Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярное клонирование и структурный анализ генов прохимозина быка и человека

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярное клонирование и структурный анализ генов прохимозина быка и человека"

ТАРТУСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ЭРД Тынис Аугустович

МОЛЕКУЛЯРНОЕ КЛОНИРОВАНИЕ И СТРУКТУРНЫЙ АНАЛИЗ ГЕНОВ ПРОХИМОЗИНА БЫКА И ЧЕЛОВЕКА

03.00.03 Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени' кандидата биологических наук

ТАРТУ 19 9 0

Работа выполнена в лабораторий молекулярной генетики Института химической и биологической физики АН Эстонии

Научный руководитель: член АН Эстонии,

доктор биологических наук, профессор Р. Л.-Э. ВИЛЛЕМС

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук П. П. ПУМПЕН кандидат биологических наук А. X. КИЛЬК

Ведуцая организация:

Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта АН СССР

Защита состоится 29 ноября 1990 г. в 15 часов на заседании Специализированного совета К.069.02.0?. Тартуского университета по адресу: 202400 Эстонская Республика, г. Тарту, ул. Юликооли, 1В.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Тартуского университета по адресу: 202400, Эстонская Республика, г. Тарту, ул. Струве, 1.

Автореферат разослан -¿Г.. октября 1990 г.

¿шпътС«

Ученый секретарь

Специализированного совета к. м. н. УУСКЮЛА Я. С.

К.069.02.0?.

Актуальность темы. Химозины являются .неонатальными желудочными протеаэами и относятся к группе аспартатных протеаэ, которая включает также пепсины А и С, ренин, катепсины D и Е иэ протеаэ млекопитающих, многие энзимы грибков и протеаэы ретровирусов. Аспвртатными протеаэами выполняется широкий спектр физиологических функций, начиная от регуляции.давления крови и кончая процессами метаболизма клеточных белков, они отличаются друг от друга по области воздействия (экстрацеллюлярные, лиэоэомальные) и по субстратной специфичности С от высокой специфичности ренина до способности пепсина расщепить "почти всё") . Ряд обстоятельств (идентичные аминокислотные остатки активного центра и одинаковая пространственная структура энзимов, а особенно - консервативная организация ген'ов этих протеаэ) указывают на го, что гены различных аспартатных протеаэ млекопитающих возникли от общего предка путем дивергенции. Для получения более детальной картины об эволюции семейства генов аспартатных протеаэ млеколитаюмих требуются сравнительные данные о структуре генов аспартатных протеаэ.

Химозины отличаются от других желудочных протеаэ (пепсины А и С) более высокой субстратной специфичностью: они расщепляют молочный белок к-казеин, вызывая свертывание молока, но в меньшей мере, чем пепсины, повреждают иммуноглобулины, содержащиеся в молоке. Предполагается, что высокая уровень экспрессии гена прохимоэина (ПХ) и низкая уровень экспрессии генов пелсиногенов на неонвтальной стадию развития способствуют образованию приобретенного иммунитете новорожденного.

Наиболее подробно изученным представителем химозинов является химозин быка. Отметим лишь, что определены его первичная и пространственная структуры, клонированы ген (до настоящей работы единственный иэ генов ПХ) и кДНК ПХ в ряде лабораториях мира. Клонирование и экспрессирование кДНК ПХ быка в гетерологических системах открывает возможность подступить к белковой инженерии химозина, а также может представлять биотехнологический интерес.

Цель работы. Целью настоящей работы является молекулярное клонирование и структурный анализ кДНК ПХ быка, экспрессирование кДНК ПХ быка в Escherichia coli, клонирование и изучение структуры гена ПХ человека.

Нвучная новизна работы. Впервые клонирован участок генома человека, гомологичный зкэонам и фланкирующим

последовательностям гена ПХ быка. Установлены размер, рестрикционная карта и частичная первичная структура этого участка. Установлено, что нуклеотидая последовательность наблюдаемого гена человека, соответствующая кодирующему региону гене ПХ быка, содержит изменения по сравнению с кодирующем регионом гена ПХ быка, которые исключают возможность кодирования полноразмерного белка, гомологичного ПХ быка. На основании этих данных сделан вывод, что в геноме человека содержится псевдоген ПХ.

В первичной структуре кДНК ПХ быка, клонированной в настоящей работе, выявлены ряд замен основании по сравнению с ранее опубликованными нуклеотидными последовательностями кДНК ПХ быка.

Практическая ценность работы. Клрнированная в настоящей работе кДНК ПХ быка применима для экспрессирования в гетерологических системах. Изготовленные плаэмиды,

обеспечивающие экспрессию кДНК ПХ быка и ее делеционных мутантов в Escherichia coli, могут быть использованы для продукции рекомбинантного ПХ и его Фрагментов.

Структура работы. Диссертация изложена на 121 стр.

машинописного текста, включая 3 таблиц и 26 рисунков. Работа содержит следующие разделы: введение, обзор литературы С посвящен сруктуре генов аспартвтных протеаз млекопитающих, экспрессии генов лрохимозина и филогенетическим отношениям генов желудочных аспартатных протеаз позвоночных), материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы и список цитируемой литературы (1&6 источников).

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены и

обсуждены на VIII Двустороннем симпозиуме СССР-Франция "Молекулярная биология белков и нуклеиновых кислот" (Москва, 1986), VII Всесоюзном симпозиуме по химии белков и пептидов (Таллинн, 1987), на Всесоюзных конференциях "Новые направления биотехнологии" СПущино, 1986) и "Актуальные вопросы биотехнологии" (Ленинград, 1987), на XIV Международном биохимическом конгрессе (Прага, 1968), на Международном конференции по аспартатным протеазам (Сонома, США, 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1 . Молекулярное клонирование и экспрессия кДНК ПХ быка в Escherichia coli.

1.1. Выделение и анализ поли(А)+-РНК.

РНК, .использованную при изготовлении клонотек кДНК, выделили иэ слизистой оболочки желудка новорожденного теленка по описанной методике (Chirgwin et el., 1979). Количество полученной РНК составляло приблизительно 1,2 мг на один грамм ткани, в дальнейшем из суммарной РНК выделили полис А)+-фракцию хроматаграфированием на колонке олигоСйТО-целлюлозы (Aviv end Leder, 1972).

Матричную активность полученной поли(А)+-РНК изучали в лизате ретикулоцитов кролика (Pelham and Jackson, 1976). На злектрофореграмме продуктов трансляции выделенной поли(А)+-РНК С Рис. 1) мажорным является полипептид, который по молекулярному весу С 42 кДа) соответствует препрохимозину.

Рис. 1. Трансляция in vitro поли(А)+-ФРвкции РНК, выделенной иэ желудка телен^. Электрофоретическое разделение В-меченных продуктов трансляции в 10% ПАА геле в присутствии ДДС-Na (дорожка 2). Дорожка 1 - смесь контрольной инкубации лизат^ ретикулоцитов без добавленной поли(А) -РНК. Указано расположение овальбумина (0V; 43 кДа) и альбумина бычьей сыворотки (BSA; 68 кДа) на злектрофореграмме.

! -г

Рис. 2. Анализ поли(А) -РНК, выделенной иэ желудка теленка, А. Электрофоретическое разделение РНК (10 и 20 мкг) в 1,5% агарозном геле в присутствии формальдегида. Б. Блот-гибридиэация РНК из злектрофореграммы А с 3'-концевым зондом кДНК ПХ быка ( авторадиогрвмма).

•*8S г RNA-

Эле^трофоретический анализ поли(А) -РНК С рис. 2) показывает, что полученный препарат содержит большое количество рибосомальной высокомолекулярной РНК. При блот-гибридизации поли(А)+-РНК с фрагментом кДНК ПХ быка (клонирование зонда описано в разделе 1.2.) появляется сигнал, который соответствует размеру молекулы РНК примерно 1,5 т. н. (рис. г).

1.8. Клонирование кДНК ПХ быка.

С целью получения химозин-специфического зонда гибридизации провели клонирование фрагмента кДНК ПХ быка, используя при этом опубликованные данные о расположении рестрикционных сайтов в молекуле кДНК ПХ быка (Harris et el., 19В2; Moir et al., 1982). Двухцепочечнуи кДНК (0,2 мкг) синтезировали по описанной методике (Gubler and Hoffmann, 1963), расцепили с BamHI и разделили в ПАА геле. Фрагменты ДНК, равные по размеру фрагментам кДНК ПХ быка, злюировали из геля, лигировали с ДНК фага М13шрВ, рестриктированной BamHI, и полученный препарат использовали для трансформации клеток Е. coli JM103. В результате получены два клона, содержащие Фрагмент кДНК ПХ быка размером в 525 п. о. (соответствующий Фрагмент кДНК ПХ быка назван З'-концевым зондом).

В дальнейшем, из 0,8 мкг двухцепочечной кДНК, синтезированной на матрице поли(А)+-РНК из желудка телёнка по описанной методике (Gubler and Hoffmann, 1983), была изготовлена клонотека (численностью примерно^20000 клонов) на основе вектора р1)С18, используя методику Oflnro(dG)-олиго(dC)-коннекторов. Из 3000 кланов, анализированных по гибридизации с З'-концевым зондом кДНК ПХ быка, положительный сигнал дали 26 клонов. Для дальнейшей работы была выбрана pPCIS, содержащая вставку 1,5 т. п. о.

Анализ первичной структуры вставки pPCIS показывал, что она кодирует форму В химозина и охватывает всю кодирующую последовательность мРНК ПХ быка (1143 основании), а также 5 основании, расположенных перед инициирующим кодоном в 5'-конце мРНК, и З'-концевую некодирующую последовательность длиной около 300 основании. Сравнение первичной структуры кДНК ПХ быка в рРС15 с опубликованными последовательностями кДНК и зкэонов гена ПХ быка (гена ЬРС) выявляет ряд различии (Таблица 1), большинство из которых не приводят к изменению кодируемых аминокислотных остатков, выведенная аминокислотная последовательность кДНК в pPCIS содержит изменения в двух, положениях по сравнению с первичной структурой ПХ,

Различия в первичной структуре мРНК ПХ быка

Таблица 1

Положение основания*

к ДНК в плаэмиде pPCIS

к ДНК (Harris et al., 1982)

кДНК СMoir et al., 1982)

ген (HidaKa et al., 1986)

Gin Gin Gin Gin

45 ( 1S) CAG CAA CAG CAG

Thr Ale Ale Thr

49 С 1?) ACT GCT GCT ACT

Leu Leu Leu Leu

432 С 144) CTG СТА CTG CTG

Asp Asn Asp Asp

688 С 230) GAC AAC GAC GAC

Leu Leu 'Leu Leu

817 С 273) CTG TTG CTG CTG

Gly Gly Asp Gly

905** (302) GGT GGT GAT GGT

Val Val Val Val

954 ( 318) GTT GTC GTC GTC

Ile Ile Ile Ile

963 С 321) ATT АТС АТС АТС

Gin Gin Gin Gin

1008 ( 336) CAG CAA CAG CAG

1212*** С T T T

1214*** А А делеция А

1243*** T С С С

* Нумерация основании начинается от первого основания инициеторного кодона. В скобка* указано положение кодона. *» Различие между а- и В-формой химозина (ро11тапп ^ а1., 1979) .

*»* В 3'-некодируюцей части мРНК.

установленной Фолтманном с соавторами прямым секвенированием белка С Foltmann et al., 19??): в положении 1? С по нумерации остатков, начинающей от N-конца препрохимозина), который соответствует первому положению прохимозинв, находится остаток Thr вместо остатки А1а, в в положении 218 остаток Asn вместо остатки Asp. Кроме кДНК в рРС15 кодируется остаток Thr в положение 1? только клонированным геном ЬРС (Hidaka et al, 1986), а а молекулах кДНК ПХ быка формы А С Moir et al., 1982) и формы В (Harri« et al., 19В8) в соответствующее положение кодируется остаток Ala.i По видимому, кДНК в рРС15 и геномная последовательность,

описанная а работе Хидака с соавторами, представляют аллельную форму ПХ быка, неописанную 'на белковом уровне. Что касается второго различия в аминокислотной последовательности, то кодон ААТ, соответствующий остатку Авп, найден также в положении 21В остальных опубликованных последовательностей кДНК ПХ быка (Harris et al., 1982; Moir et al., 1962).

1.3. Экспрессия кДНК ПХ быка в E»cherichla coll.

Исходным вектором при конструировании плаэмиды для экспрессии кДНК ПХ быка в Е. coli выбрали плазмиду pEV (Crowl at al., 1965), которая содержит левый промотор Фага X - В изготовленной плазмиде С pEV-PC) фрагмент кДНК, кодирующий Г)Х быка, начиная с шестого аминокислотного остатка пропептида, расположен в полилинкерном участке вектора pEV в правильной рамке трансляции. N-концевая последовательность белка, кодированного плазмидой pEV-PC, различается от последовательности.ПХ быка: вместо 5 N-концевых аминокислотных остатков пропептида ПХ быка кодируется Б аминокислотных остатков фрагментами полилинкерных участков плазмидов pEV и pUCS (рис. 3).

1 2 3 4 5 6 7 6

а) ПХ быка: А1а(или Thr)-Glu-Ile-Thr-Arg-Ile-Pro-Leu ...

(6) (?) [В) 123456789 Met Asn Glu Phe Pro Gly Ile Pro Leu

б) pEV-PC: ATTAAT ATG ААТ GAA TTC CCG GGG АТС CCT CTG ...

полилинкер полилинкер кДНК ПХ быка плаэмиды pEV плаэмиды pUC6

Рис. 3. Первичные структуры N-концевых участков пропептида ПХ быка (а) и слитного белка, кодированного плазмидой pEV-PC (б). Цифры в скобках над последовательности, кодированной pEV-PC, указывают положение соответствующего остатка в молекуле ПХ быка.

Плазмидой pEV-PC трансформировали клетки Е. coli штамма рор2136 (полученный от др. Рэбо, Институт Пастера), продуцирующие термочувствительный репрессор фага X . Электрофоретмчесний анализ белков, синтезированных в клетках рор2136[pEV-PCJ показывает, что клетки, выращенные при 42°С, продуцируют белок молекулярным аесом 40 кДа (рис. 4), который соответствует расчетному молекулярному весу ракомбинантного ПХ, кодированного плазмидой pEV-PC. В клетках рор213б[pEV-PC], выращенных при 30°С,

соответствующий белок отсутствует, также как.и в клетках рор2136[ pEV v/rfl] , выращенных при 30°С и при 42°С. Иммунологический анализ клеточных экстрактов с химозин-специфической антисывороткой, проведенный А. Торпом (нала лаборатория), подтвердил предположение, что белок молекулярным весом 40 кДа, синтез которого индуцируется повышением температуры выращивания клеток, является рекомбинантным ПХ Срис. 4). В экстракте неиндуцированных клеток рор2136[pEV-PC] и в других контрольных клеточных экстрактах присутствия белков, узнаваемых антителами против химозина , не наблюдалось.

Рис. 4. Экспрессия кДНК ПХ быка в .Escherichia coll рор2136. А. Электрофорети-ческое разделение белков, синтезирующихся в Е. coll, в 10Х ПАА геле в присутствии ДДС-Na. 1 и 2 - лизаты клеток pop2136[pEV vrfl], выращенных при 30° и 42°С, соответсвенно; 3 и 4 -лизвты клеток pop2136[gEV-РС], выращенных при 42 С и 30 С, соответсвенно. Указано расположение овальбу-мина С□V; 43 кДа), стрелкой отмечено расположение рекомбинантного ПХ. Б. Им-муноблот злектрофореграммы с химозин-специфической антисывороткой (проведен А. Торпом из навей лаборатории) . Дорожки обозначены как указано выае.

Энзиматическую активность рекомбинантного ПХ изучали в неочищенном виде по способности экстракта индуцированных клеток рор2136[pEV-PC] свертывать молоко. Клеточные экстракты инкубировали в кислотной среде перед определением активности свертывания, чтобы обеспечить автокаталитическое превращение ПХ в химозин. Как показывают данные, приведенные в таблице 2, активностью свертывания молока обладает лиаь экстракт индуцированных клеток рор2136[pEV-PC], обработанный раствором мочевины. Из этого следует,. что ПХ, синтезированный в клетках Е. coli, находится в денатурированном состоянии, в форме агрегатов. Ножно предполагать, что агрегация 'ПХ, синтезированного в Е. ooli, вызвана неправильным складыванием белка и неправильным

--■'.й- з «-

pEV vn prv-'-'C

ЗО^с !

Таблица 2

выявление энэимвтической активности рекомбинантного ПХ в экстрактах трансформированных клеток Е. coli рор2136.

Название Температура Обработка Активность

трансформирую- выращивания экстракта свертывания

щей плазмиды клеток мочевиной молока

1, pEV-PC 30°C нет отсутствует

2. pEV-PC 30°C да отсутствует

3. pEV-PC 42°C нет отсутствует

4. pEV-PC 42°C да 2 ед. акт.»/мл

S. ,»* pEV-PC 42°C да отсутствует

£. pEV vrfl 42°C да отсутствует

* Единицей активности свертывания принято количество, вызывающее свертывание 10 мл молока при 30°С в течении 100 сек. (Ро1гтвпп, 1970) .

** Клеточный экстракт не подвергали кислотной обработке.

образованием дисульфидных связей. Приобретение активности свертывания молока экстрактом индуцированных клеток рор2136[рЕУ-РС] после обработки раствором мочевины свидетельствует о том, что изменение первичной структуры М-конца ПХ в определенных пределах не препятствует автокаталитическому превращению ПХ в химозин.

1.4. Конструирование плазмидов. экспрессирующих делецирнные мутанты кДНК ПХ быка в Escherichia coli.

С целью определения антигенных детерминантов в молекуле химозина (при помощи моноклональных антител, изготовленных в нашей лабораторией рабочей группой под руководством др. М. Саармв), сконструировали 6 плазмидов, обеспечивающих экспрессию фрагментов кДНК ПХ быка в Е. coli. Исходной плазмидой использовали pEV-PC, из которой делетировали рестриктазами BamHI и EcoRI различные участки кДНК ПХ. Изготовленные плазмиды кодируют следующие сегменты ПХ: pPCdel23 - участок от аминокислотной остатки 6 до остатки 164, pPCdel12 от остатки 339 до 36S, pPCdel3 от остатки 6 до 339, pPCd«H3 от остатки 160 до 339, pPCdaH от остатки 160 до 36S и pPCdalS от остатки 6 до 164, которому следует сегмент от остатки 340 до 365. Плаэмидами pPCdel23, pPCd«H2, pPCdel3 и pPCdal2 кодируется в N-конец фрагментов

ПХ аминокислотная послшдовательмость Мв1-Авп-(31и-Р|1е-Рго-С1у, как и в случае плаэмиды рЕУ-РС, а плаэмидами рРСс!е113 и рРСавИ остатки метионина и аспврвгина. К С-концу сегментов ПХ, кодированным плаэмидами рРСав123, pPCdвlЗ и pPCdel13 (из которых удален фрагмент кДНК, содержащий терминирующий кодон мРНК ПХ быка) , пришит фрагмент Сот аминокислотной остатки 99 до С-конца) продукта гена, обеспечивающего резистентность к тетрациклину

Изготовленные плазмиды переданы рабочей группе руководимой др. М. Саарма.

2. Структурный анализ участка генома человека, гомологичного гену ПХ быка.

2.1. Выделение и характеристика геномных клонов.

Рекомбинантные клоны, содержащие последовательности гомологичные гену ПХ быка (гену ЬРС) , выделили из двух геномных клонотек человека, используя в качестве зонда Фрагменты кДНК ПХ быка (рис. 5). Из числа 106 клонов клонотеки, содержащей ДНК фетальной печени (Lawn et al., 1978), изолировали S клонов (CHI, СМ13, CM 15, CM 1? и CM18)

5

дающие позитивный сигнал при гибридизации, а из 9x10 клонов клонотеки (любезно предоставленной др. Р. Алликметс), содержащей ДНК плаценты, выделили 3 клона (А8, All, АЗО). Последующий рестрикционный анализ выявил, что наборы рестрикционных фрагментов у клонов СМ18 и AB являются уникальными, а наборы фрагментов шести остальных клонов совпадаются по парно: они идентичны у клонов СМ1 и CM1S, у клонов СМ13 и СМ1? и у клонов А11 и АЗО. По видимому, клоны содержащие вставки с одинаковыми наборами рестрикционных Фрагментов являются копиями одного исходного клона, и поэтому только один представитель из каждой пары (СМ1, СМ13, А11) был выбран для дальнейшего изучения. Размеры вставок изолированных геномных клонов следующие: у клона СМ1 - 15 т. п. о.; у СМ13 - 15 т. п. о.; у СМ18 - 13 т. п. о.; у AB - IS т. п. о.; у А11 - 14 т. п. о.

Сравнение рестрикционных карт клонов СМ1, СМ13 и СМ18 (рис. 5) показывает, что вставки этих клонов составляют серию перекрывающихся фрагментов участка генома человека длиной около 20 т. п. о. фрагменты ДНК, расщепленной рестриктаэой BamHI, которые гибридиэуются с 5'-концевым и З'-концевым зондом кДНК ПХ быка, составляют свыше 9 т. п. о.

5' probe 3' photoe

a) bovine PC cDNA

/И

E H

B<87)

H-

*m\

B(56l)

"I-

I

b) hurtan PC-^ -+-

Xli-i

6 7 99/

H-

B0086)

7Г /

/а v/ lié

CHS

МП 4-M «-

E H В

i I I

BHHB в

ai кь

1 kb

CHI, CMS CMte

H BEE

E H В

В в

вн

BHHB

I I I I

CH13. СИ17

HE E H EHB ->-"-LJ-U_y/ AS

BHHB В ■ ' " '

All АЭ0

Рис. S. Карта и стратегия секвенирования участка генома человека, гомологичного гену ЬРС (ЬРСф). (а) Схематическое изображение фрагментов кДНК ПК быка, использованных при выделении и характеризоввнии геномных клонов. Указано расположение сайтов рестриктазы BamHI и инициирующего [ ATG) и терминирующего кодона (TGA) . С б) Организация гена hPCip , рестрикционные карты и стратегия секвенирования

изолированных геномных клонов. Участки гена ИРСф , гомологичные зкзонам гена ЬРС, отмечены черными ящиками. Левосторонней часть вставки клонов СМ1 и СМ15 размером в 3 т. п. о. и правосторонная часть вставки клона А8 размером в 3,5 т. п. о. не указаны. Длинной двусторонней стрелкой обозначен фрагмент клонов А11 и АЗС, не гибридизующийся с зондами кДНК ПХ быка. Обозначения сайтов рестриктаз: В -BamHI, Е - EcoRI, Н - Hindlll.

(3,3 + 2,4 + 1,7 т. п. о.) из этого участка.

В клонах AS и А11, изолированных из другой клонотеки, также содержатся BamHI фрагменты величиной в 2,4 т. п. о. и 1,7 т. п. о., гибридизующиеся с З'-концевым зондом, а в клоне А11 BamHI фрагмент длиной в 1,4 т. п. о., гибридизухщийся с BamHI-Hinfl зондом. Однако, в двух участках рестрикционные карты изолированных клонов расходятся. Во-первых, в отличие от клонов СМ18 и А11, в клоне А8 гибридизуется с BamHI-Hinfl зондом BamHI фрагмент размером в 6,7 т. п. о., а рестрикционные карты клонов А8 и Ail различаются друг от друге в 3' фланкирующем участке

изучаемого гена на протяжении й т. п. о. (рис. 5). Во-вторых, иэ фрагментов рестрикции с BamHI в клоне А11 с S'-концевым зондом гибридизуется только фрагмент величиной в 0,7 т. п. о., а рестрикционная карта прилегающей части вставки А11 размером в 5,3 т. п. о. полностью различается от карты клонов CHI, СМ13 и СМ18 в соответствуйте* участке. По видимому, в клоне А11 содержится фрагмент гена ПХ, структура которого в регионе, расположенным в 5' направлении от экэона 5, различается от структуры гена ПХ, представленного в клонах СМ1, СМ1Э и СМ18. Однако, не исключено, что вставка клона All образовалась в результате слияния двух раздельно расположенных в геноме Фрагментов ДНК в ходе изготовления клонотеки.

2.2. Первичная структура последовательностей генома человека, гомологичных экзонам гена ЬРС.

Первичная структура была определена у фрагментов ДНК человека, покрывающих в сумме 6т. п. о. на участке размером в 11 т. п. о. В том числе секвенированы последовательности, гомологичные всему кодирующему региону и непосредственным Фланкирующим участкам гена ЬРС в 5' и 3' направлении. Фрагменты ДНК человека, гомологичные экзонам 1-9 гена ЬРС, расположены на участке размером в 10 т. п. о. Сравнение установленных нуклеотидных последовательностей ДНК человека и зкзонов гена ЬРС (рис. 6) показывает, что рвэмеры "экэонов" 1-3, 3 и 7-9 изучаемого гена человека являются идентичными размерам соответствующих экэонов гена ЬРС, однако в "зкзоне" 4 гена человека делетировано одно основание, а в "зкзоне" б гена человека—два основания. Гомология нуклеотидных последовательностей кодирующей части гена ЬРС и выстроенных "зкзонов" 1-9 составляет 82% (наименьшая гомология (76%) наблюдается в зкзоне 1, а наибольшая гомология (84%) в экзонах 5 и 6). Недавно опубликованная нуклеотидная последовательность части (экэонов 6-8) гена пепсиногена А (ПГА) быка (1-й а! а1., 1988) имеет примерно такую же гомологию ( 86%) с последовательности) соответствующего участка гена ПГА человека (Во^ака аХ., 1983).

Делеция размером в одно основание в "зкзоне" 4 (в кодоне 124 по нумерации кодонов ЬРС, использованной на рис. 6) причиняет сдвиг рамки трансляции предполагаемой мРНК изучаемого гена человека по сравнению с мРНК ЬРС и появление терминирующего кодона, перекрывающего с кодонами 163 и 164

ЬРС* ATiUIAfiATATTCTGAGACAACACI^AGGATACCTAACCCCCATGCTGATAAGÇGCCACAGATGGCCTCACTCGG ЬРС CCCGGGGTGGT* *

-150 -100

TGTGAGTGCTCCTTATCAGCATCGGTCTTAGGTATCCTGAGTGTTGTCTCACTGTATTTGTGCAGTGACCTACAGTCAG MQCC**»*C*»***»**»A£»**»*G*»GT»**GT***G***C»A»**T*A*»*C**»»k***«**G**CGA*T*T»»

-50

CAGCTATCTCTGAAGTCTGGGCTTCCAGCCACAGGACACCTGGCTCCCTCTATAAAGGCTGTGGA-GTGGGCTCTGGCT »G»*»»»*»»*»C*»CT*»»»»*C*»»»»»»G»**GAG»»CC»TA»»T»»»»»»*»A»»*»*»»»A*»*»»»C»»»*»»

♦ 1 50

GGAGCAjGTGGCCAGTCTGCAGTCCAGG ATG AGG GGC CTT GTG GTA TTC CTT GCA GTC TTT GCT CTC AC»*»»*C*»»TG*A*CCAGA»»**A» »»* »»* T»T **C .»»• »»G C*A »*• **T »•• *»C *** »»*

I 1 10

TCT GAO GTC AAT GCC АТС ACC AG GTGAGTGTCA...intcon A (1.9 kb),.ATCTCCTCAG G GTT .»С с»» .Q. (¡c. *XG ••« ••• •• ••••••••«»., .lntron А (3.0 kb) . ,с<»»»»»»»» • A»C

20

CCT CTG CAC AAA GGG AAG TCG CTG AGG AGG GCC CTG AGG GAG CGC AGG CTC CTG GAG GAC • *• »•• T»» **» »*C **» »*T •*» »»• *A» *»G *»» *A* • »• «AT G** »*T *•* ***

10 40

TTC CTG AGG AAT CAC CAT TAT GCA GTC AGC AGG AAG CAC TCC AGC TCT GGG GTG GTG GCC •*» *»» CA* »*A *»G »*G »** »GC A»» •** *»C •»* T*» *•* G*» *TC *** »A* »** **•

50 60

AGC GAG TCT CTG ACC AAC TAC CTG GAT GTGAGTGGCT... intron В (0.9 kb)...CTGTCTTCAG »•• C»C ••• ••* •** «** ..lntron В (0.7 kbï. .****»с**л*

70

TGT CAG TAC TTT GGG AAG АТС TAC АТС GGG ACC CCT CCC CAG AAG TTC ACC TTG GTG TTT A»* ••• ••» • •• «*« *** С*** **G *** *** G»* **» G*° С** ***

80 90

GAT ACA GGC TCC CCG GAT АТС TGG GTG CCC TCT GTC TAC TGC AAC AGT GAT GCC TGT С **C »*T »»* T»T **C T** *** **A *** A** *•* **G **C A** *«C A

100 110

GTGAGTGACC...Intron С (О.в кЫ...TGTGTTTCAG AA AAC CAC CAA CGC TTC GAT CCG TCC ..lntron С (1.0 kb)...»••••»C»** *** *** **G «•* »»C AGA

A

AAG TCC TCC ACC CA- CAG AAC ATG GGC AAG TCC CTG ТСС АТС CAG TAT GGC АСА GGC AGC *»G *** TTC *** *** С** •** С** *** **T **С »»с **г *** **»

120 130

ATG CGG GGC TTG CTG GGC TAT GAC ACT GTC ACC GTAAGTGGTG.,. intron О (1.9 kb)..TCT ••• »A* ••• A»C «*A ••• •»• ••• ««C ••• **T ••G"«**A»... intron D <1.4 kb)..»» 140 150

CTTGCAG GTC TCC AAC ATT GTG GAC CCC CAC CAG ACT GTG GGT CTG AJGC ACC CAG GAA CCT •*»•»*» *** »** «** ДХ» »»G *** »»A **A »»C *»• ••• *»• «»G *»C

160

GGC GAC АТС TTC ACC TAC TCC GAG TTT GAT GGG АТС CTG GGG CTG GCC TAT CCC TCT CTT »»G »•» G»» *»» »»• «»T G»* »»A »*C *»C »•* •** •»• *•• A»» **» »»C «*G *»C

170 180

GCC TCT GAG tftg TCA GTG CCA GTG TTT GAC AAC ACG ATG CAG AGG CAC CTG GTG GCC CAA ••• »»А *•• »»С »»G A*A »»С »•• »*» ••• »*• »T* •»» A»C *»» *»• »•• *•* »*» •••

190 200

GAC CTG TTC TCA GTC TAC ATG AGC AG GTAAGAGCTG...lntron E (1.4 kb)... "* 210 *** "T *** "' °A* ** ......--.»"»on E (0.5 kb) ...

ьрсо ттсстттсао о лат сас сас сос лес атс стс асо стс асс ссс атт сат сто тсс ЬРС С********* • *»• *с* *а* с** ••• ««С ««с -С» **с

220 230

ТАС ТАС АСА асе ТСС СЮ САС ТСО АТА ССС АТС АСТ С— САА 6АА ТАС ТСО САО ТТС АСТ •»# #*• *** *** **• *** С*С *** С** #*А 'ТЯ **0

240 250

СТО САС АС ОТСООГСАОС.. .1п£гоп Г (0.8 КЫ . .СССТТССААС Т СТС АТС АТТ САС ССС СТО ... ... .. .¡.п«оп Г (1.5 кЬ) ..«••*СТ*С** • •*• «С» «С АС" "Т ••*

260

ото вте осс твт еле ест ссс тст сас ссс атс стс сас асс овс асс тсс сто стс вте

*** *** *** *•* *** •** *** •** **0 *** *** аа* **с

270 280

ООО ССТ ООС ОСА САС АТС СТС ААС АТС САС САС ОСС АТА вСА ССС АСТ ОСО ССС САС ТАС д.» д»с б** **• *** *** **Т ••• **А СА* АА*

290 300

ДАТ ОАв СТСАССТСАй. . ,1ПЬГ0П г 10.6 кЬ) .. .ССТТСТТТАЯ ТТТ САС АТС вАС ТвС ООО ССС 00. ... • »•••сс*"...1п1гоп О (0.5 кЫ...!*•••••••• ••* •*« ••• ••• ••• "АС аа*

310

СЮ АСС АСС АТТ ССС АСС ЙСТ ОТС ТТС вАС АТС САС СЙС ААС ААа ТАС ССС СТС ССА ССС *** -[А* **G «ТС *** **Т *** Л*Т **а *Т* **а А*С

320 330

тсс всс тат асс асс сав СТЛТСЛСТСТ...ШСГСП И (0.7 кЬ) .. .ссттссссас сас сао ссс *** »к* »** »** 1Г^ГОП Н (0.6 кЬ> .. . ***

Б

ТТС ТСС АСС Авт ССТ ТТС САО вот ОАС ТАТ АСТ ТСС САС САС ТОО АТС СТО (КС ААТ ОТС **• *** #•* ««* а** **А а** СА* *** а*а ••• • С**

340 350

ТТС АТС ТСв САО ТАТ ТАС АСТ СТС ТТТ ОАС АСС АСС ЛАТ ААС СОТ СТО ООО СТС ССС ААС •к* *** С*А *** *** *** **С *** *** *** *** С** **С *** *ТС *** *** *** *#С **А

360 370

ОСТ ОТС |ТСЯГТОСАТСАСТССССАСООАССТСААТОТОАССАААСА-------------------------------

••С А** 1Тта.СА....0.**А...д*л......с...Сс.*.С.*.ССТ(зСАСАСАСАСАТССАСАСАТСТАСАТСА

380

---------САСАСССССДСАТАСАТСАСДТСТССАСССАСАТССГГСССААТАу.САССССАТТТСТССАЛАСССТСА

0САСАТ0ТО*****А*А****С*******О*Т*С***А******А***Т********СТТ*ТС****ОТ*****Т***С

сттсссттсттстсдстсссастс^астстссссссттстсссссгссАтстсдстсссдсатсстстстссссдсдс

Рис. 6. Сравнение частичных нуклеотидных последовательностей участка генома человека, гомологичного гену ЬРС (ЬРСл ), и ЬРС (Н1£)ака а1 а1., 1986). (А) В' - фланкирухщие последовательности и экзоны 1-5; С Б) зкзоны 6-9 и 3'-Фланкирующие последовательности. Размеры интроноа указаны в скобках. Звездочками отмечены основания, идентичные основаниям гена ЬРС^ . Нумерация основании в двух направлениях от начала транскрипции гена ЬРС. Цифры под последовательности гена ЬРС указывают положения кодонов. Прямые и инвертированные повторы основании в 3Фланкирующем регионе гена ЬРСф отмечены стрелками. ТАТА-бокс в 5'-Фланкирующих участках и ААТААА-злемент в 3'- флакируюцих участках подчеркнуты. Приведенная нуклеотидная последовательность ЬРСф депонирована в библиотеке нуклеотидных последовательностей ввпвапК СЛос Аламос, США) под номером М32503.

мРНК ЬРС. Следовательно, возможная мРНК этого гена человеке могла бы кодировать белок из 162 аминокислотных остатков, соответствующий сигнальному пептиду, пропептидному сегменту и N-концевой части первого домена из двухдоменной структуры бычьего химозина, включая аминокислотные остатки Asp-Thr-Gly первого домена, расположенные в активном центре аспартатных лротевз. Нуклеотидная последовательность изучаемого гена человека содержит критические изменения еще в двух положениях: в "экзоне" 5 (в . кодоне 192) находится терминирующий кодон в «азе с белковой последовательностю гена ЬРС, а в "экзоне" 6 (в кодоне 245) находится вторая мутация сдвига рамки Сделеция размером в два основания). 3'-концевая часть "экэона" 5 гена человека, содержащая терминирующий кодон в рамке трансляции мРНК ЬРС, была секвенирована в четырех клонах С СМ 1, СМ18, А8, А11), выделенных из двух разных клонотек, и во всех случаях нуклеотидные последовательности оказались идентичными. Таким образом, анализ первичной структуры изучаемого гена человека выявляет присутствие в нем ряда мутации, которые превращают этот ген неспособным кодировать полноразмерный белок, гомологичный ПХ Быка. Поэтому далее мы ссылаемся на этот ген как на псевдоген прохимозина человека и обозначаем ЬРСф.

Следует отметить, что по имеющимся данным нельзя сделать окончательный вывод, что изучаемый нами участок генома человека является неизбежно псевдогеном. Во-первых, не исключено, что в ходе сплвйсинга предположительного предшественника мРНК исследуемого гена "экзоны" 4-6 вырезаются (как, например, псевдо-зкэон, описанный в гене А-Кристаллина человека (Jaworski and Pietigorsky, 1989)) или заменяются другими участками гена. Во-вторых, можно спекулировать, что 5'-концеввя часть гена ИРСф (до середины "экзона" 5) кодирует гомодимерную аспартатную протеаэу, подобную протеазам ретровирусов (Navia et al., 1989).

Если в нуклеотидной последовательности hPCtfj в кодонах 124 и 245 сохранить рамку трансляции, соответствующую рамке мРНК ЬРС, и продолжать выведение аминокислотных остатков после терминирующего кодона в позиции 192, рассчитанная аминокислотная последовательность hPC\jj (рис. 7) содержит ряд аминокислотных остатков, консервативные в определенных положениях С-концевого домена аспартатных протеаз. Остатки активного центра Aep-Thr-Gly, кодированные экзоном 7 всех генов аспартатных протеаз млекопитающих, описанных до

1 lo » зо fo 50 <о 7е. Io Г*

hPC» IUGLVVFMVTUAlVMITinFnjaC<X8ZJUUUJIBKL¿B>fXI0nnnrAVSKKHS88----GWWíESLT»TLOC^Yr¿*I TI СЛТКЖМТ.

ЬРС ..C...L.......OGTS...I..T......K..K.BG......0«QQ-GI.S .T.GF----.В. . .V»......8.......Ь.....В..»

hrcA .xb.uxgl.-____ci-Wf».. .rwt.....т.е. .с. .к.. .xk.hlxpa. .YrpgMBAm.DBQp.B.. . -ив.. .t.G----a.D..v

hpgc .nm. .v.vclo.l.a-.wk...kfr..z.rrmk.rc..gk.. .t.k.opjuf .trfgdl--s.it.pm-a.m.juk. . .b.s......H.LV

loo 1)0 í?0 . 130 140 150 lfO 170

L.....S.F____I..K.I. .K.......*____F..I..F...I......Q.1.............10............т...«.......a..____

......sin........s.b. .т..». .■.bd...t.stsbtv..t......t.x......o.gg.s.tb.ip. ..вт...вл.т.ар...........is

1......sm........0.0..ts.s..a..b...t8t«.qtf.l...s..lt.n----l. .os.ov.b.et. ..kb...m.v.jo....n>____a.8

200 210 220 230 340 2}0 240 270 210 :?0

St«VFVFl*niOiaLVAOOLreVTritbt--IiDQe$l¿TUUIDW«TG8U*lM»T»OBWO

. .T.I.....M.M.............0.« .0.1.....G...P.........V.V.V.Q.........T.l---->..!............К----HD

. SGAT.....INN0G..8.......L.A-DOQS . .WIPGC. .8.......к. V. V.VKG. . . t----ITWM. B1-. .аж. ... .......T.

VDBATTAMQGKV.BGALTSPV____L.H0QC88.GAWPGCV.8.L. . .QIT.A.V.OBL.. .ICIBSrL.G.QASGV.BI.....V.......TV .00*

100 3(0 3)0 3}0 3{0 350 340 370 3M 3?»

ILMIQQAtGATMSQnXPVIDCGltUlSIPTAVPBIBGKKYPLPPeATYSODQGPCTSGfOÚ---DraQ^HIUavPLIMIMIUllMnCUUV

...........OI..G......D4..n..V____а. .N. . .T.................В---ПН. .-К----О. ..»........А. -Ь......1

• А.. .6D. . .sebsftgwiws.SAl. .L.D1. .T.B.VO..V.....IL.8B.8.1.....MtPTB.CS-L----О.. .»О-ГТ----A. .Q----PVA

HSALL. .Т. .qh»b.g0.I>V*.BSI0M..StT.I.8.VKr.....S.ILen.r..V.vcrms«qhe.n.----О.-до----T.LG.....Р.Т.А

Рис. 7. Сравнение аминокислотных последовательностей, расситанных от структуры генов hPCtJi, ЬРС (Hidaka et al., 1986), hPGA (ген ПГА человека; Soaawa et al., 1983) и hPGC (ген ПГС человека; Науапо et al-, 1988). Точки обозначают аминокислотные остатки, идентичные остаткам , кодированным геном hPC$ . Звездочками отмечены кодоны с делециями, причиняющими сдвиг рамки трансляции, а черным кружком кодон с нонсенс-мутацией в последовательности hPC<K Аминокислотные остатки OTG, соответствующие остаткам активного центра аспартатных протеаэ, подчеркнуты в последовательности hPCifi.

настоящей времени, консервативны и в рассчитанной белковом последовательности ЬРОф , а четыре остатка цистеина, кодированные "экэонами" 7, В и 9 гена ЬРСф, расположены в типичных положениях. Рассчитанные аминокислотные последовательности (лРСф и ЬРС содержат идентичные остатки на 293 позициях из ЗВ1 (из 323 остатков зрелого химозина идентичны 257 (80%), из 16 остатков сигнального пептида - 12 (75%), а из 42 остатков пропептидв - 24 (В7%)).

Сравнение аминокислотной последовательности,

кодированной геном ИРСф, с рассчитанными последовательностями пепсиногенов А и С человека, выявляет общие аминокислотные остатки на 208 и на 170 положениях, соответственно (рис. 7). Таким образом, в обейх случаях гомология заметно ниже чем гомология выведенных аминокислотных последовательностей ЬРСф и ЬРС. Эта свидетельствует о том, что расхождение генов аспартатных протеаэ на функционально различные гены прохимоэина и пепсиногенов происходило в ходе эволюции перед дивергенцией отрядов приматов и парнокопытных.

Используя предположение, что скорости эволюционирования генов ПХ и ПГА являются равными, можно приблизительно оценить промежуток времени, проаедаий от момента превращения гена ПХ человека в псевдоген ПХ. Общее число замен основании

в расчете на нуклеотидный сайт у генов ЬРСф и ЬРС составляет

0,168, 0,064 и 0,337 замен в первом, втором и третьем

положении кодона, соответственно, а скорости накопления

-9 -9

замен основании у генов ПГА - 0,89x10 , 0,34x10 и 1,96x10 замен на нуклеотидный сайт в год в первом, втором и третьем положении кодона, соответственно (средние значения вычислены исходя из сравнения нуклеотидной

последовательности гена ПГА человека (Боевые в1 а1., 1963) с последовательностями гена ПГА быка (1_и вЬ а1., 1988) и кДНК ПГА свиньи (Тгика£08Ь1 в! а1., 1988)). Принимая за скорость

-9

эволюционирсаания псевдогена 4,6x10 замен основании на нуклеотидный сайт в год (1.1 е1 а1., 1981) и временем, истекшей от радиации отрядов млекопитающих, 80 млн. лет, получим, что от момента превращения гена ПХ человека в псевдоген ПХ прошло примерно 10 млн. лет (7 млн. лет для первых двух положении кодона и 9 млн. лет для третьего положения кодона).

2.3. Структура 5'- и 3'-»ланкирующих участков.

В протяжении 130 п. о. 5'-»ланкирующие участки генов ►)РСф и ЬРС гомологичны на 75% (рис. 6А; в нунлеотидную последовательность ЬРС^ введен разрыв размером в одно основание). Эти последовательности содержат ТАТА-бокс в одинаковых положениях, однако мотив СААТ-бокса (ССААТ), наблюдаемый в 5'— участке бычьего гена, отсутствует в последовательности ЬРСф. В Б'-фланкирующем регионе гена ЬРСф найдены несколько повторяющихся последовательностей. В положениях от -109 до -221 ЬРСф (положения основании обозначены в соответствии с началом транскрипции гена ЬРС (Н1сЗака вЬ а1., 1986)) находится палиндромный элемент с почти перфектным (одно основание заменено) инвертированным повтором размером в 41 л. о. (положения от -109 до -149 и от -181 до -221), а в положениях от -13 до -21 и от -93 до -101 ЬРСф находятся прямые повторы (9 п. о.).

Для выстраивания З'-концевых последовательностей генов ЬРСф и ЬРС с максимальной гомологией требуется введение двух разрывов в сравниваемые нуклеотидные последовательности (рис. 6Б). В 3'-фланкирующем участке МРСф обнаружена делеция размером в 40 п. о., которая захватывает большую часть из примерно 60 очередупщихся СА основании в 3 нетранслируемом регионе генв ЬРС. Вторая делеция (размером в 9 п. о.) находится в 3' направлении от потенциального сайта

а) hPCi}j: ЬРС :

в) hPCiJi: ЬРС :

в) hPCijj: ЬРС :

г) hPCip: ЬРС :

Д) ЬРСф: ЬРС :

GGC7GTGGA-GTGGGCTCTG AGCTGTGGAAGTGGGCCCTG

GTCCTCCACCCA-CAGAACA GTCGTCCACCTTCCAGAACC

TACCCATGACTG—CAAGAA TGCCCGTGACTGTGCAGCAG

д----------------------------------------CACACGCGCAC

ACCTGCACACACACATGCACACAT6TACATGAGCACATGT6C/-CADACACAC

GCCTGACTTCCCTTGTTGTCACTGGGGC GTCTGGCTTCCTTT---------GGGGC

Рис. 8. Фрагменты выстроенных нуклеотидных последовательностей В'- С а) и З'-Фланкирующих участков (г, д) и зкзонов 4 (б) и 6 (в) генов ЬРСф и ЬРС, прилегающие к делециям в одной из генов. Короткие прямые повторы основании подчеркнуты.

полиаденилирования (ААТААА) гена ЬРС. Мотив сайта полиаденилирования содержится также в З'-прилегающейся последовательности гена hPC\f>.

Во всех участках, где обнаружены делеции при сравнении нуклеотидных последовательностей генов hPCij) и ЬРС, в непосредственной близости присутствуют короткие прямые повторы основании (размерами в пределах 3-12 нуклеотидов) (рис. 8). Можно предположить, что эти делеции возникли в результате "скольжения" цепей ДНК в ходе репликации ( Efstratiadis at al., 1980).

Сравнение первичных структур S'-фланкирующих регионов генов ЬРСф и hPGA (Sogawa et al., 1983) не выявляет длинных общих мотивов, однако идентичная последовательность из ? основании (GATAAGG) найдена в положениях от -S2 до -46 гена hPGA и в положениях от -1В? до -181 гена hPCiJi. В обейх случаях этот мотив расположен в палиндромном элементе (частично в случае гена hPGA).

2.4. Гибридизационный анализ геномной ДНК.

ДНК, выделенную из клеток желудка человека и быка,

анализировали по методу Саузерна (Southern, 1975), используя

32

в качестве пробы Р-меченные фрагменты кДНК ПХ быка. Блот-гибридизация ДНК быка, расщепленной рестриктазой BamHI, выявляет фрагменты размерами в 1,6 и 2,1 т. п. о. при использовании S'-концевого зонда, и фрагменты размерами в 0,8, 1,0 и 1,8 т. п. о. при использовании З'-концевого зонда. Наблюдаемый набор BamHI Фрагментов, а также наборы гибридизующихся фрагментов рестрикции остальных использованных рестриктаэ (рис. 9А), хорошо согласуются с рестрикцион-

А Б

5' ргоЬе 3' ргоЬе 5' ргоЬе 3' ргоЬе

В В0 Е ЕН В Вд Е ЕН ВЕ Е В В Е

Рис. 9. Блот-гибридизация геномной ДНК быка (А) и человека СБ) с 5'- и З'-концевыми зондами кДНК ЬРС С авторадиограммы). Геномная ДНК расщеплена рестриктазами ВатН1 (В), BglI ( Вй) , ЕсоЯ1 СЕ), ЕсаЯ1 + Н1псП11 СЕН) или ВатН1 + ЕсоВХ С ВЕ) . Справа от авторадиограмм указано расположение маркерных Фрагментов ДНК на злектрофореграмме Сраэмеры в т. п. о.).

ной квртой клонированного гена ЬРС С Н1<3ака еЬ а1., 19В6).

На дорожке человеческой ДНК, рестриктированной ВатН1, при гибридизации Б'-концевым зондом кДНК появляется сигнал, соответствующий фрагменту размером в 3,3 т. п. о., а при гибридизации З'-концевым зондом - сильный сигнал, соответствующий фрагменту размером в 2,4 т. п. о. и слабый сигнал, соответствующий фрагменту размером в 1,7 т. п. о. Срис. 9Б). Из человеческой ДНК, расщепленной рестриктазой ЕсоН1, гибридизуются 5'-концевым зондом фрагменты размером в 5,8 т. п. о. и приблизительно в 8,5 т. п. о., а З'-концевым зондом - фрагмент размером в 5,8 т. п. о. Таким образом, размеры фрагментов геномной ДНК, рестриктированной ВашН1, гибридиэирующиеся зондами кДНК ПХ быка, равны размерам Фрагментов из выделенных геномных клонов ЬРСф, но фрагмент размером а 5,8 т. п. о., наблюдаемый при гибридизации геномной ДНК, расщепленной рестриктазой ЕооВ1, не соответствует расположению сайтов ЕсоВ1 в геномных клонах. Гибридизация геномной ДНК, рестриктированной одновременно рестриктазами ВашН1 и ЕсоН1, 5'-концевым зондом кДНК ПХ быка выявляет, что расщепление ВатН1 фрагмента ЪРСф размером в Б,3 т. п. о. рестриктазой ЕсоВ1 в геномной ДНК и в клонах СМ1, СМ13 и СМ1В происходит одинаково. По видимому наличие ЕсоДХ Фрагмента размером в 5,8 т. п. о. на геномном блоте

свидетельствует о том, что 3'-Фланкирующий участок ЬРСф в геномной ДНК человека, использованной при гибридизациоином анализе, содержит дополнительный сайт рестриктаэы EcoHI, отсутствующий в изолированных геномных клонах.

Таким образом, результаты блот-гибридизации --еномной ЦНК человека указывают, что геном человека не содержит последовательностей, первичная структура которых является близким к структуре экзонов гена ЬРС, кроме участка генома, описанного в настоящей работе. Дальнейшими экспериментами С анализом ДНК линии гибридных клеток человека и хомячка методом полимеразной цепной реакции) установлено, что ген hPCiJi расположен в первом хромосоме человека (Kolmer, örd, Alhonen, Hyttinen, Saarma, Villems and Jänne, submitted).

ВЫВОДЫ

1. Изготовлена клонотека кДНК клеток слизистой оболочки желудка телёнка и выделена из нее кДНК ПХ. Анализ нуклеотидной последовательности клонированной кДНК ПХ быка выявил в ней несколько замен основании по сравнению с ранее опубликованными.

2. Сконструированы плазмиды, обеспечивающие экспрессию кДНК ПХ быка и ее фрагментов в Escherichia coli под контролем левого промотора фага А . Изучена экспрессия кДНК ПХ быка в штамме Е. coli, продуцирующем термочувствительный репрессор «are X .

3. Из двух клонотек ДНК человека выделены клоны, покрывающие участок генома человека, гомологичный кодирующему региону и фланкирующим последовательностям гена ПХ быка. Определена частичная первичная структура клонов и установлено, что последовательности, гомологичные экэонам 1-9 гена ПХ быка, расположены в фрагменте ДНК человека размером в 10т. п. о.

4. Установлено, что гомология выстроенной нуклеотидной последовательности Фрагментов ДНК человека и кодирующей части гена ПХ быка составляет 62Х (наименьшая гомология, 76Х, наблюдается с экэоном 1, а наибольшая гомология, 84Х, с экзонами 5 и 6 гена ПХ быка), однако в "экзонах" 4 и 6 наблюдаемого гена человека обнаружены мутации сдвига рамки трансляции (делеции размером в одно и два основания, соответственно), а в "экэоне" S наблюдаемого гена человеке содержится терминирующий кодон в фазе чтения мРНК ПХ быка.

Таким образом, анализ первичной структуры изучаемого участка генома человека выявляет ряд мутации, исключающие возможность кодирования полноразмерного белка, гомологичного ПХ быка, и следовательно, в геноме человека содержится псевдогвн ПХ.

5. Показано, что геном человека не содержит последовательностей, первичная структура которых является близкой к структуре зкзонов гена ПХ быка, кроме участка генома, описанного в настоящей работе.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1. Эрд Т. А., Торп А. А., Кольмер М. И. Молекулярное клонирование гена химозина и исследование его экспрессии // Биотехнология. - 198?. - Т. 3. - № 3. - С. 307-311.

2. Эрд Т. А., Торп А. А., Кольмер М. И. Экспрессия кДНК прохимозина теленка в Esherichia coli // Тезисы докладов VII Всесоюзного симпозиума по химии белков и пептидов,- Таллинн, 1907. - С. 138-139.

3. Эрд Т. А., Пийпер Ю. X. Структура 5'-концевого участка гена прохимозина в геноме человека // Доклады АН СССР. - 1988. - Т. 301 - № 3. - С. 761-764.

4. Кольмер М. И., Эрд Т. А., Улманен. Клонирование и экспрессия химозина в клетках млекопитающих // Доклады АН СССР. - 1989. - Т. 308. - № 1. - С. 234-237.

5. fird Т., Piiper J. Structure of prochymosin (psaudo)-gene in human genome // 14th International Congress of Biochemistry, July 10-15, 1988, Prague, Czechoslovakia. Abstracts July 15, 1988. - Prague, )988. - P. 108.

6. Ord T., Kolmer m., Villems R., Saarma M. Characterization of human genomic region homologous to bovine proehymosin gene // Тезисы докладов и стендовых сообщении Второго двустороннего симпозиума СССР-США "Структура зукариотическо-го генома и регуляция его экспрессии". - Москва, 1989. - С. 61 .

7. (3rd Т., Kolmer M., Villems R., Saarma M. Structure of the human genomic region homologous to the bovine prochymosin-encoding gene // Gene. - 1990. - Vol. 91. - No 2. - P. 241-246.