Молекулярные и клеточные маркеры индивидуальной чувствительности человека к воздействию ионизирующего излучения

Воробьева, Наталья Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярные и клеточные маркеры индивидуальной чувствительности человека к воздействию ионизирующего излучения
ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярные и клеточные маркеры индивидуальной чувствительности человека к воздействию ионизирующего излучения"

□□згтт'зго На правах рукописи

ВОРОБЬЕВА Наталья Юрьевна

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ И КЛЕТОЧНЫЕ МАРКЕРЫ ИНДИВИДУАЛЬНОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ЧЕЛОВЕКА К ВОЗДЕЙСТВИЮ ИОНИЗИРУЮЩЕГО

ИЗЛУЧЕНИЯ

03.00.01- радиобиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

0 6 ДЕН 2007

Москва - 2007

003177320

Работа выполнена в лаборатории радиационной биофизики и экологии Института химической физики им Н Н Семенова Российской Академии Наук

Научный руководитель: доктор биологических наук

Осипов Андреян Николаевич

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Засухина Галина Дмитриевна Институт общей генетики им Н.И Вавилова РАН

доктор биологических наук, профессор Саенко Александр Семенович Медицинский радиологический научный центр РАМН

Ведущая организация: Институт биохимической физики

им Н М Эмануэля Российской академии наук

часов

2007 г в «

Защита состоится Ж на заседании диссертационного совета Д.501 001.65 в Московском государственном университете им Ломоносова по адресу 119899, г Москва, ГСП, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет /

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ по адресу 119899, г Москва, ГСП, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет.

Автореферат разослан «>/$2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время человек часто подвергается воздействию радиации (совместно с другими агентами) в малых дозах, которые могут изменить радиочувствительность организма в сторону снижение радичувствительности (адаптивный ответ) и ее увеличение Следует учитывать и малоизученные виды комплексного воздействия на организм - так, в последние десятилетия резко увеличилось число полетов на больших высотах, где человек подвергается воздействию целого ряда неблагоприятных факторов космическое излучение, перегрузки, вибрация, гиподинамия, стресс и др Результаты многочисленных медико-биологических исследований свидетельствуют о том, что подобные комплексные воздействия приводят к увеличению частоты цитогенетических нарушений (Heimers, 2000), заболеваниям опухолевого (Buja et al, 2005) и неопухолевого генеза (Grosz et al, 2007), изменениям уровня повреждений генома и чувствительности клеток к дополнительным воздействиям (Пелевина и др, 2007) Эти изменения являются предпосылками для развития нестабильности генома (Zha et al, 2007). Однако, как правило, оценивается лишь принципиальная возможность возникновения генотоксических эффектов путем сравнения средних показателей исследуемых групп с контролем Анализ вариабельности индивидуальных различий отдельных лиц в большинстве исследований не проводится, в то время как их радиочувствительность может различаться в десятки раз

С другой стороны для лечения онкологических заболеваний человека часто используется лучевая терапия, где опухоли подвергают локальному облучению в высоких дозах Известно, что чувствительность опухолей одного и того же типа к облучению у различных индивидуумов существенно различается (Пелевина и др , 2006). Также резко различается последствия лучевой терапии для организма при облучении опухолей в сходных дозах (Pinar et al, 2007) Поэтому при онкологических заболеваниях также чрезвычайно важно определять индивидуальную реакцию на радиационное воздействие

Из вышеизложенного следует, что поиск адекватных критериев оценки индивидуальной радиочувствительности человека и ее вариабельности является одной из важнейших проблем современной радиобиологии и медицины

Так как радиочувствительность организма связана главным образом со способностью клеточных систем 1) предотвращать возникновение повреждений ДНК, 2) репарировать индуцированные радиацией повреждения ДНК, 3) эффективно элиминировать клетки, в которых репарация повреждений ДНК невозможна (запуск апоптоза), то в настоящей работе были изучены основные компоненты, определяющие клеточную радиочувствительность

Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в оценке индивидуальной чувствительности лимфоцитов крови человека к дополнительному облучению в условиях in vitro и выявления маркеров, характеризующих вариабельность радиочувствительности и ее изменение при воздействии профессиональных факторов, развитии онкологических заболеваний и их лучевой терапии

Были поставлены следующие задачи исследования • на лимфоцитах периферической крови контрольных доноров, летчиков, космонавтов и онкологических больных

1 Оценить уровень разрывов ДНК и повреждаемость ДНК при дополнительном облучении клеток в условиях in vitro;

2. Изучить эффективность репарации двунитевых разрывов ДНК и

ее индивидуальную вариабельность, 3 Сравнить динамику клеточной гибели (апоптоз, некроз), 4. У онкологических больных до и во время проведения курса лучевой терапии исследовать уровень разрывов ДНК, повреждаемость ДНК при дополнительном облучении клеток в условиях т vitro, эффективность репарации двунитевых разрывов ДНК и гибель клеток по механизмам апоптоза и некроза, 5 Сопоставить информативность изученных показателей для характеристики индивидуальной реакции Положения, выносимые на защиту:

1. Полеты на больших высотах приводят к увеличению повреждаемости ДНК в лимфоцитах крови при дополнительном облучении клеток в условиях in vitro и возрастанию индивидуальной вариабельности радиочувствительности,

2 У онкологических больных (рак простаты) до лучевой терапии в лимфоцитах крови отмечается повышение уровня разрывов ДНК, увеличение повреждаемости ДНК при дополнительном облучении клеток в условиях т vitro и доли гибнущих клеток В процессе лучевой терапии рака простаты увеличивается уровень разрывов ДНК лимфоцитов крови и частота их гибели

3 Использованный в работе комплекс клеточно-молекулярных методов и подходов позволяет дать адекватную оценку индивидуальной радиочувствительности человека и ее вариабельности

Научная новизна. Впервые на лимфоцитах крови контрольных доноров, летчиков, космонавтов проведено исследование исходного уровня разрывов ДНК, выхода двунитевых разрывов ДНК при дополнительном облучении клеток в условиях т vitro, эффективности их репарации и динамика гибели клеток (ранний и поздний апоптоз, некроз) при инкубации в условиях in vitro

Впервые на лимфоцитах крови больных раком простаты до и в про-

цессе лучевой терапии изучено изменение уровня разрывов ДНК, повреждаемости ДНК при дополнительном облучении клеток в условиях in vitro, эффективности репарации двунитевых разрывов ДНК и динамика клеточной гибели (ранний и поздний апоптоз, некроз) при инкубации в условиях m vitro

Впервые с применением современных клеточно-молекулярных методов дана комплексная сравнительная оценка вариабельности радиочувствительности в когортах контрольных доноров, летчиков, космонавтов и онкологических больных до и во время лечения

Научно-практическая ценность работы. Результаты работы могут быть использованы в радиационной биологии для определения различий в индивидуальной реакции на облучение, в медицине и космической биоло-гиии для выявления у пилотов и космонавтов ранних признаков необходимости прекращения полетов, в медицине для прогнозирования эффективности и последствий лучевого лечения онкологических заболеваний.

Личный вклад диссертанта. Представленная работа является частью исследований, проведенных лабораторией радиационной биофизики и экологии ИХФ РАН с личным вкладом диссертанта, в получение представленных в работе материалов не менее 70 % Автор самостоятельно осуществляла постановку и проведение исследований, первичную обработку и анализ полученных данных, формулировала положения и выводы работы

Апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на Международной конференции БИОРАД-2006 «Биологические эффекты радиации и радиоактивное загрязнение среды» (Сыктывкар, 2006), 4th International Workshop on Space Radiation Research and 17th Annual NASA Space Radiation Health Investigators' Workshop (Moscow -St Petersburg, Russia, 2006), 35th Annual Meeting of the European Radiation Research Society and the 4th Annual Meeting of the Ukrainian Society for Radiation Biology (Kiev, Ukraine, 2006), International Free Radical Summer School 2006 (Spetses Island, Greece, 2006), III Международном симпозиуме «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии» (Москва-Дубна, 2007)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 2 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, использованных в работе, трех глав результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы Работа изложена на_страницах машинописного текста и содержит_таблиц и_рисунков. Список литературы

включает _ источников, из них_ на иностранном языке

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для исследований были подобраны четыре различных когорты людей

1) Группу контроля составили здоровые сотрудники лаборатории лабораторных методов исследований клинико-диагностического отделения ФГУ РНЦРР Росмедтехнологии, доноры пункта переливания крови МРНЦ РАМН. У всех контрольных доноров было получено согласие на проведение данного исследования. Всего было обследовано 33 контрольных доноров

2) В группу летчиков вошли 41 пилот гражданской авиации, летавшие на разной высоте (6000-17000 м), различное количество часов (3904520 ч) Общий налет составил от 390 до 4520 часов, а накопленная доза 0,019-1,4 сГр

3) В группу космонавтов вошли 8 человек, обследование которых проводилось спустя 10-20 лет после завершения полетов, время в космосе составляло от 11 до 679 суток (суммарно за несколько полетов) и накопленная доза составила 0,14 - 22,7 сГр.

4) Группу онкологических больных до лечения составили 18 пациентов с диагнозом рак предстательной железы, которые были госпитализированы в отделение урологии ФГУ РНЦРР Росмедтехнологий в период с апреля по сентябрь 2007 года Диагноз был подтвержден морфологически и методом ИФА. У 10 человек размер опухоли был определен как T1N0M0, у 7- T2N0M0

5) Группу онкологических больных во время лечения составили 6 пациентов Взятие материала было произведено до начала лечения и спустя 2-5 месяцев после начала лечения (локальная суммарная поглощенная доза на предстательную железу составляла 41-123 Гр)

Выделение лимфоцитов из гепаринизированной венозной крови проводили путем центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографин (Histopaque, Sigma) в соответствии с прилагаемой инструкцией После выделения лимфоциты отмывали и ресуспензировали в фосфатно-солевом буфере (рН 7,4) до конечной концентрации 1-2 х 106 клеток/мл.

Для оценки уровня двунитевых разрывов ДНК и эффективности их репарации в лимфоцитах использовали метод электрофореза единичных клеток (метод ДНК-комет) в нейтральных условиях Степень поврежден-ности ДНК, определяемая этим методом, оценивается по увеличению количества мигрировавшей из ядерной области ДНК и расстояния ее миграции после проведения электрофореза ДНК иммобилизованных в агарозу единичных клеток Сравнительные фотографии ДНК-комет лимфоцитов крови контрольных доноров после облучении в различных дозах представлены на рис. 1

Рис.1 Сравнительные фотографии ДНК-комет лимфоцитов крови контрольных доноров после облучении в различных дозах.

Краткое описание метода:

20 мкл суспензии лимфоцитов смешивали со 100 мкл 0.5 % раствора легкоплавкой агарозы (тип IV) в фосфатно-солевом буфере (рН 7,4) при температуре 37°С и наносили на предварительно покрытые 1% слоем нор-моплавкой агарозы предметные стекла, накрывали покровными стеклами и выдерживали 5 мин при 4°С на предварительно охлажденной металлической пластине. После солидификации агарозы удаляли покровные стекла и полученные сайды помещали в охлажденный (4°С) фосфатно-солевой буфер.

Облучение проводили на терапевтической установке «Алтай» (Россия, источник гамма-излучения 60Со) в дозе 1 и 10 Гр при мощности дозы 1,5 Гр/мин.

Через 1 -2 мин после окончания облучения слайды переносили в холодный (4°С) лизирующий буфер (2.5 М NaCl, 100 мМ Na2EDTA, 20 мМ Tris-HCl, рН 10.0, 1 % Triton Х-100 и 10 % DMSO) в течение 2 ч. После лизиса клеток слайды переносили в холодный (4°С) трис-боратный буфер (ТВЕ, рН 8.2, Sigma) и выдерживали 20 мин. Электрофорез проводили в ТВЕ буфере при напряжении 1.5 В/см при температуре 4°С в течение 20 мин. После электрофореза слайды слегка подсушивали и фиксировали в 70 % этаноле в течение 10 мин.

Для исследования эффективности репарации ДНК, агарозные слайды с облученными клетками помещали в среду RPMI-1640, содержащей 20%

сыворотки крупного рогатого скота и инкубировали при 37°С в течение 60 мин После чего проводили лизис, электрофорез и фиксацию согласно описанной выше процедуре

Для окраски ДНК использовали акридиновый оранжевый (Sigma) (2 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере, pH 7 4). Визуализацию ДНК-комет проводили с помощью люминесцентных микроскопов ЛЮМАМ И8 и МИКМЕД-2 вар 11 (ЛОМО, Россия) и видеосистемы на основе цифровой камеры Фильтр возбуждения ФС1-5 (400-440 нм), запирающий фильтр 515 (515 нм) Использование запирающего фильтра 515 позволяет фиксировать преимущественно «зеленую» флуоресценцию, характерную для комплексов акридиновый оранжевый - двунитевая ДНК. Для анализа ДНК-комет использовали программу CometScore (TriTek Corp http //tritekcorp com) Оценивали момент хвоста ДНК-комет равный произведению расстояния от центра ядра до центра плотности хвоста кометы на % ДНК в хвосте

Дополнительно у отдельных индивидуумов проводили исследования уровня радиационно-индуцированных двунитевых разрывов ДНК, при помощи анализа фосфорилированного гистона ШАХ (у-Н2АХ) Фосфори-лирование серина 139 гистона Н2АХ на сайтах повреждений ДНК является наиболее ранним откликом клеток млекопитающих на образование двунитевых разрывов ДНК и свидетельствует о распознавании повреждения ДНК-зависимыми киназами ATM, ATR и DNA-PK (Ismail et al, 2007) Анализ проводится с помощью специфических антител к у-ШАХ, конъюгиро-ванных с флуоресцентными красителями

Для определения уровня у-Н2АХ использовали набор «anti-phospho-Histone ШАХ» (Millipore Corp), согласно прилагающемуся протоколу Анализ проводили на проточном цитофлуориметре Daco Galaxy (Дания) со скоростью 200 клеток/сек Компьютерную обработку проводили с использованием программы FlowMax В каждом образце анализировали 30 000 клеток

Для изучения сравнительной динамики апоптотической гибели контрольных (необлученных) и облученных в дозе 1 Гр лимфоцитов при инкубации в полной среде m vitro использовали метод проточной цитофлуоро-метрии с анализом фосфатидилсерин-позитивных клеток и клеток с поврежденной мембраной. Известно, что после индукции апоптоза происходит переход молекул фофатидилсерина с внутренней стороны клеточный мембраны на наружную Данное событие является необратимым и свидетельствует о том, что в клетках запущен механизм апоптотической гибели Идентификация фосфатидилсерин-позитивных клеток основана на специфическом связывании фофатидилсерина аннексином 5 (плацентарный антикоагулирующий белок-1) конъюгированным с флуоресцентным красителем (FITC) Анализ фосфатидилсерин-позитивных клеток методом проточной цитофлуорометрии является одним из наиболее быстрых и эффективных методов обнаружения апоптотических клеток Использование ком-

бинированного окрашивания клеток флуоресцентными красителями, конъюгированными с аннексином 5, и йодистым пропидием, проникающим только в погибшие клетки с нарушенной мембраной, позволяет раздельно детектировать раннюю и позднюю стадии апоптоза, а также некроз.

Окраску лимфоцитов проводили с использованием набора «Аннексии V» (Beckman Coulter), согласно прилагающемуся протоколу Образцы анализировали на проточном цитофлуориметре Daco Galaxy (Дания) со скоростью 200 клеток/сек Компьютерную обработку проводили с использованием программы FlowMax. Анализ клеток в образце проводили по четырем параметрам интенсивность прямого и бокового светорассеяния (FSC/SSC) в линейных координатах и интенсивность флуоресценции FITC и пропидий йодида (FL1/FL2) в логарифмических единицах В каждом образце анализировали 30 ООО клеток

Статистическую обработку результатов экспериментов проводили с использованием программы Statistica 6 0

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Уровень разрывов ДНК лимфоцитов периферической крови летчиков, космонавтов и онкологических больных

Уровень повреждений ДНК, определяемый с помощью метода ДНК-комет, в клетках человека может сильно варьировать в зависимости от наличия заболеваний (Collins et al, 1998) и курения (Frenzilli et al, 1997) Поэтому для исследований отбирались только здоровые, некурящие доноры в возрасте от 30 до 50 лет Результаты исследований 33 контрольных доноров показали, что в контрольной когорте наблюдаются существенные индивидуальные различия в исходных уровнях разрывов ДНК, но не один из доноров не выходил за границы 95%-ного доверительного интервала (табл 1) Полученные результаты, в целом, свидетельствуют об адекватном выборе контрольной когорты

Исследования лимфоцитов крови летчиков показали, что в когорте летчиков параметры распределения уровня разрывов ДНК резко отличаются от контрольных (табл 1) Средние значения уровней разрывов ДНК 6-ти летчиков выходят за верхнюю границу 95% доверительного интервала контрольного распределения, в то время как для 1 летчика этот показатель выходит за нижнюю границу 95% доверительного интервала контрольного распределения Сравнение дисперсий распределения уровней разрывов ДНК в группах летчиков и контроле, показало, что эти различия статистически достоверно различаются по F критерию Фишера Таким образом, условия полетов приводят к возрастанию индивидуальной вариабельности и по уровню разрывов ДНК лимфоцитов крови

В отличие от результатов, полученных при обследовании летчиков,

обследование небольшой когорты космонавтов не выявило статистически достоверных изменений уровня разрывов ДНК по сравнению с контролем (табл 1). По всей видимости, отсутствие различий обусловлено более тщательным медицинским отбором и последующим контролем за состоянием здоровья Кроме того исследования космонавтов проводились спустя 10-20 лет после прекращения полетов

Наиболее выраженные изменения уровня разрывов ДНК были зарегистрированы при исследовании онкологических больных с раком простаты. Было показано, что у онкобольных до лечения среднее значение момента хвоста ДНК-комет было статистически достоверно выше контрольного значения в 2 3 раза (табл 1) Во время лечения онкобольных среднее значение момента хвоста ДНК-комет лимфоцитов увеличивалось еще в большей степени (~3.4 раза по сравнению с контролем) и статически достоверно отличалось от контроля (1=2 55, р<0.05), что, по всей видимости, является следствием лучевой терапии опухоли. Дисперсии распределения уровней разрывов ДНК в группах онкобольных и контроле статистически достоверно различаются по Р критерию Фишера.

Таблица 1. Параметры распределения уровней разрывов ДНК (момент хвоста ДНК-комет, уел ед ) лимфоцитов крови контрольных доноров, летчиков, космонавтов и онкологических больных.

Группа N Среднее ± БЕ ББ N ех 95% 1 .р

Контроль 33 8,87± 0 60 3 46 0

Летчики 41 9 46± 1 03 6 59 7 0 64 3 64 р<0 001

Космонавты 8 8 55±1 90 5 38 1 0 84 2 42

Онкобольные до лечения 18 20 15± 1 91 8 09 13 6 98 р<0 001 5 48 р<0 001

Онкобольные во время лечения 6 29 76±3 14 7 68 6 11 00 р<0 001 4 94 р<0 01

Примечание N - число обследованных людей, БЕ -стандартная ошибка, 50 -стандартная дисперсия, N ех 95% - число людей, выходящих за границ соответствующего 95% доверительного интервала контрольной группы, г -значения I-критерия Стьюдента при сравнении с контрольным распределением, /•" - значения F критерия Фишера при сравнении с дисперсией контрольного распределения

2. Повреждаемость ДНК лимфоцитов периферической крови летчиков, космонавтов и онкологических больных при дополнительном облучении in vitro

В настоящей главе представлены результаты исследования индукции двунитевых разрывов ДНК лимфоцитов периферической крови летчиков, космонавтов и онкологических больных при дополнительном воздействии у-излучения в дозе 1 Гр Для оценки уровня двунитевых разрывов ДНК использовали метод ДНК-комет Предполагается, что именно двунитевые разрывы ДНК влияют на фрагментированность ДНК, определяемую методом ДНК-комет при проведении электрофореза в нейтральных условиях (Calini et al, 2002). Выход радиоиндуцированных двунитевых разрывов ДНК для редкоионизирующего излучения может колебаться от 20 до 50 на клетку/Гр (Ward, 1988) и зависит от состояния антиоксидантных защитных систем клеток и степени конденсации хроматина (в активных областях, где доступ свободных радикалов к ДНК не лимитирован белками количество радиационных повреждений ДНК значительно выше, чем в неактивных областях) В наших предварительных исследованиях было показано, что значения момента хвоста ДНК-комет статистически достоверно (г>0 9, р<0 01) коррелирует с количеством фосфолирированного гистона Н2АХ (у-Н2АХ), то есть с количеством распознанных двунитевых разрывов ДНК

Облучение лимфоцитов крови контрольных доноров, летчиков и онкологических больных in vitro в дозе 1 Гр приводило к статистически достоверному увеличению уровня разрывов ДНК, регистрируемому методом ДНК-комет почти во всех обследованных группах за исключением группы космонавтов (рис 2)

Дополнительно проводили исследования изменений уровня гистона у-Н2АХ в лимфоцитах отдельных индивидуумов из групп контрольных доноров, а также онкологических больных до и время лечения Было показано

1 В лимфоцитах крови онкологических больных до лечения уровень гистона у-Н2АХ выше чем лимфоцитах контрольных доноров,

2 Лучевая терапия рака простаты приводит к увеличению уровня у-Н2АХ в лимфоцитах крови по сравнению с показателями до лечения,

3 Дополнительное облучение лимфоцитов крови в дозе 1 Гр вызывает увеличение уровня у-ШАХ во всех исследованных группах

В целом, результаты исследований подтверждают данные полученные помощью метода ДНК-комет

i исходным уровень

i облучение в дозе 1 Гр

140 о

I30

m 1-

§20 X II

510

......

щ____

контроль

летчики

космонавты онкобольныедо онкобольныево лечения «ремя лечения

Рис. 2. Уровни разрывов ДНК лимфоцитов крови в различных исследуемых когортах до и после облучения клеток in vitro в дозе 1 Гр. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка. *** - р<0.001, * - р < 0.05 - достоверность различий по сравнению с исходным уровнем.

Так как межгрупповые уровни исходных разрывов ДНК значительно различались, то для оценки радиоповреждаемости ДНК нами было сочтено целесообразным использование значений увеличения момента хвоста ДНК-комет после дополнительного облучения в дозе 1 Гр за вычетом значений до облучения (инкремент момента хвоста). Инкремент момента хвоста был рассчитан для каждого человека. Результаты статистического анализа полученных данных представлены в табл. 2.

Как видно из табл. 2 вариабельность уровня двунитевых разрывов ДНК вызванных облучением была высока, но не одно из значений не выходило за границы 95%-ного доверительного интервала. В группе летчиков отмечалось статически достоверное (р<0.05) увеличение повреждаемости ДНК при облучении по сравнению с контролем. Дисперсии распределения уровня двунитевых разрывов ДНК в группе летчиков и контроле после облучения в дозе 1 Гр также статистически достоверно различались по F критерию Фишера (р<0.05). Уровни радиоиндуцированных двунитевых разрывов ДНК лимфоцитов крови 9-ти летчиков выходили за верхнюю границу 95% доверительного интервала контрольного распределения. Увеличение радиоповреждаемости ДНК свидетельствует, о том, что у отдель-

ных индивидуумов полеты ведут к изменениям молекулярно-клеточных параметров, определяющих уровень первичных радиационно-индуцируемых повреждений ДНК (степень конформации хроматина, уровню экспрессии генов и концентрации эндогенных антиоксидантов, находящихся в непосредственной близости от ДНК)

Анализ данных, полученных при исследовании лимфоцитов крови космонавтов, показал отсутствие достоверных различий среднего значения уровня радиационно-индуцированных разрывов ДНК (табл 2)

Таблица 2 Значения абсолютного увеличения (инкремент) момента хвоста ДНК-комет (уел ед) лимфоцитов крови контрольных доноров, летчиков, космонавтов и онкологических больных после облучения клеток т vitro в 1 Гр за вычетом значений до облучения.

Группа N Среднее ± SE SD Nex 95% t F

Контроль 33 10 93 ±1 14 6,54 0

Летчики 41 15 93±1 53 9,78 9 2 52 р<0 05 2 24 р<0 05

Космонавты 8 9 00±3 54 10,01 1 0 67 2 34

Онкобольные до лечения 18 19 11±2 55 10,82 7 3 37 р<0 01 2 74 р<0 05

Онкобольные во время лечения б 12 99±2 56 6,28 1 071 1 08

Примечание N - число обследованных людей, БЕ -стандартная ошибка, ЯО -стандартная дисперсия, N ех 95% - число людей, выходящих за границу соответствующего 95% доверительного интервала контрольной группы, Г -значения /критерия Стьюдента при сравнении с контрольным распределением, Р - значения F критерия Фишера при сравнении с дисперсией контрольного распределения

Наиболее выраженное увеличение повреждаемости ДНК при дополнительном облучении отмечалось для онкологических больных до лечения Среднее значение инкремента момента хвоста ДНК-комет, у онкологических больных было почти в два раза статистически достоверно (р<0 001) выше по сравнению с контролем (табл 2) Помимо увеличения среднего значения инкремента момента хвоста, в группе онкологических больных отмечалось статистически достоверное (р<0 05) увеличение дисперсии

распределения уровня разрывов ДНК по сравнению с контрольным распределением (табл. 2) Уровни радиоиндуцированных двунитевых разрывов ДНК лимфоцитов крови 7-ти онкольных выходили за верхнюю границу 95% доверительного интервала контрольного распределения

Анализ данных полученных при исследовании онкологических больных после лечения не выявил изменений повреждаемости ДНК при дополнительном облучении (табл 2). Возможно, вследствие значительно меньшей статистической выборки.

Для целей практической медицины чрезвычайно важно помимо общих оценок исследуемых групп дать оценку радиочувствительности каждого конкретного индивидуума На рис 3 представлено распределение контрольных доноров, летчиков, космонавтов и онкологических больных по исходным уровням разрывов ДНК лимфоцитов и уровням разрывов ДНК после облучения клеток in vitro Пунктирными линиями показаны границы 95 % доверительного интервала для контрольной группы Такая форма представления данных позволяет нам разделить всех исследуемых индивидуумов на 4-е группы. К первой группе относятся люди с условно нормальным уровнем разрывов ДНК и условно нормальной радиоповреждаемостью ДНК. Видно, что из 33 контрольных доноров к этой группе относятся 32 человека (~ 97 %), в то время как из 41 обследованного летчика к первой группе можно отнести только 26 человек (~ 63 %). В случае космонавтов это 7 чел (~ 88 %) Для группы онкологических больных до лечения только 3 человека из 18 обследованных (~ 17 %) Для онкологических больных после лечения - 0 Вторая группа - это люди с «нормальным» исходным уровнем разрывов ДНК, но повышенной радиоповреждаемостью ДНК К этой группе относятся 9 летчиков (~ 22 %), 2 онкологических больных до лечения и один контрольный донор. Третья группа - повышенная радиоповреждаемость ДНК при повышенном исходном уровне разрывов ДНК В эту группу входят 5 летчиков (~ 12 %), один космонавт, одиннадцать онкобольных до лечения (65%) и все 6 онкобольных во время лечения И, наконец, к четвертой группе с повышенным исходным уровнем разрывов ДНК и «нормальной» радиоповреждаемостью ДНК относится 1 летчик и 2 онкобольных до лечения Для летчиков и космонавтов полученные данные могут иметь важное прогностическое значение В случае онкологических больных важно установить чувствительность каждого больного к лечению Все индивидуумы, не входящие в первую группу, а в особенности люди относящиеся к третьей группе, требуют тщательного медицинского обследования с привлечением молекулярно-биологических методов для выяснения детальных механизмов обнаруженных отклонений

сР ©

О» л

° °

«* о

♦ *ь оА

»АО

О контроль ♦ летчики А космонавты

10 15 20 25 30

Исходный момент хвоста ДНК-комет, усл. ед.

о контроль

♦ онкобольнысдо лечения а онкобольные в процессе лечения |у

Исходный момент хвоста ДНК-комег. усл. ед.

Рис. 3. Распределение контрольных доноров, летчиков и космонавтов (А), а также контрольных доноров и онкологических больных (Б) по исходным уровням разрывов ДНК лимфоцитов и уровням разрывов ДНК после облучения лимфоцитов в дозе 1Гр. Пунктирные линии - границы 95 % доверительного интервала для контрольной группы. I — норма. II -повышенная радиоповреждаемость ДНК. III - повышенная радиоповреждаемость ДНК при повышенном исходном уровне разрывов ДНК. IV -повышенный исходный уровень разрывов ДНК.

3. Эффективность репарации радационно-индуцированых двунитевых разрывов ДНК лимфоцитов периферической крови летчиков, космонавтов и онкологических больных

Для оценки клеточной радиочувствительности необходимо исследовать не только степень радиоповреждаемости наиболее критических для жизнедеятельности клеток молекулярных структур, но и эффективность репарации радиационно-индуцированных повреждений. Нами было изучена репарация двунитевых разрывов ДНК после облучения в дозе 10 Гр и инкубации клеток в полной среде при 37°С в течение 1 ч. За это время проходит быстрая фаза репарации путем негомологичной рекомбинации (Запваг, 2004). Для количественной оценки эффективности репарации рассчитывали процент остаточных, неотрепарированных к окончанию времени инкубации двунитевых разрывов ДНК.

Результаты исследований представлены на рис. 4 как среднее для групп ± стандартная ошибка и стандартное отклонение. Как видно из рис. 4 в облученных лимфоцитах контрольных доноров после 1 ч инкубации остается примерно 45 % двунитевых разрывов ДНК. Полученные данные хорошо согласуются с данными литературы (\¥озе%уос12ка ег. а1., 2002).

Рис. 4. Доля неотрепарированных двунитевых разрывов ДНК в лимфоцитах после облучения в дозе 10 Гр и инкубации клеток в полной среде при 37°С в течение 1 ч. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка.

В группе летчиков эффективность репарации двунитевых разрывов ДНК была несколько ниже, чем в контрольной группе, однако распределения статистически достоверно различаются только по двустороннему ь критерию (р=0 029), что является отражением очень высокой вариабельности в когорте летчиков Дисперсии распределений % неотрепарированных двунитевых разрывов ДНК в группе летчиков и контроле также статистически достоверно различались по Б критерию Фишера (р<0 05)

В отличие от летчиков, эффективность репарации двунитевых разрывов ДНК у космонавтов статистически достоверно не отличалась от контроля

Наиболее выраженное увеличение вариабельности эффективности репарации двунитевых разрывов ДНК отмечалось в когорте онкологических больных до лечения (Б критерий Фишера = 9 15, р<0.01)

В группе онкологических больных во время лечения вариабельность была ниже и статистически достоверных отличий от контроля не отмечалось

4. Апоптотическая гибель лимфоцитов периферической крови летчиков, космонавтов и онкологических больных

Для изучения сравнительной динамики гибели контрольных (необ-лученных) и облученных в дозе 1 Гр лимфоцитов при инкубации в полной среде in vitro использовали метод проточной цитофлуорометрии с анализом фосфатидилсерин-позитивных клеток и клеток с поврежденной мембраной Анализ полученных данных свидетельствует о высокой вариабельности динамики гибели по механизмам апоптоза и некроза необлученных и облученных in vitro лимфоцитов периферической крови разных доноров при инкубации течение 24 ч (37°С).

Обращает на себя внимание тот факт, что процент клеток гибнущих без облучения и после облучения по механизму некроза практически не отличается, в то время как облучение приводит к статистически достоверному увеличению частоты апоптотических клеток после 4 ч инкубации (рис 5 1) Причем, как показывает анализ данных, это увеличение обеспечивается в основном за счет клеток находящихся в стадии позднего апоптоза Процент облученных клеток находящихся в стадии раннего апоптоза увеличивается лишь на 24 ч

30 ■} Qранний аполтоэ_________l.A

D поздний алоптоз

8 12 16 ¿0 24 время, ч

8 20

г* 10

2.А

0 4 8 12 16 ¿0 24 время, ч

X 20

З.А

0 4

8 12 16 20 24 врем», ч

4.А

0 4 8 12 16 20 24 время, ч

* 20 ■

£ «

§ ю зе

Х.Б

■LZ'vsz,

О 4 8 12 16 20 24 время, ч

30 20 10 О

З.Б

О 4 8 12 16 20 24 время, ч

Рис. 5. Изменение относительного количества лимфоцитов, гибнущих по механизмам апоптоза и некроза при инкубации in vitro в течение 0, 2, 4 и 24 ч без дополнительного облучения (А) и после облучение в дозе 1 Гр (Б). Группы: 1 -контрольные доноры; 2 - летчики; 3 - онкобольные до лечения; 4 - онкобольные во время лечения.

В группе исследованных летчиков отмечалось значимое увеличение как спонтанной апоптотической гибели клеток при инкубации, так и частоты радиоиндуцированного апоптоза (рис 5 2) Так через 24 ч инкубации без дополнительного облучения, суммарная частота клеток в стадии позднего и раннего апоптоза составляла для летчиков 13.89±5 18 % по сравнению с 4 57±0 82 % в контроле (р<0 01) После облучения в дозе 1 Гр и инкубации в течение 24 ч частота апоптотических лимфоцитов крови летчиков составила 17.61±5 62 % против 6 13±0 68 % в контроле (р<0 01) Дисперсии процента апоптотической гибели лимфоцитов для группы летчиков и контроля также статистически достоверно различались по F критерию Фишера

Для группы онкологических больных до лечения (рис 5.3) отмечали статистически достоверное (р<0.01) увеличение частоты апоптотической гибели лимфоцитов при инкубации и увеличение дисперсии распределения (р<0 05)

Наиболее высокая частота апоптотической гибели лимфоцитов была зарегистрирована для онкобольных во время лечения (рис. 5 4) Процент апоптотических лимфоцитов составил 16 79±4 88 % (р<0.01), а после облучения и 24 ч инкубации 19 43±6 03 % (р<0 01) Характерно, что после облучения лимфоцитов онкобольных во время лечения отмечалась весьма высокая клеточная гибель по пути некроза (рис 5 4)

Интересно, что лимфоциты крови людей, чувствительных к воздействию ионизирующего излучения, также более чувствительны к условиям инкубации in vitro, о чем свидетельствует наличие статистически достоверной (р<0 05) корреляционной связи между уровнем радиационно-индуцированных двунитевых разрывов ДНК и частотой спонтанного апоптоза на 24 ч инкубации

ВЫВОДЫ

1 Показано, что в лимфоцитах летчиков по сравнению с контрольными донорами отмечается статистически достоверное увеличение индивидуальной вариабельности уровня разрывов ДНК (р<0 001), уровня двунитевых разрывов ДНК при облучении in vitro в дозе 1 Гр (р<0 05), увеличение индивидуальной вариабельности эффективности репарации двунитевых разрывов ДНК (р<0.05)

2 В группе летчиков по сравнению с контролем отмечалось значимое увеличение как апоптотической гибели лимфоцитов крови при инкубации in vitro (р<0 01), так и частоты апоптоза индуцированного дополнительным облучением в дозе 1Гр (р<0 01)

3 Исследования лимфоцитов крови космонавтов не выявили статистически достоверных изменений от контроля по всем исследованным показателям

4 У больных раком простаты до лучевого лечения отмечается высокий уровень разрывов ДНК в лимфоцитах крови (в среднем более чем в 2 раза, по сравнению с контролем, р<0.001) Лучевая терапия опухоли приводит к достоверному увеличению уровня разрывов ДНК в лимфоцитах крови (р<0 05) по сравнению их уровнями у больных до лечения

5 Показано, что уровень радиационно-индуцированных двунитевых разрывов ДНК и его индивидуальная вариабельность при облучении лимфоцитов крови больных раком простаты ш vitro статистически достоверно выше, чем у контрольных доноров (р<0 01 и р<0 05, соответственно). Вариабельность эффективности репарации двунитевых разрывов ДНК в группе онкологических больных до лечения статистически выше, чем у контрольных доноров (р<0 01) Во время проведения лучевой терапии рака простаты уровни радиационно-индуцированных двунитевых разрывов ДНК и эффективность их репарации не отличались от контроля

6 Обнаружено статистически достоверное (р<0 01) увеличение частоты апоптотической гибели лимфоцитов у онкологических больных по сравнению с контрольными донорами

7 Лучевая терапия рака простаты приводит к статистически достоверному увеличению частоты гибели лимфоцитов по пути апоптоза (р<0 05), и некроза (р<0 05) Дополнительное облучение лимфоцитов крови этих пациентов in vitro приводит к увеличению клеточной гибели в основном по пути некроза

8 Анализ радиационно-индуцированных двунитевых разрывов ДНК и частоты клеточной гибели показывают, что эти показатели могут быть маркерами индивидуальной радиочувствительности и являются адекватными и информативными тестами для обнаружения индивидуумов с повышенной радиочувствительностью

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Vorobvova N Yu. Osipov А N, Serebryanyi А М., Tsetlin V V , Pelevina 11 Influence of cosmic radiation on chromatin structure and DNA radiodamag-ing of peripheral blood lymphocytes in pilots // Abstracts of the International conference "Biological effects of low dose ionizing radiation and radioactive pollution on environment" BIORAD-2006 (February 28 - March 3, 2006, Syktyvkar, Russia) - Syktyvkar - 2006 - P. 72-73

2 Pelevina 11, Antoschina M M, Bondarenko V A, Vorobvova N.Yu. Vo-ronkov Yu.I, Gotlib V U, Kudryashova О V , Osipov A.N., Ryabchenko NI, Serebryanyi AM., Tsetlin V V. The perculianty of low dose irradiation. The possible late effects on pilots and cosmonauts // Abstract book of 4th International Workshop on Space Radiation Research and 17th Annual NASA Space Radiation Health Investigators' Workshop (June 5-9, 2006, Moscow - St Petersburg, Russia). Dubna, Russia - 2006 - P. 95-96

3 Vorobvova N Yu . Osipov A N, Pelevina 11, Serebryamy A M , Tsetlin V V Changes of chromatin structure and DNA radiodamagmg in pilots peripheral blood lymphocytes // Abstract book of the 35th Annual Meeting of the European Radiation Research Society and the 4th Annual Meeting of the Ukrainian Society for Radiation Biology (August 22-25, 2006, Kiev, Ukraine) Kiev, Ukraine. - 2006 -P 62

4 Vorobveva N Yu . Osipov A.N., Pelevma II., Serebryamy AM., Tsetlm V V Primary radiation-induced DNA damage of blood lymphocytes chromatin in cosmonauts and pilots. // Proc. of the International Free Radical Summer School 2006 (September 30 to October 6, 2006, Spetses Island, Greece) Spetses Island, Greece - 2006. - P 114.

5. Пелевина И.И, Антощина M.M , Бондаренко В А, Воробьева Н Ю , Воронков Ю И , Готлиб В Я , Кудряшова О В , Осипов А.Н, Рябченко Н И, Серебряный А М, Цетлин В В Молекулярно-генетические эффекты в лимфоцитах крови пилотов и космонавтов результаты исследования отдельных индивидуумов // III Международный симпозиум, посвященный 100-летию со дня рождения академика Н М Сисакяна «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии» (24-28 января 2007 г., Москва-Дубна)-Аннотации докладов -Дубна ОИЯИ. 2007 -С. 132-133. 6 Пелевина И И , Антощина М М, Бондаренко В А, Воробьева Н Ю . Воронков Ю И , Готлиб В Я., Кудряшова О В , Осипов А Н, Рябченко Н И, Серебряный А М, Цетлин В В Индивидуальные цитогенетические и молекулярно-биологические особенности лимфоцитов крови летчиков и космонавтов // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2007 - Т 47 -№2 -С 141-150

7. Воробьева Н.Ю . Осипов А.Н, Пелевина И И Чувствительность лимфоцитов периферической крови летчиков и космонавтов к воздействию у-излучения. индукция двунитевых разрывов ДНК. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 2007 - Т 144 - № 10 -С 404407

Заказ X» 547. Объем 1 п.л Тираж 100 эю

Отпечатано в ООО «Петроруш» г. Москва, у л Палиха-2а, те т. 250-92-06 www postator.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Воробьева, Наталья Юрьевна

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Вариабельность чувствительности человека к воздействию ионизирующего излучения.

1.2.Изменение клеточной радиочувствительности после облучения в малых дозах.

1.3. Индукция и репарация двунитевых разрывов ДНК.

1.4. Роль фосфорилирования гистона Н2АХ в репарации двунитевых разрывов ДНК.

1.5. Использование метод ДНК-комет для оценки уровня повреждений ДНК и эффективности их репарации.

1 .б.Фосфатидилсерин как маркер клеточной гибели по механизму апоптоза.

2. Материалы и методы исследования.

3. Результаты и обсуждение.

3.1. Уровень разрывов ДНК лимфоцитов периферической крови.

3.1.1. Результаты исследования летчиков и космонавтов.

3.1.2. Результаты исследования онкологических больных.

3.2. Двунитевые разрывы ДНК, индуцированные облучением in vitro в лимфоцитах крови и эффективность их репарации.

3.2.1.Радиационно-индуцированные двунитевые разрывы ДНК лимфоцитов периферической крови при облучении in vitro.

3.2.1.1. Результаты исследования летчиков и космонавтов.

3.2.1.2. Результаты исследования онкологических больных.

3.2.2.Эффективность репарации радационно-индуцированых двунитевых разрывов ДНК.

3.3. Анализ гибели лимфоцитов периферической крови.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярные и клеточные маркеры индивидуальной чувствительности человека к воздействию ионизирующего излучения"

Актуальность проблемы. В настоящее время человек часто подвергается воздействию радиации (совместно с другими агентами) в малых дозах, которые могут изменить радиочувствительность организма в сторону: снижение радичувствительности (адаптивный ответ) и ее увеличение. Следует учитывать и малоизученные виды комплексного воздействия на организм - так, в последние десятилетия резко увеличилось число полетов на больших высотах, где человек подвергается воздействию целого ряда неблагоприятных факторов: космическое излучение, перегрузки, вибрация, гиподинамия, стресс и др. Результаты многочисленных медико-биологических исследований свидетельствуют о том, что подобные комплексные воздействия приводят к увеличению частоты цитогенетических нарушений (Нетегэ, 2000), заболеваниям опухолевого (Вица е1 а1., 2005) и неопухолевого генеза (вгозг е1 а1., 2007), изменениям уровня повреждений генома и чувствительности клеток к дополнительным воздействиям Эти изменения являются предпосылками для развития нестабильности генома (2Ьа е1 а1., 2007). Однако, как правило, оценивается лишь принципиальная возможность возникновения генотоксических эффектов путем сравнения средних показателей исследуемых групп с контролем. Анализ вариабельности индивидуальных различий отдельных лиц в большинстве исследований не проводится, в то время как их радиочувствительность может различаться в десятки раз.

С другой стороны для лечения онкологических заболеваний человека часто используется лучевая терапия, где опухоли подвергают локальному облучению в высоких дозах. Известно, что чувствительность опухолей одного и того же типа к облучению у различных индивидуумов существенно различается (Пелевина и др., 2006). Также резко различается последствия лучевой терапии для организма при облучении опухолей в сходных дозах (Pinar et al., 2007). Поэтому при онкологических заболеваниях также чрезвычайно важно определять индивидуальную реакцию на радиационное воздействие.

Так как радиочувствительность организма связана главным образом со способностью клеточных систем: 1) предотвращать возникновение повреждений ДНК; 2) репарировать индуцированные радиацией повреждения ДНК; 3) эффективно элиминировать клетки, в которых репарация повреждений ДНК невозможна (запуск апоптоза), то в настоящей работе были изучены основные компоненты, определяющие клеточную радиочувствительность.

Были поставлены следующие задачи исследования:

• на лимфоцитах периферической крови контрольных доноров, летчиков, космонавтов и онкологических больных:

1. Оценить уровень разрывов ДНК и повреждаемость ДНК при дополнительном облучении клеток в условиях in vitro\

2. Изучить эффективность репарации двунитевых разрывов ДНК и ее индивидуальную вариабельность;

3. Сравнить динамику клеточной гибели (апоптоз, некроз);

4. У онкологических больных до и во время проведения курса лучевой терапии исследовать уровень разрывов ДНК, повреждаемость ДНК при дополнительном облучении клеток в условиях in vitro, эффективность репарации двунитевых разрывов ДНК и гибель клеток по механизмам апоптоза и некроза;

5. Сопоставить информативность изученных показателей для характеристики индивидуальной реакции.

Положения, выносимые на защиту:

2. У онкологических больных (рак простаты) до лучевой терапии в лимфоцитах крови отмечается повышение уровня разрывов ДНК, увеличение повреждаемости ДНК при дополнительном облучении клеток в условиях in vitro и доли гибнущих клеток. В процессе лучевой терапии рака простаты увеличивается уровень разрывов

ДНК лимфоцитов крови и частота их гибели.

3. Использованный в работе комплекс клеточно-молекулярных методов и подходов позволяет дать адекватную оценку индивидуальной радиочувствительности человека и ее вариабельности.

Научная новизна. Впервые на лимфоцитах крови контрольных доноров, летчиков, космонавтов проведено исследование исходного уровня разрывов ДНК, выхода двунитевых разрывов ДНК при дополнительном облучении клеток в условиях in vitro, эффективности их репарации и динамика гибели клеток (ранний и поздний апоптоз, некроз) при инкубации в условиях in vitro.

Впервые на лимфоцитах крови больных раком простаты до и в процессе лучевой терапии изучено изменение уровня разрывов ДНК, повреждаемости ДНК при дополнительном облучении клеток в условиях in vitro, эффективности репарации двунитевых разрывов ДНК и динамика клеточной гибели (ранний и поздний апоптоз, некроз) при инкубации в условиях in vitro.

Научно-практическая ценность работы. Результаты работы могут быть использованы: в радиационной биологии для определения различий в индивидуальной реакции на облучение; в медицине и космической биологии для выявления у пилотов и космонавтов ранних признаков необходимости прекращения полетов; в медицине для прогнозирования эффективности и последствий лучевого лечения онкологических заболеваний.

Личный вклад диссертанта. Представленная работа является частью исследований, проведенных лабораторией радиационной биофизики и экологии ИХФ РАН с личным вкладом диссертанта, в получение представленных в работе материалов не менее 70 %. Автор самостоятельно осуществляла постановку и проведение исследований, первичную обработку и анализ полученных данных, формулировала положения и выводы работы.

Апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на Международной конференции БИОРАД-2006 «Биологические эффекты радиации и радиоактивное загрязнение среды» (Сыктывкар, 2006); 4th International Workshop on Space Radiation Research and 17th Annual NASA Space Radiation Health Investigators' Workshop (Moscow - St. Petersburg, Russia, 2006); 35th Annual Meeting of the European Radiation Research Society and the 4th Annual Meeting of the Ukrainian Society for Radiation Biology (Kiev, Ukraine, 2006); International Free Radical Summer School 2006 (Spetses Island, Greece, 2006); III Международном симпозиуме «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии» (Москва-Дубна, 2007).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 2 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Заключение Диссертация по теме "Радиобиология", Воробьева, Наталья Юрьевна

выводы

1. Показано, что в лимфоцитах летчиков по сравнению с контрольными донорами отмечается статистически достоверное увеличение индивидуальной вариабельности уровня разрывов ДНК (р<0.001), уровня двунитевых разрывов ДНК при облучении in vitro в дозе 1 Гр (р<0.05), увеличение индивидуальной вариабельности эффективности репарации двунитевых разрывов ДНК (р<0.05).

2. В группе летчиков по сравнению с контролем отмечалось значимое увеличение как апоптотической гибели лимфоцитов крови при инкубации in vitro (р<0.01), так и частоты апоптоза индуцированного дополнительным облучением в дозе 1Гр (р<0.01).

3. Исследования лимфоцитов крови космонавтов не выявили статистически достоверных изменений от контроля по всем исследованным показателям.

4. У больных раком простаты до лучевого лечения отмечается высокий уровень разрывов ДНК в лимфоцитах крови (в среднем более чем в 2 раза, по сравнению с контролем, р<0.001). Лучевая терапия опухоли приводит к достоверному увеличению уровня разрывов ДНК в лимфоцитах крови (р<0.05) по сравнению их уровнями у больных до лечения.

5. Показано, что уровень радиационно-индуцированных двунитевых разрывов ДНК и его индивидуальная вариабельность при облучении лимфоцитов крови больных раком простаты in vitro статистически достоверно выше, чем у контрольных доноров (р<0.01 и р<0.05, соответственно). Вариабельность эффективности репарации двунитевых разрывов ДНК в группе онкологических больных до лечения статистически выше, чем у контрольных доноров (р<0.01). Во время проведения лучевой терапии рака простаты уровни радиационно-индуцированных двунитевых разрывов ДНК и эффективность их репарации не отличались от контроля.

6. Обнаружено статистически достоверное (р<0.01) увеличение частоты апоптотической гибели лимфоцитов у онкологических больных по сравнению с контрольными донорами.

7. Лучевая терапия рака простаты приводит к статистически достоверному увеличению частоты гибели лимфоцитов по пути апоптоза (р<0.05), и некроза (р<0.05). Дополнительное облучение лимфоцитов крови этих пациентов in vitro приводит к увеличению клеточной гибели в основном по пути некроза.

8. Анализ радиационно-индуцированных двунитевых разрывов ДНК и частоты клеточной гибели показывают, что эти показатели могут быть маркерами индивидуальной радиочувствительности и являются адекватными и информативными тестами для обнаружения индивидуумов с повышенной радиочувствительностью.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты проведенных исследований, свидетельствуют о том, что профессиональные воздействия (условия полетов) приводят к увеличению у летчиков вариабельности по всем изученным показателям и статистически достоверному увеличению чувствительности лимфоциты крови к воздействию облучения in vitro. Однако исследования небольшой группы исследованных космонавтов не выявили подобных закономерностей. Отсутствие зависимости между выраженностью наблюдаемых эффектов и продолжительностью и высотой полетов свидетельствует об индивидуальном (разнонаправленном) характере реакции организма на внешние воздействия.

Исследования больных раком простаты показали, что спонтанный уровень двунитевых разрывов ДНК, которые определяли методом ДНК-комет и с помощью анализа фосфорилированного гистона Н2АХ, повышен у больных до лечения по сравнению со здоровыми донорами. Поврежденность ДНК лимфоцитов в процессе лучевой терапии еще более возрастает. У онкологических больных до лечения отмечается повышенная чувствительность лимфоцитов крови к облучению in vitro. Эффективность репарации двунитевых разрывов ДНК лимфоцитов до и во время лечения различаются не существенно. Обнаружено возрастание доли лимфоцитов в стадии раннего апоптоза у онкологических больных до лечения (по сравнению со здоровыми донорами) и значительное возрастание доли клеток, гибнущих как по пути апоптоза, так и некроза во время курса лучевой терапии и дополнительного облучения in vitro. Можно полагать, что наблюдаемые у большинства онкологических больных увеличение поврежденности генома лимфоцитов при лечении и повышение доли гибнущих клеток являются прогностическими показателями для оценки последствий лучевой терапии.

Особенно следует отметить, что частота всех изученных молекулярно-биологических и цитогенетических показателей сильно варьирует у отдельных индивидуумов. Как следствие характеристика по средним значениям на группу не является информативной, не позволяет выделить людей с высокой чувствительностью к облучению.

В целом, проведенные исследования показали, что использованные клеточные и молекулярные маркеры (уровень исходных и индуцированных облучением in vitro двунитевых разрывов ДНК, эффективность их репарации, клеточная гибель) позволяют судить о состоянии лимфоцитов крови и их чувствительности к воздействию ионизирующего излучения у отдельных индивидуумов. Метод ДНК-комет можно рекомендовать как базовую методику для выявления индивидуумов с повышенной чувствительностью к условиям полета и к дополнительным радиационным нагрузкам.

Предполагается, что на основании данных о чувствительности к тест-нагрузкам ex vivo таких клеток-«маркеров состояния организма» как лимфоциты крови можно оценить не только индивидуальную радиочувствительность, но и выявить те или иные нарушения у каждого конкретного человека, которые могут быть ранними показателями риска возникновения разных заболеваний, включая злокачественные опухоли.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Воробьева, Наталья Юрьевна, Москва

1. Жестяников В.Д. Репарация ДНК и ее биологическое значение. Л., 1979. 285 с.

2. И.И. Пелевина, В.Я. Готлиб, A.A. Конрадов. 20 лет изучения последствий Чернобыльской аварии это много или мало для оценки их характера и масштабов. // Радиац. биология. Радиоэкология. 2006. Т. 46. № 2. С. 240-248.

3. Канцерогенез под редакцией Д. Г. Заридзе.- М.: Медицина, 2004.576 с.

4. Митрикас В.Г., Цетлин В.В. Проблемы обеспечения радиационного контроля на ОПС Мир в 22-м цикле солнечной активности // Космич. исслед. 2000. Т. 38. Вып. 2. С. 121-126.

5. Пелевина И. И., Алещенко А. В., Антощина M. М., Готлиб В. Я., Кудряшова О. В., Семенова Л. П., Серебряный А. М. Реакция популяции клеток на облучение в малых дозах // Радиационная биология. Радиоэкология. 2003. Т. 43. N 2. С. 161-166.

6. Пелевина И.И., A.B. Алещенко, В.Я. Готлиб, О.В. Кудряшова, Л.Е. Курнешова, Л.А. Носкин, Л.П. Семенова, A.M. Серебряный

7. Цитогенетические повреждения, радиочувствительность и адаптивный ответ у детей, проживающих в разных районах Москвы. // Радиац. биология. Радиоэкология. 2004. Т. 44. № 3. С. 278-282

8. Самуилов В. Д., Олескин A.B., Лагунова Е. М. 2000. Биохимия 65: 10291046

9. Серебряный A.M., A.B. Алещенко, В.Я Готлиб, О.В. Кудряшова, Л.П. Семенова, И.И. Пелевина О реакции клеточной популяции на облучение в малых дозах. // Радиац. биология. Радиоэкология. 2007. Т.47.№1. С. 93-99.

10. Н.Серебряный A.M., Алещенко A.B., Готлиб В.Я., Кудряшова О.В., Семенова Л.П., Пелевина И.И. Клеточный состав популяции лимфоцитов и радиационный адаптивный ответ. // Цитология. 2003. Т. 45. № 1.С. 81-85.

11. Сойфер В.Н. Репарация генетических повреждений // Сорос, образ, журнал. 1997. №8. С. 4-13.

12. Спитковский Д. М. Концепция действия малых доз ионизирующих излучений на клетки и ее возможное приложение к трактовке медико-биологических последствий аварии на ЧАЭС // Радиационная биология. Радиоэкология. 1992. Т. 32. .Вып. 3. С. 199-209.

13. П.Тарасов В. А. Молекулярные механизмы репарации и мутагенеза. М., Наука. 1982. стр. 11-19.

14. Andree H. A., Reutelingsperger C. P. M., Hauptmann R., Hemker H. C., Hermenes W. T., Williams G. M. Binding of vascular anticoagulant alpha (VAC alpha) to planar phospholipid bilayers. // J. Biol. Chem. 1990. 265: 4923-4928.

15. Andree H. A., Stuart M. C., Hermens W.T., Reutelingsperger С. P. M., Hemker H. C., Frederic P. M. Clustering of lipid- bound annexin V may explain its anticoagulant effect. // J. Biol. Chem. 1992 267: 17907-17912.

16. Balasubramaniam, U., and N.L. Oleinick. Preferential crosslinking of matrix-attachment region (MAR)-containing DNA fragments to the isolated nuclear matrix by ionizing radiation. // Biochemistry. 1995.34:12790-12802.

17. Barquinero J.F., Barrios L., Caballin M.R., Miro R., Ribas M., Subias A. and Egozcue J. Occupational exposure to radiation induces an adaptive response in human lymphocytes // Int. J. Radiat. Biol. 1995. 67:187-191.

18. Beckman, K.B., and B.N. Ames. Oxidative decay of DNA. // Journal of Biological Chemistry. 1997.272:19633-19636.

19. Belyaev I.Y. Harms- Ringdahl M A simple and sensitive pulsed field gel electrophoresis protocol to study 50 Kb apoptotic DNA fragmentation in human lymphocytes. // Radiats. Biol., Radiecol. 2002. 42:279-283.

20. Benton ER, Benton EV.Space radiation dosimetry in low-Earth orbit and beyond.

21. Bernardi P., Brockemeir K. M., Pfeiffer D. R. Recent progress on regulation of the mitochondrial permeability transtion pore: a cyclosporin-sensitive pore in the inner mitochondrial membrane// J. Bioenerg. Biomembr. 1994.-V. 26.- P. 509-517.

22. Billen D. Spontaneous DNA Damage and Its Significance for the "Negligible Dose" Controversy in Radiation Protection // Radiat. Res. 1990. V. 124. P. 242-245.

23. Bosi A., and Olivieri G. Variability of the adaptive response to ionizing radiation in humans. // Mutat. Res. 1989. 211,13-17.

24. Budd R. C. Death receptors couple to both cell proliferation and apoptosis, 2002. //J. Clin. Invest. Vol.109 №4.-P. 437-442.

25. Bunch, R.T., D.A. Gewirtz, and L.R. Povirk. A combined alkaline unwinding/Southern blotting assay for measuring low levels of cellular DNA breakage within specific genomic regions. // Oncology Research. 1992. 3:715. Buja et al., 2005

26. Cai L.and.Liu S.Z. Induction of cytogenetic adaptive response of somatic and germ cells in vivo and in vitro by low dose X-irradiation // Int. J. Radiat. Biol., 1990. 58,187-194.

27. Calini V, Urani C, Camatini M. Comet assay evaluation of DNA single- and double-strand breaks induction and repair in C3H10T1/2 cells. // Cell Biol Toxicol. 2002;18(6):369-79.

28. Castedo M., Hirsch T., Susin S.A., Zamzami N., Marchetti P., Macho A., Celeste A,Fernandez-Capetillo O, Kruhlak MJ, Pilch DR, Staudt DW, Lee A,

29. Bonner RF, Bonner WM, Nussenzweig A. 2003.Histone H2AX phosphorylation is dispensable for the initial recognition of DNA breaks. Nat. Cell Biol. 1996. 5: 675-679.

30. Cavallo D, Marinaccio A, Perniconi B, Tomao P, Pecoriello V, Moccaldi R, Iavicoli S. Chromosomal aberrations in long-haul air crew members. Mutat Res. 2002 Jan 15;513(l-2):ll-5

31. Cell Cycle. 2007 Mar 1;6(5):606-11. Luger K., Richmond T. J. The histon tails of the nucleosome. // Curr. Opin. Genet. Dev. 1998.8:140-146.

32. Champion A. R., Hanson J. A., Court J.B. and Venables S. E. The micronucleus assay: an evaluation of its use in determining radiosensitivity in vitro.//Mutagenesis. 1995.10:203-208.

33. Chang H.Y., Yang X. Proteases for cell suicide: functions and regulation of caspases. // Microbiol. And Mol. Biol. Rev. 2000.- V.64:4.- P. 821-846.

34. Chin, S.M., L.Y. Xue, L.R. Friedman, and N.L. Oleinick. 1995. Differential dependence on chromatin structure for copper and iron ion induction of DNA double-strand breaks. //Biochemistry. 1995. 34:2653-2661.

35. Chinnaiyan A.M. The apoptosome: heart and soul of the cell death machine //Neoplasia 1999. V.l.P-5-15.

36. Chiu S. M., Oleinick N. L., Friedman L. R., Stambrook P. J. Hypersensitivity of DNA in transcriptionally active chromatin to ionizing radiation. // Biochim Biophys Acta. 1982. V. 699(1). P. 15-21.

37. Chiu S.M., Friedman L.R., Sokany N.M., Xue L.Y. Nuclear matrix proteins are crosslinked to transcriptionally active gene sequences by ionizing radiation. //Radiat. Res. 1986a. V.107. P. 24-28.

38. Chiu, S.M., L.Y. Xue, L.R. Friedman, and N.L. Oleinick. 1993. Copper-ion-mediated sensitization of nuclear matrix attachment sites to ionizing radiation. // Biochemistry 1993. 32:6214-6219.

39. Chiu, S.M., L.Y. Xue, L.R. Friedman, and N.L. Oleinick. Chromatin compaction and the efficiency of formation of DNA-protein crosslinks in y-irradiated mammalian cells.//Radiation Research. 1992. 129:184-191.

40. Chowdhury D., M. C. Keogh, H. Ishii, C.L. Peterson, S. Buratowski, J. Liebermann. y-H2AX dephosphorilation by protein phosphotase 2A facilitates DNA double-strand break repair. // Mol. Cell 2005. 20: 801-809.

41. Combs GF Jr. Impact of selenium and cancer-prevention findings on the nutrition-health paradigm. // Nutr Cancer. 2001;40(1):6-11.

42. Cornetta T., Festa F., Testa A., Cozzi R. DNA damage repair and genetic polymorphisms: Assessment of individual sensitivity and repair capacity. // International Journal of Radiation Oncology. 2006. 66:537-545.

43. Cortes F, Dominguez I, Mateos S, Pinero J, Mateos JC. Evidence for an adaptive response to radiation damage in plant cells conditioned with X-rays or incorporated tritium. // Int J Radiat Biol, 1990;57(3):537-41

44. Di Giorgio M., Mingazzini P, Sammartino P, Canavese A, Arnone P, Scarpini M. Host defense and survival in patients with lung carcinoma. // Cancer. 2000. 89(10):2038-45.

45. DiTullio R.A. Jr, Mochan T.A., Venere M, Bartkova J, Sehested M,Bartek J, Halazonetis T. D. 53BP1 functions in an ATM dependent checkpoint pathway that is constitutively activated in human cancer. // Nature Cell Biology 2002 4:998-1002

46. Dizdaroglu M., M.L. Dirksen, H. Jiang, and J.H. Robbins. Ionizing-radiation-induced damage in the DNA of cultured human cells. Identification of 8, 5-cyclo-2-deoxyguanosine. // Biochemistry Journal. 1987. 241: 929-932.

47. Dizdaroglu, M. Oxidative damage to DNA in mammalian chromatin. // Mutation Research. 1992. 275:331-342.

48. Downs J.A., Lowndes, Jackson S.P. A role for Saccharomyces cerevisiae histoneH2A in DNA repair.//Nature. 2000.408: 1001-1004.

49. Duffaud F, Orsiere T, Villani P, Pelissier A.L, Volot F, Favre R & Botta A. Comparison between micronucleated lymphocyte rates observed in healthy subjects and cancer patients. // Mutagenesis, 1997. 12: 227-231

50. Dundr M., Hoffmann- Rohrer U., Hu Q et al. A kinetic framework for a mammalian RNA polymerase in vivo. // Science. 2002. 298: 1623-1626.

51. Eastham A.M. Atkinson J, West C.M. Relationships between clonogenic cell survival, DNA damage and chromosomal radiosensitivity in nine human cervix carcinoma cell liner.// Int J Radiat Biol. 2001 Mar;77(3):295-302.

52. Eastham A.M., Marples B., Kittle A.E., Orton C. J., West C. M Fibroblas radiosensetivity measured using the comet DNA-damage assay correlates with clonogenic survival parameters. //Br. J. Cancer. 2001. 79:1366-71

53. Elia, M.C., and M.O. Bradley. Influence of chromatin structure on the induction of DNA double strand breaks by ionizing radiation. // Cancer Research. 1992. 52:1580-1586.

54. Esmon T.C. Cell mediated events that control blood coagulation and vascular injury. // Ann. Rev. Cell Biol. 1993. 9: 1-26.

55. Esposito RD, Durante M, Gialanella G, Grossi G, Pugliese M, Scampoli P, Jones TD. On the radiosensitivity of man in space. // Adv Space Res. 2001;27(2):345-54.

56. Fadok VA., Voelker D. R., Campbell P. A., Cohen J.J., Bratton D.L. Henson P. M. Exposure of phosphotidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognitin and removal by macrophages. // J. Immunol. 1992.148:2207-2216.

57. Fairbairn, D. W.; Olive, P. L. and O' Neil, K. L.: The comet assay: a comprehensive reveiw. // Mutation Res. 1995. 339: 37-59.

58. Farooqi, Z., Kesavan PC. Low-dose radiation-induced adaptive response in bone marrow cells of mice // Mutat. Res., 1993. 302, 83-89.

59. Felsenfeld G. Groudine M. Controlling the double helix. // Nature. 2003. 421:448-453.

60. Fink M Imholz D., Thoma F. Contribution of the Serine 139 of histone H2A to chromatin structure. // Mol Cell Biol. 2006. 27: 3589-3600.

61. Flores M.J., Pinero J., Ortiz T., Pastor N., Mateos J.C. and Cortes F. Both bovine and rabbit lymphocytes conditioned with hydrogen peroxide show an adaptive response to radiation damage // Mutat. Res., 1996. 372, 9-15.

62. Fortune J. M., Osheroff N. Topoisomerase II as a target for anticancer drugs: when enzymes stop being nice. // Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 2000. 6: 221-253.

63. Franco S., Gostissa M., Zha S. et al. H2AX prevents DNA breaks from progressing to chromosome breaks and translocations. // Mol. Cell. 2006. 21:201-214

64. Frenzilli G, Betti C, Davini T, Desideri M, Fornai E, Giannessi L, Maggiorelli F, Paoletti P, Barale R Evaluation of DNA damage in leukocytes of ex-smokers by single cell gel electrophoresis. Mutat Res. 1997 Apr 29; 375(2): 117-23.

65. Gajewski, E., G. Rao, Z. Nackerdien, and M. Dizdaroglu. Modification of DNA bases in mammalian chromatin by radiation-generated free radicals. // Biochemistry 1990. 29:7876-7882.

66. Ganguly BB. Cell division, chromosomal damage and micronucleus formation in peripheral lymphocytes of healthy donors: related to donor's age. // Mutation Research, 1993. 295: 135-148.

67. Goodhead DT. Initial events in the cellular effects of ionizing radiation: clustered damage in DNA. // Int J Rad Biol. 1994. V. 65 P.7-17

68. Goodhead, D.T. The initial physical damage produced by ionizing radiations. // International Journal of Radiation Biology. 1989. 56:623-634.

69. Gottlieb E., Armour SM, Harris MH, Thompson CB. Mitochondrial membrane potential regulates matrix configuration and cytochrome c release during apoptosis. // Cell Death and Differentiation. 2003 V.10, 709-717

70. Gourabi H., and Mozdarani H. A cytokinesis-blocked micronucleus study of the radioadaptive response of lymphocytes of individuals occupationally exposed to chronic doses of radiation // Mutagenesis. 1998. 13. 475-480.

71. Grôsz A, Toth E, Péter I. A 10-year follow-up of ischemic heart disease risk factors in military pilots. // Mil Med. 2007 Feb;172(2):214-219.

72. Hain J., Jaussi R., and Burkart W. Lack of adaptive response to low doses of ionizing radiation in human lymphocytes from five different donors. // Mutat. Res. 1992.283.137-144.

73. Hansen, J. C., Tse C., Wolffe. Structure and functions of the core histone N-termini: more than meets the eye. // Biochemistry. 1998. 37:17637-17641.

74. Heimers A. Chromosome aberration analysis in Concorde pilots. // Mutat Res. 2000 May 8;467(2): 169-76.

75. Holley, W.R., and A. Chatterjee. Clusters of DNA damage induced by ionizing radiation: Formation of short DNA fragments. 1. Theoretical modelling.//Radiation Research. 1996.145:188-199.

76. Homburg C. H. E., Dehaas M., Vondemborne A. E. G.K., Verhoeven A. J., Roos D. Human neutrophils lose their surface Fc gamma RIII and acquir annexin V binding sites during apoptosis in vitro. // Blood. 1995. 85: 532540.

77. Hu W.H., Johnson H., Shu H.B. Activation of NF-kappa B By FADD, Casper and caspase-8. // J. Biol. Chem. 2000.-V. 27. -10838 10844

78. Hutchinson, F. Chemical changes indused in DNA by ionizing radiation. // Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 1985; 32:115-154.

79. Iavicoli S, Marinaccio A, Perniconi B, Palmi S, Cavallo D.Study of the genotoxic effects of exposure to cosmic radiation in flight personnel using cytogenetic and molecular techniques.Med Lav. 2003 Mar-Apr;94(2): 192-9. Italian.

80. Ikushima T. Chromosomal responses to ionizing radiation reminiscent of an adaptive response in cultured Chinese hamster cells // Mutation Research. 1987. V. 180. No 2. 215-221.

81. Ikushima T. Radioadaptive response: characterization of a cytogenetic repair induced by low-level ionizing radiation in cultured Chinese hamster cells // Mutation Research 1989. V. 227. No 4. 241-246.

82. Ikushima, T. Radioadaptive response: a novel chromosomal response in Chinese hamster cells in vitro // In: Chromosomal Aberrations, Basic and applied aspects, 1989b. G. Obe and AT. Natarajan eds. Springer-Verlag, Berlin. P. 151-161.

83. Ikusshima T. Radioadaptive Response: Responses to the Five Questions. // BELLE Newsletter 1999. Vol. 7. No. 3. P. 15-20.

84. Ishii K.and Watanabe M. Participation of gap-junctional cell communication on the adaptive response in human cells induced by low dose of X-rays // Int. J. Radiat. Biol. 1996. 69: 291-299.

85. Jeggo P.A., Taccioli G.E., and Jackson S.P. Manage a trios: double strand break repair, V(D)J recombination and DNA-PK. // BioAssays 1995. 17:949-957.

86. Jorgensen, T.J. and Shiloh Y. The ATM gene and the Radiobiology of ataxia telangiectasia. // International Journal of Radiation Biology. 1996. 69:527-537.

87. Kadhim MA, Moore SR, Goodwin EH. Interrelationships amongst radiation-induced genomic instability, bystander effects, and the adaptive response. // Mutat Res. 2004 Dec 2;568(l):21-32.

88. Kaiina I, Nemethovä G. Variability of the adaptive response to low dose radiation in peripheral blood lymphocytes of twins and unrelated donors. // Folia Biol (Praha). 1997;43(2):91-5.

89. Kao G. D., Mckenna W. G., Guenther M.G., Muschel R.J., Lazar M. A.,Yen T. J. Histone deacetylase 4 interacts with 53BPlto mediate the DNA damage response. // Journal of Cell Biology. 2003. 160; 1017-1027

90. Kimura H., Sugaya K., Cook P.R. The transcription cycle of RNA polymerase II in living cells. // J. Cell Biol 2002. 159:777-782.

91. Kolodner RD, Putnam CD, Myung K. Maintenance of genome stability in Saccharomyces cerevisiae. // Science. 2002. 297:552-57.

92. Koopman G., Reutelingsperger C. P. M., Kuijten G.A.M., Keehnen R.M.J., Pals S.T., Vanoers M.H.J. AnnexinV for flow cytometric detection of phosphotidylserin expression on B cells underdoing apoptosis. // Blood 1994. 84: 1415-1420,

93. Kruhlak, M. J.,Celeste A., Dellaire G et al. Changes in chromatin structure and mobility in living cells at sites of DNA double- strand breaks. // J Cell Biol. 2006.172:823-834.

94. Kuhne M., Riballo E., Rief N., Rothkamm K., Jeggo P. A., Lobrich M. A double-strand break repair defect in ATM-deficient cell contributes to radiosensitivity. // Cancer Research . 200464: 500-508.

95. Leatherbarrow E. L., Harper J. V., Cucinotta F. A., O Neil P. Induction and quantitation of gamma- H2AX foci following low and high LET-irradiation. // International Journal of Radiation Biology. 2006. 82: 111- 118.

96. Lee T.K., Allison R. R., O Brian K. F., Dobbs L. J. Lymphocyte radiosensitivity correlated with pelvic radiotherapy morbidity. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 2003. 57:222- 229.

97. Léonard A, Léonard ED, Gerber GB, Crutzen-Fayt MC, Richard F, Gueulette JG, Akhmatullina NB. No evidence for radiation-induced clastogenic factors after in vitro or in vivo exposure of human blood. // Mutat Res. 1998 Dec 3;420(l-3):33-6.

98. Limoli CL, Ponnaiya B, Corcoran JJ, Giedzinski E, Kaplan MI, Hartmann A, Morgan WF. Genomic instability induced by high and low LET ionizing radiation. //Adv Space Res. 2000;25(10):2107-17.

99. Little, J.B., H. Nagasawa, T. Pfenning, and H. Vetrovs. Radiation-induced genomic instability: delayed mutagenic and cytogenetic effects of X-rays and alpha particles. // Radiation Research 1997.148:299-307.

100. Liu S.Z., Cai L., Sun S.Q. Induction of a cytogenetic adaptive response by exposure of rabbits to very low dose-rate gamma-radiation // Int. J. Radiat. Biol., 1992. 62,187-90.

101. Live PL, Wlodek D, Durand RE, Banath JP. Factors influencing DNA migration from individual cells subjected to gel electrophoresis. //Exp Cell Res 1992. 198:259-267.

102. Ljungman M. The influence of chromatin structure on the frequency of radiation-induced DNA strand breaks: a study using nuclear and nucleoid monolayers.//Radiation Research. 1991. 126:58-64.

103. Lobrich, M, P.K. Cooper, and B. Rydberg. Non-random distribution of DNA double-strand breaks induced by particle irradiation. // International Journal of Radiation Biology. 1996. 70:493-503.

104. Loignon M, Amrein L, Dunn M, Aloyz R. XRCC3 depletion induces spontaneous DNA breaks and p53-dependent cell death.

105. Lockett KL, Hall MC, Clark PE, Chuang SC, Robinson B, Lin HY, Su LJ, Hu JJ. DNA damage levels in prostate cancer cases and controls. Carcinogenesis. 20061. Jun; 27(6): 1187-93.

106. MacPhail S.H., Banath J. P., Yu T.Y., Chu E.H., Lambur H., Olive P. L. Expression of phosphorylated histone H2AX in cultured cell lines following exposure to X-rays. // International Journal of Radiation Biology. 2003. 79: 351-358.

107. Malyapa, R.S., W.D. Wright, and J.L. Roti Roti. DNA supercoiling changes and nucleoid protein composition in a group of L5178Y cells of varying radiosensitivity. // Radiation Research 1996.145:239-242.

108. Malyapa, R.S., W.D. Wright, and J.L. Roti Roti. Radiosensitivity correlates with changes in DNA supercoiling and nucleoid protein content incells of three Chinese hamster cell lines. // Radiation Research. 1994.14:312320.

109. Markova E., Schultz N., Belyaev. I. Kinetics and dose-response of residual 53BPl/y-H2AX foci: co-localization, relationship with DSB repair and clonogenic survival. // Int. J. Radiat. Biol. 2007. Vol. 83. №5. 319-329.

110. Matsumoto H, Takahashi A, Ohnishi T. Radiation-induced adaptive responses and bystander effects. // Biol Sci Space. 2004 Dec;18(4):247-54.

111. McKelvey-Martin, V. J.; Green, M. H. L.; Schmerzer, P., Pool-Zobel, B.L.; DeMeo, M. P. and Collins, A. The single cell gel electrophoresis assay (comet assay): A European reveiw. // Mutat. Res. 1993: 288: 47-63.

112. Meyn, M.S. Ataxia telangiectasia and cellular responses to DNA damage. //Cancer Research 1995. 55:5991-6001.

113. Mitricas VG, Tsetlin VV, Teltsov MV, Shumshurov VI. Radiation dose measurements aboard the Mir using the R-16 instrument. // Radiat Meas. 2002 Oct;35(5):515-25.

114. Miyashita T, Krajewski S, Krajewska M, Wang HG, Lin HK, Liebermann DA, Hoffman B, Reed JC. Tumor suppressor p53 is a regulator of bcl-2 and bax gene expression in vitro and in vivo. // Oncogene. 1994 Jun;9(6):1799-805.

115. Miyashita T, Reed JC. Tumor suppressor p53 is a direct transcriptional activator of the human bax gene. // Cell. 1995 Jan 27;80(2):293-9.

116. Morgan WF. Non-targeted and delayed effects of exposure to ionizing radiation: II. Radiation-induced genomic instability and bystander effects in vivo, clastogenic factors and transgenerational effects. // Radiat Res. 2003 May;159(5):581-96.

117. Mothersill C, Seymour C. Low-dose radiation effects: experimental hematology and the changing paradigm. // Exp. Hematol. 2003. 31(6):437-445.

118. Miiller WU, Bauch T, Stiiben G, Sack H, Streffer C. Radiation sensitivity of lymphocytes from healthy individuals and cancer patientsas measured by the comet assay. // Radiat Environ Biophys. 2001 Mar;40(l):83-9.

119. Muller W-U., Bauch T., Streffer C., Mallek D von. Does radiotherapy affect the outcome of the comet assay? // The British Journal of Radiology, 2002. 75. 608-614

120. Murnane JP. Role of induced genetic instability in the mutagenic effects of chemicals and radiation. // Mutat Res. 1996 Jan; 367(1):11-23. Review.

121. Nackerdien, Z., G. Rao, M.A. Cacciuttolo, E. Gajewski, and M. Dizdaroglu. Chemical nature of DNA-protein crosslinks produced in mammalian chromatin by hydrogen peroxide in the presence of iron or copper ions. //Biochemistry. 1991.30:4873-4879.

122. Nadin SB, Vargas-Roig LM, Drago G, Ibarra J, Ciocca DR. Hsp27, Hsp70 and mismatch repair proteins hMLHl and hMSH2 expression in peripheral blood lymphocytes from healthy subjects and cancer patients. // Cancer Lett. 2007 Jul 8;252(l):131-46.

123. Nagasawa H, Little JB. Unexpected sensitivity to the induction of mutations by very low doses of alpha-particle radiation: evidence for a bystander effect. // Radiat Res. 1999. Nov;152(5):552-7.

124. Nagata S. Apoptotic DNA fragmentation. // Exp. Cell. Res. 2000. V. 256. P. 12-18.

125. Nicholas JS, Butler GC, Davis S, Bryant E, Hoel DG, Mohr LC Jr. Stable chromosome aberrations and ionizing radiation in airline pilots. // Aviat Space Environ Med. 2003 Sep;74(9):953-6.

126. Nikjoo, H., P. O'Neill, D.T. Goodhead, and M. Terrissol. Computational modelling of low-energy electron-induced DNA damage by early physical and chemical events. // International Journal of Radiation Biology. 1997. 71:467-483.

127. Nojima H. Cell cycle checkpoints, chromosome stability and the progression of cancer. // Hum Cell. 1997 Dec; 10(4):221-30. Review.

128. Olive P.L., Banath J.P. Phosphorylation of histone H2AX as a measure of radiosensitivity. // International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 2004. 58:331-335.

129. Olive P.L., Banath JP, Durand RE. Heterogeneity in radiationinduced DNA damage and repair in tumor and normal cells using the "comet" assay. // Radiat Re. 1990. 122:86 -94.

130. Olive PL, Banath JP, Durand RE. Heterogeneity in radiationinduced DNA damage and repair in tumor and normal cells using the "comet" assay. // Radiat Re. 1990. 122:86-94.

131. Olive, P. L. and Banath, J. P. Detection of DNA double-strand breaks through the cell cycle after exposure to X-rays, bleomycin, etoposide and Id Urd. // Int. J. Radiat. Biol., 1993 b: 64(4), 349-358.

132. Olive, P. L. and Banath, J. P. Growth fraction measured using the comet assay. // Cell Prolif., 1992: 25: 447-457.

133. Olive, P. L. and Banath, J. P. Induction and rejoining of radiation-induced DNA single-strand breeaks: 'tail moment "as a function of position in the cell cycle. // Mutation Res., DNA repair, 1993 a: 294: 275-283.

134. Olive, P. L. and Banath, J. P. Radiation-induced DNA double-strand breaks produced in histone-depleted tumor cell nuclei measured using the neutral comet assay. // Radiat. Res. 1995: 142: 144-152.

135. Olive, P. L. DNA organization affects cellular radiosensitivity and detection of initial DNA strand breaks. // Int. J. Radiat. Biol., 1992: 62 (4), 389-396.

136. Olive, P. L. Reveiw. DNA damage and repair in individual cells: applications of the comet assay in radiobiology. // Int. J. Radiat. Biol. 1999:75 (4): 395-405.

137. Olive, P. L., Banath, J. P. and Evans, H. H. Cell killing and DNA damage by Etoposide in Chinese hamster V79 monolayers and spheroids: Influence of growth kinetics, growth environment and DNA packaging. // Br. J. Cancer, 1993: 67: 522-530.

138. Olive, P. L., Banath, J. P. and Fjell, C. D. DNA strand breakage and DNA structure infuence staining with propidium iodide using the alkaline comet assay. //Cytometry, 1994 a: 16: 305-312.

139. Olive, P. L.; Banath, J. P. and Durand, R. E. Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells. // Radiat. Res. 1990: 122: 86-94.

140. Olive, P. L.; Banath, J. P. and Macphail, H. S. Lack of a correlation between radiosensitivity and DNA double strand break induction or rejoining in six human tumor cell lines. // Cancer Res. 1994 b: 54: 3939-3946.

141. Olive, P. L.; Hilton, J. and Durand, R. E. DNA conformation of Chinese hamsterV79 cells and sensitivity to ionizing radiation. // Radiat. Res., 1986:107: 115-124.

142. Olive, P. L.; Johanson, P. J.; Banath, J. P. and Durand, R. E. The comet assay: a new method to examine heterogeneity associated with solid tumours. //Nature (Medicine), 1998:4:103-105

143. Olive, P. L.; Wlodek, D. and Banath, J. P. DNA double-strand breaks measured in individual cells subjected to gel electrophoresis. // Radiat. Res. 1991:51:4671-4676.

144. Olive, P. L.; Wlodek, D.; Durand, R. E. and Banath, J. P. Factors influencing DNA migration from individual cells subjected to gel electrophoresis.// Exp. Cell Res., 1992:198:259-267.

145. Olivieri G., and Bosi A. Possible causes of variability of the adaptive response in human lymphocytes. // In Chromosomal Aberrations Basic and Applied Aspects, 1990.

146. Olivieri, G., J. Bodycote, and S. Wolff. Adaptive response of human lymphocytes to low concentrations of radioactive thymidine. // Science. 1984. 223:594-597.

147. Oshita F, Fujiwara Y, Saijo N. Radiation sensitivities in various anticancer-drug-resistant human lung cancer cell lines and mechanism of radiation cross-resistance in a cisplatin-resistant cell line. // J Cancer Res Clin Oncol. 1992; 119(1 ):28-34.

148. Ostling, and Johanson. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA-demage in individual mammalian cells. // Biochemical and Biophysical Research communications, 1984; 123: 291-298.

149. Paull T. T., Rogakou E. P, Yamazaki V., Kirchgessner C.U., Geller M, Bonner W. M. A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage. // Current Biology. 2000. 10: 886-895

150. Paull TT, Gellert M. The 3' to 5' exonuclease activity of Mre 11 facilitates repair of DNA double-strand breaks. // Mol Cell. 1998. Jun; l(7):969-79.

151. Peace B.E & Succop P. Spontaneous micronucleus frequency and age:what are normal values? // Mutation Research, 1999. 425: 225-230

152. Perera FP. Environment and cancer: who are susceptible? Science, 1997. 278:1068-1073.

153. Pinkoski M. J., Brunner T., Green D. R. Fas and Fas ligand in gut and liver// AM. J. Physiol. Gastrointest. 2000. -. V. 278. P. 354-366.

154. Prise, K.M., M. Folkard, H.C. Newman, and B.D. Michael. Effect of radiation quality on lesion complexity in cellular DNA. // International Journal of Radiation Biology. 1994.66:537-542.

155. Raaphorst, G. P., and Boyden, S. Adaptive response and its variation in human normal and tumour cells. // Int. J. Radiat. Boil. 1999. 75, 865-873.

156. Ramos JM, Ruiz A, Colen R, Lopez ID, Grossman L, Matta JL. DNA repair and breast carcinoma susceptibility in women. // Cancer. 2004 Apr 1;100(7):1352-7.

157. Rapp A. Greulich K. Afer double strand break induction by UV-A, homologous recombination and nonhomologous end joining cooperate at the same DBS if both system are available.2004.

158. Raynal P., Pollar. H. B. Annexins: the problem of assessing the biological role for a gene family of multifunctional calcium- and phospholipid- binding proteins. Biochem. Biophys. Acta. 1994. 1197: 63-93

159. Rogakou E. P., Pilch D. R., Orr A. H., Ivanova V. S., Bonner W. M. DNA double-strand breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. // J. Biol. Chem. 1998. 273: 5858-5868.

160. Rogakou E.P., Boon C., Redon C., Bonner W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double- strand breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. //J. Biol. Chem. 1999.146: 905-916.

161. Romano E, Ferrucci L, Nicolai F, Derme V, De Stefano GF. Increase of chromosomal aberrations induced by ionising radiation in peripheral blood lymphocytes of civil aviation pilots and crew members. // Mutat Res. 1997 Jun 9;377(l):89-93.

162. Rothkamm R., Lobrich M. Evidence for lack of DNA double-strand break repair in human cells exposed to very low x-ray doses. // Proceedings of National Academy of Science of the USA. 2003.100: 5057- 5062.

163. Roti Roti, J.L., W.D. Wright, and Y.C. Taylor. DNA loop structure and radiation response. // Advances in Radiation Biology 1993. 17:227-259.

164. Rydberg, B. Clusters of DNA damage induced by ionizing radiation: Formation of short DNA fragments. 2. Experimental detection. // Radiation Research 1996.145:200-209.

165. Sanear A., Lindsey-Boltz L.A., Unsal-Kacmaz K., and Linn S. Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints // Annu. Rev. Biochem. 2004. 73:39-85

166. Sánchez P, Peñarroja R, Gallegos F, Bravo JL, Rojas E, Benitez-Bribiesca L. DNA damage in peripheral lymphocytes of untreated breast cancer patients. // Arch Med Res. 2004 Nov-Dec;35(6):480-3.

167. Sankaranarayanan K., Von Duyn A., Loos M., and Natarjan, A.T. Adaptive response of human lymphocytes to low level radiation from radioisotopes or X-rays. // Mutat. Res. 1989. 211:7-12.

168. Sasaki MS, Ejima Y, Tachibana A, Yamada T, Ishizaki K, Shimizu T, Nomura T. DNA damage response pathway in radioadaptive response. // Mutat Res. 2002. Jul 25; 504(1-2): 101-18.

169. Savill J. The innate immune system: recognition of apoptotic cells. // In: Apoptosis and the Immune Response, Gregory C. D. (edit.), Willey- Liss Inc., New York. 1995. 341-369.

170. Scaffidi C, Fulda S, Srinivasan A, Friesen C, Li F, Tomaselli KJ, Debatin KM, Krammer PH, Peter ME. Two CD95 (APO-l/Fas) signaling pathways (1998). EMBO J., 17:1675-1687

171. Schrolt A.J., Madsen J., Tanaka Y.1985. In vitro recognition and clearance of red blood cells containing phosphatidylserin in their plasma membranes. //J. Biol. Chem. 260:5131-5138.

172. Seaton B. A. // Annexins: molecular structure to cellular function. Book series: Molecular Biology Intelligence Unit, R. C. Landes Company, Austin, USA. 1996

173. Sedelnikova O.A., Horikawa I., Zimonjic D.B.,Popescu N.C., Bonner W. M., Barret J.C. Senescing human cells and ageing mice accumulate DNA lesions with unrepaired double- strand breaks. // Nature Cell Biology 6: 168170.

174. Shadley J.D., Wolff S. Very low doses of X-rays can cause human lymphocytes to become less susceptible to ionizing radiation, // Int. J. Radiat. Biol., 1987. 2. 95-96.

175. Shadley J.D.and Wiencke J.K. Induction of the adaptive response by X-rays is dependent on radiation intensity // Int. J. Radiat. Biol., 1989. 56. 107118.

176. Shogren-Knaak, M.H., Ishii J., Sun M., Pazin M.J., Davie J. R., Peterson C. L. Histone H4-K16 acetylation controls chromatin structure and protein interactions. // Science 2006.311: 844-847.

177. Sinclair WK. Radiation risk estimation and its application to human beings in space. // Adv Space Res. 1984;4(10):115-20.

178. Singh N. P., McCoy M., Tice R. R., Schneider E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. // Exp. Cell. 1988.Res.175:184-191

179. Singh, N. P. and Stephens, R. E. Microgel electrophoresis: sensitivity, mechanisms and DNA electrostretching. // Mutation Res. 1997. 383:167-175.

180. Singh, N. P.; Danner, D. B.; Tice, R. R.; Brandt, L. and Scneider, E. L. DNA damage and repair with age in individual human lymphocytes. // Mutation Res., 1990 237: 123-130.

181. Singh, N. P.; Danner, D. B.; Tice, R. R.; McCoy, M. T.; Collins, G. D. and Schneider, E. L. Abundant alkali-sensitive sites in DNA of human and mouse sperm. //Exp. Cell Res. 1989:184: 461-470.

182. Singh, N. P.; Tice, R. R.; Stephens, R. E. and Schneider, E. L. A microgel electrophoresis technique for the direct quantitation of DNA damage and repair in individual fibroblasts cultured on microscope slides. // Mutation Res. 1991:252:289-296.

183. Slavotinek A., McMillan, T. J. and Steel C. M. A comparison of micronucleus frequency and radiation survival in lymphoblastoid cell lines. // Mutagenesis. 1993. 8. 569-575

184. Smith LE, Nagar S, Kim GJ, Morgan WF. Radiation-induced genomic instability: radiation quality and dose response. // Health Phys. 2003. Jul.; 85(l):23-9.

185. Stucki M.J., Clapperton D., Mohammad M. B., Yaffe S. J., Smerdon S.J., Jackson S.P. MDC1 directly binds phosphorylated histone H2AX to regular cellular responses to DNA double- strand breaks. //Cell. 2005.123; 12131226.

186. Sung P. Catalysis of ATP-dependent homologous DNA pairing and strand exchange by yeast RAD51 protein. // Science. 1994. Aug 26; 265(5176):1241-3.

187. Susin S.A., Zamzami N., Kroemer G. The cell biology of apoptosis: evidence for the implication of mitochondria. //Apoptosis 1996.1: 231-242.

188. Sutherland, B.M., P.V. Bennnett, Sidorkina O. et al. Clustered DNA damages indused in isolated DNA and in human cells by low doses of ionizing radiation. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2000. 97: 103-108.

189. Swairjo M.A., Concha N.O., Kaetzel M.A., Dedman J.R.,Seaton B.A. Ca2+-bridging mechanism and phospholipid head group recognition in the membrane-brinding protein annexin V. // Nature Structural Biology 1995 2: 968-974.

190. Tait J.F., Gibson D., Fujikawa K. Phospholipid binding properties of human placental anticoagulant protein-I, a member of the lipocortin family. // J. Biol. Chem. 1989. 264: 7944-7949.

191. Taneja N., Davis M., Choy J. S., Beckett M. A., Singh R., Kron S. J.,Weichselbaum R. R. Histone H2AX phosphorylation as a predictor of radiosensitivity and target for radiotherapy. // Journal of Biological Chemistry 2004.279: 2273-2280.

192. Thompson, L.H. Evidence that mammalian cells possess homologous recombinational repair pathways. // Mutation Research. 1996. 363:77-88.

193. Thorberry N.A., Lazebnik Y. Caspases: enemies within. // Science- 1998. -V.281.-P. 1312-1316.

194. Trujillo KM, Yuan SS, Lee EY, Sung P. Nuclease activities in a complex of human recombination and DNA repair factors Rad50, Mrel 1, and p95. // J Biol Chem. 1998. Aug 21 ;273(34):21447-50.

195. Tsujimoto Y. Role of Bcl-2 family proteins in apoptosis: apoptosomes or mitochondria? // Genes Cells. 1998 Nov;3(l l):697-707

196. Tsukuda T., A. B. Fleming J. A. Nickoloff, M. A. Osley. Chromatin remodeling at a DNA double- strand break site in Saccharomyces cerevisiae, //Nature 2005. 438:379-383.

197. Twardella D., Chang- Claude J. Studies on radiosensitivity from an epidemiological point of view overwiev of methods and results.// Radiother. Oncol, 2002 62: 249-260.

198. Ullrich, R. L. and Ponnaiya, B. Radiation-induced instability and its relation to radiation carcinogenesis. // Int J Radiat Biol. 1998. 74:6, 747-54.

199. Van Attikum, H., Gasser S. M. The hi stone code at DNA breaks: a guide to repair. //Nat. Rev. Mol Cell Biol. 2005. 6:757-765.

200. Varga-Weisz P. D., Becker P.B Regulation of higher-order chromatin structure by nucleosome- remodeling factors. // Curr. Opin. Genet. Dev. 2006. 16: 151-156.

201. Wang W.D., Chen Z.T., Li DZ. Detecting normal cell radiosensitivity via assay of DNA damage in lymphocytes for individualizing radiotherapy in head and neck cancer patients. 2005.

202. Ward JF. Biochemistry of DNA lesions. // Radiat Res Suppl. 1985. 8:S103-111.

203. Ward, J.F. DNA damage produced by ionizing radiation in mammalian cells: Identities, mechanism of formation, and repairability. // Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology 1988.35:95-125.

204. Ward, J.F. Some biochemical consequences of the spatial distribution of ionizing radiation produced free radicals. // Radiation Research 1981. 86:185-195

205. Ward, J.F. The complexity of DNA damage-relevance to biological consequences. // International Journal of Radiation Biology. 1994. 66:427432.

206. Waiters, R.L., and B.W. Lyons. Variation in radiation-induced formation of DNA double-strand breaks as a function of chromatin structure. // Radiation Research 1992.130:309-318.

207. White C. L., Suto R.K., Luger K. Structure of the yeast nucleasome core particle reveals fundamental changes in internucleosome interactions. // EMBO J 2001. 20: 5207-5218.

208. Wiencke J.K., Afzal V., Olivieri G. and Wolff S. Evidence that the 3H. thymidine induced adaptive response of human lymphocytes to subsequentdoses of X-rays involves the induction of chromosomal repair mechanism // //Mutagenesis. 1986. 1.375-380.

209. Williamson P., Bevers E. M., Smeets E. F., Comfurius P., Schlegel R. A., Zwaal F. A. Continuous analysis of the mechanism of activated transbilayer lipid movement in platelets. // Biochemistry. 1995. 34: 10448-10455.

210. Wojcik A, Streffer C, Adaptive response to ionizing radiation in mammalian cells: a review. // Biol. Zent. bl. 1994. 113:417-434.

211. Wojcik A. and Tuschl H. Indications of an adaptive response in C57BL mice pre-exposed in vivo to low doses of ionizing radiation. // Mutat. Res., 1990.243:67-73.

212. Wolff S. The Adaptive Response in Radiobiology: Evolving Insights and Implications. // Environmental Health Perspectives. 1998. V. 106, S-l. P. 277-283.

213. Woltfe, A. P., Hayes J. J. Chromatin disruption and modification. // Nucleic Acids Res. 1999. 27:711-720.

214. Wright E.G. Radiation-induced genomic instability in haemopoietic cells // Int. J. Radiat. Biol., 1998. Vol. 74. № 6. P. 681-687.

215. Wykes S. M., Piasentin E., Joiner M. C., Wilson G. D., Marples B. Low-dose hyper-radiosensitivity is not caused by a failure to recognize DNA double-strand breaks. // Radiation Research 2006.165: 516-524.

216. Yan N, Shi Y. Histone HI.2 as a trigger for apoptosis. Nat Struct Biol.2003 Dec;10(12):983-5

217. Zamzani N., Marchetti P., Castedo M. Sequencial reduction of mitochondrial transmembrane potential and generation of reactive oxygen species in early programmed cell death. // J. Exp. Med.- 1995. V.182. - P. 367-377.

218. Zha S, Alt FW, Cheng HL, Brush JW, Li G. Defective DNA repair and increased genomic instability in Cernunnos-XLF-deficient murine ES cells. // Proc Natl Acad Sci USA. 2007 Mar 13;104(11):4518-23.

219. Zong WX, Ditsworth D, Bauer DE, Wang ZQ, Thompson CB. Alkylating DNA damage stimulates a regulated form of necrotic cell death.Genes Dev.2004 Jun 1; 18(11): 1272-82. Epub 2004 May 14.

Информация о работе

Воробьева, Наталья Юрьевна
кандидата биологических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.01

Диссертация

Молекулярные и клеточные маркеры индивидуальной чувствительности человека к воздействию ионизирующего излучения - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы