Молекулярные механизмы влияния этанола и его метаболитов на клеточные мембраны in vitro и in vivo

Прокопьева, Валентина Даниловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярные механизмы влияния этанола и его метаболитов на клеточные мембраны in vitro и in vivo
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярные механизмы влияния этанола и его метаболитов на клеточные мембраны in vitro и in vivo"

На правах рукописи

Прокопьева Валентина Даниловна

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ВЛИЯНИЯ ЭТАНОЛА И ЕГО МЕТАБОЛИТОВ НА КЛЕТОЧНЫЕ МЕМБРАНЫ //V У1ТЯО И 11У У1УО

03.00.13 Физиология 03.00.04 Биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Томск-2003

Работа выполнена в ГУ НИИ психического здоровья Томского научного центра СО РАМН и МГУ им. М.В. Ломоносова

Научные консультанты:

доктор биологических наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ Болдырев Александр Александрович

доктор медицинских наук,

профессор Бохан Николай Александрович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Суханова Галина Алексеевна

доктор биологических наук,

профессор Шалабодов Александр Дмитриевич

доктор биологических наук, Большаков Михаил Алексеевич

Ведущая организация:

Институт физиологии СО РАМН, г. Новосибирск

Защита состоится (2&£í,7í¿l¿)2003 года в to часов на заседании диссертационного совет/ Д 208.096.01 при Сибирском государственном медицинском университете по адресу: 634050, -

г. Томск, Московский тракт, 2

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке *

Сибирского государственного медицинского университета по адресу 634050, г. Томск, пр. Ленина, 107.

Автореферат разослан 2003 года.

Ученый секретарь диссертационного совета Бражникова Н.А.

ЪоО?- А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Биологические мембраны являются неотъемлемой частью любой живой клетки. Помимо таких функций биологических мембран как отграничение клетки от окружающей среды, разделение внутреннего объема клетки на отдельные компартменты, обеспечение специфики межклеточных контактов и контроль за проникновением в клетку и выход из нее различных соединений, биологические мембраны способны воспринимать, усиливать и передавать внутрь клетки сигналы из внешней среды, создавать специальные условия для протекания ферментативных реакций, осуществляемых гидрофобными мембранными белками, обеспечивать превращение биологической энергии и т.д.

Эффективное выполнение биологическими мембранами разнообразных функций возможно благодаря их уникальной структуре. В настоящее время имеется большое количество научных обзоров, монографий и учебных пособий, посвященных описанию принципов организации и функционирования биологических мембран [Крепе Е.М., 1981; Конев C.B., 1987; Твердислов В.А. и соавт., 1987; Скулачев В.П., 1989; Болдырев A.A. и соавт., 1990; Hausley M.D., Stanly К.К., 1984; Halliwell В., Gutteridge J.M.C., 1999]. Их анализ позволяет заключить, что такие важные функции биомембран как способность воспринимать, классифицировать (усиливать или элиминировать) и передавать информацию, осуществлять транспорт ионов против их концентрационного градиента, преобразовывать энергию в форму, необходимую клетке, осуществляются благодаря структурным (конформационным) перестройкам мембранных компонентов. Такая тесная структурно-функциональная связь в биомембранах обеспечивает как динамическое равновесие внутри клетки, так и возможность взаимодействия клеток друг с другом.

Известно, что в основе многих патологий лежат изменения свойств клеточных мембран. Структурно-функциональные нарушения биомембран могут быть не только причиной, но и следствием развития патологических процессов. Как правило, при патологиях происходит комплексная модификация функций мембран, которая непременно сопровождается структурными изменениями как мембранных липидов (изменение липидного состава, соотношения насыщенных и ненасыщенных жирных кислот, входящих в состав липидов, развитием перекисного окисления липидов и др.), так и мембранных белков (гликирование, карбонили-рование, кросс-линкинг) [Halliwell В., Gutteridge J.M.C., 1999].

Клеточные мембраны являются мишенью действия токсинов, радиоактивного и ультрафиолетового облучения. Кроме этого известно большое количество природных модификаторов мембран, способных в зависимости от условий и их концентрации оказывать различное (иногда противоположное) действие на клеточные мембраны. Такие соединения относят к классу мембранотропных веществ. Одним из них является этанол. Изучение молекулярных механизмов влияния этанола и его метаболитов на биомембраны in vivo и in vitro при остром или хроническом влиянии в свете но------------- ~ --------- ' к

взаимоотношениях в биологических

СП'

фунда-

ментальные основы возникновения и развития одного из наиболее широко распространенных заболеваний в мире - алкоголизма.

В настоящее время исследования, посвященные различным аспектам алкоголизма, интенсивно проводятся в разных странах. Для успешного решения таких проблем алкоголизма, как выяснение общих закономерностей формирования и течения этого заболевания, его клиники и дифференцированной терапии больных алкоголизмом, необходимы углубленные представления о молекулярных механизмах влияния этанола и структурно-функциональных изменениях, возникающих в биологических мембранах вследствие острого или хронического его действия.

Благодаря усилиям многих исследователей в последние годы получены новые данные о молекулярных механизмах формирования алкогольной зависимости и токсического действия этанола. Однако многие аспекты молекулярных механизмов повреждающего действия хронической алкоголизации остаются неясными. До сих пор неизвестно, в какой мере эти повреждения связаны с прямым влиянием неметаболизированного этанола на клетки, а в какой - с влиянием его метаболитов. Основным путем метаболизма этанола в организме является его окисление до ацетальдегида алкогольдегидрогеназой, этанол-индуцируемым ци-тохромом Р450 (CYP2E1) и каталазой [Lieber C.S., 1994; French S.W., 1996]. Ацетальдегид обладает высокой реакционной способностью. Он может взаимодействовать с NH2-, SH-, СООН- группами, что может приводить к модификации белков, липидов, нуклеиновых кислот и других биомолекул [Hipkiss A.R., et al., 1998; Holownia A., et al., 1999]. Кроме того при хроническом поступлении в организм высоких доз этанола побочными продуктами его окислительного превращения могут быть чрезвычайно активные гидроксиэтил-радикалы [Reinke L.A., et al., 1997]. Показана возможность накопления в этих условиях супероксидных, гид-роксильных, пероксильных и других радикалов, которые также могут приводить к повреждению биомембран и гибели клеток [Sato Y. et al, 1995; PekinerB., Pennock J.F., 1994].

Другой путь метаболизма этанола в организме - его неокислительное превращение в этиловые эфиры жирных кислот (ЭЭЖК) под действием синтазы этиловых эфиров жирных кислот. Этот путь является преобладающим в нервных клетках и кардиомиоцитах [Gorski N.P., et al., 1999; Laposata M., 1999]. Этиловые эфиры жирных кислот, вмешиваясь в метаболические процессы клетки, могут приводить к перестройке клеточного метаболизма, нарушению многих функций, включая такую важную, как трансмембранный транспорт целого ряда метаболитов [Gubitosi-Klug R.A., Gross, R.W., 1996].

Для изучения тонких молекулярных механизмов повреждающего действия этанола и его метаболитов на клеточные мембраны в качестве модели удобно использовать эритроциты периферической крови и их тени. Эритроциты являются высокочувствительной тест-системой внутренней среды организма. Помимо осуществления присущей им основной специфической газотранспортирую-щей функции, эти клетки принимают участие в обеспечении стабильности водно-солевого обмена, кислотно-основного равновесия, определяют микрореоло-

гические свойства крови, способны связывать и переносить вирусы, токсины, лекарственные вещества и т.д.

При алкоголизме обнаруживается структурно-функциональная дезорганизация эритроцитов, меняется их морфология, что сопровождается снижением гемолитической устойчивости и развитием анемии [Chi L.M., Wu W.G., 1991; Bizzaro N., et al., 1993]. Такие изменения эритроцитов неизбежно усугубляют тканевую гипоксию, имеющую место при алкоголизме. Нарушается роль эритроцитов в процессах, связанных с поддержанием гомеостаза на уровне целого организма, что осложняет течение заболевания. В связи с этим актуальным является вопрос, каков молекулярный механизм происхождения аномальных клеток красной крови при данном заболевании и насколько обратимы эти патологические изменения эритроцитов.

Одним из важных факторов, контролирующих форму эритроцита, является работа мембранных ион-транспортирующих систем. Показано нарушение функционирования и регуляции эритроцитарной Na/K-АТФазы при алкоголизме [Johnson J.H., Crider В.Р., 1989]. Есть данные о действии алкоголя на трансмембранный транспорт лития [Ostrow D.G., et al., 1986] и об изменении под действием этанола проницаемости биомембран для Са2+ [Kelly-Murphy S., et al., 1984]. Однако сведений, касающихся функционирования и регуляции ион-транспортирующих систем в эритроцитах больных алкоголизмом, явно недостаточно.

При алкоголизме значительные изменения происходят не только в эритроцитах, но и в других клетках крови. Известно, что у больных алкоголизмом происходит снижение фагоцитарной активности [Евсеев В.А., 1990; Гамалея Н.Б. и соавт., 2000]. В то же время до сих пор нет данных о соотношении показателей маркеров окислительного стресса в организме с дыхательной активностью ней-трофилов при данной патологии.

Таким образом, имеющихся в настоящее время экспериментальных данных недостаточно для понимания тонких молекулярных механизмов токсического * действия этанола и его метаболитов на структурно-функциональные взаимоотношения в биологических мембранах, отсутствует целостная картина, выявляющая на молекулярном уровне причины структурно-функциональных изменений клеток крови при алкоголизме. Неисследованным также остается вопрос о том, насколько возможно восстановление патологически измененных параметров клеток красной и белой крови в процессе традиционной дезинтоксикацион-ной терапии. Кроме того, актуальным является поиск новых способов коррекции клеточных повреждений при алкогольной интоксикации.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в исследовании молекулярных механизмов повреждающего действия этанола и продуктов его метаболизма - ацетальдегида и этиловых эфиров жирных кислот - на клетки крови in vitro и in vivo.

При выполнении работы были поставлены следующие задачи:

1. Выявить особенности влияния этанола и ацетальдегида на устойчивость эритроцитов к кислотному и окислительному гемолизу in vitro.

2. Оценить взаимосвязь изменения морфологии эритроцитов с изменением состояния эритроцитарных белков при действии этанола и ацетальдегида in vitro.

3. Установить закономерности влияния этанола и ацетальдегида на гидрофобную область липидного матрикса эритроцитов in vitro.

4. Изучить влияние этиловых эфиров линоленовой и пальмитиновой жирных кислот на структуру и стабильность эритроцитов in vitro.

5. Дать комплексную оценку структурно-функционального статуса эритроцитов больных алкоголизмом в динамике лечения.

6. Выявить особенности функционирования и регуляции мембранных ферментов (Na/K-АТФазы) и ионных каналов (Са2+-а1сгивируемых К+-каналов) в эритроцитах больных алкоголизмом в динамике лечения.

7. Оценить уровень окислительной модификации белков и липидов сыворотки крови больных алкоголизмом в динамике лечения.

8. Исследовать фагоцитарную и дыхательную активности нейтрофилов у больных алкоголизмом в динамике лечения.

9. Оценить эффективность применения природного мембраностабилизатора и антиоксиданта карнозина in vitro в качестве протектора структурно-функциональных нарушений клеток крови больных алкоголизмом.

Положения, выносимые на защиту

1. Молекулярные механизмы влияния этанола и ацетальдегида на эритроциты in vitro существенно различаются. Неметаболизированный этанол снижает устойчивость эритроцитов к кислотному гемолизу. В условиях окислительного гемолиза этанол не приводит к дестабилизации эритроцитов, напротив, наблюдается тенденция к повышению стабильности клеток. Этанол приводит к снижению микровязкости гидрофобной области липидного бислоя без изменения белкового спектра и окислительного статуса белков мембран эритроцитов. Аце-тальдегид не изменяет устойчивость эритроцитов к гемолизирующему действию кислоты, но снижает устойчивость к действию гипохлорита натрия. При этом происходит снижение микровязкости липидного бислоя мембран и изменяется состояние эритроцитарных белков - наблюдается их окислительная модификация, затрудняется экстракция спектрина и актина. Как этанол, так и ацетальде-гид in vitro не нарушают морфологию эритроцитов.

3. Структурно-функциональные изменения эритроцитов при действии этанола и его метаболитов in vitro отличаются от структурно-функциональных нарушений эритроцитов больных алкоголизмом. У больных нарушение морфологии эритроцитов сочетается со снижением гемолитической устойчивости клеток, кросс-линкингом эритроцитарных белков, снижением гидрофобного объема мембран, повышением упорядоченности их структуры, уменьшением чувстви-

телыюсти мембран к хаотропному действию этанола и ацетальдегида, повышением активности Na/K-АТФазы и проводимости К+(Са2+)-каналов. В процессе дезинтоксикационной терапии наблюдается положительная динамика перечисленных параметров: увеличивается количество морфологически нормальных эритроцитов, восстанавливается их гемолитическая устойчивость, нормализуются гидрофобный объем мембран, активность Na/K-АТФазы и проводимость К+(Са2+)-каналов, а также чувствительность липидного матрикса к хаотропному действию этанола, однако чувствительность мембран к хаотропному действию ацетальдегида не восстанавливается.

4. Хроническое поступление высоких доз этанола в организм приводит к увеличению окислительной модификации белков и липидов сыворотки крови и к повышению дыхательной активности нейтрофилов. После лечения содержание продуктов ПОЛ в сыворотке крови и дыхательная активность нейтрофилов нормализуются, уровень карбонилирования сывороточных белков снижается, однако остается выше нормы.

5. Природный дипептид карнозин повышает устойчивость эритроцитов больных алкоголизмом к кислотному гемолизу и предохраняет клетки от структурных повреждений in vitro. Аналогичными свойствами обладает ацетилированное производное карнозина - N-ацетил-карнозин. Карнозин обладает иммуномоду-лирующим действием, которое выражается в регулировании фагоцитоза и продукции активных форм кислорода нейтрофилами. Эффект карнозина зависит от его концентрации и функционального состояния клеток.

Новизна исследования и наиболее существенные научные результаты

В данном исследовании выявлены неизвестные ранее механизмы повреждающего действия этанола и его метаболитов на клеточные мембраны. Впервые проведено сравнение действия этанола и ацетальдегида in vitro на устойчивость эритроцитов к кислотному и окислительному гемолизу. Показано, что дестабилизирующий эффект неметаболизированного этанола на эритроциты проявляется в условиях кислотного, но не окислительного гемолиза. Ацетальдегид проявляет свое действие в условиях окислительного, но не кислотного гемолиза.

Молекулярные механизмы действия этанола и ацетальдегида на мембраны эритроцитов существенно различаются. Этанол не приводит к модификации белков мембран эритроцитов. В результате влияния ацетальдегида увеличивается уровень карбонилирования белков эритроцитов, затрудняется экстракция спектрина и актина из теней эритроцитов, при этом продукты кросс-линкинга белков не обнаруживаются. Модификация белков эритроцитов под действием ацетальдегида без кросс-линкинга не приводит к морфологическим нарушениям клеток, в то время как модификация белков под действием глутаральдегида, приводящая к кросс-линкингу белков, сопровождается нарушением формы эритроцитов.

наблюдается значительное снижение стабильности эритроцитов без нарушения морфологии. В эритроцитах больных алкоголизмом этиловые эфиры жирных кислот не обнаружены.

Впервые дана комплексная структурно-функциональная характеристика эритроцитов больных алкоголизмом в динамике лечения. У больных в состоянии абстиненции выявлены нарушение морфологии эритроцитов, в мембранах обнаружены продукты кросс-линкинга белков, установлено возрастание микровязкости гидрофобной области эритроцитарных мембран. Обнаружена различная чувствительность мембран эритроцитов больных алкоголизмом и здоровых лиц к воздействию этанола и ацетальдегида: этанол, как и ацетальдегид, приводит к увеличению гидрофобного объема мембран здоровых доноров, в то время как у больных в состоянии абстиненции мембраны эритроцитов оказываются не чувствительными к этанолу и ацетальдегиду. После лечения увеличивается количество морфологически полноценных клеток, наблюдается снижение микровязкости эритроцитарных мембран, восстанавливается чувствительность гидрофобной области мембран к хаотропному действию этанола, но не ацетальдегида.

Впервые исследованы особенности функционирования и регуляции мембранных ион-транспортирующих ферментов и каналов в патологически измененных эритроцитах больных алкоголизмом. Установлено, что у больных в период абстиненции активность Na/K-АТФазы, как и Са2+-зависимая калиевая проницаемость мембран эритроцитов, повышены. При алкоголизме в условиях Mg2+-дефицита изменяется характер зависимости активности Ыа/К-АТФазы от магния. Показана важная роль белков мембранного каркаса в регуляции К+(Са2+)-каналов эритроцитов. Обнаружена различная чувствительность К+(Са2+)-каналов к изменению объема клеток при изменении осмолярности среды инкубации у здоровых доноров и больных алкоголизмом, что свидетельствует об изменении свойств мембранного каркаса эритроцитов при алкоголизме. После лечения активность Na/K-АТФэзы и Са2+-зависимая К+-проводимость эритроцитов пациентов нормализуются. В период ремиссии зависимость активности Na/K-АТФазы от магния не отличается от нормы.

Обнаружено увеличение содержания продуктов перекисного окисления липи-дов и повышение уровня карбонилирования белков в сыворотке крови больных алкоголизмом в период абстиненции. Показано снижение фагоцитарной активности нейтрофилов и повышение их дыхательной активности у пациентов. Эти результаты подтверждают данные литературы об активации окислительных процессов и состоянии окислительного стресса при алкоголизме. После лечения содержание продуктов ПОЛ в сыворотке крови пациентов не отличается от нормы, количество карбонилированных белков снижается, однако остается повышенным по сравнению с нормой. Показатели дыхательной активности нейтрофилов больных алкоголизмом после лечения также приближаются к норме.

Впервые в опытах in vitro показано, что природный гидрофильный антиокси-дант гистидин-содержащий дипептид карнозин и его ацетилированное производное N- ацетил-карнозин повышают устойчивость эритроцитов больных алкоголизмом к кислотному гемолизу и увеличивают количество морфологически нормальных эритроцитов. Впервые установлено, что карнозин in vitro способен

стимулировать фагоцитоз и дыхательную активность нейтрофилов у здоровых лиц и больных алкоголизмом. Эффекты карнозина зависят от его концентрации и функционального состояния клеток.

Теоретическое и практическое значение работы

Полученные данные расширяют современные представления о механизмах повреждающего действия этанола и его метаболитов на биологические мембраны. Результаты работы фундаментального характера вносят вклад в развитие представлений о механизмах структурно-функциональных нарушений клеток крови при алкоголизме и могут быть использованы для разработки новой патогенетически обоснованной терапии больных алкоголизмом, служить основанием для оптимизации оценки эффективности проводимого лечения. Разработанный способ повышения устойчивости к гемолизу эритроцитов путем введения в кровь природного гидрофильного антиоксиданта карнозина или его N-ацетильного производного может использоваться при стабилизации донорской крови, защите эритроцитов в аппаратах искусственного кровообращения, а также при патологиях, сопровождающихся повреждением эритроцитов.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на Межреспубликанской научно-практической конференции «Синтез, фармакология и клинические аспекты новых психотропных и сердечно-сосудистых веществ» (Волгоград, 1989), на Международной конференции «Регуляция свободнорадикальных реакций (биомедицинские аспекты)» (Варна, 1989), на Всесоюзной конференции «Медико-биологические аспекты охраны психического здоровья» (Томск, 1990), на XII и XIII съездах психиатров России (Москва, 1995; 2000), на Межрегиональной конференции «Медико-биологические аспекты нейрогуморальной регуляции» (Томск, 1997), на региональном научном симпозиуме «Молекулярные основы заболеваний XXI века» (Томск, 2000), на VII, VIII, IX и X научных отчетных сессиях НИИ психического здоровья Томского научного центра СО РАМН (Томск, 1995; 1997; 1999; 2001), на конференции «Психическое здоровье в XXI веке: оценка и прогноз» (Томск, 2001), на VII Всемирном конгрессе по биологической психиатрии (Берлин, 2001), XXVII Съезде Федерации Европейских биохимических обществ (Лиссабон, 2001), VIII конгрессе Европейского общества по исследованию биомедицинских аспектов алкоголизма (Париж, 2001), IV съезде физиологов Сибири (Новосибирск, 2002), на Всероссийской конференции «Современные проблемы биологической психиатрии и наркологии» (Томск, 2003).

Публикации. Результаты работы представлены в 41 публикации, из них 1 патент на изобретение, 5 статей в зарубежной печати, 14 статей в центральных рецензируемых журналах.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 226 печатных страницах, содержит 8 таблиц, 24 рисунка. Состоит из введения, разделов: «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследования и их обсуждение», а также заключения, выводов и списка литературы, включающего 501 источник, из них 151 отечественных и 350 зарубежных.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Методы исследования

В работе использовали кровь 120 мужчин, больных алкоголизмом II стадии (диагноз по МКБ-10 соответствовал коду Б 10.2), средний возраст на день обследования составил 40,5±8,5 лет. У 78 пациентов за период лечения кровь брали дважды, чтобы проследить динамику исследуемых показателей. Критериями включения больных в основную группу явилось: пребывание в абстинентном состоянии; добровольное согласие на участие в исследовании. Критериями исключения из исследования являлись: возраст старше 55 лет; наличие эндогенных заболеваний, эпилепсии; наличие заболеваний, передающихся половым путем (ВИЧ-инфекции, сифилиса); наличие выраженных коморбидных неврологических и соматических заболеваний, затрудняющих объективную оценку клинического состояния, вызванного основным заболеванием; отказ больного от участия в исследовании.

Первый раз кровь для анализа у всех больных брали в день поступления на лечение до купирования абстинентного синдрома. Второй раз кровь брали у больных, которые успешно прошли курс дезинтоксикационной терапии в течение 3035 дней и находились в стадии формирования ремиссии. В отдельных случаях кровь брали также на 5-7 день лечения, сразу после купирования абстинентного синдрома (29 пациентов). Контрольную группу составили 58 практически здоровых мужчин соответствующего возраста (средний возраст 38,0±8,8 лет), у которых анамнестически были исключены алкоголизм и употребление спиртных напитков, по крайней мере, в течение последних 10 суток.

В период проведения лечения пациенты получали традиционную медикаментозную терапию, включающую дифференцированное назначение дезинтоксика-ционных средств (изотонический раствор натрия хлорида, гемодез, витамины группы «В», «С») и следующих основных групп препаратов: антидепрессанты (амитриптилин до 100 мг/сут); корректоры поведения (неулептил до 30 мг/сут, сонапакс до 50 мг/сут); гипнотики (хлорпротиксен до 100 мг/сут); ноотропы (пирацетам до 800 мг/сут), вегетостабилизаторы (пирроксан до 60 мг/сут, гран-даксин до 100 мг/сут).

Кроме того, использовали кровь лабораторных кроликов-самцов породы шиншилла. Кровь кроликов стабилизировали 3,8 % цитратом натрия в соотношении 1:10 в момент отбора из ушной вены. Для стабилизации крови пациентов и здоровых доноров использовали 3,8 % цитрат натрия при заборе периферической крови (соотношение 1:10) и гепарин при заборе венозной крови (25 ед. на мл крови).

При исследовании гемолитической устойчивости эритроцитов образец крови (0,1 мл) разводили физиологическим раствором (0,85 % ЙаС1, рН 6,3) в 10 раз и инкубировали на водяной бане 2 ч при 37 °С, после чего хранили в тех же условиях не более 4 ч. Преинкубацию разведенного в 10 раз образца крови с 0,10,5 % этанолом или 0,25 % ацетальдегидом проводили 1 ч при 37 °С. Количество клеток в образце крови подсчитывали в камере Горяева. Гемолитическую устойчивость эритроцитов определяли по изменению оптической плотности

проб, содержащих суспензию клеток, в области 630 нм [Терсков И.А., Гитель-зонИ.И., 1957]. Измерения проводили при 25 °С, при непрерывном перемешивании пробы. Кислотный гемолиз индуцировали добавлением 2 мМ соляной кислоты (pH среды инкубации после добавления HCl составлял 2,7), окислительный гемолиз - добавлением 0,2 мМ гипохлорита натрия, либо 1,5 мМ SIN-lyCD (З-морфолино-Ы-нитрозо-аминоацетонитрил, у-циклодекстриновый комплекс), либо 2 мМ перекиси водорода, или смеси 2 мМ перекиси водорода с 0,04 мМ FeS04. Для характеристики гемолитической устойчивости эритроцитов использовали параметры Ттах и %тах, которые представляют собой соответственно время достижения максимальной скорости гемолиза (в мин) и количество клеток (в %), подвергающихся гемолизу с максимальной скоростью.

При исследовании влияния этиловых эфиров жирных кислот на спонтанный гемолиз эритроцитов клетки инкубировали в присутствии или отсутствии человеческого сывороточного альбумина (40 мг/мл) при 25 °С в течение 24 часов после добавления 100 мкМ этиловых эфиров линоленовой или пальмитиловой жирных кислот, растворенных в 10 мМ растворе диметилсульфоксида (DMSO). В контрольные образцы добавляли то же количество DMSO без ЭЭЖК. Уровень спонтанного гемолиза оценивали по количеству гемоглобина в супернатантах после центрифугирования образцов (измеряя абсорбцию проб при 415 нм) по сравнению с уровнем гемоглобина в образцах с тем же количеством эритроцитов, подвергнутых полному гемолизу путем растворения клеток в 10 объемах 5 мМ фосфатного буфера (pH 8,0).

Активность каталазы измеряли методом, предложенным Aebi Н. (1984), по снижению уровня перекиси водорода в пробе, которое регистрировали спек-трофотометрически при 240 нм. В качестве ингибитора каталазы использовали 3-аминотриазол в концентрации 25 мМ в присутствии метиленового синего (0,01 мг/мл) [Tephly T.R., et al., 1961].

Получение теней эритроцитов, а также экстракцию из них спектрина и актина проводили по описанным ранее методам [Shotton D.M., 1998]. Белковый состав препаратов определяли методом электрофореза в полиакриламидном геле (ЭФ в ПААГ) по Лэммли в присутствии додецилсульфата натрия [Laemmli U.K., 1970]. Концентрацию белка в пробах определяли по методу Лоури [Lowry О.Н., et al., 1951].

Качественную оценку размера и формы эритроцитов проводили после окрашивания мазков крови по стандартной методике с красителем Романовского [Меньшиков В.В., 1987] под световым микроскопом MBI-15-2 (LOMO, Россия). Особенности поверхностной архитектоники эритроцитов изучали методом сканирующей электронной микроскопии. Для этого биоптаты периферической крови обрабатывали по методу, предложенному Г.И. Козинцом и Ю.А. Симоварт (1985). Готовые препараты исследовали в электронных микроскопах «РЭМ-200» и «JEM-100» (Япония).

Оценку микровязкости мембран эритроцитов проводили с помощью флуоресцентного зонда пирена на спектрофлуориметре «Hitachi-MPF4» (Япония) [Van-derkooi J.M., Calles J.B., 1974].

Анализ содержания ЭЭЖК в мембранах эритроцитов проводили методом газовой хроматографии, как описано в работе Bird D.A. et al., 1997. Распределение фосфатидилсерина в мембранах эритроцитов оценивали с флуоресцеин-изотио-цианат-меченным аннексином V методом проточной цитометрии [Koopman G. et al., 1994] на флоуцитометре Becton-Dickinson FACSort.

Активность Ыа/К-АТФазы в эритроцитах определяли методом, разработанным Казеиновым A.M. и соавт. (1984), по увеличению концентрации неорганического фосфата (Ф„) в пробе на биохимическом анализаторе ФП-901 (Финляндия). Активность выражали в мкмоль Ф„/часхмл упакованных эритроцитов. Проводимость Са2+-активируемых К+-каналов мембран эритроцитов оценивали по изменению мембранного потенциала в ответ на увеличение внутриклеточной концентрации ионов кальция при добавлении Са2+-ионофора А23187 [Орлов С.Н., и соавт., 1992]. Для регистрации изменений мембранного потенциала в суспензии эритроцитов использовали метод непрерывной регистрации рН среды инкубации, предложенный Vestergaard-Bogind В., Bennekou Р. (1982). Этот метод основан на том, что в присутствии протонофора распределение протонов зависит от мембранного потенциала Е как E=RT/F(pHi-pH0), где pHj и рН0 - значения рН цитоплазмы и среды инкубации, соответственно. При низкой буферной емкости среды инкубации (в наших условиях она примерно в 100 раз меньше буферной емкости цитоплазмы) изменениями pHj можно пренебречь, а его квазистационарный уровень определять при гемолизе клеток в присутствии детергента (использовали тритон Х-100, конечная концентрация в пробе 0,2 %).

Карбонильные группы сывороточных белков определяли иммунохимическим методом слот-блот после обработки белков 2,4-динитрофенилгидразином (DNPH) и получения динитрофенол-меченных по карбонильным группам белков (DNP-меченных белков) [Harlow Е., Lane D., 1988]. Использовали первые антитела, специфические к динитрофенолу, и вторые антитела с коньюгированной щелочной фосфатазой. В качестве стандартного белка, содержащего известное количество карбонильных групп, использовали раствор бычьего сывороточного альбумина (50 мг/мл), предварительно обработанный 5 мМ NaOCl [Buss Н. et al., 1997].

Карбонильные группы в белках эритроцитов выявляли с помощью метода Вестерн-блот, используя кит для определения окислительной модификации белков. Тени эритроцитов обрабатывали DNPH для получения DNP-меченных белков. Белки, разделенные методом ЭФ в ПААГ, переносили путем блоттинга с геля на нитроцеллюлозную мембрану и обрабатывали специфическими антителами на DNP-меченные белки, а затем вторичными антителами, конъюгирован-ными с пероксидазой.

Оценку перекисного окисления липидов в сыворотке крови проводили, определяя один из конечных продуктов ПОЛ - малоновый диальдегид (МДА) - с помощью тиобарбитуровой кислоты по методу, описанному Владимировым Ю.А., Арчаковым А.И. (1972).

Иммунологические исследования проводили методами, описанными Кетлинским С.А. и Калининой Н.М. (1998). Фагоцитарную активность лейкоцитов оценивали по поглотительной способности нейтрофилов. В качестве тест-системы

использовали мелаиинформальдегидиый латекс. Измеряли фагоцитарный индекс (пропорциональный проценту фагоцитирующих нейтрофилов) и фагоцитарное число (среднее число частиц латекса, поглощенных одним фагоцитом). Дыхательную активность нейтрофилов оценивали по восстановлению в цитоплазме клетки нитросинего тетразолия до диформазана (НСТ-тест). Измеряли процент клеток, образующих гранулы диформазана, и цитологический индекс (ЦИ), пропорциональный количеству образовавшихся гранул диформазана, без стимуляции (спонтанный НСТ-тест) и при стимуляции латексом (стимулированный НСТ-тест).

Результаты обрабатывали методами вариационной статистики. Для оценки достоверности различия средних вариационных рядов использовали t-критерий Стьюдента и непараметрический критерий Манна-Уитни [Урбах В.Ю., 1975; Лакин Г.Ф., 1990]. Были использованы компьютерные программы: ANOVA, Statistics 5.0, Microsoft Excel.

В работе использовали реактивы: SITS (4-ацетамидо-4-изотиоцианостильбен-2,2'-дисульфоновая кислота), СССР (карбонилцианид-ш-хлорфенилгидразон) («Calbiochem», США); А23187, тритон Х-100, NaOCl, этиловые эфиры жирных кислот, 3-аминотриазол, метиленовый синий, SIN-lyCD (З-морфолино-N-нитрозо-аминоацетонитрил, у-циклодекстриновый комплекс), Кумасси R-250, DNPH (динитрофенилгидразин), кроличьи антитела к динитрофенолу, вторые (козьи) анти-кроличьи антитела, конъюгированные с щелочной фосфатазой, нитросиний тетразолий (HCT), 5-бромо-4-хлоро-3-индолилфосфат (BCIP), PIPES (пиперазин-Ы-Н-бис-2-этан сульфонат), L-гистидин, ацетальдегид («Sigma», США); реактивы для электрофореза в ПААГ («Reanal», Венгрия); аннексии V, меченый FITC (флуоресцеинизотиоцианатом) («Molecular Probes», США); кит для определения окислительной модификации белков (OxyBlot Protein Oxidation Detection Kit, «Intergen Company», США); нитроцеллюлозные мембранные фильтры ВА 85 (0,45 цт) («Schleicher & Schuell», Германия); реактивы для выявления активности пероксидазы, конъюгированной с антителами (ECL Western Blotting Analysis System, «Amersham», США). Меланинформальдегидный ла-» текс был получен из ВНИИ биологического приборос!роения, Москва. Дииеп-

тиды: карнозин, анзерин (N'-метил-карнозин), офидин (Ы3-метил-карнозин) и N-ацетил-карнозин (N-Ac-карнозин) были любезно предоставлены профессором A.A. Болдыревым (кафедра биохимии МГУ им. М.В. Ломоносова). Остальные реактивы были получены от фирмы «Реахим», Россия.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Молекулярные механизмы влияния этанола и его метаболитов на мембраны эритроцитов in vitro

I.l. Влияние этанола и ацетальдегида на устойчивость эритроцитов к кислотному и окислительному гемолизу

Устойчивость эритроцитов к гемолитическому воздействию определяется многими факторами, в том числе - возрастом клеток и состоянием их клеточной мембраны. Поскольку действие различных по своей природе гемолитических

агентов зависит от исходного состояния эритроцитарной мембраны, ее подверженность гемолизу может служить интегральным показателем жизнеспособности клеток. Известно, что при алкоголизме наблюдается снижение устойчивости эритроцитов и развитие анемии [Chi L.M., Wu W.G., 1991]. В настоящее время неясно, является ли этот феномен результатом прямого воздействия этанола на клетки крови, или же он опосредованно реализуется за счет продуктов его окислительного метаболизма.

Нами проведено исследование влияния этанола и ацетальдегида на гемолитическую устойчивость эритроцитов кролика в условиях кислотного или окислительного гемолиза. Для характеристики устойчивости эритроцитов к разным окислителям было проведено сравнение эффектов гипохлорита натрия (NaOCl), перекиси водорода, гидроксид-радикалов, образующихся в ходе реакции Фенто-на, индуцируемой добавлением к перекиси водорода ионов двухвалентного железа, а также NO-радикала, генерация которого осуществлялась в ходе спнтан-ного разложения SIN-lyCD в водной среде. Наиболее эффективным из перечисленных окислителей оказался NaOCl, который в концентрации 0,2 мМ вызывал полный гемолиз клеток за 4 мин, тогда как в присутствии 1,5 мМ SIN-lyCD гемолиз продолжался в течение 20 мин. Перекись водорода в концентрации 2 мМ и смесь перекиси водорода (2 мМ) с сульфатом железа (0,04 мМ) (реакция Фен-тона) не вызывали заметных изменений оптической плотности образца в течение 10 мин наблюдения. После трехкратного отмывания эритроцитов от примеси плазмы клетки претерпевали частичный гемолиз (на 40 %) при протекании реакции Фентона. Последующее добавление в кювету HCl в конечной концентрации 1М приводило к быстрому гемолизу оставшихся эритроцитов. Таким образом, большая часть клеток в этих условиях оставалась в нативном состоянии. Это позволило заключить, что мембраны эритроцитов обладают устойчивостью к повреждающему действию перекиси водорода и гидроксид-радикалов, но чувствительны к NO* и особенно к NaOCl.

Мы сравнили влияние этанола на гемолиз эритроцитов кролика под действием 2 мМ HCl или 0,2 мМ NaOCl, вызывающих, соответственно, кислотный и окис- ' лительный гемолиз. Кислотные эритрограммы контрольных эритроцитов, полученных от разных особей животных, были хорошо воспроизводимы. Усредненные величины Ттах и %тах (которые, соответственно, представляют собой время s достижения максимальной скорости гемолиза (в мин) и количество клеток (в %), подвергающихся гемолизу с максимальной скоростью) для них составляли 5,5±0,5 мин и 21±4 %. Эритрограммы гемолиза, индуцированного NaOCl, были хорошо воспроизводимы в течение эксперимента, но отличались более выраженными колебаниями Тгаах и %тах У разных кроликов. Их усредненные величины составляли соответственно 2,4±1,2 мин и 32±10 %. Для сравнения результатов данные Ттах и %шах, полученные в каждом эксперименте, нормализовали, выражая в процентах от величин, полученных для контрольных проб. Действие этанола на состояние эритроцитов в ходе кислотного или окислительного гемолиза в наших экспериментах оказалось различным. Влияние этанола в диапазоне концентраций 0,1-0,5% (17-85 мМ) на состояние клеток в ходе кислотного ге-

молиза было слабо выражено и проявлялось только после преинкубации с этанолом в течение 1 ч (рис. 1 А).

Эффект этанола заключался в уменьшении устойчивости эритроцитов к гемолизу (снижение Ттах) и в возрастании доли клеток, подвергающихся гемолизу с максимальной скоростью (увеличение %шах). Последнее обстоятельство отражало уменьшение гетерогенности (дисперсии распределения) эритроцитов по отношению к гемолитическому фактору. Действие этанола на эритроциты при окислительном гемолизе в том же диапазоне концентраций проявлялось сразу после его добавления к клеточной суспензии и также выражалось в уменьшении Тщах и увеличении %тах (рис. 1 Б).

Рис. 1. Влияние этанола на устойчивость эритроцитов к гемолизу, А - индуцированному 2 мМ НС1 после преинкубации клеток с этанолом в течение 1 ч; Б - индуцированному 0,2 мМ ЫаОС1 после добавления этанола к клеткам непосредственно перед индукцией гемолиза (дифференциальная форма кривых): 1 -контроль; 2 - 0,1 % этанол; 3 - 0,25 % этанол; 4 - 0,5 % этанол. По оси абсцисс -время с момента индукции гемолиза, по оси ординат - количество клеток, гемолизированных за указанный промежуток времени

При преиикубации клеток с этанолом в течение 1 ч этот эффект становился более существенным. Это позволило предположить, что продукты метаболизма этанола вносят дополнительный вклад в модификацию мембраны эритроцитов. Основным продуктом окислительного метаболизма этанола в организме является ацетальдегид. Алкогольдегидрогеназа, осуществляющая окисление этанола до ацетальдегида, в эритроцитах отсутствует роггапо А. е1 а1., 1989]. Однако ту же реакцию может осуществлять присутствующая в них катал аза, активность которой в эритроцитах достаточно высока [ НаШшеИ В., Оийепс1§е 1.М.С., 1989]. Для вьиснения возможного вклада ацетальдегида в уменьшение гемолитической устойчивости эритроцитов мы сравнили его действие с действием этанола примерно в той же процентной концентрации. Оказалось, что 0,25 % (55 мМ) ацетальдегид не оказывает достоверного влияния на чувствительность эритроцитов к кислотному гемолизу. На окислительный гемолиз эритроцитов ацетальдегид оказывал похожий по характеру, но более слабый, чем этанол, эффект (рис. 2).

Время, ммн

Рис. 2. Влияние ацетальдегида на устойчивость эритроцитов к гемолизу, индуцированному 0,2 мМ ЫаОС1 (дифференциальная форма кривых): 1 - контроль; 2 - добавление 0,25 % ацетальдегида к суспензии эритроцитов непосредственно перед индукцией гемолиза; 3 - преинкубация суспензии эритроцитов в течение 1 ч с 0,25 % ацетальдегидом. По оси абсцисс - время с момента индукции гемолиза, по оси ординат - количество клеток, гемолизированных за указанный промежуток времени

Максимальное влияние ацетальдегида на гемолитическую устойчивость эритроцитов (Тщах) реализуется сразу после его добавления к клеточной суспензии, а дальнейшие изменения устойчивости клеток в ходе их преинкубации с ацетальдегидом касаются только характера распределения эритроцитов по устойчивости, который отражает параметр %„,„. Таким образом, клеточная популяция в целом в ходе преинкубации с ацетальдегидом становится более уязвима к действию окислителя.

Опыты с эритроцитами, в которых активность каталазы была заингибирована 3-аминотриазолом, проводили с клетками, тщательно отмытыми от примесей ингибитора. Процедура отмывки клеток приводила к дестабилизации эритроци-

тов. В табл. 1 представлены данные о влиянии этанола на гемолитическую устойчивость эритроцитов кролика с активной или неактивной каталазой. Клетки инкубировали с 0,5 % этанолом в течение 1 ч до проведения гемолиза. За 100 % были приняты контрольные величины Ттах и %тах для клеток, не преинкубиро-ванных с этанолом. Для эритроцитов с активной каталазой эти величины составили 4,5+0,25 мин и 27±5 % в условиях кислотного гемолиза, и 27±5 сек и 20±4% в условиях окислительного гемолиза. Соответствующие контрольные величины Т11ИХ и %тах для клеток с инактивированной каталазой были равны 4,0±0,25 мин, 25+3 % в условиях кислотного гемолиза, и 25±5 сек, 27±5 % в условиях окислительного гемолиза, что достоверно не отличалось от соответствующих показателей эритроцитов с активной каталазой.

Таблица 1

Влияние этанола на параметры, характеризующие гемолитическую устойчивость эритроцитов кролика с активной или неактивной каталазой

Условия гемолиза Активность каталазы Ттах (% от контроля) %тах (% от контроля)

Кислотный Активна 89,8±1,4* 95,3±4,3

Неактивна 82,717,7* 114,3±12,7

Окислительный Активна 94,5±3,4* 168,9±33,0*

Неактивна 112,0±11,5 75,2±5,9*

Примечание: представлены средние величины, полученные в 7 независимых экспериментах. Данные представлены в % от контрольных величин; * - различия достоверны по сравнению с контролем, р < 0,05.

При кислотном и окислительном гемолизе клеток с активной или неактивной каталазой величины Ттах и %тах под влиянием этанола изменяются по-разному. Так, обработка этанолом обоих типов клеток приводила к значительному снижению Тми и не влияла на %тах при кислотном гемолизе. Однако при окислительном гемолизе инкубация эритроцитов с этанолом приводила к менее значительному снижению Тщах, но существенному повышению %шах в клетках с активной каталазой, в то время как в клетках с ингибированной каталазой наблюдалось достоверное снижение %тах при незначительном повышении Ттах. Таким образом, в условиях кислотного гемолиза, когда каталаза не активна, этанол продолжает оказывать дестабилизирующий эффект на эритроциты. Следовательно, этот дестабилизирующий эффект этанола не связан с его превращением под действием каталазы, а скорее всего обусловлен прямым действием немета-болизированного этанола на эритроцитарную мембрану или другие клеточные компоненты. В условиях окислительного гемолиза эффект этанола на эритроциты обусловлен главным образом действием продуктов окислительного метаболизма этанола. Это подтверждают данные, полученные в экспериментах с пре-инкубацией эритроцитов с этанолом, каталаза которых неактивна (табл. 1), которые свидетельствуют о том, что в условиях, когда продукция ацетальдегида

нарушена путем ннгибирования каталазы, чувствительность эритроцитов к окислительному гемолизу снижается (наблюдается некоторое повышение Ттах и существенное снижение %тах). Можно предположить, что дестабилизирующий эффект этанола на эритроциты в условиях окислительного гемолиза обусловлен, в частности, накоплением свободных радикалов в процессе окисления этанола и последующим перекисным окислением мембранных липидов и белков [Halliwell. В., Gutteridge J.M.C., 1999; Reinke L.A. et al., 1997]. Ацетальдегид, образующийся в процессе функционирования каталазы, может быть одним из факторов, снижающих устойчивость клеток к окислительному гемолизу, поскольку прямой дестабилизирующий эффект ацетальдегида на эритроциты в этих условиях также был обнаружен (рис. 2).

1.2. Влияние этанола и ацетальдегида на эритроцнтарные белки

Следующим этапом работы было сопоставление влияния 85 мМ этанола, а также ацетальдегида и глутарового альдегида в концентрациях 5 и 50 мМ, на устойчивость эритроцитов кролика к окислительному гемолизу, морфологию клеток и эритроцитарные белки. Как показано выше, инкубация эритроцитов с 85 мМ этанолом приводит к снижению устойчивости клеток к действию гемолити-ков. При этом изменений в состоянии эритроцитарных белков, как и нарушения морфологии клеток, мы не обнаружили.

По данным литературы ацетальдегид способен модифицировать белки, взаимодействуя, в частности, с их свободными аминогруппами [Gaines К.С. et al., 1977]. Мы провели исследование влияния ацетальдегида на белковый состав эритроцитов. Аналогичные исследования были проведены с глутаровым альдегидом, который, благодаря наличию двух альдегидных групп, является «сшивающим» агентом, часто используемым в экспериментах для кросс-линкинга белков [Steck N.L., 1972]. Инкубация эритроцитов с 5 или 50 мМ ацетальдегида делает эритроциты менее устойчивыми к действию NaOCl. В присутствии 50 мМ ацетальдегида это действие более выражено. Ни 5 мМ, ни 50 мМ ацетальдегид in vitro не нарушали морфологию эритроцитов. Глутаровый альдегид в тех же условиях повышал устойчивость эритроцитов к гемолизирующему действию гипохлорита натрия и приводил к существенному нарушению формы клеток.

При электрофорезе белков эритроцитов в ПААГ мы обнаружили, что обработка мембран эритроцитов кролика как 5 мМ, так и 50 мМ ацетальдегида не приводит к появлению новых полос, соответсвующих высокомолекулярным белкам, то есть процесса кросс-линкинга не происходит. В то же время такая обработка затрудняет экстракцию спектрина и актина из мембран эритроцитов (рис. 3). Глутаральдегид, как и ацетальдегид, затрудняет экстракцию спектрина и актина из теней эритроцитов, кроме того, он индуцирует процесс кросс-линкинга эритроцитарных белков (рис. 3). На электрофореграмме белков мембран, обработанных глутаровым альдегидом, видны полосы, соответствующие высокомолекулярным белкам, которые не обнаруживаются ни в контроле, ни после обработки мембран ацетальдегидом. Полученные данные позволяют предположить, что кросс-линкинг эритроцитарных белков может приводить к нарушению морфологии клеток.

При исследовании окислительной модификации белков эритроцитов человека под влиянием этанола и ацетальдегида in vitro было обнаружено, что инкубация эритроцитов с этанолом в диапазоне концентраций 0,1-0,5 % в течение 1 ч не приводит к каким-либо изменениям уровня карбонилирования эритроцитарных белков. Можно предположить, что повреждающее действие этанола на эритроциты реализуется, в основном, через его действие на липидную компоненту мембран.

Рис. 3. Влияние ацетальдегида и глутаральдегида на белки эритроцитов. Элек-трофореграммы белков мембран эритроцитов после экстракции спектрина и актина (дорожки 1-3) и экстрактов спектрина и актина (дорожки 4-6). Дорожки 1 и 4 - без обработки мембран. Дорожки 2 и 5 - после обработки мембран эритроцитов ацетальдегидом (5 мМ). Дорожки 3 и 6 - после обработки мембран глу-таральдегидом (5 мМ). С, А - указывают расположение полос спектрина и актина в гелях, соответственно

В то же время после инкубации эритроцитов с ацетальдегидом (0,05 % и 0,25 %) наблюдалось увеличение карбонилов белков. Уровень окислительной модификации белков эритроцитов под действием ацетальдегида зависит от концентрации и времени его воздействия (рис. 4).

Таким образом, окислительная модификация белков эритроцитов под действием ацетальдегида при отсутствии кросс-линкинга белков приводит к снижению гемолитической устойчивости клеток к действию №ОС1, при этом морфология клеток не нарушается. Модификация белков под действием глутаральдегида, приводящая к «сшивке» белков, существенно повреждает форму эритроцитов.

Молекулярный механизм снижения гемолитической устойчивости эритроцитов под действием этанола, вероятно, связан главным образом с изменением не белковой, а липидной компоненты эритроцитарных мембран, поскольку преин-кубация клеток с этанолом не приводит к заметным изменениям в белковом спектре и окислительном статусе белков эритроцитов.

1 2 3

4 5 6

12345 67 8 9

Рис. 4. Результаты Вестерн-блот анализа, проведенного с использованием антител против БИР-меченных по карбонилам белков. Препараты белков теней эритроцитов здорового донора после инкубации с ацетальдегидом. 1, 2, 3 - контроль, без АцА; 4, 5,6 - 0,05 % АцА; 7,8,9 - 0,25 % АцА. 4 и 7 - время инкубации с АцА 1 час; 5 и 8 - время инкубации с АцА 6 час; 6 и 9 - время инкубации с АцА 18 часов

1.3. Влияние этанола и ацетальдегида на микровязкость мембран эритроцитов

Для характеристики эффектов этанола и ацетальдегида на микровязкость мембран эритроцитов мы использовали метод флуоресцентного анализа. В качестве флуоресцентного зонда был использован пирен - неполярное соединение, молекулы которого распределяются в гидрофобном компартменте мембраны и способны образовывать эксимеры. Степень эксимеризации пирена (р47о/Рз92) зависит от микровязкости гидрофобного окружения и может служить ее характеристикой. Наши исследования показали, что инкубация теней эритроцитов здоровых доноров в течение 30 мин как с этанолом (в концентрациях 0,25 % и 0,5 %), так и с ацетальдегидом (в концентрациях 0,1 % и 0,25 %) приводит к увеличению степени эксимеризации пирена (табл. 4), то есть к снижению микровязкости липидного матрикса эритроцитарных мембран.

Таким образом, снижение микровязкости гидрофобной области мембран эритроцитов без изменения белков мембранного каркаса под действием этанола приводит к дестабилизации клеток в условиях как кислотного, так и окислительного гемолиза. Снижение микровязкости гидрофобной области мембран эритроцитов с одновременной модификацией белков под действием ацетальдегида дестабилизирует клетки только в условиях окислительного гемолиза, устойчивость эритроцитов к гемолизирующему действию кислоты при этом не изменяется.

1.4. Роль этиловых эфиров жирных кислот в повреждении мембран эритроцитов

В эритроцитах синтеза этиловых эфиров жирных кислот (ЭЭЖК) не происходит [Gorski N.P. et al., 1996; Saghir M. et al., 1999]. Однако, как было показано Doyle K.M. et al. (1994), употребление этанола приводит к повышению уровня ЭЭЖК в сыворотке крови человека. ЭЭЖК являются липофильными соединениями. Поэтому, при повышении их уровня в крови в результате хронического поступления этанола в организм человека, эти метаболиты неокислительного превращения этанола могут взаимодействовать с мембранами эритроцитов, приводя к модификации структуры и функции клеток крови. Наши исследования in vitro показали, что инкубация эритроцитов с этиловыми эфирами линоленовой (ЭЭЛК) и пальмитиновой (ЭЭПК) кислот в течение 24 ч приводит к встраиванию обоих соединений в мембрану эритроцитов (табл. 2).

Таблица 2

Содержание этиловых эфиров линоленовой (ЭЭЛК) и пальмитиновой (ЭЭПК) жирных кислот в мембранах эритроцитов здоровых доноров после 24 часовой инкубации эритроцитов в присутствии 100 мкМ ЭЭЖК in vitro

Этиловый эфир жирной кислоты Концентрация в мембране (мкг эфира/мг белка)

Без ЭЭЖК Не определяется (п = 6)

ЭЭЛК 0,95±0,021 (п = 4)

ЭЭПК 1,25±0,051 (п — 6)

Примечание: п - количество доноров.

Анализ спонтанного гемолиза эритроцитов после их преинкубации с ЭЭЖК обнаружил значительное снижение стабильности эритроцитов после встраива-> ния в их мембрану как ЭЭЛК, так и ЭЭПК. При инкубации эритроцитов с ЭЭЖК в присутствие физиологических концентраций альбумина (40 мг/мл) - белка, который способен связывать ЭЭЖК в крови, - дестабилизирующий эффект ЭЭЖК , на клетки снижался, однако все еще достоверно выявлялся (рис. 5).

Снижение стабильности эритроцитов может сопровождаться нарушением асимметрии распределения фосфатидилсерина между внутренним и внешним монослоями мембраны, а именно, может происходить перераспределение фосфатидилсерина с внутренней поверхности липидного бислоя на наружную [Diaz С. et al., 1996; Kuypers F.A. et al., 1998]. Встраивание липофильных ЭЭЖК в мембрану эритроцита может являться одной из причин такого перераспределения. Действительно, наши исследования методом флоуцитометрии с помощью флуорес-цеинизотиоцианат-меченного аннексина V показали, что при инкубации эритроцитов с ЭЭЛК уровень наружного фосфатидилсерина достоверно возрастал на 14 %, а с ЭЭПК - на 4 % (р<0,05). При этом морфология клеток не изменялась.

g 700 600

й 500

I 400

1 300 I 200

1 100

Рис. 5. Влияние ЭЭЖК на спонтанный гемолиз эритроцитов человека. Представлены данные эффектов инкубации эритроцитов со 100 мкМ этиловых эфи-ров линоленовой (ЭЭЛК) и пальмитиновой (ЭЭПК) жирных кислот в течение 24 часов без альбумина (серые столбики) и с альбумином (40 мг/мл) (светлые столбики). Уровень гемолиза эритроцитов в контроле (без ЭЭЖК) составлял 0,64±0,04 % и был принят за 100 %. * - различия достоверны по сравнению с контролем, р < 0,05

Таким образом, в экспериментах in vitro обнаружено, что этиловые эфиры жирных кислот, в силу своей липофильности, способны встраиваться в биомембраны, индуцируя при этом перераспределение фосфатидилсерина между внутренним и внешним монослоями липидного бислоя и дестабилизируя клетки, не нарушая при этом их морфологию.

II. Динамика структурно-функциональных параметров эритроцитов больных алкоголизмом в процессе традиционной дезинтоксикационной терапии

Как показали эксперименты с нормальными эритроцитами и их мембранами in vitro, этанол и его метаболиты - ацетальдегид и этиловые эфиры жирных кислот - способны оказывать повреждающее действие на клеточные мембраны. Дальнейшим этапом работы было изучение особенностей структурно-функционального статуса эритроцитов больных алкоголизмом, то есть оценка эффекта этанола и его метаболитов на эритроциты in vivo. По данным литературы у больных алкоголизмом в состоянии абстиненции часто наблюдается явление пойкилоцитоза, развивается макроцитоз [Gil Е.В., et al., 1989; Homaidan F.R., etal., 1986]. Изменение морфологии эритроцитов сопровождается снижением времени их жизни и развитием анемии [Chi L.M., Wu W.G., 1991; Bizzaro N., etal., 1993]. Мы провели оценку динамики структурно-функциональных характеристик эритроцитов больных алкоголизмом с давностью заболевания не менее пяти лет за период стационарного лечения (30-35 дней) методами традиционной дезинтоксикационной терапии.

Без ЭЭЖК ЭЭЛК ЭЭПК

11.1. Морфология эритроцитов больных алкоголизмом на разных стадиях лечения

С помощью методов световой и сканирующей электронной микроскопии у всех обследуемых больных алкоголизмом в период абстиненции были обнаружены более или менее выраженные изменения морфологии эритроцитов периферической крови.

На рис. 6 представлены микрофотографии эритроцитов здорового донора (рис. 6 А) и больного алкоголизмом в период абстиненции (рис. 6 Б). В целом у больных на фоне снижения количества нормальных двояковогнутых дискоцитов увеличивается число клеток с единичными и множественными выростами, конической формы с округлой вершиной, с гребнем, клеток в виде «спущенного мяча», плоского диска, а также эритроцитов куполообразной и сферической формы.

Рис. 6. Электронные микрофотографии эритроцитов периферической крови: А - здорового донора; Б - больного алкоголизмом II стадии в период абстиненции. (По данным сканирующей электронной микроскопии; увеличение в 1000 раз)

Статистический анализ показал, что у здоровых доноров количество нормальных клеток (дискоцитов) составляет 87,2±5,0 % (п=12), у больных алкоголизмом в состоянии абстиненции это количество было достоверно меньше - 66,8+7,6 % (п=15), р< 0,025. У больных, находящихся в состоянии формирования ремиссии после лечения, процент нормальных клеток повышается до 74,8+5,1 % (п=11), однако остается достоверно ниже нормы (р< 0,025).

11.2. Гемолитическая устойчивость эритроцитов больных алкоголизмом на разных стадиях лечения

Оценку стабильности эритроцитов больных алкоголизмом проводили методом кислотных эритрограмм [Терсков И.А., Гительзон И.И., 1957]. Кислотная эритрограмма здоровых доноров достаточно стабильна и хорошо воспроизводима. Основные средние параметры эритрограмм здоровых доноров и больных алкоголизмом в стадии абстиненции и в стадии формирования ремиссии представлены в табл.3.

Таблица 3

Основные параметры эритрограмм здоровых доноров и больных алкоголизмом на разных стадиях лечения

Доноры п Тщах, МИН %ПШХ) %

Здоровые 15 3,54±0,14 21,35±2,28

Больные в стадии абстиненции 17 3,20+0,27 23,10± 2,10

Больные в стадии формирования ремиссии 15 3,4010,40 21,50±2,20

Примечание: п - количество обследованных доноров.

У больных алкоголизмом в состоянии абстиненции наблюдается тенденция к сдвигу эритрограммы влево - несколько снижается Т^ и повышается %1ШХ. И хотя этот сдвиг не является достоверным (р > 0,05), можно предполагать, что в данной группе доноров доля эритроцитов со сниженной устойчивостью к гемолизирую-щему действию кислоты повышена. После лечения больных (в стадии формирования ремиссии) средние параметры их эритрограмм практически не отличаются от контрольных (табл. 3), что свидетельствует о повышении стабильности основной массы эритроцитов у больных алкоголизмом за время лечения.

II.3. Белки эритроцитов больных алкоголизмом

Методом ЭФ в ПААГ мы исследовали белковый состав мембран эритроцитов здоровых доноров и больных алкоголизмом. В тенях эритроцитов больных алкоголизмом, полученных из эритроцитов с патологически измененной формой, были выявлены высокомолекулярные белки, которые не обнаруживались в образцах теней, полученных из морфологически нормальных эритроцитов (рис. 7 А). Появление высокомолекулярных белков в мембранах эритроцитов может свидетельствовать о кросс-линкинге белков. Качественная оценка уровня карбонилирования белков эритроцитов методом Вестерн-блот показала, что степень окислительного повреждения белков в клетках больных алкоголизмом с нарушенной морфологией существенно выше, чем в клетках больных с нормальной морфологией или клетках здоровых доноров (рис. 7 Б).

Вероятно, при совместном хроническом воздействии in vivo этанол и ацеталь-дегид в повышенных концентрациях способны приводить к кросс-линкингу белков и их окислительной модификации, а также к изменению физико-химического состояния фосфолипидного бислоя эритроцитов. Сочетание этих эффектов может быть одной из причин нарушения морфологии и снижения стабильности клеток при алкоголизме. В то же время при данном заболевании нельзя не учитывать роль других факторов, таких, в частности, как нарушение кислотно-щелочного равновесия и изменение реологических свойств крови, нарушение ионных обменных процессов (Умудов Х.М., 1987; Elgsaeter A. et al., 1986), повышение степени неэффективного эритропоэза (Сычева В.А., 1975; Шапиро Ю.Л. и соавт., 1983;

Яковченко В.А. и соавт., 1987) и др., которые in vivo также вносят существенный вклад в нарушение формы эритроцитов и снижение их стабильности.

11.4. Микровязкость мембран эритроцитов больных алкоголизмом на разных этапах лечения: влияние этанола и ацетальдегида

Одной из причин появления в кровеносном русле трансформированных эритроцитов, находящихся на различных стадиях онтогенеза (способные к обратной трансформации в дискоциты переходные формы, необратимо трансформированные предгемолитические и дегенеративно измененные эритроциты), является модификация липидной фазы эритроцитарной мембраны, изменение ее микровязкости.

123456789 10 123456789 10

Рис. 7. Анализ белкового состава препаратов методом ЭФ в ПААГ (А) и результат последующего Вестерн-блот анализа, проведенного с использованием антител против DNP-меченных белков (Б). 1 - окисленный бычий сывороточный альбумин (ОБСА), обработанный раствором, не содержащим DNPH (- DNPH);

2 - ОБСА, обработанный раствором, содержащим DNPH (+DNPH); 3 - тени морфологически измененных эритроцитов больного алкоголизмом (+ DNPH); 4 - тени морфологически нормальных эритроцитов больного алкоголизмом (+ DNPH); 5 - тени эритроцитов здорового донора (+ DNPH); 6 - то же, что и

3 (- DNPH); 7 - то же, что и 4 (- DNPH); 8 - то же что и 5 (- DNPH); 9 - коммерческий препарат смеси стандартных белков (- DNPH); 10 - смесь стандартных белков (тироглобулин 330 кДа, ферритин 220 кДа, альбумин 67 кДа, катала-за 60 кДа, лактатдегидрогеназа 36 кДа) (- DNPH)

Мы провели исследование микровязкости мембран эритроцитов больных алкоголизмом в состояниях абстиненции и формирования ремиссии с помощью флуоресцентного зонда пирена. Оказалось, что степень эксимеризации пирена в мембранах эритроцитов больных алкоголизмом достоверно снижена по сравнению с мембранами здоровых доноров (табл. 4). Это свидетельствует о более плотной упаковке жирнокислотных цепей липидов в эритроцитарных мембранах пациентов, о повышенной жесткости этих биомембран по сравнению с нормой. Полученный нами факт хорошо согласуется с данными литературы [Beauge F. et al., 1987; Miller N.S., 1990].

«w

Таблица 4

Влияние этанола и ацеталъдегида на степень эксимеризации пирена (Р4701Р39^ в тенях эритроцитов разных групп доноров

Обследованные Контроль Этанол Ацетальдегид

группы 0,25 % 0,50 % 0,10 % 0,25 %

Здоровые 1,10±0,11 1,28±0,04* 1,30±0,03* 1,35±0,04* 1,3110,03*

доноры (В) (5) (8) (3) (8)

Больные в стадии абстиненции 0,69+0,10" (5) 0,78±0,11# (3) 0,81±0,07* (3) 0,69±0,16# (3) 0,74±0,15# (3)

Больные

в стадии формирования 0,74±0,08* (9) 0,84±0,09# (8) 0,97±0,10*# (7) 0,85±0,12# (4) 0,71±0,14# (4)

ремиссии

Примечание: в скобках указано количество обследованных доноров; * - различия достоверны по сравнению с соответствующей группой здоровых доноров, р<0,025, * - различия достоверны по сравнению с соответствующим контролем, р<0,05.

Степень эксимеризации пирена в мембранах больных, находящихся в состоянии формирования ремиссии, несколько повышена по сравнению с этим показателем у больных в состоянии абстиненции. И хотя достоверной разницы между этими группами больных мы не обнаружили, видно, что по мере перехода больного из состояния абстиненции в состояние ремиссии под влиянием проводимых дезинтоксикационных меропрятий наблюдается тенденция к увеличению текучести липидного матрикса в их эритроцитах.

О том, что в процессе лечения пациента мембраны его эритроцитов изменяют свои свойства, свидетельствуют также результаты, полученные нами при сравнительном изучении влияния этанола и ацетальдегида на степень эксимеризации пирена в мембранах здоровых доноров и больных в состоянии абстиненции и формирования ремиссии. Как уже говорилось выше, преинкубация мембран эритроцитов здоровых доноров с этанолом в концентрации 0,25 % и 0,50 % приводила к повышению степени эксимеризации пирена в этих мембранах; другими словами, этанол оказывал разупорядочивающее влияние на липидный бислой теней нормальных эритроцитов. Ацетальдегид в концентрациях 0,10 % и 0,25 % также приводил к достоверному повышению гидрофобного объема мембран эритроцитов здоровых доноров.

Липидный матрикс мембран эритроцитов больных алкоголизмом в состоянии абстиненции оказался не чувствительным к действию как этанола, так и ацетальдегида (табл. 4). Ни в одном случае, ни этанол, ни ацетальдегид в используемых концентрациях достоверного влияния на степень эксимеризации пирена в данных мембранах не оказывали. Эти результаты свидетельствуют об изменении физического состояния гидрофобной области мембран в данной группе пациентов и не противоречат данным литературы, согласно которым изменения липидного бис-

лоя мембран в результате длительного действия этанола сводятся к тому, что мембрана адаптируется, изменяя обмен составляющих ее липидов, становясь более упорядоченной. В этом новом физическом состоянии мембрана устойчива к дальнейшему действию экзогенного алкоголя, «толерантна» к его эффектам и одновременно «зависима» от его присутствия [Chin G.H., Gold-stein D.B., 1977].

Гидрофобная область мембран эритроцитов больных алкоголизмом, находящихся в стадии формирования ремиссии, оказалась чувствительной к 0,5 % этанолу, то есть после лечения чувствительность липидного матрикса к хаотропно-му действию этанола частично восстанавливается. Однако ацетальдегид достоверного влияния на микровязкость мембран больных данной группы не оказывал (табл. 4). По данным литературы [Latge С. et al., 1987] воздействие ацеталь-дегида на липидный матрикс лишь частично повторяет таковое этанола. Наши й результаты находятся в соответствии с этими данными: мембраны эритроцитов больных алкоголизмом, модифицированные под влиянием хронической алкоголизации и ставшие не чувствительными к воздействию как этанола, так и аце-тапьдегида, в результате проведенного лечения вновь приобретают чувствительность к солюбилизирующему действию этанола, оставаясь при этом не чувствительными к действию ацетальдегида.

Таким образом, этанол, как и ацетальдегид, способен снижать микровязкость мембран эритроцитов здоровых доноров. Хроническая алкоголизация приводит к изменениям физико-химического состояния мембран эритроцитов, в результате чего мембраны становятся не чувствительными к солюбилизирующему действию как этанола, так и ацетальдегида. В процессе лечения пациентов мембраны их эритроцитов претерпевают изменения и вновь приобретают способность реагировать на добавленный этанол, однако чувствительность к ацетальдегиду у этих мембран не восстанавливается.

Одной из причин изменения микровязкости мембран эритроцитов больных алкоголизмом и снижения стабильности клеток могло бы быть накопление в клеточных мембранах этиловых эфиров жирных кислот. Для проверки этого * предположения мы исследовали содержание ЭЭЖК в мембранах эритроцитов больных алкоголизмом. Нам не удалось обнаружить ЭЭЖК в мембранах эритроцитов больных алкоголизмом как в стадии абстиненции, так и в стадии фор-^ мирования ремиссии. Таким образом, мы показали, что данный механизм повреждения мембран эритроцитов in vivo не реализуется.

II.5. Na/K-АТФязэ эритроцитов больных алкоголизмом на разных этапах лечения: изменение чувствительности к ионам магния

Na/K-АТФаза является мембраносвязанным ферментом, активность которого в значительной степени зависит как от физического состояния липидного окружения, так и от электролитного состава окружающей мембрану жидкости. В норме электролитный состав плазмы крови и цитоплазматической жидкости сбалансирован. При алкоголизме водно-солевой баланс нарушается, изменяются как вне-, так и внутриклеточные концентрации калия, натрия, кальция, магния.

По данным литературы при хронической алкоголизации концентрация Mg2+ в сыворотке крови снижается [Ураков И.Г., 1986]. На культуре гладко-мышечных клеток сосудов головного мозга собаки было показано, что этанол содействует быстрому истощению внутриклеточного свободного Mg2+. Введение Mg2+-содержащих препаратов животным защищает их от повреждений, обусловленных действием высоких доз этанола [Altura В.М. et al., 1995]. Эффективность магний-содержащих препаратов продемонстрирована и в клинике алкоголизма [DePetrillo P., Peterson D., 1992].

Известно, что Mg2+ является кофактором многих ферментативных реакций. В частности, Mg2+ необходим для Na/K-АТФазы, так как, с одной стороны, он участвует в образовании субстрата, которым является MgATO, с другой стороны, Mg2+ ускоряет переход фермента из EjP в Е2Р форму. Кроме того, магний оказывает существенное действие на структуру биомембран, изменяя эффективный гидрофобный объем и увеличивая подвижность жирнокислотных цепей ли-пидов [Boldyrev А.А. et al., 1977]. Важная роль ионов магния для Na/K-АТФазы и дефицит этого катиона у больных алкоголизмом стали основанием для проведения опытов по изучению влияния разных концентраций магния на активность Na/K-АТФазы в эритроцитах больных алкоголизмом (данные эксперименты проведены in vitro).

Мы обнаружили, что у всех больных алкоголизмом II стадии в период абстиненции активность Na/K-АТФэзы эритроцитов достоверно выше, чем в контрольной группе (р < 0,05). Процент активации фермента оказался различным при разных концентрациях магния. В результате характер зависимости активности фермента от концентрации Mg2+ в среде инкубации в данной группе больных оказался измененным по сравнению с контролем (рис. 8).

На 5-7 день лечения пациентов (после купирования у них абстинентного синдрома) мы обнаружили достоверное повышение активности Na/K-АТФазы у больных по сравнению со здоровыми донорами лишь при 6 мМ MgCl2 (рис. 8). При этом характер зависимости АТФазы от концентрации ионов магния в среде инкубации оставался таким, как в период абстиненции.

После лечения на стадии формирования ремиссии активность Na/K-АТФазы эритроцитов пациентов практически не отличалась от нормы.

Ранее мы показали, что хроническое воздействие этанола на организм человека приводит к упорядочению структуры клеточных мембран, что обусловливает снижение их текучести и увеличение устойчивости к дезорганизующему действию этанола (табл. 4). С помощью флуоресцентного зонда пирена мы обнаружили, что магний увеличивает гидрофобный объем мембран эритроцитов больных алкоголизмом: с ростом концентрации ионов магния в среде инкубации увеличивалась и степень эксимеризации пирена. Эти результаты хорошо согласуются с данными литературы [Boldyrev А.А. et al., 1977; Болдырев А.А., Тверди-словВ.А, 1978], в которых методом ЭПР с помощью гидрофобных спиновых зондов было показано, что в присутствии магния увеличивается подвижность жирнокислотных цепей липидов и гидрофобный объем биомембран.

Можно предположить, что в наших экспериментах с Na/K-АТФазой добавление хлористого магния в концентрации 3 мМ и 6 мМ к эритроцитам больных в состоянии абстиненции, когда микровязкость мембран клеток повышена, приводит к снижению их микровязкости, что отражается на активности Na/K-АТФэзы. У здоровых доноров мембрана эритроцита исходно находится в другом физическом состоянии. По этой причине, вероятно, увеличение концентрации хлористого магния с 3 до 6 мМ практически не отражается на активности Na/K-АТФазы (рис. 8).

мкмоль Фн/час.мл

12 j 10 -

8 -6 -4 -2

0 -I-1-1-1-1

0 3 6 9 12

Мд2\ мМ

Рис. 8. Зависимость активности Na/K-АТФэзы эритроцитов человека от концентрации Mg2+ в инкубационной среде. Концентрация АТФ во всех случаях -2 мМ. А - здоровые доноры (п=19); Б - больные алкоголизмом до купирования абстинентного синдрома (п=33); В - больные алкоголизмом после купирования абстинентного синдрома (п=29); Г - больные алкоголизмом после лечения на стадии формирования ремиссии (п=25). * - различия достоверны по сравнению с контролем, р < 0,05; п - количество обследованных доноров

р>

Увеличение концентрации хлористого магния in vitro до 12 мМ (до концентраций, значительно превышающих физиологические) приводит к ингибирова-^ нию Na/K-АТФазы во всех группах доноров. В данном случае, по-видимому, включаются дополнительные механизмы влияния ионов магния на активность рассматриваемого фермента.

Практически одинаковые Mg^-зависимости активности Na/K-АТФазы у здоровых доноров и доноров, больных алкоголизмом после лечения на стадии формирования ремиссии, свидетельствуют о существенном изменении свойств мембран и мембранных ферментов эритроцитов пациентов в процессе прохождения ими курса дезинтоксикационной терапии.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что при хроническом влиянии этанола на организм в условиях тотального Мя2+-дефицита возрастает чувствительность Na/K-АТФазы к данному катиону. В период ремиссии чувствительность Na/K-АТФазы к магнию возвращается к нормальному уровню. Один

-А -Б -В -Г

из способов реализации активирующего эффекта магния на Иа/К-АТФазу при алкоголизме заключается в способности данного катиона повышать гидрофобный объем биомембран, что, вероятно, приводит к ускорению перехода фермента, являющегося интегральным мембранным белком, из одной формы (Е[Р) в другую (Е2Р) в течение ферментативного цикла.

Увеличение Na/K-АТФазы эритроцитов у больных в состоянии абстиненции косвенно свидетельствует о повышении проницаемости мембран для ионов натрия. В результате происходит активация мембранных систем, ответственных за поддержание низкого внутриклеточного уровня данного катиона, что неизбежно должно привести к перераспределению ионных потоков через мембрану, изменению трансмембранного концентрационного градиента одновалентных катионов, изменению рН цитоплазмы и осмотического давления в эритроцитах. Это, в свою очередь, не может не отражаться на форме клеток и сродстве гемоглобина к кислороду, так как изменение рН и нарушение формы существенно влияет на процессы насыщения гемоглобина кислородом в легких и его высвобождения в тканях. Кроме того, у клеток с патологически измененной формой понижена пластичность, что затрудняет прохождение их через узкие изогнутые капилляры. Таким образом, у больных алкоголизмом в состоянии абстиненции эффективность функционирования эритроцитов как переносчиков кислорода значительно снижается. В результате развивается тканевая гипоксия, что хорошо известно из клинической практики и литературных источников [Иванец Н.Н., Валентик Ю.В., 1988].

III. Са2+-активируемые К+-каналы мембран эритроцитов больных алкоголизмом

III.1. Са1+-зависимая калиевая проницаемость мембран эритроцитов больных алкоголизмом в состоянии абстиненции

Определенный вклад в изменение деформируемости эритроцитов вносят К+(Са2+) -каналы этих клеток [Dodson R.A. et al., 1987].

У больных алкоголизмом в состоянии абстиненции амплитуда гиперполяризационного ответа эритроцитов на добавку Са2+-ионофора А23187 (АЕ), являющаяся интегральной характеристикой оперирования Са2+-активируемых К+-канапов [Ugar О., Onaran Н.О., 1997; Петрова И.В., 1999], значительно увеличена по сравнению с контрольными значениями. В эритроцитах здоровых доноров в изоосмотической среде (320 мОсм) этот параметр составлял -32,23±1,77 мВ (п=12), а в эритроцитах больных алкоголизмом - -38,19±1,22 мВ (п=13), р < 0,02. Поскольку известно, что гиперполяризация мембраны клеток в наших условиях обусловлена открыванием К+ (Са2+)-каналов и выходом ионов калия [Vestergaard - Bogind В. et al., 1987], полученные результаты свидетельствуют об увеличении Са2+-зависимой К+-проницаемости мембран эритроцитов больных алкоголизмом.

Полученные результаты еще раз подтверждают, что у больных алкоголизмом в состоянии абстиненции мембранные системы, обеспечивающие транспорт катионов, благодаря наличию в организме разнообразных регуляторных механизмов,

переходят в новое функциональное состояние, пытаясь приспособить клетку к работе в новых условиях, создавшихся в результате хронического действия этанола и его метаболитов. Однако резервы адаптации in vivo ограничены. Нарушение трансмембранных градиентов катионов, в частности, в результате ускоренного выхода ионов калия из эритроцитов, может являться одной из основных причин изменения морфологии эритроцитов, снижения их устойчивости к гемолизу и способности к деформациям [Dodson R.A. et al., 1987; Петрова И.В., 1999].

III.2. Роль мембранного каркаса эритроцитов в регуляции

В литературе имеются косвенные данные о том, что белки мембранного каркаса участвуют в регуляции К+(Са2+)-каналов эритроцитов [Орлов С.Н и др. 1992; Петрова И.В., 1999]. Изменение объема эритроцитов при изменении осмолярно-сти среды in vitro и при различных патологиях приводит к перестройке структурной организации белков мембранного каркаса клеток [Brugnara С., Tosteson D.C., 1987]. Исследование объем-зависимой регуляции К+(Са2+)-каналов показало существенное различие зависимости амплитуды гиперполяризационных ответов эритроцитов от осмолярности среды у здоровых лиц и у больных алкоголизмом.

При набухании в гипоосмотической среде (220 мОсм) амплитуда гиперполяризационного ответа мембраны эритроцитов здоровых доноров не отличалась от значений, полученных в изоосмотических условиях. Амплитуда гиперполяризационного ответа мембраны эритроцитов больных алкоголизмом при 220 мОсм оказалась достоверно ниже значения, полученного в изоосмотических условиях. В то же время ДЕ оставался существенно повышенным по сравнению с данным параметром у здоровых доноров в аналогичных условиях (р < 0,02) (Рис. 9).

220 320 420 520

Осмолярность, мОсм

Рис. 9. Зависимость амплитуды гиперполяризационного ответа эритроцитов от осмолярности среды инкубации у здоровых доноров (К, п=12) и у больных алкоголизмом (А, п=13). * - различия с контролем достоверны, р < 0,02

каналов

-50 -i

При сжатии эритроцитов здоровых доноров в гиперосмотической среде максимальная амплитуда гиперполяризационного ответа клеток наблюдалась при 420 мОсм. При 520 мОсм вновь происходило некоторое снижение ДЕ. Амплитуда гиперполяризационного ответа эритроцитов больных алкоголизмом при увеличении осмолярности среды постепенно снижалась (рис. 9). При 420 мОсм и 520 мОсм АЕ в эритроцитах больных алкоголизмом не отличалась от соответствующих значений в эритроцитах здоровых доноров.

Полученные данные свидетельствуют о различной чувствительности К+(Са2+)-каналов к изменению объема эритроцитов у больных алкоголизмом и здоровых доноров. Можно предположить, что изначально существуют различия в органи- у зации мембранного каркаса эритроцитов у здоровых и больных алкоголизмом, которые приводят к неодинаковым структурным сдвигам мембранного каркаса в динамических условиях растяжения и сжатия клеток. ,

Проверка этого предположения была проведена с помощью подхода, при котором исключалось участие одного из основных белков мембранного каркаса -спектрина - в объем-зависимых реакциях клетки. Как показали Shnyrov V.L. et al. (1990), инкубация эритроцитов при 50 °С в течение 10 мин приводит к необратимой инактивации спектрина. Этот подход мы использовали для выяснения роли белков мембранного каркаса эритроцитов в объем-зависимой регуляции К+(Са2+)-каналов.

После тепловой денатурации спектрина эритроцитов как здоровых доноров, так и больных алкоголизмом, амплитуда гиперполяризации достоверно снижалась, причем в обеих группах доноров исчезала зависимость ДЕ от осмолярности среды инкубации (рис. 10). Кроме того, после термоинактивации спектрина при всех значениях осмолярности исчезала разница в величине гиперполяризационного ответа между экспериментальными группами доноров.

Рис. 10. Зависимость амплитуды гиперполяризационного ответа эритроцитов от осмолярности среды инкубации у здоровых доноров (К, п=12) и у больных алкоголизмом (А, п=13) после тепловой денатурации белков мембранного каркаса при 50 °С в течение 10 минут

220 320 420 520

Осмолярность, мОсм

Полученные результаты свидетельствуют о важной роли белков мембранного каркаса в регуляции К+(Са2+)-каналов эритроцитов. Различная чувствительность каналов интактных эритроцитов к изменению объема клеток у здоровых доноров и больных алкоголизмом позволяет предполагать модификацию свойств мембранного каркаса эритроцитов при алкоголизме.

IV. Окислительная модификация белков и липидов сыворотки крови, фагоцитарная и дыхательная активность нейтрофилов у больных алкоголизмом в динамике лечения

IV.1. Содержание продуктов перекисного окисления липидов и карбони-лированных белков в сыворотке крови больных алкоголизмом на разных стадиях лечения

Окисление белков и липидов происходит при разных патологиях: ишемии-реперфузии сердца, болезни Альцгеймера, старении, диабете, ревматоидном артрите, легочных и мышечных заболеваниях [Levine et al., 1990, Reznick and Packer, 1994]. Признаками окислительной модификации белков являются появление карбонильных остатков, изменение каталитической активности, окислительная фрагментация, гликирование, образование белковых агрегатов [Levine R.L., et al., 1990; Hipkiss A.R., et al., 1998]. Уровень перекисного окисления липидов часто оценивают по накоплению малонового диальдегида (МДА) - конечного продукта ПОЛ.

При алкоголизме также наблюдается окислительная модификация мембранных и сывороточных белков и липидов. Снижается количество сульфгидриль-ных групп и повышается уровень карбонилирования белков, растет содержание МДА в сыворотке крови. При этом концентрация глутатиона падает, и значительно возрастает активность ксантиноксидазы [Grattagliano I., et al., 1996].

Мы провели исследование уровня карбонилирования сывороточных белков и содержания МДА в сыворотке крови у больных алкоголизмом II стадии в период абстиненции и в период формирования ремиссии. Результаты представлены в табл.5.

Таблица 5

Содержание карбонилов белков и продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови больных алкоголизмом и здоровых доноров

Исследуемые группы Карбонилы белков, нмоль/мг МДА, мкмоль/л

Здоровые доноры 0,089±0,018 (п=5) 4,10+0,2 (п=10)

Больные в стадии абстиненции 0,296+0,080* (п=9) 4,79+0,3** (п=22)

Больные в стадии формирования ремиссии 0,212±0,050* (п=5) 3,96±0,2 (п=22)

Примечание: п - количество обследованных доноров; * - различия достоверны по сравнению с группой здоровых доноров, р < 0,05, "-различия достоверны по сравнению с группой больных в стадии формирования ремиссии, р<0,05.

Видно, что уровень карбонилирования сывороточных белков, как и продуктов ПОЛ в сыворотке крови у больных алкоголизмом ^¿евнод!абстиненции досто-

I БИБЛИОТЕКА ;

1 С-Петербург ' зз

I РЭ «К» ___{

верно выше, чем у здоровых доноров. Это свидетельствует об активации окислительных процессов в данный период заболевания.

После лечения уровень МДА в сыворотке пациентов не отличается от нормы. Уровень карбонилирования сывороточных белков после лечения несколько снижается, но все еще остается достоверно выше нормы. Таким образом, в процессе дезинтоксикационной терапии больных алкоголизмом происходит нормализация содержания продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови пациентов, в то время как для нормализации уровня карбонилированных белков, вероятно, требуется более длительный период времени.

IV.2. Фагоцитарная и дыхательная активность нейтрофилов больных алкоголизмом на разных стадиях лечения

Результаты исследования фагоцитарной активности нейтрофилов и теста восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-теста), характеризующего продукцию активных форм кислорода в процессе дыхательного взрыва лейкоцитов здоровых лиц и больных алкоголизмом на разных стадиях лечения, представлены в табл. 6.

Фагоцитарная активность у больных алкоголизмом как до, так и после лечения несколько снижена, что согласуется с данными литературы [Евсеев В.А., 1990; Черенько В.Б., Бохан H.A., 1991; Гамалея Н.Б. и др., 2000]. Показатели спонтанного НСТ-теста в лейкоцитах больных алкоголизмом, находящихся в стадии абстиненции, достоверно увеличены по сравнению с таковыми у здоровых лиц. Это может свидетельствовать о повышении продукции активных форм кислорода лейкоцитами у больных данной группы, что не противоречит данным литературы о том, что хроническая алкоголизация приводит к состоянию окислительного стресса [Bondy S.C., Guo S.X.,1994; Reinke L.A., et al., 1997] и об антигенной стимуляции и активации аутоиммунных реакций при данном заболевании [Маянский А.Н., Пикуза О.И., 1993].

Таблица 6

Показатели фагоцитарной активности и НСТ-теста в лейкоцитах здоровых доноров и больных алкоголизмом на разных стадиях лечения

Показатели Здоровые доноры (п=10) Больные в стадии абстиненции (п=22) Больные после лечения (п=22)

Фагоцитарный индекс, % 82,8±4,5 74,2±3,8 75,3+3,7

Фагоцитарное число, количество частиц латекса 9,55±0,80 6,15±1,00* 6,25±0,90*

НСТ-тест, % Спонтанный 9,8±1,8 15,6±2,5* 13,6±1,8

Стимулированный 24,2+2,6 24,2±4,2 26,4±3,8

ЦИ Спонтанный 0,12±0,02 0,2340,02* 0,18±0,02

Стимулированный 0,35±0,05 0,36±0,04 0,38±0,04

Примечание: ЦИ - цитологический индекс, п - количество обследованных доноров; * - различия достоверны по сравнению с показателями здоровых доноров, р<0,05.

После лечения показатели спонтанных НСТ-теста и цитологического индекса все еще остаются повышенными по сравнению с соответствующими показателями здоровых доноров, однако это повышение становится не достоверным. Показатели стимулированного НСТ-теста, как и значения цитологического индекса после стимуляции лейкоцитов, в группе здоровых доноров и в обеих группах больных алкоголизмом не различаются между собой. Эти данные свидетельствуют о том, что у больных алкоголизмом снижен «функциональный резерв» лейкоцитов.

Таким образом, представленные данные позволяют заключить, что наряду со значительными нарушениями структуры и функции клеток красной крови у больных алкоголизмом в состоянии абстиненции имеет место окислительная модификация сывороточных белков и липидов, а также увеличивается спонтанная продукция активных форм кислорода лейкоцитами. Лечение больных традиционными методами не приводит к полной нормализации исследуемых показателей, хотя положительная динамика очевидна.

V. Коррекция повреждений клеток крови больных алкоголизмом

Важной проблемой является поиск способов коррекции клеточных повреждений при алкогольной интоксикации. Одним из перспективных соединений, сочетающих в себе антиоксидантные и мембраностабилизирующие свойства, является природный гидрофильный гистидинсодержащий дипептид карнозин (Р-аланил-L-гистидин) [Болдырев A.A., 1999].

V.l. Влияние карнозина на гемолитическую устойчивость эритроцитов больных алкоголизмом

Предварительная оценка влияния карнозина и родственных соединений - гис-тидина, N-ацетил-гистидина, анзерина (N'-метил-карнозина), офидина (Ы3-метил-карнозина) и N-ацетил-карнозина (N-Ac-карнозина) на основные параметры кислотных эритрограмм больных алкоголизмом показала, что все эти соединения, кроме гистидина, оказывают стабилизирующий эффект на клетки больных алкоголизмом. Однако этот эффект во всех случаях был менее выражен, чем у карнозина. Исключение составил N-Ac-карнозин, положительное действие которого на стабильность эритроцитов превышало действие карнозина. В дальнейшем мы сосредоточили внимание на исследовании эффектов двух соединений - карнозина и N-Ac-карнозина. В качестве препарата сравнения в данных исследованиях мы использовали синтетический буфер PIPES, обладающий близкими к гис-тидин-содержащим дипептидам буферной емкостью и рК.

В табл. 7 даны среднестатистические значения основных параметров кислотных эритрограмм больных в состоянии абстиненции в присутствии этих соединений и без них. Добавление PIPESa в среду инкубации несколько повышало устойчивость эритроцитов по сравнению с контролем - наблюдался рост Т^, снижалось среднее значение %тах. Однако достоверных различий между контрольной эритрограммой (без добавок) и эритрограммой в присутствие PIPESa мы не обнаружили.

Таблица 7

Влияние исследуемых соединений на параметры кислотных эритрограмм больных алкоголизмом

Соединение, 2 мМ п Тшах> МИН %тах> %

Контроль 32 3,20±0,27 22,4+5,3

Р1РЕ8 11 3,70±0,30 18,3+3,5

Карнозин 10 4,1010,60* 14,1+4,5

Ы-Ас-карнозин 12 4,4010,60* 12,212,5*

Примечание: п - количество обследованных доноров; * - различия достоверны по сравнению с контролем, р < 0,05.

Добавление в среду инкубации карнозина приводило к выраженным положительным изменениям эритрограммы: она становилась более пологой, достоверно увеличивалось Т^, снижался %В присутствии И-Ас-карнозина эти изменения становились еще более выраженными. Если учесть, что гемолиз эритроцитов во всех случаях проводили при исходном значении рН среды, равном 5,5, а рК исследуемых соединений при используемой температуре находится в области 6,8-7,0, можно полагать, что представленные изменения эритрограммы под влиянием этих веществ не объясняются их рН-буферными свойствами. Вероятно, такое изменение эритрограмм в присутствие карнозина и Ы-Ас-карнозина связано с изменением в их присутствии устойчивости эритроцитарных мембран к повреждающему действию кислоты за счет мембраностабилизирующего действия дипептидов.

У.2. Влияние карнозина на морфологию эритроцитов больных алкоголизмом

О том, что исследуемые дипептиды стабилизируют эритроциты, свидетельствуют и микроскопические данные, полученные при использовании крови 30 больных алкоголизмом, находившихся в момент забора крови в состоянии абстиненции. Инкубация эритроцитов таких больных в физиологическом растворе (контроль) в течение 5 мин (рН 5,5) приводила к повреждению морфологии клеток. Из всей популяции эритроцитов лишь 15,27±4,35 % эритроцитов сохраняли нормальную форму двояковогнутого диска. У остальных клеток наблюдалось существенное повреждение формы - появлялось большое количество пойкило-цитов. В присутствии 5 мМ Р1РЕ8а нормальную форму сохраняли 17,27±14,22 % клеток (различия с контролем не достоверны, р > 0,05). Добавление к физиологическому раствору 5 мМ карнозина или 1Ч-Ас-карнозина при том же значении рН приводило к тому, что, соответственно, 30,37±20,39 % и 40,83±25,73 % эритроцитов сохраняли нормальную форму (различия с контролем достоверны, р < 0,01). Таким образом, карнозин и М-Ас-карнозин оказывают стабилизирующий эффект на эритроциты больных алкоголизмом, предохраняют их от структурных повреждений.

У.З. Влияние карнозина на фагоцитарную активность и продукцию активных форм кислорода нейтрофилами больных алкоголизмом

В данном исследовании мы использовали две концентрации карнозина, различающиеся в 100 раз (0,01 мМ и 1 мМ). Кровь инкубировали в растворе Хенкса в присутствии соответсвующей концентрации карнозина в течение 30 мин при 37 °С. В фоновые пробы карнозин не добавляли.

Карнозин в концентрации 0,01 мМ стимулирует фагоцитарную активность полиморфноядерных лейкоцитов как здоровых, так и больных алкоголизмом доноров до и после лечения, что хорошо видно на рис. 11 Б.

Увеличение концентрации карнозина до 1 мМ приводит к подавлению фагоцитоза у больных алкоголизмом, а на состояние лейкоцитов здоровых доноров существенного эффекта не оказывает (рис. 11).

Контроль До лечения После Контроль До лечения После

лечения лечения

Рис. 11. Влияние карнозина (0,01 мМ и 1,00 мМ) на фагоцитарную активность нейтрофилов здоровых доноров (контроль) и больных алкоголизмом в стадии абстиненции (до лечения) и в стадии формирования ремиссии (после лечения). А - фагоцитарный индекс (% фагоцитирующих нейтрофилов); Б - фагоцитарное число (среднее количество частиц латекса, поглощенных одним фагоцитом).

* - различия достоверны по сравнению с соответствующим контролем, р < 0,05;

# - различия достоверны по сравнению с фоном, р < 0,05

При оценке эффекта карнозина на продукцию активных форм кислорода в процессе дыхательного взрыва лейкоцитов в спонтанном и стимулированном НСТ-тестах обнаружено, что в концентрации 0,01 мМ карнозин увеличивает продукцию нейтрофилами активных форм кислорода в обоих видах НСТ-теста как у здоровых доноров, так и у больных алкоголизмом (рис. 12). Это свидетельствует о способности карнозина повышать «функциональный резерв» клеток. В концентрации 1 мМ карнозин не оказывает достоверного эффекта на продукцию активных форм кислорода у больных, и повышает ее, хотя и в меньшей степени, чем в концентрации 0,01 мМ, у здоровых лиц (рис. 12).

Полученные данные позволяют сделать заключение, что эффект карнозина in vitro на фагоцитарную и дыхательную активности нейтрофилов существенно зависит от концентрации: в концентрации 0,01 мМ (более физиологичной для крови) этот дипептид оказывает активирующее действие на клетки как больных, так

и здоровых лиц. При повышении концентрации до 1 мМ наблюдается угнетение фагоцитарной активности и отсутствие эффекта на дыхательную активность нейтрофилов больных алкоголизмом. На показатели нейтрофилов здоровых доноров карнозин в концентрации 1 мМ действует иначе, нежели на клетки больных алкоголизмом: на фагоцитарную активность влияния не оказывает, а дыхательную активность стимулирует, но в меньшей степени, чем в концентрации 0,01 мМ.

Контроль До лечения После Контроль До После

лечения лечения лечения

Рис. 12. Влияние карнозина (0,01 мМ и 1,00 мМ) на продукцию активных форм кислорода нейтрофилами здоровых доноров (контроль) и больных алкоголизмом в стадии абстиненции (до лечения) и в стадии формирования ремиссии (после лечения). А - НСТ-тест спонтанный (процент клеток, образующих гранулы ди-формазана без стимуляции); Б - НСТ-тест стимулированный (процент клеток, образующих гранулы диформазана при стимуляции латексом); * - различия достоверны по сравнению с соответствующим контролем, р < 0,05; # - различия достоверны по сравнению с фоном, р < 0,05

Таким образом, карнозин обладает иммуномодулирующем действием, которое выражается в регулировании фагоцитоза и продукции активных форм кислорода нейтрофилами. В зависимости от концентрации карнозин может быть как антиоксидантом, так и прооксидантом. Разнонаправленные эффекты карнозина на клетки, находящиеся в разном функциональном состоянии, позволяют предполагать, что нагрузочный тест с карнозином может являться прогностически информативным при оценке состояния иммунокомпетентных клеток крови.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе установлено, что этанол и его метаболиты ацетальдегид и этиловые эфиры жирных кислот в модельных экспериментах in vitro способны индуцировать изменения биологических мембран и структурно-функциональных характеристик эритроцитов. Молекулярные эффекты этанола и ацетальде-гида in vitro существенно различаются между собой.

Инкубация эритроцитов in vitro с этанолом приводит к снижению гемолитической устойчивости клеток в условиях как кислотного, так и окислительного гемолизов. В присутствии ингибитора каталазы - фермента, способного осуществ-

лять окисление этанола до ацетальдегида в эритроцитах - этанол оказывает дестабилизирующее действие только в условиях кислотного гемолиза. В условиях окислительного гемолиза неметаболизированный этанол обладает слабым стабилизирующим действием. Этанол снижает микровязкость гидрофобной области липидного бислоя мембран эритроцитов, при этом модификации мембранных белков и белков цитоскелета не происходит.

Ацетальдегид снижает гемолитическую устойчивость эритроцитов в условиях окислительного, но не кислотного гемолиза. При этом также имеет место снижение микровязкости липидного бислоя. Кроме того, происходит окислительная модификация мембранных белков, затрудняется экстракция спектрина и актина из мембран эритроцитов.

Учитывая данные литературы о том, что скорость протекания кислотного ге-k молиза лимитируется скоростью проникновения протонов в цитозоль клеток,

которая в свою очередь определяется ионной проницаемостью мембраны [Ivanov I.T., 1999], а основным механизмом повреждения мембран эритроцитов в условиях окислительного гемолиза является индукция перекисного окисления липидов [Панасенко О.М. и др., 1998], можно сделать заключение, что преобладающим механизмом повреждающего действия неметаболизированного этанола на мембрану эритроцита является его влияние на липидный матрикс, приводящее к изменению физико-химического состояния мембраны, определяющего его ионную проницаемость. В то время как молекулярный механизм повреждающего действия ацетальдегида на мембрану связан со способностью ацетальдегида индуцировать окислительную модификацию белковой и липидной компонент мембран.

Этанол и ацетальдегид in vitro не приводят к нарушению морфологии клеток и кросс-линкингу эритроцитарных белков. После инкубации эритроцитов с глута-ровым альдегидом - известным сшивающим агентом - был выявлен кросс-линкинг белков, который сопровождался нарушением морфологии эритроцитов. Эти данные позволяют заключить, что одной из причин морфологических нарушений эритроцитов является процесс кросс-линкинга белков.

Инкубация эритроцитов с этиловыми эфирами жирных кислот (линоленовой и пальмитиновой) приводит к встраиванию ЭЭЖК в мембраны эритроцитов. При этом происходит снижение стабильности клеток и перераспределение фосфати-дилсерина с внутренней (цитоплазматической) стороны мембраны на наружную. Морфология клеток не нарушается.

У больных алкоголизмом в состоянии абстиненции (модель влияния этанола и его метаболитов на клеточные мембраны in vivo) имеют место выраженные структурно-функциональные изменения эритроцитов, часто выявляются морфологические нарушения. Патологические изменения морфологии клеток сочетаются со снижением их гемолитической устойчивости, кросс-линкингом и карбо-нилированием эритроцитарных белков. Обнаружено снижение гидрофобного объема мембран таких клеток, повышение упорядоченности их структуры, а также снижение чувствительности к хаотропному действию этанола и ацетальдегида по сравнению с мембранами эритроцитов здоровых доноров.

Гипотетически одной из причин изменения микровязкости мембран эритроцитов больных алкоголизмом и снижения устойчивости клеток к действию ге-молизирующих агентов могло бы быть накопление в мембранах продуктов неокислительного превращения этанола - этиловых эфиров жирных кислот. Однако наши исследования продемонстрировали отсутствие ЭЭЖК в мембранах эритроцитов больных алкоголизмом.

В организме при хроническом поступлении высоких доз алкоголя эффекты этанола и его метаболитов, вероятно, суммируются. Кроме того, при действии этанола и его метаболитов in vivo происходят изменения практически во всех органах и системах, изменяется ионный состав крови, соотношение НАД/НАДН, развивается окислительный стресс, меняются реологические свойства крови, происходит нарушение эритропоэза и др. Все это оказывает дополнительное (по сравнению с влиянием этанола и его метаболитов in vitro) повреждающее действие на клеточные мембраны. Эритроциты «приспосабливаются» к функционированию в изменившихся условиях. Это обстоятельство, на наш взгляд, является основной причиной, по которой у больных алкоголизмом часто обнаруживаются структурно-функциональные нарушения клеток, не выявляемые (нарушение морфологии) или противоположные (снижение микровязкости гидрофобной области липидов при действии этанола и ацетальдегида in vitro с одной стороны и повышение этого параметра у больных алкоголизмом - с другой) при изучении эффектов этанола и его метаболитов в модельных экспериментах in vitro.

Несмотря на более плотную упаковку жирнокислотных цепей липидов в мембранах эритроцитов больных алкоголизмом, вьивлено существенное увеличение активности мембраносвязанного фермента Na/K-АТФазы и достоверное повышение Са2+-зависимой К+-проводимости клеточных мембран, что косвенно свидетельствует об увеличении проницаемости мембран эритроцитов для одновалентных катионов. Активация ион-транспортирующих систем мембран эритроцитов больных алкоголизмом в состоянии абстиненции может рассматриваться как один из механизмов, направленных на адаптацию клеток к новым условиям, которые формируются в организме при алкоголизме. Нарушение трансмембранных градиентов катионов в эритроцитах может являться одной из основных причин развития анемии при алкоголизме, поскольку такие нарушения способны приводить к изменению морфологии эритроцитов, снижению их устойчивости к гемолизу и способности к деформациям клеток [Dodson R.A. et al., 1987; Петрова И.В., 1999], а также к разрушению эритроцитов [Brugnara С., et al., 1995].

В наших экспериментах была обнаружена различная чувствительность К+(Са2+)-каналов эритроцитов к изменению объема клеток при изменении осмо-лярности среды инкубации у здоровых доноров и больных алкоголизмом. После тепловой денатурации белков мембранного каркаса проводимость каналов падала как в клетках здоровых лиц, так и больных алкоголизмом, при этом исчезала чувствительность каналов к изменению объема эритроцитов. Эти данные позволили сделать заключение о важной роли белков мембранного каркаса в регуляции Са2+-зависимой К+-проницаемости мембран эритроцитов и об изменении свойств цитоскелета эритроцитов при алкоголизме.

Наряду со значительными нарушениями структуры и функции клеток красной крови у больных алкоголизмом имеет место частичная окислительная модификация сывороточных белков, накопление продуктов перекисного окисления ли-пидов в сыворотке крови, а также повышается продукция активных форм кислорода нейтрофилами. Данные результаты свидетельствуют в пользу того, что при алкоголизме в организме развивается состояние окислительного стресса.

После проведенного лечения у пациентов на стадии формирования ремиссии структурно-функциональные параметры эритроцитов частично нормализуются. Наблюдается некоторое повышение количества морфологически нормальных клеток (дискоцитов): от 66,8±7,6 % (до лечения) до 74,8±5,1 % (после лечения). Гемолитическая устойчивость эритроцитов больных на стадии формирования ремиссии не отличается от нормы. Обнаружена тенденция к повышению гидрофобного объема мембран эритроцитов, доступного для пирена. Мембраны эритроцитов вновь приобретают способность реагировать на добавленный этанол, однако чувствительность к ацетальдегиду у этих мембран не восстанавается. Происходит нормализация активности Ыа/К-АТФазы и К+(Са2+)-каналов эритроцитов. Эти данные свидетельствуют о частичной обратимости патологических процессов, приводящих к структурно-метаболическим и функциональным нарушениям биологических мембран при хронической алкогольной интоксикации.

Мембрана является динамичной системой, способной адаптироваться к изменению условий гомеостаза, вызванных влиянием внешних факторов, в частности, этанола и его метаболитов. Однако структурно-функциональные перестройки биологических мембран как адаптационный ответ на хроническое воздействие этанола, имеют ограниченный ресурс. Вероятно, их глубина и способность восстанавливаться после прекращения токсического воздействия этанола и его метаболитов зависит от стадии алкоголизма.

Несовершенство лекарственной терапии алкоголизма делает необходимыми поиск и разработку новых эффективных фармакологических средств профилактики и лечения этого заболевания. Поскольку мембранотропные эффекты этанола и его метаболитов весьма существенны, и так как при алкоголизме формируется состояние окислительного стресса, перспективными могут быть препараты, стабилизирующие биологические мембраны, защищающие их от повреждающего действия свободных радикалов. Препараты, улучшающие состояние биологических мембран, повышающие их резервы адаптации, безусловно, полезны в клинике алкоголизма. Наши исследования влияния карнозина - природного ан-тиоксиданта и мембраностабилизатора - на эритроциты больных алкоголизмом показали, что данный препарат способен повышать устойчивость эритроцитов к действию гемолизирующих агентов, предохранять клетки от структурных повреждений.

Кроме того, нами обнаружено существенное иммуномодулирующее действие карнозина, которое выражается в регулировании фагоцитоза и продукции активных форм кислорода нейтрофилами больных алкоголизмом. Полученные данные позволяют сделать заключение, что карнозин может рассматриваться как перспективный препарат для включения его в арсенал фармакологических средств для лечения больных алкоголизмом.

выводы

1. Механизмы повреждающего действия этанола и ацетальдегида на эритроциты in vitro существенно различаются. Дестабилизирующий эффект неметабо-лизированного этанола на эритроциты проявляется в условиях кислотного, но не окислительного гемолиза. Ацетальдегид дестабилизирует эритроциты в условиях окислительного, но не кислотного гемолиза. Этанол не влияет на состояние эритроцитарных белков. Ацетальдегид приводит к окислительной модификации белков, снижению экстракции спектрина и актина из мембран эритроцитов.

2. Модификация белков эритроцитов под действием ацетальдегида, осуществляющаяся без кросс-линкинга, не приводит к нарушению формы клеток. Модификация белков под действием глутаральдегида, приводящая к кросс-линкину, сопровождается нарушением морфологии эритроцитов.

3. Этиловые эфиры линоленовой и пальмитиновой жирных кислот встраиваются в мембрану эритроцитов in vitro. При этом происходит перераспределение фосфатидилсерина с внутренней поверхности липидного бислоя на наружную и дестабилизация клеток без нарушения морфологии. В мембранах эритроцитов больных алкоголизмом этиловые эфиры жирных кислот не выявлены.

4. Состояние абстиненции при алкоголизме часто сопровождается увеличением дегенеративных форм эритроцитов со сниженной устойчивостью к гемолизи-рующему действию кислоты. Морфологические нарушения эритроцитов сочетаются с кросс-линкингом и карбонилированием белков. На стадии формирования ремиссии у больных алкоголизмом наблюдается повышение количества эритроцитов, имеющих нормальную морфологию, увеличивается гемолитическая устойчивость клеток. В эритроцитах больных алкоголизмом с нормальной морфологией кросс-линкинг белков не выявлен.

5. Этанол и ацетальдегид повышают гидрофобный объем мембран эритроцитов здоровых лиц. Алкоголизм сопровождается модификацией физического состояния гидрофобной области липидного матрикса мембран эритроцитов: мембраны теряют чувствительность к хаотропному действию этанола и ацетальдегида. В процессе лечения больного его мембраны вновь приобретают способность реагировать на добавленный этанол, однако чувствительность к ацеталь-дегиду не восстанавливается.

6. При алкоголизме в период абстиненции активность №,К-АТФазы эритроцитов повышается, меняется характер зависимости активности фермента от концентрации Mg2+ в инкубационной среде. В период ремиссии эти параметры нормализуются. Магний увеличивает эффективный гидрофобный объем липидного бислоя эритроцитов больных алкоголизмом.

7. Абстиненция при алкоголизме сопровождается увеличением Са2+-зависимой калиевой проницаемости эритроцитов. Белки мембранного каркаса эритроцитов контролируют работу К+(Са2+)-каналов. При алкоголизме способность мембранного каркаса эритроцитов реагировать на изменение осмолярности среды модифицируется.

и образование активных форм кислорода лейкоцитами нормализуются, однако уровень окисленных белков остается повышенным.

9. Карнозин in vitro повышает устойчивость эритроцитов больных алкоголизмом к кислотному гемолизу и предохраняет клетки от структурных повреждений. Карнозин обладает существенным иммуномодулирующим действием, которое выражается в регуляции фагоцитоза и продукции активных форм кислорода нейтрофилами. Эффекты карнозина зависят от его концентрации и функционального состояния клеток.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1.Boldyrev A.A. Temperature-induced transitions in SR membranes detected by fluorescence methods /Boldyrev A.A., Lopina O.D., Prokopieva V.D., Sarzala M.G. // Biochem. Int. 1982. Vol. 5. № 2. P. 247-252.

2. Прокопьева В.Д. Влияние температуры на флуоресценцию меток и зондов различной локализации, встроенных в препараты саркоплазматического ретику-лума / Прокопьева В.Д., Лопина О.Д., Болдырев A.A. // Биофизика. 1983. Т. 28, № 1.С. 40-45.

3. Boldurev A. Diphenylhexatriene and pyrene as tools for characterization of biological membranes / Boldurev A., Lopina 0., Prokopieva V. // Biochem. Int. 1984. Vol. 8. № 6. P. 851-856.

4. Болдырев A.A. Мембранные липиды как регуляторы межбелковых взаимодействий / Болдырев A.A., Лопина О.Д., Прокопьева В.Д. // Нейрохимия. 1985. Т. 4.№ 1.С. 81-96.

5. Болдырев A.A. Как регулируется активность мембранных ферментов / Болдырев A.A., Прокопьева В.Д. // Биологические науки. 1985. № 9. С. 5-13.

6. Прокопьева В.Д. Сравнительная оценка кардиопротекторного действия природных антиоксидантов карнозина и аскорбиновой кислоты / Прокопьева В.Д., Лаптев Б.И., Афанасьев С.А., Свирко Ю.С.: Мат-лы межреспубликанской научн.-пракгич. конф. «Синтез, фармакология и клинические аспекты новых психотропных и сердечно-сосудистых веществ». Волгоград, 1989. С. 136-137.

7. Dorofeeva L. The Effect of Chronic Ethanol on NADPH-Dependent and Ascor-bat-Dependent Lipid Peroxidation in Liver Microsomes and Brain Sinaptosomes of Rats / Dorofeeva L., Prokopieva V. // Int. Conf. «Regulation of Free Radical Reactions (Biomed. Aspects)». Varna, 1989. P. 212.

8. Прокопьева В.Д. Перекисное окисление липидов в микросомах печени и синаптосомах мозга хронически алкоголизированных крыс / Прокопьева В.Д., Эверстова Т.Д., Ткаченко И.Б.: Сб. научн. тр. «Медико-биологические аспекты охраны психического здоровья». Томск, 1990. С. 154-155.

9. Савоненко A.B. Характеристика Ыа,К-АТФазы эритроцитов крыс с разным отношением к этанолу в норме и после хронической алкоголизации / Савоненко A.B., Прокопьева В.Д. // Вопросы наркологии. 1993. № 1. С. 41-44.

10. Прокопьева В.Д. Влияние ионов магния на кислотные эритрограммы крови крыс в норме и после хронической алкоголизации / Прокопьева В.Д., Мезенцева И.Б.: Сборн. научн. тр. «Региональные аспекты современной аддиктоло-гии». Томск, 1994. С. 99-101.

11. Прокопьева В.Д. Клинико-динамические особенности эритрограмм при алкоголизме / Прокопьева В.Д., Бохан H.A. // Сб. мат-лов VII научн. отчета, сессии НИИ ПЗ «Актуальные вопросы психиатрии». Томск. 1995. Вып. 7. С. 151-153.

12. Прокопьева В.Д. Влияние сыворотки крови хронически алкоголизирован-ных крыс на очищенную Na, К-АТФазу / Прокопьева В.Д., Савоненко A.B.: Мат-лы XII съезда психиатров России. М., 1995. С. 814-815.

13. Прокопьева В.Д. Влияние ионов магния на кислотные эритрограммы больных алкоголизмом / Прокопьева В.Д., Бохан H.A.: Мат-лы конф., посвящ. 15-летию НИИ психического здоровья ТНЦ СО РАМН, «Современные проблемы пограничных и ад диктивных состояний». Томск, 1996. С. 109-110.

14. Прокопьева В.Д. Изучение молекулярных механизмов регуляции активности Na, К-АТФазы при алкоголизме // Тр. конф., посвящ. 35-летию ЦНИЛ, «Медико-биологические аспекты нейрогуморальной регуляции». Томск, 1997. С. 20-22.

15. Прокопьева В.Д. Сравнительная характеристика Mg-зависимых свойств Na, К-АТФазы эритроцитов хронически алкоголизированных крыс и больных алкоголизмом / Прокопьева В.Д., Савоненко A.B., Бохан H.A.: Сб. мат-лов 8 научн. отчета, сессии НИИ ПЗ «Актуальные вопросы психиатрии». Томск.

1997. Вып. 8. С. 115-116.

16. Прокопьева В.Д. Изменение чувствительности Na, К-АТФазы к ионам магния в эритроцитах больных алкоголизмом на разных этапах лечения / Прокопьева В.Д., Бохан H.A. // Сибирский медицинский журнал. 1998. № 3-4. С. 60-64.

17. Прокопьева В.Д. Влияние карнозина и его N-ацетильного производного на стабильность эритроцитов больных алкоголизмом в состоянии абстиненции / Прокопьева В.Д., Бохан H.A., Джонсон П., Болдырев A.A. // Вопросы медицинской химии. 1998. Т. 44. № 5. с. 474-478.

18. Прокопьева В.Д. Защитное действие карнозина и родственных соединений на эритроциты больных алкоголизмом / Прокопьева В.Д., Бохан H.A.: Сб. научн. тр. «Реабилитация в психиатрии (клинические и социальные аспекты)». Томск,

1998. С. 146-147.

19. Солонский A.B. Нейроморфологические, нейрохимические и поведенческие характеристики экспериментального изучения алкогольной зависимости / Солонский A.B., Бохан H.A., Галактионов O.K., Дорофеева Л.И., Мельникова Т.Н., Савоненко A.B., Прокопьева В.Д. // Сибирский вестник психиатрии и наркологии. 1998. № 1-2. С. 43-48.

20. Prokopieva V.D. Modulation of the erythrocyte Na,K-ATPase from alcoholic patients by Mg2+-ions / Prokopieva V.D., Bohan N.A. // Alcohol & Alcoholism (J of the European Society for Biomedical Research of Alcoholism (ESBRA). 1999. Vol. 34. № 3. P. 475. (№ 218).

21. Прокопьева В.Д. Регуляция Na,К-АТФазы эритроцитов больных алкоголизмом ионами магния / Прокопьева В.Д. // Сибирский вестник психиатрии и наркологии. 1999. № 4. С. 38-40.

22. Prokopieva V.D. Effects of camosine and related compounds on the stability and morphology of erythrocytes from alcoholics / Prokopieva V.D., Bohan N.A., Johnson P., Abe H., BoldyrevA.A. // Alcohol & Alcoholism. 2000. Vol.35. № i. P. 44-48.

23. Тюлина O.B. Влияние этанола на гемолитическую устойчивость эритроцитов / Тюлина О.В., Хантельманн М.Дж., Прокопьева В.Д., Джонсон П., Болдырев A.A. // Биохимия. 2000. Т. 65. № 2. С. 218-224.

24. Прокопьева В.Д. Влияние этанола и ацетальдегида на микровязкость мембран эритроцитов больных алкоголизмом на разных этапах лечения / Прокопьева В.Д., Бохан H.A., Кондакова И.В. // Бюл. Экспер. Биол. 2000. Т. 129, приложение № i.e. 90-92.

25. Tyulina O.V. Does ethanol metabolism affect erythrocyte hemolysis? / Tyu-lina O.V., Huentelman M.J., Prokopieva V.D., Boldyrev A.A., Johnson P. // Biochem. Biophys. Acta. 2000. Vol. 1535. P. 69-77.

26. Тюлина O.B. Влияние метаболизма этанола на гемолитическую устойчивость эритроцитов / Тюлина О.В., Хантельманн М.Дж., Прокопьева В.Д., Джонсон П., Болдырев A.A. // Мат-лы симп. «Молекулярные основы заболеваний XXI века» В сб.: Актуальные вопросы кардиологии. Томск, 2000. Раздел VI. С. 266-267.

27. Прокопьева В.Д. Динамика структурно-функциональных характеристик эритроцитов больных алкоголизмом / Прокопьева В.Д., Бохан H.A.: Мат-лы симп. «Молекулярные основы заболеваний XXI века». В сб.: Актуальные вопросы кардиологии. Томск, 2000. Раздел VI. С. 260.

28. Прокопьева В.Д. Гидрофобный объем мембран эритроцитов больных алкоголизмом: влияние этанола и ацетальдегида / Прокопьева В.Д., Бохан H.A.: Мат-лы XIII съезда психиатров России. Москва, 2000. С. 263.

29. Прокопьева В.Д. Ацетальдегид и мембрана эритроцита / Прокопьева В.Д., Тюлина О.В., Додд Р., Куликов Е.В., Джонсон П. // Бюл. Экспер. Биол. 2001. Приложение 1. С. 39-42.

30. Рязанцева Н.В. Структурные особенности мембран эритроцитов у больных шизофренией / Рязанцева Н.В., Новицкий В.В., Прокопьева В.Д., Степовая Е.А., Баскаков М.Б. // Бюл. Экспер. Биол. 2001, приложение № 1. С. 81-84.

31. Кремено C.B. Исследование Са2+-активируемых калиевых каналов мембран эритроцитов человека при нервно-психических патологиях / Кремено С.В, Петрова И.В., Прокопьева В.Д.: Сб. научн. тр. «Современные технологии психиатрического и наркологического сервиса». Томск, 2001. С. 57-59.

32. Прокопьева В.Д. Сравнительная оценка гидрофобного объема мембран эритроцитов больных алкоголизмом в периоды абстиненции и формирования ремиссии / Прокопьева В.Д., Бохан H.A. // Актуальные вопросы психиатрии и наркологии. Томск, 2001. Вып. 10. С. 214-215.

33. Джонсон П. Эффекты этанола, ацетальдегида и этиловых эфиров жирных кислот на эритроциты человека / Джонсон П., Тюлина О.В., Прокопьева В.Д., Додд Р.Д., Хокинс Дж. Р., Клэй C.B., Уилсон Д.О., БолдыревА.А. // Актуальные вопросы психиатрии и наркологии. Томск, 2001. Вып. 10. С. 188-189.

34. Prokopieva V.D. Disturbances of structure and functions of alcoholics' erythrocytes / Bohan N.A. // The World Journal of Biological Psychiatry. 2001. Vol. 2. P. 276. (Abstracts of VII World Congress of Biol.Psychiatry. 1-6 July 2001, Berlin, Germany).

35. Dodd R. Acetaldehyde and glutaraldehyde effects on erythrocyte proteins and resistance to oxidative hemolysis. / Dodd R., Tyulina O.V., Prokopieva V.D., Johnson P., Boldyrev A.A. // Abstr. of 27th Meeting of the Federation of European Biochemical Societies (FEBS). Ipisbon. 2001. P. 227.

36. В.Д. Исследование влияния карнозина на Са2+-активируемые К+-каналы эритроцитов человека при разной осмолярности среды инкубации / Прокопьева В.Д., Ситожевский А.В., Кремено С.В., Корюкин В.И., Петрова И.В. // Тез. VI Междунар. конф. «Биоантиоксидант». Москва, 2002. С. 477-478.

37. Tyulina O.V. In vitro effects of ethanol, acetaldehyde and fatty acid ethyl esters on human erythrocytes / Tyulina O.V., Prokorieva V.D., Dodd R.D., Hawkins J.R., Clay S.W., Wilson D.O., Boldyrev A.A., Johnson P. // Alcohol & Alcoholism. 2002. Vol. 37. №2. P. 179-186.

38. Прокопьева В.Д. Исследование роли липидного матрикса и белков мембранного каркаса в регуляции Са2+-активируемых К+-каналов эритроцитов у больных алкоголизмом и сахарным диабетом II типа / Прокопьева В.Д., Петрова И.В., Ситожевский А.В., Кремено С.В., Корюкин В.И., Баскаков М.Б., Бо-хан Н.А., Новицкий В.В. // Бюл. Экспер. Биол. 2002. № 10. С. 401-404.

39. Тюлина О.В. Гистидин-содержащие дипептиды и форменные элементы крови / Тюлина О.В., Бычкова О.Н., Прокопьева В.Д., Болдырев А.А. // Проблемы гематологии и переливания крови. 2002. №4. С. 53-63.

40. Невидимова Т.И. Иммуноактивные свойства дипептидов / Невидимо-ва Т.И., Прокопьева В.Д., Найденова Н.Н., Коконова Д.Н., Скрипка Н.Н.: Сб. тез. Всерос. конф. «Современные проблемы биологической психиатрии и наркологии». Томск, 2003. С. 154-155.

Изобретение

41. Прокопьева В.Д. Патент на изобретение «Способ повышения устойчивости к гемолизу эритроцитов и восстановления их поврежденной формы» №2162698 / Прокопьева В.Д., Болдырев А.А., Бохан Н.А., Семке В.Я., Кулагин Е.М. Положительное решение о выдаче патента от 14.09.2000.

>1323 6

-/t

Подписано в печать: 07.05.2003 г. Бумага: офсетная Тираж: 100 экз. Заказ: № 120/Х

Печать: трафаретная Формат: 60x84/16

Издательство Томского государственного педагогического университета ы t ffifft

634041, г. Томск, пр. Комсомольский, 75 1Щв1втШ1;::

Тел. (3822) 20-81-66, E-mail: publish@tspu.edu.ru

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Прокопьева, Валентина Даниловна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

РАЗДЕЛ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Метаболизм этанола

1.2. Метаболизм ацетальдегида

1.3. Влияние этанола и его метаболитов на биологические мембраны

1.3.1. Влияние этанола и его метаболитов на липидный матрикс при остром и хроническом действии.

1.3.2. Влияние эfaнoлa и его метаболитов на структуру и функции мембранных белков и ионный гомеостаз.

1.4. Нарушение окислительно-восстановительных реакций и окислительный стресс при алкоголизме

1.5. Влияние этанола и его метаболитов на эритроциты

1.6.Фармакологические средства для лечения алкоголизма

1.6.1. Препараты, применяемые в терапии алкоголизма

1.6.2. Мембраностабилизаторы в терапии алкоголизма

1.6.3. Карнозин и его аналоги - мембраностабилизаторы и антиоксиданты

РАЗДЕЛ II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

11.1. Объекты исследования

11.2. Взятие крови и получение эритроцитов, теней эритроцитов, экстракция спекгрина и актина

11.3. Исследование гемолитической устойчивости эритроцитов

11.4. Определение активности каталазы в эритроцитах

11.5. Исследование влияния альдегидов на состояние белков эритроцитов in vitro

11.6. Микроскопические методы исследования (световая и электронная микроскопия)

11.7. Определение микровязкости мембран эритроцитов 82 щ II.8. Определение содержания этиловых эфиров жирных кислот в мембранах эритроцитов

II.9. Оценка распределения фосфатидилсерина в мембранах эритроцитов

П.Ю.Определение активности 1Ма,К-АТФазы в эритроцитах

11.11. Оценка проводимости Са2+-активируемых lC-каналов эритроцитов

11.12. Изменение объема эритроцитов и термоденатурация белков мембранного каркаса

11.13. Определение карбонилов белков

11.14. Определение уровня перекисного окисления липидов в сыворотке крови

11.15. Иммунологические методы

11.16. Использованные реактивы

11.17. Статистические методы 89 РАЗДЕЛ III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ

ОБСУЖДЕНИЕ

НИ. Молекулярные механизмы влияния этанола и его метаболитов на эритроциты in vitro

111.1.1. Влияние этанола и ацетальдегида на устойчивость эритроцитов к кислотному и окислительному гемолизу

111.1.2. Влияние этанола и ацетальдегида на белки эритроцитов

111.1.3. Влияние этанола и ацетальдегида на Са2+-

§ активируемые lC-каналы эритроцитов

III. 1.4. Влияние этанола и ацетальдегида на микровязкость мембран эритроцитов

III. 1.5. Роль этиловых эфиров жирных кислот в повреждении мембран эритроцитов

III.2. Динамика структурно-функциональных параметров эритроцитов у больных алкоголизмом в процессе традиционной дезинтоксикационной терапии

111.2.1. Морфология эритроцитов больных алкоголизмом на разных стадиях лечения

111.2.2. Гемолитическая устойчивость эритроцитов больных алкоголизмом на разных стадиях лечения

111.2.3. Белковый состав мембран эритроцитов больных алкоголизмом

111.2.4. Микровязкость мембран эритроцитов больных алкоголизмом на разных стадиях лечения.

111.2.5. Na/K-АТФаза эритроцитов больных алкоголизмом на разных стадиях лечения. Изменение чувствительности к ионам магния

Ш.З. Са2+-активируемые К*-каналы мембран эритроцитов больных алкоголизмом

111.3.1. К+(Са2+)-каналы эритроцитов больных алкоголизмом в состоянии абстиненции

111.3.2. Роль мембранного каркаса эритроцитов в регуляции К+(Са2+)-каналов

III.4. Окислительная модификация белков и липидов сыворотки крови, фагоцитарная и дыхательная активности нейтрофилов больных алкоголизмом

111.4.1. Содержание продуктов ПОЛ и карбонилов белков в сыворотке крови больных алкоголизмом на разных стадиях лечения

111.4.2. Фагоцитарная активность и продукция активных форм кислорода нейтрофилами больных алкоголизмом в динамике лечения

III.5. Коррекция повреждений клеток крови больных алкоголизмом карнозином

111.5.1. Влияние карнозина на гемолитическую устойчивость эритроцитов больных алкоголизмом

111.5.2. Влияние карнозина на морфологию эритроцитов больных алкоголизмом

111.5.3. Влияние карнозина на Са2+-активируемые К*-каналы эритроцитов больных алкоголизмом

111.5.4. Влияние карнозина на фагоцитарную активность и продукцию активных форм кислорода нейтрофилами больных алкоголизмом

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярные механизмы влияния этанола и его метаболитов на клеточные мембраны in vitro и in vivo"

Актуальность проблемы

Биологические мембраны являются неотъемлемой частью любой живой клетки. Помимо таких функций биологических мембран как отграничение клетки от окружающей среды, разделение внутреннего объема клетки на отдельные компартменты, обеспечение специфики межклеточных контактов и контроль за проникновением в клетку и выход из нее разнообразных соединений, биологические мембраны способны воспринимать, усиливать и передавать внутрь клетки сигналы из внешней среды, создавать специальные условия для протекания ферментативных реакций, осуществляемых гидрофобными * мембранными белками, обеспечивать превращение биологической энергии, осуществлять контроль за взаимодействием между отдельными мембранными структурами и т.д.

I биомембран как способность воспринимать, классифицировать ц (усиливать или элиминировать) и передавать информацию, осуществлять транспорт ионов против их концентрационного градиента, преобразовывать энергию в форму, необходимую клетке, осуществляются благодаря структурным конформационным) перестройкам мембранных компонентов. Такая тесная структурно-функциональная связь в биомембранах обеспечивает как динамическое равновесие внутри клетки, так и ^ возможность взаимодействия клеток друг с другом.

Известно, что в основе многих патологий лежат изменения свойств клеточных мембран. Структурно-функциональные нарушения биомембран могут быть не только причиной, но и следствием развития патологических процессов. Как правило при патологиях происходит комплексная модификация функций мембран, которая непременно сопровождается структурными изменениями как мембранных липидов (изменением в соотношении липидного состава мембран, в соотношении насыщенных и ненасыщенных жирных кислот, входящих в состав липидов, развитием перекисного окисления липидов и др.), так и мембранных белков (гликирование, карбонилирование, кросс-линкинг) (Halliwell В., Gutteridge J.M.C., 1999).

Клеточные мембраны являются мишенью действия ядов, токсинов, радиоактивного и ультрафиолетового облучения. Кроме этого известно большое количество природных модификаторов мембран, способных в зависимости от условий и их концентрации оказывать различное (иногда противоположное) действие на клеточные мембраны. Такие соединения относят к классу мембранотропных веществ. Одним из них является этанол. Изучение молекулярных механизмов влияния этанола и его метаболитов на биомембраны in vivo и in vitro при остром или хроническом влиянии в свете новых знаний о структурно-функциональных взаимоотношениях в биологических мембранах позволяет лучше понять фундаментальные основы возникновения и развития одного из наиболее широко распространенных заболеваний в мире - алкоголизма.

В настоящее время исследования, посвященные различным аспектам алкоголизма, интенсивно проводятся в разных странах. Благодаря усилиям многих исследователей в последние годы получены новые данные о молекулярных механизмах формирования алкогольной зависимости и токсического действия этанола. Известно, что алкоголь индуцирует изменения в NMDA-рецепторных комплексах мозга и влияет на экспрессию гена нейрональной NO-синтазы (Putzke J. et al., 2001), приводит к нарушениям митохондриальных процессов окисления в печени (Videla L.A., 1984) и др. Хроническая алкоголизация вызывает мощный окислительный стресс, который приводит к структурным изменениям биологических мембран, нарушению функционирования мембранных каналов и ферментов во многих клетках и тканях (Bondy S.C., Guo S.X., 1994; Goldstein D., Chin J. 1981; Foley T.D., Rhoads D.E. 1994; Johnson J.H., Crider B.P., 1989).

He ясными, однако, остаются многие вопросы, касающиеся молекулярных механизмов повреждающего действия хронической алкоголизации. До сих пор неизвестно, в какой мере эти повреждения связаны с прямым влиянием неметаболизированного этанола на клетки, а в какой - с влиянием его метаболитов. Основным путем метаболизма этанола в организме является его окисление до ацетальдегида алкогольдегидрогеназой, этанол-индуцируемым цитохромом Р450 (CYP2E1) и каталазой (Lieber S.C., 1994; Chen L.H. et al., 1995, Kishimoto R. et al., 1995; French S.W., 1996). Ацетальдегид обладает высокой реакционной способностью. Он может взаимодействовать с NH2- SH-, СООН-группами, что может приводить к модификации белков, липидов, нуклеиновых кислот и других биомолекул (Hipkiss A.R. et al, 1998; Holownia A. et al, 1999). Кроме того, при хроническом поступлении в организм высоких доз этанола побочными продуктами его окислительного превращения могут быть гидроксиэтил-радикалы (Reinke L.A. et al., 1997). Показана возможность накопления в этих условиях супероксидных, гидроксильных, пероксильных и других радикалов, которые, являясь сильными окислителями, также могут приводить к повреждению биомембран и гибели клеток (Sato Y. et al, 1995; Pekiner В., Pennock J.F., 1994).

Другой путь метаболизма этанола в организме - его неокислительное превращение в этиловые эфиры жирных кислот (ЭЭЖК) под действием синтазы этиловых эфиров жирных кислот. Этот путь является преобладающим в нервных клетках и кардиомиоцитах (Gorski N.P. et al., 1999; Laposata M., 1997, 1999). ЭЭЖК, вмешиваясь в метаболические процессы клетки, могут приводить к перестройке клеточного метаболизма, нарушению многих функций, включая такую важную, как трансмембранный транспорт целого ряда метаболитов (Gubitosi-Klug R.A., Gross, R.W., 1996).

Для изучения тонких молекулярных механизмов повреждающего действия этанола и его метаболитов на клетки удобно в качестве модели использовать эритроциты периферической крови и их тени. Эритроциты являются высокочувствительной тест-системой внутренней среды организма. Помимо осуществления присущей им основной специфической газотранспортирующей функции эти клетки принимают участие в обеспечении стабильности и регуляции водно-солевого обмена, кислотно-основного равновесия, определяют реологические свойства крови, способны связывать и переносить вирусы, токсины, лекарственные вещества и т. д.

При алкоголизме обнаруживается структурно-функциональная дезорганизация эритроцитов, меняется их морфология, что сопровождается снижением гемолитической устойчивости и развитием анемии (Chi L.M., Wu W.G. 1991; Bizzaro N. et al., 1993). Такие изменения эритроцитов неизбежно усугубляют тканевую гипоксию, имеющую место при алкоголизме. Нарушается роль эритроцитов в процессах, связанных с поддержанием гомеостаза на уровне целого организма, что осложняет течение заболевания. В связи с этим актуальным является вопрос, каков молекулярный механизм происхождения аномальных клеток красной крови при данном заболевании и насколько обратимы эти патологические изменения эритроцитов.

Одним из важных факторов, контролирующих форму эритроцита, является работа мембранных ион-транспортирующих систем. Известно, например, что при серповидноклеточной анемии происходят существенные изменения в функционировании Са2+-активируемых Ю-каналов эритроцитов (Canessa М., 1991; Romero J.R. et.al., 1997). Повышенная проводимость К*-каналов ведет к дегидратации клеток, снижению их деформируемости (Apovo М. et al., 1994; Brugnara С. et al., 1995) и повышенному гемолизу (Freedman J.C. et al., 1988). Изменения в функционировании Na/K-Hacoca и Na+,K\2Cr -котранспорта обнаружены при р-талассемии (Olivieri О. et. al., 1994). При алкоголизме показано нарушение функционирования и регуляции эритроцитарной Na/K-АТФэзы (Johnson J.H., Crider В.Р., 1989). Есть данные о действии алкоголя на трансмембранный транспорт лития (Ostrow D.G. et al., 1986), об изменении под действием этанола проницаемости биомембран для Са2+ (Kelly-Murphy S. et al., 1984) и о влиянии алкоголя на кальций-зависимый транспорт калия в эритроцитах человека (Harris R.A., Caldwell К.К., 1986). Однако сведений, касающихся функционирования и регуляции ион-транспортирующих систем в эритроцитах больных алкоголизмом, явно недостаточно.

При алкоголизме значительные изменения происходят не только в эритроцитах, но и в других клетках крови. Известно, что у больных алкоголизмом развивается ярко выраженная лимфопения (Назаров З.А., Щербакова А.А., 1987; Liu Y.R., 1980), происходит снижение фагоцитарной активности (Евсеев В.А., 1990; Гамалея Н.Б. и соавт., 2000). При данной патологии снижается количество Т-лимфоцитов, увеличивается уровень циркулирующих иммунных комплексов и др. (Кузнецова Н.И. и соавт., 1987; Черенько В.Б., 1991, 1994; Chelazzi G. et al., 1985). В то же время до сих пор нет данных о соотношении показателей маркеров окислительного стресса в организме с дыхательной активностью нейтрофилов при данной патологии. щ

Таким образом, имеющихся в настоящее время экспериментальных данных явно недостаточно для понимания тонких молекулярных механизмов токсического действия этанола и его метаболитов на структурно-функциональные характеристики биологических мембран, отсутствует целостная картина, отражающая на молекулярном уровне причины структурно-функциональных изменений клеток крови при алкоголизме. Не исследованным также остается вопрос о том, насколько возможно восстановление патологически измененных параметров клеток красной и белой крови в процессе традиционной дезинтоксикационной терапии. Кроме того, актуальным является поиск новых способов коррекции клеточных повреждений при алкогольной интоксикации.

Цель и задачи исследования.

Цель настоящей работы заключалась в исследовании молекулярных механизмов повреждающего действия этанола и продуктов его метаболизма - ацетальдегида и этиловых эфиров жирных кислот - на клетки крови in vitro и in vivo.

При выполнении работы были поставлены следующие задачи:

6. Выявить особенности функционирования и регуляции мембранных ферментов (Na/K-АТФэзы) и ионных каналов (Са2+-активируемых К+-каналов) в эритроцитах больных алкоголизмом в динамике лечения.

8. Исследовать фагоцитарную и дыхательную активности нейтрофилов у больных алкоголизмом в динамике лечения.

Положения, выносимые на защиту.

1. Молекулярные механизмы влияния этанола и ацетальдегида на эритроциты in vitro существенно различаются. Неметаболизированный этанол снижает устойчивость эритроцитов к кислотному гемолизу. В условиях окислительного гемолиза этанол не приводит к дестабилизации эритроцитов, напротив, наблюдается тенденция к повышению стабильности клеток. ^ Этанол приводит к снижению микровязкости гидрофобной области липидного бислоя без изменения белкового спектра и окислительного статуса белков мембран эритроцитов. Ацетальдегид не изменяет устойчивость эритроцитов к гемолизирующему действию кислоты, но снижает устойчивость к действию гипохлорита натрия. При этом происходит снижение микровязкости липидного бислоя мембран и изменяется состояние эритроцитарных белков - наблюдается их окислительная модификация, затрудняется экстракция спектрина и актина. Как * этанол, так и ацетальдегид in vitro не нарушают морфологию эритроцитов.

2. Этиловые эфиры жирных кислот встраиваются в мембраны эритроцитов при инкубации in vitro. При этом снижается стабильность эритроцитов, нарушается асимметрия распределения фосфатидилсерина между внутренним и наружным монослоями мембраны, но нарушения морфологии клеток не происходит. У больных алкоголизмом ЭЭЖК в эритроцитах не обнаруживаются. ^ 3. Структурно-функциональные изменения эритроцитов при действии этанола и его метаболитов in vitro отличаются от структурно-функциональных нарушений эритроцитов больных алкоголизмом. У больных нарушение морфологии эритроцитов сочетается со снижением гемолитической устойчивости клеток, кросс-линкингом эритроцитарных белков, снижением гидрофобного объема мембран, повышением упорядоченности их структуры, 4 уменьшением чувствительности мембран к хаотропному действию этанола и ацетальдегида, повышением активности Ыа/К-АТФазы и проводимости К+(Са2+)-каналов. В процессе дезинтоксикационной терапии наблюдается положительная динамика перечисленных параметров: увеличивается количество морфологически нормальных эритроцитов, восстанавливается их гемолитическая устойчивость, нормализуются гидрофобный объем мембран, активность Na/K-АТФэзы и проводимость К^Са^-каналов, а также чувствительность липидного матрикса к хаотропному действию этанола, однако чувствительность мембран к хаотропному действию ацетальдегида не восстанавливается.

5. Природный дипептид карнозин повышает устойчивость эритроцитов больных алкоголизмом к кислотному гемолизу и предохраняет клетки от структурных повреждений in vitro. Аналогичными свойствами обладает ацетилированное производное карнозина - N-ацетил-карнозин. Карнозин обладает иммуномодулирующим действием, которое выражается в регулировании фагоцитоза и продукции активных форм кислорода нейтрофилами. Эффект карнозина зависит от его концентрации и функционального состояния клеток.

Новизна исследования и наиболее существенные научные результаты .

Впервые установлено, что этиловые эфиры жирных кислот, встраиваясь в мембрану эритроцита in vitro, приводят к перераспределению фосфатидилсерина с внутренней поверхности эритроцитарной мембраны на внешнюю, при этом наблюдается значительное снижение стабильности эритроцитов без нарушения морфологии. В эритроцитах больных алкоголизмом этиловые эфиры жирных кислот не обнаружены.

Впервые исследованы особенности функционирования и регуляции мембранных ион-транспортирующих ферментов и каналов в патологически измененных эритроцитах больных алкоголизмом. Установлено, что у больных в период абстиненции активность Na/K-АТФазы, как и Са2+-зависимая калиевая проницаемость мембран эритроцитов, повышены. При алкоголизме в условиях Мд^-дефицита изменяется характер зависимости активности Na/K-АТФэзы от магния. Показана важная роль белков мембранного каркаса в регуляции К*(Са2+)-каналов эритроцитов. Обнаружена различная чувствительность К^Са^у-каналов к изменению объема клеток при изменении осмолярности среды инкубации у здоровых доноров и больных алкоголизмом, что свидетельствует об изменении свойств мембранного каркаса эритроцитов при алкоголизме. После лечения активность Na/K-АТФэзы и Са2+-зависимая 1С-проводимость эритроцитов пациентов нормализуются. В период ремиссии зависимость активности Na/K-АТФэзы от магния не отличается от нормы.

Обнаружено увеличение содержания продуктов перекисного окисления липидов и повышение уровня карбонилирования белков в сыворотке крови больных алкоголизмом в период абстиненции. Показано снижение фагоцитарной активности нейтрофилов и повышение их дыхательной активности у пациентов. Эти результаты подтверждают данные литературы об активации окислительных процессов и состоянии окислительного стресса при алкоголизме.

После лечения содержание продуктов ПОЛ в сыворотке крови пациентов не отличается от нормы, количество карбонилированных белков снижается, однако остается повышенным по сравнению с нормой. Показатели дыхательной активности нейтрофилов больных алкоголизмом после лечения также приближаются к норме.

Впервые в опытах in vitro показано, что природный гидрофильный антиоксидант гистидин-содержащий дипептид карнозин и его ацетилированное производное N- ацетил-карнозин повышают устойчивость эритроцитов больных алкоголизмом к кислотному гемолизу и увеличивают количество морфологически нормальных эритроцитов. Впервые установлено, что карнозин in vitro способен стимулировать фагоцитоз и дыхательную активность нейтрофилов у здоровых лиц и больных алкоголизмом. Эффекты карнозина зависят от его концентрации и функционального состояния клеток.

Теоретическое и практическое значение работы.

Апробация работы.

Результаты работы были представлены на Межреспубликанской научно-практической конференции «Синтез, фармакология и клинические аспекты новых психотропных и сердечно-сосудистых веществ» (Волгоград, 1989), на Международной конференции «Регуляция свободнорадикальных реакций (биомедицинские аспекты)» (Варна, 1989), на Всесоюзной конференции «Медико-биологические аспекты охраны психического здоровья» (Томск, 1990), на XII и XIII съездах психиатров России (Москва, ,1995; 2000), на Межрегиональной конференции «Медико-биологические аспекты нейрогуморальной регуляции» (Томск, 1997), на региональном научном симпозиуме «Молекулярные основы заболеваний XXI века» (Томск, 2000), на VII, VIII, IX и X научных отчетных сессиях НИИ психического здоровья Томского научного центра СО РАМН (Томск, 1995; 1997; 1999; 2001), на конференции «Психическое здоровье в XXI веке: оценка и прогноз» (Томск, 2001), на VII Всемирном конгрессе по биологической психиатрии (Берлин, 2001), XXVII Съезде Федерации Европейских биохимических обществ (Лиссабон, 2001), VIII конгрессе Европейского общества по исследованию биомедицинских аспектов алкоголизма (Париж, 2001), IV съезде физиологов Сибири (Новосибирск, 2002), на Всероссийской конференции «Современные проблемы биологической психиатрии и наркологии» (Томск, 2003).

Публикации.

Результаты работы представлены в 41 публикации, из них 1 патент на изобретение, 5 статей в зарубежной печати, 14 статей в центральных рецензируемых журналах.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Прокопьева, Валентина Даниловна

ВЫВОДЫ

1. Механизмы повреждающего действия этанола и ацетальдегида на эритроциты in vitro существенно различаются. Дестабилизирующий эффект неметаболизированного этанола на эритроциты проявляется в условиях кислотного, но не окислительного гемолиза. Ацетальдегид дестабилизирует эритроциты в условиях окислительного, но не кислотного гемолиза. Этанол не влияет на состояние эритроцитарных белков. Ацетальдегид приводит к окислительной модификации белков, снижению экстракции спектрина и актина из мембран эритроцитов.

4. Состояние абстиненции при алкоголизме часто сопровождается увеличением дегенеративных форм эритроцитов со сниженной устойчивостью к гемолизирующему действию кислоты. Морфологические нарушения эритроцитов сочетаются с кросс-линкингом и карбонилированием белков. На стадии формирования ремиссии у больных алкоголизмом наблюдается повышение количества эритроцитов, имеющих нормальную морфологию, увеличивается гемолитическая устойчивость клеток. В эритроцитах больных алкоголизмом с нормальной морфологией кросс-линкинг белков не выявлен.

5. Этанол и ацетальдегид повышают гидрофобный объем мембран эритроцитов здоровых лиц. Алкоголизм сопровождается модификацией физического состояния гидрофобной области липидного матрикса мембран эритроцитов: мембраны теряют чувствительность к хаотропному действию этанола и ацетальдегида. В процессе лечения больного его мембраны вновь приобретают способность реагировать на добавленный этанол, однако чувствительность к ацетальдегиду не восстанавливается.

6. При алкоголизме в период абстиненции активность Na,K-АТФазы эритроцитов повышается, меняется характер зависимости активности фермента от концентрации Мд2+ в инкубационной среде. В период ремиссии эти параметры нормализуются. Магний увеличивает эффективный гидрофобный объем липидного бислоя эритроцитов больных алкоголизмом.

7. Абстиненция при алкоголизме сопровождается увеличением Са2+-зависимой калиевой проницаемости эритроцитов. Белки мембранного каркаса эритроцитов контролируют работу К*(Са2+)-ка налов. При алкоголизме способность мембранного каркаса эритроцитов реагировать на изменение осмолярности среды модифицируется.

8. У больных алкоголизмом в период абстиненции происходит окислительная модификация сывороточных белков и липидов, увеличивается продукция активных форм кислорода нейтрофилами. После лечения содержание продуктов ПОЛ и образование активных форм кислорода лейкоцитами нормализуются, однако уровень окисленных белков остается повышенным.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе установлено, что этанол и его метаболиты - ацетальдегид и этиловые эфиры жирных кислот - в модельных экспериментах in vitro способны индуцировать изменения биологических мембран и структурно-функциональных характеристик эритроцитов. Молекулярные механизмы действия этанола и ацетальдегида на эритроциты in vitro существенно различаются.

Инкубация эритроцитов in vitro с этанолом в диапазоне концентраций 0,1-0,5% приводит к снижению стабильности клеток, определяемой по выходу гемоглобина в среду инкубации в результате спонтанного гемолиза эритроцитов, а также к снижению гемолитической устойчивости клеток в условиях кислотного (под действием соляной кислоты) и окислительного (под действием гипохлорита натрия) гемолизов. Инкубация эритроцитов с ацетальдегидом в концентрации 0,25% не оказывает влияния как на скорость спонтанного выхода гемоглобина, так и на устойчивость эритроцитов к кислотному гемолизу, но снижает устойчивость клеток к окислительному гемолизу.

Согласно данным литературы скорость протекания кислотного гемолиза лимитируется скоростью проникновения протонов в цитозоль клеток, которая в свою очередь определяется ионной проницаемостью мембраны и усиливается при ее окислительном повреждении (Ivanov I.T., 1999). Дестабилизирующий эффект этанола в условиях кислотного гемолиза отражает, по-видимому, его действие на проницаемость мембраны для ионов, которая определяется микровязкостью мембраны и ее целостностью (Chi L.M., Wu W.G., 1991). При окислительном гемолизе в наших условиях преобладающим механизмом повреждения эритроцитарных мембран, согласно данным литературы, является процесс индукции перекисного окисления липидов под действием гипохлорита натрия (Панасенко О.М. и соавт., 1998; Черный В.В. и соавт., 1992).

Можно предположить, что этанол снижает микровязкость липидного бислоя, вследствие чего увеличивается как доступность фосфолипидов к действию окислителя, так и проницаемость мембраны для ионов. Поскольку гемолиз эритроцитов значительно усиливается после преинкубации клеток в присутствии этанола, можно предполагать, что этанол метаболизирует в клетках, и продукты его метаболизма вносят дополнительный вклад в модификацию бислоя. Одним из таких продуктов может быть ацетальдегид, который, согласно нашим данным, усиливает дестабилизацию клеток в условиях окислительного гемолиза. В условиях, когда каталаза (единственный фермент в эритроцитах, способный окислять этанол до ацетальдегида) ингибирована 3-амнотриазолом, этанол оказывает дестабилизирующий эффект на эритроциты только в условиях кислотного, но не окислительного гемолиза.

Таким образом, можно заключить, что неметаболизированный этанол способен оказывать повреждающее действие на мембраны эритроцитов. Это заключение подкрепляется недавно опубликованными данными о том, что неметаболизированный этанол может проникать через клеточные, в том числе и эритроцитарные, мембраны и взаимодействовать с мембранными компонентами, модифицируя структуру и функции мембран (Trandum С. et al., 1999; Wirkner К. et al., 1999).

В то же время имеются данные о том, что повреждающие эффекты этанола на структуру и функции мембран реализуются главным образом вследствие влияния его метаболитов (Holownia A. et al., 1999; Brahm J., 1983; Laposata M., 1999). Полученные нами данные показывают, что дестабилизирующий эффект этанола в случае окислительного гемолиза не может быть объяснен только действием образовавшегося ацетальдегида, так как преинкубация эритроцитов с этанолом оказывает более выраженный повреждающий эффект на эритроциты, чем преинкубация с ацетальдегидом в сопоставимых концентрациях (см. рис. 2Б и рис. 3). Можно предположить, что в данном случае имеет место комбинация эффектов неметаболизированного этанола и образовавшегося в результате действия эритроцитарной каталазы ацетальдегида.

Это подтверждают эксперименты, где исследовался эффект этанола на окислительный гемолиз в клетках с ингибированной каталазой: время достижения максимальной скорости гемолиза (Ттах) для таких клеток было повышено, а количество клеток, подвергающихся гемолизу с максимальной скоростью (%тах) достоверно снижено по сравнению с этими величинами в контрольных клетках (таблица 1, рис. 5Б). Эти данные свидетельствуют также о том, что ингибирование продукции ацетальдегида из этанола эритроцитами путем ингибирования каталазы снижает чувствительность эритроцитов к гемолизирующему действию гипохлорита натрия, то есть этанол оказывает в данных условиях стабилизирующее действие.

Полученные нами данные о влиянии этанола на гемолитическую устойчивость эритроцитов к кислоте доказывают, что АцА не вовлекается в дестабилизирующий эффект в данных условиях, так как мы не обнаружили разницы в параметрах кислотного гемолиза для контрольных клеток и клеток с инактивированной каталазой (таблица 1, рис. 4 А, Б). В то же время в условиях окислительного гемолиза, которые в большей степени, чем при кислотном гемолизе, приближены к условиям окислительного стресса in vivo, продукция АцА каталазой вносит свой вклад в дестабилизацию эритроцитов. Об этом свидетельствуют сниженное Ттах и повышенный %тах в эритроцитах с активной каталазой по сравнению с клетками, в которых каталаза была неактивна. Нельзя исключить, что этот эффект может быть связан с образованием свободных радикалов в процессе окисления этанола, а также продуктов ПОЛ и окислительной модификации белков (Halliwell В., Gutteridge J.N.C., 1999; Reinke L.A. et al., 1997), однако в данном случае АцА также должен вносить свой вклад в повреждающее действие этанола, так как в наших экспериментах было показано, что АцА сам способен дестабилизировать эритроциты в условиях окислительного гемолиза (рис. 3).

Мы провели более детальные исследования изменения белковой и липидной компонент мембран эритроцитов под действием этанола и АцА, чтобы лучше понять, чем обусловлены различия в повреждающем действии этих соединений на эритроциты.

Оказалось, что этанол снижает микровязкость гидрофобной области липидного бислоя эритроцитов, при этом модификации мембранных белков и белков цитоскелета не происходит, морфология эритроцитов не нарушается.

АцА также оказывает хаотропное действие на гидрофобную область липидного бислоя. Кроме того, инкубация клеток с ацетальдегидом приводит к окислительной модификации мембранных белков (увеличивается уровень их карбонилирования), затруднению экстракции спектрина и актина из мембран эритроцитов. Морфологически клетки, инкубированные с АцА, также остаются нормальными.

Таким образом, молекулярный механизм снижения гемолитической устойчивости эритроцитов под действием неметаболизированного этанола, вероятно, связан главным образом с изменением не белковой, а липидной компоненты эритроцитарных мембран, поскольку преинкубация клеток с этанолом не приводит к заметным изменениям в белковом спектре и окислительном статусе белков эритроцитов. Модификация мембран под действием АцА затрагивает белковую компоненту. На липидную компоненту АцА, вероятно, оказывает лишь часть тех эффектов, которые оказывает этанол. Такой вывод следует также из опытов по восстановлению чувствительности гидрофобной области мембран больных алкоголизмом после лечения к хаотропному эффекту этанола, но не ацетальдегида, и согласуется с данными литературы (Latge С. et al., 1987).

Сравнительное исследование влияния ацетальдегида, не вызывающег кросс-линкинга белков эритроцитов в наших экспериментах, и глутарового альдегида, приводящего к «сшивке» эритроцитарных белков, на морфологию эритроцитов показало, что глутаровый альдегид, «сшивая» белки, существенно нарушает морфологию клеток, при этом эритроциты становятся более устойчивыми к окислительному гемолизу. Модификация белков эритроцитов под действием АцА делает клетки менее устойчивыми к действию гипохлорита натрия и не нарушает морфологию клеток. Таким образом, в модельных (не физиологических) условиях мы показали, что различия в типах модификации мембранных белков и белков цитоскелета эритроцитов могут приводить к различным изменениям морфологии и стабильности этих клеток. В опытах с эритроцитами больных алкоголизмом было обнаружено, что нарушение морфологии эритроцитов in vivo часто сопровождается кросс-линкингом эритроцитарных белков.

Продукты неокислительного превращения этанола в организме - этиловые эфиры жирных кислот (линоленовой и пальмитиновой) - в экспериментах in vitro встраиваются в мембраны эритроцитов. При этом происходит снижение стабильности клеток, оцениваемой по спонтанному гемолизу эритроцитов. Модифицируется липидный бислой, в частности, происходит перераспределение фосфатидилсерина с внутренней (цитоплазматической) стороны мембраны на наружную. Известно, что такое перераспределение фосфатидилсерина в мембранах эритроцитов может быть причиной снижения стабильности клеток (Diaz С. et al., 1996). Как показали микроскопические исследования, встраивание ЭЭЖК в эритроциты не нарушает морфологию клеток.

Таким образом, и этанол, и ацетальдегид, и этиловые эфиры жирных кислот при добавлении к эритроцитам in vitro снижают стабильность клеток, не нарушая их морфологию. Можно заключить, что модификация липидного бислоя под действием этанола и его метаболитов, как и окислительная модификация белков эритроцитов под действием АцА, не являются достаточным условием нарушения морфологии эритроцитов. Кросс-линкинг белков эритроцитов (в нашем случае - в нефизиологических условиях, под действием глутарового альдегида) приводит к нарушению морфологии клеток.

В организме при хроническом поступлении высоких доз этанола, эффекты этанола и его метаболитов, вероятно, суммируются, что может приводить к дополнительным нарушениям клеток, не всегда выявляемым в модельных экспериментах. Кроме того, в организме под влиянием хронической алкоголизации нарушается функционирование многих органов и систем, что приводит к снижению антиоксидантного статуса, изменению кислотно-основного равновесия и реологических свойств крови и др., что также не может не отражаться на клетках крови in vivo.

Эксперименты, проведенные на клетках крови больных алкоголизмом, показали, что хроническая алкоголизация сопровождается выраженными структурно-функциональными нарушениями эритроцитов. У больных в состоянии тяжелой абстиненции часто встречаются клетки патологической формы: конические с округлой вершиной, с гребнем, клетки в виде "спущенного мяча", плоского диска, а также эритроциты куполообразной и сферической формы, акантоциты. Нарушение морфологии эритроцитов сочетается со снижением их гемолитической устойчивости. Обнаружено снижение гидрофобного объема мембран таких клеток, повышение упорядоченности их структуры, а также снижение чувствительности к хаотропному действию этанола и ацетальдегида по сравнению с мембранами эритроцитов здоровых доноров. Методом ЭФ в ПААГ показано изменение белкового спектра, появление высокомолекулярных белков в мембранах морфологически нарушенных эритроцитов больных алкоголизмом, что, очевидно, связано с кросс-линкингом белков, происходящим in vivo. Причины морфологических нарушений эритроцитов при алкоголизме до конца не ясны. Скорее всего при алкоголизме in vivo решающими факторами нарушения морфологии эритроцитов являются нарушения в эритропоэзе, существенные изменения состава и физических свойств циркулирующей крови, хотя вклад хронического (годами) повреждающего действия на мембраны высоких концентраций этанола и АцА также нельзя полностью исключить.

Гипотетически, одной из причин изменения микровязкости мембран эритроцитов больных алкоголизмом и снижения устойчивости клеток к действию гемолизирующих агентов могло бы быть накопление в мембранах продуктов неокислительного превращения этанола - этиловых эфиров жирных кислот. Однако наши исследования продемонстрировали отсутствие ЭЭЖК в мембранах эритроцитов больных алкоголизмом как в клетках с нормальной, так и с нарушенной морфологией.

Несмотря на более плотную упаковку жирнокислотных цепей липидов в мембранах эритроцитов больных алкоголизмом, нами выявлено существенное увеличение активности мембраносвязанного фермента Na/K-АТФэзы и достоверное повышение Са2+-зависимой Ю-проницаемости, что косвенно свидетельствует об увеличении проницаемости мембраны эритроцитов для одновалентных катионов. Изменение проницаемости мембран для ионов неизбежно приводит к перераспределению ионных потоков через мембрану, изменению трансмембранного концентрационного градиента одновалентных катионов, изменению рН цитоплазмы и осмотического давления в эритроцитах. Это, в свою очередь, не может не отражаться на форме клеток и сродстве гемоглобина к кислороду, так как изменение рН и нарушение формы существенно влияет на процессы насыщения гемоглобина кислородом в легких и его высвобождения в тканях. Активация ион-транспортирующих систем мембран эритроцитов больных алкоголизмом может рассматриваться как один из механизмов развития анемии и тканевой гипоксии, имеющих место при данном заболевании (Иванец Н.Н., Валентик Ю.В., 1988).

В литературе есть косвенные данные о том, что К*(Са2+)-каналы эритроцитов регулируются белками цитоскелета (Орлов С.Н. и соавт., 1992). В наших экспериментах была обнаружена различная чувствительность каналов эритроцитов к изменению объема клеток у здоровых доноров и больных алкоголизмом, что позволяет сделать заключение об изменении свойств цитоскелета эритроцитов при алкоголизме. После тепловой денатурации основного белка мембранного каркаса эритроцитов -спектрина - разница в чувствительности каналов к изменению осмолярности среды инкубации между клетками больных и здоровых доноров исчезала, что еще раз подтверждает важную роль белков мембранного каркаса в функционировании и регуляции К*(Са2+)-каналов.

Полученные нами данные позволяют также заключить, что наряду со значительными нарушениями структуры и функции клеток красной крови у больных алкоголизмом имеет место окислительная модификация сывороточных белков и липидов, а также изменение функциональной активности нейтрофилов: фагоцитарная активность несколько снижена, что согласуется с данными литературы (Черенько В.Б., Бохан Н.А., 1991; Liu Y.R., 1980), а спонтанная продукция активных форм кислорода лейкоцитами достоверно увеличена. Эти результаты находятся в соответствии с данными литературы о том, что хроническая алкоголизация приводит к состоянию окислительного стресса (Bondy S.C., Guo S.X., 1994; Reinke L.A. et al., 1997).

После проведенного традиционного лечения больных алкоголизмом (дезинтоксикационная терапия, ноотропы, витамины группы В и С) у пациентов на стадии формирования ремиссии структурно-функциональные параметры эритроцитов частично нормализуются. Наблюдается некоторое повышение количества морфологически нормальных клеток (дискоцитов): от

66,8±7,6% (до лечения) до 74,8±5,1% (после лечения). Гемолитическая устойчивость эритроцитов больных на стадии формирования ремиссии не отличается от нормы. Обнаружена тенденция к повышению гидрофобного объема мембран эритроцитов, доступного для пирена. Мембраны эритроцитов больных после лечения вновь приобретают способность реагировать на добавленный этанол так, как мембраны клеток здоровых доноров, однако чувствительность к ацетальдегиду у этих мембран не восстанавливается. После проведенного традиционного лечения происходит нормализация активности Na/K-АТФэзы и проводимости К*(Са2+)-каналов эритроцитов. Эти данные свидетельствуют о частичной обратимости патологических процессов, приводящих к структурно-функциональным нарушениям биологических мембран при алкогольной интоксикации.

В процессе лечения больных алкоголизмом происходила также нормализация показэтелей окислительной модификации липидов сыворотки крови. Уровень карбонилирования сывороточных белков больных алкоголизмом после лечения снижался, но все еще оставался достоверно повышенным. Показатели спонтанных НСТ-теста и цитологического индекса, характеризующие продукцию АФК в процессе «дыхательного взрыва» лейкоцитов, в этот период достоверно не отличались от соответствующих показателей здоровых доноров.

Таким образом, традиционные методы лечения алкоголизмэ приводят к положительным сдвигам и в окислительном стэтусе больных. Однэко для повышения эффективности лечения и достижения более стэбильной и длительной ремиссии целесообрэзны, нэ наш взгляд, разрэботкэ и внедрение новых подходов к лечению данной патологии с учетом окислительного статусэ больных и применения препэрэтов, способствующих устранению состояния окислительного стресса в организме пациентов.

В этой связи необходимы поиск и разработка новых эффективных фармакологических средств профилактики и лечения этого заболевания, обладающих антиоксидантной и антирадикальной активностью. Поскольку мембранотропные эффекты этанола и его метаболитов весьма существенны, перспективными, на наш взгляд, могут быть препараты, стабилизирующие биологические мембраны, защищающие их от повреждений. Мембрана является динамичной системой, способной адаптироваться к изменению условий гомеостаза, вызванных влиянием внешних факторов, в частности, этанола и его метаболитов. Однако структурно-функциональные перестройки биологических мембран как адаптационный ответ на хроническое воздействие этанола, имеют ограниченный ресурс. Вероятно, их глубина и способность восстанавливаться после прекращения токсического воздействия этанола и его метаболитов, зависит от стадии алкоголизма. Препараты, улучшающие состояние биологических мембран, повышающие их резервы адаптации, безусловно, полезны в клинике алкоголизма.

Карнозин сочетает в себе свойства антиоксиданта, антирадикального агента и способность стабилизировать биологические мембраны, повышать их устойчивость к действию различных повреждающих факторов (Болдырев А.А., 1999). Наши исследования влияния карнозина на эритроциты больных алкоголизмом показали, что данный препарат способен повышать устойчивость эритроцитов к гемолизирующему действию кислоты, предохранять клетки от структурных повреждений.

Кроме того, нами обнаружено существенное иммуномодулирующее действие карнозина в концентрации 0,01 мМ, которое выражается в повышении функционального резерва клеток, сниженного при алкоголизме, регулировании фагоцитоза, повышении продукции активных форм кислорода нейтрофилами у больных алкоголизмом. Полученные данные позволяют предполагать, что карнозин может рассматриваться как перспективный препарат для включения его в арсенал фармакологических средств для лечения больных алкоголизмом.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Прокопьева, Валентина Даниловна, Томск

1. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки. М.: Мир, 1994. - Т.2. - С. 289-290.

2. Андронова Л.М., Барков Н.К. Роль возраста в процессе формирования экспериментального алкоголизма у крыс разного пола. // Фармакология и токсикология. 1980. - №2. - С. 166-169.

3. Анохина И.П. Нейробиологические аспекты алкоголизма. // Вестник академии мед. наук СССР. 1988. - №3. - С. 21-28.

4. Анохина И.П., Коган Б.М. Нарушения различных звеньев регуляции катехоламиновой нейромедиации при алкоголизме. // Вопр. наркологии. -1988. № 3. - С. 3-6.

5. Антоненков В.Д., Панченко Л.Ф. Роль перекисных процессов в патогенезе алкогольного поражения печени и сердца. // Матер. Всес. научн. конф. Медико-биологические проблемы алкоголизма. -Воронеж, 1987. С. 6-11.

6. Ашмарин И.П. Пути пролонгации действия нейропептидов. // Вестник РАМН. 1992. - №8. - С. 7-10.

7. Бекярова Г.И., Маркова М.П. Каган В.Г. Защита а-токоферолом эритроцитов от гемолиза, индуцированного термической травмой. И Бюлл. экспер. биол. мед. 1989. - Т. 107, №4. - С. 413-415.

8. Битенский В.В., Марьянчик Р.Я. Актуальные вопросы клинической и социальной реабилитации больных алкоголизмом. М. - 1979. - С. 43-45.

9. Божко Г.Х. Роль ацетальдегида в механизмах дествия этанола. // Успехи физиологических наук. 1990. -Т.21, №3. - С. 98-116.

10. Бойтлер Э. Нарушения метаболизма эритроцитов и гемолитическая анемия. Пер. с англ. Под ред. Ю.Н.Токарева; Пер. Ф.И.Атауллаханова, Н.В.Ермакова. - М.: Медицина, 1981. - 256 с.

11. Болдырев А.А. Введение в биохимию мембран. М.: Высшая школа, 1986.

12. Болдырев А.А. Карнозин и защита тканей от окислительного стресса. М.: Диалог-МГУ, 1999. - 362 с.

13. Болдырев А.А., Котелевцев С.В., Ланио М., Альварес К., Перес П. Введение в биомембранологию. Под ред. А.А.Болдырева. М.: МГУ, 1990. - 208 с.

14. Болдырев А.А., Курелла Е.Г., Рубцов A.M., Тюлина О.В., Шара М., Шентюрц М. Прямое измерение взаимодействия карнозина и его аналогов со свободными радикалами. // Биохимия. 1992. -Т. 57.-С. 1360-1365.

15. Болдырев А.А., Стволинский С.Л., Паскуаль К. Влияние карнозина и тролокса на клеточную хемилюминесценцию лейкоцитов. // Биохимия.- 1992. Т. 57. - С. 1337-1342.

16. Болдырев А.А., Твердислов В.А. Молекулярная организация и механизм функционирования Na-Hacoca. Итоги науки и техники. Серия Биофизика. М.: ВИНИТИ, 1978. Т. 10. - 148 с.

17. Борисенко С.А. Мембранные эффекты этанола. // Нейрохимия и фармакология алкоголизма. М.: Медицина, 1985.-С. 186-206.

18. Бурбенская Н.М., Ротенберг Ю.С. Регуляция окислительного фосфорилирования в митохондриях печени малыми концентрациями этанола и ацетальдегида. // Тез.Всес.симп. Метабол.регуляция физиол.состояния. Пущино.: Изд-во АН СССР, 1984.-С. 42.

19. Буров Ю.В., Ведерникова Н.Н. Нейрохимия и фармакология алкоголизма. М.: Медицина, 1985. - 240 с.

20. Ваулин В.И. Состояние мозгового кровообращения у больных хроническим алкоголизмом. Автореф. дисс. канд.мед.наук. -М., 1979.-23 с.

21. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Прекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: Наука, 1972. С. 241243.

22. Волков B.C., Кочегуров В.Н. Показатели центральной гемодинамики и особенности артериальной гипертензии у больных алкоголизмом. // Кардиология. 1980. - Т.20, №6. -С. 102-103.

23. Волох А.Н. Морфологические изменения ретикулярной формации продолговатого мозга при экспериментальном алкоголизме. Клиника, патогенез, лечение алкоголизма. -Кишинев, 1973. С. 130-133.

24. Волошин П.В., Божко Г.Х. Алкоголь, цереброваскулярная и кардиальная патология // Ж. нвропатологии и психиатрии. -1989.- Вып. 9. С. 122-126.

25. Воропаев Н.Е. Декомпенсация пластических свойств поверхностной артериальной сети лобных долей головного мозга при хроническом алкоголизме. // В сб.: Пластичность нервной системы в норме и патологии. М., 1989. - С. 144-146.

26. Высокогорский В.Е. Роль оксидоредуктаз и их множественных форм в метаболических процессах при алкоголизации. Дисс. д-ра мед. наук. Омск, 1992.

27. Гамалея Н.Б., Ульянова J1.И., Даренский И.Д. Нарушения в системе клеточного иммунитета у больных алкоголизмом и перспективы их коррекции с помощью иммуномодулятора Т-активина. // Вопросы наркологии. 2000. - №4. - С. 54-60.

28. Гительзон И.И., Терсков И.А. Эритрограммы как метод клинического исследования крови. Новосибирск.: Изд-во СО АН СССР, 1959.

29. Глебов B.C., Попова Н.Н., Коханов В.Н. О роли абстинентного синдрома в развитии алкогольной энцефалопатии. // Ж. невропатологии и психиатрии. -1983. Вып. 8. - С. 1227-1231.

30. Головач А.А., Никитина Л.И. Компьютерная томография мозга при хроническом алкоголизме. // В сб.: Новые методы диагностики и лечения психических заболеваний. Минск, 1989. - С. 52-59.

31. Голубков О.З., Нутенко Э.А., Попович Н.М. Об одном клиническом варианте мозговых сосудистых расстройств у больных алкоголизмом. // Тез. докл. научно-практической конф. Неотложная наркология. Харьков, 1987. - С. 68-70.

32. Гольдберг Е.Д. Справочник по гематологии. Томск.: изд-во ТГУ, 1989.- 372 с.

33. Гольдберг В.Е., Дыгай А.М., Новицкий В.В. Рак легкого и система крови. Томск, 1992. - 236 с.

34. Гуляева Н.В. Супероксидперехватывающая активность карнозина в присутствии ионов меди и цинка. // Биохимия. -1987-Т. 52.-С. 1216-1220.

35. Гуляева Н.В., Обидин А.Б., Левшина И.П., Филоненко А.В., Дупин A.M., Болдырев А.А. Влияние карнозина на показатели свободнорадикального окисления липидов при остром стрессеу крыс. // Научн. докл. высш. школы: Биол. науки. 1989. - №8 -С. 5-16.

36. Дорофеева Л.И. Действие алкоголя на перекисное окисление липидов (обзор литературы). // МРЖ Психиатрия. 1986. -Раздел XIV. - С. 1-6.

37. Евсеев В.А. Иммунологические парадоксы алкоголизма -перспективы иммунотерапии. // Иммунология. 1990. - №2. - С. 4-8.

38. Заводник И.Б., Пилецкая Т.П., Степуро И.И. Влияние температуры на лизис эритроцитов человека пальмитиновой кислотой. // Биофизика. 1991. -Т.36, вып. 6. - С. 1056-1060.

39. Иванец Н.Н., Валентик Ю.В. Алкоголизм. М.: Наука, 1988.

40. Ивков В.Г., Берестовский Г.Н. Липидный бислой биологических мембран. Серия «Теоретическая и прикладная биофизика». -М.: Наука, 1982.

41. Казенное A.M., Маслова М.Н., Шалабодов А.Д. Исследование активности Na.K-АТФазы в эритроцитах млекопитающих. // Биохимия. 1984. - Т. 49. - С. 1089 - 1095.

42. Карупу В.Я. Электронная микроскопия. Киев: Вища школа, 1984.-208 с.

43. Кершенгольц Б.М., Алексеев В.Г., Тазлова Р.С. Биферментная система окисления этанола и ее роль в развитии алкоголизма. // Биохимия алкоголизма. Минск: Наука и техника, 1980. - 69 с.

44. Кетлинский С.А., Калинина Н.М. Иммунология для врача. СПб, 1998.-155 с.

45. Ковалев В.В., Немцов А.В. Состояние и перспективы научных исследований в области алкоголизма. // Сов. мед. 1987. - №4. -С. 3-11.

46. Коваль А.З. Острые нарушения мозгового кровообращения при хронической алкогольной интоксикации. Автореф. дис.канд. мед. наук. Киев, 1981. -23 с.

47. Козлов М.М., Лерхе Д., Маркин B.C., Майер В. Втягивание мембраны эритроцита в микропипетку: перераспределение мембранного скелета. // Биол. мембраны. 1989. - Т.6, №7. - С. 754-764.

48. Козинец Г.И., Симоварт Ю.А. Поверхностная архитектоника клеток периферической крови. Таллин: Валгус, 1985. - 250 с.

49. Колотилин Г.Ф., Григорьев Н.Р., Петрищев A.M. Изменения в аггрегационных свойствах эритроцитов при хроническом алкоголизме. // Ж.невропатологии и психиатрии им. С.С.Корсакова. 1986. - Т. 86, №10. - С. 1569-1571.

50. Комиссарова И.А., Магалиф А.Ю., Ротенберг Ю.С. О возникновении зависимости от этанола и ее возможных молекулярных механизмах. // Труды НИИ общей и суд. психиатрии им. Сербского. Клиника и патогенез алкогольных заболеваний. М., 1984. - С. 98-102.

51. Комиссарова И.А., Ротенберг Ю.С., Гудкова Ю.В., Магалиф А.Ю. Молекулярные механизмы действия эндогенного и экзогенного этанола. // Известия АН СССР. 1983. - №2. - С. 260-267.

52. Комиссарова И.А., Ротенберг Ю.С., Мастеропуло А.П. Механизмы действия этанола и подходы к коррекции обменных нарушений при хронической алкоголизации. // Обзорная информация "Медицина и здравоохранение". М.: ВНИИМИ, 1986. - Вып. 6.-74 с.

53. Конев С.В. Структурная лабильность биологических мембран. -Минск, 1987.

54. Корман Д.П. Некоторые лекарственные свойства антиоксидантов. // Биоантиокислители в регуляции метаболизма в норме и патологии. М., 1982. - С. 213-222.

55. Корнышева Е.А., Аникин В.В., Каргаполова А.В. Особенности динамики быстрых изменений фосфатидилинозитов крови у больных хроническим алкоголизмом. // Вопр.мед.хим. 1992. -№3. - С. 25-27.

56. Коробов В.Н., Федорович И.П., Климишин Н.И. Физико-химические и функциональные свойства гемоглобина мышей, инфицированных карциномой Эрлиха. // Бюлл.эксп.биол.мед. -1992. -Т.113, №6. С. 640-642.

57. Котык А., Яначек К. Мембранный транспорт. Междисциплинарный подход. М.: Мир, 1980. - 342 с.

58. Кочегуров В.Н. Гемодинамический механизм алкогольной артериальной гипертензии. // Тез. 3 Всероссийского съезда кардиологов. Свердловск, 1985. - С. 73-74.

59. Кочегуров В.Н. Изменения упруговязких свойств артериальных сосудов у больных алкоголизмом. // Сб. Научных трудов «Алкоголизм». М., 1988. - С. 80-82.

60. Крепе Е.М. Липиды клеточных мембран. Л., 1981.

61. Кузнецова Н.И., Проскурякова Т.В., Гуртовенко В.М. Иммунологические сдвиги и активность ферментов метаболизма этанола при алкогольной интоксикации. // Материалы 1 Съезда психиатров соц. стран. М., 1987. - С. 460-463.

62. Куницын В.Г., Курилович С.А., Волченко М.В. Удельная электропроводность «теней» эритроцитов и гемоглобина при алкоголизме. И Бюлл.эксп.биол.мед. 1993.- Т. 115, №12. - С. 595-599.

63. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1990. 352 с.

64. Лаптев А.В. Влияние алкоголя на особенности клинических проявлений сосудистых заболеваний. // Тез. докл. Актуальные вопросы наркологии. Кишинев, 1986. - С. 98-99.

65. Ла Селле Р. Мембраны и болезнь. Пер. с англ. М.: Медицина, 1980.-С. 17-34.

66. Ли Хо Ик, Владимиров Ю.А., Деев А.И. Сравнительное изучение действия карнозина и других антиоксидантов на хемилюминесценцию суспензии монослойных липосом в присутствии ионов железа. // Биофизика. 1990. - Т. 35. - С. 8285.

67. Лопина О.Д., Болдырев А.А. Влияние дипептидов анзерина и карнозина на аккумуляцию Са2+ фрагментами саркоплазматического ретикулума. //Доклады АН СССР. -1975 -Т. 220.-С. 1218-1221.

68. Лопухин Ю.М., Арчаков А.И., Владимиров Ю.А., Коган Э.М. Холестериноз. М., 1983.

69. Мальцева В.В., Котелевцев С.В., Скрябин Г.А. Влияние карнозина на Е-рецептор Т-лимфоцитов человека. // Тез. всес. конф. «Биохимия-медицине». Л., 1988. - С. 130.

70. Мальцева В.В., Сеславина Л.С., Матвеева Н.К. Действие осмотического шока на популяцию клеток крови. // Научн. Докл. Высш. Школы., Биол. Науки. -1990. №6. - С. 148-153.

71. Максимчук В.П., Митрофанов B.C., Шевченко Н.В. Алкогольная интоксикация и зависимость: механизмы развития, диагностика, лечение. Минск, 1988. - С.79-115.

72. Мануйленко Ю.А., Болотова З.Н., Бойко Т.П. Поражение некоторых структур мозга при алкоголизме. // Биологические основы алкоголизма. М., 1984. - С. 139 -142.

73. Маянский А.Н., Галлиуллин А.Н. Реактивность нейтрофила. -Казань.: Изд-во Казанского ун-та, 1984.

74. Маянский А.Н., Пикуза О.И. Клинические аспекты фагоцитоза.- Казань: Магариф, 1993.

75. Международная классификация болезней (10-ый пересмотр). Классификация психических и поведенческих расстройств. Перевод под ред. Нуллера Ю.Л., Циркина С.Ю. ВОЗ. Россия. Сан1сг-Петербург: АДИС,1994.

76. Мельников Л.К. Вегетативно-сосудистые кризы при алкогольной интоксикации. // Сов. медицина. 1980. - №6. -С. 106.

77. Меньшиков В.В. Лабораторные методы исследования в клинике. М.: Медицина, 1987.

78. Митрохин Н.М., Казакова И.С., Каплан Е.Р. Морфологические изменения эритроцитов под влиянием некоторых физиологически активных веществ. // Хим. фарм. журнал. -1989. Т. 23, №6. - С. 716-718.

79. Молодцов М.Ю., Бутусова Н.Н., Жукотский А.В., Коган Э.М. Морфологические изменения эритроцитов при алкоголизме и определяющие их факторы. // Вопросы наркологии. 1992. -№2. - С.72-75.

80. Морозов Г.В. Состояние и перспективы научных исследований в области алкоголизма. // Материалы 4 Всес. нарколог, конф. Кривой Рог, 1982. - С. 3-5.

81. Мжельская Т.И., Болдырев А.А. Биологическая роль карнозина в клеточном гомеостазе. //Журн.эвол.биох.физиол. -1997. -Т.ЗЗ. С 688-698.

82. Назаров З.А., Щербакова А.А. Некоторые гематологические показатели у больных алкоголизмом. // Здравоохр. Казахстана.- 1987. №5. - С. 24-25.

83. Невидимова Т.И., Суслов Н.И. Психотропные эффекты тимогена. Н Бюл. экспер. биол. мед. 1995. - № 2. - С. 199-200.

84. Неретин В .Я., Кирьяков В.А., Котов С.В. О влиянии алкоголя на мозговую гемодинамику. // Сов. медицина. 1987. - Вып.5. -С. 61-62.

85. Островский Ю.М. Метаболическая концепция генеза алкоголизма. // Этанол и обмен веществ. Минск: Наука и техника, 1982.

86. Островский Ю.М., Садовник М.Н. Пути метаболизма этанола и их роль в развитии алкоголизма. // Итоги науки и техники. Токсикология. М.: ВИНИТИ, 1984. - Т.13. - С. 93-150.

87. Островский Ю.М., Сатановская В.И., Садовник М.Н. Биологический компонент в генезисе алкоголизма. Минск: Наука и техника, 1986. - 95 с.

88. Островский Ю.М., Сатановская В.И., Островский С.Ю. Метаболические предпосылки и последствия потребления алкоголя. Минск: Наука и техника, 1988. - 263 с.

89. Островский В.Ю., Степуро И.И. Механизм связывания гексенала и виадрила сывороточным альбумином. // Биоорг. Химия.-1979.-Т.5, №8. С. 1161-1170.

90. Панасенко О.М., Арнхольд Ю., Сергиенко В.И. Влияние рН на перекисное окисление фосфолипидных липосом,индуцированное гипохлоритом. // Биофизика. -1998. Т. 43. - С. 463-469.

91. Панченко А.Ф., Антоненков В.Д., Яковченко В.А. Этанол и обмен веществ. Минск, 1982. - С. 143-160.

92. Петров Р.В., Хаитов Р.И., Пинегин Б.В. и др. Оценка иммунного статуса человека при массовых иммунологических обследованиях. // Методические рекомендации. Иммунология. -1992.-№ 6.-С.51-62.

93. Петрова И.В. Функционирование и регуляция Са2+-активируемых калиевых каналов эритроцитов. Автореферат дисс.д-ра биол. наук. Томск, 1999. - 34 с.

94. Пигарева Н.В., Симбирцев А.С., Колобов А.А., Калинина Н.М., Кауров О.А., Кетлинский С.А. Изучение иммуномодулирующей активности нового пептидного соединения бестима. // Иммунология. 2000. - № 1. - С. 33-35.

95. Писчасова Г.К., Горбачева И.В., Мухин В.А. Клиника и механизмы метаболических и структурных нарушений при алкоголизме.// Труды Омского мед.ин-та. Омск, 1986. - С. 7678.

96. Попова М.С., Ураков И.Г. Программа исследований по биологическим основам алкоголизма. // Биол.основы алкоголизма. М., 1984. - С. 15-18.

97. Попова Э.Н. О влиянии алкоголя на структуры мозга. // Ж. невропатологии и психиатрии. 1981. - Вып. 7. - С. 1084-1093.

98. Ромоданов А.П., Разумовская-Молукало J1.П. Сосудистый компонент психических нарушений у больных с органическими поражениями головного мозга. // Ж. невропатологии и психиатрии. 1992. - Вып.1. - С. 41-46.

99. ЮЗ.Ротенберг Ю.С. Проблема влияния промышленных токсичных веществ на биоэнергетические процессы организма. Дисс.д-ра.биол.наук. М., 1981. - 311 с.

100. Роуз С. Устройство памяти. От молекул к сознанию.: Пер с англ. Ю.В.Морозова. М.: Мир, 1995. - 384 с.

101. Ю5.Рубинчик М.М., Богданович Н.К. О морфологических особенностях гипоталямуса человека при длительном злоупотреблении алкоголем. // Судебно-мед. экспертиза. -1981. -Т.24, №4.-С. 31-34.

102. Юб.Руденская Г.Е., Смирнов В.Е., Энтин Г.М. Роль алкоголя в возникновении и течении кардио- и церебральных заболеваний. //Ж. невропатологии и психиатрии. 1982. - Вып. 2. - С. 267-277.

103. Рузиев А.Я. Особенности клинического течения и диагностики цереброваскулярной патологии при алкоголизме. // Тез. 2-ого Съезда невропатологов и психиатров Узбекистана. Ташкент, 1987.-С. 89-93.

104. Румянцев А.П., Тиунова J1.В., Остроумова Н.А. Метаболизм органических соединений жирного ряда. // Итоги науки и техники. Токсикология. М.: ВИНИТИ,1981. -Т.12. - С. 65-116.

105. Савельев Ю.М., Динерштейн Л.В. Сосудистые нарушения в головном мозге у больных алкоголизмом (Клинико-морфологические исследования) // Ж. невропатологии и психиатрии. 1981. - Вып. 2. - С. 74-78.

106. ИО.Салаева З.М., Давыдова Л.А. Клинико-морфологическая характеристика цереброваскулярных нарушений при алкогольной интоксикации. // Вопросы психоневрологии. -Баку.: Изд-во Азерб. мед. ин-т., 1980. Вып.8. - С.25-29.

107. Санников А.Г., Сторожок С.А., Василевский В.В. О молекулярных дефектах белков мембраны эритроцита и их последствиях. File: ///А /О молекулярных дефектах белков мембраны.htm. -1999.

108. Северин С.Е., Юй-Шуюй. Влияние дипептидов анзерина и карнозина на окислительное фосфорилирование визолированных митохондриях грудной мышцы голубя. // Биохимия. 1958. - Т. 23. - С. 862-868.

109. З.Семке В.Я., Галактионов O.K., Мандель А.И., Бохан Н.А., Мещеряков Л.В. Алкоголизм: региональный аспект. Томск.: Изд-во Том. Ун-та, 1992.

110. Симхович Б.З., Кишенис А.А. Механизм действия сердечнососудистых препаратов антагонистов кальция (обзор). // Хим.-фарм. журн. - 1984. - №2. - С. 134-147.

111. Иб.Скулачев В.П. Энергетика биологических мембран. М., 1989.

112. Скулачев В.П. Карнозин и анзерин как специализированные рН-буферы переносчики ионов водорода. // Биохимия. - 1992. -Т. 57.-С. 1311-1316.

113. Стволинский С., Соуза Понтеш Э., Сергиенко В. Иммуномодулирующие эффекты карнозина в экспериментах in vivo и in vitro. // Биологические мембраны. 1996. - Т. 13. - С. 299-306.

114. Сторожок С.А. Содержание гидроперекисей в липидах,активность супероксиддисмутазы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы эритроцитов при алкогольной интоксикации. // Вопросы мед. хим. 1983. - Т.29, №6. - С. 3135.

115. Сторожок С.А. О механизмах токсического воздействия этанола на систему красной крови. Автореф. дис.канд.мед.наук. Челябинск, 1984.

116. Сторожок С.А., Соловьев С.В. (1992) Структурные и11 функциональные особенности цитоскелета мембраныэритроцита. // Вопросы мед. химии. 1992. - Т. 38, №2. - С.14-17.

117. Сторожок С.А., Панченко Л.Ф., Филиппович Ю.Д., Глушков B.C. Изменение физико-химических свойств биологических мембран при развитии толерантности к этанолу. // Вопросы мед. химии. 2001. -№2. - С. 1 -7.

118. Сытинский И.А. Биохимические основы действия этанола на центральную нервную систему. М.: Медицина, 1980. - 192 с.

119. Сычева В.А. Морфологические особенности крови у больныхалкоголизмом и алкогольными психозами. Автореф. дисс.канд.биол.наук. М., 1975.

120. Твердислов В.А., Тихонов А.Н., Яковенко Л.В. Физические механизмы функционирования биологических мембран. М.: МГУ, 1987.

121. Теоретические основы поиска средств для лечения алкоголизма // Итоги науки и техники. Серия Токсикология Сб. под ред. акад. АБ.Вальдмана. - М.: ВИНИТИ, 1984. - Т. 13. -182 с.

122. Терсков И.А., Гительзон И.И. Эритрограммы как метод клинического исследования крови. // Биофизика. 1957. - Т.11. - С. 259-266.

123. Тиунов Л.А. (1981) Основные механизмы метаболизма ксенобиотиков в организме человека и животных. // Итоги науки и техники. Серия Токсикология. М.:ВИНИТИ, 1981. - Т. 12. -С.5-64.

124. Ткачук В.А. Введение в молекулярную эндокринологию. М.: Изд-воМГУ, 1983.-256 с.

125. Тухтаев К.Р., Шаюсупова А.У., Аринов А.Н. // Тез. 8 Всес. Съезда невропатологов, психиатров и наркологов. М.,1988. -Т.1.-С. 444-445.

126. Тюлина О.В., Каган В.Е., Болдырев А.А. Модулирующий эффект карнозина и родственных соединений на дыхательный взрыв лейкоцитов, активированных сульфатом бария. // Бюлл.эксп.биол.мед. 1994. - Т. 118, №11. - С.463-466.

127. Тюлина О.В., Стволинский С.Л., Каган В.Е., Болдырев А.А. Влияние карнозина и его природных производных на хемилюминесценцию лейкоцитов, активированных BaS04. // Нейрохимия. 1995. -Т.12, №1. -С.46-51.

128. Умудов Х.М. Автоматизированная морфометрия эритроцитов в норме и при холестеринозе. Дисс. канд. мед. наук, М., 1987.

129. Успенский А.Е. Биологические маркеры употребления алкоголя. // Клиническая медицина. 1986. - Т. 64, №6. - С. 128.

130. Успенский А.Е. Токсикологическая характеристика этанола. // Итоги науки и техники. Серия Токсикология. ВИНИТИ. 1984. -Т.13.-С. 6-56.

131. Ураков И.Г. Алкоголь: личность и здоровье. М.: Медицина, 1986.

132. Урбах В.Ю. Статистический анализ в биологических и медицинских исследованиях. М.: Медицина, 1975. - 295 с.

133. Формазюк В.Е., Горшкова Т.Ю., Болдырев А.А., Сергиенко В.И. Характеристика хлораминовых комплексов карнозина с гипохлорит-анионом. // Биохимия. 1992. - Т. 57. - С. 13241329.

134. Хавинсон В.Х., Малинин В.В. Механизмы геропротекторного действия пептидов. // Бюл. экспер. биол. мед. 2002. - Т. 133, №1. - С. 4-10.

135. Черенько В.Б. Состояние системы иммунитета у больных алкоголизмом с экзогенно-органическими поражениями головного мозга. Автореф. дисс.канд. мед. наук. Томск, 1994.-24 с.

136. Черенько В.Б., Бохан Н.А. Некоторые показатели системы иммунитета у больных алкоголизмом. // Тез. регион, научно-практ. конф. Региональные аспекты психического здоровья. -Владивосток, 1991. С. 103-105

137. Черницкий Е.А., Воробей А. В. Структура и функция эритроцитарных мембран. Минск: Наука и техника, 1981. - 260 с.

138. Черный В.В., Донат Э., Мирский В.М., Пауличке М., Соколов

139. B.C. Модификация свойств липидного бислоя, связанная с влиянием гипохлорита натрия. I. Действие на мембраны эритроцитов. // Биологические мембраны. 1992. - Т. 9. - С. 6065.

140. Шалабодов А.Д. 1Ма,К-АТФаза эритроцитов человека и крысы в норме и при первичной артериальной гипертензии. Дисс.канд. биол. наук. Ленинград, 1985.

141. Швачко А.Г., Формазюк В.Е., Сергиенко В.И. Тушение хемилюминесценции синглетного кислорода в присутствии карнозина. // Бюлл. эксп. биол. мед. 1990. - Т. 110, №8. - С. 155-157.

142. Шмидта Р., Тевс Г. Физиология человека. // В четырех томах, Т.З. Кровь. Кровообращение. Дыхание. Пер. с англ. Под ред. Костюка П.Г. М.: Мир, 1986. - 288 с.

143. Яковченко В.А., Николаев А.Б. Козин А.Н. Материалы 3 республиканского съезда невропатологов, психиатров и наркологов Грузии. Тбилиси, 1987. - С.652-655.

144. Abu-Murad С., Nordmann R. Effect of desferoxamine on ethanol in mice. // I Congress of the lnt.Soc.Biomed.Res.Alcoholism. -Munich, 1982.-P. 288.

145. Aebi H. Catalase in vitro. // Methods in Enzymol. 1984. - V. 105. - P. 121-126.

146. Ahrens M.L. Electrostatic control by lipids upon the membrane-bound Na+/K+-ATPase. II The influence of surface potential upon the activating ion equilibria. // Biochem. Biophys. Acta. 1983. - V. 732, N1.-P. 1-10.

147. Akkus I., Gultekin F., Akoz M. Effect of moderate alcohol intake on lipid peroxidation in plasma, erythrocyte and leukocyte and on some antioxidant enzymes. // Clin.Chim.Acta. 1997. - V. 266. - P. 141-147.

148. Aloia R.C., Paxton J., Davaau J. Effect of chronic alcohol consumption on rat brain microsome lipid composition, membrane fluiditi and Na,K-ATPase activity. // Life Sci. 1985. - V.36. - P. 1003-1017.

149. Altura B.M. Gebrewold A. Altura B.T. Gupta R.K. Role of brain Mg2+.j in alcohol-induced hemorrhagic strokein a rat model: a 31P-NMR in vivo study. //Alcohol.-1995- V.12, N2. P. 131 -136.

150. Amit Z., Brown Z.W., Rockman G.E. Possible involvement ofacetaldehyde, norepinephrine and their tetrahydroisoquinoline derivates in the regulation of ethanol self-administration. // Drug.Alc.Depend. 1977. - V.2, N5-6. - P. 495-500.

151. Asai H., Imaoka S., Kuroki Т., Monna Т., Funae Y. Microsomal ethanol oxidizing system activity by human hepatic cytochrome P* 450s. // J.Pharmacol.Exp.Ther. 1996. - V. 277. - P. 1004-1009.

152. Babor T.F., Ritsen E.B., Hodgson R.J. Alcohol-related problems in the primary health care setting. A review of early intervention strategies. // Brit. J. Add. 1986. - V.61. - P.22-47.

153. Badawy A., Williams D., Evans M. The role of tyrosine availability in the multiple effects of acute ethanol administration on rat brain catecholamine synthesis. // Pharmacol. Biochem. Behav. 1983. -V. 18, Suppl. 1.-P. 389-396.

154. Bailey S.M., Patel V.B., Young T.A., Asayama K., Cunningham C.C. Chronic ethanol consumption alters the glutathione/glutathione peroxidase-1 system and protein oxidation status in rat liver. // Alcohol. Clin. Exp. Res. -2001. -V. 25. P. 726-733.

155. Barry R.E., Megivan J.D. Acetaldehyde alone pay initiate hepatocellular damage in acute alcoholic liver disease. // Gut. -1985. V.26, N10. - P. 1065-1069.

156. Bate-Smith E.C. The buffering of muscle in rigor; protein, phosphate and carnosine. // J. Physiol. -1938 V. 92. - P. 336-343.

157. Baynes J.W., Monnier V.M. The Maillard reaction in aging, diabetes and nutrition. Ed. Alan R. - Liss. - New York, 1989.

158. Beauge F., Fleuret-Balter C., Barin F., et al. Brain membrane disordering related to acute ethanol administration in native and short-term ethanol intoxicated rats. // Drug.Alcohol.Depend. 1982. -V.10, N2-3.-P. 143-151.

159. Beauge F., Gallay J.,Stibler H., Borg S. Alcohol abuse increases the lipid structural order in human erythrocyte membranes. A stedy-state and time-resolved anisotropy study. // Biochem. Pharmacol. -1988. V.37. - P. 3823-3828.

160. Beauge F., Leguicher A., LeBourhis В., Aufrere G Membrane properties in behaviorally ethanol-dependent rats. // Ale. Ale. 1987. - V. 22, Suppl.1. - P. 669-673.

161. Beauge F., Niel E., Hispard E., Perrotin R., Thepot V., Boynard M., Nalpas B. Red blood cell deformability and alcohol dependence in humans. //Ale. Ale. 1994. - V. 29. - P. 59-63.

162. Beauge F., Stibler H., Borg S. Abnormal fluidity and surface carbohydrate content of the erythrocyte membrane in alcoholic patients.

163. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 1985. - V.9. - P. 322326.

164. Beauge F., Stibler H., Borg S. Alterations of erythrocyte щ. membrane organization in alcoholics. // Ale. Ale. 1987. - V.1. - P.561.565.

165. Beglund M., Risberg J. Regional cerebral blood flow during alcohol withdrawal. // Arch.Gen.Psychiatry. 1981. - V. 38. - P. 351-355.

166. Bernstein J., Meneses P., Basilio C. // Res. Comm. Chem. Pathol.

167. Pharmacol. -1984. V.46, N1. - P.121-126.

168. Berridge M.J. A novel cellular signal system based on the integration of phospholipid and calcium metabolism. // In: Calcium and cell function. 1982. - V. VIII. - P. 1-36.

169. Beilin L.J., Puddey I.B. Alcohol and essential hypertension. // Ale. Ale. 1984. - V. 19, N3. - P. 191 -195.

170. Bjorneboe A., Hagen B.F., Drevon C.A. Long-term administration of ethanol effects the knetics of tocopherol in rats. // Pharmacol.

171. And Toxicol. 1987. -V. 61, N1. - P. 33.

172. Bird D.A., Kabakibi A., Laposata M. The distribution of fatty acid ethyl esters among lipoproteins and albumin in human serum. // Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 1997. - V.21. -P. 602-605.

173. Bizzaro N., Piazza I., Baldo G., Baritussio A. Alcohol induced burrcell (echinocytic) haemolytic anaemia and haemochromatosis. // Clin. Lab. Haematol. 1993. -V. 15. - P. 93-102.

174. Blum K.f Briggs A.H., DeLallo L. On the mechanism of the methadon-induced alcohol consumption in humans. // Subst. Alcohol Actions Misuse. 1982. - V. 3, N 1-2. - P. 1-4.

175. Boldyrev A.A. Does carnosine possess direct antioxidant activity? // Int. J. Biochem. 1993. -V. 25. - P.1101-1107.

176. Boldyrev A., Abe H., Stvolinsky S. Effects of carnosine and related compounds on generation of free oxygen species: A comparative study. // Сотр. Biochem. Physiol. 1995. - V. 112B. -P. 481-485.

177. Boldyrev A.A., Dupin A.M., Bunin A.Ya., Babizhaev M.A., Severin S.E. The antioxydative properties of carnosine, a natural histidine-containing dipeptide. // Biochem. Intern. 1987. - V. 15. - P. 11051113.

178. Boldyrev A.A., Dupin A.M., Pindel E.V., Severin S.E. Antioxidative properties of histidine-containing dipeptides from skeletal muscles of vertebrates. // Сотр. Biochem. Physiol. 1988. - V. 89B. - P. 245-250.

179. Boldyrev A.A., Ruuge E., Smirnova I., Tabak M. Na.K-ATPase: the role of state of lipids and Mg ions in activity regulation. // FEBS Letters. 1977. - V.80. - P.303-307.

180. Bondy S.C., Guo. Effect of ethanol treatment on indices of cumulative oxidative stress. // Eur. J. Pharm. 1994. - V.270, N4. -P. 349-355.

181. Bora P.S., Farrar M.A., Miller D., Chaitman B.R., Guruge B.L. Myocardial cell damage by fatty acid ethyl esters. // J. Cardiovasc. Pharmacol. 1996. - V. 27. - P. 1-6.

182. Bora P.S., Lange L.G. Molecular mechanism of ethanol metabolism by human brain to fatty acid ethyl esters. // Ale. Clin. Exper. Res. 1993. - V. 17. - P. 28-30.

183. Boveris A., Llesuy S., Azzalis L.A. et al. In situ rat brain and liver spontaneous chemiluminescence after acute ethanol intake. // Toxicol.Lett. 1997. - V.93. - P. 23-28.

184. Brahm J. Permeability of human red cells to a homologous series of aliphatic alcohols. Limitations of the continuous flow tube method. // J.Gen.Physiol. 1983. - V. 81. - P. 283-304.

185. Brander C.J., Eklund H., Zeppezauer E. et al. Structure and mechanism of alcohol dehydrogenase. Protein: Struct., Funct. and Ind. Appl. // FEBS Fed.Eur.Biochem.Soc. 12th Meet. -Dresden, 1978. - Oxford, 1979. - P. 15-23.

186. Brandts J.F., Erickson L., Lysko K., Schwartz E.T., Taverna R.D. Calorimetric studies of the structural transitions of the human erythrocyte membrane. The involvement of spectrin in the A transition. // Biochemistry. 1977. - V. 16. - P. 3450-3454.

187. Brown C.E. Interactions among carnosine, anserine, ophidine and copper in biochemical adaptatyon. // J. Theoret. Biol. 1981. - V. 88. - P. 245-256.

188. Brown C.E., Antholine W.E. Chelation chemistry of carnosine. Evidence that mixed complexes may occure in vivo. // J.Phys.Chem. -1979. -V. 83. P. 3314-3319.

189. Brown C.E., Margolis F.L., Williams Т.Н., Pitcher R.G., Elgar G.J. Carnosine binding: characterization of steric and change requirements for ligand recognition. // Arch. Biochem. Biophys. -1979.-V. 193.-P. 529-542.

190. Brown C.E., Antholine W.E. Evidence that carnosine and anserine may participate in Wilson"s disease. // Biochem. Biophys. Res.Comm. 1980. - V. 92. - P. 470-477.

191. Brown С.E., Virgine D.W., Czernuszewicz R., Nakamoto K. Regulation of peroxobridge formation betwine cobalt (ll)-carnosine complexes by histidine: possible involvment in polycythemia. // J.lnorg.Biochem. 1982. - V.17. - P. 247-158.

192. Brugnara C., Franclin H. Volume change in single cell anaemia red cells. // Science. 1986. - V. 232. - P. 388-390.

193. Brugnara C., Tosteson D.C. Cell volume, К transport, and cell density in human erythrocytes. //Am.J.Physiol. 1987. - V.252(Cell Physiol. 21): - C269-C276.

194. Brugnara C. Membrane transport of Na and К cell degydration in sickle erythrocytes. // Experientia. 1993. - V. 49. - P. 100 - 109.

195. Brugnara C., Armsby C.C., De Francenshi L., et al. Ca2+-activated K+-channels of human and rabbit erythrocytes display distinctive pattern of inhibition by venom peptide toxins. // J.Membr.Biol. -1995.-V.147, N1.-P. 71-82.

196. Buhler R., Pestalozzi D., Hess M., vonWartburg J.P. Localization of alcohol dehydrogenase in human tissues: a immunohistochemical study. // Biochem.Pharmacol. 1983. - V. 18, Suppl.l. - P. 55-62.

197. Buss H., Chan T.P., Sluis K.B., Domigan N.M., Winterborn C.C. Protein carbonyl measurement by a sensitive ELISA method. // Free Rad. Biol.Med. 1997. - V.23, N3. - P. 361-366.

198. Calabrese V., Renis M., Calderone A., et al. Stress proteins and SH-groups in oxidant-induced cellular injury after chronic ethanol administration in rat. // Free Rad.Biol.Med. 1998. - V. 24. - P. 1159-1167.

199. Canessa M. Red cell volume-regulated ion transport system in haemoglobinopathies. // Hematol.Oncol.Clin.North.Am. 1991. -V.5. - P. 495-516.

200. Cavero I., Spedding M. Calcium antagonists: a class of drugs with a bright future. Part I. Cellular calcium homeostasis and calcium as a coupling massenger. // Life Sci. 1983. - V.33, N 26. - P. 25712581.

201. Cederbaum A.I. Oxygen radical generation by microsomes: Role of iron and implications for alcohol metabolism and toxicity. // Free Radic.Biol.Med. 1989. - V.7. - P. 559-567.

202. Chamulitrat W., Spitzer J.J. Nitric oxide and liver injury in alcohol-fed rats after lipopolysaccharide administration. // Alcohol. Clin. Exp. Res. 1996. - V.20. - P. 1065-1070.

203. Chang W., Waltenbaugh C.f Borensztajn J. Fatty acid ethyl ester synthesis by the isolated perfused rat heart. // Metab: Clin. Exp. Res. 1997. - V.46. - P. 926-929.

204. Chelazzi G., Piccinelli O., Senaldi G. Cellular immunity in alcohol-induced liver disease. // Acta gastro-enterol.belg. 1985. - V.48, N2. - P. 111-117.

205. Chen L.H., Xi S., Cohen D.A. Liver antioxidant defenses in mice fed ethanol and the AIN-76A diet. // Alcohol. 1995. - V. 12. - P. 453^457.

206. Chevion, M., Berenshtein, E., Stadtman. E.R. Human studies related to protein oxidation: protein carbonyl content as a marker of damage. // Free Radic. Res. 2000. - V. 33, Suppl.1. - S99-S108.

207. Chi L.M. Wu W.G. Mechanism of hemolysis of red blood cell mediated by ethanol. // Biochem.Biophys.Acta. 1991. - V. 1062. -P. 46-50

208. Chin J., Goldstein D. Effects of low concentrations of ethanol on the fluidity of spin-labeled erythrocyte and brain membranes. // Molec. Pharmacol. 1977. - V. 13. - P. 435^41.195 «

209. Chin J.H., Goldstein D.B. Drag tolerance in biomembranes: a spin label study of the effect of ethanol. // Science (Wash.DC). 1977. -V.196. - P. 684-685.

210. Chin J.H., Goldstein D.B. Cholesterol blochs the disordering effects of ethanol in biomembranes. // Lipids. 1984. - V. 19, N12. -P. 929-935.

211. Clow A., Murray R.M., Sandler M., Stolerman J.P. Intraventricular tetrahydropapaveroline increases alcohol consumption in rat. // Brit.J.Pharm. 1982. -V. 75, Suppl. 54. - P. 48-54.

212. Cohen C.M. The molecular organization of the red cell membrane skeleton. // Semin. Hematol. 1983. - V. 20. - P. 141-158.

213. Cohen C.M., Langley R. Characterization of human erythrocyte spectrin a and p chains: association with actin and erythrocyte protein 4.1.// Biochemistry. 1984. - V.23, N19. - P. 4488-4495.

214. Cohen M., Hartlage P.L., Krawiecki L. Serum carnosinase deficiency: a non-disabling phenotype? // J. Ment. Defic. Res. -1985.-V. 29.-P. 383-389.

215. Conte A., Bianchi I., Guazzelli M., Taponeco G., Bertelli A., Ronca G. Effect of L-propionyl carnitine on some properties of erythrocytes and leukocytes of alcohol abusers. // Int. J. Tissue React. 1995. -V. 17.-P. 21-31.

216. Cooper J.A. Effects of cytochalasin and phalloidin on actin. // J.Cell.Biol. 1987. - V.105. - P.1473-1478.

217. Czapski G. Reaction of HO*. // In: Meth. In Enzymology. Ed. L. Packer. 1984. - V. 105. - P. 209-215.

218. Dahl Т.A., Midden W.R., Hartman P.E. Some prevalent biomolecules as defenses against singlet oxygen damage. // Photochem. Photobiol. 1988. - V. 47. - P. 357-362.

219. DePetrillo P. Peterson D. Effect magnesium sulfate on alcohol withdrawal symptomatology. // Amer. Soc.Clin. Pharmacol. Ther. -1992. -V.1.-P. 169-173.

220. Deitrich R.A. Baker R.C. Initial sensitivity of rat inbred strains to acute alcohol. //Alcoholism. 1984. - V.8, N5. - P. 487-490.

221. Diaz C., Morkowski J., Schroit A.J. Generation of phenotypically aged phosphatidylserine-expressing erythrocytes by dilauroylphosphatidylcholine-induced vesiculation. // Blood. 1996. - V 87. - P. 2956-2961.

222. Di Luzio N.R. Prevention of the acute ethanol-induced fatty liver by antioxidants. // Physiologist. 1963. - V.6. - P. 169-173.

223. DiPadova C., Worner T.M., Julkunen R.J.K., Lieber C.S. The effect of abstinence on the blood acetaldehyde response to a test dose of alcohol in alcoholics. // Alcohol.Clin.Exp.Res. 1987. -V.11.-P. 559-561.

224. DiPalma J.R. Magnesium replacement therapy. // Am.Fam.Physician. 1990. - V.42, N1. - P.173 -176.

225. Dodge J.T., Mitchell C., Hanahan D.J. The preparation and chemical characterisation of haemoglobin-free ghosts of human erythrocytes. //Arch. Biochem. Biophys. 1963. - V.100. - P. 119130.

226. Dodson R.A., Hinds T.R., Vincenzi F.F. Effects of calcium and A23187 on deformability and volume of human red blood cells. // Blood cells. -1987.-V. 12.-P. 555-561.

227. Doyle, K.M., Bird, D.A., Al-Salihi, S., Hallaq, Y., Cluette-Brown, J.E., Goss, K.A. and Laposata, M. Fatty acid ethyl esters are present in human serum after ethanol ingestion. // J. Lipid Res. 1994. - V. 35. - P. 428437.

228. Doyle K., Hojnacki J., Cluette-Brown J. Ethanol-induced alterations in erythrocyte membrane phospholipid composition. // Amer.J.Med.Sci. -1990. V. 299, N2. - P. 98-102.

229. Droitte Ph., Lamboeuf Y., de Saint Blanquat G. Membrane fatty acid changes and ethanol tolerance in rat and mouse. II Life Sci. 1984. - V. 35. - P. 1221-1229.

230. Dumas D., Muller S., Gouin F., Baros F.f Viriot M.L., Stoltz J.F. Membrane fluidity and oxygen diffusion in cholesterol-enriched erythrocyte membrane. // Arch. Biochem. Biophys. 1997. - V. 341. - P. 34-39.

231. Dunnett M., Harris R.C. Determination of carnosine and other biogenic imidazoles in equine plasma by isocratic reversed-phase ion-pairhigh-performance liquid chromatography. // J. Chromatogr. 1992. - V. 579. -P. 45-53.

232. Dupont I., Lucas D., Clot P., Menez C., Albano E. Cytochrome P-4502E1 inducibility and hydroxyethyl radical formation among alcoholics. // J.Hepatology. 1998. - V. 28. - P. 564-571.

233. Eder P., Soong С., Tao V. // Biochemistry. 1986. - V. 25. - P. 1764-1770

234. Edwards G. Report of a WHO-group of investigators on criteria for identifying and classifying disabilities related to alcohol consumption. Alcohol related disabilities. // WHO-Offset Publication. 1977. - N 32. - P. 5-22.

235. Edwards G. The Alcohol Dependence Syndrome. A concept as stimulus to enquary. // Brit. J. Add. 1986. - V. 81. - P. 171 -183.

236. Elgsaeter A., Stokke B.T., Mikkelsen A., Branton D. The molecular basis of erythrocyte shape. // Science. 1986. - V. 234, N4781.-P. 1217-1223.

237. Eriksson C.J.P. Alcohol and aldehyde metabolizing systems. Ed. Thurman R. N.Y.: Acad.Press, 1977. - P. 285-294.

238. Eriksson C.J.P. Effects of exogenous ethanol, pyrazole, cyanamide and disulfuram on endogenous acetaldehyde in rats. // Acta Pharmacol. 1985. - V. 57, Suppl.1. - abstr. 20.

239. Faqvin W.G., Chanwala S.G., Cantley L.C., Branton D., Protein kinase С of human erythrocytes phosphorylates bands 4.1 and 4.9. // Biochim Biophys Acta. -1986. V. 887, N. 2. - P. 142-149.

240. Fernandez-Sola J., Villegas E., Nicolas J.M. et al Serum and muscle levels of alpha-tocopherol, ascorbic acid, and retinol are normal in chronic alcoholic myopathy. // Alcohol Clin. Exper. Res. -1998.-V.22.-P. 422-427.

241. Feuerlein W. Epidemiologic und volkswirtschaftliche Bedeutung des Alkoholismus. //Therapiewoche. 1984. - V.34. - P.2916-2931.

242. Foley T.D., Rhoads D.E. Stimulation of synaptosomal Na,K-ATPase by ethanol: possible involvement of an isozyme-specific inhibitor of Na,K-ATPase. // Brain Res. 1994. - V. 653. - P.167-172.

243. Foster D.M.,Huber M.D., Klemm W.R. Ethanol may stimulate or inhibit Na,K-ATPase, depending upon Na+ and K+ concentrations. // Alcohol. 1989. - V.6. - P. 437 - 443.

244. French S.W. Ethanol and hepatocellular injury. // Clin.Lab.Med. -1996.-V. 16.-P. 289-306.

245. Gaines K.C., Salhany J.M., Tuma D.J., Sorrell M.F. Reaction of acetaldehyde with human erythrocyte membrane proteins. // FEBS Letters. 1997. - V.75, N1. - P. 115-119.

246. Gastaldi M., Lerique D., Feugere Т., Le Petit-Thevenin J., Nobili O., Boyer J. Altered acylation of erythrocyte phospholipids in alcoholism. //Ale. Clin. Exper. Res. 1988. - V.12. - P. 356-359.

247. Gil E.B., Romero Ortiz A., Maldonado M.A., Rubio L.M.A., Maldonado M.I.A., Rico I.J. Erythrocyte morphometry in alcoholism. // Anal.Med.Interna. 1989. - V. 6. - P. 454-457.

248. Godfraind J. Calcium entry blockers and tissue protection. New York: Raven Press, 1985. -485p.

249. Gold M.S., Pottash A.L., Extein J. Evidence for an endorphin dysfunction in nethadone addicts: lack of ACTH response to naloxone. II Drug Alc.Depend. 1981. - V.8, N3. - P. 257-262.

250. Goldberg D.M., Kapur B.M. Enzymes and circulating proteins as markers of alcohol abuse. // Clin. Chem. Acta. 1994. - V.226, N2. -P. 191-209.

251. Goldstein D., Chin J. Interaction of ethanol with biological membranes. // Fed.Proc. 1981. - V. 40. - P. 2073 - 2076.

252. Gorski, N.P., Nouraldin, H., Dube, D.M., Preffer, F.I., Dombrowski, D.M., Villa, E.M., Laposata, M. Fatty acid ethyl esters: Nonoxidative ethanol metabolites with emerging biological and clinicalsignificance. // Lipids. 1999. - V. 34. - P. S281-S285.

253. Graham L., Gallop P.M. Covalent protein crosslincs: general detection, quantitation and characterization via modification with diphenyl-borinic acid. // Anal. Biochem. 1994. - V.217, N2. - P. 298-305.

254. Grattagliano I., Vendemiale G., Didonna D., Errico F., Bolognino A., Pistone A., Cofano M., Signorile A., Ciannamea F., Altomare E. Oxidative modification of proteins in chronic alcoholics.// Boll. Soc. Ital. Biol. Sper. 1995. - V.71. - P. 189-195.f

255. Grattagliano I., Vendemiale G., Sabba C., Buonamico P., Altomare E. Oxidation of circulating proteins in alcoholics: role of acetaldehyde and xanthine oxidase. // J.Hepatol. 1996. - V. 25, N1.-P. 28-36.

256. Grennell T.L. The binding of alcohol to brain membranes. // Adv. Exp. Med. Biol. 1975. - V. 59. - P. 11-22.

257. Griffiths H.R. Antioxidants and protein oxidation. // Free Radic. Res. 2000. - V.33, Suppl S47-S58.

258. Gubitosi-Klug R.A., Gross R.W. Fatty acid ethyl esters, nonoxidative metabolites of ethanol, accelerate the kinetics of activation of the human brain delayed rectifier K+ channel, Kv1.1. // J. Biol. Chem. 1996. - V.271. - P. 32519- 32522.

259. Gulewitsch W.S., Amiradzibi S. Uber das Carnosin, eine neue organische Base des Fleischextraktes. // Ber. Deutsch. Chem. Ges. 1900. - V.33. - S. 1902-1903.

260. Haber P.S., Wilson J.S., Apte M.V., Pirola R.C. Fatty acid ethylesters increase rat pancreatic lysosomal fragility. // J. Lab. Clin. Med. 1993. - V.121. - P. 759-764.

261. Halliwell DB., Gutteridge J.M.C. In: Free Radicals in Biology and medicine. // Oxford: Oxford University Press, 1989. P. 86-91; 332334.

262. Halliwell DB., Gutteridge J.M.C. In: Free Radicals in Biology and medicine. // Oxford: Oxford University Press, 1999. P. 134-136; 485-491.

263. Handler J.A., Bradford B.U., Glassman E et al. Catalase-dependent ethanol metabolism in vivo in deermice lacking alcohol dehydrogenase. // Biochem.Pharmacol. 1986. - V.35, N 24. -P.4487-4492.

264. Harlow E., Lane D. Antibodies: a laboratory manual. // Cold Spring Harbor Laboratory. -1988.

265. Harris R.A., Baxter D.M., Mitchell M.A., Hitzemann R.J. // Mol. Pharmacol. 1984. - V.25. - P. 401-409.

266. Harris R.A., Caldwell K.K. Alcohol and the calcium-dependent potassium transport of human erythrocytes. // Alcohol. 1986. - V. 2, N1.-P. 149-152.

267. Harris R.D., Burnett R., McQuilkin S., McClard A., Simon F.R. Effects of ethanol on membrane order: Fluorescence studies. // Ann. New York Acad. Sci. 1987. - V. 492. - P. 125-135.

268. Harris R., Schroeder F. Ethanol and physical properties of brain membranes. // Molec.Pharmacol. 1981. - V. 20, N1. - P. 128-137.

269. Hausley M.D., Stanly K.K. Dynamics of Biological membranes. // N.Y. 1984.

270. Hayashi N., Kamada Т., Sato N. et al. Inhibition of cytochrome P-450 dependent mixed function oxidation by ethanol. // Dig.Diseses and Sci. 1985. - V. 30, N4. - P. 334-339.

271. Heim M., Morgner J. Alcoholism and macrocytosis. // Zeitschrift fur arztliche fortbildung. 1980. - V. 74, N 18. - P. 846-846.

272. Hillman R.S. Ann.N.Y.Acad.Sci. 1975. -V. 252. - P. 297-306.

273. Hipkiss A.R., Worthington V.C., Himsworth D.T., Herwig, W. Protective effect of carnosine against protein modification mediated by malondialdehyde and hypochlorite. // Biochim. Biophys. Acta. -1998.-V. 1380.-P. 46-54.

274. Hiraishi H., Shimada Т., Ivey K.J., Terano A. Role of antioxidant defenses against ethanol-induced damage in cultured rat gastric epithelial cells. // J.Pharmacol.Exper.Therap. 1999. - V. 289. - P. 103-109.

275. Hjelle J.J., Gubbs J.H., Petersen D.R. Inhibition of mitochondrial aldehyde dehydrogenase by malondialdehyde. // Toxicol. Letters. -1982.-V. 12, N1. P. 35-43.

276. Но A.K., Rossi N. Suppression of ethanol consumption by metenkephalin in rats. // J.Pharm.Pharmacol. 1982. - V. 34, N2. -P. 118-119.

277. Hoffman P.L., Luthin G., Tabakoff B. Abstr. 1-st Congr. Int. Soc. Biomed. Res. On Alcoholism. Munich: Germany, 1982. - P. 74.

278. Holmes R.S., Duley J.A., Algar E.M., et.al. Biochemical and Genetic Studies on Enzymes of Ethanol Metabolism74 the Mouse as a Model Organosm for Human studies. // Ale. Ale. 1986. - V. 21, N1.-P. 41-56.

279. Holownia A., Ledig M., Braszko J.J., Menez J.-F. Acetaldehyde cytotoxicity in cultured rat astrocytes. // Brain Res. 1999. - V. 833. - P. 202-208.

280. Homaidan F.R., Kricka L.J., Bailey A.R., Whitehead T.P. Red cell morphology in alcoholics: a new test for alcohol abuse. // Blood Cells. 1986. - V. 11. - P. 375-392.

281. Hoult J.R.S., Peers S.H. Effects of ethanol and mepacrine on arachidonate mobilisation in trombin and А-23187-stimulated platelet phospholipids. // Brit.J.Pharm. 1985. - V. 84, suppl. - P. 153-154.

282. Hrelia S., Lercker G.f Biagi P.L., Bordoni A., Stefanini F., Zunarelli P., Rossi C.A. Effect of ethanol intake on human erythrocyte membrane fluidity and lipid composition. // Biochem. Int. 1986. -V. 12.-P. 741-750.

283. Hsieh S.T., Sano H., Saito K.f Kubota Y.t Yokoyama M. Magnesium supplementation prevents the development of alcohol-induced hypertension. // Hypertension. 1992. - V.19, N2. - P. 175 -182.

284. Huentelman M.J., Peters C.M., Ervine W.E., Polutnik S.M., Johnson P. Ethanol has differential effects on rat neuron and thymocyte reactive oxygen species levels and cell viability. // Comparative Biochem.Physiol. 1999. - V. 124. - P. 83-89.

285. Hunter G. Observation on the distribution and variation of carnosine in cat muscle. // Biochem. J. 1924. - V. 18. - P. 408411.

286. Jackson M.C., Kucera C.M., Lenney J.F. Purification and properties of human serum carnosinase. // Clin.Chim.Acta. 1991. -V.196. - P. 193-206.

287. O.Johnson J.H., Crider B.P. Increases in Na,K-ATPase activity of erythrocytes and skeletal muscle after chronic ethanol consumption: Evidence for reduced efficiency of the enzyme. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - V. 86. - P. 7857 - 7860.

288. I.Johnson J., Hainline В., Rajagopolan K. Methanol and ethanol metabolism. // J.Biol.Chem. 1980. - V. 255, N5. - P. 1783-1786.

289. Johnson P., Wie Y., Huentelman M.J., Peters C.M., Boldyrev A.A. Hydralazine, but not captopril, decreases free radical formation and apoptosis in neurones and thymocytes. // Free Radical Research. -1988.-V.28.-P. 393-402.

290. Jones A.W., Skagerberg S., Borg S., Anggard E. Time course of breath acetaldehyde concentrations during intravenous infusions of ethanol in healthy men. // Drug. Alcohol. Depend. 1984. - V.14, N2.-P. 113-119.

291. Keilin D., Hartree E.F. Properties of catalase: Catalysis of coupled oxidation of alcohols. // Biochem. J. 1945. - V. 39. - P. 293-301.

292. Kelly-Murphy S., Waring A.J., Rottenberg H., Rubin E. Effects of chronic ethanol consumption on the partition of lipoohilic compounds into erythrocyted membranes. // Lab.Invest. 1984. -V.50, N2.-P. 174-183.

293. Kinoshita H., Ijiri I., Ameno S., Fuke C.( Ameno K. Additional proof of reduction on ethanol absorption from rat intestine in vivo by high acetaldehyde concentration. //Alc.Alc. 1995. - V.30, N4. - P. 419421.

294. Kishimoto R., Fujiwara I., Kitayama S., Goda K., Nakata Y. Changes in hepatic enzyme activities related to ethanol metabolism in mice following chronic ethanol administration. // J.Nutr.Sci.Vitaminol. 1995. - V.41. - P. 527-543.

295. Klassen L.W., Tuma D.J., Sorrell M.F., McDonald T.L., De Vasure J.M., Thiele G.M. Detection of reduced acetaldehyde protein adducts using a unique monoclonal antibody. // Alcohol. Clin. Exp. Res. 1994. - V. 18, N1. - P. 164-171.

296. Klassen L.W., Thiele G.M. Immune reactivity to proteins biotransformed by alcohol metabolites. // Alcohol Clin. Exp. Res. -1998. Aug;22(5 Suppl). - P. 204S-207S

297. Klemm W.R. Prog. Neuropsychopharmacol. U Biol. Psychiatry. -1987.-V.11.-P. 633-658.

298. Kohen R., Misgav R., Ginsburg I. The SOD like activity of copper: carnosine, copper.anserine and copper:homocarnosine complexes. // Free Rad. Res. Com. 1991. -V. 12-13, Pt 1. - P. 179-185.

299. Kohen R., Yamamoto Y., Kundy K.S., Ames B.N. Antioxidant activity of carnosine, homocarnosine, and anserine present in muscle and brain. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. 1988. - V. 85. - P. 3175-3179.

300. Koop D.R., Morgan E.T., Tarr G.E., Coon M.J. Purification and characterization of a unique isoyme of cytochrome P-450 from liver microsomes of ethanol-treated rabbits. // J.Biol.Chem. 1982. -V.257. - P. 8472-8480.

301. Koopman G., Reutelingsperger C.P., Kuijten G.A., Keehnen R.M., Pals S.T., van Oers M.H. Annexin V for flow cytometric detection ofphosphatidylserine expression on В cells undergoing apoptosis. // Blood. 1994. - V. 84. - P.1415-1420.

302. Korsten M.A., Matsuzaki S., Felnman L., Lieber C.S. High blood acetaldehyde levels after ethanol administration. Difference between alcoholic and nonalcoholic subjects. // New Engl. J. Med. -1975.-V.292.-P. 386-389.

303. Kukielka E., Dicker E., Cederbaum A.I. Increased production of reactive oxygen species by rat liver mitochondria after chronic ethanol treatment. // Arch. Biochem. Biophys. 1994. - V.309. - P. 377-386.

304. Kuypers F.A., Yuan J., Lewis R.A., Snyder L.M., Kiefer C.R., Bunyaratvej A., Fucharoen S., Styles L., De Jong K., Schrier S.L. Membrane phospholipid asymmetry in human thalassemia. // Blood. 1998. - V. 91. - P. 3044-5301.

305. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the bead of bacteriophage T4. // Nature. 1970. - V.227. -P.680-685.

306. Landolfi R., Steiner M. Ethanol raises prostacyclin in vivo and in vitro. // Riusa-blood. 1984. - V. 64, N3. - P. 679-682.

307. Laposata M. Fatty acid ethyl esters: short-term and long-term serum markers of ethanol intake. // Clin.Chim. 1997. - V.43. - P. 1527-1534.

308. Laposata M. Fatty acid ethyl esters: nonoxidative ethanol metabolites with emerging biological and clinical significance. // Lipids. 1999. - V.34. - S281-S285.

309. Laposata E.A., Lange L.G. Presence of nonoxidative ethanol methabolism in human organs commonly damaged by ethanol abuse. // Science. 1986. - V. 231. - P. 497-499.

310. Latge C., Lamboeuf Y.f Roumec C. et al Effect of chronic acetaldehyde intoxication on ethanol tolerance and membrane fatty acids. // Drug Ale. Depend. 1987. - V.20. - P. 47-55.

311. Lazarev P.B., De Duve C. The synthesis and turnover of rat liver peroxisomes. V. Intracellular pathway of catalase synthesis. // J.Cell.Biol. 1973. - V. 59. - P. 507-524.

312. Lebsack M.E., Gordon E., Lieber Ch.S. Effect of chronic ethanol consumption on aldehyde dehydrogenase activity in the babaon. // Biochem. Pharmacol. 1981. - V.30, N16. - P. 2273 - 2277.

313. Lenney J.F., George R.P., Weiss A.M., Kucera C.M., Chan P.W.H., Rinzler G.S. Human serum carnosinase: characterization, disdinction from cellular carnosinase and activation by cadmium. // Clin. Chim. Acta. 1982. -V. 123. - P. 221-231.

314. Lepcock I.R., Frey H.E., Bayne H., Markus I. Relationship of hyperthermia-induced hemolysis of human erythrocytes to the thermal denaturation of membrane proteins. // Biochim. Biophys. Acta. 1989. - V.980. - P. 191-201.

315. Lester D., Keokosky W.Z., Felzenberg F. Effects of pyrazoles and other compounds on alcohol metabolism. // Quart. J. Stud. Alcohol. 1968. - V. 29. - P. 449-454.

316. Levine R.L., Garland D., Oliver C.N., Amici A., Clliment I., Lenz A.-G., Ahn B.-W., Shaltiel S., Stadtman E.R. Determination ofcarbonyl content in oxidatively modified proteins. // Meth. Enzymol. 1990. - V. 186. - P. 464 - 478.

317. Li Т.К. Enzymology in human alcohol metabolism. //Adv. Enzymol. -1971.-V.45.-P. 427-483.

318. Li C.J., Nanji A.A., Siakotos A.N., Lin R.C. Acetaldehyde-modified and 4-hydroxynonenal-modified proteins in the livers of rats with alcoholic liver disease. // Hepatology. 1997. - Sep; V.26, N3. - P. 650-657.

319. Lieber C.S. Microsomal ethanol oxidizing system (MEOS) and metabolism of ethanol, drugs, xenobiotics and carcinogens. // Biochem. Soc. Trans. 1988. - V.16, N3. - P. 232 - 239.

320. Lieber C.S. Matabolic effect of acetaldehyde. // Biochem.Soc.Trans. 1988. - V.16, N3. - P. 241 - 247.

321. Lieber C.S. Interaction of ethanol with drugs, hepatotoxic agents, carcinogens and vitamins. // Ale.Ale. 1990. - V.25, N 2/3. - P. 157176.

322. Lieber C.S. Medical and Nutritional Complications of Alcoholism: Mechanisms and Management. // Plenum Press, New York, 1992. -P. 579.

323. Lieber C.S. Hepatic and metabolic effects of ethanol: pathogenesis and prevention. // Annals Med. 1994. - V. 26. - P. 325-330.

324. Lieber C.S. Cytochrome P4502E1: Its physiological and pathological role. // Physiol. Rev. 1997. - V.77. - P.517-544.

325. Lieber C.S. Microsomal Ethanol-Oxidizing System (MEOS): The First 30 Years (1968-1998) // A Review/ Alcoholism: Clin and Exp. Res. 1999. -V. 23, N6. - P. 991-1007.

326. Lieber C.S., Baraona E., Leo M.A. Metabolism and metabolic effects of ethanol, including interaction with drugs, carcinogens and nutrition. // Mutat. Res. Rev. Genet. Toxicol. 1987. - V. 186, N3. -P. 201-233.

327. Lieber C.S., De Carli L.M. Ethanol oxidation by hepatic microsomes: adaptive increase after ethanol feeding. // Science. -1968.-V. 162.-P. 917-918.

328. Lieber C.S., De Carli L.M. Hepatic microsomal ethanol oxidizing system, in vitro characteristics and adaptive properties in vivo. // J.Biol.Chem. 1970. - V.245. - P. 2505-2512.

329. Lindros K. Res. Adv. Alcohol Drag Problems. 1978. - V.4. - P. 111-176.

330. Littleton J. Cell-membrane lipids in ethanol-tolerance and dependence. // Biochim. Soc. Trans. 1983. - V.11, N1. - P. 61-62.

331. Liu Y.R. Effects of alcohol on granulocytes and lymphocytes. // Semin.Hematol. 1980. - V.2. - P. 130-136.

332. Loguercio C., Clot P., Albano E et al. Free radicals and not acetaldehyde influence the circulating levels of GSH after acute or chronic alcohol abuse: in vivo and in vitro studies. // Ital. J. Gastroenterol. Hepatol. 1997. - V.29. - P. 168-173.

333. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagtnt. // J. Biol. Chem. -1951.-V. 193. -P.265-275.

334. Lucas D., Berthou F., Dreano Y., Menez J. Ethanol-inducible cytochrome P-450: assessment of substrates as specific chemical probes in rat liver microsomes. // Alc.Alc. 1989. - V.24, N4. - P. 381.

335. Lucch L., Govoni S., Batlaaini A. Ethanol administration in vivo alters calcium ions control in rat striatum. // Brain. Res. 1985. -V.333, N2. - P. 376-379.

336. Lyon R., Goldstein D. Changes in synaptic membrane order associated with chronic ethanol treatment in mice. // Molec.Pharmacol. 1982. - V. 23. - P. 86-91.

337. Lyon R., McComb J., Schreurs J., Goldstein D. A relationship between alcohol intoxication and the disordering of brain membranes by a series of short-chain alcohols. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1981. - V.218, N3. - P. 669-675.

338. Magruder J.D., Waid-Jones M., Peitz R.C. Ethanol-induced alterations in rat synaptosomal plasma membrane phospholipids. // Molec. Pharmacol. 1985. - V.27, N3. - P. 256-262.

339. Mantle D., Preedy V.R. Free radicals as mediators of alcohol toxicity. // Adverse Drug React. Toxicol. Rev. 1999. - V.18, N4. -P. 235-252.

340. Marklund S.L. CuZnSOD, MnSOD, catalase and glutathione peroxidase in normal and neoplastic human cell lines and normal human tissues. // Cancer. Res. 1982. - V.42. - P. 1955-1961.

341. Martin N.G., Perl J., Oakeshott J.G., Gibson J.B., Starmer G.A., Wilks A.V. A twin stady ethanol metabolism. // Behav.Genet. -1985. -V. 15, N2.-P. 93-109.

342. McGivern R.F., Deutsch C.K., Ronca A.E., Paulucci Т., Noble E. Antagonism of tertiary butanol by АСТКЦ-ю naloxone and dexamethasone. // Subst. Alcohol Actions Misuse. 1982. - V.3, N1-2.-P. 121-127.

343. Meier-Tackmann D., Leonhardt R.A., Agarwal D.P., Goedde H.W. Effect of acute ethanol drinking on alcohol metabolism in subjects with different ADH and ALDH genotypes. // Alcohol. 1990. - V.7. -P. 413-418.

344. Meltzer H.L., Alexopolos G.M.D. Increased erythrocyte calcium in alcoholism. // J. Clin. Pharmacol. 1982. - V. 22. - P. 466-469.

345. Mendiratta S., Qu Z., May J.M. Erythrocyte defenses against hydrogen peroxide: the role of ascorbic acid. // Biochem. Biphys. Acta. 1998. - V.1380. - P. 389-395.

346. Meyer T. Determination of ethanol in biological samples by head-space gas chromatography using glass capillary columns. // Acta Pharm. Toxicol. 1978. - V.43. - P. 164-168.

347. Mezey E., Potter J.J., Reed W.D. Ethanol oxidation by a component of liver microsomes roch in cytochrome P-450. // J. Biol. Chem. 1973. - V.248. - P. 1183-1187.

348. Michaelis M.L. Michaelis E.K. Effects of ethanol on NMDA receptors in brain: possibilities for Mg2+-ethanol interactions. // Alcohol. Clin. Exp. Res. 1994. - V.18, N5. - P. 1069-1075.

349. Michell R.H. Inositol phospholipid breakdown, cell activation and drug action. In: Control and manipulation of calcium movement. // New York: Acad. Press. 1985. - P. 51-62.

350. Miller N.S. Increased membrane order of erythrocytes in alcoholics as measured by fluorescence polarization: a possiblemarker for tolerance in alcoholics. // Adv. Alcohol Subst. Abuse. -1990. V.9, N3-4. - P. 43-52.

351. Mische S., Mooseker M., Morrow J. Erythrocyte adducin: a calmodulin-regulated actin-bundling protein that stimulates spectrin-actin binding. //J. Cell. Biol. 1987. - V.105. - P. 2837-2849.

352. Mitchell J.J., Paiva M., Heaton M.B. The antioxidants vitamin E and beta-carotene protect against ethanol-induced neurotoxicity in embryonic rat hippocamal cultures. // Alcohol. 1999. - V.17. - P. 163-168.

353. Mohn G., Schmidt M., lanthur B.W., Klemm G. Induction of MEOS and binding of ethanol on the liver: microsomes of female mice. Industr. and Environ. Xenobiotics. // Proc. Intern. Conf. Prague, 27-30 May, 1980. - Berlin o.a., 1980. - 1981. - P. 337-342.

354. Morris M.E. Brain and CSF magnesium concentrations during magnesium deficit in animals and humans: neurological symptoms. // Magnes Res. 1992. - V.5, N4. - P.303-313.

355. Morrisett R.A. Martin D. Oetting T.A. Lewis D.V. Wilson W.A. Swartzwelder H.S. Ethanol and magnesium ions inhibit N-methyl-D-aspartate-mediated synaptic potentials in an interactive manner. // Neuropharm. 1991. - V. 30, N11. - P. 1173-1178.

356. Morton S., Mitchell M. Effect of chronoc ethanol feeding on glutathione turnover in the rat. // Biochem. Pharmacol. 1985. -V.34, N9. - P. 1559-1563.

357. Myers W., Singer G. Ethanol preference in rats with a prior history of acetaldehyde self-administration. // Experientia. 1984. - V.40, N9.-P. 1008-1010.

358. Nagai K., Suda Т., Kawasaki К Effects of L-carnosine on blood cells and biomembrane. // J. Physiol. Soc. Jap. 1990. - V.52. - P. 339-344.

359. Nagasawa H.T., Elberling J.F., Roberts J.C. ^-Substituted cysteines as sequestering agents for ethanol-derived acetaldehyde in vivo. // J. Med. Chem. 1987. - V. 30, N8. - P. 1373-1378.

360. Nakao M.f Jinbu Y., Sato S., Ishigami Y., Nakao Т., Ito-Ueno E., Wake K. Structure and function of red cell cytoskeleton. // Biomed. Biochim. Acta 1987. - V. 46. - P. 5 - 9.

361. Newcomb T.G., Loeb L.A. Mechanisms of mutagenicity of oxidatively-modified bases. // In: Molecular Biology of Free Radicals in Human Disease. Eds. O. Aruoma and B. Halliwell. Oica International, Saint Lucia, London, 1998. P. 139-166.

362. Ng R.H., Marshall F.D. Distribution of homocarnosine-carnosine synthetase in tissues of rat, mouse, chick and frog. // Сотр. Biochem. Physiol. 1976. - V.54B. - P. 519-521.

363. Nickel В., Morozov G.V. Alcoholbedingte Krankheiten: Grundlagen und Klinik. Berlin: Verl.Volk u Gesundheit. - 1989. -416 p.

364. Nie Y., Stubbs C.D., Williams B.W., Rubin E. Ethanol causes decreased partitioning into biological membranes without changes in lipid order. // Arch.Biochem.Biophys. 1989. - V.268. - P. 349359.

365. Niemela O. Aldehyde-protein adducts in the liver as a resalt of ethanol-induced oxidative stress. // Front Biosci. 1999. - V.4. -D506-D513.

366. Nishiki К., Chance В., Morris M.A. In "Alcohol and aldehyde metabolizing systems". Ed. Thurman R . et al. N.Y.: Acad. Press, 1977.-V.3.-P. 271-284.

367. Orlov S.N., Pokudin N.I., Kotelevtsev Y.V., Gulak P.V. Volume dependent regulation of ion transport and membrane phosphorylation in human and rat erythrocytes. // J. Membrane Biol. -1989.-V.107.-P. 105-117.

368. Расе N. Alcoholism as a modern problem. // Drug Therapy. -1978.-V.8, N1. P.29-34.

369. Pares A., Planas R., Torres M. Effects of silymarin in alcoholic * patients with cirrhosis of the liver: results of a controlled, doubleblind, randomized and multicenter trial. // J. Hepatol. 1998. - V.28. -P. 615-621.

370. Parke J., Radke E. Alcohol-induzierte Hypertonie. // Z.gesamte inn. Med. Und Grouzgeb. 1990. - Bd 45, N1. - S.22-23.

371. Pavlov A.R., Revina A.A., Dupin A.M., Boldyrev A.A., Yaropolov A.I. The mechanosm of interaction of carnosine with superoxide radicals in water solutions. // Biochem. Biophys. Acta. 1993. -V.1157. - P. 304-312.

372. Pediconi M., Colonibo C., Gall G. Effects of acute and chronic ethanol administration on tromboxane and prostacyclin levels and release in brain cortex. // Prostaglandins. 1985. - V.30, N2. - P. 313-322.

373. Pekiner В., Pennock J.F. Oxidation of human red blood cells by a free radical initiator and effects of radical scavengers. // Biochem. Mol. Biol. Int. 1994. - V.33. - P. 1159-1167.

374. Peters T. Principtes of action of calcium entry blockers on cellular ^ movements of calcium. // Int. Angiol. 1984. - V.3, N1. - P. 9-17.

375. Pryor W.A. Oxy-radicals and related species: their formation, ^ lifetimes and reaction. // Annu. Rev. Physiol. 1986. - V.48. - P.657.667.

376. Rasmussen H. Cyclic nucleotides and cellular calcium metabolism. // Adv. Cycle. Nucl. Res. 1975. - V. 5. - Ed. Drummond G.J., N.Y. - P. 26^42.

377. Rathbun W., Bethlach V. Estimation of enzymatically produced orthophosphate in the presence of cysteine and adenosine triphosphate. //Analit. Biochem. 1969. - V.28. - P. 436-442.

378. Reda Т., Blumenthal R., Muller P., Herrmann A. Influence of the spectrin network on fusion of influenza virus with red blood cells. // Mol. Membr. Biol. 1995. - V.12. - P. 271-276.

379. Reed D.J., Fariss M.W. Glutathion depletion and susceptibility. // Pharmacol. Rev. 1984. - V. 36, N2. - P. 25-33.

380. Reinke L.A., Moore D.R., McCay P.B. Mechanisms for metabolism of ethanol to 1-hydroxyethyl radicals in rat liver microsomes. //Arch. Biochem. Biophys. 1997. - V.348. - P. 9-14.

381. Reinke L.A., Moore D.R., McCay P.B. Free radical formation in livers of rats treated acxutely and chronically with alcohol. // Alcohol. Clin. Exper. Res. 1997a, - V. 21. - P. 642-646.

382. Reznick A.Z., Packer L. Oxidative damage to proteins: spectrophotometric method for carbonyl assay. // Meth. Enzymol. -1994. -V.233. P. 357-363.

383. Richter G. Charakterisierung von Alkoholgebrauch, missbrauch und Abhangigkeit und ihr klinicher Bezug. // Z.Arztl.fortb. 1989. -Bd 83. - S.803-809.

384. Rifani N. Sakamoto M., Law Т., Piatt O., Mikati M., Armsby C.C., Brugnara C. HPLC measurement, blood distribution, and pharmacokinetics of oral clotrimazole, potentially useful antisickling agent. // Clin.Chem. 1995. - V.41. - P. 387-391.

385. Romero J.R., Fabry M.E., Suzuka S., Nagel R.L., Canessa M. Red blood cells of a transgenic mouse expressing high levels of human hemoglobin S exhibit deoxy-stimulated cation flux. // J.Membr.Biol. 1997. - V.159. - P. 187-196.

386. Ron M.A. The alcoholic Brain: CT Scan and psychological findings. // Psychological Medicine, Monograph. Suppl. 3. -Cambridge University Press, Cambridge, 1983.

387. Ross D.H. Adaptative changes is Ca-membrane interactions following chronic ethanol exposure. //Adv. Exp. Med. Biol. 1977. -V.85A. - P. 459-471.

388. Ross D.H., Garrett K.M. Acute pharmacological actions of ethanol on the central neurvous system. // In: The Biology of Alcoholism. -1983. V.7. - Plen.Press, N.Y., P. 57-75.

389. Rouach H.f Houze P., Gentil M., orfanelli M.T., Nordmann R. Changes in some pro- and antioxidants in rat cerebellum after chronic alcohol intake. // Biochem.Pharmacol. 1997. - V.53. - P. 539-545.

390. Rubtsov A.M., Schara M., Sentjure M., Boldyrev A.A. Hydroxyl radical-scavenging activity of carnosine: a spin trapping study. // Acta Pharm. Jugosl. 1991. - V.41. - P. 401-407.

391. Ryle P.R. The radicals, lipid, peroxidation and ethanol hepatotoxicity. // Lancet. 1984. - N 8400. - P. 461-464.

392. Sadrzadeh S.M., Nanji A.A. The 21-aminosteroid 16-desmethyl tirilazad mesylate prevents necroinflammatory changes in experimental alcoholic liver disease. // J. Pharmacol. Exper. Therap. 1998. - V.284. - P. 406-412.

393. Saeed Dar M., Wooles W.R. The effect of acute ethanol on dopamine metabolism and other neurotransmitters in hypothalamus and the corpus striatum of mice. // J. Neural.Transmiss. 1984. -V.60, N3-4. - P. 283-294.

394. Saghir M., Blodget E., Laposata M. The hydrolysis of fatty acid ethyl esters in low-density lipoproteins by red blood cells, white blood cells and platelets. //Alcohol. 1999.- V. 19. - P. 163-168.

395. Saleem M.M., Al-Tamer Y.Y., Skursky L. Alcoholdehydrogenase activity in the human tissues. // Biochem.Med. 1984. - V.31, N1. -P. 1-9.

396. Salmela K.S. Kessova I.G., Tsyrlov I.В., Lieber C.S. Respective roles of human cytochrome P-4502E1, 1A2 and 3A4 in the hepatic microsomal ethanol oxidizing system. // Alcohol. Clin. Exp. Res.1998. -V.22. P. 2125-2132.

397. Sato Y, Kamo S., Takahashi Т., Suzuki Y. Mechanism of free radical-induced hemolysis of human erythrocytes: hemolysis by water-soluble radical initiator. // Biochemistry. 1995. - V.34. - P. 8940-8949.

398. Schlorff E.C., Husain K.f Somani S.M. Dose- and time-dependent effects of ethanol on plasma antioxidant system in rat. // Alcohol.1999. -V. 17.-P. 97-105.

399. Showoch G., Passow H. Preparation and properties of human erythrocyte ghosts. // Mol. Cell. Biochem. 1973. - V.2, N2. - P. 197-217.

400. Siew Ch., Deitrich R., Erwin V.G. Localization and characteristics of rat liver mitochondrial aldehyde dehydrogenases. // Arch. Biochem. 1976. - V.176, N2. - P. 638-649.

401. Sippel H. Inhibition of diethylmaleat-induced microsomal glutathion-S-transferase activation by acute ethanol administration. //Acta Pharmacol. 1985. - V.57, Suppl.1, abstr. 47.

402. Skinner H. Clinical versus laboratory detection of alcohol abuse: The alcohol clinical index. // Brit. Med. J. 1986. - V.292. - P. 17031708.

403. Skulachev V.P. Energetics of Biological Membranes. // Berline: Springer, 1989.

404. Slater Т.Е. Effects of ethyl alcohol and other alcohols on microsomal lipid perpxidation and enzymic systems. // Ale. Ale. -1989.-V.24, N4.-P.387.

405. Smith T.L. Synaptosomal cholesterol and phospholipid levels in several mouse strains differentially sensitive to ethanol. II J. Pharmacol. 1985. - V.232. - P. 702-707.

406. Smith T.L., Gerhart M. Alterations in brain lipid composition of mice made physically dependent to ethanol. // Life Sci. 1982. -V.31.-P. 1419-1425.

407. Sozmen E.Y., Tanyalcin Т., Onat Т., Kutay F., Erlacin S. Ethanol induced oxidative stress and membrane injury in rat erythrocytes. // Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1994. - V.32. - P: 741-744.

408. Steck T.L. Cross-linking the major proteins of the isolated erythrocyte membrane. // J.Mol.Biol. 1972. - V.66, N1. - P.295-305.

409. Stevens V.J., Pantl W.J., Newnan C.B. Drug and alcohol depend.- 1980. V.6, N1/2. - P.29-30.

410. Stibler H.f Beauge F., Leguicher A., Borg S. Biophysical and biochemical alterations in erythrocyte membranes from chronic alcoholics. // Scandinav. J. Clin. Lab. Invest. 1991. - V. 51. - P. 309-319.

411. Stowell A., Johnsen J.f Aune H.f Vatne K., Ripel A., Morland J. Are investigation of the usefulness of breath analysis in the determination of blood acetaldehyde concentrations. // Alcoholism.- 1984. V. 8, N5. - P. 442-447.

412. Tabakoff В., Culp S.G. Studies on tolerance development in inbred and heterogeneous stock National institutes of health rats. // Alcoholism. 1984. - V.8, N5. - P. 495-499.

413. Tephly T.R., Mannering G.J., Parks R.E. Studies on the mechanism of inhibition of liver and erythrocyte catalase activity by 3-amino-1,2,4-triazole (AT). // J. Pharm. Exp. Ther. 1961. - V.133. - P. 77-82.

414. Teschke R., Hasumura Y.f Lieber C.S. Hepatic microsomal ethanol oxidizing system: Solubilization, isolation and characterization. // Arch. Biochem. Biophys. 1974. - V.163. - P. 404-415.

415. Teschke R., Matsuzaki S., Ohnishi K., DeCarli L.M., Lieber C.S. Microsomal ethanol oxidizing system (MEOS): Current status of its characterization and its role. // Alcohol Clin. Exp. Res. 1977. -V.1.-P. 7-15.

416. Thiele G.M., Tuma D.J., Miller J.A., Wegter K.M., McDonald T.L., Klassen L.W. Monoclonal and polyclonal antibodies recognizing acetaldehyde-protein adducts. //Biochem Pharmacol. 1998. -V.56, N11.-P. 1515-23.

417. Thompson P. Platelet and erythrocyte membrane fluidity changes in alcohol-dependent patients undergoing acute withdrawal. // Ale. Ale. 1999. - V.34, N3. - P. 349-354.

418. Thurman R.G., Brentzel H.J. The role of alcohol dehydrogenase in microsomal ethanol oxidation and the adaptive increase in ethanol metabolism due to chronic treatment with ethanol. // Alcohol. Clin. Exp. Res. 1977. - V.1. - P. 33-38.

419. Ticku M.K., Davis M.C., Burch T.P. In "Abstr.lst.Congr.lnt.Soc.Biomed.Res.Alcoholism'\ Munich, Germany, 1982. - P. 173.

420. Tilley L.f Ralston G. Effect of erythrocyte spectrin on actin self-association //Aust. J. Biol. Sci. 1987. -V. 40. - P. 27-36.

421. Torronen R.t Laahsonen M. Liver cytosolic aldehyde dehydrogenases in rats with different predisposition to induction by phenobarbital. // Int. J. Biochem. 1984. - V.16, N6. - P. 659-666.

422. Trandum C., Westh P., Jorgensen K.t Mouritsen O.G. Association of ethanol with lipid membranes containing cholesterol, sphingomyelin and ganglioside: a titration calorimetry study. // Biochim. et Diophysica Acta. 1999. - V.1420. - P. 179-188.

423. Tsai G., Gastfriend D.R., Coyle J.T. The glutamatergic basis of human alcoholism. // Amer. J. Psychiatry. 1995. - V.152. - P. 332340.

424. Tsuboi K.K., Thompson D.J., Rush E.M. // Hemoglobin. 1981. -V.5, N3. - P. 241-250.

425. Tyopponen J.T., Eriksson P.C. Plasma testosterone in rats exposed to ethanol during vitamin E deficiency. // Intern. J. Vitam. Nutr. Res. 1987. - V.57, N3. - P. 267-271.

426. Ugar O., Onaran H.O. Allosteric equilibrium model explains steady-state coupling of beta-adrenergic receptors to adenylate cyclase in turkey erythrocyte membranes. // Biochem. J. 1997. - V. 323. - P. 765-776.

427. Uysal M., Aykac G., Kocak-Toker N. Lipid peroxidation in liver, plasma, and erythrocytes of rats chronically treated with ethanol. // Biochem. Med. 1985. - V.34, N3. - P. 370.

428. Vanderkooi J.M., Calles J.B. Pyren. A probe of lateral diffusion in the hydrophobic region of membranes. // Biochem. 1984. - V.13. -P. 4000 - 4006.

429. Vainshtein B.K. The quarternary structure of catalase. // Alcohol and aldehyde metabolizing system. New -York, 1974. - P. 533.

430. Vestergaard-Bogind В., Bennekou P. Calcium-induced oscillation in K+-conductance and membrane potential of human erythrocytesmediated by the ionophore A23187. // Biochem. Biophys. Acta. -1982. -V.688. P. 37-44.

431. Vickers M.D. Drugs in anaesthetic practice. // Sixth. Ed. Butterworths. - 1984. - P. 390-392.

432. Videla L.A. Hepatic antioxidant-sensitive respiration. Effect ethanol, iron and mitochondrial uncoupling. // Biochem. J. 1984. -V.223, N3.-P. 885-891.

433. ViolaR.E., Hartzell C.R., Villafranca J.J. Stereoscopic studies on the copper (II) complexes of carnosine. // J. Inorg. Biochem. -1979.-V. 10.-P. 281-292.

434. Von Wartburg J.P., Bethune J.L., Vallee B.L. Human liver alcohol dehydrogenase: kinetic and physico-chemical properties. // Biochem. 1964. -V.9. - P. 1775-1782.

435. Waring A.J., Rottenberg H., Ohnishi Т., Rubin E. The effect of chronic ethanol consumption on temperature-dependent physical properties of liver mitochondrial membranes. // Arch. Biochem. Biophys. 1982. - V.215. - P. 51-61.

436. Westcott J.J., Murphy R.C. Effect of alcohols on arachidonic acid metabolism in murine mastocytoma cells and human polymorphonuclear leukocytes. // Biochem. Biophys. Acta. 1985. -V.833. - P. 262-271.

437. Wilkinson D.A. Examination of alcoholics by CT scans: a critical review. // Alcoholism. 1982. - V.6. - P. 31-45.

438. Winterbourn C.C., Stern A. Human red cells scavenge extracellular H202 and inhibit formation of HOCI and OH*. // J.CIin.lnvest. 1987. - V.80. - P. 1486.

439. Wirkner K., Poelchen W., Koles L., Muhlberg K., Scheibler P., Allgaier C., Iltes P. Ethanol-induced inhibition of NMDA receptor channels. // Neurochem. Int. 1999. - V.35. - P. 153-162.

440. Woimant B. Lutte contre I'alcoholisme. Resultate de la surveillance de 500 malades pendant eing aus. // Concours med. -1984. V. 106, N29. - P.2757-2760.

441. Wood W.G., Lahiri S., Gorka C., Armbrecht H.J., Strong R. In vitro effects of ethanol on erythrocyte membrane fluidity of alcoholic patients: an electron spin resonance study. // Ale. Clin. Exp. Res. -1987. -V. 11, N4.-P. 332-335.

442. Worral S., de Jersey J, Wilce P.A., Seppa K., Sillanaukee P. Studies on the usefulness of acetaldehyde modified proteins and associated antibodies as markers of alcohol abuse. // Ale. Ale. -1994. Suppl., N2. - P. 503-507.

443. Xu D.? Thiele G.M., Beckenhauer J.L., Klassen L.W., Sorrell M.F., Tuma D.J. Detection of circulating antibodies to malondialdehyde-acetaldehyde adducts in ethanol-fed rats. // Gastroenterology. -1998. -V. 115, N3. P. 686-692.

444. Zawad J.S., Brown F.C. Beta-adrenergic coupled phospholipid methylation. A possible role in withdrawal from chronic ethanol. // Biochem. Pharmacol. 1984. - V.33, N23. - P. 3799-3805.

445. Zorzano A., Ruiz del Arbol L., Herrera E. Effect of liver disorders on ethanol elimination and alcohol and aldehyde dehydrogenase activities in liver and erythrocytes. // Clinical Science. 1989. -V.76. - P. 51-57.

446. Я выражаю благодарность всем членам моей семьи, чья поддержка и терпение явились необходимым условием выполнения данной работы.

Информация о работе

Прокопьева, Валентина Даниловна
доктора биологических наук
Томск, 2003
ВАК 03.00.13

Диссертация

Молекулярные механизмы влияния этанола и его метаболитов на клеточные мембраны in vitro и in vivo - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы