Молекулярно-генетическое исследование комаров комплекса Culex pipiens

Храброва, Наталья Валерьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетическое исследование комаров комплекса Culex pipiens
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическое исследование комаров комплекса Culex pipiens"

На правах рукописи

Храброва Наталья Валерьевна

МОЛЕКУЛЯРНО - ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КОМАРОВ КОМПЛЕКСА CULEX PIPIENS (DIPTERA: CULICIDAE)

03.00.15 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Томск-2006

Работа выполнена в Научно - исследовательском институте биологии и биофизики при Томском государственном университете

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор В.Н. Стегний

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

В.А. Степанов кандидат биологических наук A.B. Симакова

Ведущая организация: Институт цитологии и генетики СО РАН (г. Новосибирск)

Защита диссертации состоится «18 » мая 2006 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 212.267.10 в Томском государственном университете по адресу: 634050 г. Томск, пр. Ленина, 36

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Томского государственного университета

Автореферат разослан «/У» апреля 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Е.Ю. Просекина

¿ûOâA_

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Комары комплекса Culex pipiens (Díptera: Culicidae) представляют большой научный и практический интерес. Они являются активными кровососами людей и известны как переносчики возбудителей ряда опасных заболеваний человека. Высокая экологическая пластичность, сложная таксономическая структура и характер взаимоотношений между членами комплекса привлекают постоянное внимание исследователей (Виноградова, 1997).

Culex torrentium Martini, 1924 считается видом — двойником Culex pipiens, литературные сведения о нем фрагментарны, не определены и границы ареала (Natvig, 1948; Mattingly, 1951а; Service, 1968; Jupp, 1979; Gillies, Gubbins, 1982; Dahl, 1988). Морфологически С. torrentium и С. р. pipiens близки, распространение симпатричное. В биологическом отношении С. torrentium также похож на С. р. pipiens -неавтогенный, эвригамный и гетеродинамный комар (Dahl, 1988; Виноградова, 1997). По личинкам виды не различимы, определение ведется только по самцам, диагностическое значение имеют особенности строения гипопигия (Виноградова, 1997).

Исследования представителей рода Culex приобрели особое значение в связи с возникновением трех крупных эпидемий западнонильской лихорадки (West Nile virus) в урбанизированных районах на юге Румынии (Tsai, Popovici, Cernescu et al., 1998), в дельте Волги в России (Lvov, Butenko, Gromashevsky et al., 2000; Platonov, Shipulin, Shipulina et al., 2001) и на северо - востоке США (Lanciotti, Roehrig, Deubel et al., 1999) в 1996 - 1999 гг. Основным признаком, объединяющим эти эпидемии, явилось вовлечение Culex pipiens в передачу возбудителя заболевания (Hayes, 2001).

библиотека

Cflercp ОЭ

(J «то л ^

идентификации видов или подвидов позволяет изучить другие аспекты биологии, например, особенности личиночной экологии, брачного поведения, устойчивости к инсектицидам (Walton, Sharpe, Pritchard et al., 1999; Kengne, Trung, Baimai et al., 2001; Manguin, Kengne, Sonnier et al., 2002). Морфологические признаки, особенно, если они носят количественный характер, не всегда удобно использовать для этих целей, т.к. часто они подвержены индивидуальной, географической, комбинативной и модификационной изменчивости. Для облегчения идентификации критических видов комаров широко применяются разнообразные молекулярно - генетические методы в дополнение к традиционным морфологическим (Wilkerson, Parsons, Albright et al., 1993). ДНК - маркеры можно использовать для идентификации организма на любой стадии развития; эти маркеры не подвержены изменчивости, вызванной действием факторов окружающей среды (Ноу, 1994; Walton, Sharpe, Pritchard et al., 1999), что позволяет избежать недостатков, присущих морфометрическим признакам.

Цели и задачи исследования. Цель данной работы заключалась в поиске молекулярно - генетических маркеров для идентификации представителей комплекса Culex pipiens и оценке внутри - и межвидовой изменчивости Culex torrentium, С. pipiens pipiens, С. p. molestus. Для достижения поставленной цели требовалось выполнить следующие задачи:

1. Провести анализ спектров амплифицированных RAPD -фрагментов ДНК для выявления мономорфных специфичных последовательностей ДНК

2. Определить нуклеотидные последовательности специфичных RAPD - фрагментов ДНК для создания SCAR - праймеров

3. Проверить диагностическую ценность молекулярно -генетических маркеров, предложенных другими авторами для идентификации представителей комплекса Culex pipiens

4. Провести секвенирование и сравнение последовательностей второго интрона гена ацетилхолинэстеразы 2 и участка митохондриального гена субъединицы I цитохромоксидазы с у особей С. р. pipiens и С. р. molestus с целью выявления различий, пригодных для получения молекулярно - генетических маркеров

5. Оценить внутри - и межвидовую изменчивость и дивергенцию RAPD - маркеров у членов комплекса Culex pipiens

Научная новизна. Впервые были найдены специфичные RAPD - маркеры для идентификации С. torrentium. Определение нуклеотидной последовательности RAPD - фрагментов позволило создать специфичные SCAR - праймеры. ПЦР с использованием SCAR -праймеров является простым, быстрым и надежным методом идентификации С. torrentium. В ходе работы также была изучена диагностическая ценность маркеров, предложенных другими авторами для идентификации С. p. molestus и С. torrentium (Виноградова, Шайкевич, 2005), С. p. pipiens и С. torrentium (Smith, Fonseca, 2004). Показано, что эти маркеры позволяют идентифицировать особей С. torrentium, в то время как, С. p. pipiens и С. p. molestus идентичны по этим маркерам. Выявлено соответствие результатов при использовании различных типов молекулярно - генетических маркеров. Впервые предложен способ идентификации гибридных особей от скрещивания С. torrentium и С. p. molestus.

Проведен анализ изменчивости RAPD - маркеров в популяциях С. p. pipiens, С. p. molestus и С. torrentium из г. Томска, Томской области и Республики Казахстан. Полученные результаты позволили сделать вывод о генетической дифференциации С. torrentium, С. p. pipiens и С. р. molestus и об отсутствии природной гибридизации между ними в районе проведенных исследований. Кроме того, показано, что в открытых личиночных биотопах (Томская область и Республика Казахстан) доминантным видом является С. torrentium; личинки С. p. pipiens встречаются с небольшой частотой.

Практическая ценность работы. Молекулярно - генетические маркеры, рассмотренные в настоящей работе, можно использовать в любых исследованиях, где необходима надежная идентификация С. torrentium и С. p. pipiens, в частности, при изучении устойчивости к инсектицидам, путей передачи возбудителей заболеваний, при разработке новых методов контроля за численностью переносчиков, для анализа гибридогенеза, а также, в популяционно - генетических, таксономических, филогенетических и фаунистических исследованиях. Принципы поиска и создания специфичных маркеров (RAPD— и SCAR -маркеры), изложенные в диссертации, можно применять для получения диагностических маркеров практически для любого организма.

Апробация результатов работы. Результаты исследований были представлены на II Международной конференции «Проблема вида и видообразования», Томск (2001); на П1 Съезде Вавиловского общества

генетиков и селекционеров, Москва (2004); на III Международной конференции «Проблема вида и видообразования», Томск (2004).

Публикации. По теме диссертации опубликовано шесть работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов, списка цитируемой литературы. Работа изложена на 118 страницах машинописного текста, включает 7 таблиц, 17 рисунков. Список литературы содержит 164 источника, в том числе 137 на иностранном языке.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В главе на основе отечественных и зарубежных литературных источников обобщены данные о комплексе Culex pipiens. Особое внимание уделено С. р. pipiens и С. p. molestus. Подробно рассматриваются особенности биологии и экологии, а также проблема гибридизации между С. р. pipiens и С. р. molestus. Также приведены данные по биологии С. torrentium.

Кроме того, в литературном обзоре подробно обсуждается возможность использования различных типов молекулярно -генетических маркеров для видовой диагностики; наибольшее внимание уделено RAPD - и SCAR - маркерам, а также маркерам мтДНК и ITS2 регионам рДНК.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ 2.1. Материал

В работе использовалась ДНК, выделенная из личинок комаров IV стадии. Сбор личинок проводили по стандартной методике. Личинки Culex pipiens pipiens и С. torrentium, были отловлены в открытых естественных водоемах и цистернах для сбора дождевой воды, личинки С. р. molestus - в затопленных подвальных помещениях городских зданий, личинки С. territans и С. modestus - в естественном водоеме (Таблица 1). Личинки фиксировались в 96% - ом этаноле.

Таблица 1 - Выборки комаров, использованные в работе

Вид / подвид (форма) n Место сбора Тип водоема Дагга сбора

С. torrenttum и С.р pipiens 48 РК, г. Алматы Е, О 24.08.1999

С. torrenttum 48 ТО, с. Белоусово И, О 30.07.2000

С. torrenttum 48 ТО, д. Михайловка И, О 11.06.2003

С. torrenttum нС.р pipiens 48 ТО, с. Моряковский Затон И, О 03.08.2003

С. torrentmm 48 РК, с. Аксаковка Е, О 05.08.2003

С. torrentmm 48 РК, с. Науалы Е, О 08.08.2003

С. torrentmm 48 ТО, Керамический завод И, О 13.08.2003

С. torrenttum 48 ТО, Керамический завод И, О 05.07.2004

С. torrenttum 48 РК, г. Алматы 1 И,0 08.08.2004

С. torrenttum 48 РК, г. Алматы 2 И, О 08.08.2004

С. torrentmm 24 г. Томск, ул. Короленко, 15 Е, О 12.07.2004

С. torrentmm 24 г. Томск, ул. Короленко, 15 Е, О 16.06.2005

С. p. pipiens 48 РК, г. Семипалатинск И, О 16.08.2004

С. p. molestus 48 г. Томск, ул. Тимакова, 3 И,3 28.06.2000

С. p. molestus 48 г. Томск, ул. Тимакова, 3 И,3 15.07.2001

С.р molestus 48 г. Томск, ул. Яковлева, 14 И,3 21.07.2000

С. p. molestus 48 г. Томск, ул. Алтайская, 78/2 и,з 03.08.2003

С. p. molestus 48 г. Томск, ул. Тимакова, 3 и,з 24.09.2003

С. p. molestus 24 г. Томск, ул. Алтайская, 78/2 и.3 07.07.2004

С. p. molestus 24 г. Томск, ул. Короленко, 15 и,з 12.07.2004

С. p. molestus 48 г. Томск, ул. Иркутский тракт, 104 и,з 17.12.2004

С. p. molestus 48 РК, г. Сарышаган и,з 09.02.2005

F1: 99 С p. molestus х <?;$ С. torrenttum 36 Лаборатория — 15.09.2003

F1: 99 С.р molestusxââ С. torrentium 48 Лаборатория — 23.09.2003

FI : 99 С. p. molestus x es С. torrentium 24 Лаборатория — 26.06.2004

С. terri tans 48 г. Томск, коммунальный мост через р. Томь Е, О 24.08.2003

С. modestus 48 г. Томск, коммунальный мост через р. Томь Е, О 24.08.2003

Примечание. Тип водоема: Е - естественный; И - искусственный; О - открытый; 3 - закрытый;

п - объем выборки; РК - Республика Казахстан, ТО - Томская область

2.2. Методы

При выполнении работы применялись следующие методы: выделение ДНК, ЯАРБ - ПЦР, ПЦР со специфичными праймерами, электрофоретическое разделение продуктов амплификации, рестрикция, клонирование и секвенирование. Праймеры, использованные в работе, представлены в таблице 2. Для обработки полученных результатов использовали пакеты программ веяМап™ 4.02, Рптегёек^™ 4.01, РтсЬТУ 1.3.1, РОРОЕКЕ°1.32, TreeViewel .6.6, 8ТАТ18ПСА°6.0, АёоЬе®РЬо1о8Ьор® 7.0.

Таблица 2 - Праймеры, использованные в работе

Праймер Последовательность праймера, 5' —* 3' Продукт амплификации

SCARcpl SCARcp2 CCCTTACGCACGGAGAAA CTAACAAAGTACTCCCTCAA Специфичный RAPD -фрагмент (SCAR - маркер)

SCARcp3 SCARcp4 ATTTGGATTGGACTTTCTATTTA TTGAATTTTGACATGACGGTTTTT Специфичный RAPD -фрагмент (SCAR - маркер)

UEA9 UEA10 GTAAACCTAACATTTTTTCCTCAACA TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA Участок митохондриального гена субединицы I цитохромоксидазы с

5.8S 28S 5.8Sa TGTGAACTGCAGGACACATG ATGCTTAAATTTAGGGGGTA ATCACTCGGCTCGTGGATCGAT ITS2 регион рДНК

ACEpip ACEtorr В 1246s GGAAACAACGACGTATGTACT TGCCTGTGCTACCAGTGATGTT TGGAGCCTCCTCTTCACGG Участок второго интрона гена ацетилхолинэстеразы 2

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Использование молекулярно - генетических маркеров для идентификации представителей комплекса Culex pipiens

3.1.1. RAPD - маркеры

Скрининг двадцати шести RAPD - праймеров показал, что для идентификации С. torrentium и С. р. pipiens можно использовать фрагменты ДНК, амплифицирующиеся RAPD - праймерами ОРВ - 02

и OPA- 11. В спектре фрагментов ДНК, амплифицированных праймером ОРВ - 02 (5' - TGATCCCTGC - 3'), был выявлен мономорфный бэнд, размером 1183 п.н. (по данным секвенирования), идентифицирующий С. torrentium (Рисунок 1А).

• * gggg

1 2 3 4 5 6 7 8 9 lO 1 1 12 13 14 15 16 17 18 19

¡29 ; * 1-й S ' «г-Ф »•» ' — ' tt

^ a* fm 4м*

1 2 3 4 5 6 7 S 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

Рисунок 1 - Результаты амплификации ДНК с использованием ИАРЭ - праймеров ОРВ - 02 (А) и ОРА - 11 (В)

Примечание. Специфичные для С. /оггепНит фрагменты ДНК обозначены стрелками. Дорожки 2-9 - С. ОггепНит. Дорожки 11-13 - С. р. ргр1ет; дорожки 14-18 - С. р. токяШ. Дорожки 1, 10, 19 ДНК маркеры: 1кЬ (10, 8, 6, 5, 4, 3, 2.5, 2, 1.5, 1, 0.75, 0.5, 0.25 т.п.н.) (А), ЮОЬр + 1,5кЬ (1.5, 1, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1 т.п.н.) (В)

На рисунке 1В представлены результаты амплификации с использованием праймера ОРА - 11 (5* - СААТССССОТ - 3'). В паттерне С. ОггепНит четко выявляется специфичный фрагмент ДНК, размером 680 п.н. (по данным секвенирования), отсутствующий в спектре амплифицированных фрагментов ДНК С. р. ргр1ет и С, р. тоШшя.

Маркеры не подвержены внутри - и межпопуляционной изменчивости, они представлены в спектрах ИАРО - фрагментов у всех

особей С. torrentium всех изученных популяций, но отсутствуют спектрах амплифицированных фрагментов ДНК С. p. pipiens и С. р. molestus, т.е., присутствие RAPD - маркера среди продуктов амплификации характеризует особей С torrentium, а его отсутствие -особей С. p. pipiens и С. p. molestus. Таким образом, использование RAPD - маркеров позволяет надежно идентифицировать особей С. torrentium. Метод является простым и быстрым в исполнении. Любому исследователю необходим лишь навык в анализировании RAPD -спектров, остальные моменты RAPD - идентификации С. torrentium, не вызывают затруднений.

3.1.2. SCAR - маркеры

Специфичные RAPD - бэнды были клонированы и секвенированы (данные не показаны). Определение последовательности нуклеотидов позволило подобрать специфичные SCAR - праймеры. Праймеры SCARcpl и SCARcp2 (Таблица 2) были созданы на основе нуклеотидной последовательности фрагмента, размером 1183 п.н., амплифицированного RAPD - праймером ОРВ - 02. Праймеры SCARcp3 и SCARcp4 (Таблица 2) - на основе последовательности RAPD - фрагмента, размером 680 п.н. (RAPD - праймер OPA - 11); Результатом использования SCAR - праймеров является амплификация одного специфичного фрагмента ДНК (SCAR - маркера).

В ходе SCAR - ПЦР с праймерами SCARcpl и SCARcp2 у особей С. torrentium и гибридов между $9 С. p. molestus и <?<? С. torrentium амплифицируется фрагмент ДНК, размером 1093 п.н.; особи С. р. pipiens и С. p. molestus характеризуются отсутствием амплификации фрагмента ДНК соответствующего размера (Рисунок 2А). Использование праймеров SCARcp3 и SCARcp4 приводит к амплификации фрагмента ДНК, размером 474 п.н. у особей С. torrentium и гибридов между $9 С. p. molestus и SS С. torrentium-, у особей С. р. pipiens и С. р. molestus данный фрагмент ДНК не амплифицируется (Рисунок 2В).

SCAR - маркеры являются специфичными, т.к. не подвержены внутри - и межпопуляционной изменчивости. Применение SCAR -маркеров позволяет усовершенствовать метод RAPD - идентификации С. torrentium, сделать его доступным широкому кругу исследователей, т.к. в случае использования SCAR - маркеров отпадает необходимость в анализе набора фрагментов ДНК разных размеров. Однако, эти маркеры

3 4 5 й 7 8 9 10 11 12 13 !4 15 Ift 17 18 19 20 21 22 23

9 10 1 1 12 1 3 14 15 16 17 18 19 20 2 J 22 2

Рисунок 2 - Результаты амплификации ДНК с использованием праймеров SCARcpl и SCARcp2 (A), SCARcp3 и SCARcp4 (В)

Примечание. Дорожки 2, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17 - С. torrentium; дорожки 3, 5, 7 - С. p. pipiens; дорожки 9, 12, 14, 16, 18 - С. p. molestus; дорожки 19-21 - F1: $5 С. p. molestus х$$ С. torrentium. Дорожка23 -негативный контроль, дорожки 1, 10, 22 - ДНК маркеры: 1,5 kb + 100 bp (А) и 100 bp (1000,900, 800, 700, 600, 500,400, 300, 200, 100 п.н.) (В)

не позволяют идентифицировать гибридов, т.к. гибридные особи от скрещивания 9? С. p. molestus х <SS С. torrentium идентичны по SCAR -маркерам особям С. torrentium.

3.1.3. ITS2 регионы рибосомальной ДНК

По данным Виноградовой и Шайкевич (2005), размер ПЦР фрагментов ДНК С. torrentium и С. p. molestus, полученных в результате амплификации с праймерами, фланкирующими ITS2 регион, составляет приблизительно 410 п.н. и 460 п.н., соответственно, т.е. различие между ними достигает 50 п.н. На рисунке 3 представлены результаты амплификации ITS2 регионов рДНК с использованием праймеров 5.8S и 28S (Таблица 2). Размеры амплификатов равны около 410 п.н. у С. torrentium и около 460 п.н. у С. p. pipiens и С. p. molestus. В рДНК гибридных особей от скрещивания ?? С. p. molestus х ¿<S С. torrentium представлены оба варианта (материнский и отцовский) ITS2 регионов (Рисунок 3).

Рисунок 3 - Результаты амплификации ITS2 регионов рДНК с использованием праймеров 5.8S и 28S

Примечание. Специфичные продукты амплификации обозначены стрелками. Дорожки 2-9-С. torrentium-, дорожки 10 — 12 — F1: 99 С. p. molestus х с?с? С. torrentium-, дорожки 14 - 16 - С. р. pipiens-, дорожки 17-21 - С. р. molestus-, дорожка 23 - негативный контроль; дорожки 1, 13, 22 - 100 bp ДНК маркер

Следует отметить, что размеры амплифицированных фрагментов не соответствуют размерам ITS2 регионов, т.к. в состав амплификатов входят также области генов 5.8S и 28S рРНК, фланкирующие ITS2 регионы. За вычетом фланкирующих участков, размер ITS2 регионов С. torrentium, С. p. pipiens и С. p. molestus из изученных мест сбора (г. Томск, Томская область и Республика Казахстан) составляет около 257 п.н., около 307 п.н. и около 307 п.н., соответственно, что согласуется с литературными данными (Miller, Crabtree, Savage, 1996).

Использование праймеров, фланкирующих ITS2 регионы, позволяет идентифицировать особей С. torrentium и С. p. pipiens или С. p. molestus, а также гибридов от скрещивания 9$ С. p. molestus х ¿W С. torrentium. К сожалению, не удалось изучить наследование молекулярно - генетических маркеров у гибридных особей от скрещивания С. torrentium и <53 С. p. molestus, т.к. не было получено потомков от такого типа скрещивания. Однако, можно предположить, что у этих гибридов, также как у гибридов от скрещивания С. p. pipiens и С. torrentium будут представлены два типа ITS2 регионов.

3.1.4. Участок гена субъединицы I цитохромоксидазы с

Анализ последовательностей участка митохондриального гена субъединицы I цитохромоксидазы с (COI), проведенный Виноградовой

и Шайкевич (2005), показал, что эти последовательности отличаются у С. torrentium и С. p. molestus шестью заменами нуклеотидов, которые не нарушают функции гена цитохромоксидазы I. Одна из замен расположена в сайте узнавания рестриктазы SspI (ААТ'АТТ). Метод идентификации С. torrentium и С. p. molestus, предложенный этими авторами, заключается в обработке рестриктазой SspI амплифицированного участка гена COI, размером 311 п.н. (Виноградова, Шайкевич, 2005).

Для амплификации участка гена COI использовали праймеры UEA9 и UEA10 (Otranto, Traversa, Guida et al., 2003) (Таблица 2). Амплифицированный участок ДНК, размером 311 п.н. после обработки рестриктазой SspI у С. torrentium оставался неизмененным, в то время как у С. p. pipiens и С. р. molestus он разрезался рестриктазой на два фрагмента, размером 220 и 90 п.н. (Рисунок 4), т.е., особи С. р. pipiens и С. р. molestus идентичны по этому маркеру, но отличаются от особей С. torrentium. У гибридных особей от скрещивания ÇÇ С. р. molestus х S S С. torrentium амплифицированный участок митохондриального гена COI расщепляется на два фрагмента, так же как у материнской формы (Рисунок 4).

-. <т *т *

К <} 10 11 1 Ц 14 15 16 17 IÜ 19 20 2!

Рисунок 4 - Результаты рестрикции амплифицированного участка гена COI рестриктазой SspI

Примечание. Дорожки 2 - 7, 9, 10 - С. torrentium; дорожки 11 -13 - С. р. pipiens-, дорожки 14, 15 - F1: С. р. molestus х $$ С. torrentium-, дорожки 17 - 22 - С. р. molestus. Дорожки 1, 23 - ДНК маркер pUC19 / MspI (501 (489), 404, 331,242, 190, 147, 110(111), 67, 34 п.н.); дорожки 8, 23- 100 bp ДНК маркер

Известно, что мтДНК наследуется, независимо от ядерного генома, в основном через цитоплазму женских гамет. К сожалению, в ходе работы не удалось получить гибридов от скрещивания 9$ С. torrentium и SS С. р. molestus, но можно предположить с большой долей

вероятности, что участок гена COI гибридных особей от такого типа скрещивания не будет разрезаться рестриктазой Sspl, т.е. будет соответствовать типу С. torrentium (материнской форме). Учитывая характер наследования, следует ожидать, что у потомков от скрещивания С. p. pipiens и -М С torrentium участок гена COI при обработке рестриктазой Sspl будет расщепляться на два фрагмента, а у гибридных особей от скрещивания 9? С. torrentium и С. р. pipiens -будет оставаться неизмененным. Участок гена COI гибридных потомков от скрещивания С. р. pipiens и С. p. molestus любого направления будет разрезаться рестриктазой Sspl. Таким образом, вследствие материнского наследования мтДНК, метод не позволяет идентифицировать гибридных особей между С. torrentium и С. р. pipiens или между С. torrentium и С. р. molestus.

Было проведено секвенирование участка гена COI у особей С. р. pipiens и С. р. molestus. Сравнение нуклеотидных последовательностей участка гена COI С. р. pipiens и С. р. molestus показало, что они идентичны между собой (данные не показаны).

3.1.5. Второй интрон гена ацетилхолинэстеразы 2

Анализ последовательностей второго интрона гена ацетилхолинэстеразы 2 (АСЕ2), проведенный Смит и Фонсекой (Smith, Fonseca, 2004), позволил создать видоспецифичные праймеры для идентификации нескольких представителей рода Culex, включая С. torrentium и С. pipiens.

В результате мультипраймерной ПЦР с использованием праймеров ACEpip, ACEtorr и В 1246s (Таблица 2) у особей С. torrentium амплифицируется фрагмент ДНК, размером 416 п.н., у особей С. р. pipiens и С. p. molestus - 610 п.н.; у гибридных особей от скрещивания 9? С. p. molestus х SS С. torrentium амплифицируются оба фрагмента (Рисунок 5).

Эти маркеры позволяют легко идентифицировать особей С. torrentium от С. p. pipiens и С. p. molestus в выборках из любых природных популяций, включая смешанные. Кроме этого, данные маркеры применимы и для идентификации гибридных особей. Учитывая характер наследования, следует ожидать, что использование праймеров ACEpip, ACEtorr и В 1246s, позволит выявлять гибридных особей от любого направления скрещивания С p. molestus и С. torrentium, а также С. p. pipiens и С. torrentium.

Рисунок 5 - Результаты амплификации ДНК с использованием праймеров ACEpip, ACEtorr и В 1246s

Примечание. Дорожки 2-9 -С. torrentium-, дорожки 10 - 12-F1: ?? С. p. molestus х $$ С. torrentium; дорожки 14 - 17 - С. p. molestus\ дорожки 18 - 20 - С. p. pipiens; дорожки 1, 13,21 - 100 bp ДНК маркер

Секвенирование и сравнение нуклеотидных

последовательностей участка второго интрона гена АСЕ2 у особей С. р. pipiens и С. p. molestus показало, что они идентичны между собой (данные не показаны).

В таблице 3 представлены все молекулярно - генетические маркеры, изученные в настоящей работе (полученные самостоятельно и предложенные другими авторами).

Выявлено соответствие результатов при использовании различных типов маркеров. Как следует из таблицы 3 все типы маркеров, рассмотренные в работе, позволяют надежно идентифицировать особей С. torrentium. Эти маркеры применимы к любой стадии развития организма. Известно, что личинки, куколки и самки С. torrentium и С. p. pipiens морфологически неразличимы; С. torrentium и С. p. pipiens различаются только по строению гениталий самцов, поэтому молекулярно - генетические маркеры для идентификации С. torrentium будут служить основой популяционно -генетических, эколого - фаунистических, фенологических исследований этого малоизученного вида. Особи С. p. pipiens и С. p. molestus идентичны по всем изученным молекулярно - генетическим маркерам. Это свидетельствует о большей генетической близости С. p. pipiens и С. p. molestus и отдаленности от них С. torrentium, что соответствует существующим представлениям о степени филогенетического родства представителей комплекса С. pipiens (Miller, Crabtree, Savage, 1996; Виноградова, 1997). ITS2 регионы рДНК, гены мтДНК, интроны генов широко используются для создания диагностических маркеров в разных группах кровососущих комаров (Caterino, Cho, Sperling, 2000).

Таблица 3 - Молекулярно - генетические маркеры для идентификации представителей комплекса Culex pipiens

Праймер Размер продукта амплификации / рестрикции, п.н.

С. torrentium С. р. pipiens С. р. molestus Fl: С. р. molestus хвв С. torrentium

ОРВ - 02 1183 — — 1183

ОРА- И 680 — — 680

SCARcpl SCARcp2 1093 — — 1093

SCARcp3 SCARcp4 474 — — 474

5.8S 28S 410 460 460 410, 460

5.8Sa 28S 460 510 510 460.510

UEA9 UEA10 + рестрикция Sspl 311 220, 90 220, 90 220, 90

ACEpip ACEtorr В1246s 416 610 610 416,610

Примечание. «—» - отсутствие амплификации

Однако, учитывая значительное сходство С. p. pipiens и С. p. molestus по этим участкам ДНК, мы считаем, что наиболее быстрым способом получения молекулярно - генетических маркеров для идентификации С. p. pipiens и С. p. molestus, является поиск специфичных RAPD -маркеров и создание на их основе SCAR - маркеров. Гибридных особей от скрещивания С. torrentium и С. p. molestus можно выявить, как в ходе анализа размеров ПЦР - фрагментов ITS2 регионов, так и при использовании праймеров ACEpip, ACEtorr и В 1246s.

3.2. Генетическая дифференциация популяций С. p. pipiens, С. р. molestus и С. torrentium умеренных широт

Полиморфизм по RAPD - маркерам был изучен в десяти популяциях С. torrentium, пяти популяциях С. p. molestus и трех популяциях С. p. pipiens из г. Томска, Томской области (ТО) и Республики Казахстан (РК). Для оценки генетической изменчивости использовался RAPD - праймер OPA - 01 (5* - CAGGCCCTTC - 3'), амплифицирующий наибольшее число полиморфных фрагментов ДНК.

Генетическую дифференциацию популяций оценивали, используя величину генетического расстояния по Нею (DNei) (Nei, 1978), которая отражает среднее число замен аллелей в каждом локусе, произошедших за время раздельной эволюции двух популяций. Величина DNe, варьирует от нуля (максимальное сходство) до бесконечности (максимальное различие).

На рисунке 6 представлены средние значения генетических

расстояний ( D Nei) между популяциями: а) С. р. pipiens ( D Ner = 0,068 ±

0,003); б) С. р. molestus (DNe¡ = 0,036 ± 0,008); в) С. torrentium (Z)Ne, =

0,047 ± 0,003); г) С. р. pipiens и С. р. molestus (£>Nei = 0,102 ± 0,007); д)

С. р. pipiens и С. torrentium (Z)Nei=0,136± 0,007); е) С. р. molestus и С.

torrentium ( D Nei = 0,165 ± 0,005).

Средние значения генетических расстояний между популяциями

С. р. pipiens и С. р. molestus (г) больше Z)Ne¡ между популяциями С. р.

pipiens (а) и между популяциями С. р. molestus (б). Z)Ne, между популяциями С. р. pipiens и С. torrentium (д) больше, чем средние значения генетических расстояний между популяциями С. р. pipiens (а) и между популяциями С. torrentium (в). Средние значения генетических расстояний между популяциями С. р. molestus и С. torrentium (е)

значительно превышают генетические расстояния между популяциями С. р. то1е$1ш (б) и между популяциями С. гоггепНит (в). Выявленные различия статистически достоверны, о чем свидетельствуют не перекрывающиеся доверительные интервалы средних значений 0№, (Рисунок 6).

0,20

0,18

1 0,16

4> 0,14

1 0,12

а а. 0,10

а 0,08

| 0,06

а и 0,04

0,02

0,00

.....ту

-I-

□ Среднее

"~Г ±0,95 дов. интервал

Рисунок 6 - Средние значения генетических расстояний между популяциями С. р. р1р\ет, С. р. то!езШ, С. ЮггепИит

Примечание. Средние значения генетических расстояний между популяциями: а) С. р. ргргет-, б) С. р. то1е8Ш~, в) С. 1оггепИит\ г) С. р. ргргет и С. р. то1е$Ш$\ д) С. р. р\р1ет и С. ¡оггепИит; е) С. р. то1ея/и$ и С. ¡оггепНит

ШЧЗМА - дендрограмма, основанная на коэффициентах генетического сходства по Нею (1978) показывает, что все изученные популяции разделяются на три отчетливых кластера: в одном представлены популяции С. р. то1ех(ш, в другом - С. р. р1ргет, в третьем - С. ¡оггеШшт (Рисунок 7).

Анализ генетического полиморфизма ИАРО - маркеров позволяет сделать вывод о значительной дифференциации популяций С. р. р1р1ет, С. р. то1е5Шз и С. /оггепНит в районе проведенных исследований. Вывод базируется на следующих положениях: 1) генетические расстояния (0Ые1) между популяциями разных подвидов

С. р. ргргвпв

С. р. molestus

tornentium

Рисунок 7 - Дендрограмма генетического сходства популяций С. torrentium, С. р. pipiens и С. р. molestus, построенная с использованием метода иерархического кластерного анализа (UPGMA) по результатам RAPD - анализа (RAPD - праймер OPA - 01)

Примечание. Популяции: А - с. Моряковский Затон, ТО (2003г.); В - г. Алматы, РК (1999г.); С - г. Семипалатинск, РК (2004 г.); D - г. Томск, ул. Короленко, 15 (2004 г.); Е - г. Томск, ул. Тимакова, 3 (2003г.); F - г. Томск, ул. Алтайская, 78/2 (2004 г.); G - г. Томск, ул. Иркутский тр., 104 (2004 г.); Н - г. Сарышаган, РК (2005 г.); I - с. Моряковский Затон, ТО (2003 г.); J - Керамический завод, ТО (2003 г.); К - Керамический завод, ТО (2004 г.); L - г. Алматы, РК (1999 г.); М -с. Науалы, РК (2003 г.); N - с. Аксаковка, РК (2003 г.); О - г. Алматы 1, РК (2004 г.); Р - г. Алматы 2, РК (2004 г.); Q - г. Томск, ул. Короленко, 15 (2005 г.); R - г. Томск, ул. Короленко, 15 (2004 г.)

или вида достоверно превышают генетические расстояния между популяциями в пределах одного подвида или вида, 2) дендрограмма генетического сходства показывает, что все изученные популяции разделяются на три отчетливых кластера: в одном представлены популяции С. р. то1ейШ, в другом - С. р. ргргеш, в третьем - С. /оггепНит, 3) не получены прямые или косвенные подтверждения, свидетельствующие о существовании природной гибридизации между С. р. р1р1ет и С. ЮггепИит или между С. р. тоЫьШх и С. 1оггепйит\ гибридные особи не выявлены ни в одной из изученных популяций, включая смешанные выборки. По всей видимости, генетическая дифференциация, наблюдаемая между популяциями С. р. ргргет, С. р. то]е$1т и С. ЮггепИит умеренного климата, обусловлена как пре- так и постзиготическими механизмами репродуктивной изоляции. К ним относятся отличия, касающиеся жизненных циклов, полового поведения, а также, разобщенность местообитаний и цитоплазматическая несовместимость.

3.3. Распространение С. /оггепНит и С. р. р1р1епя на территории Томской области и Республики Казахстан

При проведении настоящей работы было собрано тринадцать выборок комаров из открытых водоемов (предпочтительные местообитания личинок С. р. ргргет и С. ХоггепИит) Томской области (ТО) и Республики Казахстан (РК) (Таблица 1). Только одна выборка была представлена особями С. р. р1р1ет (г. Семипалатинск, РК, 2004 г.), в состав двух выборок входили, как особи С. р. рхргет, так и С. 1оггепйит (г. Алматы, РК, 1999 г. и с. Моряковский Затон, ТО, 2003 г.), остальные десять выборок состояли только из особей С. ЮггепИит (шесть выборок в Томской области и четыре в Республике Казахстан). В смешанных сборах на долю С. гоггепИит приходилось 56,25 % особей (г. Алматы, РК, 1999 г.) и 52,08 % (с. Моряковский Затон, ТО, 2003 г.). Таким образом, показано, что в открытых личиночных биотопах в районе проведенных исследований доминирует С. (оггепНит. Что касается Республики Казахстан, то встречаемость там С. ¡оггепНит зарегистрирована неоднократно разными авторами (Дубицкий, 1970; Лопатин, 2000). В Томской области этот вид был описан Шингаревым в 1928 г. под именем С. рауЬуяку (Шингарев, 1928; Штакельберг, 1937) и это единственное упоминание о встречаемости С. гоггепйит на территории Томской области. Существует два возможных объяснения:

1) С. torrentium был и ранее широко распространен на территории Томской области, но ошибочно принимался за С. p. pipiens, по причине значительного морфологического сходства С. p. pipiens и С. torrentium; известно, что единственный морфологический признак, отличающий С. p. pipiens от С. torrentium, касается деталей строения гипопигия самцов, а именно формы дорзальных склеритов эдеагуса (Service, 1968; Onyeka, 1982; Dahl, 1988; Виноградова, 1997);

2) в течение какого — то времени С. torrentium вытеснил С. р. pipiens на территории Томской области.

Для выяснения действительной картины распространения С. р. pipiens и С. torrentium, а также, характера их взаимоотношений в Томской области, необходимо проведение широких эколого -фаунистических и фенологических исследований. В настоящей работе констатируется лишь факт преимущественной встречаемости личинок С. torrentium в открытых водных биотопах в районе проведенных исследований.

ВЫВОДЫ

1. Проведен анализ ДНК - маркеров у трех представителей комплекса Culex pipiens - Culex torrentium, С. p. pipiens, С. p. molestus

2. Выявлены, идентифицирующие Culex torrentium, специфичные фрагменты ДНК, амплифицирующиеся RAPD -праймерами ОРВ - 02 и OPA - 11

3. Определение нуклеотидных последовательностей мономорфных RAPD - фрагментов позволило подобрать видоспецифичные SCAR - праймеры. Результатом использования SCAR - праймеров является амплификация специфичных фрагментов ДНК (SCAR - маркеров), позволяющих надежно идентифицировать особей С. torrentium и С. p. pipiens в природных популяциях

4. Показано, что рестрикционный анализ участка митохондриального гена COI, анализ размеров ПЦР фрагментов ITS2 регионов рДНК, а также маркеры, основанные на последовательности второго интрона гена АСЕ2, позволяют идентифицировать особей С. torrentium

5. Выявлено, что нуклеотидные последовательности участка митохондриального гена COI и участка второго интрона гена АСЕ2 идентичны у С. р. pipiens и С. р. molestus

6. Анализ изменчивости RAPD - маркеров в популяциях представителей комплекса Culex pipiens из г. Томска, Томской области и Республики Казахстан показал, что С. torrentium, С. p. pipiens и С. р. molestus умеренного климата генетически дифференцированы, природная гибридизация между ними отсутствует

7. Показано, что в открытых личиночных биотопах (Томская область и Республика Казахстан) доминантным видом является С. torrentium; личинки С. p. pipiens встречаются с небольшой частотой

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Храброва Н.В., Сибатаев А.К. Анализ генетической изменчивости комаров Culex pipiens (Díptera: Culicidae) с использованием микросателлитного локуса CQ46 в качестве маркера // Эволюционная биология: Материалы П Международной конференции «Проблема вида и видообразование» / Под ред. В.Н. Стегния. - Томск: Томский государственный университет, 2002. - Т. 2. - С. 392 - 393.

2. Храброва Н.В., Сибатаев А.К. Молекулярные маркеры для идентификации комаров Culex pipiens pipiens и С. р. pipiens f. molestus (Díptera: Culicidae) // Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития: Материалы 1П съезда ВОГиС. - Москва, 2004. -Т.1.-С.35.

3. Храброва Н.В., Сибатаев А.К., Стегний В.Н. RAPD - маркеры для идентификации представителей рода Culex - переносчиков вируса западнонильской лихорадки // Вестник Томского гос. ун-та. Приложение. - 2004. -№ 10. - С. 128 - 130.

4. Храброва Н.В., Сибатаев А.К., Стегний В.Н. SCAR - маркер для идентификации Culex pipiens pipiens (Díptera: Culicidae) // Вестник Томского гос. ун-та. - 2004. - № 30. - С. 146 - 149.

5. Храброва Н.В., Сибатаев А.К., Стегний В.Н. Генетическая идентификация комаров группы Culex pipiens (Díptera: Culicidae) методом RAPD - анализа II Доклады РАН. - 2005. - Т. 401, № 3. - С. 125-126.

6. Храброва Н.В., Сибатаев А.К., Стегний В.Н. Таксономический статус комаров Culex pipiens L. и Culex molestus F. // Эволюционная биология: Материалы III Международной конференции «Проблема вида и видообразования» / Под ред. В.Н. Стегния. - Томск: Томский государственный университет, 2005. - Т. 3. - С. 275 - 299.

Отпечатано на участке оперативной полиграфии Редакционно-издательского отдела ТГУ Лицензия ПД №00208 от 20 декабря 1999 г.

Заказ № 7 У от " ОН 200« г. Тираж <20 экз.

fJ-66

-8266

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Храброва, Наталья Валерьевна

Список условных сокращений и обозначений.

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Существование двух форм Culex pipiens pipiens.

1.1.1. История открытия двух форм Culex pipiens pipiens.

1.1.2. Основные биологические и экологические признаки

С. р. pipiens и С. р. molestus.

1.1.2.1. Автогенность - неавтогенность.

1.1.2.2. Стеногамность - эвригамность.

1.1.2.3. Гомодинамность - гетеродинамность.

1.1.2.4. Прокормители.

1.1.2.5. Местообитания.

1.1.3. Гибридизация между С. р. pipiens и С. р. molestus.

1.1.4. Таксономический статус С. р. pipiens и С. р. molestus

1.2. Culex torrentium.

1.3. Молекулярные методы популяционной генетики, систематики и филогении. ф 1.3.1. Изоферментный анализ.

1.3.2. Иммунологический анализ.

1.3.3. ДНК - ДНК гибридизация.

1.3.4. RFLP-анализ.

1.3.5. Секвенирование.

1.3.6. RAPD-анализ.

1.4. Объекты молекулярной систематики и филогении.

1.4.1. Митохондриальная ДНК.

1.4.2. Рибосомальная ДНК.

2. Материал и методы.

2.1. Материал.

2.2. Методы.

• 2.2.1. Выделение ДНК.

2.2.2. RAPD-ПЦР.

2.2.3. Поиск специфичных RAPD - фрагментов.

2.2.4. Клонирование и секвенирование специфичных

RAPD - фрагментов.

2.2.5. SCAR-ПЦР.

2.2.6. Рестрикционный анализ участка митохондриального генабъединицы I цитохромоксидазы ф 2.2.7. Амплификация ITS2 регионов рибосомальной ДНК

2.2.8. Амплификация второго интрона гена ацетилхолинэстеразы 2.

2.2.9. Секвенирование участка митохондриального гена субъединицы I цитохромоксидазы с и второго интрона гена ацетилхолинэстеразы 2.

2.2.10. RAPD - полиморфизм.

3. Результаты.

3.1. Молекулярно - генетические маркеры для идентификации представителей комплекса Culex pipiens.

Ф 3.1.1. RAPD-маркеры.

3.1.2. SCAR - маркеры.

3.1.3. ITS2 регионы рибосомальной ДНК. 3.1.4. Участок генабъединицы I цитохромоксидазы

3.1.5. Второй интрон гена ацетилхолинэстеразы 2.

3.2. Полиморфизм RAPD - маркеров в природных популяциях

С. p. pipiens, С. p. molestus, С. torrentium.

4. Обсуждение.

4.1. Использование молекулярно - генетических маркеров для идентификации представителей комплекса Culex pipiens.

4.1.1. RAPD- маркеры.

4.1.2. SCAR - маркеры.

4.1.3. ITS2 регионы рибосомальной ДНК.

4.1.4. Участок генабъединицы I цитохромоксидазы

4.1.5. Второй интрон гена ацетилхолинэстеразы 2.

4.2. Генетическая дифференциация популяций С. p. pipiens,

С. p. molestus и С. torrentium умеренных широт.

4.3. Распространение С. torrentium и С. p. pipiens на территории

Томской области и Республики Казахстан.

Выводы. ф Литература.

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота км - километр м - метр i м - кубический метр мкг - микрограмм (10"6 грамм) мкл - микролитр (10"6 литр) мкМ - микромоль (10"6 моль) мМ - миллимоль (10"3 моль) мРНК - матричная РНК мтДНК - митохондриальная ДНК нг- нанограмм (10"9 грамм) п.н. - пар нуклеотидов (bp - base pairs) пмоль - пикомоль (10" " моль)

ПЦР - полимеразная цепная реакция (PCR - Polymerase Chain Reaction) рДНК - рибосомальная ДНК

PK - Республика Казахстан

РНК - рибонуклеиновая кислота рРНК - рибосомальная РНК см - сантиметр см3 - кубический сантиметр т.п.н. - тысяч пар нуклеотидов (kb - kilobase pairs)

ТО - Томская область тРНК - транспортная РНК

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

АР - случайные праймеры (Arbitrary Primers)

BSA - бычий сывороточный альбумин (Bovine Serum Albumin)

COI - ген субъединицы I цитохромоксидазы с

DAF - фингерпиринтинг амплифицированной ДНК (DNA Amplification Fingerprinting)

DNei- генетическое расстояние по Нею dNTP- дезоксинуклеозидтрифосфат

ETS - внешний транскрибируемый спейсер (External Transcribed Spacer)

F1 - первое поколение гибридных особей F2 - второе поколение гибридных особей IGS - межгенный спейсер (InterGenic nontranscribed Spacer) ITS - внутренний транскрибируемый спейсер (Internal Transcribed Spacer) n - объем выборки

D Nei - среднее генетическое расстояние по Нею

RAPD - случайным образом амплифицированная ДНК (Random Amplified Polymorphic DNA)

RFLP - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (Restriction Fragment Length Polymorphism) s.l. - в широком смысле (sensu lato) s.s. - в узком смысле (sensu stricto)

SCAR - последовательности, характеризующие амплифицированные регионы (Sequence Characterized Amplified Regions) Ssp I - рестриктаза из видов p. Sphaerotilus TAE - трис - ацетат - ЭДТА (буфер)

ТаяДНК — полимераза — ДНК — полимераза из бактерии Termus aquaticus

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетическое исследование комаров комплекса Culex pipiens"

Актуальность темы

Комары комплекса Culex pipiens (Díptera: Culicidae) представляют большой научный и практический интерес. Они являются активными кровососами людей (особенно на урбанизированных территориях) и известны как переносчики возбудителей ряда опасных заболеваний человека. Высокая экологическая пластичность, сложная таксономическая структура и характер взаимоотношений между членами комплекса привлекают постоянное внимание исследователей. Представление о составе комплекса Culex pipiens и таксономическом ранге его членов на протяжении длительного периода его изучения менялись, до сих пор единого мнения по этому вопросу не достигнуто (Виноградова, 1997).

Culex pipiens L., 1758 - северный обыкновенный комар, включает в себя две формы или экотипа, pipiens и molestus, для которых характерно симпатрическое распространение, небольшие морфологические и значительные биологические отличия (Виноградова, 1961, 1997; Лопатин, 2000). Единственным достоверным морфологическим признаком, позволяющим идентифицировать pipiens и molestus, является величина сифоналыюго индекса личинок. В то же время, различия в биологии настолько очевидны, что некоторые авторы рассматривают автогенную форму в качестве самостоятельного вида С. molesius Forskâl, 1775 (Miles, 1977; Knight, 1978), другие, напротив, считают pipiens и molestus формами одного вида, а отличия между ними - только физиологической изменчивостью (Harbach, Harrison, Gad, 1984; Виноградова, 1997), а третьи -подвидами или полувидами (Bullini, 1982; Лопатин, 2000).

Culex torrentium Martini, 1924 считается видом - двойником Culex pipiens, литературные сведения о нем фрагментарны, не определены и границы ареала (Natvig, 1948; Mattingly, 1951а; Service, 1968; Jupp, 1979; Gillies, Gubbins, 1982; Dahl, 1988). Морфологически С. torrentium и С. p. pipiens близки, распространение симпатричное. В биологическом отношении С. torrentium также похож на С. p. pipiens - неавтогенный, эвригамный и гетеродинамный комар (Dahl, 1988; Виноградова, 1997). По личинкам виды не различимы, определение ведется только по самцам, диагностическое значение имеют особенности строения гипопигия (Виноградова, 1997).

Надежная и быстрая идентификация комаров необходима для дифференцировки форм и лучшего понимания их потенциальной роли в передаче возбудителей заболеваний, а также для разработки эффективных мер контроля. Кроме того, возможность точной идентификации видов или подвидов позволяет изучить другие аспекты биологии, например, особенности личиночной экологии, брачного поведения, устойчивости к инсектицидам (Walton, Sharpe, Pritchard et al., 1999; Kengne, Trung, Baimai et al., 2001; Manguin, Kengne, Sonnier et al., 2002). Важное значение имеет идентификация гибридных особей, т.к. вывод о таксономическом статусе организмов должен базироваться на данных, касающихся природной гибридизации. Морфологические признаки, особенно, если они носят количественный характер, не всегда удобно использовать для этих целей, т.к. часто они подвержены индивидуальной, географической, комбинативной и модификационной изменчивости. Для облегчения идентификации криптических видов комаров широко применяются разнообразные молекулярно - генетические методы в дополнение к традиционным морфологическим (Wilkerson, Parsons, Albright et al., 1993). ДНК - маркеры можно использовать для идентификации организма на любой стадии развития; эти маркеры не подвержены изменчивости, вызванной действием факторов окружающей среды (Ноу, 1994; Walton, Sharpe, Pritchard et al., 1999), что позволяет избежать недостатков, присущих морфометрическим признакам. Кроме того, молекулярные маркеры используются при проведении популяционно - генетических и филогенетических исследований.

Цели и задачи исследования

Цель данной работы заключалась в поиске молекулярно - генетических маркеров для идентификации представителей комплекса Culex pipiens и оценке внутри - и межвидовой изменчивости Culex torrentium, С. pipiens pipiens, С. p. molestus. Для достижения поставленной цели требовалось выполнить следующие задачи: 1) провести анализ спектров амплифицированных RAPD - фрагментов ДНК для выявления мономорфных специфичных последовательностей ДНК; 2) определить нуклеотидные последовательности специфичных RAPD - фрагментов ДНК для создания SCAR - праймеров; 3) проверить диагностическую ценность молекулярно -генетических маркеров, предложенных другими авторами для идентификации представителей комплекса Culex pipiens; 4) провести секвенирование и сравнение последовательностей второго интрона гена ацетилхолинэстеразы 2 и участка митохондриального гена субъединицы I цитохромоксидазы с у особей С. р. pipiens и С. р. molestus с целью выявления различий, пригодных для получения молекулярно - генетических маркеров; 5) оценить внутри - и межвидовую изменчивость и дивергенцию RAPD -маркеров у членов комплекса Culex pipiens.

Научная новизна

Впервые были найдены специфичные RAPD - маркеры для идентификации С. torrentium. Определение нуклеотидной последовательности RAPD - фрагментов позволило создать специфичные SCAR - праймеры. ПЦР с использованием SCAR - праймеров является простым, быстрым и надежным методом идентификации С. torrentium. В ходе работы также была изучена диагностическая ценность маркеров, предложенных другими авторами для идентификации С. p. molestus и С. torrentium (Виноградова, Шайкевич, 2005), С. p. pipiens и С. torrentium (Smith, Fonseca, 2004). Показано, что эти маркеры позволяют идентифицировать особей С. torrentium, в то время как, С. p. pipiens и С. p. molestus идентичны по этим маркерам. Выявлено соответствие результатов при использовании различных типов молекулярно - генетических маркеров. Впервые предложен способ идентификации гибридных особей от скрещивания С. torrentium и С. p. molestus.

Проведен анализ изменчивости RAPD - маркеров в популяциях С. р. pipiens, С. p. molestus и С. torrentium из г. Томска, Томской области и Республики Казахстан. Полученные результаты позволили сделать вывод о генетической дифференциации С. torrentium, С. p. pipiens и С. p. molestus и об отсутствии природной гибридизации между ними в районе проведенных исследований. Кроме того, показано, что в открытых личиночных биотопах (Томская область и Республика Казахстан) доминантным видом является С. torrentium', личинки С. p. pipiens встречаются с небольшой частотой.

Практическая ценность работы

Молекулярно - генетические маркеры, рассмотренные в настоящей работе, можно использовать в любых исследованиях, где необходима надежная идентификация С. torrentium и С. p. pipiens, в частности, при и изучении устойчивости к инсектицидам, путей передачи возбудителей заболеваний, при разработке новых методов контроля за численностью переносчиков, для анализа гибридогенеза, а также, в популяционно -генетических, таксономических, филогенетических и фаунистических исследованиях. Принципы поиска и создания специфичных маркеров (RAPD- и SCAR - маркеры), изложенные в диссертации, можно применять для получения диагностических маркеров практически для любого организма.

Апробация результатов работы

Результаты исследований были представлены на II Международной конференции «Проблема вида и видообразования», Томск (2001); на III Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров, Москва (2004); на III Международной конференции «Проблема вида и видообразования», Томск (2004).

Публикации

По теме диссертации опубликовано шесть работ.

Благодарности

Прежде всего я хотела бы выразить глубокую признательность научному руководителю, заведующему лабораторией эволюционной цитогенетики НИИ ББ при ТГУ, д.б.н., профессору В.Н. Стегнию за предоставленную возможность работы над интересной темой, общее руководство и помощь на всех этапах работы над диссертацией. Также, я искренне благодарна к.б.н. Сибатаеву А.К. за предоставление части материала, определение комаров, всестороннюю помощь и поддержку. Я признательна сотрудникам лаборатории эволюционной цитогенетики НИИ ББ при ТГУ Русаковой A.M., Шабановой Ю.В., Штумпф О.В. за помощь в сборе материала, а также, к.б.н. Брагинец О.П. за синтез RAPD - праймеров. Благодарю ст. преподавателя кафедры цитологии и генетики ТГУ Новикова Ю.М. за ценные комментарии к работе. В заключение хочу выразить свою признательность всем коллегам из лаборатории эволюционной цитогенетики НИИ ББ при ТГУ за участие и моральную поддержку.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Исследование видов, подвидов и внутривидовых форм, входящих в комплекс Culex pipiens (Diptera: Culicidae), представляет одну из важнейших проблем в таксономии комаров. Эта проблема существует десятилетиями из-за трудностей и споров, касающихся ряда сложных биологических вопросов: автогенности - неавтогенности, стеногамности - эвригамности, антропофилии - зоофилии - орнитофилии, гомодинамности -гетеродинамности, морфологии, распространения и гибридизации (Harbach, Harrison, Gad, 1984). Наиболее интересен в этом смысле подвид С. p. pipiens, две формы которого наделены альтернативными биологическими признаками (Виноградова, 2003), а также Culex torrentium - вид - двойник Culex pipiens.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Храброва, Наталья Валерьевна

выводы

1. Проведен анализ ДНК - маркеров у трех представителей комплекса Culex pipiens - Culex torrentium, С. p. pipiens, С. p. molestus

6. Анализ изменчивости RAPD - маркеров в популяциях представителей комплекса Culex pipiens из г. Томска, Томской области и Республики Казахстан показал, что С. torrentium, С. р. pipiens и С. р. molestus умеренного климата генетически дифференцированы, природная гибридизация между ними отсутствует

7. Показано, что в открытых личиночных биотопах (Томская область и Республика Казахстан) доминантным видом является С. torrentium; личинки С. р. pipiens встречаются с небольшой частотой

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Храброва, Наталья Валерьевна, Томск

1. Алтухов Ю.П., Салменкова Е.А. Полиморфизм ДНК в популяционной генетике // Генетика. 2002. - Т. 38, № 9. - С. 1173 - 1195.

2. Виноградова Е. Б. О биологической обособленности подвидов Culex pipiens L. (Díptera, Culicidae) // Энтомол. обозрение. 1961. - Т. 40, вып. 1. - С. 63-75.

3. Виноградова Е.Б. Городской комар // Природа. 2003. - № 12. - С. 3 - 11.

4. Виноградова Е.Б. Комары комплекса Culex pipiens в России (таксономия, распространение, экология, физиология, генетика, практическое значение и контроль). СПб.: Изд - во Зоологического института РАН, 1997. - 307 с.

5. Виноградова Е.Б. Кровососущие комары комплекса Culex pipiens L. (Díptera, Culicidae), их практическое значение, систематика и биология // Энтомол. обозрение. 1966. - Т. 45, вып. 2. - С. 241 - 257.

6. Виноградова Е.Б. Наследование морфологических признаков при гибридизации в комплексе Culex pipiens L. (Díptera: Culicidae) // Тр. ЗИН АН СССР. 1965. - Т. 36. - С. 58 - 69.

7. Виноградова Е.Б., Шайкевич Е.В. Дифференциация городского комара Culex pipiens pipiens f. molestus и Culex torrentium (Díptera: Culicidae)молекулярно генетическими методами // Паразитология. - 2005. - Т. 39, № 6-С. 574 - 576.

8. Виноградская О.Н. К нахождению Culex torrentium Mart. (Culex exilis Dyar) в Подмосковье II Мед. паразитол. 1970. - T. 39, № 4. - С. 502 - 504.

9. Гречко В.В. Молекулярные маркеры ДНК в изучении филогении и систематики//Генетика.-2002.-Т. 38, № 8.-С. 1013- 1033.

10. Гундерина Л.И., Салина Е.А. полиморфизм и дивергенция мультилокусных маркеров ДНК у видов двойников Chironomus riparius Meigen и Chironomus piger Strenzke (Díptera, Chironomidae) II Генетика. - 2003-T. 39, №8.-С. 1059- 1065.

11. Дубицкий A.M. Кровососущие комары (Díptera: Culicidae) Казахстана. -Алма Ата: Изд-во «Наука» Казахской ССР, 1970. - 222 с.

12. Кункова Е.В., Федорова В.Г. Дополнение к фауне комаров семейства Culicidae (Díptera) Новгородской области // Паразитология. 2003. - Т. 37, № 2. -С. 113-117.

13. Кухарчук Л.П. Экология кровососущих комаров (Diptera: Culicidae) Сибири. Новосибирск: Наука, 1981.-232 с.

14. Лопатин O.E. Биологические, экологические и биохимические особенности двух подвидов комаров Culex pipiens в синантропных популяциях: Автореф. канд. дис. / Алма Ата, 1988. - 16 с.

15. Лопатин O.E. Комары Culex pipiens: электрофоретическая изменчивость ферментов // Сибирский эколог, журнал. 2000. - № 4. - С. 461 - 475.

16. Оформление курсовых, дипломных, диссертационных работ: Краткие методические рекомендации / Сост.: B.C. Крылова, Е.Ю. Кичигина. Томск, 2002.-28 с.

17. Саура А., Локки Ю., Корвенконтио П., Локки М.-Л., Ултанен И. Генетическая обособленность малярийных комаров Anopheles beklemishevi и Anopheles messeae (Diptera, Culicidae) и их внутривидовой полиморфизм // Генетика. 1979.-Т. 15, № 12. - С. 2183 - 2194.

18. Сичинава Ш.Г. Реципрокное скрещивание С. p. pipiens с С. p. molestus, копуляция и соотношение полов родительских и гибридных поколений // Сообщ. АН ГрССР. 1975. - Т. 80, № 3. - С. 733 - 736.

19. Сичинава Ш.Г. Реципрокное скрещивание С. p. pipiens с С. p. molestus, автогенность и плодовитость родительских и гибридных поколений // Сообщ. АН ГрССР. 1976. - Т. 81, № 3. - С. 717 - 720.

20. Стегний В.Н. Популяционная генетика и эволюция малярийных комаров. Томск: Изд- во Томского гос. ун-та, 1991. - 136 с.

21. Шайкевич Е.В., Виноградова Е.Б. Молекулярно генетические методы идентификации городского комара Culex pipiens pipiens f. molestus (Diptera, Culicidae) II Паразитология. - 2004. - Т. 38, № 5. - С. 406 - 412.

22. Шингарев H.H. Заметки по Culicidae // Тропическая медицина и ветеринария. 1928. - С. 47 - 53.

23. Штакельберг A.A. Фауна СССР. Насекомые двукрылые. Семейство Culicidae. Т. 3, вып. 4. М. - Л.: Изд - во Академии наук СССР, 1937. - 260 с.

24. Apostol B.L., Black W.C., Reiter P., Miller B.R. Population genetics with RAPD PCR markers: the breeding structure of Aedes aegypti in Puerto Rico // Heredity. - 1996. - Vol. 76. - P. 325 - 334.

25. Aranda C., Eritjia R., Schaffner F., Escosa R. Culex {Culex) torrentium Martini (Diptera: Culicidae) a new species from Spain // European Mosq. Bull. 2000. - № 8.-P.7-9.

26. Avise J.C., Arnold J., Ball R.M. et al. Intraspecific phylogeography: The mitochondrial DNA bridge between population genetics and systematics // Annu. Rev. Ecol. Syst. 1987. - Vol. 18. - P. 489 - 522.

27. Avise J.C., Vrijenhoek R.C. Mode of inheritance and variation of mitochondrial DNA in hybridogenic fishes of the genus Poeciliopsis II Mol. Biol. Evol. 1987. - Vol. 4. - P. 514 - 525.

28. Ayres C.F.J., Romao T.P.A., Melo Santos M.A.V., Furtado A.F. Genetic diversity in Brazilian populations of Aedes albopictus II Mem. Inst. Oswaldo Cruz. -2002. - Vol. 97, № 6. - P. 871 - 875.

29. Barr A.R. Culex II Handbook of genetics, vol.3: Invertebrates of genetic interest.-New York, 1975.-P. 347-375.

30. Barr A.R. Cytoplasmic incompatibility in natural populations of a mosquito, Culexpipiens L. // Nature. 1980. - Vol. 283. - P. 71 - 72.

31. Barr A.R. Occurrence and distribution of the Culex pipiens complex // Bull. Wld. Hlth. Org. 1967. - Vol. 33. - P. 293 - 296.

32. Bates M. The nomenclature and taxonomic status of the mosquitoes of the Anopheles maculipennis complex // Ann. Entomol. Soc. Amer. 1940. - Vol. 33. -P. 343 -356.

33. Bermingham E., Lamb T., Avise J.C. Size polymorphism and heteroplasmy in the mitochondrial DNA in lower vertebrates // J. Hered. 1986. - Vol. 77. - P. 249 -252.

34. Birky C.W. Relaxed cellular controls and organelle heredity // Science. 1983. -Vol. 222.-P. 468-475.

35. Breeuwer J.A.J., Werren J.H. Microorganisms associated with chromosome destruction and reproductive isolation between two insect species // Nature. 1990. -Vol. 346.-P. 511 -558.

36. Bullini L. The electrophoretic approach to the study of parasites and vectors // Parassitologia. 1982. - Vol. 27. - P. 1 - 11.

37. Byrne K., Nichols R.A. Culex pipiens in London underground tunnels: differentiation between surface and subterranean populations // Heredity. 1999. -Vol. 82.-P. 7-15.

38. Carlson J.E., Tulsieram L.K., Glaubitz J.C. et al. Segregation of random amplified DNA markers in Fi progeny of conifers // Theoretical and Applied Genetics. 1991. - Vol. 83. - P. 194 - 200.

39. Caterino M.S., Cho S., Sperling F.A.H. The current state of insect molecular systematics: a thriving Tower of Babel // Annu. Rev. Entomol. 2000. - Vol. 45. - P. 1-54.

40. Chapman R.W., Stephens J.C., Lansman R.A., Avise J.C. Models of mitochondrial DNA transmission genetics and evolution in higher eukaryotes // Genet. Res. 1982. - Vol. 40. - P. 41 - 57.

41. Chevillon C., Eritja R., Pasteur N., Raymond M. Commensalism, adaptation and gene flow: mosquitoes of the Culex pipiens complex in different habitats // Genet. Res. 1995. - Vol. 66. - P. 147 - 157.

42. Chevillon C., Rivet Y., Raymond M. et al. Migration/selection balance and ecotypic differentiation in the mosquito Culex pipiens II Molecular Ecology. 1998-Vol. 7.-P. 197-208.

43. Christophers S.R. Note on morphological characters differentiating Culex pipiens L. from Culex molestus Forskal and the status of these forms // Trans. R. Ent. Soc. Lond. 1951. -Vol. 102, № 7. - P. 372 - 379.

44. Clancy D.J., Hoffman A.A. Cytoplasmic incompatibility in Drosophila simulans: evolving complexity // Trends Ecol. Evol. 1996. - Vol. 11. - P. 145 -146.

45. Clary D.O., Wolstenholme D.R. The mitochondrial DNA molecule of Drosophila yakuba\ nucleotide sequence, gene organization, and genetic code // J. of Mol. Evol. 1985. - Vol. 22. - P. 252 - 271.

46. Cockburn A.F. A simple and rapid technique for identification of large numbers of individual mosquitoes using DNA hybridization // Arch. Insect. Biochem. Phisiol. 1990. -Vol. 14.-P. 191-199.

47. Cohuet A., Simard F., Toto J. C. et al. Species identification within the Anopheles funestus group of malaria vectors in Cameroon and evidence for a new species // Am. J. Trop. Med. Hyg. - 2003. - Vol. 69, № 2. - P. 200 - 205.

48. Collins F.H., Paskewitz S.M. A review of the use of ribosomal DNA (rDNA) to differentiate among cryptic Anopheles species // Insect Mol. Biol. 1996. - Vol. 5. -P. 1-9.

49. Collins F.N., Petrarca V., Mpofu S., Brandling-Bennet A.D. et al. Comparison of DNA probe and cytogenic methods for identifying field collected Anopheles gambiae complex mosquitoes // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1988. - Vol. 39. - P. 545 -550.

50. Cornel A.J., Porter C.H., Collins F.H. Polymerase chain reaction species diagnostic assay for Anopheles quadrimaculatus cryptic species (Diptera: Culicidae) based on ribosomal DNA ITS2 sequences // J. Med. Entomol. 1996. - Vol. 33. - P. 109-116.

51. Coyne J.A., Orr A. The evolutionary genetics of speciation // Phil. Trans. R. Soc. Lond. 1998. - Vol. 353. - P. 287 - 305.

52. Coyne J. A., Orr H.A. Patterns of speciation in Drosophila II Evolution. 1989. -Vol. 43. - P. 362-381.

53. Cross N.C.P., Dover G.A. Tsetse fly rDNA: An analysis of structure and sequence//Nucleic Acids Res.- 1987.-V. 15.-P. 15-30.

54. Cupp E.W., Ibrahim A.N. Identification of members of the Culex pipiens complex by immunodiffusion and Immunoelectrophoresis // J. Med. Ent. 1973. -Vol. 10, №3.-P. 277-281.

55. Dahl C. Taxonomic studies on Culex pipiens and C. torrentium II Biosystematics of Haematophagous Insects. Oxford Systematics Assoc., 1988. Special vol. 37.-P. 149-175.

56. Favia G., Dimopoulos G., Delia Torre A. et al. Polymorphisms detected by random PCR distinguish different chromosomal forms of Anopheles gambiae II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - Vol. 91. - P. 10315 - 10319.

57. Favia G., Dimopoulos G., Louis C. Analysis of the Anopheles gambiae genome using RAPD markers // Insect Mol. Biol. 1994. - Vol. 3. - P. 149 - 157.

58. Feder J.L., Chilcote C.A., Bush G.L. Are the apple maggot, Rhagoletis pomonella, and blueberry maggot, R. mendax, distinct species? Implications for sympatric speciation // Entomologia Experimentalis et Applicata. 1989. - Vol. 51.-P. 113-123.

59. Foley D.H., Bryan J.H. Electrophoretic keys to identify members of the Anopheles punctulatus complex of vector mosquitoes in Papua New Guinea // Med. Vet. Entomol. 1993. - Vol. 7. - P. 49 - 53.

60. Foley D.H., Meek S.R., Bryan J.H. The Anopheles punctulatus group of mosquitoes in Solomon Islands and Vanuatu surveyed by allozyme electrophoresis // Med. Vet. Entomol. 1994. - Vol. 8. - P. 340 - 350.

61. Foley D.H., Paru R., Dagoro H., Bryan J.H. Allozyme analysis reveals six species within the Anopheles punctulatus complex of mosquitoes in Papua New Guinea // Med. Vet. Entomol. 1993. - Vol. 7. - P. 37 - 48.

62. Fonseca D.M., Keyghobadi N., Malcolm C.A. et al. Emerging vectors in the Culex pipiens complex // Science. 2004. - Vol. 303. - P. 1535 - 1538.

63. Garner K J., Slavicek J.M. Identification and characterization of a RAPD-PCR marker for distinguishing Asian and North American gypsy moths // Insect Molecular Biology. 1996. - Vol. 5. - P. 81 - 91.

64. Gillies M.T., Gubbins S.J. Culex (Culex) torrentium Martini and Cx. (Cx.) pipiens L. in Southern English county, 1974 1975 // Mosquito Systematics. - 1982. -Vol. 14, №2.-P. 127- 130.

65. Gordeev M.I., Goriacheva I.I., Shaikevich E.V., Ejov M.N. Variability of the second internal transcribed spacer of the ribosomal DNA among five Palaearctic species of anopheline mosquitoes // European Mosq. Bull. 2004. - № 17. - P. 14 -19.

66. Gray M.W. Origin and evolution of mitochondrial DNA // Annu. Rev. Cell Biol. 1989. - Vol. 5. - P. 25 - 50.

67. Green C.A., Gass R.F., Munstermann L.E., Baimai V. Population genetic evidence for two species in Anopheles minimus in Thailand // Med. Vet. Entomol. -1990.-Vol. 4.-P. 25-34.

68. Green C.A., Munstermann L.E., Tan S.G. et al. Population genetic evidence for species A, B, C and D of the Anopheles dirus complex in Thailand and enzyme electromorphs for their identification // Med. Vet. Entomol. 1992. - Vol. 6. - P. 29 -36.

69. Guillemaud T., Pasteur N., Rousset F. Contrasting levels of variability between cytoplasmic genomes and incompatibility types in the mosquito Culex pipiens // Proc. R. Soc. Lond. 1997. - Ser. B, vol. 264. - P. 245 - 251.

70. Gyllensten U., Wharton D., Wilson A.C. Maternal inheritance of mitochondrial DNA during backcrossing of two species of mice // J. Hered. 1985. - Vol. 76. - P. 321 -324.

71. Hackett L.W. Recent findings bearing on the epidemiology of malaria in Europe // Med. Parasitol. and Paras. Dis. 1935. - Vol. 4, № 1 - 2. - P. 38 - 44.

72. Hackett L.W., Missirolli A. The varieties of Anopheles maculipennis and their relation to the distribution of malaria in Europe // Rivista di Malariologia. 1935. -Vol. 14.-P. 1-67.

73. Hall H.G. Parental analysis of introgressive hybridization between African and European honeybees using DNA RFLPs // Genetics. 1990. - Vol. 125. - P. 611 -621.

74. Harbach R.E., Harrison B.A., Gad A.M. Culex {Culex) molestus Forskäl (Diptera: Cilicidae): neotype designation, description, variation, and taxonomic status // Proc. Entomol. Soc. Wash. 1984. - Vol. 86, № 3. - P. 521 - 542.

75. Hayes C.G. West Nile virus: Uganda, 1937, to New York City, 1999 // Ann. N.Y. Acad. Sei. 2001. - Vol. 951. - P. 25 - 37.

76. Haymer D.S., Mclnnis D.O., Arcangeli L. Genetic variation between strains of the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata, detected by DNA fingerprinting // Genome. 1992. - Vol. 35. - P. 528 - 533.

77. Hertig M. The rickettsia, Wolbachia pipientis (gen. et sp.n.) and associated inclusions of the mosquito, Culex pipiens II Parasitology. 1936. - Vol. 28. - P. 453 -486.

78. Jaenson T.G.T. Overwintering of Culex mosquitoes in Sweden and their potential as reservoirs of human pathogens // Med. Vet. Ent. 1987. - Vol. 1, № 2. -P. 151-156.

79. Jobling B. On two subspecies of Culex pipiens L. (Diptera) // Trans. R. Ent. Soc. Lond. 1938. - Vol. 87. - P. 193 - 216.

80. Jobling B. The development of mosquitoes in complete darkness // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 1937. - Vol. 30. - P. 467 - 474.

81. Jupp P.G. Culex {Culex) pipiens and Culex {Cx.) torrentium (Diptera: Culicidae) in England: notes on their taxonomy and biology // Mosquito Systematics. 1979. - Vol. 11, № 2. - P. 121 - 126.

82. Kambhampati S., Black W.C. IV, Rai K.S. Random amplified polymorphic DNA of mosquito species and populations (Diptera: Cilicidae): techniques, statistical analysis, and applications // J. Med. Entomol. 1992. - Vol. 29. - P. 939 - 945.

83. Knight K.L. A review of the Culex pipiens complex in the Mediterranean subregion (Diptera, Culicidae) // Trans. R. Ent. Soc. Lond. 1951. - Vol. 102, № 7. -P. 354-364.

84. Knight K.L. Supplement to a catalog of the mosquitoes of the world (Diptera, Culicidae). College Park, 1978. - 107 p.

85. Koekemoer L. L., Kamau L., Hunt R. H., Coetzee M. A cocktail polymerase chain reaction assay to identify members of the Anopheles funestus (Diptera: Culicidae) group // Am. J. Trop. Med. Hyg. 2002. - Vol. 6, № 6. - P. 804 - 811.

86. Kondo R., Satta Y., Matsuura E.T. et al. Incomplete maternal transmission of mitochondrial DNA in Drosophila II Genetics. 1990. - Vol. 126. - P. 657 - 663.

87. Krzywinski J., Besansky N. Molecular systematics of Anopheles: from subgenera to subpopulations // Annu. Rev. Entomol. 2003. - Vol. 48. - P. 111139.

88. Ma M., Beier J.C., Petrarca V., Gwadz R. W. et al. Differentiation of Anopheles gambiae and An. arabiensis (Diptera: Culicidae) by ELISA using immunoaffinity-purified antibodies to vitellogenin // J. Med. Entomol. 1990. - Vol. 27. - P. 564 -569.

89. MacGregor M.E. The occurrence of Roubaud's "Race autogene" in a German strain of Culex pipiens in England: with notes on rearing and bionomics // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 1932. - Vol. 26. - P. 307 - 314.

90. Magnin M., Pasteur N., Raymond M. Multiple incompatibilities within populations of Culex pipiens L. in southern France // Genetica. 1987. - Vol. 74. -P. 125- 130.

91. Manguin S., Kengne P., Sonnier L. et al. SCAR markers and multiplex PCR -based identification of isomorphic species in the Anopheles dirus complex in Southeast Asia // Medical and Veterinary Entomology. 2002. - Vol. 16. - P. 46 -54.

92. Marshall J.F. The British mosquitoes. London, 1938. - 341 p.

93. Marshall J.F., Staley J. Some notes regarding the morphological and biological differentiation of Culex pipiens Linnaeus and Culex molestus Forskäl (Diptera, Culicidae) // Proc. R. Ent. Soc. Lond. 1937. - Ser. A, vol. 12, p. 1 - 2. - P. 17 - 26.

94. Mattingly P.F. Culex {Culex) torrentium Martini, a mosquito new in Great Britain//Nature.-1951a.-Vol. 168.-P. 172.

95. Mattingly P.F. The Culex pipiens complex. Introduction // Trans. R. Ent. Soc. Lond. 19516.-Vol. 102, №7. -P. 331 -342.

96. McLain D.K., Collins F.H. Structure of rDNA in the mosquito Anopheles gambiae and rDNA sequence variation within and between species of the An. gambiae complex // Heredity. 1989. - Vol. 62. - P. 233 - 242.

97. Miles S.J. Laboratory evidence for mate recognition between behaviour in a member of the Culex pipiens complex (Diptera: Culicidae) // Aust. J. Zool. 1977. -Vol. 25.-P. 491 -498.

98. Miles S.J., Paterson H.E. Protein variation and systematics in the Culex pipiens group of species // Mosquito Systematics. 1979. - Vol. 11, № 3. - P. 187 - 192.

99. Miller B.R., Crabtree M.B., Savage H.M. Phylogeny of fourteen Culex mosquito species, including the Culex pipiens complex, inferred from the internal transcribed spacers of ribosomal DNA // Insect Mol. Biol. 1996. - Vol. 5, № 2. - P. 93- 107.

100. Mitchell S.E., Narang S.K., Cockburn A.F. et al. Mitochondrial and ribosomal DNA variation among members of the Anopheles quadrimaculatus species complex// Genome. 1992. - Vol. 35. - P. 939 - 950.

101. Munstermann L.E., Conn J.E. Systematics of mosquito disease vectors (Diptera: Culicidae): Impact of molecular biology and cladistic analysis // Annu. Rev. Entomol. 1997. - Vol. 42. - P. 351 - 369.

102. Narang S.K., Kaiser P.E., Seawright J.A. Dichotomous electrophoretic key for the identification of sibling species A, B and C of the Anopheles quadrimaculatus (Say) species complex (Diptera: Culicidae) // J. Med. Entomol. 1989a. - Vol. 26. -P. 94-99.

103. Narang S.K., Kaiser P.E., Seawright J.A. Identification of species D, a new member of the Anopheles quadrimaculatus species complex: a biochemical key // J. Am. Mosq. Control Assoc. 19896. - Vol. 5. - P. 317 - 324.

104. Natvig L.R. Contributions to the knowledge of the Danish and Fennoscandian mosquitoes Culicini. Oslo: A.W. Broggers Boktrykkeri, 1948. - 567 p.

105. Nazni W.A., Lee H.L., Mori A. Restriction fragment patterns of DNA in Culex pipiens complex // Tropical Biomedicine. 1997. - Vol. 14. - P. 125 - 127.

106. Nei M. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals // Genetics. 1978. - Vol. 89. - P. 583 - 590.

107. Onyeka J.O.A. The taxonomic value of pre alar scales in the identification of Culex {Culex) pipiens L. and Culex (Cx.) torrentium Martini (Diptera: Culicidae) // Mosquito Systematica - 1982.-Vol. 14.-P. 41 -51.

108. Otranto D., Traversa D., Guida B. et al. Molecular characterization of the mitochondrial cytochrome oxidase I gene of Oesteridae species causing obligate myiasis // Medical and Veterinary Entomology. 2003. - Vol. 17. - P. 307 - 315.

109. Page R. D. M. TREEVIEW: An application to display phylogenetic trees on personal computers // Computer Applications in the Biosciences. 1996. - Vol. 12. -P. 357-358.

110. Paran I., Michelmore R.W. Development of reliable PCR-based markers linked to downy mildew resistance genes in lettuce // Theoretical and Applied Genetics. -1993.-Vol. 85.-P. 985-993.

111. Paskewitz S.M., Collins F.H. Use of polymerase chain reaction to identify mosquito species of the Anopheles gambiae complex // Med. Vet. Entomol. 1990. -Vol. 4.-P. 367-373.

112. Paskewitz S.M., Wesson D.M., Collins F.H. The internal transcribed spacers of ribosomal DNA in five members of the Anopheles gambiae species complex // Insect Mol. Biol. 1993. - Vol. 2, № 4. - P. 247 - 257.

113. Platonov A.E., Shipulin G.A., Shipulina O.Y. et al. Outbreak of West Nile virus infection, Volgograd Region, Russia, 1999 // Emerg. Infect. Dis. 2001. - Vol. 7.-P. 128- 132.

114. Porter C.H., Collins F.H. Species diagnostic differences in a ribosomal DNA internal transcribed spacer from the sibling species Anopheles freeborni and Anopheles hermsi (Diptera: Culicidae) // Am. J. Trop. Med. Hyg. - 1991. - Vol. 45. -P. 271 -279.

115. Power E.G.M. RAPD typing in microbiology a technical review // J. of Hospital Infection. - 1996. - Vol. 34. - P. 247 - 265.

116. Proft J., Maier W.A., Kampen H. Identification of six sibling species of the Anopheles maculipennis complex (Diptera: Culicidae) by a polymerase chain reaction assay // Parasitol. Res. 1999. - Vol. 85. - P. 837 - 843.

117. Ribeiro H., Ramos H.C., Capela R.A., Pires C.A. Research on the mosquitoes of Portugal (Diptera, Culicidae). Ill Further five new mosquito records // Sep. Garcia de Orta. - 1977. - Vol. 6. - P. 51 - 60.

118. Rice W.R., Hostert E.E. Laboratory experiments on speciation: what have we learned in 40 years?//Evolution. 1993.-Vol. 47.-P. 1637- 1653.

119. Schaffner F. A revised checklist of the French Culicidae // European Mosq. Bull.- 1998.-№2.-P. 1-9.

120. Service M.W. The taxonomy and biology of two sympatric sibling species of Culex, C. pipiens and C. torrentium (Diptera: Culicidae) // J. Zool. 1968. - Vol. 156. - P. 313 - 323.

121. Shute P.G. Culex molestus // Trans. R. Ent. Soc. Lond. 1951. - Vol. 102, № 7.-P. 380-382.

122. Smith J.L., Fonseca D.M. Rapid assays for identification of members of the Culex (iCulex) pipiens complex, their hybrids, and other sibling species (Diptera: Culicidae) // Am. J. Trop. Med. Hyg. 2004. - Vol. 70, № 4. - P. 339 - 345.

123. Strong K.L., Mahon R.J. Genetic variation in the Old World screw-worm fly, Chrysomya bezziana (Diptera: Calliphoridae) // Bulletin of Entomological Research. -1991.-Vol. 81.-P. 491 -496.

124. Tamura K. The rate and pattern of nucleotide substitution in Drosophila mitochondrial DNA // Mol. Biol. Evol. 1992. - Vol. 9. - P. 814 - 825.

125. Tate P., Vincent M. The biology of autogenous and anautogenous races of Culex pipiens L. (Diptera: Culicidae) // Parasitology. 1936. - Vol. 28. - P. 115145.

126. Tsai T.F., Popovici F., Cernescu C. et al. An epidemic of West Nile encephalitis in southeastern Romania // Lancet. 1998. - Vol. 352. - P. 767 - 771.

127. Urbanelli S., Silvestrini F., Sabatinelli G. et al. Characterization of the Culex pipiens complex (Diptera: Culicidae) in Madagascar // J. Med. Entomol. 1995. -Vol. 32.-P. 778-786.

128. Wainhouse D., Jukes M.R. Geographic variation within populations of Panolis flammea (Lepidoptera: Noctuidae) in Britain // Bulletin of Entomological Research. -1997.-Vol. 87.-P. 95-99.

129. Walton C., Shape R.G., Pritchard S.J. et al. Molecular identification of mosquito species // Biological J. of the Linn. Soc. 1999. - Vol. 68. - P. 241 - 256.

130. Welsh J., McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers // Nucl. Acids. Res. 1990. - Vol. 18. - P. 7213 - 7218.

131. Werren J.H., Zhang W., Guo L.R. Evolution and phylogeny of Wolbachia: reproductive parasites of arthropods // Proc. R. Soc. Lond. 1995. - Ser. B, vol. 261. -P. 55-71.

132. Wesson D.M., McLain D.K., Oliver J.H. et al. Investigation of the validity of species status of Ixodes dammini (Acari: Ixodidae) using rDNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993.-Vol. 90.-P. 10221 - 10225.

133. West D.F., Black W.C. Breeding structure of three snow pool Aedes mosquito species in northern Colorado//Heredity. 1998. - Vol. 81.-P. 371 -380.

134. Wilkerson R.C., Parsons T.J., Albright D.G. et al. Random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers readily distinguish cryptic mosquito species (Diptera: Culicidae: Anopheles) II Insect Molecular Biology. 1993. - Vol.1, № 4. -P. 205-211.

135. Williams J.G.K., Kubelik A.R., Livak K.J., Rafalski J.A., Tingey S.V. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers // Nucl. Acids. Res. 1990. - Vol. 18. - P. 6531 - 6535.

136. Yasothornsrikul S., Panyim S., Rosenberg R. Diagnostic restriction fragment patterns of DNA from the isomorphic species of Anopheles dirus II Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health. 1988. - Vol. 19. - P. 703 - 708.

137. Yen J.H., Barr A.R. The etiological agent of cytoplasmic incompatibility in Culexpipiens II J. Invertebr. Pathol. 1973. - Vol. 22. - P. 242 - 250.

Информация о работе

Храброва, Наталья Валерьевна
кандидата биологических наук
Томск, 2006
ВАК 03.00.15

Диссертация

Молекулярно-генетическое исследование комаров комплекса Culex pipiens - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы