Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование и характеристика часто повторяющихся последовательностей семейства PatL, специфичных для подотряда Ruminontia

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Клонирование и характеристика часто повторяющихся последовательностей семейства PatL, специфичных для подотряда Ruminontia"

академия наук армянской сс?

институт биохшпе

На правах рукописи УДК 577.216.9:578.52

АКСГОТН Карен Пановт

КШШР0ВШ2 И х4ржшрйсейка ЧАСТО ПОВТОРЯЕМСЯ ПООЛЕДОВЛТЕЛЬНОСХЕЛ сешества рв«, спщшчшх ДЛЯ ПОДОТРЯДА Вш1тпИа

• 03.СО.03 - молекулярная биологсш

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЕРЕВАН - 1990

Работа выполнена в Институте молекулярной гонотики АН СССР в отлила молекулярной гмЗриогенвтики и клеточной дифференцирован.

Научный руководитель - доктйр биологических наук, профессор, лауреат Государственной премии СССР К. Г. Га©аряи.

Официальна« оппоненты:, доктор биологических наук, профессор

ф-

Р. М. НалОандян,

кандидат биологических наук, старший * научная сотрудник Д. Г. Парсаданян

Вадуыая организация - Научно-исследовательский технологический

институт аминокислот МинмедОиопром СССР *

Защита состоится "_"_ 1890г. а _ часов

на заседании специализированного совета по присуждению ученой степени кандидата наук Д 0^3.15.01 при Институте биохимии АН Арм. ССР С375044, Ереван-44, ул. П.Севака, 9/1Э.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии АН Арм. ССР.

явторефэрат разослан "_"_ 1090г.

Учений секретарь спецсовота доктор Биологических наук, профессор

А. А. Симонян

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Обязательным компонентом геномов эукариот являются часто повторяющиеся последовательности (Singer H.F. 1982). Несмотря на то, что они исследуются уже на протяжении многих лет, остается много неясных вопросов, касающихся структуры, функции и эволюции этого_ класса повторов. Хорошо изучены такие семейства частых повторов,-отнесенные к LINE, как L1 человека (Skowronski J. et al., 1986), и отнесенные к SINE, как В1 мыши (Krayev A.S.vet al., 1980^ В2 мыши (Krayev A.S. et al., 1982), Alu человека (Jelinek W.R. et al., 1980) и др. Эти повторы диспергированы в геномах, но не являются вездесущи®!, а часто группируются в определенных областях (Oloffsop В. et al., 1983; Vassilev L. et al., 1986). В частности, они нередко встречаются -рядом со структурными генами и даже внутри них (Tsukada T. et al., 1982; Schip van het F. et al., 1987). Такая локализация позволяет . предполагать, ' что эти повторы тлеют отношение к регуляции экспрессии генов, хотя однозначно это не продемонстрировано. Для выяснения функции частых повторов необходимо их дальнейшее исследование, особенно в тех организмах, которые до сих пор не изучены. В частности очень мало исследовались эти повторы в геномах Ruminant la. Настоящая работа посвящена изучению часто повторяющихся последовательностей семейства PstI, характерного для подотряда жвачных (Ruminantta).

Цель работы заключалась в клонировании, определении структуры, транскрибируемости и эволюционной значимости членов семейства повторов PstI.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые определена структура и ориентация повторяющихся последовательностей, окружающих ген гормона роста быка, показано, что эти повторы относятся к PstI- семейству частых повторов. Продемонстрировано отсутствие повторяющихся элементов внутри повтороз. Определена тракскрибируемость повторе! семейства PstI в различных органах быка, показана ассимметричность транскрипции этих повторов.

Установлено, что члены-семейства повторов Pstl могут являтся тестом на принадлежность ДНК к подотряду Ruminant la.

Объем и структура работы. Диссетация состоит из введения, обзора литературы, изложения методов, результатов и их' обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 197 ссылок. Работа изложена на 90 страницах машинописного теста, иллюстрирована 15 рисунками.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на семинаре отдела молекулярной эмбриогенетики и клеточной дифференцироБки ИМГ АН СССР 29.03.90г., совместном семинаре лаборатории молекулярной энзимологии и лаборатории нуклеиновых кислот ИЭБ АН Арм.ССР 21.04.90г., -Советско-Французской конференции "Организация и экспрессия эукариотического и прокариотического генома" (Киев, 1990).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Трансформацию шташа E.colt TG1 (К12 'd(leu-pro) sypE thlhst •dqD5/F traD36 proA+B+ lacl lacZ Ml 5) плазмидной ДНК проводили по методу Манделя и Хита (Mandel M. et al., 1970). Выделение плазмидной ДНК осуществляли по методу Бирнбойма и Доли (Birnboim N.S. et al., 19.79). Очистку ДНК проводили с помощью осаждения полиэтиленгликолем 6000.'

Элюции фрагментов ДНК из .легкоплавкой агарозы (ШРА фирмы "Bio-Rad", USA) проводили как описано Маниатисом с соэет. (Maniatls T. et al., 1932).

Для ■ клонирования и субклонирования фрагментов ДНК применяли стандартные методы (Maniatls T. et al., 1982). В работе использовали ферменты НПО "Фермент" (Вильнюс, СССР) и фирмы "Amersham" (Англия).

Ник-трансляцшо проводили по инструкции к "Nick-translation ' Kit" ("Amersham", Англия) с использованием предоставляемых фирмой реактивов."В реакционную смесь входило, примерно, 0,1 мкг ДНК. В качестве меченного предшественника использовали [а-^РШТ? (НПО

4

"Фермент"., Ташкент, СССР) (Maniati's T. et al., 1982).

Геномную ДНК из разных органов животных выделяли с помощью размельчения в жидком . азоте, обработки протеиназой К с последующей депротеинизацией фенолом и хлороформом и гореосавдением спиртом.

Суммарную РНК из различных органов быка выделяли как описано Шерером с соавт. (Scherrer К. et al., 1962),. Поли(А)-содержащую фракцию РНК (поли(А)+РНК) получали с помощью хроматографии на поли(и)+-сефарозе (Gazaryan К.G. et al., 1975).

Плот- и дот-гибридизации с ДНК и РНК проводили при 65°С с использованием буфера, содержащего 0,2% SDS, 0,1 S пирофосфата натрия, 5xSSPE, 100 мкг/мл гепарина. Отмывали фильтры при той же температуре с использованием последовательно 0,5xSSC с 0,1% SDS и 0,1xSSC с 0,1% SDS. Влот-гибридизацию с ДНК осуществляли по стандартному способу (Southern Е.М., 1975). Блот-гибридизацию с РНК проводили при 65°С по методу, описанному Мазером с соавт. (Mather E.L. et al., 1981). Поли(А)+?НК (5 ккг на лунку) разделяли в \% агарозном гелэ.

Для клонирования и ыечекия однонитевоЗ ДНК использовал!! инструкцию к "М13 Cloning/Sequencing System" ("Pharmacia P-L Blochemlcals", USA) с предоставляемыми фирмой реактивами.

Определение первичной нуклеотндной последовательности проводили по методу Сенгера (Sanger Р. et al., 1977). '

!

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

, Анализ 5'- и 3'-фланкирующих последовательностей ..гена гормона роста быка показал, что в 3'-фланкирующей области повтор расположен на расстоянии не-менее 4,5 т.п.н. и не более 7,0 т.п.н. от" гена, . а его размер не превышает 2,0 т.п.н. Гомологичная последовательность в 5'-области данного гена имеет несколько меньший размер, примерно 1,8 т.п.н. Для более детальной ■ характеристики этих повторой были субклонированы с помощью pUC19 , EcoRI/PstI-фрагмент, расположенный в 5'-фланкирующей

5.

последовательности гена гормона роста быка (плазмида рАКЗ) РзИЛ^Ш-фрагмент, расположенный'В 3'гфланкирующей области тог же гена (плазмида рАК2) (рис. 1).

С целью определения частоты повторения в геноме клонировании повторов из 3'- и 5'-фланкирующих областей гена гормона рост проводили дот-гибридизацию с ДНК и сравнивали интенсивное! сигналов с разными количествами фаговой ДНК,- содержащей ге гормона роста и фланкирующую последовательность. Анализ показал что частота повторения повтора, содержащегося в 5'-фланкирующе области, равна ~105. Аналогичный результат был получен и пр гибридизации с повтором из 31-фланкирующей области.

Картирование ЕсоМ/РзИ-фрагмента плазмида рАКЗ показало что в нем содержатся два сайта для рестриктазы БаиЗА. Пр гибридизации элюированного Есой1/Рз1;1-фрагмента (1,8 т.п.н.) рестрицировашюго БаиЗА, с меченным Н1пйП1/^1П-фрагмешш размером 2,0 т.п.н. из 3'-фланкирующей последовательности клонированным в плазмзде рАК2, гомология выявлялась со всем тремя, образующимися при рестрикции фрагментами (рис. 2а) Следовательно, повторяющиеся последовательности в 5'-фланкирующе области расположены, по всей длине ЕсоМ/Рб^-фрагмента и имея размер не более 1,8 т.п.н.

При гибридизации плазмида рАК2, рестрицированной РэИ, меченным ЕсоШ/РэП-фрагментом плазмида рАКЗ, выявлялас гомология с двумя фрагментами величиной 0,8 и 1,2 т.п.н. (рис 26), т.е. суммарная длина перекрестно гибридизующихс последовательностей равна примерно 2,0 т.п.н. Таким образов соглосно полученным данным длина исследуемых повторов рав! максимум 2,0 т.п.н.- Однако нельзя исключить, что их размер несколько меньше определенных нами.

Интересно было бы сравнить обнаруженные нами повторы с ул известиями клонированными повторяющимися последовательностяь генома быка. -В геноме быка описаны три Еида подобных чао повторяющихся последовательностей. Так РвН-семейство содерю Рзт,т-фрагменты длиной 510 п.н. в количестве 2х105 копий (Макете!

6

5'

51 Р6 R Н- Н^Р

ттт/штщ

Р В31

тжтттшшА i и а.гтпя.

5,1 тан.

I 0,7 И 0,9 l<\51 а,2.тлх. 1,9 тп.н. 0,8 1,атпн1 о,8 I 3,1 т.ан. рХКГ -. ,

Рис. 1. Схема строения и рестриктная карта фрагмента да, содержащего ген гормона роста быка. Заштрихованная область - ген гормона роста быка. Тонкие линии -фланкирующие последовательности. Волнистые линии -локализация повторяющихся последовательностей. Стрелки-ориентация повторов. Условные обозначения: Р - PstI; R -EcoHI; В - BamHI; Н - Hindlll; S - SacI; Sa - Sau3A. Для Sau3A и SacI отмечены только те сайты, которые использовались в экспериментах. ■

-о

■ А . Б

12 12

Рис. 2.: Блот-гкбридизация плазмиды рАК2, рестрицироЕанной Рзг1/Бас1 (1), и плазмиды рОУИ2, рестрицированной ЕсоМ/Рб1;1 (2) с [32Р]рАКЗ (а) и ЕсоИ/РеП-фрагментом плазмиды рАКЗ, -рестрицированной БаиЗА (1) и плазмиды рОУЕ2, рестрицированной ЕсоИ/РвИ (2) с [32Р]рА1Й" (б). Количество ДНК е лунках - 1 мкг. Маркера - отдельные РБ1;1-фрагменты фага X.

(

8.

К. ег а1., 1988). Степень гомологии этого семейства с диспергированными'повторами .других млекопитающих была неизвестна. В геноме быка ранее выявлены также А1и-подобные повторы, которые делятся на два семейства: семейство димерных повторов быка (ВОР) и семейство мономерных повторов быка (ВИ1) (БкоигопэМ. ,1. е1 а1., 1984). Для идентификации клонированных наш повторяющихся последовательностей проводили блот-гибридизацию плазмиды рАК2 с ДНК быка и овцы. Сравнение с данными блот-гибридизации, полученными другими авторами свидетельствуют о сходстве наших повторов с РэП-повторами, описанными Маевской и др. (МаЗеигака К^ а1., 1988) в частности, дискретная полоса при рестрикции ДНК Реи имеет- тот же молекулярный вес, что и Рз1;1-фрагмент, выявленный в геноме быка Маевской при гибридизации с Рэ1;1-повтором. Поскольку совпадает также частота повторения этих повторов, можно считать, что повторы, обнаруженные в 5'- и 3'-фланкирующих областях гена гормона роста быка, откосятся именно к этому семейству.

С целью более надежного доказательства идентичности РБИ-повторов и повторов, обнаруженных нами вблизи гена гормона роста быка, правели частичное • секвинирование одного из клонированных фрагментов (плазмида рАКЗ). Данные приведет на рис. 3. Сиквенировали три участка ДНК: 190 п.н. от сайта БаиЗА в сторону сайта Рз"Ы (участок А); 269 п.н. от сайта ЕсоР.1 в сторону сайта БаиЗА (участок Б) и 330 п.н. от сайта Рзг1 в сторону сайта БаиЗА (участок В). Сравнение этих последовательностей с последовательностью Рэ1:1-фрагментов размером 510 п.н., клонированных и сиквенированных ранее Маевской и др., показало, что с консенсусной последовательностью РэИ-повтора гомологию имеет участок А. В районе от 34 по 174 п.н. участка А имеется 72,8% гомологии с районом РэИ-повтора от 281 по 421 п.н. Последовательность расположенная в ЕсоЫ/БаиЗА-фрагменте не имеет гомологии с РвИ-повтором. Следовательно, описанный Маевской и др. Рэ^-повтор, на самом деле является частью более длинной повторяющейся последовательности. Согласно работе этих авторов

9.

УЧАСТОК Л:

ТТЛ \АОО(тЛ

А * *

СТСОАТС'!Гл "ТСААССТССТ

ж*******

ТОАА'-ЗСТС

АСТСАТТСО1 ********< *

АСТСАТТСОА

АСйСаАССАС **********

АССССАССАС

САТС-АА Ь *****

САТйАС Б УЧАСТОК Б:

СААТТСАСТС ССАСТСААТА АСАЛААСйТС ТСТТСАААСТ СТСААААТТС АйТТТААССС УЧАСТОК В: АТАТССТСТС С(!АТ1'ТиСАО

тсстсстсст

СвСАШАСА вААСАТТСОА ОТОАААСТОА СТОГДКОСА

ЛТСЧС^СОТО ААТА

ЛЛС-САСАТСА

ТСЛААСТТСС ***** **

АААОТ СО АААиАСССТО

х* * *******

ЛАЛС.ХССТС-

ЛААОиОТААС *** * **

АСАС-САТОАС

СТССТСООТС

АСГАСТТТС-О **********

АСТАСТТТОС

АТССТСООАА **********

АТССТСйСАА АТС ТТ САТ

АТСОТТСС.АТ

ТТСАТТСОАА **********

ТТСАТТСОАА

ССАССТОАТ:; **********

ССАССТОАТС,

АСАЖАССС **********

АСАТТСАСай

ССАТСАСТО ******* *

таСАТСАССН

а..г40ТС-АТСТ * * : * * * * * * ПСАСТСАТСС

ТСААОААСТА ***** **

ССААСАОСТа ТОССАСА

САаОАСОАОА

АСТСААТОАА ******** *

АСТСААТОСА

САСС1АТТТС АААТСС'ТСАА ТАССАССААА ТТТССААААС АС-ТТСЮА'ГТ ССААТССТАА АСТвСАС'.' Т ТССАСТСаТС ТССААООСАО ССТТСААСАС ТССАТСТАй

СТСК.ТО: ОА ССАТАтАС СТСапх:1Г!"Г АСССТССАСС САТССТСО'ГА АСТТ'СТТСА САЙССАССАС вОТСССССвТ СТЫХТТСгСС АТТТССТТСТ АСТСАС'ТСАС ТОТСТОССОА ТССААОсТТО СОАТСОаТСС

АОАТСАТССТ Т'ХАААСТОСТ ТСАССАСТСС ССАСАССАСТ АСААЛвАСАА ТСТСАААСАА ТСАСАССОТТ ССААОТААТа ТАССТСААСС АТСААСТТС-С

АйСАТСААСС ТОАСТСТССТ АОСТССААСС ССАТТССТТС СТСйССТССА СТСТТССССА СССТССАТТС ТССААСССАА ССААТОСАТО АААОтеАААА СССТСАОССА СОСССАТСОА АССЮ

Риг. 3. Последовательное?л различных участков ЕсоМ/РэП-фрагмента 5'-фланкирующей области гена гормона роста быка. Последовательность А (линил I,) данз в сравнении с канонической последовательностью РзН-повтора (линия Б) определенной Маевйкой с соавт.

Б

Ь

Ь

данные повторы могут иметь длину 1,2 т.п.н. Следовательно, можно оценить размер Pstl-повторяющихся последовательностей, прилежащих к гену гормона роста быка, равным от 1200 до 2000 п.н.

Pstl-noETOpH, локализованные вокруг гена гормона роста быка, расположены е Pstl-фрагментах, имеющих размеры 1200 и 4900 п.н. (рис. 1), т.е. клонированные нами Pstl-повторы относятся к членам семейства, не содержащим в себе два сайта PstI, расположенные на расстоянии, примерно, 510 п.н. друг от друга, что характерно для многих членов этого семейства.

Для решения вопроса об ориентации изучаемых повторяющихся последовательностей и наличии внутренних повторов в клонированных фрагментах была проведена перекрестная гибридизация в мягких условиях (55°С) плазмидн рАК2, рестрицированной PstI/SacI, с меченным, клонированным в М13шр8 однонитевым фрагментом Sau3A/EcoRI (700 п.н.) из 5'-фланкирующей последовательности re«'i гормона роста быка. При этом" гибридизация происходила лишь с однш фрагментом (800 п.н.) (см. рис. 1). Учитывая отсутстр1-'0 гибридизации в этих условиях 5'-концевого ЕсоЫ/БаиЗА-фрагментп с б'-к.оцевым Sau3A/PstI-$parM6HTOM длиной 900 п.н. и 3*-концевам 1200 п.н. можно утверждать, что гомологичные последовательнее.рп расположены с двух сторон от гена в инвертированной ориентации к не содержат Енутри себя повторяющихся элементов.

Для выяснения степени гомологии между двумя Pstl-повторами, окружающими ген гормона роста быка, проводили т жестких условиях (65°С) гибридизацию плазмид рАКЗ и рАК2 с фрагментом Sau3A/E<:oRI. из 5' -фланкирующей области гена (700 п.н.'. При повнмзшш температуры гибридизации и отмые.ш на 10°С, гибридизация с фрагментом Pstl-'BglII из 3' -(фланкирующей последовательности не происходила, чго указывает на наличие частичной (80 - ЭО'Х) гомологии между 5'- и 3'-концевыми повторами. Это соответствует данным МаевскоЯ и др. (Maje-vska К." et al., 1988), которые с помощью секвижгрования показали, чт) степень гомологии различных ü'.-ьторякщихол Р^и-фрарментоь размером 510 п.н., входящих ь сс> .тав исашусчих нами повторов, составляет 84,6«.

II.

Представлялось интересным выяснить, с ДНК каюк еще организмов имеют гомологию исследуемые повторы. Для этой цели наш были проанализированы с помощью дот-гибридизации ДНК ряда организмов: человека, мыши, голубя, свиньи, камерунской козы, пони, домашней козы и Drosophtla melanogaster. В качестве положительного контроля была использована геномная ДНК быка. Выяснилось, что с меченным зоццом гибридизуются только ДНК овцы, камерунской козы и домашней козы. При этом не обнаружена гибридизация с ДНК человека, мыши,' голубя, свиньи, пони и Drosophtla melanogaster. Результаты гибридизации показывают, что описанные наш повторяющиеся последовательности имеют гомология только с ДНК . некоторых представителей подсемейства козлов и баранов (Caprlnae), входящего в семейство полорогих (Bovldae) (подотряд жвачные, отряд парнокопытные). Интересно было бы проанализировать ДНК других подсемейств данного семейства организмов. Также представляет интерес анализ ДНК представителей других семейств данного подотряда^ (Ruminant la). Однако полученные нами данные показали, что исследуемая последовательность характерна не для всех парнокопытных (Artiodactyla), так как ДНК свиньи, входящая в этот отряд, не гкбридизуется с меченным зондом в этих условиях'. Тагам образом, наш обнаружена повторяющаяся последовательность, которая, возможно, является зондом на определенный таксон в отряде парнокопытных. Аналогичные семейства повторов известны и для других классов организмов. Например, общее семейство повторов обнаружено у гиббона, шимпанзе и человека, но не у других групп приматов Старого Света (Gillespie В., 1977). Существование этих повторов объясняется их скачкообразным образованием на поздних этапах эволюции.

Интенсивность сигналов на автографе указывает на то, что в ДНК овцы, камерунской козы.и домашней козы, последовательности, гомологичные клонированным повторам" быка, также представлены множественными копиями (интенсивность сигналов, примерно, такая же как и с ДНК быка). Полуколичественный анализ автогрзфг показал, что исследуемые последовательности представлены е геномах всех Ruminantia, примерно, 105 копиями.

С цельво клонирования Pstl-подобных повторов из генома общ

ыд осуществлен скрининг геномной библиотеки .с использованием в :ачестве зонда повтора, прилежащего к 5 * -концу гена> гормона роста ыка (плазмида рАКЗ). В результате был выделен рекомбинантный фаг Л1, содержащий вставку генома овцы, размер которой равен , 10 '.п.н.' Отдельные участки этого фрагмента были субклонированы в ¡екторе риС19 (плазмида 'рОУШ-1, рОУШ-2, рОУШ-З, рОУИ2).- На >ис. 4 представлена р'естриктная карта данного'участка генома овцы [ схема субклонирования фрагментов.

С помощью блот-гибридизации провели анализ клонированных фрагментов генома овцы. При использовании в качестве зондов говторов, расположенных на 5'-конце (рис. 5а) и 3'-конце (рис. >б) гена гормона роста, в умеренных условиях гибридизации и >тмывки обнаружена гомология со всеми РэМ-фрагментами тглазмид ЮУЙ1 -1, • рОУЙ1-2, рОУШ-З. При этом имеется различие в штенашности гибридизации разных субклонированных участков с )азными зондами. 3'-концевой РэМ-повтор генома быка

'ибридизуется существенно более интенсивно с РаП-фрагментом зазмером 1,3 т.п.н. и заметно менее интенсивно с РБИ-фрагментом зазмером 1,7 т.п.н., чем 5'-концеЕоЯ повтор. При гибридизации зтих же зондов с р0УН2 обнаружено, что.5'-концевой повтор быка табридизуется с Рэ1;1-фрагментом размером 500 п.н. При гспользовашш в качестве зонда З'-концеЕого повтора гибридизуется вишь РэП-фрагмент размером 2,3 т.п.н. Таким образом, в слонированном фрагменте генома овцы размером 10 т.п.н. участок, имеющий гомологию с 5'-концевым РвИ-повтором генома быка,' равен 3,7 т.п.н.

С З'-концевым-РБ^-ровтором генома быка гомологии имеет тал.е замая область генома овцы за исключением ЕсоШ/РэИ- фрагмента размером 500 п.н. Кроме того, 3'-конец проклонироганного участка ямеет с этим зондом, по-видимому, частичную гомологию.

Определен участок повтора генома быка, расположенный в 5'-флакирующей области гена гормона роста, который имеет гомологию с повторами генома овцы из клонированного фрагмента. С этой цель проводили блот-гибридизацию ЕсоРЛ/ЗаиЗА-фраг,мента

13.

Кис. 4. Рестриктяая к -¡г та участка генома овцы, клонк] оваяного из библиотеки Харон-4А и схема субклонирования фрагментов. Ровные линии - гаклднчя ДНК, иолнистые - вег.тор. Условны0 обозначение р - р;г ; Н - ЕооРГ.

А

Б

по

Рис. 5. Блот-гибридизация рекомбшантных плазмид с Р'"Р] рАКЗ (а) и [32Р]рАК2 (б). В а): 1 - рАК2 (рестрикция Pstl/SacI): ? - pOVRI -1 (рестрикция Pstl/EcoRI); 3 - pOVR1-2 (рестрикция Fotl/EcoRI); a - pOVR1-3 (рестрикция PstI). В 6): 1 - EccRI/PsU-фрэгмент плазмидн рАКЗ (рестрикция Sau3A); 2; 3; 4 - тоже, что в а). Маркеры - отделы-;:;э Pstl-фрагменты ДНК фага

15.

размером 700 п.н. (см. рис. 1), который клонирован в фаге М13тр8,

с различными плазмидами, содержащими повторяющиеся последовательности генома овцы. В качестве контроля на этот ке фильтр были нанесены элюированная EcoRI/PstI-фланкирующая область гена гормона роста быка и плазмида рАК2, содержащая 3'-фланкирующую область того же"'гена. Видно, что с EcoRI/Sau3A-фрагментом гибридизуется только по одному фрагменту из каждой контрольной ДНК, причем гибридизация с фрагментом 3'-концевого повтора генома быка существенно менее интенсивная, чем с гомологичным повтором. При гибридизации данного меченного однонитевого зонда с плазмидами pOVR1-1, pOVR1-2, pOVR1-3, pOVR2, в'умеренных'условиях гибридизации и отмывки (55°С), сигнал давал только вектор. Учитывая, что весь 5'-концевой повтор, фрагмент EcoRI/PstI, гибридизуется с овечьими повторами, можно сделать вывод, что в 5'-области гена гормона роста быка участок, гомологичный проклонированным, повторяющимся последовательностям генома овцы, расположен во фрагменте Sau3A/PstI, имеющем размер 900 п.н;, т.е. только часть Pstl-повтора генома быка шее1! гомологию с Pstl-повторами овцы.

Интересно было посмотреть имеются ли сходные повт9ры околс структурных генов овцы. Из библиотеки генов овцы на EMBL3 с помощью олигонуклеотидных зондов (смесь CCTGACACCAIGGCCTGCTGITCCJ! СС, AAATCCACAGAAGCTGGTGGAACAGCA) выделили фрагмент ДНК, содержащий кератиновые гены (В2А и B2D). На рис. 6 представлен* рестриктная карта клонированного SalGI-фрагмента, размером околс 16,6 т.п.н. Гибридизация этого фрагмента с 5'-концевым повторок гена гормона роста ' быка, показала, что гомологичны« последовательности расположены в области от сайта SalGI до сайт! StuI (см. рис. 6).

Для более детального изучения из данного протяженногс участка был субклонирован SalGI/EcoRI-фрагмент величиной okojk 5,6 т.п.н. На рис. 7 представлена картина блот-гибридизацю плазмида рАКЗ, содержащей 5'-фланкирующую область гена гормон! роста быка (а), и элюированного 3'-повтора того же гена (б), <

16.

а

о ^

а

плечи

ФЛГД

ШЛА.

о:

]В2А|

шш

62!)

А

ы.

о о ш

О •о

л) V)

плечи

"РДГД

+\ЛЛЛЛ

-»-и ъ « ¿1 о-а. ш

/

6

ЕсоЦ,

Ра«

Бах! У-Ьа Рб«

V «

1 0,8тп.н 1,65 тан. о,55т.п.н. 0,55 тан 1,15 т. п. и. 0,ПШ 0,6ТП.Н.

Рис. 6. Рестриктная карта БаШ-фрагмента, содержащего кластер кератиновых генов (а) и су бронированного ЕсоН1/За1И-Фрагмента (б). Заштрихованные участки - кератиновые гены, } волнистые линии - локализация повторов.

Рис. 7. Блот-гибридизация плазмиды рАК4 с [32Р1рАКЗ (а) и [32Р] элюироващйм SacI/BglllniparMeHTOM плазмиды рАК2 (б). Рестрикции: 1 - Xbal; 2 - Xbal/SacI; 3 - Xbal/PstI; 4 -PstI; 5 - SacI; 6 - Pstl/Sacl. Маркеры - отдельные Pstl-фрагменты ДНК фага

18.

субклонированным в плазмиде рЭК фрагментом 5аЮ1/ЕсоЯ1 (плазмида рАК4). Из предстзвленных данных видно, что область, гомологичная меченным зондам, локализована в двух участках субклонированного фрагмента. С 5'- и 3*-повторяющимися элементами, фланкирующими ген гормона роста быка, гибридизуются только фрагменты ХЬа1/Рз1;1 (1,15 т.п.н.) и РэП/ЕсоМ (800 п.н.). Таким образом, в субклонированном БаХМ/ЕсоМ-фрагменте рядом с кератиновым В2Б геном имеется два участка, соответствующие Рэ-Н-повторам быка, которые не прилежат друг к другу. Следовательно, повторяющиеся последовательности Рэ1;1-семейства хотя и кластеризованы, но Еместе с тем разделены иными последовательностями, а не расположены тэндемно. При этом они,- по-видимому, часто кластеризуются вблизи структурных геноЕ.

Хотя уже клонировано и детально охарактеризовано несколько семейств повторов крупного рогатого скота, остается неизвестной их функция, в частности, нет информации об их транскрибируемости. Для выяснения этого вопроса в отношении РэМ-повторов, прилежащих к гену гормона роста быка, проводили гибридизацию плазмиды рАКЗ с цитоштазматичеслой поли(А)+РНК, выделенной из гипофизов крупного рогатого скота, которые- являются местом экспрессии гена гормона роста. При этом на автографе выявляются многочисленные отличающиеся по размерам молекулы РНК. содержащие гомологичные данному повтору последовательности. Параллельную дорожку, вырезанную из того же фильтра, гибридЕзоЕали с РэгГ-фрагментом (388 п.н.) кДНК гормона роста быка (ЯоуеМк К.Р. ег а!.. "982). Видно, что в зтом случае гибридизация происходит с дискретными по размерам молекулами- с мРНК гормона роста, имеющей размер 300 :-:., следовательно, диффузный сигнал, наблюдаемый при гибридизации с рАКЗ не является результатом деградации РНК, а отражает наличие гетерогенного набора РНК, транскрибируемы:: в гипофизе с РаП-позторов.

.Для определения транскрибируемости повторов Рэгт-семейства в других органах проводили дот-гибридизацию б жестких условиях с поли(А)+РКК, выделенной из разных органов быка. Для сравнения

19.

уровней транскрибируемости изучаемых повторов в различных органах на фильтры наносили голи(А)+РНК в количестве от 1 мкг до 0,05 мкг. В качестве отрицательного контроля • использовали тРНК из дрожжей. Из представленных данных видно, что оба повтора являются транскрибирующимися, хотя интенсивность транскрипции в разных органах существенно отличается.

С целью выяснения направления транскрипции .РзИ-повторов, прилегающих к гену -гормона роста быка, осуществляли разделение цепей 5'-фланкирующей последовательности (РэП/ЗаиЗА-фрагмент размером 900 п.н. Г с помощью субклонирования ее в ДНК фага М13 и проводили раздельную гибридизацию цепей с поли(А)+РНК, выделенных из. разных органов быка. Шеется существенное (~в 2-3 раза) различие в интенсивности сигналов, образующихся при гибридизации •с разными .цепями повтора. Достоверность этого различия подтверждают данные, указывающие на одинаковую гибридизацию разных зондов с одинаковым количеством геномной ДНК быка, нанесенной на эти зке фильтры. Таким образом, имеет место преимущественная транскрипция одной из цепи ДНК.

Сравнение ориентации кдонированного 'Рз1;1/ЗаиЗА-$рагмента в геноме и учет того, что активно транскрибирующаяся цзпь клонируется в.фаге М13тр9, а не в М13пю8, свидетельствует о том, что основная транскрипция 5'-фланкирующего повтора осуществляется в том же направлении, в котором происходит транскрипция гена гормона роста бцка. - ■

Для решения вопроса о- структуре и функции часто повторяющихся последовательностей е геномах эукариот требуются дополнительные исследования, касающиеся положения этих повторов б геноме, их организации, транскрибируемости и эволюции. Все эти аспекты затронуты нами на примере одного семейства Рз11-поЕТоров. Первый интересный результат заключается в том, что эти повтори являются специфичными только для подотряда Ят1папИа.

РэИ-поБторы обнаружены нами вблизи двух случайно' выбранных структурных генов двух видов подотряда ШпШалИа. Это свидетельствует об определенной сцеплевнссти этих повторов со

груктурнши генами. Расположение отдельных повтороЕ в ближайшем кружении различных генов отмечено ранее (Isukada Т. et al., Э82; Schip van het P. et al., 1987; Weber J.L. 'et al., 1984), го косвенно свидетельствует в_пользу подобного предположения, зучение ряда повторов показало, что они могут участвовать в роцессах репликации ДНК (Johnson Е.М. etal., 1936), усилении icKinnon R.D. et al., 1986) и ослаблении (Jeffrey D. et al., Э89) транскрипции прилежащих генов, формировании определенной груктуры хроматина (Kuo М.Т. et al., 1985) и др. Тем не менее эпрос относительно функции частых поЕторов остается открытым, го, однако, не . дает оснований относить -ece • повторы к эгоистическим" /ЩК. Б частности, как известно, многие 'частые звторы транскрибируются (Dudley J.Р., 1987; Kramerov В.А. et. Li, 1985; Jackson М. .et al., 1935; Kole Ь.В.Р ef.al., 1983). 3tI-no3TopH также транскрибируются во fecex изученных нами рганах,- хотя и с разной интенсивностью. Транскрипты злиаденилировзны и гетерогенкы по размерам. Кроме'того, тлеет зсто частичная ассимметрия транскрипции. Все эти результаты таг: э свидетельствуют, о том, что 'повторы вряд ли можно отнести к эгоистической" ДНК.

Анализ структуры п организации Pstl-повторов указывает на э, что они относятся к классу LINE. Согласно нашзм данным; а экже полученным ранее. uia.jewska К. et al., 1988; Skcvvronski J. t äl., 1984) Pstl-повторы составляют основное по массе семейство DiE в геномах Ruminant la. В целом'семейство PstI-поБТоров сходно з структуре, организации и трансхриСпруемести с другими эвторами класса LINE, содержащимися в геномах разных .тсганигуоз Dudley J.Р., 1937; Eraxerov D.A. et al., 1935; Jackson 'i. et 1., 1935; Kole L.3. et al., 1983). Как и другие LINS, stl-повторы характеризуются • ограниченной эволвкшонзоЯ знсзрватиБностью. See это свидетельствует о сходстве между змейстЕНМп частых повторов у эукарист как по структуре л рганизацки, так и по характеру трэнскрипцлк.

21.

выводы

1. Исследована структура и организация повторов прилежащих к ген: гормона роста быка. Показано, что они относятся ]

с;

РвИ-семейству часто повторяющихся (10 ), длинных диспергированных в геноме последовательностей.

2. Показано, кто РзГС-повторы присутствуют только в подотряд йш 1патЛ1а.

3. Охарактеризованы аналогичные повторы в геноме овцы в целом и

. двух клонированных фрагментах генома овцы, один из которы содержит гены кератина овцы.

4. Показана дифференциальная транскрипция РзП-повторов в различных органах быка. Транскрипты гетерогенны по размерам голиаденилированы. Процесс транскрипции имеет ассиметричны характер. ' .

список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Акопян К.Ж., Генинг Л.В., Бегетова Т.Е. Изучел» последовательностей, фланкирующих ген гормона роста быка. II конференция молодых ученых Института экспериментальной биологи .АН Арм.ССР. Тез. докл. Дшшжан. 1938, стр. 5.

2. Акопян К.Ж., Генинг Л.В., Бегетова Т.В., Тарантул В.З. Газарян К. Г. Характеристика семейства часто повторякщихс последовательностей генома быка.// Молекулярная биология. -Г38Э, т.23, N.4, с.588-995.

3. Акопян К.Ж., Гоникг Л.В., Тарантул В.З., Газарян К.Г. Структура ГэГС-повторов, прилегающих к гену гормона роста транскрипция секейстга РоГС-повторов в различных органах быка./ Молекулярная биолог-ил. -1900, т.24, N.3, с.775-781.

4. Акопян К.Ж., Жумабаева Б.Д., Генинг Л.В., Тарантул В.З., Газарян К.Г. Клонирование и частичная характеристика повторов генома овцы, имеющих гомологию с Pstl-семейством повтороЕ генома быка.// Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. -1990, т.11„ принято к печати.

5. Akopyan K.Zh., Zhumabajeva B.D., Gening L.V., Tarantul V.Z., Gasaryan K.G. Bovine growth hormone gene and sheep high sulphur keratin genes have in their flanclg regions homological repeats of PstI family which are specific for Ruminant la.// Mucl. Acids Res. В печати.

Заказ , тира«

Фнлкал типографии iS 1 Госкомиздата Арм. ССР ул. Гр. Кочара 4