Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетический анализ гена ENOD12 бобовых, определяющего ранние стадии развития симбиоза

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетический анализ гена ENOD12 бобовых, определяющего ранние стадии развития симбиоза"

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ МИКРОБИОЛОГИИ РАСХН

На правах рукописи

РГ 5 ОД

2 Ц ДПР МЕНЬ

Артем Евгеньевич

УДК: 577.123:635.656.

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ГЕНА £N0012 БОБОВЫХ, ОПРЕДЕЛЯЮЩЕГО РАННИЕ СТАДИИ РАЗВИТИЯ СИМБИОЗА

Специальности: 03.00.07 — Микробиология 03.00.15 — Генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1995

Диссертационная работа выполнена в лаборатории биотехнологии Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии РАСХН.

Научный руководитель — доктор биологических наук, член-корр. РАСХН И. А. Тихонович.

Официальные оппоненты — доктор биологических наук А. Ф. Смирнов, кандидат биологических наук Л. А. Шарыпова.

Ведущее учреждение — кафедра генетики и селекции Санкт-Петербургского Государственного Университета. ^

Защита состоится «1Ч> » ,)чКс1*~3\ 1995 г. в час. на заседании Специализированного совета К 020.26.01. по присуждению ученой степени кандидата биологических наук во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии по адресу: Санкт-Петербург—Пушкии-6, шоссе Подбельского, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан « ^ » ^ Н 1995 г.

Ученый секретарь Специализированного совета,

кандидат биологических наук А. Н. Зарецкая

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Акт2альность_проблеыы. Азотфиксирующий симбиоз между бобовыми растениями и почвенными бактериями родов Hhlzobivm, Bradyrhizoblum и Azorhlzoblvm является процессом, позволяющим растению-хозяину утилизировать азот атмосферы, переводя его © доступные для растения восстановленные формы; в свою очередь, бактериальный партнер получает доступ к продуктам растительного фотосинтеза. С генетической точки зрения становление и функционирование симбиоза - сложный многоступенчатый процесс, в основе которого лежит координированное взаимодействие геномов обоих симбионтов. Один из аспектов исследований - идентификация и анализ генов растения- хозяина (sym-генов и генов нодулинов), дифференциально экспрессиругацихся в процессе развития сшбиоти-ческих взаимоотношений. (Ые, 1971; Verm, Miao, 1992) и одним из наиболее интенсивно изучаемых генов нодулинов, экспрессиру-ющихся на ранних стадиях симбиогенеза является ген EN0D12, идентифицированный впервые у гороха и представленный в его геноме двумя копиями - EN0D12A и EN0D12B (Scheres et al., 1990; Govers et al., 1991). О функции EN0D12 имеется множество косвенных данных (например, инициация его транскрипции под действием биологически активных детерминант), однако до настоящего момента не было информации о межвидовой и внутривидовой вариабельности этого гена, а также о возможностях изучения EN0D12 методами классической генетики. Поэтому с 1991г в лаборатории биотехнологии ВНИИСХМ такие эксперименты были начаты. Данная работа выполнялась при финансировании программами "Интер-биоазот - 2000", "Приоритетные направления генетики" и "Биотехнология", а также грантами R6KOOO (ISF) и ШО (Нидерланды).

Целью настоящей работы явился молекулярно-генетический анализ EN0D12, представленного -копиями EN0D12A и EN0D12B,

Конкретные задачи исследования состояли в следующем:

- идентификация с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) у различных видов* бобовых последовательностей, гомологичных EN0D12 гороха, и анализ полиморфизма выявленных генов на уровне первичной структуры.

- изучение межсортового полиморфизма EN0D12A и EN0D12B у различных генотипов гороха, в особенности у линий, обладающих контрастными синологическими свойствами (линии европейского, афганского и иранского происхождения).

- анализ различных линий гороха афганского происхождения с поиощь» недетерминированной ПЦР (RAPD) (Williams et al.. 1990) для выявления их генетического полиморфизма на молекулярной уровне и изучение вариабельности EN0D12A и EN0D12B у этих линий.

- изучение наследования EN0D12A и EN0D12B в потомстве а также совместный анализ наследования этих генов с симбиотической мутацией sym2 для выявления их возможной идентичности.

- анализ сцепления ШЛИ 2 с морфологическими маркерами гороха.

Научная новизна. В работе проведен молекулярно-генетический анализ одного из растительных генов, экспрессирующихся на ранних стадиях симбиоза. В результате показано наличие группы EN0D12 у различных бобовых и определена первичная структура гена EN0D12B у бобов (УIda faba L.). При анализе этого гена у гороха был обнаружен полиморфизм его промоторной области в различных линиях, часть из которых несет другие sym-мутации (линии афганского и иранского происхоадения).

С помощью метода RAPD исследована выборка линий гороха афганского происхождения и обнаружен маркер, характерный для гороха'афганского, но не европейского происхоадения.

Применен метод, позволяющий анализировать наследование генов нодулинов совместно с вут-мутациями.

Определено сцепление генов EN0D12A и EN0D12B с маркером b третьей группы сцепления гороха.

Практическая значимость. Обнаруженный полиморфизм гена ENQD12 позволяет предполагать функциональную связь между этим геном и теми мутациями, наличие которых определяет высокую специфичность генотипа растения-хозяина по отношению к генотипу микросимбионта. Такие модели, обладающие контрастными симбио-тичесгаши свойствами, имеют большое практическое значение, поскольку позволяют создавать пары макро-микросимбионт, в которых генетические факторы растения контролируют 'избирательность - инокуляции только отобранными штаммами, независимо от

конкуренции со стороны спонтанной микрофлоры.

А5робация_работы. Результаты работы докладывались на 9-ом Международном Конгрессе по азотфиксации (Канкун, Мексика, 1993), II Российском симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" (Пущино, Россия, 1993), I Европейской конференции по азотфиксации (Сегед, Венгрия, 1994), I съезде ВОГИС (Саратов, Россия, 1994).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ.

Структ2рз_и_объеу_работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, описания результатов и обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 162 страницах машинописного текста, содержит 3 таблицы, 20 рисунков. Список литературы включает 271 наименование.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Мат§2иал_и_метода_исслезования. Для идентификации последовательностей, гомологичных гену ЕШЭ12 гороха (Plsum sativum), работу проводили на наше (Fhaseolus aureus), сое (Glycine max) (коллекционный номер Всесоюзного института растениеводства К-7208), бобах (Vicia /aba) (К-1617), люпине (Lupinua luteua) (К-1943), нуте (Cicer arletínum) (К-1181), фасоли (Fhaseolus vulgaris) (К-14279). Семена были получены из ШРа. В эксперименты по выявлению полиморфизма гена EN0D12 у гороха были включены линии афганского происхождения: NGB 102150, предоставленная С.Бликстом (Nordic Gene Bank, Landskrona, Sweden), линии 31/6, 1887/16, 1884/16, 29/2-2, 28/11-2 из коллекции ВНИИСХМ, линии "Afghanistan", предоставленная проф.Т.А.Ли (Сельскохозяйственный Университет г.Вагенингена, Нидерланды). Этим же университетом был предоставлен сорт европейского происхождения "Feltham first". Сорт "Совершенство" был получен из ВНИИ селекции и семеноводства.овощных культур.

В экспериментах по анализу сцепления EN0D12A и EN0D12B с геном sym2 использовались рекомбинантные инбредные линии (РИЛ) четвертого и шестого поколений, полученные в результате скрещивания европейской линии NGB 101238 и афганской линии NGB 102150, несущей в гомозиготном состоянии мутацию sjto2 (Lie,

-41984). Две РИЛ F6 получены путей трехкратного самоопыления Nocf-растенкй F2 и отобраны по признаку стабильности наследования устойчивости этих растений к заражению штаммом клубеньковых бактерий Rhlzoblum legwinozarvm bv.viceae CIAM1026 из коллекции ВНИИСХМ.

В работе' по локализации EN0D12 на генетической карте гороха были использованы гибрида Fg от скрещивания иутантной линии Спринт-2 Pix", образующей на корнях симбиотические клубеньки, неспособные фиксировать молекулярный азот атмосферы (Borisov et al., 1992) с множественно маркированной линией NGB 101238 (коллекция С.Бликста).

Растения выращивали в вермикулите, при 23°С со световым периодом 12 ч. и, при необходимости, трехдневные проростки инокулировали водной суспензией клубеньковых бактерий (отони С1АШ026) в дозе 107-108 клеток на растение. При посадке в вермикулит проводили полив (100 мл на 1кг субстрата) безазотным раствором Прянишникова (1963).

Манипуляции с.плазмидной и геномной ДНК проводили с помощью рестриктаз Pst I. ВагаЧ I, EcoR I, Hindlll, Sma I, SalG I а такие Taq полимеразы, Т4 ДНК-лигазы, Т7 ДНК полимеразы, фрагмента Кленова ДНК полимеразы I и щелочной фосфатазы из кишечника теленка. .■•'.'

Праймеры для ПЦР были синтезированы твердофазным фосфорамидным методом в Институте цитологии РАН (С-Петербург). Использовали следующие последовательности: . 5' -MGTGGTCACACATGATAAGA-3' , 5' -TOGMGCTTTTGATTTECTTAGCA--3' 5' -СССТТССЮТТСТТСТССТСА-З',' 5' -GCmAGATATGGATGmTGTTC-3'' ■ 5'-AICACTGCACTAGCAGGAAGT-3'

Праймеры для RAPD-анализа были синтезированы фосфонатным методом в Институте молекулярной генетики (Москва). Использовали олигонуклеотида следующего состава: 5'-CGCGGCCA-3' , 5'-GCIGGIGG-3' , 5'-AATGCAGG-3' Б'-ТССТСАСТОА-З', 5'-CCGCCGCCGCC-31, 5'-CAGTTCT-3'

Препаративное выделение плазмидной ДНК, расщепление ДНК зндонуклеазами рестрикции! обработку рестрицированной плазмиды щелочной фосфатазой, капиллярный перенос на нитроцеллюлозную - мембрану в 10xSSC буфере и гибридизацию проводили в условиях,

рекомендованных Маниатисом с соавторами (1984).

Растительную ДНК выделяли из листьев либо по методу Вильямса (Williams et al., 1992), либо по модифицировэнному (Козик, перс. сообщ.) методу Дрейпера с соавг. (1991).

ПЦР проводили в амплификаторе РЕА-3002 фирмы "Labotek" (Рига) по методике, предлагаемой для RAPD-анализа (Williams et al., 1990), увеличив количество праймеров и Taq полимеразы до 1.2*10~3о.е. и 2 ед, на реакцюо, соответственно. Реакцию проводили в 1.5 мл пробирках "Eppendori". Пробы инкубировали при 95°С в течение Зх мин в 25 мкл ПЦР-буфера (10ыМ ïris-HCl, рН 8.3, 50ыМ КС1, 2мМ MgClg« 0.001% желатин "Sigma", ЮОмкМ каадого из дезоксинуклеогидтрифосфатов (Pharmacia), праймеры, Taq поли-мераза, 0.1-1мкг соответствущей геномной ДНК и 20 мкл стерильного жидкого парафина) и проводили 30-35 циклов ПЦР. Каждый цикл включал денатурацию (95°, 30 сек), отжиг (50°, 60 сек) и синтез (72°, 90 сек). Последнюю реакцию синтеза проводили в течение 5 мин. RAPD анализ (40-45 циклов) проводили согласно Williams et al. (1990), варьируя, для максимальной воспроизводимости результатов, количество геномной ДНК от 50 нг до 1мкг.

ДНК из геля выделяли по методике фильтрования центрифугированием (Vaux, 1992).

Лигировакие транскрипта ПЦР по тупым концам осуществляли в мультифункциональной плазмиде pTZ19 (Pharmacia, LKB) по методике Дрейпера с соавт. (1991). В дальнейшем фрагменты переклонировали в ДНК фагов М13тр18/19 и выделяли одноцепочечную ДНК для секвенирования.

Секвенирование ДНК проводили по методике, предлагаемой фирмой "Fermentas" (Вильнюс) для секвенирования по Сэнгеру с помощью Т7 ДНК полимеразы.

Обработку результатов генетического расщепления проводили по методу максимального правдоподобия, используя программы для IBM совместимых компьютеров "PLANT" и "CH0S" (С.М.Розов, неопубликовано). ?§§25Ьтаты_и_обсужаениел

Для выявления последовательностей, гомологичных EN0D12A и EN0D12B гороха, нами была применена детерминированная ПЦР, при

проведении которой использовали прайыеры, гомологичные различным участкам генов А и В (рнс. 1).

ыошгл

-545 -485 +3 ■

х * х

{_£,_11 !'3 ■ 11 С Трг4 _£ГЬ]

-510 -450 *3

а. Ф 4.

ЕП, ££2. ЕГЗ,

Р, С """рта ргь

Рисунок 1. Расположения прайыеров при проведении ПЦР (стрелками сверху указаны расположения прайыеров относительно старта трансляции). Условные обозначения: Р^-Рр- проиоторная часть гена, С - кодирующая часть, Г - терминирующая часть.

После проведения ПЦР с прайиераыи ргЗ и ргД, ДНК бобовых переносили на нитроцеллюлозу и гибридазовали с меченной пробой кДНК Ш0В12А гороха - РвЕЖ)В12Л). Для данной пары прайыеров, комплементарных 3' и 5'-концам кДНК-ових копий Е.СЩ12А и £N00123 гороха, после радиоавтографии наше были обнаружены сигналы, соответствуйте фрагментам ДНК, гибридазуюащмся с радиоактивным зондом (рис. 2). Это свидетельствует о том, что Е1СШ12-подобные фрагменты разной длины присутствуют во всех изученных геномах бобовых. При этом в ряде случаев (бобы, люпин, фасоль) на дороже идентифицировалось два гибридизациошшх сигнала, то есть,ген в этих случаях представлен двуия копиями, как и у гороха', ДНК которого использовалась в качестве контроля (рис. 2). ~ Помимо разного количества выплифицируодихся копий, вариабельность £N0012 такте проявлялась в разной интенсивности гибрндизационных ответов, что шкет бить объяснено либо различной степенью гомологии участка соответствующей ДНК, фланкирующего изучаемый ген, гетерологнчноыу ПЦР-праймеру, сконструированному на основе ЕМ0Б12 гороха, либо различной степенью гомологии полученного ПЦР-транскрипта радиоактивному зонду -кДНК Ш0В12А гороха. Таким образом, оба фактора отражают иесвидовую вариабельность гена на молекулярном уровне, то есть его структурный полиморфизм.

„ Для пары прайиеров ргЗ и рг5 были получены результаты,

похоше на описанные выше для праймерсв ргЗ и рг4, однако, в этом случае для некоторых ДНК (люпин, фасоль) мы обнаруживали

Рисунок 2. Радиоавтограф продуктов ПЦР, проведенной с праймераыи ргЗ и рг4 на ДНК различных бобовых: 1-бобы; 2-горох, линия NGB102150; 3-горох, сорт "Совершенство"; 4-люпин; 5-маш; 6-нут; 7-Л. HlndlII; 8-соя; 9-фасоль, сорт 1; 10-фасоль, сорт 2; 11-горох NGB 102150 (независимая реакция).

сигнал лишь одной копии гена EN0D12 - ENQD12B. Поскольку для ргЗ и рг4 было показано присутствие у данных бобовых обеих копия EN0D12, то можно полагать, что отсутствие амплификации при проведении ПЦР с прайыерами для более протяженной части гена обусловлено структурной вариабельностью, выраженной в слабой гомологии между фрагментами ДНК, фланкирующими участок гена, и прайыерами.

2Л__Изучение__первичной__структуры___гена____В)01Л 2В___Y.___бобов

(VPEN0D12B).

Наиболее интенсивные ответы при Саузерн-гибридизации после ПЦР во всех случаях были получены для продукта ПЦР бобов, который по своей молекулярной массе соответствовал гену ENOD12B и был наш! обозначен по предлоиешгай терминологии (Van К atrasen, 1984) как VÍEN0D12B (EH0D12B бобов, Vicia faba L.). Фрагмент ДНК бобов, который был получен в реакции амплификации с прайыерами ргЗ и рг5 и соответствовал гену VÍEN0D12B, был секвешгрован; он состоит из 414 п.о. и содержит открытую рамку считывания в 267

123 4 5 6789 10 11

п.о. Как и предполагалось, нуклеотидные последовательности генов ViENODI2В и F6EN0D12B высокогомологичны друг другу - гомология достигает 82%. Сравнительный анализ гипотетических белковых последовательностей ViENODI2В и PsENODI2В обнаружил гомологию между ними в 75.6% (рис. 3). Белок V1EN0D12B общей массой 9995 Да, содержащий 89 аминокислот, также, как и PeEN0D12B, принадлежит к классу гидроксипролин-богатых белков (ГББ): он исключительно богат пролином (процентное содержание - 16.8%) и содержит 3 допол-. нительных остатка этой аминокислоты по сравнению с полипептидом PBEN0D12B (рис. 3). Из 15-ти имеющихся в последовательности белка ViENODI2В гидроксилролиновых остатков 10 включено в 5 • пентапептидных блоков: в каждом из блоков на N-конце имеется дипептид Рго-Рго, и основными мотивами являются Pro-Pro-Val-Авп-Gly(Lys) и Pro-Pro-Gln-Lys-Glu. Эти же блоки имеются и в последовательности белка PbEN0D12B (Covers et al., 1991). Пятый пентапептид, имеющийся только у VIEN0D12В - Pro-Pro-Arg-Ile-Ser. В центральной части всех идентифицированных белков EN0D12A и EN0D12B имеется полиморфная область, тогда как N- и С-концы достаточно консервативны. Возможно, что центральные части полипептидов играют роль линкеров, обеспечивая ковалентную связь между функционально важными фрагментами каждого из белков семейства.

pVfEN0D128pr

pPsENOD12J3pr pVfEN0D12Bpr

pPsEN0D12Bpr

Рисунок 3. Сравнение белковых последовательностей' У1Ш)Ш2В и РвЕН0012В. Дополнительные коды пролина выделены. Идентичные аминокислоты соединены пунктиром.

3. Разнообразие БШР12А. и Ш0Р12В в линиях гороха с контрастно '' 'В данной части экспериментальной работы перед нами стояла

- №SFFLSSLVFFUALILVP<£UQYHLNPAYEPPVNGPPVNKPPaKETP -50

» J J '!!!'! t • I I • < • t I « I i i i i i i i i i it i i • i i i i i i i t • i i i i < i i i i i i i i i i « < i i i i < i i i i i i i i i i » i i i i i » i

- MASLFUSSLVLFUALIIVP<«FAQYHL№VDEPPVNEPTVNKPPQKETP -50

- VHKPPQKEPPRISTDHK-SHLHVTHPSYCKHPTEEHIvjIHF -89 !!!!!! 1 ! !!!!I !!!!!! I ! !

- VYKPPQKKSPWYMPEQKESHLHV----YOKHLTAEHNIHI ■ -86

задача изучения внутривидовой вариабельности дуплицировэнного гена ЕШ)12 у Пзит ааИхям, для чего проводили ПЦР с последующей Саузерн-гибридизацией, используя в качестве матрицы ДНК различных линий и сортов гороха, различающихся, в-основном, географическим происхождением. Для выявления полиморфных сайтов был использован набор праймеров (рис. 1), позволяющий проводить ПЦР промоторной, кодирующей и терминирующей частей ЕЫСШ12А и ЕПСШ12В в шести различных парных комбинациях: рг1-рг4, рг2-рг4, ргЗ-рг4, рг1-рг5, рг2-рг5, ргЗ-рг5.

Для проведения эксперимента были взяты два европейских сорта и одна афганская линия, несущая природную симбиотическую мутацию Буш2. При этом полиморфизм фрагментов амплификации, соответствующих копиям ЕШ)12А и ШЛ)12В, не проявлялся при использовании пар праймеров, фланкирующих только кодирующую или кодирующую и терминирующую части гена, т.е. пар ргЗ-рг4 и ргЗ-рг5, зато был явно выражен при проведении ПЦР с- праймерами рг1-рг4, рг2-рг4, рг1-рг5, рг2-рг5. На рис. 4 представлены результаты Саузерн-гибридизации после электрофореза четырех групп продуктов ПЦР для разных праймеров, которые использовали для амплификации ДНК европейских сортов "РеЛЛЬат ЛгвГ' и "Совершенство", а такне афганской линии N08 102150. Для проверки соответствия продуктов ПЦР генам А и В фрагменты ДНК переносили и гибридизовали по Саузерну с меченым зондом кДНК . РбШШ12А и оказалось, что продукты, соответствующие ДНК линии НОВ 102150 (например, дорожка 2) киеют большую молекулярную массу по сравнению с- продуктами, полученными на европейских сортах (дорожки 1 и 3). Инсерция составляет примерно 14 пар нуклеотидовР ' Поскольку в предварительных экспериментах было показано, что кодирующие и терминирующие части генов А и В не являются вариабельными, можно сделать однозначный вывод о большей протяженности проиоторных частей генов ЕЫШ12А и ЕМСШ12В у гороха линии ШВ 102150 по сравнению с европейскими сортами. 4. Анализ гена ШЗР12 в выборке__афганских__генотипов__гороха.

Поскольку данные о промоторных сайтах ЕГ1СШ12А и БЖФ12В у афганского гороха, изложенные в главе 3, были получены нами только на одной линии гороха, то для большей корректности полученных выводов было решено провести аналогичные эксперименты,

м.в.

Pr.t-Pr.4 Рг.1-Рг.5 Pr.2-Pr.4 Рг2.-Рг.5 чэркера

Сов. 2150 Fel.f. Сов. 2150 Fel.f. Л-ген 1051 Сов. 2150 Fel.f. Сов. 2150 Fel.f. л-геи 991

Л-ген 881 - —— 946 В-ген Д-геи 821 8S6 947

774 £-ген _ Б-ген 631

- - 714 В-ген

Рисунок 4. Схема располояения фрагментов ДНК на форезе в 1.5% агарозном геле после проведения ПЦР на ДНК гороха с различными комбинациями прьймеров. На схеме указаны фрагменты, даицие положительный ответ при гибридизации с кДНК P6EN0D12A, Сов. - сорт "Совершенство"; 2150 - линия NGB 102150; Fel.i. -сорт "Feltham iirst"

расширив выборку линий афганского происхождения, несущих рецессивный аллель зуш2, до шести. Сложность состояла в том, что имея информацию только о географическом происхождении и наличии гена sym2 в выбранных линиях, мы не могли с уверенностью утверждать, с что ни одна из изучаемых линий не идентична какой-либо другой в этой выборке. Для получения дополнительной информации о генетическом родстве выбранного растительного материала нами был применен KAPD-метод, позволяющий с- помощью ПЦР со случайным олигонуклеотидом определять степень сходства генотипов (Williams et al., 1990). Поскольку к началу данных работ не было информации о праймерах, эффективных на ДНК гороха, нами были синтезированы различные олигонуклеотиды, вмшыфицирующие геномную 'ДНК сои, и проверена их эффективность на горохе. При использовании для RAPD афганских линий одного из праймеров, GCTGGTGG, нами было показано, что , во-первых, изучаемые линии гороха не идентичны друт другу, а во-вторых был обнарукен

маяорный молекулярный маркер, который присутствовал у всех изученных афганских генотипов. Далее проводили ПЦР на ДНК этих линий с праймерами рг1 и рг5, и оказалось, что у всех выбранных линий, за исключением 1887/16, промоторная область как гена EN0D12A, так и EN0D12B имеет бблыпую протяженность по сравнению с европейским сортом "Feltham first". Таким образом, полиморфизм (инсерция) промоторной области EN0D12A и EHQD12B оказался характерным для подавляющего большинства изученных линий, несущих симбиотическую мутацию sym2.

Эти данные позволили выдвинуть гипотезу о том, что инсерция регуляторной области EN0D12 аллельна мутации sym2. С одной стороны, эти линии несут нутацию зуш2, которая обусловливает их специфические синбиогические свойства, а с другой - 'имеют измененную регуляторную область одного из ранних генов нодулинов - EN0D12. Это монет указывать на то, что эти гены функционально связаны, и первым, наиболее очевидным, было предположение, что гены sym2 и EN0D12 идентичны. Однако, в дальнейшем результаты однозначно показали,• что ген EN0D12 и мутация sym2 неаллельш (см.главу 5) и локализованы в разных группах сцепления гороха (си. главу 6).

5л_Пршенеше_классического__генетического__анализа__и__ПЦР__для

изучетш^аследоватя^мм^__сиубиотаческой

MYZäiiiPi-SYiüii

В анализе по выявлению идентичности ' EN0D12 и ауш2 использовались предоставленные O.A. Куликовой рекомбинантные 1шбред1ше линии (РИЛ) пестого поколения 4-37/2 и 4-37(1)2), гомозиготные по гену sym2, который обусловливает неспособность растений с0 афганским генотипом образовывать клубеньки при инокуляции европейскими штампами бактерий Bhizobium leg. bv. vtceae'. В этой rre работе использовались гибрида четвертого поколешш, которые различались по способности формировать клубеньки со штаиыои CIAH1026 н, следовательно, шели генотипы 0ym2sym2 либо Sym2-. Нами была проведена ПЦР на ДНК, выделенных из указанных лшшй, с праймерами рг1-рг5. Результаты представлены в Таблгце 1. Тестон, позволявши*! проследить за наследованием аллелей EN0D12A н EN0D12В, в этой эксперименте слуяило то, что дашшй набор преймеров позволял получать разное

количество продуктов ПЦР у родительских линий: 1 продукт для ДНК МСВ 101238 и 2 продукта для ЫСВ 102150. Если бы при этом ген 1ЖШ12 был идентичен зутп2, все РИЛ шестого поколения, а также гомозиготные по зут2 гибрида четвертого поколения имели бы две амплифицируодихся аллели гена ЕЖИ!2.

Однако результаты показали, что количество продуктов ПЦР, характеризующее наследование генов £N0012А и ШЛ)12В от ИСВ 101238 или от ШВ 102150, не коррелирует с наследованием гена зут2: например, Р4-ги0рид 1-20(3), гомозиготный по Бута2, представлен одним фрагментом ПЦР, а Р4-гибрид 1-3(5), такяе имеющий рецессивный зут2 в гомозиготном состоянии - двумя фрагментами. Исходя из этих результатов был сделан вывод о неидентичности гена БЖШ12 и мутации зут2. Результаты этой части работы таюте проиллюстрировали возможность совместного генетического анализа генов, выявленных на основе двух подходов к изучению симбиоза -классического генетического и молекулярно- биологического. В дальнейшем, одновременное использование генетического анализа и молекулярных методов (ПЦР) позволило нам локализовать гены БЖФ12А и ЕЖЮ12В на генетической карте гороха.

№ Линия Поколение Наличие Генотип Количество

клубеньков продуктов

ПЦР

1 ЛСВ 102150 , - вутагвулё 2

г ИСВ 10123 рг + БПЕБУЫг 1

3 4-37/2 "б - Бу!г£ву7п2 1

4 4-31(1)2 - Вул£Е>уТТ£ 1

5 1-го(3) р4 - 8уш2еуп12 1

6 1-11(6) + БУыг - г

Т 1-27(3) + - г

8 1-18(10) - Вутп2бутп2 г

9 1-3(5) ?л - 8уш2вуп£ 2

Таблица 1. Суммарные данные о генотипе линий и продуктах ПЦР, полученных дляевропейской линии ИСВ 101238 и афганской линии N08 102150, а также их гибридов г, и

Примененный подход был далее использован наше для локализации EN0D12 на генетической карте гороха. Было получено потомство F2 от скрещивания линии NGB 101238, маркированной 25-ю морфологическими маркерами, и линии "Спринт-2 Fix-". По данным ПЦР- анализа с праймерами рг1-рг5 количество получающихся продуктов амплификации для ДНК NGB 101238 и мутантной лишш "Спринт-2 Fix-" было различным (1 и 2 продукта соответственно, Рис. 5).

Различия родительских линий по EN0D12 позволили рассматривать ПЦР-продукты в качестве молекулярных маркеров, наследующихся по Менделю. Поскольку гибриды F1 a tsimg F2, гетерозиготные по аллелям EN0D12A и EN0D12B, не отличались по результатам ПЦР-анализа от . доминантной родительской линии Спринт-2 Fix" (данные не приводятся), мы имели возможность тестировать лишь два класса растений - "один продукт" и "два продукта" ПЦР.

Компьютерный анализ наследования всех использованных в работе признаков выявил сцепленное наследование признака "отсутствие продукта ПЦР, соответствующего гену ENOD12A" с признаком, обусловленным наличием гена Ь,: "усиление красных тонов антоциановой пигментации пазухи прилистников, венчика, боба и семенной козурц" (Рис. 5).

Ранее наш были получены данные, свидетельствующие о сцепленном наследовании копий EN0D12A и EN0D12B (Козик с соавт., 1994). Такин'образом, в результате данных исследований в третьей группе сцепления гороха был локализован локус EN0D12, содержащий обе копии данного дуплицированного гена., Нутшо отметить, что из гёнов нодулинов гороха . до этого были локализованы только леггеиоглобин (Weeden, 1991) и подавно - теп EM0D10 (LaRue and Weeden, 1994).

ВЫВОДЫ

1. Оптимизирована методика применения полимеразной цепной реакции (ПЦР) для изучения генов paimero нодулина гороха (Pisin sativum L.) EHQDI2А и ETOD12B: подобраны, и синтезированы прайнеры, а такте отработан ряд параметров синтеза, позволяющих эффективно аиплкфицировать эти гены.

5- -14-

Рис. >6. Продукты ПЦР, соответствующие родительским линиям и гибриду F1: 1 - родительская линия Спринт-2 Pix"; 2 - гибрид F1 Спринт-2 Fix~«NGB 101238; 3 - Родительская линия NGB 101238.

Данные по расщеплению в поколении F2 для генов Ь и EN0D12A после скрещивания линий NGB 101238 и CnpHHT-2Fix~ сведены в таблицу.

1051 946

1

Число растений с определенным фенотипом B.EN0D12A B,enod12A b,EN0D12A b,enodl2A

34

8

Процент рекомбинации

17.92% + 6.14%

уг

*3:1

для гена Ъ 0.03 0.8000 < р < 0.9000

для гена EN0D12A 0.03 0.8000 < р < 0.9000

РекомбинационныЙ Xq.5 b-EN0D12A 14.94 0.0000 < р < 0.0005

Объединенный Xq 5 b-EN0D12А

15.00 0.0010 < р < 0.0050

2. В геномах различных бобовых (бобы, люпин, нут, ыаш, соя и фасоль) с помощью ПЦР идентифицированы последовательности, гомологичные генам Е№ЭБ12А и ШШ12В, что позволяет предположить универсальность участия гена ЕЖФ12 в контроле . симбиотической азотфиксации.

3. Определена первичная структура одного из идентифицированных генов, соответствующего гену ЕЖ® 12В бобов -У10ГСда12В, и установлена гомология его последовательности, с ранее идентифицированными генами.

4. Выявлен межсортовой полиморфизм -ШЛ)12А и ЕШ012В

гороха, в частности, обнаружена вариабельность промоторных (регуляторных) областей как гена ENOD12A, так и EN0D12B у линий, обладающих измененной специфичностью • (линии афганского и иранского происхождения).

5. Для изучения полиморфизма афганских линий гороха била оптимизирована и применена методика ПЦР со случайным олигонуклеотидом - RAPD- Показано различие меяду изученными линиями афганского происхождения, а также обнаружен мажорный молекулярный маркер, характерный для гороха афганского, но не европейского происхождения.

6. Показана возможность применения ПЦР для анализа наследования генов нодулинов, и с помощью вовлечения молекулярных маркеров в классический генетический анализ показана нетовдественность гена EN0D12 и симбиотической мутации sym2.

7. Гены EN0D12A и EH0D12B локализованы в третьей группе сцепления гороха.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Козик A.B., Матвиенко М.А., Мень А.Е., Заленский А.О., Тихонович И.А.. 1992. Гены гороха (Piauin sativum), участвующие в симбиозе с азотфиксирующими бактериями. III. Исследование структуры гена раннего нодулина EN0D12 для различных сортов гороха с помощью полимеразной цепной реакции (PCR). Мол. Биол. 26: 591-595.

2. Козик A.B., Куликова O.A., Матвиенко М.А., Мень А.Б., Тихонович И.А., Бисселийг Т. 1993. Изучение с помощью PCR сцепления ибаду симбиотическими генами гороха. II Российский симпозиум "Новые методы биотехнологии растений". Пущино. '83-рус., 322-англ.

3. Kozik A., Kullkova О., Matvienko Ы., Men A., Tikhonovich I. and Bisseling Т. 1993. Polymorphism and Inheritance of pea early nodulin gene EN0D12 and its sequences in other legumes. In: Palacios R., Mora J., Newton W.E. (eds.J New HorizonB in Nitrogen Fixation. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht/Boston/London. 358.- ,, ы

4. Men А.Е., Borisov A.Y., Robo? s'.mY, Teyganov V.E.,

Tlkhonovich I.A. 1993. The early nodulin gene Enod12A is in linkage group 3. Pieum Genetice. 25: 32-33.

5. Козин A.B.', Мень A.E., Куликова O.A., Бисселинг Т., Тихонович И.А. 1994. Гены гороха (Piaum sativum), участвующие в симбиозе с азотфиксируюрщи бактериями. IV. Изучение наследования симбиотических генов с использованием молекулярных ДНК-маркеров. Мол. Биол. 28: 542-548.

6. Men А.Е., Borisov АЛ., Tsyganov V.E., Andreychuk • Y.V., Kozik A.V. and Tikhonovich I.A. 1994. Genetic mapping ol the Piston sativum early nodulln gene EN0D12. A PCR-amplified EN0D12 irorn Vioia /aba-. In: KIbb G., Endre G. (eds.). Proceedings oi the 1st European Nitrogen Fixation Conierence. Oiiicina Press, Szeged, Hungary, pp; 338.

7. Мень A.E., Козик A.B. 1994. Использование молекулярных маркеров для изучения симбиотических генов гороха. Материалы I съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров. Генетика. 30 (приложение): 99.

Р.Т.П. Тип. ВИР. ¿ак.ЮЗ Тир. 100. Бесплатно.