Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярные основы контроля нереста берегового краба Sesarma Haematocheir

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Молекулярные основы контроля нереста берегового краба Sesarma Haematocheir"

КАЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ В.И. УЛЬЯНОВА-ЛЕНИНА

На правах рукописи

ГУСЕВ ОЛЕГ АЛЕКСАНДРОВИЧ

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ КОНТРОЛЯ НЕРЕСТА БЕРЕГОВОГО КРАБА 8Е8ЛШЛ НАЕМЛЮСНЕШ (ВВЛСНУиВЛ&ВЛРБЮЛЕ).

03.00.04 - биохимия, 03.00.08 - зоология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань 2004

Работа выполнена на кафедре зоологии беспозвоночных Казанского государственного университета имени В.И. Ульянова-Ленина и в лаборатории морской биологии и экологии Окаямского Национального Университета (г. Окаяма, Япония).

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

А. И. Голубев

профессор М. Сайгуза (Masayuki Saigusa) Официальные оппоненты: доктор биологических наук З.И. Абрамова

доктор биологических наук, профессор Р.Н. Буруковский

Ведущее учреждение:

Казанский институт биохимии и биофизики КНЦ РАН

Защита состоится « 21 » октября 2004 г. в 13-00 часов на заседании диссертационного совета Д212.081.08 при Казанском государственном университете им. В.И. Ульянова-Ленина, 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, д. 18

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке имени Н.И.Лобачевского Казанского государственного университета.

Автореферат разослан « 21 » сентября 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук, доцент ^^¿хУс^Л А.Н. Аскарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Феномен биологический ритмов в живых системах - одно из самых загадочных и малоизученных явлений в природе. Внутренние часы организмов разных уровней организации демонстрируют удивительную стабильность и в то же время достаточную пластичность для подстраивания фазы активности под изменяющиеся внешние циклы среды. Многочисленными экспериментами было показано, что даже в отсутствии регулярной внешней стимуляции, биологические ритмы самоподдерживаются в организме на продолжении длительного времени (Enright, 1980; Grosse et al., 1995 и др.).

Современные методы исследований позволили выявить и охарактеризовать основные механизмы молекулярного контроля циркадианных ритмов у ряда видов беспозвоночных и позвоночных животных, включая человека. Были установлены группы генов, экспрессирующихся лишь в определенный период светового цикла (Chen et al., 1991; Baylies et al., 1992 и др.). На основании этих экспериментальных данных проведено генетическое исследование «clock-мутантов» дрозофилы и была построена детальная модель циркадианного осциллятора (Helfrich-Fdrster, 1996). Понимание биохимических механизмов лежащих в основе функционирования околосуточных биологических часов было успешно применено в фармацевтике для создания ряда лекарственных препаратов (Kondo et al., 1994; Kutsuna et al., 1998 и др.).

Наряду с этими достаточно хорошо изученными механизмами молекулярного контроля существуют уникальные примеры синхронизации биологической активности с внешними циклами среды. Одним из них является нерестовое поведение некоторых видов крабов семейства Grapsi-dae. Взрослые особи крабов ведут полусухопутный образ жизни, возвращаясь на берег для нереста лишь один-два раза в год, когда после месяч-

Рчкг5]

' svaif

ной инкубации на абдоменальных придатках икра стряхивается в морской воду. Уникальность этого события в том, что нерест крабов строго ассоциирован с ночными приливами и не происходит в другое время (Saigusa, 1982). Другая особенность поведения крабов в том, что в течение получаса после попадания в морскую воду эмбрионы прорывают яйцевые оболочки и переходят к свободноплавающему личиночному образу жизни. Выклев эмбрионов крабов (хатчинг — от англ. hatching) находится в непосредственной зависимости от поведения самки. В лабораторных условиях хатчинг также высоко синхронизирован среди эмбрионов. Однако, отделенные от абдомена самки более чем за 48 часов до ожидаемого момента хатчинга, эмбрионы не способны завершить развитие. А эмбрионы, изолированные от самки менее чем за 48 до момента нереста, способны самостоятельно завершить эмбриогенез и перейти в личиночную стадию. Молекулярные основы контроля биологических часов такого типа к настоящему времени не были известны. Лишь для некоторых десятиногих ракообразных установлено существование гомологов clock-локусов, но косвенное участие этих генов было продемонстрировано в контроле циркадианной структуры только для локомоторной активности (Naylor, 1997, 2003). Между тем, контроль времени хатчинга эмбрионов Grapsidae представляет собой, по видимому, совершенно иную структуру, независимую от циклического изменения уровня РНК определенных генов под действием светового режима. Другой сложностью изучения механизмов хатчинг-программы (термин Saigusa, 2000) у крабов является отсутствие информации о нерестовых ферментах ракообразных. Эта группа ферментов ответственна за полное или частичное растворение яйцевых оболочек у многих рыб, морских ежей и амфибий (Lepage et al., 1990; Lin et al., 2000). Как было показано, экспрессия этих белков непосредственно связана со временем предполагаемого нереста.

Таким образом, три аспекта изучения нереста полусухопутных крабов на наш взгляд представляют особый интерес. Это - механизмы контроля времени хатчинга, идентификация генов, экспрессия которых непосредственно связана с хатчинг-программой, а также выявление и характеристика активных веществ, вовлеченных в процессы морфологических и физиологических изменений, сопровождающих хатчинг.

Цель исследования. Идентификация генов и многофакторный анализ активных веществ, участвующих в регулировании времени хатчинга развивающихся эмбрионов у берегового краба Sesarma haematocheir, a также попытка инициации хатчинга in vitro.

В ходе иследования нами решались следующие задачи:

1. Идентифицировать и проанализировать гены, которые экспрес-сируются избирательно лишь в эмбрионах, находящихся в программе хатчинга.

2. Выделить соединения, являющиеся аналогами или гомологами нерестовых ферментов у крабов и участвующие в частичном или полном растворении яйцевых оболочек, которое является условием успешного хатчинга.

3. Разработать способ искусственной инициации хатчинг-программы эмбрионов в лабораторных условиях воздействием химических соединений или физических факторов.

Научная новизна. Идентифицирована и выделена новая сериновая протеаза, а также клонирован кодирующий ее ген. Было показано, что данный фермент частично растворяет яйцевые оболочки, а также способствует удалению остающихся после хатчинга эмбрионов яйцевых оболочек с плеопод самки, подготавливая тем самым их к новой кладке икры. Наличие такого фермента является эволюционным преимуществом крабов, так как позволяет начинать инкубацию новой партии икры без линь-

ки, тогда как для других десятиногих раков линька является необходимым условием очистки плеопод и подготовки для новой инкубации яиц.

В ходе экспериментов по сравнению библиотек генов, экспресси-рующихся в эмбрионах на разных этапах хатчинг-программы, методом супрессионной вычитающей гибридизации был идентифицирован и клонирован новый ген, по структуре схожий с генами кодирующими белки теплового шока (ШР-90). Показано, что экспрессия этого гена многократно усиливается в эмбрионах, находящихся в хатчинг-программе. Предложена гипотеза о возможной схеме участия стрессовых белков в инициации программы хатчинга в эмбрионах крабов Grapsidae.

Установлена возможность искусственной инициации хатчинга эмбрионов при воздействии ряда химических веществ. В этом случае нерест также был высоко синхронизирован среди эмбрионов. Проведен сравнительный анализ возможности изменения временного механизма в эмбрионах крабов и полученных ранее данных о структуре захватывания ритмов активности некоторых видов обитателей беломорской литорали.

Практическая значимость работы. Разведение десятиногих раков является на сегодняшний день одним из перспективных направлений морской биотехнологии. Один из ключевых моментов в этом направлении - эффективный мониторинг и возможность контроля репродуктивных циклов промысловых видов этой группы. Данное исследование является первой попыткой выявления молекулярных механизмов временной упорядоченности выклева эмбрионов крабов и морфологических сопутствующих изменений. Результаты работы могут послужить основой разработки комплексных подходов к искусственному контролю репродуктивных циклов десятиногих раков в аквакультуре.

Апробация работы. Результаты основных этапов диссертационной работы были доложены и обсуждались на Научных ассамблеях Международного комитета «С08РАК» (Нагойя, Япония, 1998; Варшава, Польша,

2000; Хьюстон, США, 2002; Париж, Франция, 2004), на Международной конференции «Белое море: фауна и экология» (Петрозаводск, 1999), на Ежегодном симпозиуме Зоологического общества Японии (Фукуока, 2001; Каназава, 2002; Хакодате, 2003; Кобе, 2004), на Ежегодных заседаниях Японского общества эмбриологии членистоногих (Сунадайра, 2002; Итако, 2003); на XIX Международном генетическом конгрессе (Мельбурн, Австралия, 2003), на итоговых научных конференциях Казанского университета в 2001, 2002, 2003; на международной конференции «Геон-2003» (Казань, 2003), на XIX Международном зоологическом конгрессе (Пекин, Китай, 2004). Заявлено участие в Международном научном семинаре «Проблемы репродукции и раннего онтогенеза морских гидро-бионтов» (Мурманск, 2-4 ноября 2004).

Публикации. По теме настоящей диссертации опубликовано 10 научных работ в зарубежных журналах и изданиях трудов российских и зарубежных конференций.

Положения, выносимые на защиту:

• 1. Частичное растворение яйцевых оболочек при нересте крабов происходит при участии сериновой протеиназы пострансляциооно принимающей двухдоменную форму. Протеиназа обладает высокой стрессовой устойчивостью и является первым выделенным представителем нерестовых протеиназ в ракообразных.

2. Выклев эмбрионов крабов может быть направленно инициирован кратковременным воздействием растворов ряда кетонов

3. Инициация выклева (хатчинга) эмбрионов крабов происходит при участии стрессового белка HSP-90, экспрессия которого развивающихся эмбрионах многократно возрастает за 40-45 часов до нереста.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы, 12 рисунков, включает введение обзор литературы, описание материалов и методов

исследования, их результаты, обсуждение результатов, выводы и список литературы. Список литературы содержит 150 источников, из них 140 зарубежных.

Декларация личного вклада автора. Автор лично проводил сбор

материала, экспериментальную лабораторную и аналитическую части исследований; в целом вклад автора составляет не менее 3/4 общего объема всей работы.

Благодарности. Считаю своим долгом выразить глубокую благодарность моим научным руководителям профессору А.И.Голубеву и профессору М.Сайгузе, которые щедро делились со мной богатым опытом и навыками, необходимыми для проведения исследований, оказали определяющее влияние на формирование моих научных интересов. Ценные советы и замечания были высказаны сотрудниками биолого-почвенного факультета КГУ профессорами М.Р.Шариповой и Д.Г.Ишмухаметовой, доцентами О.Д.Любарской, А.Н.Аскаровой, А.Н.Фаттаховой, за что автор им очень благодарен. Большое спасибо Р.МСабирову за редактирование части рукописи и за ценную консультативную помощь. Автор также искренне благодарен за постоянную поддержку при выполнении данного исследования сотрудникам кафедры зоологии беспозвоночных КГУ и лаборатории морской биологии и экологии Окаямского национального университета (Япония).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Самки крабов haematocheir инкубирующие икру собирались в период с мая по сентябрь 2000 - 2003 годов. Крабов содержали в индивидуальных пластиковых емкостях с подсоленой пресной водой (соленость 5-60/00). Время нереста каждой самки фиксировалось индивидуально и на

основе полученных данных строился график соотношения нереста с циклами внешней среды..

Для выделения нерестовой протеиназы воду, в которой происходил нерест, собирали и белки, содержащиеся в ней, осаждали центрифугированием. Осадок растворяли в 100 mM Tris-Cl (pH 9.0) и хранили при температуре -30°С. Белки, содержащиеся в нерестовой воде, разделяли с применением гель-фильтрации, гидрофобной, ионообменной и высокоэффективной жидкостной хроматографии. На каждом этапе отбирались биологически активные фракции. В качестве контролей использовали как воду (морскую и DW), так и жидкость, собранную с поверхности массы икры инкубируемой самкой за 7-14 дней до ожидаемого нереста. Биологическая активность определялась in vitro по способности содержимого белковых фракций частично растворять и размягчать структурные компоненты яйцевых оболочек и плеопод крабов. Степень чистоты препарата и молекулярную массу фермента определяли электрофорезом. Белковые фракции HPLC разделяли методом электрофореза в 15% агарозном геле по методу Лаэммли (Laemmli, 1970). N-концевую последовательность се-риновой протеазы определяли по методу Эдмана в образцах, полученных на этапе HPLC на колонке (150 mm х 6 mm) YMC-Pack ODS-A (YMC Co., Ltd., Japan) в градиенте концентрации (8-52%) ацетонитрила с 0.1% серной кислоты в течение 80 мин. Затем белок иммобилизовали и секвени-ровали с использованием автоматического аминокислотного анализатора (Apply Biosystems).

Поликлональные антитела получали серийной иммунизацией мыши смесью активных фракций на стадии гель-фильтрационной хроматографии. Иммунные сыворотки были очищены от примесей с помощью аффинной хромотографии на указанные полипептиды и протестированы в Western-блот гибридизации с суммарным белком, выделенным из эмбрионов. Выделенные и очищенные антитела использовали для West-

em-гибридизации с целью выявления экспрессии белка на разных стадиях хатчинг программы в эмбрионах.

На основе частично детерминированной аминокислотной последовательности нерестовой протеазы были синтезированы вырожденные олигонуклеотидные праймеры. Для клонирования гена, кодирующего искомый белок, использовали метод ПЦР с применением вырожденных затравок и кДНК-матрицей, полученной обратной транскрипцией тотальной РНК эмбрионов. Продукты ПЦР разделяли электрофорезом в 0.8 % агарном геле. Фрагменты ДНК вырезали из геля и проводили очистку Gel Extraction Kit (Qiagen), затем клонировали в pCR 2.1 ТОРО плазмидном векторе и определяли нуклеотидную последовательность с помощью ав-тематического сиквенатора DSQ-2000L (Shimadzu). Клонирование 51 и 3' -концевых частей кДНК, кодирующей нерестовую протеазу, осуществлялось в соответствие с протоколом Marathon cDNA Amplification Kit (BD Biosciences:). Дня синтеза первой цепи кДНК была использована тотальная РНК, выделенная из эмбрионов в день нереста. Анализ экспрессии гена в развивающихся эмбрионах проводили с помощью ОТ-ПЦР, используя ОРС-специфичные олигонуклеотидныее праймеры и кДНК, полученную с тотальной РНК эмбрионов на разных стадиях развития.

Поиск гомологии среди известных генов и структурный анализ нуклеотидной и аминокислотной последовательностей проводили с помощью программного пакета Vector NTI Suit 9 (Informax) с интегрированным модулем BLAST.

Эксперименты по искусственной инициации хатчинга проводились над изолированными от самки кластерами эмбрионов, помещенными в 50-луночный планшет. Эмбрионы подвергались кратковременному (5-10 минут) воздействию различных химических соединений, включающих бутанол, этанол, метанол, различные альдегиды, ацетон и пр. Далее икринки промывались в подсоленой пресной воде. На протяжении следую

щих 72 часов эмбрионы содержались в лунках и регистрация количества эмбрионов, перешедших в стадию зоэа, проводилась каждый час. Далее строились графики, отражающие структуру временной упорядоченности программы хатчинга в каждой группе эмбрионов.

Для выявления генов, непосредственно вовлеченных в контроль нерестовой программы, методом супрессионной вычитающей гибридизации (suppression subtracted hybridization - S S H) сравнивались эмбрионы двух типов: 1 - с искусственно инициированной программой хатчннга, 2- не способные перейти в личиночную стадию. В основе вычитающей гибридизации кДНК лежит процесс гибридизации двух образцов кДНК, называемых драйвером и трейсером, в результате которой общие для двух образцов транскрипты подлежат удалению (вычитаются). Особенностью, выбранного нами метода, было использование эффекта селективной супрессии полимеразной цепной реакции при амплификации продукта гибридизации.

Для вычитающей гибридизации использовались кДНК библиотеки, приготовленные на основе суммарной РНК эмбрионов, искусственно вовлеченных в программу хатчинга и эмбрионов из контрольной группы. В качестве основной рабочей гипотезы использовалось предположение о том, что после воздействия внешнего фактора, инициирующего внутреннюю программу хатчинга, начинается экспрессия генов, вовлеченных во временной и физиологический контроль этого события. Полученные библиотеки кДНК, обогащенные транскриптами специфичными для эмбрионов, вовлеченных в программу хатчинга, были проанализированы в первичном скрининге. Для этого были определены нуклеотидные последовательности 200 фрагментов ДНК из продуктов ПЦР финальной стадии вычитающей гибридизации экспериментальной и контрольных групп. Уникальность полученных генов и уровня их экспрессии для экспериментальной группы эмбрионов была подтверждена Нозерн блоттингом с

использованием тотальной РНК эмбрионов, использовавшихся для SSH, а также методом ОТ-ПЦР с использованием кДНК полученной с тотальной РНК эмбрионов крабов на разных этапах эмбриогенеза.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Синхронизация времени нереста между самкой и эмбрионами

Показано, что в лабораторных условиях с различными температурными (15-25°С) и световыми (DD, LD(12:12), LD (16:8)) режимами, нерест крабов синхронизируется со временем прилива в естественной среде обитания. Самки крабов осуществляли нерест лишь в условиях темноты, избегая светлые периоды. При совпадении светлого периода со временем прилива самки нерестились во время следующего прилива. При постоянном освещении условиях в лаборатории самки не нерестились вообще. В то же время нам удалось инициировать нерест у подавляющего большинства (90-95%) изолированных от самки эмбрионах кратковременным (5-10 мин.) воздействием 70% водного раствора ацетона. Нерест происходил примерно через 45-50 часов после стимуляции с высоким уровнем синхронизации среди эмбрионов (Рис.1). Следует отметить, что уровень синхронизации нереста среди эмбрионов зависел от времени их отделения от самки.

У эмбрионов отделенных от самки ближе к предполагаемому времени нереста уровень синхронизации времени нереста между собой был значительно выше того же показателя среди эмбрионов, отделенных от абдомена самки раньше. Анализ времени нереста между группами эмбрионов инкубировавшихся на абдомене самки и искусственно стимулированных действием ацетона изолированных эмбрионов позволил выдвинуть

Чшт I От! »«Г* Ж* В*» Ьг*

• 11 • 11 • 12 • II • И • II • II кп

Рис. 1. Инициация нереста в эмбрионах кратковременной инкубацией в 70% растворе ацетона. О - время изоляции кластеров от самки. Линия А - время стимуляции раствором ацетона Линия р - время хатчинга эмбрионов. SI - индекс синхронизации, отражающий уровень упорядоченности времени нереста среди эмбрионов (р<0.05).

предположение, что стимуляция эмбрионов самкой происходит несколько раз в последние 48 часов перед нерестом. В тоже время все эмбрионы, изолированные от самки не ранее чем за 48 часов до предполагаемого времени нереста, были способны самостоятельно завершить развитие и перейти в личиночную стадию.

2.2. Выделение и клонирование нерестовой протеазы

Было установлено присутствие биологически активного фактора в воде, в которой происходил нерест. Этот фермент способен частично отслаивать яйцевые оболочки эмбрионов и очищать поверхность плеопод от остающихся после нереста структурных элементов кластеров эмбрио-

нов. Он был назван OHSS (ovigerous setae stripping substance). Было показано, что белковая фракция, соответствующая протеиназе, обнаруживается на окрашенном полиакриламидном геле в виде двух фракций с молекулярной массой 22 и 25 KDa ОТ-ПЦР с использованием РНК, полученной из эмбрионов в качестве матрицы и двух вырожденных олигонуклео тидных праймеров, синтезированных на основе частично детерминированной аминокислотной последовательности, позволил амплифицировать и клонировать фрагмент ДНК размером 240 п.н. Определение нуклеотид-ной последовательности этого фрагмента подтвердило, что это участок гена кодирующего OHSS.

Рис 2. Нуклеотидная и предсказанная аминокислотная последовательности 0И88.

- сайт протеолитической активации протеиназы. - позиция нитронов о - каталитическая триада аминокислот. Аминокислотные последовательности выявленные в ходе сиквенирования

С помощью метода быстрой амплификации концевых фрагментов кДНК (RACE от apid amplification ofcDNA ends) и праймеров, специфичных к выявленному нами фрагменту, мы клонировали полноразмерную форму кДНК (1754 п.н.) этого гена из эмбрионов. Данная кДНК содержала единственную ОРС и кодировала полипептид длиной 492 а/к (рис. 2) Первичный анализ с использованием пакета программ BLAST последовательности аминокислот, предсказанной на основе последовательности нуклеотидов выявленной кДНК, показал ее существенное сходство с последовательностью группы трансмембранный сериновых протеазы трип-синовой группы (36-38% совпадений) (рис.3).

Рис 3. Сравнение первичной структуры трипсинового домена ОШЗ с другими сериновыми протеазами. Линиями показаны предполагаемые дисульфидные мостики между консервативно расположенными цистеинами. Пунктирная линия отображает дополнительный дисульфидный мостик, наличие которого определется присутствием в домене дополнительного цистеина. ▼ ■- сайт протеолитического активирования пропептида ОИЗЗ. * ■• аминокислоты формирующие каталитическую триаду. - аминокислоты формирующие субстратный карман.

Положение активных аминокислот, формирующих каталитическую триаду, а также сайтов первичного распознавания субстрата, позволили нам сделать вывод, что ОН88 является сериновой протеазой. Тем не менее, область высокого сходства с сериновыми протеазами распространялась лишь на часть предсказанного полипептида, тогда как аминокислотный участок располагающийся ближе к аминной группе (а/к 20-240) не обнаруживали сходства с известными на настоящий момент белками. Наличие сайта посттрансяционной активации Ш100, консервативного для сериновых протеаз, позволило сделать вывод о том, что изначально ОЖ8 синтезируется в виде неактивного зимогена, который впоследствии расщепляется на две полипептидной цепи. Анализ аминокислотной последовательности ОЖ8 не выявил присутствия активационного пептида. Это свидетельствует о том, что пострансляционная активация протеазы осуществляется, по-видимому, с участием других белков. Наличие в составе трипсинового домена ОШ8 дополнительной пары цистеинов, дополняющих шесть консервативных, позволяет сделать вывод о том, что после активации обе полипептидные цепи остаются соединенные дополнительным дисульфидным мостиком. Это предположение также подтверждаются наличием двух белковых фракций на геле после электрофореза продукта хромотографий. По-видимому, дополнительный дисуль-фидный мостик разрушался во время электрофореза, и полипептиды 22 и 25 кДа представляют собой каталитическую и некаталитическую цепи ОШ8.

Проведены эксперименты "М^егп-гибридизации с использованием поликлональных антител и анализа экспрессии ОН88 гена эмбрионов на разных стадиях развития. Экспериментально было показано, что интенсивная экспрессия гена начинается уже на самых ранних стадиях эмбриогенеза. Присутствие в тотальном белке эмбрионов неактивированной формы ОЖ8 (55 кЛа) наблюдалось уже за 15 дней до предполагаемого

нереста. В то же время активированная форма OHSS появлялась лишь за несколько дней до ожидаемого нереста. Экспериментально было показано, что очищенная протеиназа сохраняет каталитические функции в широком диапазоне температур и рН. Фермент также показал высокую устойчивость в сохранении уникальной способности растворять стуктурные элементы яйцевых оболочек после длительной заморозки и инкубации при высоких температурах.

23. Идентификация генов избирательно экспрессирующихся в эмбрионах вовлеченных в нерестовую программу

На основе результатов первичного скрининга кДНК библиотеки, обогащенной транскриптами специфичными для эмбрионов, вовлеченных в программу хатчинга, было показано, что кДНК библиотеки содержат довольно низкий процент клонов с подтвержденной дифференциаль-ностью. Из 200 транскриптов на двух этапах гибридизации, нуклеотидная последовательность которых была определена, дифференциальность экспрессии была подтверждена лишь для двух. Для дальнейшего анализа был выбран лишь один, демонстрировавший значительную разницу в уровне экспрессии между экспериментальной и контрольной группой эмбрионов (рис. 4А). Анализ с помощью пакета программ BLAST последовательности аминокислот, предсказанной на основе последовательности нуклеотидов выявленной кДНК, показал ее существенное сходство с последовательностью группы белков теплового шока HSP-90 (heat shock protein 90kDa).

Мы сделали вывод, что выявленный нами ген является гомологом (ортологом) HSP-90 других эукариот. HSP-90- группа белков-шаперонов, синтезирующихся в клетке в ответ на большинство химических и физических стрессов. К настоящему времени в генетическом банке отсутству-

ет информация об этой группе белков в ракообразных, поэтому поиск гомологии проводили среди шаперонов других групп животных.

С Ас+3 С Ас+12

В -72 -60 -40 -18 -6 хатчинг

Рис. 4 Эксперессия Ьф-90 гена в развивающихся эмбрионах краба. А - экспрессия в эмбрионах контрольной и эксперементальной группах (через 3 и

12 часов после инкубации с раствором ацетона). Метод Нозерн блоттинга В - уровень экспрессии гена в эмбрионах инкубируемых самкой краба, (цифры обозначают часы до момента хатчинга). Метод ОТ-ПЦР.

Методом ОТ-ПЦР с использованием кДНК полученной с тотальной РНК эмбрионов было подтверждено, что ЖР-90 гомолог не является просто ответом на химический стресс. На основе экспериментальных данных был сделан вывод, что экспрессия этого гена резко возрастает

также в эмбрионах развивающихся на плеоподах самки (рис. 4В). Увеличение уровня экспрессии было показано на стадии соответствующей 4045 часам до момента нереста.

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Изучение поведенческих, физиологических и молекулярно-биологических аспектов нереста является важным шагом на пути понимания механизмов, лежащих в основе контроля биологических часов, принципиально отличных от циркадианной системы осцилляторов насекомых и позвоночных. Настоящее исследование показало, что с большой долей уверенности можно говорить о том, что упорядоченность и время хатчинга эмбрионов крабов находится в непосредственной зависимости от стимуляции со стороны самки.

К настоящему времени исследования в области нереста ракообразных были сконцентрированы в двух главных направлениях. Первое - это анализ морфологических изменений, происходящих в развивающихся эмбрионах при их переходе к свободно-плавательному образу жизни и структурных компонентах эмбриональной оболочки во время нереста. Второе - это поведенческие и экологические аспекты хатчинга среди эмбрионов и нерестового поведения самок ракообразных в синхронизации с внешними циклами среды. Ни в том, ни в другом случае практически не затрагивались молекулярные механизмы, сопровождающие нерест. Кроме того, к настоящему времени для ракообразных не было выявлено биологически активных веществ, секреция которых непосредственно была бы связана с нерестом.

Нами была выделена и клонирована ранее неизвестная сериновая протеаза (ОН88), непосредственно участвующая в расщеплении яйцевой оболочки эмбрионов и облегчающая подготовку плеопод самок к новой

партии кластеров икры. Отметим, что все нерестовые протеазы, известные к настоящему времени в других группах животных принадлежат к семейству металло-протеаз, активность которых определяется присутствием атомов металлов (в большинстве случаев цинка). Тем не менее, рядом исследовательских групп были сделаны предположения о том, что нерестовые протеазы могут быть представлены трипсиновыми протеаза-ми (Coleen et al., 2002). Эти предположения основывались на данных о том, что присутствие ингибитора трипсина блокировало расщепление оболочек яйца, делая нерест невозможным. Результаты нашего исследования впервые полностью подтвердили это предположение. По-видимому, OHSS является первым представителем качественно новой группы нерестовых протеаз, неизвестных до сих пор. Особенностью этого белка является факт того, что структурно он близок к плазменным сериновым про-теазам, в большинстве своем выполняющим функцию активации других протеаз. Некаталическая часть OHSS также содержит участок, структурно близкий к активному участку распознавания субстрата хитиназ, что также подразумевает непосредственное участие этого белка в расщеплении структурных элементов кутикулярных образований абдомена самок. Пострансляционная модификация OHSS тесно связана со временем нереста крабов. По-видимому, последние этапы активации этой протеазы происходят непосредственно в ночь нереста. Это делает дальнейшее изучение OHSS одним из перспективных подходов к пониманию механизма работы внутренних часов крабов. В то же время является вероятным участие OHSS в других физиологических процессах развивающегося эмбриона. Анализ экспрессии гена кодирующего OHSS свидетельствует о том, что транскрилты появляются в развивающихся эмбрионах уже на стадии ранней бластулы, но их дальнейшая судьба нам пока неизвестна.

Другим результатом проведенных исследований является получение метода искусственного инициирования хатчинга в эмбрионах. Нами

впервые показана возможность инициации хатчинга кратковременным воздействием растворов ряда кетонов. То, что эмбрионы, изолированные более чем за 48 часов до ожидаемого момента нереста вообще не способны перейти в личиночную стадию, позволяет предположить, что действие кетонов сходно с действием некого стимула передающегося от самки к эмбрионам и инициирующего хатчинг. Кроме того, экспериментальные данные об упорядоченности хатчинга среди изолированных в лаборатории эмбрионах подтверждают предположение о том, что стимуляция самкой эмбрионов происходит несколько раз на протяжении последних 48 часов перед нерестом, что, по-видимому, обеспечивает высокий уровень его синхронизации среди эмбрионов.

Впервые показано участие стрессового белка ШР-90 в программе хатчинга эмбрионов. Усиление секреции стрессовых белков является универсальным ответом организма на разнообразные внешние воздействия. С этой точки зрения нам представляется вероятным, что возможность инициации нереста действием раствора кетонов опосредована именно увеличением уровня содержания стрессовых белков в эмбрионах, что очевидно является одним из ключевых моментов запуска механизма хатчинга.

Данной работе мы выделили и структурно охарактеризовали ряд активных факторов, синтез и функционирование которых непосредственно связаны с контролем времени нереста крабов. Дальнейшие, более детальные исследования молекулярной природы активности этих соединений, также как и механизмы их взаимодействия с другими факторами в развивающихся эмбрионах в будущем позволят, на наш взгляд, создать целостную картину структуры околоприливного осциллятора контролирующих нерест ракообразных.

выводы

1. Впервые экспериментально выяснена структура синхронизации времени нереста берегового краба Sesarma каетШоеке1г с циклами внешней среды. Показана возможность искусственной инициации нереста у изолированных от самки эмбрионов кратковременным воздействием растворов рада кетонов. Показано наличие у эмбрионов инициируемого внутреннего комплекса физиологических изменений, завершающихся через 45-50 часов высоко синхронизированным среди тысяч эмбрионов хатчингом.

2. Выделена и клонирована новая сериновая протеза, являющаяся в крабах аналогом нерестовых протеаз других групп животных. Получено экспериментальное подтверждение, ранее высказанное рядом авторов предположение о том, что нерестовые протеазы могут быть представлены не только металлопротеазами, но и сериновыми протеазами.

3. Методами супрессионной вычитающей гибридизации получен ряд генов, избирательно экспрессирующихся лишь у эмбрионов, находящихся в программе хатчинга.

4. Клонирован и структурно охарактеризован новый для ракообразных стрессовый белок Ы8Р-90. Показано, что уровень экспрессии этого шаперона многократно возрастает в эмбрионах как искусственно вовлеченных в программу хатчинга, так и нормально развивающихся на плео-подах самки, за 48-50 часов до предполагаемого хатчинга. На основе экспериментальных данных выдвинута гипотеза о роли Ы8Р-90 в инициации хатчинга эмбрионов крабов.

Основные публикации по теме диссертации

1. Gusev О. The circatidal rhythm of activity of the White Sea barnacle Balanus balanoides I O. Gusev, A. Golubev, N. Petrova // Proc. of 32nd COSPAR Sci. Assembly (Nagoya, Japan). - 1998. - C. 383-384.

2. Гусев ОЛ. Исследования биологических ритмов беспозвоночных Белого моря в лабораторных условиях (методическое пособие) / О.А. Гусев, А.КГолубев // Изд-во Казанск. ун-та. - Казань, 1999. - 21 с.

3. Gusev О. Tide-associated biological rhythms of some White sea littoral invertebrates / 0. Gusev, A. Golubev // Adv. in Space Res., No 28. -2001. С 613-615.

4. Gusev O. Novel HSP-90 protein in semi-terrestrial crab Sesarma haemato-

cheir and its possible participation in control of hatching program in embryos / 0. Gusev // Proc. ofXIX Int Cong, of Genetics. - 2003. - С 230235.

5. Gusev O. Molecular cloning and gene structure of novel serine protease

from crab Sesarma haematocheir / O. Gusev // Proc. Int. Conf. «GEON-2003». -Kazan.- С 63-64.

6. Hirano U. К вопросу о происхождении крабовых форм ракообразных /

U. Hirano, H. Ikeda, О. Gusev, H. Takada, M. Saigusa // «Uminshi» Official J. Crustacean Soc. ofJapan, No 41. — 2003 — C. 10- 13 (на японском языке).

7. Gusev О. Purification and cDNA cloning of the ovigerous-hair stripping substance (OHSS) contained in the hatch water of an estuarine crab Sesarma haematocheir I O. Gusev, H. Ikeda, T. Okochi, J. M. Lee, M. Hatakeyama, С Kobayashi, K. Agata, H. Yamada, M. Saigusa // J. Experimental Biol., No 207 (Pt 4). - 2004. - С 621-632.

8. Gusev О. Induction of hatching and expression of a 90-KD heat-shock protein (hsp90) induced by organic solvents and its possible participation on 'hatching program' of the embryo in an estuarine crab Sesarma haemato-cheir I O.Gusev, ceda, Y.Hirano, J.M.Lee, M.Hatakeyama, M.Saigusa // J. Experimental Biol. - 2004 - 8 p. (in press).

9. Gusev O. Chaperons expressions and search for new gravity-related genes in the embryos of crabs and amphibians. / 0. Gusev, A. Kashiwagi, and M. Saigusa // Adv. in Space Res.. - 2004 - 5 p. (in press).

10. Гусев О.А. Молекулярный контроль выклева эмбрионов полусухопутного краба Sesarma haematocheir (Brachyura: Grapsidae) I О. А. Гусев, A.R Голубев, М. Сайгуза // Тез.докл. Междунар. научн. семинара «Пробл. репродукции и раннего онтогенеза морских гидробионтов». Мурманск, 2004. - 2 с. (в печати).

»17192

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гусев, Олег Александрович

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Основные типы биологических ритмов и систем их контроля.

1.1.1. Осциллятор и наблюдаемые ритмы.

1.1.2. Кривая подстройки фазы: почему она важна?.

1.1.3 .Генетический анализ циркадианного осциллятора. ф 1.1.4. Околоприливный осциллятор.

1.2. Основные черты экологии и биологии размножения береговых крабов рода Sesarma.

1.2.1. Репродуктивная система береговых крабов.

1.2.2. Синхронизация нереста крабов с циклами внешней среды.

1.2.3. Синхронизация хатчинга эмбрионов.

1.3. Нерестовые протеиназы: структура и биологические функции.

1.4. Белки теплового шока и их роль в эмбриогенезе.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Животные и микроорганизмы для экспериментов.

2.2. Реактивы и среды.

2.3. Очистка протеиназы хроматографическими методами.

2.4. Электрофорез белков.

2.5. Получение библиотек кДНК, обогащенных последовательностями специфически экспрессирующихся в программе нереста крабов.

2.6. Скрининг библиотеки кДНК и клонирование гена, кодирующего OHSS.

2.7. Статистическая обработка данных.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1 Выделение и очистка нерестовой протеиназы.

3.1.1. Биологическая активность OHS S.

3.1.2. Очистка и выделение нерестовой протеиназы методами хроматографии.

3.1.3. Устойчивость биологической активности OHSS.

3.1.4. Реципрокный анализ эффекта нерестовой воды береговых крабов.

3.1.5. Очистка OHSS методом RP-HPLC.

3.1.6. Частичное аминокислотное сиквенирование OHSS.

3.1.7. Клонирование гена кодирующего OHSS.

3.1.8. Анализ аминокислотной последовательности OHHS.

3.1.9. Поиск последовательностей, гомологичных гену OHSS с использованием базы данных международного ф банка генов.

3.1.10. Анализ структуры гена кодирующего OHSS и его активности.

3.1.11. Пострансляционная модификация и активация OHSS

3.1.12. Использование поликлональных антител для детекции OHSS в тотальном белке эмбрионов.

3.1.13. Посттранскрипционные изменения в структуре мРНК кодирующей OHSS и множественность локусов гена.

3.1.14. Морфологические изменения в абдоменальных волоска: под дейтвием OHSS. ф 3.1.15. Межвидовые различия в структуре OHSS.

3.2. Инициация хатчинга эмбрионов в лаборатории и применение вычитающей гибридизации на модели программы нереста крабов.

3.2.1. Инициация хатчинга эмбрионов — эффект органических соединений.

3.2.2. Поиск генов специфичных для программы хатчинга с использованием вычитающей гибридизации.

3.2.3. Анализ экспрессии и структуры гена кодирующего HSP-90.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярные основы контроля нереста берегового краба Sesarma Haematocheir"

Феномен биологических ритмов в живых системах — одно из самых загадочных и малоизученных явлений в природе. Внутренние часы организмов разных уровней организации демонстрируют удивительную стабильность и, в то же время, достаточную пластичность для подстраивания фазы активности под изменяющиеся внешние циклы среды. Многочисленными экспериментами было показано, что даже в отсутствии регулярной внешней стимуляции, биологические ритмы самоподдерживаются в организме на продолжении длительного времени (Enright, 1980 и др.).

Современные методы исследований позволили выявить и охарактеризовать основные механизмы молекулярного контроля циркадианных ритмов у ряда видов беспозвоночных и позвоночных животных, включая человека. Были установлены группы генов, экспрессирующихся лишь в определенный период светового цикла (Chen et al., 1991; и др.). На основании этих экспериментальных данных проведено генетическое исследование «с1оск-мутантов» дрозофилы и была построена детальная модель циркадианного осциллятора (Helfrich-Forster, 1996). Понимание биохимических механизмов, лежащих в основе функционирования околосуточных биологических часов, было успешно применено в фармацевтике для создания ряда лекарственных препаратов (Kondo et al., 1994; и др.).

Наряду с этими, достаточно хорошо изученными, механизмами молекулярного контроля существуют уникальные примеры синхронизации биологической активности с внешними циклами среды. Одним из них является нерестовое поведение некоторых видов крабов семейства Grapsidae. Взрослые особи крабов ведут полусухопутный образ жизни, возвращаясь на берег для нереста лишь один-два раза в год.

Там, после месячной инкубации, на абдоменальных придатках икра стряхивается в морской воду, и личинки краба переходят к планктонному образу жизни. Уникальность этого события в том, что нерест крабов строго ассоциирован с ночными приливами и не происходит в другое время (Saigusa, 2000). Другая особенность поведения крабов в том, что в течение получаса после попадания в морскую воду эмбрионы прорывают яйцевые оболочки и переходят к свободноплавающему личиночному образу жизни. Выклев эмбрионов крабов (хатчинг — от англ. hatching) находится в непосредственной зависимости от поведения самки. В лабораторных условиях выклев также высоко синхронизирован среди эмбрионов. Однако, отделенные от абдомена самки более чем за 48 часов до ожидаемого момента хатчинга эмбрионы не способны завершить развитие. А эмбрионы, изолированные от самки менее чем за 48 часов до момента нереста, способны самостоятельно завершить эмбриогенез и перейти в личиночную стадию. Молекулярные основы контроля биологических часов такого типа к настоящему времени не были известны. Лишь для некоторых десятиногих ракообразных установлено существование гомологов с1оск-локусов, но косвенное участие этих генов было продемонстрировано в контроле циркадианной структуры только для локомоторной активности (Naylor, 1985, 1997). Между тем, контроль времени хатчинга эмбрионов Grapsidae представляет собой, по видимому, совершенно иную структуру, независимую от циклического изменения уровня РНК отдельных генов под влиянием светового режима. Другой сложностью изучения механизмов хатчинг-программы (термин Saigusa, 2000) у крабов является отсутствие информации о нерестовых ферментах ракообразных. Эта группа ферментов ответственна за полное или частичное растворение яйцевых оболочек у многих рыб, морских ежей и амфибий (Lepage et al., 1990; Lin et al., 2000). Как было показано, экспрессия этих белков непосредственно связана со временем предполагаемого нереста.

Таким образом, три аспекта изучения нереста полусухопутных крабов на наш взгляд представляют особый интерес. Это - механизмы контроля времени хатчинга, идентификация генов, экспрессия которых непосредственно связана с хатчинг-программой, а также выявление и характеристика активных веществ, вовлеченных в процессы морфологических и физиологических изменений, сопровождающих хатчинг.

Цель исследования. Идентификация генов и многофакторный анализ активных веществ, участвующих в регулировании времени хатчинга развивающихся эмбрионов у берегового краба Sesarma haematocheir, а также попытка инициации хатчинга in vitro.

В ходе иследования нами решались следующие задачи:

1. Идентифицировать и проанализировать гены, которые экспрессируются избирательно лишь в эмбрионах, находящихся в программе хатчинга.

2. Выделить соединения, являющиеся аналогами или гомологами нерестовых ферментов у крабов и участвующие в частичном или полном растворении яйцевых оболочек, которое является условием успешного хатчинга.

3. Разработать способ искусственной инициации хатчинг-программы эмбрионов в лабораторных условиях воздействием химических соединений или физических факторов.

Научная новизна. Идентифицирована и выделена новая сериновая протеиназа, а также клонирован кодирующий ее ген. Было показано, что данный фермент частично растворяет яйцевые оболочки, а также способствует удалению остающихся после хатчинга эмбрионов яйцевых оболочек с плеопод самки, подготавливая тем самым их к новой кладке икры. Наличие такого фермента является эволюционным преимуществом крабов, так как позволяет начинать инкубацию новой партии икры без линьки, тогда как для других десятиногих раков линька является необходимым условием очистки плеопод и подготовки для новой инкубации яиц.

В ходе экспериментов по сравнению библиотек генов, экспрессирующихся в эмбрионах на разных этапах хатчинг-программы, методом супрессионной вычитающей гибридизации был идентифицирован и клонирован новый ген, по структуре схожий с генами кодирующими белки теплового шока (HSP-90). Показано, что экспрессия этого гена многократно усиливается в эмбрионах, находящихся в хатчинг-программе. Предложена гипотеза о возможной схеме участия стрессовых белков в инициации программы хатчинга в эмбрионах крабов Grapsidae.

Установлена возможность искусственной инициации хатчинга эмбрионов при воздействии ряда химических веществ. В этом случае хатчинг также был высоко синхронизирован среди эмбрионов. Проведен сравнительный анализ возможности изменения временного механизма в эмбрионах крабов и полученных ранее данных о структуре захватывания ритмов активности некоторых видов обитателей беломорской литорали.

Практическая значимость работы. Разведение десятиногих раков является на сегодняшний день одним из перспективных направлений морской биотехнологии. Один из ключевых моментов в этом направлении — эффективный мониторинг и возможность контроля репродуктивных циклов промысловых видов этой группы. Данное исследование является первой попыткой выявления молекулярных механизмов временной упорядоченности выклева эмбрионов крабов и сопутствующих ему морфологических изменений. Результаты работы могут послужить основой разработки комплексных подходов к искусственному контролю репродуктивных циклов десятиногих раков в аквакультуре.

Апробация работы. Результаты основных этапов диссертационной работы были доложены и обсуждались на Научных ассамблеях Международного комитета «COSPAR» (Нагойя, Япония, 1998; Варшава, Польша, 2000; Хьюстон, США, 2002; Париж, Франция, 2004), на Международной конференции «Белое море: фауна и экология» (Петрозаводск, 1999), на Ежегодном симпозиуме Зоологического общества Японии (Фукуока, 2001; Каназава, 2002; Хакодате, 2003; Кобе, 2004), на Ежегодных заседаниях Японского общества эмбриологии членистоногих (Сунадайра, 2002; Итако, 2003); на XIX Международном генетическом конгрессе (Мельбурн, Австралия, 2003), на итоговых научных конференциях Казанского университета в 2001, 2002, 2003; на международной конференции «Геон-2003» (Казань, 2003), на XIX Международном зоологическом конгрессе (Пекин, Китай, 2004). Заявлено участие в Международном научном семинаре «Проблемы репродукции и раннего онтогенеза морских гидробионтов» (Мурманск, 24 ноября 2004).

Публикации. По теме настоящей диссертации опубликовано 10 научных работ в зарубежных журналах и изданиях трудов российских и зарубежных конференций.

Положения, выносимые на защиту:

1. Частичное растворение яйцевых оболочек при нересте крабов происходит при участии сериновой протеиназы пострансляционно принимающей двухдоменную форму. Протеиназа обладает высокой стрессовой устойчивостью и является первым выделенным представителем нерестовых протеиназ в ракообразных.

2. Выклев эмбрионов крабов может быть направленно инициирован кратковременным воздействием растворов ряда кетонов.

3. Инициация выклева (хатчинга) эмбрионов крабов происходит при участии стрессового белка HSP-90, экспрессия которого в развивающихся эмбрионах многократно возрастает за 40-45 часов до хатчинга.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Гусев, Олег Александрович

выводы

1. Охарактеризованы особенности синхронизации нереста крабов рода Sesarma в лабораторных уловиях. Показана возможность искусственной инициации хатчинга изолированных от самки эмбрионов кратковременным воздействием 70% раствором ацетона. Выявлено наличие у эмбрионов инициируемого внутреннего комплекса физиологических изменений, завершающихся через 48-50 часов высоко синхронизированным среди тысяч эмбрионов нерестом.

2. Выделена и охарактеризована новая сериновая протеза, являющаяся в крабах аналогом нерестовых протеаз других групп животных. Получено экспериментальное подтверждение, ранее высказанное рядом авторов предположение о том, что нерестовые протеиназы могут быть представлены не только металлопротеиназами, но и сериновыми протеиназами.

3. Методами супрессионной вычитающей гибридизации был впервые получен ряд генов избирательно экспрессирующихся лишь в эмбрионах находящихся в программе хатчинга.

4. Клонирован и структурно охарактеризован стрессовый белок HSP-90, новый для ракообразных. Впервые показано, что уровень экспрессии этого шаперона многократно возрастает в эмбрионах, как искусственно вовлеченных в программу хатчинга, так и нормально развивающихся на плеоподах самки, за 48-50 часов до предполагаемого нереста. На основе экспериментальных данных сделано предположение о роли HSP-90 в инициации нереста в эмбрионах крабов.

БЛАГОДАРНОСТИ

Считаю своим долгом выразить глубокую благодарность моим научным руководителям: профессору А.И.Голубеву и профессору М.Сайгузе, которые щедро делились со мной богатым опытом и навыками, необходимыми для проведения исследований, оказали определяющее влияние на формирование моих научных интересов. Ценные советы и замечания были высказаны сотрудниками биолого-почвенного факультета КГУ профессорами М.Р.Шариповой и Д.Г.Ишмухаметовой, доцентами О.Д.Любарской, А.Н.Аскаровой, А.Н.Фаттаховой, за что автор им очень благодарен. Большое спасибо Р.М.Сабирову за редактирование части рукописи и за ценную консультативную помощь. Автор также искренне благодарен за постоянную поддержку при выполнении данного исследования сотрудникам кафедры зоологии беспозвоночных КГУ и лаборатории морской биологии и экологии Окаямского национального университета (Япония). Отдельную благодарность хочется выразить руководству Беломорской Морской Биологической Станции КГУ за помощь в организации и проведение экспериментальной части работы. Хочется отметить, что без всех этих людей, данная работа так и осталась бы студенческой мечтой.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гусев, Олег Александрович, Казань

1. Алпатов A.M., Чернышев В.Б., Зотов В.А., Ритвельд В.Й. / Пустынный жук-чернотелка Trigonoscelis gigas Reitter: перспективный биообъект для космической хронобиологии. // Авиакосмическая и экол. мед. 2000 -34(1)-с. 58-61.

2. Агаджанян Н.А. / Биологические ритмы. // М., Наука". 1967 - 34 с.

3. Алякринский Б. /Проблемы космической биологии. Биологические ритмы и организация жизни человека в космосе. // М.: Наука 1983. - 46 с.

4. Ашофф Ю. / Биологические ритмы. / М.: Мир — 1984 — 40 с.

5. Гусев О., Голубев А. / Исследования биологических ритмов беспозвоночных Белого моря в лабораторных условиях (методическое пособие) // Изд-во Казанск. ун-та. — Казань, 1999. 21 с.

6. Панасенко О., Ким М. и Гусев Н. / Структура и свойства малых белков теплового шока.// Успехи биологической химии. — 2003 43 - с. 59-98.

7. Руденская Г. Н. / Брахиурины сериновые коллагенолитичекие ферменты из крабов // Биоорг. хим. - 2003 - 29 - с. 117-128

8. Руденская Г. Н., Исаев В.А., Степанов В.М. и др./ Выделение и свойства сериновой протеиназы PC камчатского краба Paralithodes camtschatica протеолитического фермента широкой специфичности.// Биохимия. - 1996 - 61-6- с. 119-123

9. Руденская Г. Н., Исаев В.А., Калебина Т.С. и др./ Выделение и трипсина PC камчатского краба Paralithodes camtschatica и его свойства.// Биоограническая химия. 1996- 24(2)- с. 112-118

10. Чернышев В.Б. /(1984) Суточные ритмы активности насекомых. //М., Изд-во МГУ.-1984. 34 с.1. На английском языке:

11. Adachi К, Hirata Т, Nishioka Т, Sakaguchi М. / Hemocyte components in crustaceans convert hemocyanin into a phenoloxidase-like enzyme. // Comp Biochem Physiol В Biochem Mol Biol 2003 - 134 - c. 135-141.

12. Albrecht U. / Invited review: regulation of mammalian circadian clock genes. // J Appl Physiol 2002 - 92 - c. 1348-1355.

13. Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, et al. / Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. // Nucleic Acids Res 1997 - 25 - c. 3389-3402.

14. Aoki H, Ahsan MN, Matsuo K, Hagiwara T, Watabe S. / Purification and characterization of collagenolytic proteases from the hepatopancreas of northern shrimp (Pandalus eous). // J Agric Food Chem 2003 - 51 - c. 777783.

15. Asai M, Yoshinobu Y, Kaneko S, et al. / Circadian profile of Per gene mRNA expression in the suprachiasmatic nucleus, paraventricular nucleus, and pineal body of aged rats. // J Neurosci Res 2001 - 66 - с. 1133-1139.

16. Banumathy G, Singh V, Pavithra SR, Tatu U. / Heat shock protein 90 function is essential for Plasmodium falciparum growth in human erythrocytes. // J Biol Chem 2003 - 278 - с. 18336-18345.

17. Barrett D, Edwards BF / Hatching enzyme of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus.// Methods Enzymol. 19764-5- c.354-373.

18. Barrett D, Angelo GM. / Maternal characteristics of hatching enzymes in hybrid sea urchin embryos.// Exp Cell Res. 1969 - 57 - 159-166.

19. Borkovich KA, Alex LA, Yarden O, et al. / Lessons from the genome sequence of Neurospora crassa: tracing the path from genomic blueprint to multicellular organism. // Microbiol Mol Biol Rev 2004 - 68 - c. 1-108, table of contents.

20. Caplan AJ. / Hsp-90's secrets unfold: new insights from structural and functional studies. // Trends in Cell Biology 1999 - 9 - c. 262-268.

21. Chen YL, Lu PJ, Tsai IH. / Collagenolytic activity of crustacean midgut serine proteases: comparison with the bacterial and mammalian enzymes. // Comp Biochem Physiol В 1991 - 100 - c. 763-768.

22. Cheng P, Yang Y, Liu Y. / Interlocked feedback loops contribute to the robustness of the Neurospora circadian clock. // Proc Natl Acad Sci U S A -2001 -98-c. 7408-7413.

23. Christensen S, Silverthorne J. / Origins of phytochrome-modulated Lhcb mRNA expression in seed plants. // Plant Physiol 2001 - 126 - c. 1609-1618.

24. Christians ES, Zhou Q, Renard J, Benjamin IJ. / Heat shock proteins in mammalian development. // Semin Cell Dev Biol 2003 - 14 - c. 283-290.

25. Cirelli C. / How sleep deprivation affects gene expression in the brain: a review of recent findings. // J Appl Physiol 2002 - 92 - c. 394-400.

26. Claridge-Chang A, Wijnen H, Naef F, Boothroyd C, Rajewsky N, Young MW. / Circadian regulation of gene expression systems in the Drosophila head. //Neuron 2001 - 32 - c. 657-671.

27. Clegg JS, Jackson SA, Popov V.I. /Long-term anoxia in encysted embryos of the crustacean, Artemia franciscana: viability, ultrastructure, and stress proteins. // Cell Tissue Res. 2000-301 - c.433-446.

28. Constance CM, Green CB, Tei H, Block GD. / Bulla gouldiana period exhibits unique regulation at the mRNA and protein levels. // J Biol Rhythms -2002- 17-c. 413-427.

29. Csermely P, Schnaider T, Soti C, Prohaszka Z, Nardai G. / The 90-kDa molecular chaperone family: structure, function, and clinical applications. A comprehensive review. // Pharmacol Ther 1998 - 79 - c. 129-168.

30. D'Aniello A, de Vincentiis M, Di Fiore MM, Scippa S. / Hatching enzyme from the sea-squirt Ciona intestinalis: purification and properties. // Biochim Biophys Acta 1997- 1339-c. 101-112.

31. D'Aniello A, Denuce MJ, de Vincentiis M, et al / Corrigendum to: hatching enzyme from the sea-squirt ciona intestinalis: purification and properties. // Biochim Biophys Acta -1998- c.1387-11395.

32. Ditty JL, Williams SB, Golden SS. / A cyanobacterial circadian timing mechanism. // Annu Rev Genet 2003 - 37 - c. 513-543.

33. Drivenes O, Soviknes AM, Ebbesson LO, Fjose A, Seo HC, Helvik JV. / Isolation and characterization of two teleost melanopsin genes and their differential expression within the inner retina and brain. // J Comp Neurol -2003 -456-c. 84-93.

34. Dubocovich ML, Rivera-Bermudez MA, Gerdin MJ, Masana MI. / Molecular pharmacology, regulation and function of mammalian melatonin receptors. // Front Biosci 2003 - 8 - c. dl093-l 108.

35. Elaroussi MA, DeLuca HF. / A new member to the astacin family of metalloendopeptidases: a novel 1,25-dihydroxyvitamin D-3-stimulated mRNA from chorioallantoic membrane of quail. // Biochim Biophys Acta 1994 -1217-c. 1-8.

36. Enright JT / Temporal precision in circadian systems: a reliable neuronal clock from unreliable components? // Science 1980 -209 - c. 1542-1545.

37. Fan TJ, Chiaki K. / Purification and Biochemical Characterization of the Hatching Enzyme from Xenopus laevis. // Sheng Wu Hua Xue Yu Sheng Wu Wu Li Xue Bao (Shanghai) 1998 - 30 - c. 75-80.

38. Fan TJ, Katagiri C. / Properties of the hatching enzyme from Xenopus laevis. // Eur J Biochem 2001 - 268 - c. 4892-4898.

39. Foster RG, Hankins MW. / Non-rod, non-cone photoreception in the vertebrates. // Prog Retin Eye Res 2002 - 21 - c. 507-527.

40. Fradin C, Kretschmar M, Nichterlein T, Gaillardin C, d'Enfert C, Hube B. / Stage-specific gene expression of Candida albicans in human blood. // Mol Microbiol 2003 - 47 - c. 1523-1543.

41. Froehlich AC, Pregueiro A, Lee K, et al. / The molecular workings of the Neurospora biological clock. // Novartis Found Symp 2003 - 253 - с. 184198; discussion 102-189, 198-202, 281-184.

42. Fukuhara C, Dirden JC, Tosini G. / Regulation of period 1 expression in cultured rat pineal. // Neurosignals 2002 - 11 - c. 103-114.

43. Fuller CA, Sulzman FM, Moore-Ede MC: Thermoregulation is impaired in an environment without circadian time cues. Science 199:794-796, 1978

44. Fuller CA, Sulzman FM, Moore-Ede MC: Circadian control of thermoregulation in the squirrel monkey, Saimiri sciureus. Am J Physiol 236:R153-161, 1979

45. Geier G, Zwilling R. / Cloning and characterization of a cDNA coding for Astacus embryonic astacin, a member of the astacin family of metalloproteases from the crayfish Astacus astacus. // Eur J Biochem 1998 - 253 - c. 796-803.

46. Goudeau M, Lachaise F. // Fine structure and secretion of the capsule enclosing the embryo in a crab (Carcinus maenas (L.))./ Tissue Cell. 1980 -12 -c. 287-308.

47. Goudeau M, Lachaise F. / Structure of the egg funiculus and deposition of embryonic envelopes in a crab. // Tissue Cell. — 1983 — 15 c. 47-62.

48. Goudeau M, Talbot P, Harper R. / Mechanism of egg attachment stalk formation in the lobster, Homarus. // Gamete Res. 1987 - 18 - c. 279-289, 1987

49. Gore AC, Oung T, Yung S, Flagg RA, Woller MJ. / Neuroendocrine mechanisms for reproductive senescence in the female rat: gonadotropin-releasing hormone neurons. // Endocrine 2000 - 13 - c. 315-323.

50. Greene R, Siegel J. / Sleep: a functional enigma. // Neuromolecular Med -2004 5 - c. 59-68.

51. Gupta RS. / Phylogenetic analysis of the 90 kD heat shock family of protein sequences and an examination of the relationship among animals, plants, and fungi species. // Mol Biol Evol 1995 - 12 - c. 1063-1073.

52. Gusev O, Ikeda H, Okochi T, et al. / Purification and cDNA cloning of the ovigerous-hair stripping substance (OHSS) contained in the hatch water of an estuarine crab Sesarma haematocheir. // J Exp Biol 2004 - 207 - c. 621-632.

53. Gusev O. / Novel HSP-90 protein in semi-terrestrial crab Sesarma haematocheir and its possible participation in control of hatching program in embryos / Proc. of XIX Int. Cong, of Genetics. 2003. - c. 230-235.

54. Gusev O., Golubev A./ Tide-associated biological rhythms of some White sea littoral invertebrates // Adv. in Space Res. 2001 - 28. -c. 613-615.

55. Hall JC. / Cryptochromes: sensory reception, transduction, and clock functions subserving circadian systems. // Curr Opin Neurobiol 2000 - 10 - c. 456-466.

56. Hayasaka N, LaRue SI, Green CB. / In vivo disruption of Xenopus CLOCK in the retinal photoreceptor cells abolishes circadian melatoninrhythmicity without affecting its production levels. // J Neurosci 2002 - 22 - c. 1600-1607.

57. He Q, Cheng P, Yang Y, Yu H, Liu Y. / FWD1-mediated degradation of FREQUENCY in Neurospora establishes a conserved mechanism for circadian clock regulation. // Embo J 2003 - 22 - c. 4421-4430.

58. Hedstorm L., Tiao-Yin Lin, Fast W. / Hydrophobic interactions control zymogen activation in the trypsin family of serine protease // Biochemistry. -1996-35 — c. 4515-4523.

59. Helfrich-Forster C. / The neuroarchitecture of the circadian clock in the brain of Drosophila melanogaster.// Microsc Res Tech 2003 - 62- c.94-102.

60. Heikkila JJ. / Expression and function of small heat shock protein genes during Xenopus development. // Semin Cell Dev Biol 2003 - 14 - c. 259-266.

61. Itoh MT, Sumi Y. / Circadian clock controlling egg hatching in the cricket (Gryllus bimaculatus). // J Biol Rhythms. 2000 - 15 - c.241-245.

62. Katagiri C, Maeda R, Yamashika C, Mita K, Sargent TD, Yasumasu S. / Molecular cloning of Xenopus hatching enzyme and its specific expression in hatching gland cells. // Int J Dev Biol 1997 - 41 - c. 19-25.

63. Kitamura Y, Katagiri C. / Characterization of the hatching enzyme from embryos of an anuran amphibian, Rana pirica. // Biochim Biophys Acta 1998 - 1387-c. 153-164.

64. Kondo T, Strayer CA, Kulkarni RD. / Circadian rhythms in prokaryotes:luciferase as a reporter of circadian gene expression in cyanobacteria. // Proc Natl Acad Sci U S A. 1993 - 90 - 5672-5676.

65. Kondo T, Ishiura M. / Circadian rhythms of cyanobacteria: monitoring the biological clocks of individual colonies by bioluminescence. //J Bacteriol. -1994- 176-c. 1881-1885.

66. Kondo T, Tsinoremas NF, Golden SS, et al / Circadian clock mutants of cyanobacteria. // Science. 1994 - 266 - c. 1233-1236.

67. Konopka RJ. / Genetics of biological rhythms in Drosophila. //Annu Rev Genet. 1987 - 21 - c. 227-236.

68. Krone PH, Evans TG, Blechinger SR. / Heat shock gene expression and function during zebrafish embryogenesis. // Semin Cell Dev Biol 2003 - 14 -c. 267-274.

69. Lanz H, Hernandez S, Garrido-Guerrero E, Tsutsumi V, Arechiga H. / Prophenoloxidase system activation in the crayfish Procambarus clarki. // Dev Comp Immunol 1993 - 17 - c. 399-406.

70. Lei H, Furth EE, Kalluri R, et al. / Induction of matrix metalloproteinases and collagenolysis in chick embryonic membranes before hatching. // Biol Reprod- 1999 60-c. 183-189.

71. Lepage T, Gache С / Purification and characterization of the sea urchin embryo hatching enzyme. // J Biol Chem. 1989 - 264 - c.4787-4793.

72. Levine MZ, Harrison PJ, Walthall WW, Tai PC, Derby CD. / A CUB-serine protease in the olfactory organ of the spiny lobster Panulirus argus. // J Neurobiol 2001 - 49 - c. 277-302.

73. Li Y, Song X, Ma Y, Liu J, Yang D, Yan B. / DNA binding, but not interaction with Bmal 1, is responsible for DEC 1 -mediated transcription regulation of the circadian gene mPerl. // Biochem J 2004 - 382 - c. 895-904.

74. Lincoln GA, Andersson H, Loudon A. / Clock genes in calendar cells as the basis of annual timekeeping in mammals—a unifying hypothesis. // J Endocrinol 2003 - 179 - c. 1-13.

75. Loros JJ, Dunlap JC. / Genetic and molecular analysis of circadian rhythms in Neurospora. // Annu Rev Physiol 2001 - 63 - c. 757-794.

76. MacRae TH. / Molecular chaperones, stress resistance and development in Artemia franciscana. // Semin Cell Dev Biol 2003 - 14 - c. 251-258.

77. Martin JR, Keller A, Sweeney ST. / Targeted expression of tetanus toxin: a new tool to study the neurobiology of behavior. // Adv Genet 2002 - 47 - с. 147.

78. Matsushika A, Makino S, Kojima M, Mizuno T. / Circadian waves of expression of the APRR1/TOC1 family of pseudo-response regulators in Arabidopsis thaliana: insight into the plant circadian clock. // Plant Cell Physiol 2000 - 41 - c. 1002-1012.

79. McDonald MJ, Rosbash M. / Microarray analysis and organization of circadian gene expression in Drosophila. // Cell 2001 - 107 - c. 567-578.

80. Mealey-Ferrara ML, Montalvo AG, Hall JC. / Effects of combining a cryptochrome mutation with other visual-system variants on entrainment of locomotor and adult-emergence rhythms in Drosophila. // J Neurogenet 2003 - 17-c. 171-221.

81. Merrow M, Roenneberg T, Macino G, Franchi L. / A fungus among us: the Neurospora crassa circadian system. // Semin Cell Dev Biol 2001 - 12 - c. 279-285.

82. Meyer-Bernstein EL, Sehgal A. / Molecular regulation of circadian rhythms in Drosophila and mammals. // Neuroscientist 2001 -1-е. 496-505.

83. Mitchell-Olds T, Knight CA / Evolution. Chaperones as buffering agents? // Science. 2002 - 296 - 2348-2349.

84. Milton CC, Huynh B, Batterham P, Rutherford SL, Hoffmann AA. / Quantitative trait symmetry independent of Hsp-90 buffering: distinct modes of genetic canalization and developmental stability. // Proc Natl Acad Sci U S A-2003 100-c. 13396-13401.

85. Muta T, Hashimoto R, Miyata T / Proclotting enzyme from horseshoe crab hemocytes. cDNA cloning, disulfide locations, and subcellular localization. // J Biol Chem. 1990 - 265 - c. 22426-22433.

86. Naylor E. /Tidally rhythmic behaviour of marine animals. // Symp Soc Exp Biol.- 1985-39-63-93.

87. Naylor E. / Crab clocks rewound. // Chronobiol Int. -1997 14 - c.427-430.

88. Naylor E, Bergmann BM, Krauski K, et al. / The circadian clock mutation alters sleep homeostasis in the mouse. // J Neurosci. — 2000 20 - c. 81388143.

89. Nomura K, Shimizu T, Kinoh H, Sendai Y, Inomata M, Suzuki N. / Sea urchin hatching enzyme (envelysin): cDNA cloning and deprivation of protein substrate specificity by autolytic degradation. //Biochemistry 1997 - 36 - c. 7225-7238.

90. O'Sullivan CM, Liu SY, Karpinka JB. / Embryonic hatching enzyme strypsin/ISP 1 is expressed with ISP2 in endometrial glands during implantation // Mol Reprod Dev. 2002 - 62:328-334.

91. Okamura H, Yamaguchi S, Yagita K. / Molecular machinery of the circadian clock in mammals. // Cell Tissue Res 2002 - 309 - c. 47-56.

92. Okano T, Fukada Y. / Chicktacking pineal clock. // J Biochem (Tokyo) -2003- 134-c. 791-797.

93. Okano T, Sasaki M, Fukada Y. / Cloning of mouse BMAL2 and its daily expression profile in the suprachiasmatic nucleus: a remarkable acceleration of Bmal2 sequence divergence after Bmal gene duplication. // Neurosci Lett -2001 -300-c. 111-114.

94. Okano T, Yamamoto K, Okano K, et al. / Chicken pineal clock genes: implication of BMAL2 as a bidirectional regulator in circadian clock oscillation. // Genes Cells 2001 - 6 - c. 825-836.

95. O'Sullivan CM, Liu SY, Karpinka JB, Rancourt DE. / Embryonic hatching enzyme strypsin/ISPl is expressed with ISP2 in endometrial glands during implantation. // Mol Reprod Dev 2002 - 62 - c. 328-334.

96. Ozbudak EM, Thattai M, Kurtser I, Grossman AD, van Oudenaarden A. / Regulation of noise in the expression of a single gene. // Nat Genet 2002 - 31 - c. 69-73.

97. Page TL / Circadian rhythms of locomotor activity in cockroach nymphs: free running and entrainment. // J Biol Rhythms. 1990 - 5 - c. 273-289.

98. Piggins HD. / Human clock genes. // Ann Med 2002 - 34 - c. 394-400.

99. Palmer JD / Dueling hypotheses: circatidal versus circalunidian battle basics. // Chronobiol Int. 1997 - 14 - c. 337-346.

100. Palmer JD / Contributions made to chronobiology by studies of fiddler crab rhythms. // Chronobiol Int. 1995 - 8 - с. 110-130.

101. Pittendrigh C., Daan S. / A Functional analysis of circadian pacemakers in nocturnal rodents. // J. Сотр. Physiol. 1976 - 106 - c. 223 - 252.

102. Prodromou C, Pearl LH. / Structure and functional relationships of Hsp-90. // Curr Cancer Drug Targets 2003 - 3 - c. 301-323.

103. Rietveld WJ, Minors DS, Waterhouse JM / Circadian rhythms and masking: an overview// Chronobiol Int. 1993 - 10:306-312.

104. Ruden DM, Garfinkel MD, Sollars VE, Lu X. / Waddington's widget: Hsp-90 and the inheritance of acquired characters. // Semin Cell Dev Biol -2003- 14-c. 301-310.

105. Rudenskaia GN. / Brachyurins—serine collagenolytic enzymes from crabs. // Bioorg Khim 2003 - 29 - с. 117-128.

106. Rudenskaia GN, Isaev VA, Kalebina TS, et al. / Isolation of trypsin PC from the Kamchatka crab Paralithodes camtschatica and its properties. // Bioorg Khim 1998-24-c. 112-118.

107. Sahi C, Agarwal M, Reddy MK, Sopory SK, Grover A. / Isolation and expression analysis of salt stress-associated ESTs from contrasting ricecultivars using a PCR-based subtraction method. // Theor Appl Genet 2003 -106-c. 620-628.

108. Saigusa M. / Hatching controlled by the circatidal clock, and the role of the medulla terminalis in the optic peduncle of the eyestalk, in an estuarine crab Sesarma haematocheir. // J Exp Biol 2002 - 205 - c. 3487-3504.

109. Saigusa M, Iwasaki H. / Ovigerous-hair stripping substance (OHSS) in an estuarine crab: purification, preliminary characterization, and appearance of the activity in the developing embryos. // Biol Bull 1999 - 197 - с. 174-187.

110. Saigusa M, Terajima M. / Hatching of an estuarine crab, Sesarma haematocheir: from disappearance of the inner (E3) layer to rupture of the egg case. // J Exp Zool 2000 - 287 - c. 510-523.

111. Saigusa M, Terajima M, Yamamoto M. / Structure, formation, mechanical properties, and disposal of the embryo attachment system of an estuarine crab, Sesarma haematocheir. // Biol Bull 2002 - 203 - c. 289-306.

112. Sakharov I, Litvin FE, Artyukov AA. / Purification and characterization of two serine collagenolytic proteases from crab Paralithodes camtschatica. // Comp Biochem Physiol Biochem Mol Biol 1994 - 108 - c. 561-568.

113. Sangster ТА, Lindquist S, Queitsch C. / Under cover: causes, effects and implications of Hsp-90-mediated genetic capacitance. // Bioessays 2004 - 26 - c. 348-362.

114. Sawada H, Yamazaki K, Hoshi M. / Trypsin-like hatching protease from mouse embryos: evidence for the presence in culture medium and its enzymatic properties. // J Exp Zool 1990 - 254 - c. 83-87.

115. Scheving LA. / Biological clocks and the digestive system. // Gastroenterology 2000 - 119 - c. 536-549.

116. Schnaider T, Oikarinen J, Ishiwatari-Hayasaka H, Yahara I, Csermely P. / Interactions of Hsp-90 with histones and related peptides. // Life Sci 1999 -65-c. 2417-2426.

117. Schork NJ, Chakravarti A, Thiel B, et al. / Lack of association between a biallelic polymorphism in the adducin gene and blood pressure in whites and African Americans. // Am J Hypertens 2000 - 13 - c. 693-698.

118. Sellos D, Van Wormhoudt A. / Molecular cloning of a cDNA that encodes a serine protease with chymotryptic and collagenolytic activities in the hepatopancreas of the shrimp Penaeus vanameii (Crustacea, Decapoda). // FEBS Lett 1992 - 309 - c. 219-224.

119. Shaw PJ, Tononi G, Greenspan RJ, Robinson DF. / Stress response genes protect against lethal effects of sleep deprivation in Drosophila. // Nature -2002-417-c. 287-291.

120. Shearman LP, Weaver DR. / Distinct pharmacological mechanisms leading to c-fos gene expression in the fetal suprachiasmatic nucleus. // J Biol Rhythms 2001 - 16 - c. 531-540.

121. Shibata S. / Neural regulation of the hepatic Circadian rhythm. // Anat Rec 2004 - 280A - c. 901.

122. Shirasu N, Shimohigashi Y, Tominaga Y, Shimohigashi M. / Molecular cogs of the insect circadian clock. // Zoolog Sci 2003 - 20 - c. 947-955.

123. Shue G, Kohtz DS. / Structural and functional aspects of basic helix-loop-helix protein folding by heat-shock protein 90. // J Biol Chem 1994 - 269 - c. 2707-2711.

124. Slade JP, Man PS, Wells T, Carter DA. / Stimulus-specific induction of an Egr-1 transgene in rat brain. // Neuroreport 2002 - 13 - c. 671-674.

125. Smolen P, Baxter DA, Byrne JH. / Modeling transcriptional control in gene networks—methods, recent results, and future directions. // Bull Math Biol 2000 - 62 - c. 247-292.

126. Sollars V, Lu X, Xiao L, Wang X, Garfinkel MD, Ruden DM. / Evidence for an epigenetic mechanism by which Hsp-90 acts as a capacitor for morphological evolution. // Nat Genet 2003 - 33 - c. 70-74.

127. Somers DE. / Clock-associated genes in Arabidopsis: a family affair. // Philos Trans R Soc Lond В Biol Sci 2001 - 356 - c. 1745-1753.

128. Stehle JH, von Gall C, Korf HW. / Analysis of cell signalling in the rodent pineal gland deciphers regulators of dynamic transcription in neural/endocrine cells. // Eur J Neurosci 2001 - 14 - c. 1-9.

129. Stehle JH, von Gall C, Korf HW. / Melatonin: a clock-output, a clock-input. // J Neuroendocrinol 2003 - 15 - c. 383-389.

130. Takahata S, Ozaki T, Mimura J, Kikuchi Y, Sogawa K, Fujii-Kuriyama Y. / Transactivation mechanisms of mouse clock transcription factors, mClock and mArnt3. // Genes Cells 2000 - 5 - c. 739-747.

131. Tomioka K. (1993) Analysis of coupling between optic lobe circadian pacemakers in the cricket Grillus bimaniculatus. J.Comp.Physiol. 1993 — 172 - c.401-408.

132. Wever R.A. / Properties of human sleep-wake cycles: parameters of internally synchronized free-running rhythms. //Sleep. 1984 - 7(1) - c.27-51.

133. Winfree A.T. / The timing of biological clock. //N.Y., Sci.Amer.Lib -1983.

134. Winget C.M., Bond G.H., Rosenblatt L.S., Hetherington N.W., Higgins E.A., DeRoshia C. / Quantification of desynchronosis. // Chronobiologia. -1975-2(3)-c. 197-204.

135. Wirz-Justice A., Pringle C. (1987) / The non-entrained life of a young gentleman // Oxford Sleep 1987 - 10(1) - c. 57-61.

136. Yahara I: The role of HSP90 in evolution. Genes Cells 4:375-379, 1999

137. Yamagami K, Hamazaki TS, Yasumasu S, et al / Molecular and cellular basis of formation, hardening, and breakdown of the egg envelope in fish. / Int

138. Rev Cytol. 1992 - 136 - с. 51-92.

139. Yasumasu S, Iuchi I, Yamagami K. / Isolation and some properties of low choriolytic enzyme (LCE), a component of the hatching enzyme of the teleost, Oryzias latipes. // J. Biochem (Tokyo). 1989 - 105 - c. 212-218.

140. Yasumasu S, Iuchi I, Yamagami K. / Purification and partial characterization of high choriolytic enzyme (HCE), a component of the hatching enzyme of the teleost, Oryzias latipes. // J Biochem (Tokyo). 1989145- c.204-211.

141. Yasumasu S, Katow S, Hamazaki TS, et al. / Two constituent proteases of a teleostean hatching enzyme: concurrent syntheses and packaging in the same secretory granules in discrete arrangement. //Dev Biol. 1992-149- c. 349-356.

142. Yasumasu S, Katow S, Umino Y, et al. / A unique proteolytic action of HCE, a constituent protease of a fish hatching enzyme: tight binding to its natural substrate, egg envelope. // Biochem Biophys Res Commun. 1989 -162 -c.58-63.

143. Yasumasu S, Yamada K, Akasaka K, et al. / Isolation of cDNAs for LCE and HCE, two constituent proteases of the hatching enzyme of Oryzias latipes, and concurrent expression of their mRNAs during development.// Dev Biol. -1992- 153-c. 250-258.

144. Young AR, Mancuso N, Meeusen EN, et al. / Characterisation of proteases involved in egg hatching of the sheep blowfly, Lucilia cuprina. // Int J Parasitol. 2000 - 30 - c. 925-932, 2000.

145. Zimmerman V., Felder. D. / Reproductive biology of crabs Sesarma. // Mar. Biol. Ecol. 1991 - 391(4) - c. 314-321.