Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярные механизмы взаимодействия фенольных антиоксидантов со свободными радикалами липидов в мембранных системах

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярные механизмы взаимодействия фенольных антиоксидантов со свободными радикалами липидов в мембранных системах"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М. В. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи

УДК 577.16:577.161:577.352.334

БАУТИНА Анна Леонидовна

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ФЕНОЛЬНЫХ АНТИОКСИДАНТОВ СО СВОБОДНЫМИ РАДИКАЛАМИ ЛИПИДОВ В МЕМБРАНАХ

03.00.02 - биофизика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва —1990

Работа выполнена на кафедре биофизики Биологического факультета Московского Государственного университета

имени М.В.Ломоносова Научный руководитель - доктор биологических наук,

профессор И.И.Иванов Официальные оппоненты - доктор биологических наук

М.Н.Марзляк

кандидат биологических наук Ю.В.Архипенко Ведущее учреждение - 2-ой Московский медицинский

институт им. Н.И.Пирогова Защита диссертации состоится 1990г.

в Ж: часов на заседании Специализированного Совета К.053.05.68 по присуждению ученой степени кандидата наук по специальности "биофизика" в Московском Государственном университете юл.М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан * хээог.

Ученый секретарь Специализированного Совета К.053.05.68

кандидат биологических наук // Б.А.Гулиов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. Одним из фундаментальных процессов поражения клеточных мембран является перокисноо окисление ли-пидов (ПОЛ). В основе ПОЛ лежит высокая потенциальная склонность ненасыщенных липидов к окислительной деструкции. Под' держание реакций ПОЛ но низком стационарном уровне в нормально функционирувдих организмах определяется наличием целого ряда защитных систем и, в первую очередь, системой гидрофобных биоантиоксидантов (АО) из класса замещенных фенолов и их производных. Центральное место среди природных липидных АО занимают токоферолы (ТФ).

Интерпретация механизмов действия фенольных АО основана на представлениях об их действии в гомогенных жидкофазных системах, в основе которого лежит реакция АО с перекисными свободными радикалами (СР) углеводородов: ROj + inOH -» юон + + inO*(7). Эти представления оказались плодотворными при рассмотрении широкого круга явлений, протекающих в биомембранах при ПОЛ и при разработке принципов ого регулирования. Однако, при пароходе от гомогенных систем к мембранам необходимо учитывать специфику структурной организации мембраны, а также характер локализации АО в ной. Важной отличительной чертой ТФ является длинная боковая углеводородная цепь, которая обеспечивает им способность специфически встраиваться и ориентироваться в гидрофобной области липидного матрикса ( Ыавиоу et al.,1982, Brivaotava et al.,1983, Krin ot al.,1984, Perly et al.,1985, Aran da et al.,1989). При этом полярная фенольная часть молекулы АО локализуется на внешней границе углеводородного слоя мембраны. С этих позиций не ясно, каким образом преодолевается пространственная разобщенность липидных радикалов, возникающих в глубине углеводородной области бислоя, и активных ОН- груш ТФ. Следует отметить, что в настоящее время не получено надежного подтпэрждэния стехиометрии реакции прямого взаимодействия ROj и АО в мембранных системах в соответствии с реакцией (7); в ряде работ показано, что при торможении ПОЛ токоферолами гидроперекиси практически не обнаруживаются ( Bieri,Anderson, 1960, UiokH,Gebiolci,1981 , Yfcne-kei,1987, TakaheBhi ot al.,1989). Для сб'яснения этих фактов

продлокшш различные ворсии взаимодействия ТФ со CP в мембранах ( Barclay,Ingold.l981, Ivanov,1985)• Том не менее, «опрос о механизмах антирадикалыюго действия ТФ и других фе-нольных АО в мембранах все еще остается открытым и требует дальнейших экспериментальных исследований.

Принимая во внимание принципиальное значение взаимодейст-ствия ингибиторов окисления с первичными CP в мембранах клеток нормально функционирующих организмов, детальный анализ природы этих реакций и особенностей их протекания в гетерогенных системах представляет значительный интерес с теоретической и практической точек зрения.

Целью настоящей работы явилось исследование механизмов действия фенолышх АО в мембранных системах. Представлялось важным оценить вклад реакции взаимодействия перекисных радикалов липидов с молекулами АО (реакция 7) в их антиокислительный эффект в зависимости от структурной- организации липидов в системе. В работе решались следующие задачи:

- проанализировать стехиометрию между изменением содержания основных компонентов реакции ингибированного окисления липидов, а именно, накоплением гидроперекисей липидов, поглощением кислорода и убылью АО в течение индукционного триода;

- провести независимыми методами сравнительное исследование закономерностей и механизмов антиокислительного действия фенолышх АО в липидных системах, различающихся по характеру надмолекулярной организации - модельные мембраны (липосомы), мицеллы и гомогенные жидкофазные системы;

- изучить особенности ингибированного ПОЛ в условиях контролируемого инициирования с применением известных инициаторов с целью детального анализа взаимодействия фонолышх АО со свободными радикалами инициаторов в мембранных системах.

Научная новизна работы. Сравнительный анализ липидных систем, различающихся уровнем гетерогенности, позволил установить, что вклад реакции взаимодействия фенолышх АО с пере-кисными радикалами липидов в антиокислительный эффект существенно зависит от структурной организации липидов. В отличие от гомогенных систем, где эта реакция явллэтея основной, в гетерогенных липидных системах, в том числе и модельных мембранах, стехиометрия расходования АО, накопления гидропэрега-сой липидов и потребления кислорода, соответствующая реакция

(7) , не выполняется. Применение химических инициаторов раз. личной структуры и исследование свободно-радикальных процессов в аэробных и ана&робных условиях позволило установить, что ингибирование окислительного процесса в мембрашшх системах фенольными АО происходит преимущественно в результате их взаимодействия с радикалами инициатора со свободной валент ностью на атоме кислорода. Используемые АО слабо реагируют со свободными радикалами с активным центром на атома углерода. Совокупность полученных данных свидетельствует о том, что в основа ингибирувдего действия фенольных АО в мембранах лежит их способность взаимодействовать с низкомолекулярними радикалами инициатора, которые могут легко перемещаться диффузионным путем по всей толще липидного бислоя. Предлагаемый механизм снимает вопрос о пространственной разобщенности реагирующих центров при ингибировании ПОЛ природными АО. Эти представления дают простое объяснение близкой антиокислительной эффективности ТФ и его короткоцепочечного производного • пентаметилхромана в мембранах.

Практическая ценность. Результаты проведенных исследований расширяют наши представления об особенностях ингибирова-ния окисления липидов в мембранных системах, что важно при разработка принципов регулирования ПОЛ в биомембранах и их стабилизации при различного рода неблагоприятных воздействиях. Полученные результаты позволяют глубже понять природу патологических состояний, связанных с интенсификацией ПОЛ при недостатке витамина Е в тканях и наметить новыо методы их предотвращения. Понимание•механизмов антирадикалыгого действия наиболее сильных фенольных АО в мембранах представляет интерес при разработке рекомендаций для направленного синтеза и подбора аффективных ингибиторов ПОЛ.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на пх и хх конференциях молодых ученых Биологического факультета МГУ ( Москва, 1988,1989), на 10 объединенном симпозиуме биохимических обществ СССР - ГДР ( Ташкент, 1989), на научном семинаре по биофизике мембран кафедры биофизики Биологического факультета МГУ.

Публикации. По теме диссертации опубликовано шесть печатных работ.

Структура диссертации. Диссертация состоит из всодвния,

обзора литературы, описания материалов и методов исследования, розультатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДУ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В работе использовали с1,1.,а-токофорол ("Serva", "Merok"), 2,2,Ь,7,8-понтамо тил-6-гидроксихроман (ПМХ)("Serva"), 2,6-ди-трет-бутил-4-мэтилфенол (ионол)("Reanal"), а-токоферилацетат ("Serva"), убшеинон СЦ0 ("Serva"), витамин Kg ("Sigma"), диме-ристоилфосфатидилхолин (ДМФХ) ("Sigma"), дикаин ("Serva"); осталыше реактивы квалификации не ниже ч.д.а. Органические растворители очищали перегонкой.

Яичный фосфатидилхолин (ЯФХ) получали модифицированным методом его осаждения в виде комплекса с CdClg ( Pangbona,1951). Многослойные липосомы и мицеллы формировали обычным способом, смотивая ЯФХ, наносетшй на стенки ферментной колбы, с нужным количеством 40 мМ Трис-(оксиметил)-аминометанмалат NaOH буфера или Triton х-100 ("Sigma"), соответственно. Липосомы с восстановленными убихиноном Q10 и витамином Й3 формировали в атмосфера аргона. Для модификации липосом или мицелл к раствору липида в етаноло добавляли растворы модификаторов в необходимых количествах. Для создания анаэробных условий липосомы переносили в трубку Тумберга и проводили пятикратно процедуру замораживания- откачивания воздуха- оттаивания.

Инициирование ПОЛ проводили: I. при повышенной температуре (ввтоокисленив), 2. введением химических инициаторов -азодиизобутилонитрила (АИБН) и дициклогексилпероксидикарбона-та (ДГПК), 3. УФ-облучением (осветитель 0И-18А, лампа СВД-120), 4. добавлением солей железа.

Скорость развития ПОЛ оценивали спектрофотометрически по накоплении гидроперекисей с сопряженными двойными связями (ГПСС) (Л^акд» 236 ш) или малонового диальдэгида, реагирующего с тиобарбитуровой кислотой с образованием окрашенного комплекса (А1лакс ■= Б35 нм), полярографически по определении изменения концентрации 02 в системе ( электрод lOiapita, потеп-циал полуволны 0,6 в) и регистрацией высокотемпературной тер-молшиносцонции хлорофилла при ПОЛ.

Экстракцию липидои га липосом осуществляла по методу Фол-ча ( Poloh et al.,1957) или гексаном ( Fukuzawa et.al.,1982).

Омыление липидов проводили по методу Тосика- Uypa (Tosio,lío-ore, 1945). Концентрацию ТФ илп ПМХ определяли по их флуоресценции (ХВ03б>= 290 нм, ^флуор.^30 "м) или Fe3+- дипириди-ловым методом (Воуег,1951).

Гель-фильтрацию продуктов окисления ЯФХ и АО осуществляли на колонке 1x100 см, наполненной Сефадексоы Ш-20 ("Pharma ia Pine OhemioeüB"), элюант - хлороформ:этанол- 1:1 (по объему).

Тонкослойную хроматографию (ТСХ) осуществляли на пластинках "Siluíol". Разделение продуктов деградации ТФ проводили в хлороформе, ТСХ производных ЯФХ - в системе хлороформ:метанол: вода » бб:2Б:4 (по объему).

Калориметрические измерения проводили о использованием дифференциального сканирующего микрокалориметра ДАСМ-1Ы.

Спектры поглощения регистрировались на спектрофотометрах "Hitaohi-557" и "Speoord UV-vis". Флуоресцентные измерения проводили на спектрофлуориметрах "Hitaohi-850H и ИИРР-2А".

В необходимых случаях результаты вкспериматров обрабатывали статистически ( Плохинский,1980).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

I. Прженение метода дифференциальной сканируидей микрокалориметрии (ДСК) для оценки локализации гидрофобных соединений в мембранах.

При изучении механизмов действия лнпотропных соединений в мембранах ваано иметь сведения об их локализации в линидном бислое. Использование независимых (физических а химических методов - ЯМР, ПК-спектроскопии, поляризации флуоресценции, флуо-риметрин и др.- позволило получить ряд данных об ориентации ТФ в бислойных структурах, однако вопрос о локализации этого АО в мембранах продолжает оставаться темой оживленной научной дискуссии. В последнее время для изучения располсжзния лкпо-тропных соединений в мембранах и их взаимодействия с липида-1Я1 наиел применение «ЭТОД ДСК ( Наввеу et.al.,19B2, ErivaBta-va et al., 1983), который in и использовал:! в нсаой работо для получения дополнительной информации о локализации гидрофобии* АО'в мембрашых систомах. В этих окспержаптах было исследовано влияние на фазовый переход (ОТ) ДОЯС ряда природных и синтетических гидрофобных соединений. В опытах использоизли

а-ТФ, а-ТФ-вцотат, убихинон <310, убихинол Q10, ионол, окисленный и восстановленный витамин Kg, и дикаин. Сведения, полученные в последнее время, позволяют предполагать, что локальный анестетик прокаинового ряда дикаин локализуется преимущественно d зоне полярных головок лишда (O'Leary.1984). Действительно, данные ДСК показали, что с увеличением концентрации дика-ина в многослойных липосомах из ДМФХ t° плавления липида уменьшается (Atç 7,Б°С), тогда как кооперативность перехода существенно не изменяется. В отличив от этого, гидрофобные коротко-цепочечные незаряженные соединения - ионол, хинон и хинол Кд-практически не изменяют температуру ФП ДМФХ в мембранах. С ростом концентрации этих соединений в липосомах наблюдается уменьшение АН и уширенио пика плавления липида. Однако, эти эффекты проявляются лишь при достаточно высоких количествах встроенных в липосомы веществ ( соотношение липид:соединение-» 10:1 (М/М) и ниже). Включение в мембраны длинноцепочечных модификаторов, в том числе и ТФ, приводит к резкому уменьшению. АН и уширению лика плавления лшшда уке при соотношении липид:АО = 80:1, при атом t° ФП практически не изменяется.

Полученные результаты позволяют считать, что слабое действие короткоцепочечных гидрофобных соединений на ФП липида свя-. зано, по-видимому, с незначительным нарушением ван-дер-вааль-сового взаимодействия между жирнокислотными остатками ДМФХ. Вероятно, это обусловлено "вытеснением" этих соединений из углеводородной зоны мембраны при температурах ниже точки плавления ФЛ. Напротив, сильное пертурбирувдее действие ТФ обусловлено тем, что его боковой углеводородный "хвост" размещается вдоль кирнокислотных остатков липидных молекул при температурах как выше, так и ниже точки фазового перехода.

Таким образом, полученные данные являются дополнительным аргументом в пользу того, что молекула природного АО ТФ располагается в мембранах подобно молекулам ФЛ, и при его инги-бирунцем действии в мембранных системах возникает вопрос о • преодолении пространственной равобщенности между активной гид-роксилыюй группой ТФ и лгашдныма свободными радикалами.

II. Действие фенольных АО в гомогенных системах.

Существующие представления о закономерностях ПОЛ и механизмах ого ингибирэвапЕЛ детально разработатш для зквдкофазних ли-

пидных систем. В соответствии с реакцией (7) , лекащой в основе ингибирувдого эффекта внтиоксидантов в растворе, в теченио периода индукции окисления лшшдов следует ожидать образования гидропорекисей в количестве, близком к количеству израсходованного АО. В связи с этим, на следупдом этапо работы на примере перекисного окисления липидов в гомогенном растворг. с помощью набора доступных методов мы изучили стехиометрию между изменением концентраций основных компонентов ингибирован-ного окисления - ГПСС, АО и 02 - в течение т^д . В предварительных экспериментах показано, что наиболее четкие результаты были получены при использовании в качестве инициаторов АИБН и ДГПК. Добавление этих соединений в раствор лецитина вызывало ускорение накопления ГПСС или поглощения кислорода ^инкуб.=Б0°с в опы™ с ДГПК и 6б°с в опытах с АИБН). При инициированном 225 мкЫ ДГПК или 300 мкМ АИБН скисле1ши 10 мМ лецитина в гептане 60 мкМ ТФ, ПМХ или ионола вызывают появление хорошо выраженных периодов индукции . По окончании ^ипд скорость накопления ГПСС не отличается от таковой в отсутствии ингибиторов. При использовании в качестве АО юнола, количество накопившихся к концу индукционного периода ГПСС примерно в 1,6 раза правыиало начальную концентрацию АО в растворе. Полученное соотношение А[ГПСС]/Д[ионол] за время периода индукции удовлетворительно согласуется со стехиометрией реакции (7) и данными, известными из литературы по жидкофазному окислению углеводородов. В течение периода индукции, возникающего при добавлении к субстрату окисления ТФ или ПМХ, гидроперекиси липида накапливаются в несколько меньшем количества (°< 20-25 мкМ), чем количество израсходованного АО 45 мкМ). Подобная закономерность наблюдалась и в этаноле. Важно отметить, что ТФ, ПМХ и ионол ( [АО]«60 мкМ ) вызывали появление почти одинаковых по длительности порюдов индукции окисления ЯФХ в растворе: в случав ДГПК- инициированного окисления тщ)д был равен примерно 75 мин., при АИБН- инициированном ПОЛ - <* 4 часам. Аналогичные закономерности получоны в работе (Niki et al.,1985).

Представленные результаты свидетельствуют о том, что антц-окислительное действие исследуемых фонолышх АО в гомогенных жидкофазных системах реализуется главным образом чероз реакцию прямого взаимодействия АО с порокнгашми радикалами липи-

дов. Некоторое отклонение соотношения А[ГПСС]/А[А0] в 1,,,.,. от стехиометрии реакции (7) для ТФ и ПЫХ, на наш взгляд, может быть связано с частичным расходованием этих АО по другим путям, например, через взаимодействие с активными CP инициаторов. Принципиальная возможность такой реакции в жидкофазных системах показана на примере ускоренной убыли ТФ в бутаноле в присутствии ДГПК или АИБН (t= ББ°С) по сравнению с контролем.

III. Инициированное окисление мицелл из ЯФХ в присутствии фвнолышх АО.

В следупцом разделе работы мы попытались проанализировать, сохраняется ли соотношение скоростей накопления гидроперекисей и расходования АО, наблюдаемое в гомогенных системах, в индукционном периоде окисления липидов в модельных гетерогенных лигшдных системах - мицеллах. В качестве детергента при приготовлении мицелл из лецитина и АО использовали 10 мМ Triton х-100. Triton х-100 обладает сильным поглощением в коротком ультрафиолоте, что затрудняет определение ГПСС в такой системе. Наблюдение за окислительным процессом в мицеллах проводили по определению содержания 02 в системе. ПОЛ инициировали добавлением ДГПК или АИБН.

При ДГПК- инициированном окислении лецитина в мицеллах ([лец.]= 10 мМ, t =Б0°С) в течение периода индукции, вызванного 60 мкМ ТФ или ПЫХ, потребления 02 системой практически не происходит. Изменение концентрации ДГПК от 0,365 мМ до 0,73 мМ сказывалось только на длине индукционного периода. Мицеллы, содержащие ионол ([ион.]от 8 до 25 мкМ), дают иную картину потребления Og в ходе инициированного ДГПК окисления: в течение периода индукции снижение количества 02 в системе идет со значительной скорость®, которая, в свою очередь, зависит от концентрации ионола или ДГПК в мицеллах ([ДГПК] изменяли от 0,365 до 0,73 мМ). В отличив от этого, в случае АИБН- инициированного окисления мицелл ( [лец.]= 2 мЫ,1АИБН]= = 7 мМ, t=60°C) наблюдается потребление системой кислорода в тсчениэ периода индукции, обусловленного дэбым из исследованных феполышх АО. Поглощение 02 в Тщщ в присутствии ТФ или Ш.К мокло объяснить присоединением 02 к влкялъному радикалу из АИБН ( 14 02 i02■)(роакция 0). Судя по продолжительности периодов индукции, в мицеллах ТФ и ПЫХ проявляют близкую

антиоксидантную активность ( тиад « 10 щш. при [А0] = 60 нкМ, [ДГПК]= 0,54 мМ; т^дд^ 25 мин. при 1А0]= 16 мкМ, [АШШ]= 7 мМ). Ионол тормозит окислительный процесс в точение более длительного времени, чем хроманольные АО ( тивд 32 мин. при [ион. ]= 8 мкЫ, [ДГПК]= 0,54 №; 36 мин. при [ион. ]= 10

мкЫ, [АИЕН]= 7 мМ).

Таким образом, изучение стехиометрии Д[021: Д[АО] показало, что, в отличие от гомогенных систем, уже в мицеллах механизм действия АО не укладывается в принятую схему реакций ин-гибированного жидкофазного окисления углеводородов.

IV. Изучение механизмов взаимодействия фвнольных АО со СР в модельных мембранах.

Следующим этапом нашей работы явилось выяснение особенностей ингибированного фенольныки АО окисления ливддов и, в первую очередь, справедливости реакции (7) в наиболее простых мембранных системах. Для этого мы использовали многослойные липосомы (ЛС) из ЯФХ.

I. Автокаталитический режим окисления.

Модификация лилосом из лецитина токоферолом или пентаме-тилхрсманом ([лац.]= 2,85мМ, [А0]= 26 1= Б0°С) вызывала сильное подавление окислительного процесса ( 7 час.),

причем скорость расходования АО в т:ш!Д_, измеренная по их флуоресценции, в несколько раз превосходила скорость накопления ГПСС. Анализ результатов автоокисления липосом из ЯФХ и фэ-нольных АО показывает, что наблюдаемое в индукционном периоде соотношение А[ГПСС] / А[АО] сильно варьировало в зависимости от концентраций АО и лецитина в системе, от степени окислен-ности липида и изменялось от 0,28 до 0,14, что значительно" меньше соотношения, соответствующего реакции (7). В некоторых случаях, например, при модификации липосом ПМХ ([ПМХ]= 25 исМ) к концу индукционного периода накопления ГПСС вообще обнаружить не удалось. Скорость убыли ТФ и ПМХ в одинаковых условиях и длительность обусловленных ими периодов швдчсщга незначительно отличались друг от друга, что указывает на близкую антиокислительную способность этих АО в мембранах.

' Одним из недостатков автокаталиткческого ранима окисления является невозможность контролировать скорость генерации пор-вичных СР и их природу. В связи с этим, в дальнейших исслэдо-

нпниях мы проводили окисление ЛС в условиях контролируемого инициирования с использованием химических инициаторов ДГГПС и /'.ИБП.

2. Инициированное окисление липосом в присутствии АО.

I) ДГПК- зависимое окисление линосом.

о) определение скорости ПОЛ по накоплению ГГГСС.

При проведении окисления в условиях контролируемого инициирования ми использовали АИБН и ДГПК в концентрациях, для которых распад инициатором (1) подчиняется уравнению 1-го порядка, и справедлив кинетический закон неингибировашого окисления ( сЦГПСС]/ сИ~У Ш ). Характерные кинатичекие кривые окисления лвцитинр и убыли АО в липосомах в присутствии ДГПК представлены на рис. I. В точение г^ ГПСО практически не накапливаются в системе и только после того, как АО израсходуется, начинается развитие окислительного процесса. Это свидетельствует о том, что при инициированном окислении липидов п мембранных системах скорости расходования АО и накопления ГПСО в индукционном периоде не подчиняются стехиометрии реакции (7) ( рис. I и табл. I). Как и в случае автоокисления.

Рис. I. Накопление ГПСС (I, 11,111,71) и убыль АО (IV,V) при инициированном 40 мкМ ДГПК ПОЛ липосом при Б0°С, [лец.)« -2,6 мМ, [А0]= 12 мкМ: I- без АО, II, IV- ТФ, III,V- ПМХ, VI- ионол.

скорость расходования ТФ и ПЫХ и длительность вызываемых ими

периодов индукции близки. Длительность индукционного периода

10 ■

0,5 ¿[ГПСС] мкМ

10

t,4ac.

к/.

2 4 6 t,4ac.

I

при окислении ЛС со встроенным ионолом значительно больше, чем в случае ТФ и ПМХ при равных концентрациях антиоксидантов. Такое различие эффективности АО проявлялось при использовании разных препаратов ТФ ( "Ыегок" и "Serva") и ионола ( "Reanal" и "Реахим"). Отметим, что при малых концентрациях ионола ([ион.]й 3 мкМ) количества образующихся ГПСС и израсходованного АО в течение приближаются к стехиометрии реакции (7).

Таблица I. Окисление липосом из ЯФХ и фенольного АО в присутствии ДГПК при Б0°0.

[лец.] мЫ АО [АО] ыкМ [ДГПК] мкЫ аинд. час. A[ROOH]/A[AO] за,синд.

2,85 ТФ 26 80 I 0:26

2,85 ПМХ 26 80 I 0:26

15 ТФ 115 160 I 8:105

2.6 • ТФ 12,8 40 1.5 0:10

2.6 пых 12,8 40 1.5 0:12,8

2.6 ионол 12.8 40 6 1:12,8

При ДГПК- инициированном окислении липосом, модифицированных ТФ или ПЫХ, в течение периода индукции наблюдалось возрастание поглощения в области 260-270 нн. Регистрируемый спектр имел форму дуплета ( 262 и 267 ны), характерного для хинонов этих хроманольных АО. Сопоставление количеств израсходованных АО, измеренных по их флуоресценции, с количествами образовавшихся соответствующих хинонов, рассчитанных по поглощению с использованием б» 1ББОО.( Мерзляк,1972), показало-, что в присутствии ДГПК от 60 до 1002 ТФ или ПМХ в индасцион-ном периоде трансформируется в ТФ-хинон или ПМХ-хинон, соответственно. Подобное увеличение поглощения при 260-270 им в Тууд наблюдалось и в ряде опытов в случае автоокисления модифицированных ТФ или ПМХ липосом. В отличив от этого, в гомогенной системе в течение периода индукции окисления лецитина в присутствии ТФ или ПМХ поглощение реакционной смоси при 265 нм практически не изменяется ни в режиме автоокисления, ни при добавлении инициаторов.

б) Определение скорости ПОЛ по поглощению системой О,,.

Вагаая информация о взаимодействии фонольных АО со СР при ИОЛ в мембранах была получена при регистрации скорости поглощения кислорода в реакционной системе. Достоинствами использованного в этой серии окспериментов полярографического метода является возможность напрямую определять концентрацию кислорода в небольших объемах образца с высокой чувствительностью.

Типичные кривые поглощения кислорода при добавлении ДГПК к лгагосомам, инкубируемым при Б0°С, представлены на рис.2.

Рис. 2. Поглощение 02 в липо-сомах из лецитина (15 мМ) без АО (I) и в присутствии ПМХ (II), ТФ (III) или ионола (iv,v) при добавлении 200 мкМ ДГПК (t=60°0). Момент добавления ДГПК указан стрелкой. LAW» 12 ж М

Встраивание в липосомы фенольных АО вызывало появление хорошо выраженного периода индукции, в течение которого не наблюдалось поглощения 02, но шло быстрое расходование АО. Длительность периода индукции зависела от концентрации АО в ли-посомах и была практически одинаковой в случае ТФ и его ко-роткоцепочечного производного ПЫХ. Отсутствие потребления шюлорода в индукционном периоде ДГПК- инициированного окисления лецитина в ЛО является аргументом против образования и последующего развала ROOH в т^д и свидетельствует о том, что образующиеся в ходе периода индукции СР перехватываются АО правде, чем они успеют прореагировать с кислородом.

Встраивание в ЛС понола в близких концентрациях также подавляло поглощенно 02, однако в этой случае длительность периода индукции была примерно в 5 раз больше,' чем в присутствии ТФ пли ПМХ (рис 2). Прз снявошш концентрации ионола в система до 2,25 мкЫ , когда индукционный период сокращался до~ 25 мин., наблюдалось заметное потребление кислорода в Тщщ,; по

окончании периода индукции поглощение Og ускорялось. Аналогичное снижение концентрации ТФ в ЛС вело лишь к укорочению т)Ц1Д в теченио которого не наблюдалось расходования кислорода.

Следует подчеркнуть, что длительность в присутствии АО, длина кинетической цепи неингибированного окисления и вклад инициатора в развитие процесса ПОЛ, полученные из результатов измерения количества израсходованного Og или накопления ГПСС в системе, были практически одинаковы.

2) АИБН- зависимое окисление липосом.

Из-за низкого значения kd для АИБН и слабого растворения его в лецитиновом бислов ( Barclay, ingold, 1981), эксперименты по АИБН- индуцированному окислению ЛС из ЯФХ проводили при t° инкубации 60°С и высокой концентрации инициатора. Несмотря на нарушение целостности липосомальнза мембран при такой температуре, в них сохраняется ламеллярная структура (Shipley,1973).

Встраивание в липосомы ТФ или ПМХ вызывало появление индукционного периода в АИБН- индуцированном окислении ЯФХ, длительность которого была практически одинаковой при равных концентрациях АО. Как и при ДГПК- зависимом ПОЛ, в случае АИБН-иницнированного окисления лецитина в мембранах в теченио периода индукции на фоне почти полного расходования АО накопление ГПСС было очень незначительным, либо вообще отсутствовало ( рис.3)

20

10

Рис. 3. Накопление ГПСС (1,11) и убнль АО (III,IV) при инициированном 7,3 мМ АИБН ПОЛ липосом в присутствии ТФ (I, III) или ПМХ (II, IY) при 60°С: [лэц. ]= 2 [А0]~ - 25 Mifi.

30 t.rctn.

Отличием АИЕН-индуцированного окисления ЯФХ в мембранах

от ДШК- иедуцировшшого явилось поглощенно кислорода в течение периода индукции. Отсутствие при этом накопления ГПСС свидетельствует в пользу того, что потребление кислорода в индукционном периода обусловлено присоединением 02 к диметил-цианматильным радикалам инициатора ( 1" + о2 •* (О)) с последупцим перехватом этих радикалов молекулой АО ( + + 1пОН ). Количественное сопоставление возможных скоростей реакций (О) и ( 1" + 1пОН - ) с учетом концентраций реагирующих компонентов и констант их взаимодействия позволяет заключить, что реакция присоединения кислорода к инициирующему радикалу 1" протекает примерно на два порядка быстрее, чем взаимодействие 1* с ингибитором окисления. Дополнительным аргументом в пользу предположения о том, что поглощение системой 02 в гш1д обусловлено реакцией (О), является равенство скорости потребления 02 при ингибированном ТФ (или ПМХ) окислении ЛС в присутствии АИБН ( <Ц02]/<П ~ о,4а мкМ/мин.) и рассчитанной скорости образования инициирующих радикалов ( - 2екй[АКБН]0 « 0,49 мкМ/мин., где значение е, полученное в эксперименте, равно 0,054).

Важно подчеркнуть, что при модификации ЛС из лецитина невысокими концентрациями ионола ($10 мкЫ) в течение индукционного периода АИБН-эависимого ПОЛ происходит накопление гидроперекисей липида. К концу т^д количество образовавшихся ГПСС почти в 2 раза превышало начальную концентрацию ионо-ла в системе, что согласуется с представлениями о прямом взаимодействии Хпон с перекисными липидными радикалами. При этом в присутствии ионола в течении Тщ^ скорость потребления 02 существенно выше, чем в присутствии ТФ или ПМХ, что, вероятно, отражает суммарный вклад двух процессов - присоединения 02 к 1' (роакция 0) и к И' с образованием (реакция I). Как при ДГПК-зависимом ПОЛ, при АИШ- инициированном 01шсленш липосом из лецитина длительность периода индукции в присутствии ионола в несколько раз больше, чем в опытах с ТФ или ПМХ при равных концентрациях АО в система.

Таким образом, данные по ингибированному окислению ДГПК-иницииров.шшого окисления липосом и по АИШ-зависимому ПОЛ мембран в присутствии ТФ или ПМХ , ставят под сомнение протекание реакции + 1пОН -> иоон.+ 1п0" (7) как определящей антирадикальное действие фенолышх АО в мембранах. Совокуп-

ность представленных результатов допускает две возможности реализации ингибиругацего действия антиоксидантов в мембранах: взаимодействие с радикалами инициатора либо перехват неокис-ленных радикалов липида И"( до присоединения кислорода).Однако, последняя возможность, на наш взгляд, сомнительна, так как в ПНЖК радикал к* существует преимущественна в виде ал-лильного радикала и его взаимодействие с АО должно сопровождаться образованием коныпгированных диенов в виде пеперекис-ных изомеров ЖК. Экспериментальные же результаты, представленные выше, указывают на отсутствие возрастания поглощения при 235 нм в течение периода индукции при инициированном окислении модельных мембран. Тем не менее, нам представлялось важным провести дополнительную проверку возможности взаимодействия фонолышх АО с бескислородными радикалами. Для этого была проделана сер!я экспериментов по изучению действия АО в .анаэробных условиях.

3. Изучение антирадикального действия фенолышх АО в мембранах в анаэробных условиях.

Принципиально важным при исследовании свободно-радикальных процессов в мембранах в присутствии АО в анаэробных условиях явилось использование двух химических инициаторов - АИБН и ДГПК, различающихся тем, что термоиндуцированное разложение ДГПК приводит к образованию радикалов с неспаренной валентностью на атоме кислорода ( Ю"» ц-С6Н110>), а распад АИБН. сопрововдается появлением первичных радикалов с неспаренной валентностью на атоме углерода ( (СНд^СССЮ). При анаэробной инкубации липосом из ЯФХ в присутствии АИБН наблюдается накопление сопряженных диеновых группировок в липиде. При добавлении АО к этим системам скорость возрастания поглощения при 235 нм не изменяется ( рис.4), то есть АО оказывается не эффективен как ингибитор этого процессв. Напротив, в случае, если цепной процесс инициируется ДГПК, добавление АО в лкпосомы снижает скорость образования сопряженных диеновых группировок, вероятно, за счет перехвата первичного свободного радикала инициатора Ю".

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о тем, что я мембранных системах последуеииа финальные АО не перехватывают ОР со свободной валентностью на атоме углерода, будт. то алкали ишпп»пторп пля липтдо. Если от свободто-ра-

дикальное состояние локализовано на кислороде (10"), хрома-нольные АО проявляют высокую антирадикальную активность.

Рис.4. Увеличение поглощения света с 235 нм при анаэробной инкубации липосом из лецитина (2 мМ) без ¿0 (I) и с ТФ (11,1X1) в присутствии 7,3 мМ АИБН (А) или 50 мкМ ДГПК (В) при 60°С: 11-[ТФ}- 20 мкЫ, Ш-[ТФ]- 30 мкМ.

При инкубации липосом из ЯФХ в анаэробных условиях (1;«50оС, [лец.]= 4 мМ) нами было обнаружено увеличение флуоресценции образца в области 390-400 нм при ^^ « 320 нм. С поккздью экстракции липидов из ЛО методом Фолча или гексаном показано, что рост флуоресценции наблюдался в неполярной лштд-со-держащэй фазе. Для-выяснения природы флуоресцирующего продукта с помощью метода колоночной хроматографии на Сефадексе ЬН-20 мы проводи разделение продуктов анаэробного прекращения ' ЯФХ в мембранах. Результаты гель-фильтрации лшшдного экстракта из ЛС после их анаэробной инкубации показали, что объемы выхода образующихся флуоресцирующих продуктов (24-26 мл) меньше, чем у лецитина (28-30 мл) и близки к объемам выхода высокомолекулярного полиэтиленгликоля 4000 (23-25 мл). Это свидетельствует о том, что при инкубации ЛО из ЯФХ' в услониях полного отсутствия кислорода протекают процессы полимеризации лшшда.

Встраивание в липосомы одного из. исследованных АО - ТФ, ПМХ или ионола в концентрации 106 мкЫ ([лец.]-Л4 мМ, 1;-5б0С)

нэ оказывало аамэтного ингибирующего действия на накопление флуоресцирующих высокомолекулярных продуктов лецитина. Эти данные указывают на то, что фенолыше АО не влияют на процессы полимеризации липида в мембранах в анаэробных условиях. Аналогичные результаты об отсутствии влияния эффективных ингибиторов ПОЛ на процессы термической и инициированной полимеризации различных мономеров в анаэробных условиях были получены ранее Долгоплоском ( Долгоплоск,Тинякова,1982).

Анализ представленных данных позволяет выделить несколько особенностей функционирования фонолышх АО в гетерогенных структурированных системах. Важным отличием действия феноль-ных АО в гетерогенных системах по сравнению с раствором является более низкая эффективность антиокислительного действия № и ШХ по сравнению с ионолом. Мы попытались щюаааш-зировать возможные причины этого. На основании показанного в эксперименте отсутствия влияния хелатора железа NaKO^H^Og на окисление липосом с ТФ, вклад реакции восстановления 6-ос-сихромапами примесных ионов железа (III) в ускоренную убыль АО был исключен. Этот результат свидетельствует также о малой вероятности железо- катализируемого распада гидроперекисей в тгад окисления ЛС в присутствии ТФ или ШХ ( ПраЙор,1979). Можно было бы допустить, что меньшая эффективность действия ТФ (ПМХ) по сравнению с ионолом в липосомах связана с взаимодействием 6-оксихроманов о липопероксидами ( Бакалова и др., 1988). Однако, изменение концентрации гидроперекисей в исходном лецитине от 0,65 молЖ до 10 молЖ нэ оказывало заметного влияния на скорость расходования АО в периоде индукции. Этот факт позволяет пренебречь роакцией между ТФ (или ПМХ) и ROOH в мембразпшх системах. Для интерпретации наблюдаемого снижения антиокислительной эффективности ТФ и ПМХ по сравнению о ионолом, по-видимому, следует исходить из того, что радикалы, образующиеся из этих АО могут различаться по их способности вступать в реакции продолгения цепи ( Бурлакова и др.,1975).

Отсутствие поглощения 02 л нгксплэнип ГПСС в ^^ ДГПК-гсппттарпвр'гтсго окисления лотосом а мицелл из ЯОХ, а также отсутствие накопления ГПСС в при АИВН-аависнмсм ПОЛ в

присутствии ТФ или ПМХ, ставит под сомнение протекание реак-

ции ROg + inOH -> rooh + inO" (7) как определяющей скорость расходования АО. Поглощение кислорода в периоде индукции АИБН- инициированного окисления липосом или мицелл в присутствии ТФ (ПЫХ) указывает на то, что присоединение 02 к радикалам, образующимся из диазонитрила, предшествует реакции инактивации CP токоферолом или ПМХ. Неспособность АО тормозить образование сопряженных диенов при инкубации ЛС в анаэробных условиях в присутствии АИБН и отсутствие влияния фенольных АО ва процессы термической полимеризации ЯФХ при анаэробной инкубации липосом позволяют считать, что ингибирование ТФ (или ПЫХ) СОЛ в мембранах не связано с протеканием реакции между АО и CP с неопаренной валентностью на атоме углерода . Таким образом, можно считать, что ингибирование хроыанольными АО инициированного ПОЛ в исследованных гетерогенных липидтах системах происходит преимущественно в результате их взаимодействия с радикалами инициатора со свободной валентностью на кислороде.

Особых комментариев заслуживают результаты, полученные при ионол- ингибированном окислении ЯФХ в гетерогенных системах. Отсутствие накопления ПЮС и поглощения 02 в Хщ^ при ДГПК-зависимом окислении, вероятно, можно рассматривать как аргумент, свидетельствующий об инактивации ионолом радикалов U-CgHjjO' инициатора ДГПК. С другой стороны, значительное накопление ГПСС в tj^ при ПОЛ в ЛС в присутствии АИБН и поглощеше 02 в периоде индукции в случае ДГПК-зависимого окисления ЯФХ в мицеллах свидетельствует о возможном взаимодействии ионола с ROj по реакции (7). Механизм ингибиро-вания, по- видимому, определяется целым рядом причин - соотношением констант радикальных реакций, концентраций реаги- ' рупцих компонентов в системе, их диффузионной подвижностью. Количественное сопоставление скоростей реакций ( io* + RH -*) и ( 10" + ионол -О в мембранах с использованием известных из литературы констант ( Barclay et.al.1989) показало, что преимущественное протекание одной из втих реакций зависит от соотношения количеств АО и ЯФХ в системе. Подобная зависимость наблюдалась и в нашем эксперименте в случае ДГПК- инициированного ПОЛ в липосомах.

Таким образом, полученные данные позволяют предложить общую схему ингибированного фенольными АО ПОЛ в мембранах:'

ионол

ионол

АИБН - iV^Oo 1

'о

н- + 02

—- под

—- ГПСС

ДГПК

ТФ (ПМХ)

Согласно данной схема, в основе ингибирупцв1ч> действия фе-нолышх АО в мембранах лежит их способность взаимодействовать с низкомолекулярными радикалами инициатора, которые могут легко перемещаться диффузионным путем по всей толще липидного би-слоя. Такой механизм снимает давно обсуждаемый в литературе вопрос о пространственной разобщенности реагирующих центров при ингггбированга НОЛ природными липпдннми АО. Отметим, что предложенная схема действия фенольных АО, в принципе, не от- • рицает и возможность реализации прямого взаимодействия ОН-группн АО и ROg, например, по механизму, предложенному Ingold (Barclay,ingoid.i981), в соответствии с которым, пврекисный липидный радикал, имеющий значительный диполышй момонт, диф- 1 фундирует в полярную область липидного бислоя, где и реагирует с активной ОН- группой АО. Однако, полученные в данной работе результаты позволяют считать, что этот мохшшзм не является определяющим в антирадикальном действии фенольных АО в модельных мембранных системах. Наши представления о молекулярных механизмах действия ТФ, вероятно, справедливы и для природных мембран. Подобная точка зрения о действии ТФ не как цепь-обрыващего АО, а как АО, предотвращающего инициирование ПОЛ в биомембранах, в частности, в микросомах печени крыс, уже высказывалась в литературе ( Yenekei.,1987), однако строгих количественных данных в ее подтверждение представлено не было.

I. Для оценки характера размещения природных длшноцепо-чечных и синтетических коротксцепочечных АО в липидных мембранах исследовали методом ДСК действие ряда гидрофобных модификаторов на параметры основного фазового перехода (ФП) мембран из ДМФХ. Установлено, что ксроткоцепочечныэ гидрофобные модтгфихптори ( иопол и гитгмтн К3) окпзнвают слабое действие на параметры ФП липида. В отличие от этого незаря-

. ВЫВОДИ

женные длинноцепочечные соединения, в том числе ТФ, резко снижают энтальпию и кооперативность ФП, практически не влияя на температуру ФП. На примере дикаина показано, что заряженные гидрофобные соединения резко снижают температуру ФП ли-пида, слабо влияя на его кооперативность. Полученные результаты о сильном пертурбирущем действии ТФ являются важным аргументом в пользу расположения этого длинноцепочечного природного АО в мембранах подобно молекулам фосфолипидов.

2. О помощью специально адаптированного набора методов проведено количественное сопоставление скоростей расходования антиоксидантов, накопления гидроперекисей липидов и потребления кислорода в течение индукционного периода окисления липидов в системах, различающихся уровнем надмолекулярной организации:

.- показано, что в гомогенных жидкофазных системах в ходе ин-гибированного окисления липидов соблюдается количественное соотношение реагирующих компонентов, соответствующее реакции взаимодействия АО и радикала K0¿ ( реакция 7 ). - в структурированных гетерогенных системах - лилосомах и мицеллах - количество израсходованного АО в течение периода индукции в несколько раз превышает количества накопившихся гидроперекисей липидов или потребленного кислорода. Это указывает на то, что ингибирущее действие АО в указанных системах обеспечивается, главным образом, не реакцией (7), а реакциями другого типа.

3. Установлено, что ингибирование финальными АО инициированного окисления липидов в мембранных системах происходит преимущественно в результате их взаимодействия с радикалами инициатора. '

4. Исследование свободно-радикальных процессов в аэробных и анаэробных условиях с применением химических инициаторов различной природы показало, что используемые фенолыше АО слабо реагируют со свободными радикалами с активным центром на атома углерода, а взаимодействуют со свободными радикалами с наспаренной валентностью на атоме кислорода.

Б. Обнаружено, что анаэробная инкубация липосом сопровождается накоплением высокомолекулярных флуоресцирующих продуктов. Фенольные АО нэ влияли на скорость их образования.

6. Установлено, что в гомогенной жидкофазной системе ТФ,

ПМХ й ионол проявляют близкую ингибирующую активность. В гетерогенных же системах -■ липосомах и мицеллах - антиоксидант-ная эффективность ТФ и ПМХ снижена по сравнению с ионолом.

7. Совокупность полученных данных позволила предложить общую схему ингибированного фенольными АО ПОЛ в мембранах с учетом характера упаковки липидов в мембранных системах, локализации АО и инициаторов и их диффузионной подвижности в бислое.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Кальнова H.D., Баутина А.Л. Влияние адриамицина на антиокислительную активность и состав фосфолипидоз эритроцитов крови мшей. Экспериментальная онкология. 1988. N 6. С.72. Деп. В ВИНИТИ 1Б.07.88, Я 5732-В88.

2. Белевич Н.П., Дмитриев Л.Ф., Баутина А.Л., Иванов, И.И. Два пути гидроксилироввния полициклических углеводородов в мембранах эндоплазматического ретикулума. Биол. науки. 1988. N 4. С.37-41.

3. Паутина А.Л. Влияние соединений различной структуры на фазовый переход димиристоилфосфатидилхолина. Проблемы соврем, биологии: Тр. XIX науч. конф. мол. ученых Виол. фак. МГУ. Деп. В ВИНИТИ 24.08.1988, N 6711-В88.Ы.,1988. 4.2. С.140-145.

4. Семин Б.К., Баутина А.Л., Иванов И.И. Действие мембра-тропных соединений различной структуры на параметры фазового перехода димиристоилфосфатидилхолнна." Биол. науки. 1989'. Н Б. С.32-36.

Б. Баутина А.Л., Иванов И.И. Молекулярные механизмы взаимодействия токоферолов со свободными радикалами липидов в мембранах. Проблемы соврем, биологии: Тр. XX науч. конф. мол. ученых биол. фак. ИГУ. Деп. в ВИНИТИ 5.02.1990, N 642-В90.М., 1989. 4.2. С.207-211.

6. Вавшшн Д.В., Матория Д.Н., Кефаров P.C., Баутина А.Л., Венедиктов П.С. Высокотемпературная тормолшшесцзнция хлорофилла при перекисном окислении липидов. Биол. мембраны. 1991. N I ( в печати).