використані в курсі лекцій з фізіології рослин та при читанні спеціальних курсів „Мінеральне живлення рослин", „Молекулярна

з

біологія рослин“, „Молекулярні механізми стійкості рослин“ для студентів біологічних спеціальностей університетів.

Особистий внесок здобувана. Експерименти, результати яких представлені в дисертації, були виконані дисертантом особисто.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційної роботи доповідались на міжнародному симпозіумі "Plant Biotechnology and Genetic Engineering” (Київ, 1994), на восьмій Конференції „Molekularbiologie der Pflanzen“ (Вернігероде, Німеччина, 1995), на Інститутських днях Інституту генетики рослин і досліджень культурних рослин (ІРК) (Гатерслебен, Німеччина, 1995 і 1997), на Річному Зібранні Німецького Товариства Генетиків (Йена, Німеччина, 1996), на дев'ятому міжнародному симпозіумі "Iron Nutrition and Interactions in Plants" (Штуттгарт, Німеччина, 1997), на семінарі з фізіології рослин в університеті міста Берн (Швейцарія), а також на наукових семінарах відділу цитофізіології та клітинної інженерії Інституту клітинної біології та клітинної інженерії НАН України та відділу молекулярної генетики Інституту генетики рослин і досліджень культурних рослин, Гатерслебен, Німеччина.

Публікації. Основні результати роботи викладені в 7 друкованих роботах, включаючи 3 статті, список яких наведено в кінці автореферату.

Об'єм і структура роботи. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та методів, результатів досліджень, обговорення, заключної частини, висновків та списку літератури, що містить 231 бібліографічне посилання. Робота викладена на 150 сторінках машинопису і містить 2 таблиці та ЗО рисунків.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ

Рослинний матеріал. Для всіх експериментів, за винятком генетичного картування, використовували рослини томата (Lycopersicon esculentum Mill.) сорту „Bonner Beste“ (BB) та його гомозиготного мутанта chloronerva {chin), насіння яких було отримано із насіннєвої колекції ІРК, Гатерслебен. Рослини Lycopersicon esculentum сорту "Money Maker", Lycopersicon pennelii та Lycopersicon cheesmanii використовували для визначення ПДРФ досліджуваних генів. Для експериментів із генетичного картування використовували лінії F2, отримані від схрещування між Lycopersicon esculentum та Lycopersicon pennelii (Tanksley et al., 1992). Ці рослини були люб’язно надані Др. Мартіном Ганалом ІРК, Гатерслебен.

Бактеріальні штами І плазміди. Переважно використовувалися DH5a чи XL-1 Blue штами Escherichia coli (Stratagene). Для клонування фрагментів ДНК використовували pCR-Script™SK(+) Cloning Kit (Stratagene).

Рослини вирощували на середовищах NL з різними концентраціями заліза, доданого у формі FeEDTA: BB+Fe (10 мкМ), chln+Fe (10 мкМ), BB-Fe (0 мкМ) і chin-Fe (2 мкМ). •

Для обробки рослин підвищеними концентраціями металів у живильне середовище додавали залізо як FeEDTA до кінцевої концентрації 100 мкМ, марганець як MnS04 до 150 мкМ, мідь як CuS04 до 10 мкМ і цинк як ZnS04 до 200 мкМ. Для обробки рослин діамідом цю сполуку додавали до живильного середовища у концентрації 1 мМ.

Сумарну РНК виділяли згідно з Heim et al. (1993). Полі(А)+ мРНК фракціонували із сумарної РНК методом афінної хроматографії на оліго(дТ)-целюлозі згідно з Sambrook et al. (1989).

Диференційний дисплей мРНК провадили за методикою Liang, Pardee (1992).

Субтрактивну гібридизацію виконували згідно з Balzer, Bäumlein (1994) з єдиною модифікацією- перед лігуванням лінкерних праймерів рєстриктазне розщеплення кДНК не провадили.

Процедуру З'-RACE ("Rapid Amplification of cDNA Ends") виконували з допомогою "З'-RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends", Gibco BRL) згідно з стандартними протоколами. Процедуру 5'- RACE виконували з допомогою "5'-RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends", Gibco BRL) згідно з стандартними протоколами.

ПЛР-фрагменти клонували з допомогою набору для клонування "pCR-Script™ Amp SK(+) Cloning Kit" (Stratagene) згідно з стандартним протоколом.

Рівень експресію генів вивчали з допомогою Нозерн-аналізу.

ДНК з рослинних тканин ізолювали згідно з модифікованим протоколом Deilaporta etal. (1983), як описано у Heim eia/. (1993).

Плазмідну ДНК ізолювали методом лужного лізису (Sambrook et al., 1988).

Процедуру генетичного картування здійснювали за ПДРФ-базованим методом згідно з Tanksley et al. (1992). Дані аналізували з допомогою Macintosh версії 2,0 програми MapMaker, описаної Länderet а/. (1987).

Плазмідну ДНК секвенували за методом Сенгера (Sanger et al., 1977) із застосуванням флуоресцентних праймерів з використанням набору "AutoRead™ 1000 sequencing kit" (Pharmacia LKB) і автоматичного секвенатора "Automated Laser Fluorescence (A.L.F. ™ DNA Sequencer" (Pharmacia LKB). Для комп’ютерного аналізу послідовностей використовували пакети програм PC/Gene (IntelliGenetics Inc.), DNASIS і PROSIS (Hitachi Software Eng. Co., Ltd.).

Концентрації важких металів визначали з допомогою атомної абсорбційної спектрофотометрії з використанням спектрофотометра моделі "SpectrAA 10 Plus"(Varian Australia Pty Ltd., Mulgrave, Victoria, Australia).

Сахарозу, глюкозу і фруктозу визначали ензиматично згідно з Bergmeyer (1974) з використанням набору для визначення цукрів (Boehringer, Mannheim). Крохмаль визначали ензиматично в перерахунку на глюкозу з використанням набору для визначення крохмалю (Boehringer, Mannheim, Germany).

Вільні амінокислоти визначали як їх стабільні фенілтіокарбамілні похідні (Guitart eia/., 1991). Хроматографічне розділення провадили на колонці С18 (Merk, ЕС240-4, 250 мм, діаметр пор 5 мкМ), а детектування- при 269 нм на Детекторному модулі 168 (Beckman).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА ІХ ОБГОВОРЕННЯ

1. Фізіологічний статус рослин.

При вирощуванні на середовищі NL із різними концентраціями заліза ВВ і chin виявляли відмінні фенотипи. Дикий тип на середовищі із дефіцитом заліза мав хлоротичні листки і потовщені кінчики коренів у порівнянні до дикого типу за нормального постачання залізом. Мутант chin як на середовищі з нормальним рівнем заліза, так і з його дефіцитом виявляв затримку в рості, мав зменшену кореневу систему, потовщені кінчики коренів, а також міжжилковий хлороз молодих листків. Ці мутантні симптоми посилювалися за дефіциту заліза.

Концентрації заліза, міді, цинку і марганцю визначали у кінчиках коренів, перших, повністю розкритих листках, і других листках, що розпускаються, 21-денних рослин ВВ і chin, вирощених на середовищі із нормальним вмістом заліза і з його дефіцитом (Рис.1). Загалом акумулювання металів було в 5-10 разів вище у коренях, ніж у листках. Концентрація Fe в кінчиках коренів і листках була вищою у мутанта, ніж у дикого типу при вирощуванні обох на 10 мкм FeEDTA Акумулювання Cu, Mn і Zn в кінчиках коренів зростало за дефіциту заліза як у chin, так і в ВВ, а також у chin за нормального постачання залізом. У листках chin рівень міді був редукований до 15-20% від ВВ, тоді коли рівень цинку був зрослим за дефіциту заліза і приблизно рівним у всіх інших випадках. Наші результати підтвердили попередні спостереження щодо поглинання і транслокації важких металів безнікоціанаміновим мутантом томата chloronerva та нікоціанамінвмісним диким типом Bonner Beste (Stephan, Grün, 1989; Pich eia/., 1995). Загалом мутант накопичує вищі концентрації металів, ніж дикий тип.

Високий рівень металів у коренях, можливо, пов'язаний із їх зв'язуванням органічними лігандами клітинних стінок кореня. Зв'язування катіонів металів клітинною стінкою є одним з механізмів формування захисту від важких металів (Феник та ін„ 1995).

Накопичення важких металів мутантом може бути пояснене як наслідок підвищеної редуктазної активності ризодермальних клітин. Рослини chin на 10 мкМ РеЕДТА поводять себе як рослини ВВ за дефіциту заліза, накопичуючи Mn, Zn і Cu, хоча рівень Fe у їх органах при цьому теж зрослий („синдром видимого дефіциту заліза”, Scholz et al., 1988).

Низький рівень Cu в листках мутанта може бути пояснений необхідністю присутності нікоціанаміну для ксилемного транспорту цього катіона (Pich et al., 1995).

Слід зазначити, що

накопичення важких

металів мутантом chin є помірним. їх концентрації у тканинах мутанта є

приблизно на рівні таких у запізодефіцитного дикого типу і в 2-3 рази

перевищують концентрації у ВВ за адекватного постачання залізом (10

мкМ FeEÄTA).

і|

Ь В : і

j&jf

£ вЗ

■ Fe

■ Cu El Mn HZn

A)

Б)

В)

Рис.1. Концентрації важких металів (мкмоль/г сухої маси) у кінчиках коренів (А), перших листках (Б) і других листках (В) 21-денних рослин ВВ і сЛ/л, вирощених за умов адекватного постачання залізом і за його дефіциту: 1- ВВ+Ре (10 мкМ РеЕДТА), 2-сЫп+Ге (10 мкМ РеЕДТА), 3- ВВ-Ре (0 мкМ РеЕДТА) і 4- с/7/п-Ре (2 мкМ РеЕДТА).

2. Вивчення диферєнційної експресії генів у порівнянні між мутантом і диким типом.

2.1. Огляд результатів диференційного дисплею мРНК.

Між собою порівнювали РНК трьох видів: ізольовану з рослин BB+Fe, chln+Fe І BB-Fe. Було виявлено ряд ПЛР-фрагментів, відмінних між лініями, що порівнювалися. Нами було ізольовано і реампліфіковано 8 таких фрагментів, всі вони були використані в якості зондів для нозерн-гібридизації з тією ж РНК, яка була використана для дисплею. Проте нозерн-аналіз в більшості випадків виявив сигнал однакової інтенсивності для всіх трьох варіантів. Лише для одного фрагмента (№2) було підтвержено диференційну експресію, а саме індукцію у кінчиках коренів мутанта. Диференційний характер решти, виявлений при диференційному дисплеї мРНК, слід віднести на рахунок артефактів методу.

2.2. Огляд результатів субтрактивної гібридизації.

Для субтрактивної гібридизації використовували мРНК, ізольовану із кінчиків коренів BB+Fe і chln+fe. В результаті було отримано дві фракції- одну, збагачену фрагментами кДНК, специфічними для BB+Fe, і другу, збагачену видами кДНК, специфічними для chln+Fe. В подальшій роботі ми зосередилися переважно на вивченні мутант-специфічної фракції. Суміш фрагментів використовували для клонування, отримані клони зі вставками секвенували і використовували для подальших аналізів. Таким чином було отримано 106 клонів, частковий перелік яких подано у Табл.1. Приблизно для 70% клонів знайти у базі даних споріднені послідовності, які б виявляли значимі гомології, не вдалося. Однак решта 30% клонів показує вищі чи нижчі гомології до вже відомих послідовностей із томата чи інших видів. В цій роботі ми більш детально охарактеризували лише деякі із генів, що відповідають перерахованим послідовностям. Ці гени кодують лізил-тРНК синтетазу, металотіонеїн-подібні білки, глутатіонпероксидазу, субодиницю Е1а 2-оксоізовалератдегідрогенази. Для них було отримано кДНК повної довжини, встановлено хромосомну локалізацію, детально вивчено характер експресії у мутанта і дикого типу. Ми вважаємо, що ці гени включені у „синдром видимого дефіциту заліза“ chloronerva, тобто тим чи іншим чином вони включені в процеси адаптації рослини до змін у живленні щодо металів-мікроелементів.

2.3. Металотіонеїн-подібні білки.

Металотіонеїни (МТ) є багатими на цистеїн низькомолекулярними білками, що здатні зв’язувати іони важких металів і беруть участь у їх метаболізмі і детоксикації (Hamer, 1986; Robinson et al., 1993).

Табл. 1. Частковий перелік кДНКових клонів, ізольованих із фракції, збагаченої видами кДНК, специфічними для мутанта сЫагапеп/а. '

№ клону Назва клону п.н. Наяв- ність ВРЗ Гомології

1 В1-1 202 + Ното sapiens, лізил-тРНК синтетаза (D31890) (52% АК)

2 В1-5 198 + Ricinus communis, металотіонеїн-подібний білок (Р30564) (57% АК)

6 В2-10 200 + Bos taurus, субодиниця Е1а 2-оксоізовалератдегідрогенази (Р11178) (50% АК)

10 В2-19 264 + Arabidopsis thaliana, глутатіонпероксидаза (U94495J (76% АК)

27 В8-2 269 + Datura іппохіа, індукований Cd транскрипт Cd-6 (Х87826) (96% HK) Gossipium hirsutum, целюлозосинтаза (U58284) (79% AK)

35 В11-2 206 + Arabidopsis thaliana, селен-зв'язуючий білок (Z99707) (41% AK)

36 В11-4 207 + Saccharomyces cerevisiae, гіпотетичний тіоредоксин-подібний білок (U18922) (58% AK)

45 В11-25 205 + Capsicum annuum, зета-каротен десатураза (92% AK)

62 В12-31 179 + Caenorhabditis elegans, форболовий ефір/діацилгліцерол- зв/язуючий білок (Р27715) (32% AK)

64 В12-36 184 •4- Nicotiana tabacum, протеїн фосфатаза тип І (Z93769) (87% НК)

75 В14-14 217 + Xenopus iaevis, нуклеолярний транскрипційний фактор (Р25980) (26%АК)

76 В14-27 197 + Дріжджі, потенційний Zn- транспортер (EMBL Р32804) (38% АК)

90 В1Е 375 + Nicotiana tabacum, мРНК фосфоенолпіруваткарбоксилази (Х59016) (94% НК)

91 В7Е 378 + Lycopersicon esculentum, мРНК енолази (Х58108) (100% НК)

95 В40Е 184 + Mesocricetus auratus, трансмембранний протеїн р23 (Е340040) (34% АК)

Нами було ізольовано чотири МТ-подібні гени томата: LEMT1, LEMT2, LEMT3 і LEMT4. Нуклеотидні послідовності повної довжини кДНК було зареєстровано в Nucleotide Sequence Database під номерами: Z68138 (LEMT1), Z68185 (LEMT2), Z68309 (LEMT3) і Z68310 (LEMT4).

2.3.1. Гени МТ-подібних білків організовані як мультигенна родина у геномі томата.

Використовуючи Саузерн-гібридизацію і експерименти по картуванню, ми показали, що гени МТ-подібних білків томата входять до складу малої мультигенної родини. Члени родини вільно розподілені по геному: LEMT1- як одинична копія на хромосомі 9, LEMT2 і LEMT4- як одиничні копії у віддалених один від одного локусах на хромосомі 6, a LEMT3, ймовірно, існує у вигляді двох тісно кластеризованих копій, розташованих в одному й тому ж локусі на хромосомі

4. Такий диспергований розподіл МТ-подібних генів томата принципово подібний до ситуації у арабідопсису (Zhou, Goldsbrough, 1995). Це контрастує із ситуацією, описаною для ссавців, де функціональні МТ-гени тісно зчеплені один з одним на хромосомах 8 і 16 у миші й людини, відповідно (Palmiter et at., 1992). Питання чи відмінність організації родини МТ-подібних генів у рослин від такої у ссавців пов’язана із їх функцією і/або еволюцією заслуговує на подальше вивчення.

2.3.2. Диференційна експресія МТ-подібних генів томата.

Для аналізу характеру експресії чотирьох МТ-подібних генів томата було проведено Нозерн-аналіз. Виявили зростання рівня транскрипта LEMT1 у кінчиках коренів chln+Fe, BB-Fe і chin-Fe у порівнянні з BB+Fe. Експресія LEMT2 і LEMT3 залишалася на приблизно однаковому рівні у всіх чотирьох випадках (Рис.2). Щоб з'ясувати вплив окремих металів на експресію LEMT генів, а також оцінити можливий внесок даних металів у формування характеру експресії LEMT генів у мутанта, рослини ВВ вирощували на середовищі з підвищеним вмістом Fe, Си, Mn і Zn. Щоб розрізнити прямий вплив іонів металів і можливий вплив активних видів кисню, генерованих при участі цих іонів, рослини обробляли тіол-окислюючою сполукою діамідом. Було показано, що LEMT1 і LEMT4 найбільше індукуються Zn. Таким чином, виявлена індукція цих генів у BB-Fe і chln+Fe та chln-Fe може бути інтерпретована як відповідь на акумуляцію насамперед іонів цинку в коренях рослин.

У наших експериментах було знайдено, що оксидативний стрес, викликаний обробкою діамідом, має різний вплив на експресію генів LEMT. LEMT1 і LEMT4 майже не змінювали експресію, а експресія LEMT2 і LEMT3 була значно репресована. Таким чином, наші дані вказують на комплексну диференційну і координовану регуляцію експресії рослинних МТ-подібних генів у відповідь на оксидативний стрес, що заслуговує на подальше вивчення.

Було знайдено, що МТ-подібні гени специфічно експресуються у різних органах томата. Це чітко вказує на функціональну диференціацію цих генів. Таким чином, функції продуктів генів LEMT2 і LEMT3, найбільш ймовірно, обмежені

коренями, годі як продукти генів LEMT1 і LEMT4

«

використовуються 14

12

для більш загаль- «

8

них процесів. 6

4

Як підсумок, 2

а

слід зазначити, ,s

що наші дані де- 4

з

монструють дифе- 2

ренційну І КООрДИ- 1

новану органо- 0

специфічну регуляцію експресії

мт Рис. 2. Нозерн-аналіз характеру експресії чотирьох МТ-

родини МТ-подіо- подібних генів томата у кінчиках коренів, перших листках та них генів томата у других листках рослин ВВ і chln на різних концентраціях , . заліза: 1- кінчики коренів BB+Fe, 2- кінчиш коренів chln+Fe,

відповідь на оо- g. кінчики КОренів BB-Fe, 4- кінчики коренів chln-Fe, 5- перші робку важкими листки BB+Fe, 6- перші листки chln+Fe, 7- перші листки ВВ-Fe. 8- перші листки chln-Fe, 9- другі листки BB+Fe, 10- другі металами та на листки chln+Fe, 11 - другі листки BB-Fe, 12- другі листки chln-оксидативний Fe. Рівень експресії у кінчиках коренів рослин BB+Fe було використано як одиницю експресії.

СТрбС] що є компонентом гомеостатичних механізмів клітини.

■ІІІ

123456789 10 11 12 І 2 3 4 S в ? Í Î 15 11 12

2.4. Лізил-тРНК синтетаза.

Аміноацил-тРНК синтетази (арсази) відіграють центральну роль в біосинтез білку, оскільки каталізують специфічне зв’язування молекул тРНК г амінокислотами. Окрім цієї первинної функції у трансляції, було описанс причетність арсаз до ряду інших процесів, зокрема, ці ферменти здатн синтезувати аденільовані б'-нуклеозидил-тетрафосфати (ApJM), відомі як "алармони", що беруть участь у регуляції клітинного гомеостазу після тепловогс шоку чи обробки окислюючими агентами (Brevet ef al., 1989).

Нами було ізольовано кДНК, що відповідає гену лізил-тРНК синтетази томата (LELysRS). Ми встановили, що цей ген представлений у геном Lycopersicon esculentum як одинична копія, локалізована на хромосомі 10.

2.4.1. Диференційна експресія гена LELysRS.

ДНК LELysRS було знайдено серед послідовностей із підвищеним рівнем експресії у коренях мутанта chloronerva. Індукцію цього гена у коренях мутанта було підтверджено нозерн-гібридизацією.

Більше того, у ВВ ген помітно індукується браком заліза. Було також виявлено зростання рівня месенджера за надміру заліза.

Виявлено, що експресія гена LELysRS має чітку коренеспеци-фічність. Цю специфічність виявлено як у ВВ, так і в chin, і вона не залежить від умов постачання залізом. На рівні чутливості Но-

зерн-гібридизації транскрипт не детектується у перших і других листках. (Рис. 3). Однак високочутлива ПЛР виявила слідові кількості транскрипта також у листках.

Тканиноспецифічність деяких арсаз відома з літератури. Наприклад, триптофаніл-тРНК синтетаза ссавців сильно індукується інтерфероном (Turpaev et al., 1996), і кількість цього фермента, виявлена у панкреатичній залозі, набагато переважає рівні, виявлені в інших органах (Favorova et а!., 1989).

Індукція експресії гена лізил-тРНК синтетази за умов стресу описана для Є. coli. Як правило, існує лише одна арсаза для кожної тРНК у бактерій, однак, для Є. coli знайдено дві відмінні лізил-тРНК синтетази. Ці два ферменти є продуктами генів lysS і lysU (Leveque et al., 1990). Ген lysS експресується конститутивно, тоді

.hlii

1 2 3 4 5 6

А)

1 2 З

В)

10 11 12

В)

Рис. 3. Нозерн-аналіз експресії гена лізил-тРНК синтетази тата.

A) Кінчики коренів ВВ і chin на різних концентраціях заліза: 1-ВВ, 10 мкМ FeEflTA, 2- chin, 10 мкМ FeEflTA, З- ВВ, 2 мкМ FeEflTA, 4- chin, 2 мкМ FeEflTA, 5- ВВ, 0 мкМ FeEflTA, 6-chln, 0 мкМ FeEflTA.

Б) Кінчики коренів ВВ, вирощених на нормальному рівні заліза і за його надміру: 1- ВВ, 10 мкМ FeEflTA, 2- 100 мкМ FeEflTA, З- „рослини Секбаха“.

B) Кінчики коренів (1-4), перших листків (5-8) і других листків (9-12) рослин ВВ і chin на різних концентраціях заліза. 1,5 і 9-ВВ, 10 мкМ FeEflTA, 2, 6 і 10- chin, 10 мкМ FeEflTA, 3, 7 і 11-ВВ, 0 мкМ FeEflTA, 4, 8 і 12- chin, 2 мкМ FeEflTA.

Рівень експресії у кінчиках коренів рослин ВВ, що росли на 10 мкМ FeEflTA, було використано як одиницю експресії.

як ген lysU індукується тепловим шоком (Clark, Neidhardt, 1990), анаеробіозом (Leveque et al., 1991) чи низьким pH середовища (Hickey, Hirshfield, 1990).

Більше того, лізил-тРНК синтетаза і деякі інші арсази здатні синтезувати аденільовані 5'-нуклеозидил-тетрафосфати (Ap4N), відомі як "алармони", що беруть участь у регуляції клітинного гомеостазу після теплового шоку чи обробки окислюючими агентами (Brevet et al., 1989).

Наші дані показують, що коренеспецифічна експресія гена LELysRS корелює з накопиченням підвищених концентрацій металів у коренях. Все це підводить до висновку, що генний продукт, крім головної функції у трансляції, може мати додаткові функції, пов'язані з відповіддю на стрес, пов'язаний із коренеспецифічним поглинанням іонів металів.

2.5. а-субодиниця 2-оксоізовалератдегідрогенази.

Мітохондріальний ферментативний комплекс дегідрогенази а-кетокислот з розгалуженим ланцюгом (BCKDH) каталізує оксидативне декарбоксилювання а-кетокислот, утворених із амінокислот з розгалуженим ланцюгом (валін, лейцин та ізолейцин), беручи таким чином участь у катаболізмі цих амінокислот. Він може відігравати істотну роль ще і в катаболізмі метіоніну і треоніну. Вважається, що цей комплекс відіграє ключову роль в утилізації вищеназваних амінокислот як субстрату для циклу Кребса. Комплекс складається із трьох каталітичних компонентів: 1) 2-оксоізовалератдегідрогенази (Е1), 2) дигідроліпоїлтрансацилази (Е2) і 3) дигідро-ліпоїлдегідрогенази (ЕЗ). Компонент Е1 в свою чергу складається з двох субодиниць: Е1а і Еір (Yeaman, 1986). Виявлено, що у людей дефект

дегідрогенази а-кетокислот з розгалуженим ланцюгом є причиною так званого "синдрому сечі липового сиропу" (maple syrup urine syndrome (MSUD)). Це аутосомне рецесивне захворювання, яке характеризується акумулюванням амінокислот і а-кетокислот з розгалуженим ланцюгом і призводить до кетоацидозу, неврологічних розладів та психічної деградації (Tanaka et al., 1983).

Нами було ізольовано кДНК, що відповідає гену, який кодує Е1а-субодиницю 2-оксоізовалератдегідрогенази томата (ODBA_LYCES). Ми виявили, що цей ген представлений у геномі Lycopersicon esculentum як одинична копія, локалізована на хромосомі 6.

2.5.1. Диференційна експресія гена.

Нозерн-експерименти з використанням геноспецифічного фрагмента як зонда показали індукцію експресії гена у кінчиках коренів BB-Fe, chln+Fe I chln-Fe. Разом з тим у коренях BB+Fe не було детектовано ніякого сигналу (Рис. 4).

Дуже мало відомо про BCKDH у рослин. Лише одне коротке 1

конференційне повідомлення описує 0,8

ідентифікування кДНК, що відповідають 0,3

0,4

Е1а- і Elß-субодиницям із ог

арабідопсису (Fujiki et al., 1996). Обидва o

гени індукуються темрявою у листках. 12 3 4

Автори роблять висновок, що в даній

ситуації BCKDH діє як поставник енергії Рис-4' Нозерн-аналіз експресії гена Е1<х-

від амінокислот із розгалуженим субодиниці 2- оксоізовалерат-

ланцюгом за вуглеводного дефіциту, що Дегідрогенази. РНК було ізольовано із виникає у зелених листках в темряві. Ми КІНЧИКІВ коренів рослин: 1- BB+Fe, 10 вивчали вміст цукрів у кінчиках коренів мк^ FeEflTA, 2- chln+Fe, 10 мкМ

рослин дикого типу і мутанта за РеЕДТА, З- BB-Fe, 0 мкМ FeEflTA і 4-

нормапьного рівня заліза і при його chin-Fe, 2 мкМ FeEflTA. Рівень експресії дефіциті. Було знайдено зростання У кінчиках коренів рослин BB+Fe було вмісту вільних цукрів і крохмалю у використано як одиницю експресії, кінчиках коренів chln+Fe, BB-Fe і chin-Fe. В даному контексті це вказує на те,

що нестача вуглеводів навряд чи може бути прямим чинником для індукції ODBAJ.YCES. З іншого боку, енергетичне голодування не виключене як наслідок низької ефективності утилізації цукрів чи дихальних розладів, що можуть мати місце за дефіциту заліза. Індукція гена може бути також пов’язана з накопиченням вільних амінокислот, виявленим нами у коренях мутанта і запізодефіцитного дикого типу.

2.6. Глутатіонпероксидаза.

Глутатіонпероксидази (GPX) є родиною ізоферментів, що каталізують відновлення Н202, органічних гідропероксидів і гідропероксидів ліпідів за рахунок окислення глутатіону, беручи таким чином участь у захисті клітини від оксидативного пошкодження (Eshdat et al., 1997). Цей фермент є одним із небагатьох відомих білків, що містять у своїй первинній структурі рідкісну амінокислоту селеноцистеїн, кодовану TGA, що в інших випадках функціонує як стоп-кодон (Böck etal., 1991).

Ми ізолювали кДНК, що відповідає гену томата, який кодує глутатіонпероксидазу (LEGPX). Встановили, що даний ген представлений у геномі Lycopersicon esculentum як одинична копія, локалізована на хромосомі 6. Аналіз послідовності показав, що кодований білок є, ймовірно, безселеновим ферментом і містить звичайний цистеїн у каталітичному центрі.

12 3 4

Нозерн-аналіз експресії гена

2.6.1. Диференційна експресія гена.

Нозерн-експерименти з використанням геноспецифічного фрагмента як зонда показали індукцію експресії гена у кінчиках коренів коренів BB-Fe, chln+Fe І chln-Fe (Рис. 5).

Тканини мутанта chin на нормальному рівні заліза і за його дефіциту, так само як і дикого типу за Рис.4. дефіциту заліза накопичують надмірні глутатіонпероксидази. РНК було ізольо-кількості іонів металів, що веде до вано із кінчиків коренів рослин: 1-

оксидативного стресу. Активування BB+Fe, 10 мкМ FeEflTA, 2- chln+Fe, 10 деяких антиоксидативних ферментів у мкМ FeEflTA, 3- BB-Fe, 0 мкМ FeEflTA і коренях chin і BB-Fe було показано в 4- chln-Fe, 2 мкМ FeEflTA. Рівень попередніх роботах. Зокрема, було експресії у кінчиках коренів рослин виявлено зростання активності ката- BB+Fe було використано як одиницю лази, аскорбатпероксидази і гваякол- експресії, залежної пероксидази (Pich, Scholz,

1993) та накопичення білка з високою

гомологією до аскорбатпероксидази (Herbik ef al., 1996). Виявлене у нашій роботі зростання експресії глутатіонпероксидази додає до антиоксидативних механізмів, активованих у коренях рослин при накопиченні іонів металів. Можливо, у відповідності до гіпотези Eshdat ef al. (1997), функція фермента у даному разі полягає в елімінуванні гідропероксидів ліпідів.

ВИСНОВКИ

1. Обмежена кількість генів включена в “синдром видимого дефіциту заліза” мутанта томата сЬІогопепю.

2. Члени родини метапотіонеїн-подібних генів томата мають диференційний характер експресії у різних тканинах, при дії іонів важких металів та за умов оксидативного стресу, спричинюваного хімічними агентами.

3. Підвищення рівня експресії І£МТ1 і І.ЕМТ4 у кінчиках коренів рослин сМогопепю і залізодефіцитного дикого типу пов'язано, найбільш ймовірно, із накопиченнням іонів цинку.

4. Члени родини металотіонеїн-подібних генів дисперговано розподілені у геномі томата переважно як одиничні копії.

5. Ген лізил-тРНК синтетази томата має коренеспецифічний характер експресії. її рівень зростає при накопиченні в коренях іонів важких металів. Цей ген представлений у геномі як одинична копія, локалізована на хромосомі 10.

6. Експресія гена, ідо кодує а-субодиницю 2-оксоізовалератдегідрогенази, індукується за дефіциту заліза. Цей ген представлений у геномі томата як одинична копія, локалізована на хромосомі 6.

7. Експресія гена томата, що кодує глутатіонпероксидазу, індукується у коренях chloronerva і дикого типу за дефіциту заліза як елемент клітинного захисту від оксидативного стресу. Гєн локалізовано як одинична копія на хромосомі 6.

Список опублікованих статей

1. Гирич, А.М., Череп, H.H., Скаржинская, М.В., Головко, А.З., Глеба, Ю.Ю. Генетическая трансформация рапса Brassica napus с помощью Agrobacterium tumefaciens// Цитология и генетика.-1995-т.29,№2-с.20-25.

2. Herbik, A., Giritch, A., Horstman, C., Becker, R., Baizer, H.-J., Baumlein, H., Stephan, U.-W. iron and copper nutrition-dependent changes in protein expression in a tomato wild type and the nicotianamine-free mutant chloronerva// Plant Physiology-1996-v. 111 -p.533-540.

3. Giritch, A., Herbik, A., Baizer, H.-J., Ganal, M., Stephan, U.-W., Baumlein, H. A root-specific iron-regulated gene of tomato encodes a lysyl-tRNA-synthetase-like protein// European Journal of Biochemistry-1997-v.244-p.310-317.

АНОТАЦІЯ

Гирич A.M. Молекулярний аналіз мутанта томата chloronerva зі зміненим метаболізмом заліза. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.25 - клітинна біологія. - Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, Київ, 1998.

Дисертацію присвячено вивченню молекулярних аспектів адаптації рослин до змін у живленні щодо металів-мікроелементів. Вивчали гени, включені у “синдром видимого дефіциту заліза” мутанта томата chloronerva. Використовуючи метод субтрактивної гібридизації, отримали кДНКову фракцію, збагачену фрагментами, що відповідають генам з підвищеним рівнем експресії у кінчиках коренів мутанта. Основну увагу приділили вивченню генів, що кодують родину металотіонеїн-подібних білків, лізил-тРНК синтетазу, а-субодиницю 2-оксоізовалератдегідрогенази та глутатіонпероксидазу. Показано причетність експресії цих генів до адаптації рослин до змін у балансі заліза та інших металів-мікроелементів.

fcii040Bi слова: важю метали, зал^зо, chloronerva, генна експрес!я, стрес.

АННОТАЦИЯ

Гирич А.М. Молекулярный анализ мутанта томата chloronerva с измененныл метаболизмом железа. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук п< специальности 03.00.25 - клеточная биология. - Институт клеточной биологии i гннетической инженерии НАН Украины, Киев, 1998.

Диссертация посвящена изучению молекулярных аспектов адаптаци! растений к изменениям в питании относительно металлов-микроэлементов Изучали гены, включенные в “синдром мнимого дефицита железа” мутанта томат; chloronerva. Использовали метод субтрактивной гибридизации, получил! кДНКовую фракцию, обогащенную фрагментами, которые соответствуют генам i повышенным уровнем експрессии в кончиках корней мутанта. Основное внимание уделено изучению генов, кодирующих семейство металлотионеин-подобны; белков, лизил-тРНК синтетазу, а-субъединицу 2-оксоизовалератдегидрогеназы i глутатионпероксидазу. Показана причастность экспрессии этих генов к адаптаци! растений к изменениям в балансе железа и других металлов-микроэлементов.

Ключевые слова: тяжелые металы, железо, chloronerva, генная экспрессия стресс.

ANNOTATION

Giritch А.М. The molecular analysis of tomato mutant chloronerva, altered in iror metabolism. - Manuscript.

Thesis for gaining a scientific degree of Candidate of Biological Sciences Institute of Cell Biology and Genetic Engineering, National Academy of Sciences of th< Ukraine, Kyiv, 1998.

The dissertation is devoted to investigation of the molecular aspects of plan adaptation to changes in the metal-micronutrients nutrition. Genes involved in th< “apparent iron deficiency syndrome” of the tomato mutant chloronerva were studied Using the subtractive hybridization technique, cDNA fraction enriched with fragments corresponding to genes with elevated expression level in the mutant, was obtained The main attention was concentrated on the investigation of genes encoding th< metallothionein-like proteins family, lysyi-tRNA synthetase, E1a subunit of a-keto aci< dehydrogenase and glutathione peroxidase. The implication of these genes expressioi to the adaptation of plants to changes in the iron and other metals status i demonstrated.

Key words: heavy metals, iron, chloronerva, gene expression, stress.