Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетический анализ кистозного фиброза в России

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетический анализ кистозного фиброза в России"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ

На правах рукописи

Р Г Б ОД

ПОТАПОВА Ольга Юрьевна

НОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КИСТОЗНОГО ФИБРОЗА В РОССИИ

Специальность: 03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1934

!

Работа выполнена в Лаборатории молекулярной генетики человека Отдела молекулярной и радиационной биофизики Санкт-Петербургского института ядерной физики РАН /директор -к. ф.-и. н. В.Н. Фомичов/ и в Отделе молекулярной генетики Научно-исследовательского института экспериментальной медицины РАМН /директор - академик РАМН Б. И. Ткаченко/.

Научные руководители:

доктор медицинских наук профессор Е. И. ШВАРЦ

кандидат биологических наук СТ. Н. с. О. В. ВОРОНИНА

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук профессор В. С. БАРАНОВ

доктор биологических наук профессор В.П. КОНОВ

Ведущее учреждение:

Санкт-Петербургский Технический Университет

Р8 ¿ии£<?7с<4>

199. ^г.

Запита диссертации состоится в часов на заседании Специализированного Ученого совета /К 001.23.01/ по присуждению ученой степени кандидата наук при Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины РАМН по адресу: 197376. Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, 12.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭИ РАНН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, 12.

Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного Совета

О.Г. Куликова

РЕШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Кистозный фиброз поджелудочной железы СКФ) или муковисцидоз MB) - одно из наиболее распространенных наследственных аболеваник человека. Оно наследуется по аутосомно-рецессивному ипу и встречается у людей белой расы с частотой 1/2500 юворожденных /Boat et al., 1989/. Таким образон, в Российской едерации (РФ) ежегодно рождается несколько сотен детей, ольных КФ /Капранов к др., 1992/.

КФ характеризуется тяжелыми хроническими обструктивными ораженняки легких и высокой концентрацией электролитов пота. У ольшой части больных КФ (80-85%} наблюдается серьёзное ;арушенио функции поджелудочной железы (ПХ) с ярко выраженной ieдостаточность» е§ феркентов /The Cystic Fibrosis Genetic .nalysis Consortium, 1990/.

Все больные КФ нуждаются в постоянной терапевтической очении с применением современных дорогостоящих препаратов, а акже в периодических хирургических вмешательствах, реобладагацкй контингент этих больных не достигает- 12-13 лет.

Таким образок, учитывая тяжесть заболевания и высокую тонкость постоянной фармакологической поддержки, а также оцкальные проблемы секей, имеющих детей больных КФ, следует акшэчкть, что изучение молекулярных основ этого заболевания есонненно является актуальной задачей. В настоящее время ногяе научные лаборатории кнра заняты исследованием различных спектоп К®.

В 198S г. гон КФ был картирован на 7 хромосоме C7g3l. 1 окус) /Tsui et al., 1985; Kainright et al., 1985; Knowlton et 1., 1985/. Были разработаны диагностические системы с спользованхек неравновесно- сцепленных полиморфизмов длин естрикционных фрагментов (ПДРФ). Возможность прямой иагностики КФ появилась только в 1989 г.. когда ген был локирован, х была обнаружена мажорная КФ иутадяя - далецхя в 0-к з кз о не гена трех нуклеотидов, приводящая к делетирозани» з белка остатка фенилаланина в 508 позиции < т. н. AF-508) Rommens et al., 1989; Riordan et al., 1989; Kerem et al.,

1989/.

Частота этой мутации варьирует в различных популяциях в широком диапазоне: от 22% у евреев-ашкекази до 90% в Дании /Tsui, 1992/. Частота делеции F-508 в России к началу данного исследования известна не била.

Изучение ПДРФ ДНК, а также долеции F-508 у большого числа больных КФ позволили предположить существование, как минимум, двух различных клинических форм КФ, а также наличие других, отличных: .от делеции F-508, мутаций в российской популяции. Выявление спектра повторяющихся мутаций в гене КФ для больных Российской Федерации является важной задачей как в практическом, так к в теретическок плане.

Изучение распространения мутаций, сходства и различий в строении мутантных генов различных этнических групп открывают новые возножностх исследования миграции популяций, родственных связей территориально отдаленных народов.

Практическая ценность выявления основных мутаций в гене КФ у больных Российской Федерации связана с возможностью создания специфических днагностикумов для пренатального и . раннего постнатального определения мутантного гена КФ, а также скрининговых исследований с целью идентификации носителей этих мутаций в. популяции.

Выявление мутаций в гене КФ в России и изучение корреляции между генотипом и фенотипом заболевания позволяют выбрать верную стратегию лечения. Цели и задачи исследования

Целью данного исследования являлся молекулярно- генетический анализ локуса кхстозного фиброза в российской популяции и определение спектра повторяющихся нутаций у больных с различными формами КФ.

Для этого необходимо было осуществить:

1) исследование ПДРФ ДНК, сцепленных с геном КФ у больных с различными клиническими формами заболевания;

2) разработку простого теста для идентификации делеции F-508;

3) исследование частоты делеции F-508 в российской популяции;

4) изучение частоты делеции F-508 у больных с различными

(линическими формами К4>;

П поиск дополнительных маркеров КФ, которые когуг быть юпользованы для пренатальной и ранней постнатальной 1иагностики КФ;

5) выявление спектра частых и повторяющихся мутаций в гене КФ у зольных с различными формами КФ;.

О разработку на основе полученных данных оптимальной схемы хиагностики КФ для жителей России. Положения, выносимые на защиту

1. Результаты изучения внегенных х внутригенных маркёров СФ выявляет гетерогенность этого заболевания и свидетельствуют > существовании, как минимум, двух клинических форм кистозного фиброза в популяции Российское Федерации.

2. на основе полхмеразной цепкой реакции (ПЦР) разработан <етод, позволяющий существенно упростить идентификацию коротких делений, на примере Д F-508 в- гене КФ.

3. Частота мутации AF-508 связана с клинической формой КФ х существенно отличается у больных с тяжелой смешанной формой »аболевакхя (РХ-КФ) и у пациентов с «мягким» протеканием 5олезни (PS-КФ). В группе больных РХ-КФ 61% хромосом несет деяецню F-508. что меньше, чем в странах Северной Европы х Америки х близко к частоте этой мутации в южно-Европейском регионе. Частота AF-508 в группе больных PS-КФ составляет 1БХ.

4. Результаты скрининга 1000 хромосом новорожденных г. Санкт-Петербурга на наличие делецки Р-508 позволяют рассчитать частоту гетерозиготного носхтельства в популяции: каждый 62-ой C8/S00 новорожденных) является носителем этой мутации. При частоте делецик F-508 у больных КФ равной 50Х, расчетная частота рождения больных детей со смешанной формой КФ в Северо-Западном регионе Россия составляет 1/3800.

5. Сравнение частот полиморфных аллелей тетрануклеотхдного повтора (GATT) в 6а хятроне КФ гена у здоровых новорожденных х у больных КФ позволяет сделать вывод о сцеплении 6-копийного аллеля с более чек одной КФ кутацхей, что дает возможность использовать (GATT)п полиморфизм как дополнительный КФ маркер.

6. выявлены спектры повторяющихся кутацхй в гене КФ,

отличных от ЛР-508, характерные для российских больных с различными клиническими формами, кистозного фиброза: Н1303К (3,6%), Я1282Х (2,ЭХ). Б542Х (1.4%) - для Р1-КФ группы и 1*334« (4.87.), 38 4 9+105сЬС~>Т (11,9%) - для РЗ-КФ группы. Определение этих мутаций позволяет увеличить долю идентифицированных аллелей с 62, 1% до 72, ЭХ у Р1-КФ больных и с 16, 7У. до 33,3% у пациентов с РЗ-КФ по сраанэикю с определением только делецик Г-508.

7. Аналкз сцепления мутаций в гена КФ с внутригениым тетракукдеотяднын повтором (СА'ГТ)п свидетельствует о неравновесном ецшшеник 8-копийкого аллеля с мутациями АГ-508, Ы1303К, С542Х, а 7-кааяйкого аялеяя - с нутацыякк К12ПЙХ, И334И, 3849+10кЬС->5.', 1677с)о1ТЛ у больных Северо-Западного региона России и г. Москвы.

8. Сравнение данных по сцеплению КФ- мутаций с (вАТТ)п аллелями у больных РФ и пациентов ка различных стран Западной Европы позволяет сделать вывод о возможности иезавхеиного возникновения мутации Е334Н в России. лябс о событии внутригенной рекомбинация, прязедшего к наличии хрохосок с разгзьши гвплэтипамя, носуиинн К334И.

3. Предлагается стратегия поиска 1СФ мутаций, основанная на

предварительном скрининге ДКК большее на (САТГ)„ ~ кояккорфизк

л

с поаявдутщш прогнозом вероятности обнаружения иутацмй, сцепленных с различными аллелямя. Эффективность формхров&нзея нультипрайнерных систем для одновременного тестирования нескольких мутаций ножот быть /Существенно, повышена при хх комплектации с учётом сцепления мутаций с аллелями (САТТ)п.

Научная новизна работы

В процессе выполнения данного исследования впервые для популяции больных КФ в Российской Федерации была показана генетическая гетерогенность Р1 и РБ форм заболевания на основе анализа шести ПДРФ и исследования частоты мажорной кутацкк ДК-508 /Уогопд.па еЪ а1., 1990/.

Идентифицированы повторяющиеся мутации, приводящие к развитию РХ и РБ форм КФ в популяции России.

На основе полимеразной цепной реакции разработаны тесты для определения ЛГ-508 с использованием различных источников ДНК.

воден мерный п России скрининг делении Р-508, по тэтам которого рассчитана ожидаемая частота рождения х детей в данной регионе.

рвые для российской популяции проанализированы частоты ее распространенных КФ нутаций. Обнаружено, что нутация возникла в России независимо от мутационного события в ой Европе, либо имело несто событие внутригенной инации. приведшее с - существованию нутации К334И на онах с разныни гаплотипаки.

основе исследования внутригенного полиморфного повтора и различных КФ мутаций предложена оптимальная схема . повреждений в гене КФ у больных. :о-практическое значение полученных результатов |ретическнй интерес представляют: поникание гетерогенной 3=1 заболевания в российской популяции; спецификация ¡й, приводящих к развитию Р5 формы КФ; открытие возможного !ного возникновения Ю34И на территории России (либо ¡о события внутригенной рекомбинация) и результаты (опаиня внутригенного полиморфного повтора (САТТ)п в гене приводящие к гипотезе о возможном сцеплении гексакерного г с абортивными формами КФ.

1кт!счаская ценность заключается в: разработке подходов к асткке РБ я РХ форм КФ; методах анализа мутаций (особенно злецнн 3?-503 с использованием различных ксточнккоз ДНК); жениой схеме поиска нутаций в гене СРШ с предварительным юи ДР-508 н полиморфизма (САТТ)П. Эти методика успешно *яззтся для верификации диагноза в совместных исследованиях 1И Пульмонологии КЗ РФ и Отделением КВ Всероссийской эй больницы. 5ацня работы

адставлвнные к защите результаты были доложены на народных конференциях: 5-ой и 8-ой Северо-Американских реициях по КФ (Арлингтон, США, 1980г. ; Орландо, США, .), 17-ой х 12-ой Европейских КФ конференциях (Копенгаген. , 1992г. ; Париж, Франция, 1994г.), 26-м ежегодном съезде ейского Общества Генетики Человека (Париж, Франция,

1994г.); на Всесоюзных (Всероссийских) конференциях «Генок человека-91» (Москва) и «Геком человека-93» (Москва). на Конференции ГНТПР «Приоритетные направления генетики» (Москва,

1993) и на Национальном Пульмонологическом Конгрессе (Москва,

1994). По теме диссертации опубликовано 4 статьи и 8 тезисов. Структура диссертации

Диссертация изложена на 120 страницах к состоит из введения, обзора литературы. материалов и методов исследования, результатов, их обсуждения и выводов. Работа иллюстрирована 19 рисунками и содержит 16 таблиц. Список литературы вклзочает 9 работ на руссксм и 215 - на английском языках.

МАТЕРИАЛЫ К МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Для изучения внегенных и внутрнгенных маркеров гена КФ и

идентификации мутаций у пациентов с различными, формами

ккстозного фиброза поджелудочной железы выделяли ДНК из крови

по методу Kunkel et al. (1977). Для скринхнговых исследований

применяли метод выделения ДНК «высаливанием» белков /Hiller et

al-, 1988; Signer et al., 1S88/. Полимеразную цепную реакцию

(ПЦР) проводили как описано Mullis & Faloona (1987).

Ферментативный гидролиз для определения ПДРФ ДНК я ■

идентификации КФ мутаций проводили как описано Sambrook et al.

(1989). С целью анализа изменений первичной структуры ДНК

амплифнцнрованный фрагмент клонировали в плазмиду pUCl9 как

описано Sambrook et al. с последующим анализом клонов методом

32

гибридизации с кинированнын г Р-АТФ праймером, использованным для ПЦР. Секвенирование отобранных клонов проводили по методу Sanger (1977), используя кит фирмы Pharmacia с Т7-секвеназой.

Образцы крови взрослых больных с «мягкой» PS формой КФ и детей со смешанной формой заболевания для этого исследования были предоставлены Отделением муковисцидоза ВНИИП МЗ РФ (профессор д. м. н. Т.Е. Гембицкая, г. Санкт-Петербург); банк ДНК больных детей с тяжелой PI формой КФ - Российским научным медико-генетическин центром (д.м.н. Н. И. Капранов).

/

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Изучение ПДРФ ДНК локуса гена КФ

При использовании сцепленного ПДРФ для диагностики заболевания важна частота гетерозиготного носительства полинорфных аллелей в популяции. Ранее были отмечены высокая частота встречаемости в общей популяции аллелей, сцепленных с КФ. в таких полиморфных системах, как XV2c/TaqI, roetH/MspI, Mp6d9/Mspl. J3.ll/Pstl и низкая - в системах KM19/PstI и Cs7/Hhal /Воронина и др.. 1990; Нващекко Т.Э., 1992/.

При исследовании ПДРФ ДНК больных КФ с различными клиническими проявлениями нами было показано вдинтичное распределение полиморфных аллелей К1/К2, Х1/Х2. К1/М2. С1/С2 э группе пациентов с PI формой КФ а сравнении с результатами исследований популяций стран западной Европы. Аллели Ml п J2 оказались также не столь высоко информативны, как и для других популяций (таблица 1).

Мутантныо хромосомы, соответствующие PI форме заболевания, в российской популяции оказались сцеплены с гаплотипом K2/X1/Ö2/C2, как и в других европейских странах. Эти данныэ свидетельству»; о наличии в нашей популяции такой же мажорной КФ нутации, приводящей к развитию PI формы КФ, что к в других этнических группах.

Ряд пациентов были выделены s PS подгруппу. Среди этих пациентов накх впервые было отпечено большое количество гетерсэягот по сайтам ПДРФ. За исключением полиморфизма в локусе КЮ.Э, распределение частот полинорфных аллелей в этой группе значительно отличалось от данных литературы. Аллель К2 и в этой группе был высоко неравновесно сцеплен с нутантныкн хромосомами. Частоты аллелей Х2 и d2 практически совпадали с данными, полученными при изучении проб ДНК доноров (таблица 1).

Отметим, что частота аллелей С1/С2 у больных PS-КФ и у доноров была почти одинаковой в нашем исследования, тогда как у больных PS-КФ кз европейских стран распределение было прямо противоположным: аллель С2 был четко сцеплен с PS-КФ хромосомами (таблица 1). Вероятно, этот результат можно

8 ■■':t'

Таблица 1

Распределение полиморфных аллелей у пациентов с КФ

Проба Рестр. Аллель Популяция PI-CF PS-CF

фермент (*) (**) (***) (**> (***) <*

КМ19 PstI K1 0.782 0.74 0.26 0.15 0.56 0.

K2 0.22 0.26 0.74 0.85 0.44 0.

XV2C Taql XI 0.48l 0.49 0.79 0.84 0.44 0.

X2 0.52 0.51 0.21 0.16 0.56 0.

J3.ll PstI J1 0.412 0.38 0.41 0.33 0.29 0.

J2 0.59 0.62 0.59. 0.67 0.71 0.

MetH Mi.pl M.X 0.531 0.57 ., 0.60 0,58 0.67. 0-

¿12 0.47 0.43 0.40 , 0.42 0.33 0.

мреаэ HspI CLl 0.552 0.07 0.14 0,50.. 0.

d2 0.45 0.93 0.S6 0.50 0.

CS.7 Hhal C1 0.652 0.68 0.22 0.14 0.62 0.

C2 0.35 0.32 0.78 0.86 0.38 0.

Í *) - данные Всроняиок и др., 1990; Кващояко Т.3., IS32 (*») - дйшив Devoto et al., 1989; Ferrari et.al., 1 Dinwiddie. et al., 19S3

(***) г- данные, полученные в нааои исследовании

рассматривать с. двух сторон: либо как полное огсутстви информативности при применении полиморфной систекы Cs7/Hhal PS-КФ в российской популяции, лкбо как наличие сцеплени определенных PS-КФ мутаций в нашей популяции с аллелем С1 тогда как в других старанах они сцеплены с аллелем С2.

Для систекы. J3.ll/Pstl нами также было . отмечен специфическое распределение аллелей, противоположное описаннои в литературе: 71% хромосон в PS-КФ группе соответствовал алле; J2. Учитывая, что частоты аллелей J2 в популяциях практичес» совпадают, можно предположить наличие специфичных КФ кутаций приводящих к развитию PS-КФ в нашей стране, сцепленных аллелем J2, тогда как в других этнических группах имеет мест сцепление с аллелем J1.

Обнаруженная специфика в распределении аллелей у обследованных больных с различными клиническими проявлениями Кф кожет быть объяснена наличием особенностей строения локуса гена К.Ф в нашей популяции, специфическими мутациями, приводящими к развитию «мягких», стёртых форм КФ и, возможно, этнической неоднородностью выборки.

Для диагностики в первую очередь рекомендуется использовать полинорфизм KM19/PstI, так как он сцеплен с- обеими формами заболевания. Применение систем XV2c/TaqI, Mp6d9/Mspl, Cs7/Hhal наиболее полезно при верификации диагноза PI-КФ, тогда как J3.il/Pstl н metH/MspI наиболее информативны для PS формы.

2. Анализ делении F-508

Для исследования делеции F-508 нами были использованы как известные варианты ПЦР-анализа, так и разработанный нами тест, позволяющий существенно сократить затраты времени и реактивов. Применение сконструированных нами прайкеров позволило проводить АС-ПЦР для обоих аллелей (с деяецией и нормального) в одной пробирке. Наличие хотя бы одного кз продуктов реакции являлось внутренним контролем, а увеличение разницы в длине продуктов нормального и мутантного аллелей позволяло анализировать продукты в стандартном ПААГ за меньшее время.

праймер для нормального аллеля (1)

l621-ATT.ATG.ССТ.GGC.ACC.ATT.АЛА.GAA.AAT.ATC.A02.ZCT.GGT.GTT-1663

прайкер для аллеля с AF-508 (2) Принцип этого метода - проведение в одной пробирке АС-ГЩР с увеличением разницы длины продуктов за счет наращивания S'-конца- прайкера, соответствующего аллеяю без мутации, - может быть применен для определения любых коротких делеций.

Деиецяк F-5Q3 встретилась в 61Я (91/1S0) хромосом пациентов с РХ-КФ х только в 16У. (7/44) хромосом больных PS-ХФ (таблица 2). Это сравнимо с частотой &F-508 в славянских и южно-европейских странах: 39Х в Югославии, 47% в Польше, 54% в Греции, 58% в Болгарии /данные CF Консорциума/.

. . . Таблица 2.

Распределение делеции F-5.08 • у больных с различными формами кистозного фиброза

Выборка Форма КФ хромосомы Генотип

КФ

всего AF—508 (%) A/A (%) (*> -/- ■ W

Москва. t>I 120 77 (64) 27 (45) 23 (38) 10 (17)

PS 2 0 / 1

Санкт- РХ 30 14 (47) 2 (13) 10 (67) 3 . (20)

Петербург PS 42 7 (17) 0 7 (33) 14 (67)

всего PI 150 91 (61) 29 (39) 33 (44) 13 (17)

PS 44 7 (16) 0 7 (32) 15 (68)

Распределение генотипов в группах пациентов с различными формами КФ также неодинаково: в РХ-группе 39JC пациентов былн гомозиготами по делеции F-508, тогда как в PS-группе их' не встретилось вообще. Количество гетерозкгот было сравнимо. Эти данныо свидетельствуют об ассоциации делеции F-508 с тяжелой формой КФ в российской популяции, что'совпадает с результатами исследований других популяций /Tsui, 1991/. Отчетливое различие, выявленное < в ! частоте делецин F-508 в возрастных группах, подтверждает предположение о связи делеции F-508 , с тяжелым течением КФ: большинство гомозиготных пациентов с генотипом А/Л умирает в детском возрасте.

В результате скрининга - 1000 хромосом новорожденных г. Санкт-Петербурга на наличие делеции F-508 было показано, что частота гетерозиготного носительства этой мутации составляет 1:62 (8/500 человек). При средней частоте делеции F-508 у пациентов с КФ 50Х частота гетерозиготного носительства КФ в популяции Северо-Западного региона России равна 1:31, что несколько ниже, чем в странах Западной Европы (1:25). Т.о.. частота рождения больных детей составит 1/3800 новорожденных. Для популяции РФ такой результат получен впервые.

сследование полиморфного повтора (GATT)

поисках информативных маркеров. позволяющих повысить тивность и упростить диагностику КФ на молекулярном-е, мы провели исследование внутригенного полиморфного ра (GATT) , расположенного в 6А интроне гена CFTR arini et al., 1991; Chehab et al.# 1991/.

отличие от других полиморфных повторов, найденных в ной последовательности гена КФ и имеющих от 7 до 25 ей, повтор GATT существует, в основном, в виде 6 и 7 копий ли с 5 и 8 повторами, найдены в единичных случаях) /ibid, гла к др. , 1992/. Кроме того, было обнаружено, что ная КФ нутация - ¿F-508 - абсолютно сцеплена с гексамернмм ром . Таким образок, атот полиморфизм представлял особый ее.

стота аллелей (GATT), и (GATT)- в популяции (таблица 3) .

о /

ически совпадала с аллельнын распределением в других яциях /Chehab et al., 1991/. однако количество гетерозягот явно превышало расчетную-величину, равную О. 41 по закону -Вайнберга, тогда как число гомозигот '6/6 было порционально мало (3,5Х против ожидаемых 11,5%). гичлые результаты были получены позже и в других аторяях /Агбангла и др., 1992/. Такое неравновесие тся до конца не объясненный. Ны предполагаем наличие ров, нарушающих условия выполнения закона Харди-Вайиборга исследованной нами популяции, и возможность сцепления копийного аллеля с абортивными формами КФ.

Таблица 3.

Полиморфизн (GATT) повтора в гене CFTR

(GATT) генотип

6/6_6/7_7/7

па N" N % N. % N %

* N N %

172 6 3.5

73 39 53. 5

21 1 5

Частота аллелей 6 7

106 ' 61.б 60 34.9 28 39.5 6 8 11 52 9 43

0.34 0.66 0.73 0.27 0.31 0.69

*) N - число исследованных образцов

Таблица

Ассоциация (GATT)6 аллеля с AF-508 у больных с различными формами КФ

(GATT) генотип

F-508 генотип Форма КФ * N б/б 6/7 7/7

N i M % N %

Д/Д РХ 29 29 100 0 0

PS 0

Д/- PI 30 9 30 21 70 0

PS 6 1 17 S 83 0

-/" PI 14 2 14 7 50 5 3

PS 15 0 7 47 8 5

всего PI 73 40 55 28 38 5

PS 21 9 5 12 43 8 3

контроль 172 6 3,5 105 61 61 36

*} H — число обследованных образцов; Д - наличие делецхи F-

<-»- отсутствие делеции F-508

Накк была показана 100X ассоциация делеции F-508 с аллелв (GATT)е в российской популяции аналогично результатам по другя странам. Более интересным кажется сцепление этого аллеля другими КФ мутациями в исследованной группе больных, которое м предположила на основе обнаруженного нами факта многократног увеличения числа гомозигот 6/6 среди пациентов с РХ-КФ, и имеющих AF-508. которых было найдено в четыре раза больше, че в контрольной группе (14% к 3,5%, соответственно) (таблица 4).

4. Исследование КФ нутаций в российской популяции

Кроне исследования мажорной КФ мутации AF-508, нами бы проведен анализ 16 распространенных КФ нутаций (G551D, R553X S549N, G542X, R560T, N1303K, 1717-1G—>А, W1282X, 621+1G—>Т 3849+1ОкЪС—>Т, R117H, R1162X, 3659delC, Д1507, R334W, R347P) для определения которых были использованы различные вариант ПЦР-анализа. Эта часть диссертационной работы была выполнен при содействии Department of Medical Genetics, University о

California at San Diego, USA (Dr.' Tiitf Cahill) и группы генной инженерии интерлейкинов Института Биоорганической Химии РАН, г. Москва ( профессор, д. х. н. Ю.- À': Берлин).

Среди 21 пациентов с PS-КФ и 70 пациентов с PÏ-КФ Кроме делеции F-508 было идентифицировано наличие шести КФ мутаций: 3849+10)сЬС—>Т (6 хромосом), N1303K (5). W1282X (4). R334W (4), G542X (2), 1677delTA (1).

Все пациенты, у которых в гетерозиготном состоянии были идентифицированы КФ мутации, описанные в литературе как «тяжелые» и ассоциированные с PI формой КФ : N1303K /Osborne et al., 1991/, W1282X /Vidaud et al., 1991; Shoshani et al., 1992/, G542X /Kerem et al., 1990/, имели выраженную недостаточность поджелудочной железы.

Нутация N1303K, частота которой составила в PI группе 3,6% (3 хромосом), оказалась наиболее распространенной. В странах Западной Европы и Америки частота N1303K не превышает 2%. Трое кз пяти пациентов, у которых была обнаружена эта мутация, умерли в возрасте до 4 лет ( из них один являлся компаундом H13Q3K/AF—508). Двое больных с генотипом AF-508/N1303K (2 и 4 года) имеют тяжелую смешанную форму КФ.

Нутация W1283X была найдена у четверых пациентов (2,9% среди РХ хромосом), причем двое яз•них являлись детькк от смешанного брака русс. /евр. Так как в Израилз частота этой мутации в КФ хромосонах достигает 60% /Abeliovich et al., 1992/, этот результат не был неожиданным. Как больные с компаундом AF-508/W1282X (2чел. ), так и пациенты, у которых вторую нутацию идентифицировать не удалось (2 чел.), имели тяжелый Р1-КФ.

У двоих пациентов в компаунде с делецией F-508 была обнаружена мутация G542X. ES частота среди хромосон Р1-КФ больных составила 1,4%. Оба пациента в возрасте 2 года имели тяжелую смешанную форму заболевания.

В общей сложности в PI группе было верифицировано 73% аллелей, из которых 62% составили хромосомы, несущие AF-508 (таблица S). Популяция Российской Федерации является существенно неоднородной, что, очевидно, затрудняет поиск повторяющихся КФ нутаций. Тем не менее, в нашем исследовании

Таблица

Частоты идентифицированных КФ нутаций в Р1 и РБ груг

Название Экзон Р1 форма КФ Рв форма

мутации N % всего % в не ДГ N % всего

ДР-508 10 87 62.1 7 16.7

Ы1303К 21 5 3.6 9.6 0

И1282Х 20 4 2.9 7.7 0

1*33 4И 7 2 1.4 3.8 2 4.8

С542Х 11 2 1.4 3.8 0

3849+ЮкЬ 19 1 0. 7 1.8 5 11. 9

С—>Т инт.

1677йе1ТА 10 1 0.7 1.9 0

идангифиц.чр. хрок. 102 72. Е 28.3 14 зз.:

ненденткфхц. хром. 38 27.. 1 73. 1 28 66.'

ВСЕГО

не АР-508 КФ хром. 53 37. 9 35 83.3

КФ хромасои 140 100.0 42 100.

только 5' 65С дяцн&кгов кз РХ группы («/70 чел.) не было найде; ик о дао'А ив обсдадоаакнкх ЕФ куг&ций к 3.7 аллелей ссталн кэкдентифвдяроз&ыших в кокпаундах с оиределаиньдак иутацкямя.

В групп® пациентов с Р5-КФ наблюдалась иная картина: часто аллелеЯ, несущих делецию Р-508, составила здесь только 16,7 таким образон, большая часть КФ хромосом оставала неидектифицкрованной. Впервые для российской популяции на были найдены повторяющиеся КФ мутации, приводящие к развитию формы КФ: 3849+Ю1сЬС—>Т и К334И. определение которых позволи увеличить вдвое вероятность идентификации КФ хромосомы в эт группе (до 33%).

Частота нутацик 3849+ЮкЬС—>Т в хромосонах пациентов с формой КФ оказалась сравнимой с частотой делеции К-508: о была найдена в гетерозиготном состоянии у пяти больных

rioro - в компаунде с AF-508). Её частота в PS группе :тавила 11,9%.

Мутацию 3849+lOkbC—>Т относят к числу «мягких» /Highsraith al., 1991/. что предполагает более легкое течение болезни и )должительный срок жизни /Augarten efc al., 1993/. Однако, обследованные нами пациенты демонстрировали иное 1ение заболевания: трое больных с генотипом 3349+lokbC—>Т/? :рли в возрасте 19-20 лет, тогда как пациенты, являющиеся шаундом 3849+lOkbC—>T/AF-508, живы и заболевание протекает гах более благоприятно. Клиническая картина у гетерозиготных ¡нентов с неидентифицированной КФ нутацией во втором аллеле >актернзовалась более поздним начален заболевания, :утствием поражения ПЯ, хронической инфнцироваккостью tudojaonas aeruginosa (синегнойной палочкой) и тяжелым •ажениек дыхательных путей.

Для хромосом, несущих мутацию 3849+ЮкЬС—>Т. накя был газан гаплотип «1-1-2-1-2» в полиморфных системах XM19/PstI -Я/Mspl - J3.ll/PstX - Cs.7/Hhal - (GATT)n, где для ПДРФ «1» отсутствие сайта- рестрикции, <2» - - наличие такового; для-" ,ТТ)п «1» - шесть копий, «2» - семь копий. Такям образок, эта ацкя расположена на хромосоме, являющейся аялелек J3 и С1, I подтверждает сцеплонке атяйс аллелей с распространэгтыни КФ ацяямя, призодящани к PS-КФ в российской популяция. Вторая кутация, идентифицированная в PS группе - R334W. В яедованиоК нами группе пациентов с PS-КФ частота нутации 4W составила 4,3% (таблица 5). Мутация H334W относится к гкин» КФ нутацияк /Kristidis et al., 1991; Tsui, 1992/, ако нами она была идентифицирована у больных с интересной кацией клиники. Среди четверых пациентов, являющихся паундани R334W/AF-S08, двое детей (2 и 4 года) имели шанную форму КФ, тогда как двое подростков, имевших в стве тяжелый КФ, унерли в возрасте 17 лет после периода тельной стабилизации с последующей эскалацией лёгочных явлений. Обе пациентки не имели никаких признаков поражения к печени, однако были инфицированы Ps. aeruginosa, инели окне хлориды пота и дефицит веса.

Для хромосом, несущих мутацию R3 34W. был показан гаплотип «1-2-2-2» в полиморфных систенах KM19/PstI - metH/MspI -J3.11/PstI - (GATT) . Т.о., аллель J2 сцеплен и со второй идентифицированной PS-КФ мутацией.

В отличие от результатов, полученных для PI группы, в PS группе только для троих пациентов (14%) удалось идентифицировать КФ мутации в обоих аллелях: двое имели генотип R334W/&F—508 И один 3849+lOkbC—>T/AF-508. У ВОСЬМИ больных была идентифицирована одна КФ хромосома (по четыре AF-508 к 3849+lOkbC—>Т аллеля). У половины пациентов (10/21 чел.) не удалось идентифицировать ни одной из исследованных мутаций. Этот результат подтверждает- наличие специфического спектра КФ мутаций, приводящих-к развитию PS-КФ.

5. Ассоциация КФ мутаций с (GATT) аллелями

Так как одна из основных задач данного исследования состояла в поясках подходов к обнаружению нутаций в гене КФ, отличных от делецки F-508, я создании схемы аффективной генетической диагностики, нами была изучена аллельная ассоциация мутантных хромосом с полиморфизмом (GATT) в 6а нитроне гена КФ. Другие полиморфные повторы имеют много аллелей. вследствие чего затруднительны для анализа.

Нами был проведен анализ аллельного сцепления найденных КФ мутаций с количеством повторов (GATT). Выло обнаружено, что всо мутации сцеплены с определенным аялелек.

Важно отметить сцепление мутации R334H с аллалем (GATT)7 в обследованной нами группе больных КФ, тогда как при исследовании германской популяции было найдено, что обе хроносоны с K334W несли (GATT)6 /Dork et al., 1992/. На основе этого результата мы предполагаем возможность события внутригенной рекомбинации или независимое возникновение мутации R334W в различных этнических группах на хромосомах с разными гаплотипами.

Вследствие чёткого аллельного сцепления, все КФ мутации можно разделить на две группы по ассоциация с аллелями (GATT)n. Мутации AF-S08, G542X, N1303K, 2143delT в российской популяции абсолютно сцеплены с шести-копийнын аллелей, тогда как мутации

82Х, R334K, 3849+lOkb С—>T, 1677delTA, S119GX, 2184insA сдятся на хромосомах с семью повторами.' Таким образон, при пизе КФ мутаций в ДНК больного кистозмдм фиброзом будет звычайно полезным предварительное определение' (GATT) отипа. Предложенная схема. скрининга КФ мутаций позволяет вкомить яроня н средства путём ограничения числа мутаций, вделенаа которых необходимо пря конкретном сочетании этипов долецкя F-508 и повтора (GATT).

генотип ДК-508

генотип

в/7 &/д д/-- -/-

'. / о

ïf/7 7/7

2

3 2,2

* 3

*) такое сочетание гекоткков Ме обнаружено

:лучай 1. Генотип Д/Д. Д ал ънедшге ясследовйнкк ко гробу:этея.

У пациента пряеутс-гзует X® хроносска, па гнгозмцая' «ян К-508 я несуяа* шесть йд-гт позгсрсс. Трпбуэясл далолно мутацаЯ, • ассспи^фоеаишх с (ОАТХ) 3. 7

¡сита присутствует ае ДР-503 КФ хроиосоиа с (бП^-Г) 7- Надо |делять мутации, сцеплашшо с (вАТТ) 7-

родя обсяадоаан8аос нами проб ДНК, полученных от йА пациента >, 29 гокозигот А/А (32%) откосились к случаю <1>. Для 28 I (29%) требовалась проверка мутаций, ассоциированных с Т>5 - случай «2». относящийся к сочетанию генотипов /6/6 (10 чоловек), -/-//5/6 (2 человека) я -/-//6/7 (14 век) (таблица 6). Для 50 проб (5550 нужно было исследовать чие мутаций, сцепленных с сень» повторами (случай 3) - так они имели сочетание генотипов Д/-//6/7 (26 человека), /6/7 (14 человек) и -/-//7/7 (10 человек). Таким образом, ко для 14 пациентов (13%) с генотипани -/-//6/7 требовался из КФ мутаций из обеих групп.

18 ВЫВОДЫ

1. Результаты изучения вяегенных и внутркгенных маркёров КФ выявляют гетерогенность этого' заболевания к свидетельствуют о существовании, как кинхкух. двух клинических форм ккстозного фиброза в популяции Российской Федерации.

2. На основе полхкеразной цепной реакции (ПНР) разработан простой метод, позволяющий существенно упростить идентификацию короткие делеций, на примере делеции F-508 в гене КФ.

3. Частота мутации AF-508 связана с клинической формой КФ х существенно отличается у больных с тяжелой смешанной формой заболевания (PI-КФ) х. у пациентов с «мягким» протеканием болезни (PS-КФ). В группе PI-КФ больных 61Х хромосом несет делеци» F-508, что ниже, чек в странах Северной Европы х Америки х близко к частотам делецхх F-508 в Южно-Европейском регионе. Частота этой мутации в группе PS-КФ больных составила 16%.

4. Результаты скрининга 1000 хромосом новорожденных г. Санкт-Петербурга на наличие делецхх F-508 позволяют рассчитать частоту гетерозхготного носительства в популяции: каждый 62-ой (8/500 новорожденных) является носхтелен этой нутации. Частота гетерозхготного носктельства КФ составляет, такхк образок. 1:31 при частоте делецхх F-508 у больных КФ 50%. Расчётная частота рождения больных детей со смешанной формой КФ в Северо-Западном регионе Россхх 1/3800 новорожденных.

5. Сравнение частот полиморфных аллелей тетрануклеотхдного повтора (GATT) п в ба хнтроне КФ гена у здоровых новорожденных х у больных КФ позволяет сделать вывод о сцеплении 6-копийного аллеля с более чек одной КФ мутацией, что дает возможность использовать (GATT)n полхкорфхзн как дополнительный КФ маркер.

6. Выявлены спектры повторявщххся мутаций в гене КФ. отличных от AF-508, характерные для россхйскхх больных с различными клиническини формами кхстозного фиброза: Н1303К (3.6%). W1282X (2.9%). G542X (1.4%) - для РХ-КФ группы X R334W (4,8%). 3849+10кЬС->Т (11.9%) - для PS-КФ группы. Определенхе этих мутаций позволяет увеличить долю идентифицированных аллелей с 62% до 73% у PI-КФ больных и с 17% до 33% у PS-КФ

«ентов по сравнению с определением только делении F-508. т. Анализ сцепления нутаций в гене КФ с внутри'генным зануклеотидным повтором ( GATT) свидетельствует об'абсолютно 1Вновеснон сцеплении 6-копийного аллеля с мутациями AF-508, • ЗЗК, G542X, а 7-копийного аллеля - с нутациями W1282X, 1W, 3849+1OkbC—>T, l677delTA у больных Северо-Западного ■ »она России и г. Москвы.

}. Сравнение данных по сцеплению КФ нутаций с ( GATT) элями у больных РФ и пациентов из различных стран Западной ты позволяет сделать вывод о возможности независимого зикновения мутации R334W■ в России. либо о событии григенной рекомбинации, приведшего к наличию хрокосон с алми гаплотипами, несущими R334W.

Предлагается стратегия поиска КФ мутаций, основанная на хварктельиом скрининге ДНК больных на (GATT)n - полиморфизм последующим прогнозом вероятности обнаружения мутаций, шейных с различными аллелями. Эффективность формирования »типраймерных систем для одновременного тестирования1 солькях мутаций может быть существенно повышена при их лектацхи с учётом сцепления мутаций с аллелями (GATT)n-

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕНЕ ДИССЕРТАЦИИ: Voronina О., Gaitslchoki V., Schwartz Е., Fotapova О., iltskaya Т. Genetic geterogeneity of clinical forns .of ;ic fybrosis. //Pediatric Pulmonology, 1990, sup.5, 202. . 0.В. Воронина, В. С. Гайцхоки. Е. И. Шварц. О.Ю. Потапова, Берлин, О. В. Плуталов, Т. Е. Генбицкая. Полимеразная цепная сция в анализе делецих F-508 при кистозном юзе.//Бхоорганхческая химия, 19S0. т.16. 1430-1431.

Воронина о.В.. Гайцхоки В.С., Потапова О. Ю., Шварц Е. И., >хцкая Т.Е.. Фридланд А. К. Исследование делецих F-508 в гене >вхсцхдоз& модифицированным методом аллель-специфического Ыхрованхя. //Тезисы Второй Всесоюзной конференции «Геном )века-91», Москва, 1991, 102-103. Voronina О.V., Gaitskhoki V.S., Potapova O.Yu., Schwartz A simple test for the detection of the F-508 cystic

fibrosis mutation.//Biochemical Medicine and Metabolic Biology, 1991, V.46, 271-273.

5. Гакцхоки B.C.. Потапова 0. Ю. , Воронина 0.В.. Берлин Ю.А. , Шварц Е.И. Ассоциация тетрануклеотидного повтора (ГАТТ)п с мутациями в гене нуковисцидоза. //Тезисы Третьей конференции «Генок человека-93», Москва, 1993, 70.

6. Потапова О. U., Кирюхина JI. В., Шварц Е. И. Скрининг делеции F-508 и её ассоциация с повтором (ГАТТ)Л в гене CFTR среди новорожденных г. С-Петербурга. //Тезисы Третьей конференции «Генок человека-93», Москва, 1993, 97.

7. Gaitskhoki V.S., Voronina O.V., Potapova o.Yu., Kiryukhina L.V., Khafizova Z.A., Petrova N.V., Kapranov N.I., Gembitskaya Т.Е., Schwartz E.I. Linkage disequilibrium between cystic fibrosis mutations and polymorphic 4-bp repeat within CFTF gene.//Biochemical Medicine and Metabolic Biology, 1993, v.50, 186-189.

8. Воронина о.В.. Потапова о. Ю., ГаЯцхоки в.С., Богачева Е. В.. Шварц Е.К.. Берлин Ю. А.. Гембхцкая Т.Е., Петрова Н. В., Капранов Н.К. идентификация нутаций в гене КФ. // Тезись конференция ГНТПР «Приоритетные направления генетики», Косква. 1S93, 108.

9. Воронина О.В.. Потапова О. Ю., Гайцхокк В. С., Богачовг Е.В.. Шварц Е.К.. Берлин Ю. А., Гекбицкая Т.Е.. Петрова Н. В.. Капранов Н. И. Ассоциация внутрхгвнкого (ГАТТ)-полиморфизма с различными кугацкякв в гене нуковисцидоза. //Тезись Национального Пульмонологического Конгресса, Косква. 1SS3.

10. О.Potapova, E.Bogacheva, E.Kuprina, О.Voronina. A way tc improve diagnostics of CF mutations. 17-th European CI Conference, May 1994, France.

11. O.Yu.Potapova, O.V. Voronina, V.S.Gaitskhoki, E.V.Bogacheva, Т.Е.Gembitskaya, E.A.Kuprina, H.I.Kapranov, Yu.A.Berlin, E.I.Scwartz. Identification of the linkage ol mutations causing cystic fibrosis to different alleles of i tetrarmcleotide repeat in intron 6A of the CFTR gene./, Biochemical Medicine and Metabolic Biology, 1994, v.51 185-187.

O.V.Voronina, V.S.Gaitskhoki, O.Yu.Potapova, E.I.Scwartz. ■rent mutations in CFTR gene in Russian CF patients linked .fferent alleles of intragenic (GATT) repeat. 26-th Annual .ng of European Society of Human Genetics, June 1994, Paris )•

O.Potapova, E.Bogacheva, E.Kuprina, O.Voronina. Specific CF nutation in Russian population. 8-th Annual North can CF Conference, 1994 (accepted).