Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетический анализ торсионной дистонии
ВАК РФ 03.00.15, Генетика
Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетический анализ торсионной дистонии"
! . *
'Г1- - -
, V РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК
ъ
МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР
На правах рукописи УДК 575:576.38:599.9
МИКЛИНА Наталья Игоревна
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ТОРСИОННОЙ ДИСТОНИИ
03.00.15 - генетика
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Москва -1998
Работа выполнена в Научно-исследовательском институте неврологии Российской академии медицинских наук
НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:
кандидат медицинских наук Маркова Е.Д.
НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ:
доктор медицинских наук Иллариошкин С.Н.
ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:
доктор биологических наук, профессор Шишкин С.С. доктор медицинских наук Кадыков A.C.
ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:
Российский Государственный Медицинский Университет
Защита состоится 1999 г. в -Т^^часов на заседании
Диссертационного совета Д 001.16.01 при Медико-генетическом научном центре РАМН (МГНЦ РАМН) по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, 1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Медико-генетического научного центра РАМН.
Автореферат разослан
■¿/А,
Ученый секретарь
Диссертационного совета
доктор биологических наук, профессор
Л.Ф.Курило
гоес
ег.ПЛ:гО~-г:Л
'JJsT-oi 1
1. Общая характеристика работы
Актуальность проблемы
Характерном чертой современной медицины является интенсивное развитие молекулярно-генетических технологий, что позволило идентифицировать большое число новых генов наследственных заболеваний человека, внедрить методы ДНК-диагностики и разработать первые подходы к генной терапии наследственных болезней (Suhr S., Gage F., 1993; McKusick V., 1994; Rosenberg R„ Iannaccone S„ 1995; Karpati G. et al.. 1996).
Результатом широкого внедрения молекулярно-генетических методов исследований в неврологии стало картирование на разных хромосомах свыше 150 генов наследственных заболеваний нервной системы, а также идентификация мутантных генов при более чем 70 психоневрологических заболеваниях (McKusick V. 1994. Harding А. 1994, Rosenberg R. 1996, Bird T. 1995, Fishbeck K.H. 1994. Mcrette С. 1994, Иллариошкин С.H. 1998). Разработка и внедрение косвенных и прямых методов определения мутаций у больных и лиц из группы риска, последующее изучение механизмов реализации мутаций на клеточном и биохимическом уровне, а также установление белковых продуктов соответствующих генов позволят разработать новые подходы к диагностике, эффективной терапии и профилактике наследственных болезней.
Торсионная дистопия (ТД), являющаяся объектом настоящего исследования, представляет собой тяжелое генетически гетерогенное наследственное заболевание нервной системы человека, характеризующееся своеобразными гиперкинезами, изменением мышечного тонуса с формированием патологических поз, прогрессирующим течением и глубокой инвалидизацней больных (Давиденков С.Н., 1932; Маркова Н.Д., 1973, 1975. 1998; Fahn S., 1988).
Автор выражает глубокую признательность за консультативную помощь при выполнении работы руководителю отдела молекулярных основ генетики чалоиека ИМГ РАН доктору биол. наук, профессору С.А. Лимборской.
С клинической точки зрения принято выделять 2 основных варианта торсионной дистонии - ригидную, дофа-зависимую дистопию (ДЗД), характеризующуюся высокой чувствительностью к малым дозам препаратов L-ДОФА (биологического предшественника нейромедиатора дофамина), и гиперкинетическую-дистоническую, дофа-независимую дистопию (ДНЗД), при которой L-ДОФА терапия не эффективна (Ткачев Р.А. и Маркова Е.Д., 1972; Маркова Е.Д., 1973, 1975; Segawa М. et al., 1971; Nygaard T.G. et al„ 1988). Указанные формы ТД отличаются как по характеру неврологического синдрома, так и по основным нейрохимическим нарушениям, лежащим в основе патогенеза болезни (Rajput А.Н. et al., 1994; Nygaard T.G., 1995; Маркова Е.Д., 1989; Бархатова В.П., 1978). Выявление такого четкого фенотипического полиморфизма ТД требовало молекулярно-генетического исследования для подтверждения (или отрицания) ее генетической гетерогенности.
Картирование и идентификация основного гена ДЗД (GCH-I) в хромосомном локусе 14q22 (Nygaard T.G. et al., 1993; Ichinose H. et al., 1994), кодирующего синтез фермента ГТФ-циклогидролаза I, и выявление в нем ряда различных мутаций (Ichinose et al., 1994; Tanaka et al., 1995; Bandmann O. et al., 1996) стало поворотным моментом в изучении данной клинической формы ТД. Этими же авторами было показано, что только 50% случаев ДЗД обусловлено изменениями в кодирующей области этого гена. На данный момент в различных популяциях мира выявлено около 40 мутаций в гене GCH-I.
Ген ДНЗД (DYT I) был картирован на хромосоме 9q34 (Ozelius L. et al.. 1989). Исследование большого числа больных с ДНЗД в популяции евреев Ашкенази (где частота этой формы гораздо выше общепопуляционной) показало наличие характерного 9я-сцепленного гаплотипа, свидетельствующего об эффекте основателя в данной этнической
группе (Bressman S. et al., 1992). В 1997 году эта же группа исследователей показала, что мажорная del GAG в гене DYT I, обусловливает 90% случаев возникновения фенотипа ДНЗД у больных различного этнического происхождения. В то же время, разными авторами показано существование самостоятельных генов ряда других, более редких клинических вариантов ТД (Fink J. et al., 1996; Knappskog P. et al., 1995; Fouad G. et al., 1996; Leube В., 1996; Almasy L., 1997). Следует отметить, что до настоящего исследования работ подобного рода по ТД в России не проводилось.
В настоящее время остается открытым широкий круг вопросов. В частности, не установлены взаимоотношения между характером мутаций и фенотнпическими проявлениями различных форм ТД, истинная пенетрантность и экспрессивность соответствующих мутантных генов. Требует изучения сравнительный анализ мутаций в генах ТД в различных популяциях, происхождение конкретных мутаций, генетический статус спорадических случаев заболеваний. Наконец, важнейшей задачей является разработка системы медико-генетического консультирования в отягощенных семьях, основанного на прямой ДНК-диагностике.
В настоящей работе представлены результаты молекулярно-генетического анализа большого количества семей с различными формами ТД из уникальной коллекции отделения нейрогенетики НИИ неврологии РАМН.
Цель и задачи исследования Целью настоящей работы явился клинико-генетический и мутационный анализ и разработка на этой основе методов прямой ДНК-диагностики различных форм ТД (на примере российской популяции).
В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи исследования:
]) исследование гена GCH-I (хромосомная область 14q22) с целыо выявления мутаций у больных с различными вариантами ДЗД;
2) исследование гена DYT I (хромосомная область 9q34) с целыо выявления мутаций у больных с различными вариантами ДНЗД;
3) сопоставление характера выявленных мутаций с особенностями клинической картины изучаемых заболеваний; анализ основных клинико-генетических корреляций;
4) разработка подходов к прямой ДНК-диагностике различных форм ТД на основе полученных данных.
Научная поспит. Впервые в России было проведено молекулярно-генетическое исследование большого числа семей с различными формами ТД, использующее широкий комплекс современных базовых молекулярных методов. Был проанализирован спектр мутаций у больных ДЗД в российской популяции, выявлен ряд новых мутаций, приводящих к развитию заболевания. Проанализирована взаимосвязь характера мутаций с особенностями течения и клинической картины заболевания. Изучена частота мажорной мутации del GAG в гене DYT I у больных с дофа-независимой формой ТД у лиц различного этнического происхождения в российской популяции. Впервые на примере славянской семьи показано возникновение мутации de novo.
Практическая значимость. Уточнен спектр клинических проявлений ДЗД н ДНЗД в подтвержденных ДНК-анализом случаях заболеваний. Изучена пенетрантность и фенотипическая экспрессия соответствующих генов и конкретных мутаций. Получен первый в нашей стране опыт прямой ДНК-диагностики различных форм ТД. На основании полученных результатов клинико-генетических и молекулярно-генетическнх исследований были разработаны принципы медико-гепетического консультирования в группе риска и в семьях больных ТД.
Основные положения, выносимые па защиту:
1) Торсионная дистония в российской популяции является генетически гетерогенной группой заболеваний, обусловленных, главным образом, мутациями в генах GCH-I (дофа-зависимая форма) и DYT I (дофа-независимая форма);
2) ДЗД в большинстве семей характеризуется наличием уникальных точковых мутаций в кодирующей области гена GCH-I; в российской популяции идентифицировано 4 новых точковых мутации данного гена и обоснована его высокая пенетрантность;
3) при ДНЗД мажорная del GAG выявляется у 100% больных в семьях евреев Ашкенази (эффект основателя); и в половине славянских семей (повторные мутации de novo)\
4) указанные формы ТД характеризуются более широкой, чем считалось ранее, фенотипической экспрессией мутантного гена, что проявляется развитием как классических генерализованных, так и разнообразных локальных и стертых форм болезни, что должно учитываться при медико-генетическом консультировании.
Апробация работы. Работа апробирована и рекомендована к защите на совместном заседании сотрудников I, II, III сосудистых, ангионейрохирургического, нейрогенетического отделений, лаборатории клинической нейрофизиологии НИИ неврологии РАМН 23.10.98 г. и на совместном заседании сотрудников МГНЦ РАМН 03.11.98 г. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на IV Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1997), на конференции "Актуальные вопросы неврологии, нейрохирургии и медицинской генетики" (Уфа, 1998), на международном симпозиуме Movement Disorders (Нью-Йорк, 1998).
2 л.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ (из них 3 в зарубежных журналах).
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 85 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, обсуждения, выводов, библиографического указателя (включающего 106 источников) и 2 приложений. Работа иллюстрирована 6 таблицами и 15 рисунками.
2. Объем и методы исследования
Общая характеристика больных и обследованных семей.
В настоящее исследование вошли 85 больных из 34 семей с различными формами ТД, в том числе: 72 семейных случая (20 семей с двумя и более больными) и 14 спорадических случаев. Общее число обследованных больных, семей и их распределение по нозологическим формам представлено в таблице 1.
Таблица 1. Распределение больных и семей по нозологическим формам н объем исследований.
Заболевание Число семей Общее число обследованных больных Число исследованных образцов ДНК больных Общее число исследованных образцов ДНК (в т.ч. ДНК лиц из группы риска и контрольной группы)
Дофа-зависимая дистопия 12 47 20 41
Дофа-независимая дистоии 22 38 28 58
Всего 34 85 48 99
Сведения об этническом составе семей и больных со спорадическими случаями представлены в таблице 2.
Таблица 2. Этнический состав обследованных семей.
Заболевание Русские Евреи Ашкенази Другие национальности
ДЗД 7 1 4
ДНЗД 13 7 2
Характеристика молекуляуио-геиети ческих методов исследования.
Молекулярно-генетическая часть работы выполнялась нами на базе ДНК-лаборатории отделения нейрогенетики НИИ неврологии РАМН и Института молекулярной генетики РАН совместно с сотрудниками отдела молекулярных основ генетики человека (к.б.н. Сломинский П.А., к.б.н. Шадрина М. И., руководитель отдела - Лауреат Государственной премии РФ, д.б.н., профессор Лимборская С.А.). Часть исследований выполнена на базе молекулярно-генетической лаборатории отделения неврологии Института мозга Университета г. Ниигата, Япония (руководитель отделения профессор Ш. Цудзи) и отдела неврологии и генетики Гарвардского Университета, Бостон, США (руководитель отдела - профессор Ксандра О. Брейкфилд). В совокупности исследовано 99 образцов ДНК, в том числе 48 образцов ДНК больных с ДНЗД и ДЗД, и 51 образец ДНК клинически здоровых родственников из обследуемых семей (включая лиц из группы риска) и лиц из группы контроля (здоровые доноры).
В работе использован комплекс базовых молекулярно-генетических методов исследования.
Выделение геномной ДНК производилось из лейкоцитов свежей или замороженной периферической крови с помощью стандартной фенол-хлороформной экстракции (Sambrook J. et al., 1989) или методом высаливания (Miller S.A. et al., 1988).
Анализ гена GCH-I. Амплификация всех шести экзонов гена GCH-I осуществлялась методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) на приборе фирмы "MJ Research" с наборами стандартных пар праймеров в составе реакционной смеси и при условиях ПЦР, предложенных для анализа мутаций при ДЗД (Ichinose et al., 1994). Анализ конформационного полиморфизма одноцепочечной ДНК (SSCP) экзонов гена и прямое секвенирование продуктов амплификации экзонов проводились согласно общепринятым методикам (Strautmieks S. et al., 1992; Sambrook J. et al., 1989). Рестрикционный анализ 1 экзона гена GCH-I был выполнен по стандартной технологии с использованием рестрикционного фермента Nla III.
Анализ делеции в гене DYT I был выполнен по стандартному методу. ДНК амплифицировалась с набором праймеров и при условиях ПЦР, описанных Ozelius L. et al. в 1997. Продукты амплификации анализировались в денатурирующем геле, содержащем 6% полиакриламид. Аллели с делецией были определены при электрофорезе с фрагментами стандартной последовательности ДНК-фага М13тр18. Подтверждение наличия делеции было получено при прямом секвенировании.
3. Результаты и обсуждение
3.1 Результаты исследования гена GCH-I у больных с ДЗД
Нами обследовано 47 больных и 38 клинически здоровых родственников из 12 семей с ДЗД. В 6 семьях было отмечено 3 и более случаев заболевания в нескольких поколениях; 6 случаев были спорадическими. Генеалогический анализ свидетельствует о том, что в 5
семьях заболевание характеризовалось аутосомно-доминантным типом наследования с неполной пенетрантностыо мутантного гена. В одной семье анализ родословной не дает возможность дифференцировать между аутосомно-доминантным типом наследования с неполной пенетрантностью и аутосомно-рецессивным типом (3 больных сестры).
В целом по группе, заболевание характеризовалось достаточно стереотипной клинической картиной, соответствующей классическим описаниям ДЗД (Маркова Е.Д., 1973; Segava, 1972). В 5 семьях нами наблюдался выраженный фенотипический полиморфизм (заболевание проявлялось как в виде генерализованной, локальной форм, так и в виде forme fruste). С этой точки зрения наиболее показательной является семья ДЗД 3 (рис. 1).
Рисунок 1. Схема родословные семей с ДЗД (черный цвет - генерализованная форма, серый цвет-локальная форма, штрих - forme fruste).
У 4 больных (IV-4, IV-6, IV-8, V-7) наблюдалась типичная генерализованная клиника ДЗД; у 2-х больных (III-2, IV-5) наблюдалась фокальная форма; 3 больных (III-3, IV-1, V-8) имели forme fruste.
3 л.
Во всех случаях (как семейных, так и спорадических) у больных отмечался выраженный, стойкий, многолетний положительный эффект при назначении небольших доз препаратов Ь-ДОФА.
Молекулярный анализ гена ОСН-1 был проведен у 21 больного, включая 15 случаев с семейным анамнезом, 6 - спорадических и 1 -клинически здорового члена семьи.
Скрининг-метод поиска мутаций выявил измененный паттерн миграции одноцепочечных фрагментов ДНК - продуктов амплификации тех или иных экзонов гена ССН-1 у больных в 4 семьях по сравнению с контрольной группой. У больных с выявленными мутациями было проведено прямое секвенирование смысловой и антисмысловой цепей, соответствующего участка гена ССН-1 (рис. 2). Этот анализ позволил определить наличие нуклеотидных замен в гетерозиготном состоянии, неописанных ранее у больных с ДЗД в других популяциях. Результаты мутационного анализа представлены в таблице 3.
Таблица 3. Мутации в гене GCH-I, выявленные в обследованных семьях.
Экзон Нуклеотидная замена Аминокислотная замена
1 ATG ->AAG MET102LYS
1 AÇG A AG Thr94Lys
2 TGT -> TGG Cysl41Trp
4 AGT -> ACT Serl76Thr
В семье ДЗД 4 выявленная трансверсия Т->А в экзоне 1 привела к замене Metl02Lys, результатом чего стала потеря сайта рестрикции для фермента Nla III. Рестрикционный анализ, проведенный у 2 больных членов этой семьи показал, что они являются гетерозиготными носителями данной мутации (рис. 3).
Рисунок 2. Анализ 1-го экзона гена ССН-1 в семье ДЗД 3. 1 2 3 4 5
а) ББСР-анализ:
дорожка 1 - больная У-7 (см. рис. 4); дорожка 2 - больная ¡У-4 (см. рис. 4); стрелкой указан измененный паттерн миграции.
в А Т С
й ' "....... ...............
С
т
о с т с
А ■
А '
в ' ■ А
С/А
в ' *. с • ' '' ;.
с
с . ' ' . . . .
'Г . • . . ' \ ' ' . '
с ... : "''' . в • ' - :
б) сиквенс: определение замены С
Рисунок 3. Рестрикционный анализ в семье ДЗД 4.
12 3 4
дорожка 1 —маркер; (рестрикционный фермент МаШ)
дорожка 2 — контроль; дорожки 3 и 4 — больные;
Все 4 выявленные замены нуклеотидов были расценены как патогенетически значимые мутации, а не нормальные полиморфизмы, поскольку: а) все они располагались в высоко консервативной области гена ССН-1 (кЫпоБе е1 а1., 1994); б) эти замены приводят к замене аминокислоты; в) выявленные мутации в каждой семье сегрегировали с патологическим фенотипом (включая случай облигатного носительства); г) указанные замены не были обнаружены при исследовании 20 и более контрольных хромосом.
У больных из семей ДЗД 5, ДЗД 6 и спорадических больных БЗСР-анализ не выявил изменений, по сравнению с контрольными образцами. Прямое секвенирование всей кодирующей области гена ССН-1 и области сплайсинга (как минимум 15 нуклеотидов из примыкающих к экзонам интронных последовательностей) также не выявили каких либо изменений, по сравнению с нормальным сиквенсом, что требует дальнейшего исследования.
Таким образом, молекулярно-генетический анализ выявил выраженную гетерогенность ДЗД.
К моменту начала настоящего исследования различными авторами было идентифицировано 22 различных мутации в кодирующей области гена ССН-1 (кЫпоБе е1 а1„ 1994; Ригикаша е1 а1„ 1995; Вапс1тапп е1 а1„ 1996; Веуег е1 а1., 1997; 81етЬе^ег ег а1., 1998). Все они являлись уникальными для каждой из обследованных семей. Наши результаты подтверждают это положение и, таким образом, в сопоставлении с литературными данными, позволяют говорить о том, что для аутосомно-доминантной ДЗД не характерно наличие мажорных мутаций. Выявленные нами 4 новых миссенс-мутации расположены в 1, 2, и 4 экзонах гена ОСН-1.
Интересно отметить, что нами впервые описан семейный случай аутосомно-доминантной ДЗД в еврейской семье; для популяции евреев
Ашкенази характерна высокая частота другой формы ТД - дофа-независимой (см. ниже).
Полученные нами результаты позволили расширить спектр известных клинических проявлений аутосомно-доминантной ДЗД. Нами, в одной семье (ДЗД 3), было показано, что гетерозиготная мутация в гене ССН-1 может проявляться наряду с "классическим" фенотипом, либо в виде изолированного тремора рук, либо непостоянной эквиноварусной позы стоп (рис. 1). Эти данные должны учитываться при медико-генетическом консультировании семей с дистопией и, в частности, для адекватного отбора больных, нуждающихся в мутационном скрининге гена ССН-1. Таким образом, можно заключить, что повреждения гена ССН-1 и вызываемое ими снижение активности соответствующего фермента может приводить к широкому спектру патологических состояний - от генерализованной ДЗД и ее разнообразных атипичных вариантов (при гетерозиготных мутациях), до синдрома гиперфенилаланинемии (в гомозиготном состоянии) (кГппозе е1 а1„ 1995). При этом тяжесть заболевания и развитие конкретного фенотипа определяется характером мутации, дозой мутантного гена и, в конечном счете, остаточной активностью фермента ГТФ-циклогидролазы I, играющего ключевую роль в синтезе дофамина и других катехоламинов.
До последнего времени дискутабельным оставался вопрос о пенетрантности гена ССН-1 в семьях с аутосомно-доминантной ДЗД. Традиционное представление о том, что пенетрантность гена ССН-1 составляет 35-40% (при соотношении больных женщин и мужчин 3:1) сложилось, главным образом, на основании описания обширной родословной, представленной Тч^аа^ е1 а1. в 1990 году. Однако идентификация гена ССН-1 позволила вернуться к решению этого вопроса на качественно более высоком уровне, поскольку стало возможным точное установление генетического статуса не только типичных, но и разнообразных
атипичных и "стертых" клинических вариантов болезни. В обследованных нами семьях соотношение больных и здоровых сибсов (с учетом атипичных клинических вариантов, подтвержденных молекулярно-генетическим тестированием) составило 39%, а число пропусков поколений - не более 16% от общего числа информативных мейозов (с предполагаемой передачей мутантного гена). Таким образом, можно заключить, что в обследованных нами семьях пенетрантность гена (с учетом вышеуказанных "стертых" форм) составляет выше 40%. Данный вывод подтверждается самыми последними результатами 81етЬе^ег е! а1., полученными при исследовании выборки немецких семей с ДЗД (81етЬе^ег е1 а1., 1998).
В изученной нами выборке больных, мутациями в кодирующей области гена ОСН-1 было обусловлено две трети семейных случаев ДЗД, что соответствует данным, полученным при обследовании других популяций (кЫпоБе е1 а1., 1994; Вапётапп е1 а1., 1995; Б1етЬе^ег е! а1., 1998). По нашему мнению, отсутствие изменений нуклеотидной последовательности гена ССН-I может быть объяснено одним из следующих факторов: а) наличием мутаций в некодирующей области гена (интроны, промоторная область гена); б) истинной генетической гетерогенностью ДЗД, т.е. повреждением другого гена (генов). Последняя возможность подтверждается тем, что типичный фенотип ДЗД описан в единичных семьях с аутосомно-рецессивным типом наследования и повреждением гена тирозингидроксилазы (Кпаррзко§ е1 а1., 1996). Можно предположить, что в нашей серии наблюдений заболевание в семье ДЗД 5, а также определенная часть спорадических случаев представляет собой пример аутосомно-рецессивного наследования и могут быть обусловлены повреждением гена тирозингидроксилазы. Это позволяет рекомендовать исследование активности этого фермента в качестве дополнительного биохимического скрининг-теста при обследовании семей с ДЗД.
Нами получен первый в России опыт прямой ДНК-диагностики в консультируемых семьях. Принимая во внимание отсутствие мажорных мутаций в гене GCH-1, использованная нами стратегия мутационного скрининга на основе SSCP-анализа представляется, на сегодняшний день, наиболее адекватной. В отдельных семьях с идентифицированными мутациями практическая ДНК-диагностика может быть упрощена при использовании соответствующих рестрикционных эндонуклеаз; примером такой диагностики может служить семья ДЗД 4 (см. рис. 3).
3.2 Результаты исследования гена DYTI у больных с ДНЗД
Нами обследовано 38 больных из 22 семей с ДНЗД и 47 клинически здоровых родственников. Этнический состав семей указан в таблице 2. В семейных случаях ДНЗД (в 10 из 14 семей) заболевание наблюдалось у родственников в 2-х и более поколений с прямой передачей от родителей (как мужчин, так и женщин) потомству, что подтверждает аутосомно-доминантный характер наследования. В 4 семьях заболевание наблюдалось у 2 сибсов; в виду небольшого размера семьи и неполной пенетрантности гена ДНЗД (Eldridge et al., 1970) в указанных семьях также не может быть отвергнут аутосомно-доминантный тип наследования. В 8 семьях были отмечены спорадические случаи заболевания.
У 21 больного имела место классическая генерализованная форма ДНЗД с ранним началом (дебют симптомов от 5 до 11 лет, среднее +6,7). У 17 больных заболевание проявлялось в виде различных локальных форм дистонии с началом в более позднем возрасте (от 7 до 30 лет, среднее ±15,5). В 2 случаях наблюдалась, так называемая forme fruste (легкий стато-кинетический тремор рук, заикание).
Обращает на себя внимание тот факт, что в 6 семьях у больных отмечалась сходная клиническая картина, тогда как 8 семей
характеризовались феиотипическим полиморфизмом (у одних членов семьи наблюдалась тяжелая генерализованная форма ТД, у других - локальная).
Молекулярный анализ гена DYT I был проведен у 28 больных и 10 клинически здоровых родственников: 16 больных (57,1%) имели генерализованную форму ТД; 10 больных (35,8%) - различные локальные формы; 2 больных (7,1%) имели forme fruste.
При разделении в 6% полиакриламидном геле амплифицированного участка ДНК, содержащего кодирующую область гена DYT I, в 24 из 38 случаев (21 больной и 3 клинически здоровых родственника) был выявлен более короткий фрагмент, чем у здоровых лиц из контрольной группы. Разница в длине последовательности составляла 3 нуклеотида (рис. 4).
Рнсунок 4. Мажорная делецпя GAG в гене DYT I.
1 2 3 4 5 6
а
топкая стрелка — нормальный аллель (250 п.о); толстая стрелка — мутантный аллель (247 п.о)
Прямое секвенирование кодирующей области гена DYT I подтвердило наличие мажорной del GAG.
При сопоставлении клинических и молекулярно-генетических данных были получены следующие результаты: del GAG была выявлена у 9 больных с генерализованной формой ТД(42,8%), причем, из них 5 человек представляли русскую популяцию, 1 был украинцем, 3 — евреи Ашкенази; та же делеция была обнаружена у 10 больных с фокальными формами ТД (с
поражением ног или рук) (100%), из них 7 человек были русские, 3 - евреи Ашкенази; у двух больных, имеющих forme fruste, так же было подтверждено наличие делеции (1 - русский, 1 - еврей Ашкенази). Следует отметить, что среди клинически здоровых родственников, у 3 из 10 было выявлено облигатное носительство мутации.
У 7 больных с генерализованной формой ТД не было обнаружено указанной делеции в гене DYT I. Все эти больные были нееврейского происхождения, причем 5 человек из 7 были единственными больными в семьях, а двое - имели больных родственников.
В одной из обследованных русских семей (рис. 5) было показано возникновение мутации - del GAG de novo. В указанной семье было обследовано 4 человека: пробанд (II-2) и ее дочь (III-1) имели типичную генерализованную форму ТД с началом в раннем возрасте (соответственно 11 лет и 10 лет); мать пробанда (1-1) и сестра пробанда (II-3) не имели признаков заболевания. Анализ гаплотипов, проведенный в этой семье показал, что пробанд (II-2) и ее дочь (III-1) имеют общую хромосому, исторически унаследованную от здоровой матери/бабушки (1-1). Сестра пробанда (II-3) так же унаследовала от матери эту хромосому. Здоровые индивидуумы I-] и II-3 не имели del GAG; данная делеция возникла спонтанно у пробанда и была унаследована ее дочерью (носительство делеции у пробанда и ее дочери подтверждено как при амплификации критического участка гена, так и при проведении прямого секвенирования).
Полученные нами результаты подтверждают, что del GAG в гене DYT I является основной мутацией, обусловливающей развитие данной формы торсионной дистонии, поскольку, суммарно делеция GAG была выявлена нами у 24 больных из 15 семей (68% обследованных семей).
Наиболее интересным при этом является анализ полученных результатов с точки зрения этнической принадлежности больных. Данная
Рисунок 5. Анализ гаплотипов.
11-1
111-1
2 2 2 2
2 1 2 1
2 1 2 1
3 2 3 2
20 0 20 0
2 1 2 1
1 2 1 2
12 2 12 2
2 4
2 3
2 2
3 1
20 2
2 1
1 1
12 8
Маркеры, использованные при анализе гаплотипов:
cen-D9S62a (0.44), D9S62b (0.85), D9S2158 (0.78), D9S2159 (0.67), D9S2160(0.75), D9S2161 (0.79), D9S63 (0,89), ASS (0.85)-tel
делеция вызывает развитие ДНЗД в 100% случаев семей у евреев Ашкенази, тогда как в других этнических группах она выявлена лишь в 53,3% случаев. По нашему мнению это является отражением характерного для популяции евреев Ашкенази эффекта основателя при данной форме ТД, показанного ранее при исследовании 9ц-сцепленных гаплотипов, поскольку у больных еврейского происхождения, вошедших в наше исследование, также был выявлен характерный гаплотип. (Breakefield X., Ozelius L. et al., 1992). В тоже время наличие данной мажорной мутации в нееврейских семьях свидетельствует, наиболее вероятно, о наличии повторных идентичных мутационных событий в критическом локусе, обусловленных особенностями нуклеотидной последовательности гена (Ozelius L. et al., 1998). Важным доказательством этого факта является выявленная в русской семье del GAG, возникшая de novo, что было подтверждено анализом гаплотипов. Это наблюдение имеет не только большое теоретическое, но и практическое значение, заставляя учитывать высокую вероятность мутации de novo при проведении медико-генетического консультирования. У больных славянского происхождения, не имевших изучаемой делеции в гене DYT I, клиническая картина полностью соответствовала классическому описанию ДНЗД (Fahn et al., 1985). По-видимому, это может быть обусловлено наличием других мутаций в указанном гене; нельзя исключить также истинной генетической гетерогенности ДНЗД, особенно, принимая во внимаиие существование 4 локусов наследственных форм торсионной дистонии, не чувствительных к препаратам L-ДОФА. В абсолютном большинстве случаев с подтвержденной делецией в гене DYT I имела место типичная клиническая картина ДНЗД - генерализованная или локальная (19 случаев из 24). При этом наблюдалось наличие у больных как генерализованной так и локальной формы в пределах одной родословной. Результаты нашей работы позволили расширить спектр фенотипических проявлений ДНЗД: у 2 больных - носителей делеции нами наблюдались
разнообразные атипичные варианты (forme fruste) - статокинетический тремор и заикание.
Нами впервые в России получен опыт ДНК-диагностики ДНЗД. что поднимает на качественно новый уровень медико-генетическое консультирование в отягощенных семьях. С клинической точки зрения важное значение имеет случай выявления облигатного носительства del GAG у клинически здоровой женщины 24 лет. С учетом возраста консультируемой данное наблюдение, наиболее вероятно, является примером неполной пенетрантности гена DYT I. Однако при этом принципиально меняется врачебная тактика по отношению к будущему потомству обследуемой женщины: ее детям, имеющим 50% риск унаследовать мутацию, должно быть рекомендовано проведение процедуры ДНК-тестирования (в данном случае после проведения ДНК-анализа было рекомендовано проведение пренатальпой ДНК-диагностики на соответствующих сроках беременности).
Таким образом, нами проведен первый в России молекулярно-генетический анализ гетерогенной группы ТД. Полученные результаты позволили идентифицировать молекулярную основу болезни в российских семьях с наследственными листаниями и детально изучить взаимоотношение между генотипом и фенотипом у носителей отдельных мутаций. Результаты нашей работы позволили существенно расширить спектр фенотипических проявлений дофа-зависимой и дофа-независимой форм торсионной дистопии и продемонстрировать значение молекулярной диагностики в установлении клинического диагноза данных тяжелых наследственных заболеваний человека. Полученный опыт прямой ДНК-диагностики различных форм наследственной листании создает основу для проведения адекватного медико-генетического консультирования и профилактики повторных случаев заболевания в отягощенных семьях.
ВЫВОДЫ
1. Впервые проведен молекулярно-генетический анализ наследственных форм ТД в российской популяции. Подтверждена на молекулярном уровне генетическая гетерогенность данного заболевания и обосновано его подразделение на ДЗД и ДНЗД.
2. В семьях с ДЗД проведен мутационный скрининг гена GCH-I:
а) идентифицировано 4 новых точковых мутации в гене GCII-I (Metl02Lys, Cysl41Trp, Serl76Thr, Thr94Lys); полученные результаты в сопоставлении с литературными данными позволяют сделать вывод об отсутствии мажорной мутации в изучаемом гене у больных ДЗД;
б) отсутствие изменений нуклеотидной последовательности в кодирующей области гена GCH-I в ряде обследованных семей с ДЗД свидетельствуют, наиболее вероятно, о генетической гетерогенности данной клинической формы дистонии;
в) выявление мутаций в ряде случаев с атипичной клинической картиной (forme fruste) позволило установить генетический статус данных лиц и доказать высокую пенетрантность мутантного гена.
3. В семьях с ДНЗД проведено исследование мажорной мутации - del GAG в гене DYT I:
а) данная мутация выявлена суммарно в 75% случаев ДНЗД у лиц из различных этнических групп;
б) в популяции евреев Ашкенази del GAG обусловливает 100% случаев заболевания, что может являться следствием эффекта основателя, характерного для данной этнической группы;
в) у больных славянской группы del GAG выявлена в 53,3% случаев, что свидетельствует о наличии других аллельных и неаллельных мутаций, приводящих к развитию этой формы дистонии;
г) выявление del GAG у больных из различных этнических групп подтверждает факт повторных независимых мутационных событий в критической области гена DYT I; впервые показано возникновение del GAG de novo (на примере славянской семьи).
4. Анализ клинико-генетических корреляций позволил существенно расширить спектр фенотипических проявлений ДЗД и ДНЗД. Данные заболевания могут проявляться как в виде классических генерализованных форм дистонии, так и в виде локальных дистонических синдромов и разнообразных forme fruste (постуральный тремор рук, заикание и др.). Это обстоятельство необходимо учитывать в клинической диагностике торсионно-дистонических синдромов.
5. Разработан метод прямой ДНК-диагностики ТД, что делает возможным проведение медико-генетического консультирования в конкретных отягощенных семьях (включая доклиническую ДНК-диагностику мутантного гена). Получен первый в России опыт прямой ДНК-диагностики различных
форм ТД.
СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Иллариошкин С.Н., Иванова-Смоленская И.А., Маркова Е.Д., Клюшников С.А., Карабанов А.В., Миклпна Н.И., Овчинников И.В. Подходы к лечению наследственных болезней нервной системы в свете возможностей прямой ДНК-диагностики. В сб. IV Российский национальный конгресс "Человек и лекарство": Тез. докл. М1997: 53.
2. Illarioshkin S.N., Markova E.D., Slominsky Р.А., Miklina N.I., Popova S.N., Limborska S.A., Tsuji S., Ivanova-Smolenskaya I.A. The GTP cyclohydrolase I gene in Russian families with dopa-responsive dystonia. Arch. Neurol. 1998; 55: 789-792.
3. Миклпна II.И., Маркова Е.Д., Иванова-Смоленская И.А.. Иллариошкин С.Н. Молекулярно-генетический анализ аутосомно-доминантной дофа-незавнеимой дистопии в российской популяции. В сб.: Актуальные вопросы неврологии, нейрохирургии и медицинской генетики: Материалы конференции. Уфа,1998: 146-147.
4. Markova E.D., Slominsky P.A., Miklina N.I., Limborska S.A., Ivanova-Smolenskaya I.A., Illarioshkin S.N. Clinical and molecular genetic heterogeneity of torsion dystonia. Mov. Disord. 1998; 13 (Suppl.2): 212.
5. Markova E.D., Slominsky P.A., Illarioshkin S.N., Miklina N.I., Popova S.N., Limborska S.A., Ivanova-Smolenskaya I.A. A novel mutation in the GTP-cyclohydrolase-I gene is associated with a broad range of clinical presentations in a family with autosomal dominant dopa-responsive dystonia. Eur. J. Neurol (in press).
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ГТФ — гуанозинтрифосфат
ДЗД — дофа-зависимая дистопия
ДНЗД — дофа-независимая дистопия
ДНК —дезоксирибонуклеиновая кислота
ПЦР — полимеразная цепная реакция
ТД — торсионная дистония
L-ДОФА — L-изомер диоксифенилаланина
SSCP — анализ конформациопного полиморфизма одноцепочечной ДНК (от англ. "single strand conformation polymorphism")
Типография Совета ОСТО РФ. Тир. 100 экз. Зак. 640.
- Миклина, Наталья Игоревна
- кандидата медицинских наук
- Москва, 1998
- ВАК 03.00.15
- Анализ динамических и точковых мутаций при наследственных неврологических заболеваниях
- Особенности нозологического спектра и клинических характеристик наследственных болезней нервной системы в городах Волгоград и Волжский
- Динамические свойства олигопептидов и возможные механизмы влияния конформационных флуктуаций на скорости элементарных процессов в белках
- Топологическое состояние ДНК в интерфазных ядрах и метафазных хромосомах
- Наследственные и соматические мутации как молекулярные маркеры для диагностики и лечения рака молочной железы