Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярные механизмы ЦИС-ТРАНС взаимодействий последовательностей, подобных участкам инициации репликации

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярные механизмы ЦИС-ТРАНС взаимодействий последовательностей, подобных участкам инициации репликации"

я?

От

Российская Академия Наук Институт молекулярной биологии им. В.А.Эш елы арига

ЛУНЯК Виктория Витальевна

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ЦИС-ТРАНС ВЗАИМ0ДИЙСП1ИЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, ПОДОБНЫХ УЧАСТКАМ ИНИЦИАЦИИ РЕПЛИКАЦИИ

Специальность 03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1996

1'дСюгл выполнена в отделении молекулярной и радиационной биофизики Петербургского Института ядерной физики РАН.

Научный рукоьодитель: доктор биологических наук, проф. Л.А.Норкин.

Оффициаиьиые оппоненты: доктор биологических наук проф. В.И.Иванов, кандидат биологических наук Л.Г.Николаев .

Ведущая организация: НИИ экспериментальной медицины РАМН,

Санкт-Петербург.

Защита диссертации состоится «2л» /г 499 / года

в час. на заседании Диссертационного совета Д002.79.01 при Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН по адресу: 117984, Москва, ул. Вавилова,°д.32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН.

Автореферат разослан " " 199 г».

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук

А .М. Крицын

Актуальность проблемы.__Б актуальной проблеме регуляции клеточного цикла эукарис.т проблема инициации репликативного синтеза традиционно привлекает внимание, ибо этой стадией детерминируется дальнейшая редупликация генома. Основные трудности в изучении молекулярных мехакизмоэ инициации репликации связаны с тем, что структура предполагаемых участков инициации репликации априорно гетерогенна. В этих услоНиях основным подходом необходимо признать тот, который определяет_ отдельные элементы, необходимые для акта первичного узнавания специфических нуклеотидных последовательностей, локализованных внутри участка инициации, специфическими «верными факторами. Подобный принцип является общим для ряда идентифицированных на сегодняшний момент предполагаемых участков инициации репликации. Необходимо отметить,что относительно природы таких взаимодействий, а также характеристики' нуклеотидкых структур и белковых факторов,обуславливающих подобное взаимодействие, в литературе существуют только отдельные сообщения. Так,в работах Тимченко с соавт. [117] из альфа-полимеразного комплекса нерегенирирующих гепатоцнтов крыс была изолирована и проклониро-ваяа последовательность ДНК, названная 0А11С1, которая в контексте прокариотического вектора обеспечизала автономную репликацию ре-хомбинантнсй конструкции в культивируемых клетках млекопитающих. Подобное свойство нуклеотидного фрагмента 0АКС1 позволило отнести описываемую последовательность к предполагаемому участку инициации репликации млекопитающих и предполагать,что все или почти все сигналы для функциональной активации данного фрагмента ДНК локализованы на изучаемой нуклеотидной последовательности.

Цель' работы. Целью данного исследования было: идентифициро вать отдельные функционально-значимые нуклеотидные последовательности (цис-элементы) в последовательности ЮАЯС1 и изучить природу ядерных факторов (транс-элементов), взаимодействующих с ними. Проанализировать степень подобия идентифицированных цис-транс элементов и характер цис-транс взаимодействие с механизмами цис-транс активации в строго идентифицированных участках инициа-

нии хромосомной репликации млекопитающих.

Для этого необходимо было решить следующие задачи.

1. Минимизировать размер последовательности 0АКС1 с тем, чтобы в состав производного у 1астка всшли все элементы, обеспечивающие автономную репликацию рекомбинантного прокариотического -вектора в клетках млекопитающих.

2. возможно подробно охарактеризовать пептиды ядерного экс тракта, взаимодействующие с данной минимизированной последова тельностью: установить возможную аналогию с другими уже известны ми пептидами, определить их молекулярный вес, внутриядерную лока лизацию и степень выраженности их функции в клеточном цикле.

3. Определить структуру специфических аффинных сайтов в пре делах изучаемой последовательности и степень их вырожденности.

4. Определить наличие в структуре изучаемой нуклеотидной пос ледовательности неканонических форм ДНК (изгибы, шпилечные "крестообразные" структуры ДНК) и установить возможность их внут риклеточной стабилизации.

5. Экспериментально подтвердить наличие аналогичных цис-тран элементов в структуре хорошо изученного хромосомного участка ини циации репликации в составе дегидрофолатредуктазного домена клетках млекопитающих.

6. Провести компьютерный анализ на предмет возможной кластер ной локализации подобных -аффинных сайтов в регуляторных областя раэ~ичиых генов млекопитающих (не менее 10 строго полностью сик ванированкых и имеющих строго идентифицированные регуляторные зо ны) .

Впервые установлено, что фрагмент ДНК размером в 14бп.н. дос таточен для автономной репликации рекомбинантного прокариотичес кого вектора в клетках млекопитающих; впервые выявлены два пепту да из ядерного экстракта специфически взаимодействующих с преяпс лагаемым участком инициации автономной репликации: один из нш совпадающий по молекулярному весу и структуре аффинных сайтов с-туе белком в тесте с антителами как не с-тус белок и отличаете конститутивным уровней экспрессии в клеточном цикле-, а другой бе лох (р28), ранее не идентифицированный в других иса'щованию

полученных результатов:

:трого локализован в ядерном матриксе; приведены эксперименгаш. ше доказательства тому, что аффинный сайт 0сЬ-1 белка обладает ааметной вырожденостью; впервые идентифицирован новый аффинным ;айт в протекткруемой ядерными белками зоне на последовательности )А11С146; впервые доказано, что "крестообразные" структур. , теоретически представленные из анализа нуклеотидной последовательности з зоне инвертированного повтора, могут существовать в плазмидном сонтексте внутриклеточно; впервые выявлена почти полная аналогия основных цис-транс элементов предполагаемого УИР БА1*С146 и*хромо-:омного УИР дегидрофолатредуктазного домена млекопитающих; впер-зые определен кластерный характер локализации 7 асЬфинных сайтов, характерных для УИР, в структуре регуляторных областей 10 генов ■шекопитающих, резко отличающихся друг от друга по 'числу и лротя-кенности экзонов и копирующих областей.

Практическая Значимость работы. Результаты данкых нееледова чий научно обосновывают создание векторных систем, включающих ак гивный промотор, для получения конструкций обеспечивающих высокий уровень экспрессии клонированных генов в клетках эукарнот; с использованием антител к идентифицированным неканоническим структурам ДНК представляется перспективным хромосомное картирование активных участков генома;примененная в работе программа компьютер ¡юго анализа первичных последовательностей генов, позволяет проводить идентификацию регуляторных областей; модернизирована и адаптирована программа двухнитевых участков ДНК на предмет обнаружения изгибов ДНК.

Апробация работы. Отпепьные фрагменты диссертационной работы многократно докладывались на научных семинарах ОМРБ ПИЯФ, РАН, н институте молекулярной генетики РАН (1992)6 в институте биоорганической химии РАН (1993), в институте канцерогенеза онкологического научного центра РАМН (1993), а также на международных симпозиумах и конференциях: Второй международной конференции регуляции эукариотической репликации ДНК, Монреаль, Канада, 1992; Международной конференции по эукариотической репликации, Колд Смринг Харбор, США, 1993; Третьей международной конференции по регуляции эукариотической репликации ДНК, Монреаль, Клнацч, 1994; Пехотной конференции по геному человека, .ериоголонка, Россия, 1143 и

1995 голу работе присвоена вторая прения в конкурсе лучших работ ПИЯФ РАН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ.

Структура и объем диссертации■ Работа изложена на 124 страницах мапинсписнсго текста, состоит из введения, четырех глав и приложения; содержит 24 рисунка. Список литературы включает названия. из которых на русском языке £.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В настоящей работе асе плазмиды, содержащие различные по размеру вставки ДНК,обозначены как рПАйС. а фрагменты ДНК обозначены как БАЛС. Плазмиды рОАКС14€ и рВАИС105 получены минимизацией исходной плазмиды рБАКС!, содержащей фрагмент из комплексной формы ДНК г.олнмеразы альфа и описанной Тимченко и соавт. [109] . Плазмиды рБАИС146 V. рЕАРС.ЮБ получены в результате встраивания фрагментов плазмиды рПА£С1 длиной 105п.н. и 146п.н. в полилинкер плазмиды рТ219Я по сайтам БшаХ и Н.гпсШ. Структура полученных реком-бинантных плазмид была проверена путем их сиквенирования по методу С'энгера [110] . Нуклеотидные последовательности плазмид представлены на Рис.6.

Частичные гепатоэктомии проводились на взрослых самцах крыс. Животный анестезировались эфиром, и делался общий разрез по серединной линии. .Ьа кровяные протоки, отходящие от средней и левой долей печени, накладывалась лигатура.и эти доли отрезались. Их пасса составляет примерно 2/3 от общей кассы печнни. Бркшила зашивалась отдельно от кожи, и крыса помещалась в отдельную клетку. Животные забивались через определенные промежутки времени после операции. В качестве контроля брались неоперированнь:е крысы.

Все стадии проводились при температуре 4°С. Печень крыс после проведения операции гепатоэктомии гомогенизировалась в буфере А, содержащем 25кМ трис-НС1, рН 7.5, 50кМ ЫаС1, 1кМ РМ2Р, 5кМ БТТ, 10% сахарозу. Гоиогенизат центрифугировали при 2000 об/мин в течение 1Б мин. Супернатанг сливали, ядерный осадок ресуспендирова-ли в небольшем объеме охлажденного буфера А. Далее к осадку добавляли рг.Еный объем 3 . 4М МаС1, приготовленного на буфере А. Еы-

делившуюся ДНК осаждали центрифугированием при 14000 об/мин в те чеиие одного часа ("Центрикон", вЯ 28). Супернатант, содержащий ядерные белки, диализовали в течение ночи против буфера В, содержащего 25мМ трис-НС1, рН 7.5, 1мМ РМЭР, 5мМ ОТТ, 10» глицерин, и замораживали по каплям в жидком азоте.

1-2 нг меченного по концу фрагмента инкубировалн с экстрактим белков (экстракт II) при 4°С в течение часа. Реакцию проводили ь среде, содержащей 50мМ трис-НСЬ,рН 8.0, 150»^М КС1, 5шМ ОТТ, 10% глицерин. В качестве неспецифического конкурента использввались ДНК спермы лосося (или с!А-с1Т) из расчета 1 мкг на 20 мкл.

Электрофоретичекое разделение проводили в 5% ПААГ, при соотношении акриламид/бисакриламид 30:1. Гель готовили на 0.5хТВЕ буфере. В качестве маркеров использовался бромфенол'овый синий и ксиленцианол. После эпектрофореза гель высушивался. Гель и наложенные на него пленки Нэ (01Ш0, "Тасма") закладывали в кассету с усиливающим экраном и выдерживали при -80°С в течение ночи.

Специфические ДНК-белковые комплексы идентифицировались авторадиографией с влажного геля, после чего вырезались и электроэлю-ировались в 0.5хТВЕ буфере. К буферу добавлялся равный объем 5мМ СаС12-Ю мММдС12 и ДНКаза I до конечной концентрации 13 нг/ил. Реакция проводилась в течение 2 минут и останавливалась добавлением равного объема хлороформа. Водная фаза отбиралась, ДНК переосаждалась. Осадок ДНК растворялся в 100% формамиие и наносился на 8% сиквенирующий ПАА гель.

Автономную репликаацию плаэмиды изучали по включению бромде-зоксиуридина (БДУ) в плазмидную ДНК. Подробно метод описан в сообщении [32]. Фибробласты Китайского хомячка линии У79 были трансфецированы плазмидами рТ219К и рПАКС14б и выращивались на среде, содержащей 10 мг/мл БДУ. Через 3 сут. после трансфекцим плазмидную ДНК выделяли по методу Хирт'а [113] и центрифугировали н градиенте плотности СвС1. Градиент фракционировали и каждую фракцию анализировали методом гибридизации с векторной ДНК рТ219й меченной Р, в реакции ник-трансляции.

Изгиб ДНК выявляли, измеряя злектрофоретическую подвижноегь фрагментов ДНК в 10%- ом ПААГ. Фрагменты вырезанные из вектсриог« ДНК, и амплифицированные фрагменты ДНК наносили на ПААГ, электро

форез гроводили в буфере ТБЕ (О .09М Трис, 0.09М борной кислоты, 1мМ ЭДТА1 половинной концентрации при 24.5 С в течение 16 часов при напряжении 3 В/см . Гель окрашивали бромистым этидием. Элект-рофоретическую подвижность фрагментов сравнивали с подвижностью фрагментов ДНК бактериофага лямбда, рестрицированной Pstl; и фрагментов ДНК pBR322, рестрицированной MspI. Для идентификации шпилечных структур были синтезированы олигонуклеотиды ТЗА (5 ' -GATTAAATAGATTTAAATCTCTTAAAGATA-3 1) и , ТЗТ (комплементарный ТЗА) (5 1 -TATCTTTAAGAGATTTAAATCTATTTAATC-3 1 ) , а также Til, (5'-ТА-ATAATAAATAACTTCTCTTACAGACAG-3'I,не содержащий палиндрома,и очищены методом HPLC. Нуклеотидная последовательность олигомеров была проверена методом сиквенирования. Олигонуклеотиды метились по 5'-концам согласно стандартной методике кечения. Невключившаяся метка была отделена преципитацией с ацетатом аммония. Олигонуклеотиды, меченные Р по 51-концам, растворялись в буфере С: ЮмМ pipes рНэ, 5; ЮмМ ::аС1. Образец киьятился в течение 15мин и быстро охлаждался во льду (15мин) . Олигомеры раздет, шись в 12% неденату-рирующем полиакриламидном геле. Электрофорез преходил при постоянном токе ЗОмА, напряжении 10-15 В/см до достижения необходимого разделения образца. Затем, гель промывался в растворе Pipes 00, pH 7.0. Электрофорет1.ческий буфер соответствовал буферу, на котором готовился гель. После разделения гель высушивался и авторадио-■графировался.

В эксперименте идентификации "крестообразной" структуры in vivo был использован бактериальный штаим JM109. Клеточная культура растилась до достижения стационарной фазы роста в.течение 14 часов при t-37C со встряхиванием, в 40мл среды LB, содержащей 100мкг/мл ампициллина. Затем клетки осаждались центрифугированием при Зтыс. оборотах в минуту и рэсусиендировались в 10мл среды LB, охлажденных до 4 С. Добавлялось 0.2мл раствора 4,51,8-триметилп-соралена, клетки инкубировались 2кин. вс льду и обрабатывались в течение 4мин !8мин в эксперименте 2) ультрафиолетовым светом (длина волны - ¿S0 ни, мощность источника 2 Дж/м х сек ) для образования поперечных ковалентных сшивок в молекуле ДНК. Клетки осаждались центрифугированием при 15 тыс.оборотах в минуту. Плаз-минная ДНК выделялась стандартным методом (Birnboim, Dolí1, 1979) .

Затем плазмида рестрицировалась ферментами ЕсоЯ I и Hind III, проводилось электрофоретическое разделение в 6% полиакриламидном геле (6 часов при t - 4 С, V - 10 V/cm, в 0.5% трис-боратном буфере) . Гель был обработан бромистым этидием и сфотографирован.

При поведении иммуноблотинга белков ядерного экстракта белки фракционировали по методу Лэммли и переносили на нитроцеллюлозный фильтр (Schleicher, Schuel). Фильтр выдерживали 1час в буфере, содержащем 0.01М ТрисНС!, pH 7.6, 0.15М NaCl и 0.005% Твин 20, трижды меняя за это время буфер. Затем в тот же буфер добавляли антитела к белку с-шус и инкубировали фильтры в течение ночи при комнатной температуре. После отмывки фильтра от несвязавшихся антител, выявляли комплекс антител с белками при помощи иммунопе-роксидазной системы . Антитела против с- терминального полипептида белка с-шус получены от Ф.Л. Киселева ( Онкологический центр, Москва). В качестве вторых антител были использоеэны антитела против иммуноглобулинов кролика, хонъюгированные с пероксидазой хрена. Термостабильная ДНК-полкмераза получена от O.K. Кабоева (ПИЯФ РАН) Программное обеспечение для компьютерного моделирования и обработки результатов подготовлено Луняк А.Н. и Конышевым В.Н.(ПИЯФ РАН).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В проблеме механизма цис-транс взаимодействий, обеспечивающих регуляцию стадии инициации репликации у высших, на наш взгляд, существенным этапом работы была идентификация минималь .ого размера участка ДНК, по предварительным данным обеспечивающего автономную репликацию рекомбинангного бактериального вектора в культивируемых клетках млекопитающих. С этой целью был использован фрагмент, ранее выделенный из альфа-полимеразного комплекса нере-генерирующих гепатоцитов крыс (DARC1), содержащий 340п.н. Было установлено, что для поддержания автономной репликации "достаточным" является фрагмент в 146п.н., обозначенный как DARC146. При этом, способность данного фрагмента обеспечивать автономную репликацию бактериального вектора, как и в случае с DARC1, уст; тв-ливалась по двум независимым критерием: утяжеление вновь синтези-

рованных нитей ДНК счет включения БДУ и приобретение резистентности вновь синтезированной ДНК устойчивости к Dpnl рестрик-тазе вследствие метилирования последней по "эукариотическому" типу (Рис.1). Таким образом, возникли основания предполагать, что в пределах 146г..н. находятся все необходимые цис-элементы, отвечающие за инициацию процесса синтеза ДНК. В этом случае казалось необходимым предполагать и тождественный механизм транс-взаимодействий .

Для полного экспериментального обоснования данных логических предположений на следующем этапе исследований мы провели сравнительный анализ цис-транс элементов DARC146 и DARC1.

Среди цис-элементов, входящих в состав DARC146 последовательности, нас, прежде всего,интересовала идентификация, так называемого, изгиба ДНК в пределах участка, переодически повторяющего блоки ААА через десять пар оснований, что соответствует теоретически описанному витку спирали ДНК. Идентификация изгиба ДНК проводилась принятым методом оценки торможения подвижности тестируемого фрагмента ДНК в ПААГ при 24 С. Торможение подвижности образца ДНК с эффективностью в пределах 1,18-1,25 отмечалось для всех использованных нами последовательностей, содержащих три блока ААА через 10п.н.: DARC146, DARC105, DARC1 и амплифицировэнного фрагмента ДНК протяженностью ЮОп.н. (Рис.2). При этом отметим, что способность поддерживать, автономную репликацию рекомбинантной конструкции являлось характерным свойством pDARCl и pDARC146. Отсюда очевидно, что наличие изгиба является необходимым, но не достаточным фактором, обеспечивающим регуляцию автономной репликации. Дополнительным доказательством в пользу существования изгиба ДНК в пределах подобных последовательностей явл. этся компьютерное моделирование, проведенное с использованием специализированной программы, разработанной А.Н. Луняком. Расчеты не только подтвердили сам факт изгиба ДНК , но и позволили проследить зависимость "крутизны" от количества встречающихся ААА-боксов (меньшее число боксов к формированию изгиба не приводило).

Исходя из принципов дополнительности цис-элементов, участвующих в регуляции инициации репликации, дальнейшие эксперименты были направлены на идентификлищи специфических нуклеотид»>их после-

Рис.1. Автономная репликация плазмиды рПАЯС14й. а - индекс рефракции четных фракций градиента СвС1. По оси абсцисс - номер фракции; по оси ординат,- величина индекса рефракции.

б - распределение в градиенте плотности СзС'Ь плазмид рТ219й и рОАНС146. выделенных из трансфецированных ими клеток VI9, инкубированных в течение 3 суток в присутствии БДУ. 1,11 - положение суперекрученной и релаксированной фирм плазмид.

в - устойчивость к действию 0рп1 рестриктазе. Стрелка показывает положение плазмидного материала,устойчивого к действию 0рп1: О - блотинг по Саузерну плазмиды ОАЛС146, выделенной из к еток У79 сразу после трансфекции, 3 - чер эз три дня после трансфекцин.

Рис.2. Выявление изгиба ДНК в нуклеотидной последовательност фрагмента ДНК DARC146 путем определения его электрофоретическо ПОДРИЖКОСТИ.

а - подвижность фрагмента 340п.н.; фрагмент вырезали из век торной ДНК, отделяли от векторной ДНК электрофорезом элюировал из геля и проводили электрофорез в ПААГ при различной температу ре, С (указан внизу электрсфореграмм); м- фрагменты ДНК фаг лямбда, обработанной рестриктазой PstI.

б - подвижность фрагментов ДНК 146 и 105п.н. при 24.5 С ; М плазмиды pBR322, расщепленная рестриктазой Mspl.

в - подвижность амплифицировакного фрагмента ЮОи.н., содер жащего блоки AAA; М - ДНК плазмидк pBR322, расщепленная рестрик тазой Mspl. Горизонтальными черточками указано положение к элоктрофореграммах фрагментов ДНК такой же длины,но не содержат!' изгиба.

ювательностей на фрагменте БАКС146, ответственных за высокосие-ифичное взаимодействие с ядерными полипептидами (транс-фактора-[и). Для этого начально был установлен сам факт специфического 1эаимодействия белков ядерного экстракта и ядерного матрикса с [уклеотидной последовательностью ОАКС146. Методом футприкт-анали-1а было выявлено несколько зон протекции в ОАИС146 к действию ¡уклеаэы, обеспеченных высокоаффинным взаимодействием нуклеотид-мх сайтов связывания на ДНК ОАЕС146 с ядерными полипептидами. Юны протекции расположены как в зоне,так и вне области формирую-[ей изгиб ДНК. Среди областей протекции идентифицировался окта-[ерный мотив,представляющий собой сайт связывания для хорошо изу-:енного фактора транскрилции-реплккации Ось-1 белка (Рис.3), при том сайт связывания содержал нуклеотидные вариации , отличающие го от классического октамерного мотива. Другие защищенные после-;овательности (например САСТГАО полностью гомологичных ранее из-естных аналогоз не имели. Вот почему в следующей серии экспери-;ентов необходимо было установить, какие конкретные белковые зле-енты из ядерного экстракта способны взаимодействовать в участках |бнаруженной протекции ОАКС146. Для большей строгости в интерпре-ации природы цис-транс взаимодействий бьоти проведены серии экс-ериментов с использованием синтетических матриц, перекрывающих азличные области протекции на последовательности БАИС146. Основ-ыми методиками, изучения природы цис-транс взаимодействий явля-ись ретардационные гели, футпринт анализы белок-нуклеиновых омплексов, методы конкурентного ингибирования образования бе-ок-нуклеиновых комплексов, иммуноблотинги. Используя лабор пере-исленных выше подходов, удалось установить, что обнаруженные наи вариации канонического октамерного мотива не являются критич-ыми для взаимодействия 0сЬ1 белка с сайтами, содержащими вариа-ии. Кроме того,строго доказано, что в образовании, белок-нуклеи-овых комплексов на этих сайтах принимает участие именно 0сЬ1 бе-ок. Нами обнаружены две ранее не описанные в литературе вариации айта связывания для ОсЬ1 белка.

Более неожиданный результат был обнаружен при исследовании и арактеристике взаимодействия с нуклеотидной последовательностью АЯС146 с полипептидом р65. По молекулярной массе и по нуклеотид-

I 2

СТ|р7_

кД»

c-

6«_

45-

ДНК-

2S-

a

Рис.3. Определение молекулярной массы белков, формирующих ре-тардационкый комплекс с фрагментом DARC146.

а - связывание фрагмента DARC146 с частично очищенным белком Oct-1. Фрагмент ДНК DARC146, меченный по 3' - концу, инкубировали с фракцией частично счищенного белка Oct - 1 и анализировали в 4%-ном ПААГ. 1 - проба без добавления белков, 2 - проба после инкубации с белками ядерного эксгра-ста.

С - положение хомплекса DARC146 - белки.

б - 12%ПААГ - 0,1%ДСИа электрофорез белков, элюированных из ретардационного комплексе. С. Слева указано положение маркерных белков.

5

ным последовательностям аффинного взаимодействия данного полипептида с ДНК (ТСТСТТА и ТСТАТТА), казалось очевидным предположить, что это может быть с-гсус белок, роль которого в промотировании синтеза ДНК широко ' обсуждается в литературе (27].Вместе с тем, ряд дополнительных фактов заставили отказаться от такого, казалось перспективного, предположения. Во-первых, в отличие от и-тус белка, экспрессия которого резко усиливается в стадии,предшествующей синтезу ДНК в регенерирующих гепатоцитах крыс, белок р65 в наших экспериментах оказался пептидом конституитивным, т.е. его ДНК-связывающая способность . постоянна (поддерживается на одном уровне) на всех стадиях клеточного цикла регенерирующих гепатоци-тов (Рис.4). Во-вторых, и это особенно важно, иммунноблотинг с антителами к с-гнус белку, не идентифицировал рб5 как с-мус (Рис.5). Таким образом, наиболее вероятно, что н^ми идентифицирован новый белок, совпадающий по молекулярной массе с с-шус белком. Наконец, полипептид р28, специфически связывающийся с последовательностью САИС146, ранее в литературе не был описан. К его особым свойствам относится строгая локализация данного полипептида в ядерном матриксе, а также присутствие на следовом уровне в ядерных экстрактах. У нас имеются основания полагать, что полипептид, образующий белок-нуклеиновый комплекс с электрофо. этичес-коГ: подвижностью 0,7 в ретардационных экспериментах и протектиру-ющий последовательность АТТААА является белком р28. Скорее всего, установленная клеточная локализация белка )28 свидетельствует э пользу того, что этот важный транс-элемент функционально обеспечивает связь предполагаемого УИР иАКС146 с ядерным матриксом. К сожалению, четвертый полипептид ядерного экстракта, связывающийся ЮА1гС146 , и по результатам "Зоис1»1-евЬегпп анализа обладающий моле--кулярным весом ЗОкДа и, по-видимому, протектирующий нуклеотидный сайт связывания САСТТАС, нами практически не охарактеризован. Данные о полипептиде с такими характеристиками в литературэ практически отсутствуют.

Итак, среди транс-элементов, специфически взаимодействующих с последовательностью ПА1*С14б, идентифицировано 4 полипептида (Рис.6). Для трех из лих строго идентифицированы аффинные сайты связывания и охарактеризована природа цис-транс взаимодействий.

0 6 12 15 18 22

Рис.4. Определение уровня белка р65 в ядерных экстрактах ,ре-генирируклцих гепатонитов.

Олигонуклеотид Р-Т8 инкубировали с белками ядерных экстрактов гепатоцитов, выделенными через 6,12,15,18 и 22 ч после частичной гепатоэктомии, и пробы анализировали методом ретардации в геле. Цифры сверху - время после операции (ч), через которое были получены ядерные экстракты.

Рис.5. Влияние антител против белка с-шус на образование комплекса ДНК-рб5.

а - иммуноблотинг белков ядерного экстракта, используемого в настоящей работе; белки фракционировали по методу Лэммли (5). Процедура блотинга описана в разделе 2.21. Числа слева- молекулярные массы маркеерных белков (кДа).

б - влияние антител к белку с-шус на образование комплекса, имеющего подвижность 0.5; олигонуклеотид Р- Т8 инкубирогали с белками ядерного экстракта без антител (1) и в их присутствии (2); пробы анализировали методом ретардации в геле.

Рис.6.

а) Изучение взаимодействия ядерных белков с фрагментом DAPC146 методом Southwestern - анализа.

- Белки фракционировали в 12% ПААГ-0,1%ДСИа (12), перенс или на нитроцеллюлоэный 1 фильтр и связывали с меченным по концу фрагментом DARC146.

1 - ядерный экстракт, 2 - белки ядерного матрихса.

Положение маркерных белков указано слева.

б) Дог-блот .гибридизация (1) тотальной хромосомной ДНК и (2) ДНК, выделенной из ядерного матрикса,. с Р-меченным фрагментом DARC146. Слева указано количество (мкг) ДНК в пятне.

(ругим важным цис-элементом предполагаемого УИР DARC146 являете* [згиб ДНК. Однако, как следует из анализа нуклеотидной последова-•ельноти DARC146, в ре состав включается инвертированный повтор, 1ерекрывающий область изгиба ДНК, в пределах которого теоретичес-:и можно ожидать формирование "крестообразной" структуры. Подобия неканоническая структура ДНК может служить дополнительным (ис-элементом, регулирующим своим. формированием изменение [ЯК-белковых взаимодействий в не только в регионе, подверженном ■онформационным изменениям, но и примыкающих к данной области [частках. Именно с этих позиций принято рассматривать функцио-■альную роль структурных переходов на ДНК в инициации процесса :интеза ДНК. Вместе с тем, в каждом конкретном случае наличие той или иной неканонической структуры требует прямых экспериментальных подтверждений. С этой целью нами были использованы синтетические олигонуклеотиды, перекрывающие область установленного юрвичным анализом нуклеотидной последовательности DARC146 инвертированного повтора. С помощью электрофореза в ПААГ мы идентифи-(ировали три возможных структурных варианта синтетических олиго-хуклеотидов: быстродвижущаяся зона соответствовала шпилечной :труктуре синтетического олигонуклеотида, зона наиболее замедлен-юй подвижности соответствовала самокомплиментарной дуплексной ¡юрме, а зона с промежуточным значениепподвижности образца в геле :оответствовала линейной форме однонитевого олигонуклеотида. Две шилечные структуры, существование которых *,эляется очевидным при шализе синтетических олигониклеотидов, в контексте нуклеотидной гаследовательности DARC146 могут обуславливать "крестообразную" ггруктуру. "Крестообразные" структуры, отсутствующие в релаксиро-5анной ДНК, становятся предпочтительными при повышении уровня су-эрскрученности молекулы ДНК. Поэтому мы провели серию экспериментов, направленных на идентификацию "крестообразной" структуры е юследовательности DAEC146, существующей в плазмидном контексте in vivo. Для этой цели мы использовали методику метилпсорален-УФ индуцированных сшивок в двухнитевои молекуле ДНК, которые стаби -¡изировали бы "крестообразную" структуру в случае ее обоазов^чия. Такие стабилизированные структуры легко выделять из клеточного тизата и в дальнейшем анализировать электрофорезом в ПААГ, янзгк'

гично приведенному выше примеру. Описанным подходом нам действительно удалось подтвердить,что "крестообразная" структура реально существует в последовательности DARC146, находящейся в плаамидном контексте in vivo (Рис.7).

Таким образом, для идентификации цис-транс взаимодействий в зоне пре-полагаемого УИР и интерпретации молекулярных механизмов автономной репликации мы получили экспериментально аргументированные факты, свидетельствующие о конкретной природе сайт-специфических взаимодействий и неканонических структур возможного участка инициации репликации. Вместе с тем, в плане адаптации изучаемых механизмов к реальной ситуации хромосомных УИР, крайне необходимо обсудить возможную общность отдельных идентифицированных цис- и .транс- элементов для систем , наиболее приближенных к утверждению их функционирования как действительных внутрихромо-сомных УИР. Оснозная сложность заключается в том, что УИР в хромосомах априорно гетерогенны, а отдельные сайты Для специфического взаимодействия с транс-элементами также в известной степени вырождены. Поэтому для сравнительного анализа был выбран наиболее интенсивно изучаемый в настоящий момент УИР дегидрофолатредуктаз-ного домена, охарактеризованного как действительный хромосомный УИР рядом авторов [16,17,18]. Как и следовало ожидать из логики организации хромосомных УИР, не было обнаружено протяженных гомологичных участков между DAP.C146 и УИР DHFR-домена. Однако, установлено наличие коротких идентичных нуклеотидных последопатель-ностей соответствующих отдельным участкам, идентифицированным нами как сайты, обеспечивающие . взаимедействие с отдельными транс-элементами. Прежде всего,это. касается нуклеотидного сайта взаимодечствил с белком р65 и последовательности АТТААА,отвечающей за связывание с полипелтидом р28. Сложнее решался вопрос о сайтах связывай>я для' Oct-1 белка. Сам акт взаимодействия DHFR-домена с Octl белком был безальтернативно установлен в различных сериях экспериментов и с использованием конкурентного ин-гибирования, и с исследованием кинетики связывания по клеточному циклу. После подробного анализа нуклеотидной последовательности удалось установить повторяющийся мотив (ТААТ), подтверждающий известное мнение о значительной вариабельности мотивов, обеспечива-

I 2 3

Рис.7. Результаты триметнлпсораленового теста (идентификация "крестообразной" структуры в последовател ности фрагмента ДНК ОА11С14б) . Клетки обрабатывались тримети.чпсораленом и облучались ультрафиолетовым светом (360 нм) в течение 4 и 8 минут. Зыделя-лась плазмидная ДНК и обрабатывалась ферментами рестрикции ЕсоК! и НИкЛИ. Образцы разделялись в 6% полиакриламидном геле. Попут ченные результаты демонстрируют наличие "крестообразной" структуры, стабилизированной триметилпсораленовыми сшивками в последовательности БАКС146. На дорожку (1) нанесена плазмидная ДНК, рест-рицированная, но не обработанная триметилпсораленом, на дорожки (2) и (3) - рестрицированная ДНК, обработанная трииетилпсораленом, облученная уф в течение 4 и 8 минут, соответственно. Линейная форма фрагмента ПАЕС14б обозначена на рисунке - Ь, "крестообразная" форма - С.

ющих специфическое взаимодействие с 0с1:1. Это лишний раз подтверждает вырожденность отдельных функционально значимых участко! в пределах УИР.

Вместе с тем, в ряде случаев отдельные специфические сайп отличаются заметным консервативизмом. .Так, в области белково! протекции на последовательности 0АЯС146 обнаружен нуклеотидны! сайт САСТТАС, который присутствует и в ОНРЛ-домеьэ. Важно отме тить, что в обоих случаях этот нуклеотидный сайт связывает"один 1 тот же пептид из ядерного экстракта гепатоцитов, природа которой нами пока не идентифицирована.

Наконец, характеризуя возможные неканонические структуры 1 пределах СНГЛ-домена, отметим существование трех блоков ААА, об разующих уж обсуждаемый выше изгиб.

Таким образом, по наличию основных цис- и трансэлементов изучаемый нами фрагмент ДНК ВАЯС146 в заметной степени аналогиче: хромосомному УИР Бите-домена.Именно выявленная нами аналогия структурной организации позволяет нам полагать, что ОАИС146 в из вестной степени претендует на роль УИР хромосом.

Вместе с тем, в контексте дискусси,. о возможной общност структурной организации последовательностей регулирующих реплика цию и транскрипцию, обращает на себя внимание многократно приво димые в данной работе факты взаимодействия с идентифицированным аффинными сайтами связывания некоторых пептидов, известных ка регуляторы транскрипции. В этой связи нам представлялось интерес ным уточнить характер распределения определенных сайт-специфичес кнх последовательностей, описанных как в этой роботе,так и в дру гих исследованиях, в пределах регуляторных областей хорошо изу чинных генов. С этой целью была использована программа, разрабо танная Конышевым В.Н. (ПИЯФ) для анализа банка данных нуклеотид ных последовательностей'различных генов. Оказалось, что во все без исключения случаях анализируемые нами семь сайт-специфичны участков распределяются кластерами только в зонах, не затрагиваю щих структурный код экзонов.т.е. в потенциальных регуляторных зо пах генома. Под- бный четкий результат указывает на то, что выяв пенный характер цис-транс взаимодействий имеет отношение не толь ко к механизму регуляции репликации, но и транскрипции в геноме.

ВЫВОДЫ.

1. Показано, что минимизированный фрагмент в 146п.н. (DARC146), перехлонированный из последовательности DARC1, ранее выделенной из альфа-полимеразного комплекса нерегенирирующих ге-патоцитов крыс, сохраняет основную функцию: обеспечивает автономную репликацию рекомбинантного бактериального вектора в клетках млекопитающих.

2. В пределах последовательности DARC146 идентифицирован AT-богатый участок, б пределах которого три блока AAA чередуются через виток спирали ДНХ. Расчетными программами и биофизическими методами установлено наличие изгиба в двуспиральной структуре нуклеотидной последовательности DARC146, детерминированного данными повторами.

3. В последовательности DARC146 установлены аффинные сайты к 4 полипептидам из ядерного экстракта /епатоцитов крыс.

4. Установлено, что последовательность DAP.C146 в ядрах гепа-тоцитов связана с ядерный матриксом, и что эта связь , по-вкдимо-му, осуществляется белком рб5.

5. Среди взаимодействующих с DARC146 пептидов, рЮО идентифи-цироран как Octl белок; рб5 , по молекулярному весу и последовательности аффинного сайта связывания соответствующий с-мус белку, оказался не с-мус белком; р28 оказался белко-* пептидом локализованным в ядерном матриксе и связывающем последовательности АТТА-АА; природа полипелтииа рЗО нами не установлена, мы можем предполагать, что этот полипептид связывает нуклеотиднын сайт CACTTAG.

6. Нами строго идентифицированы новые нуклеотидные участки связывания на ДНК для фактора транскрипции-репликации Octl белка, ранее не описанные в литературе.

7. В зоне инвертированного повтора в последовательности OARC146 экспериментально установлена шпилечная структура , которая в плазмидном контексте внутри клетки существует в линейной и "крестообразной" формах; подобным структурным транзициям приписывается функция регуляции "активированного" и "неактивированного" состояния УИР.

8. Все основные элементы, идентифицированные в пределах DARC146, и взаимодействующие с ними транс-элементы, были экспериментально устанорпены нами в пределах УИР DHFR-домена, описан.юго в литературе как хромосомный УИР млекопитающих; это позволяет нам отнести изучаемый нами фрагмент DARC146 к потенциальному участку инициации хромосомной репликации.

9. С помощью программы компьютерного анализа последовательностей ДНК в банке эукариотических генов, нами установлено, что последовательности аффинных сайтов , установленные в наших исследованиях и в ряде других работ (всего 7 последовательностей) во всех без исключения случаях распределяются кластерно только в зонах, соответствующих регуляторным участкам генов; данные обстоятельства позволяют предполагать общие элементы в организации цис-транс взаимодействий при регуляции транскрипции и репликации.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Луняк В.В., Филатов М.Ю., Ибатул^ин Ф.М., Тимченко H.A. Взаимодействие ядерных белков с областью изгиба ДНК на автономно репцицнрущейся последовательности DARC146. - Цитология. 1992. Т.35. С.86-92.

2. Тимченко H.A., Луняк В.В., Луняк А.Н. Участок инициации репликации дигидрофолатредуктазного домена и фрагмент ДНК DARC146 взаимодействуют с одинаковыми ядерными белками. - Мол.биология. 1994. Т.28. С.865-874.

3. Луняк В.В.', Тимченко H.A. Фрагмент ДНК DARC146 из компекс-иой формы ДНК-попимераэа альфа содержит несколько участков связывания ялерных белков. - Мол.биология. 1994. Т.28. С.822-831.

4. Томилин Н., Тимченко Н., Луняк В., Чемберлен К., Хенхок Р. Доказательства участия транскрипционного репликагивного фактора Oct-1 tnuclear factor 3) в активации хромосомных репликонов. Третья конференция "Геном человека-93", Черноголовка, 1993.

5. Lunyak V.V., Timchenko N.A., (1994)., DNA fragment DARC146 from complex form of DNA polymerase alpha contains several binding sites for nuclear proteins., preprint 2007., Russian Academy of Sciences Petersburg Nuclear Physics Institute., Gatchina.

6. Lunyak V.V., Konyshev V.N., Noskin L.A. (1994)., Some structural-functional particularities of ARS DARC146. Attempts to predict regulartory loci of genes., preprint 2008., Russian Academy of Sciences Petersburg Nuclear Physics Institute., Gatchina.

7. Lunyak V.V., Timchenko N.A. DNA fragment DARC146 from the complex form of DNA-polymerase alpha contains saveral binding sites for nuclear proteins. - Mol.Biol. v.28/4 part 1., p.p.539-543., 1994.

8. Timchenko N.A., Lunyak V.V., Lunyak A.N. The replication origin of dehydrofolatereductase domain and the DARC146 fragment interact with the same nuclear proteins. - Mol.Biol., v.28/4, part 2, p.p. 565-570, 1994.

9. Lunyak V.V.', Timcheuko N.A. General features of ARS DA .C146., Second McGill Conference on regulation of eukariotic DNA replication, Oct.15-18., Montreal., Canada., 1992.

10. Lunyak V.V., Timchenko N.A., Noskin L.A. General features of ARS DARC146., Cold Spring Harbor Laboratory Eukariotic of DNA Replication Meeting, Sept. 8-12, 1993 ., Cold Spring .larbor, U.S.A., 1993.

11. Lunyak V.V., Konyshev V.N., Noskin L.A. Toward predicting of ARS elements by computer analysis of the DNA sequences., Cold Spring Harbor Laboratory Eukariotic of DNA Replication Meeting., Sept.8-12., Cold Spring Harbor., U.S.A., 1993.

12. Lunyak V.V., Timchenko N.A., Noskin L.A. About some particularity of ARS DARC146., Third McGill Conference on regulation of eukariotic DNA replication., Oct.20-23., Montreal., Canria., 1994.

13. Konyshev V.N., Lunyak V.V., Koskin L.A. Predicting of ARS

elements by using computer scearch., Third McCJill Conference of regulation of eukariotic DNA replication., Oct.20-23., Montreal., Canada., 1994.

14. Lunyak V.V., Not.win L.A. Attachment putative replication origin with nuclear matrix.. Keystone symposia on molecular and cellular biology., Apr.4-10-, Hilton Head Island., U.S.A., 1995.

15. Konyshev V.N., Lunyak V.V., Noskin L.A. Attempts to predict of regulatory loci of genes by computer screach., Keystone symposia on molecular and cellular biology., Apr.4-10., Hilton Head Island., U.S.A., 1995.

OrnenaTaHi b Tnrrirpa|iin IMI3> 3aK.42I, tup.I00,yu.-M3^.ji.I; 3/IX-I996i\ . EecnjiaTH^