Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетические основы недостаточности некоторых белков плазмыкрови
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетические основы недостаточности некоторых белков плазмыкрови"
Р Г Б ОД
I !.!!/ О па правах рукописи
ШАВЛОВСКИЙ Михаил Михайлович
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ НЕДОСТАТОЧНОСТИ НЕКОТОРЫХ БЕЛКОВ ПЛАЗМЫ КРОВИ
Специальность - 03.00.04 - биохимия
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук
Санкт-Петербург 1996
Работа выполнена в Отделе молекулярной генетики Научно-исследовательского института экспериментальной медицины РАМН (директор - академик РАМН, профессор Б.И.Ткаченко)
Научные консультанты:
чяен-корр. РАМН, нрофессор1с.А.Нейфах
чяен-корр. РАМН, профессор В.С.Гайцхоки
Оффнциальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор В.П.Комов док юр медицинских наук, профессор В.Б.Долго-Сабуров доктор медицинских наук, Б.1 (.Клементьев
Ведущее учреждение: Институт цитологии РАН, г. Санкт-Петербург
Зашша состоится " кЛ " С'ыу'^ ¿¿^ 1996 г. в /1 часов на заседании специализированного совета Д 001.23.01 по специальности 03.00.04 -биохимия при НИИ экспериментальной медицины РАМН (197376, Санкт-Петербург, ул.акад. Павлова, 12.)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ РАМН (Санкт-Петербург, ул.акад.Павлова, 12).
Автореферат разослан " " ^¿о-'бУ^^ — 1996 г.
Ученый секретарь специалнзнрованот о сопста доктор биологических наук
Л.В.Пучкова
В ВЕДЕН И К
Актуальность работы. Патогенез практически любого заболевания или синдрома на молекулярном уровне обязательно связан с изменениями количества или свойств определенных белков. В условиях патологии -ни изменения носят запредельный характер, то есть выходят за рамки, характерные для нормального метаболизма. Так как все белки выполняют определенные функции (ферментативные, структурные, транспоршые, регуляторные, защитные или другие), все они обладают функциональной активностью. Как резкое уменьшение, так и резкое увеличение функциональной активности белков ведет к каскадному нарушению процессов обмена, что в конечном итоге и проявляется в виде характерных признаков заболевания на уровне отдельных органов пли всего организма. Изменения функциональной активности белков могут бы п. детерминированы совершенно разными причинами как экзо- так н эндогенного характера. Рамки, в пределах которых функциональная активность белка обеспечивает нормальное протекание обменных процессов, в свою очередь также определяются многими внешними и внутренними факторами. Наиболее отчетливо изменения функциональной активности белков проявляются в случаях наследственной патологии. В последнее время детально изучены белковые дефициты (снижения функциональной активности) при некоторых наследственных заболеваниях, в частности моногенных, когда повреждение соответствующего гена прямо определяет недостаток фермента или белка с некаталитичсскон функцией. При этом наиболее наглядно прослеживаются взаимосвязи между активностью гена, появлением аномального белка с нарушенной функцией, возникновением блока метаболизма н развитием вторичных нарушений, определяющих общую картину патогенеза наследственного заболевания. К настоящему времени известно около 4000 наследственных заболеваний и синдромов [МсКиэгск, 1992], нз которых только для приблизительно 200 установлены первичные изменения на генном и соответственно белковом уровне.
При большинстве наследственных заболеваний первичным звеном в патогенезе на биохимическом уровне являются структурные нарушения, которые ведут к изменению активности, свойств или количества определенного белка, чаще всего фермента. Однако, как показали исследования последних лет, изменения со стороны определенного белка не всегда является первичным результатом мутации в гене, кодирующем данный белок. В ряде случаев эти изменения имеют опосредованный характер за счет нарушения функциональной активности других белков или ферментов, которые принимают участие, например, в синтезе или созревании белка, функциональный дефицит которого определяет симптоматику заболевания.
В предлагаемой работе рассматриваются изменения, связанные с уменьшением функциональной активности белков, то есть белковые дефншпы и широком понимании этого термина. При этом иод'
функциональным дефицитом мы понимаем любые изменения со стороны белка, коюрмс приводят к его неспособности и полном обг.еме выполнять свои ф>нкции. Функциональный дефицит может возникать даже в том случае, кем да, несмотря на кажущуюся нормальность формирования зрелого белка (фермента), его активности оказывается недостаточно при определенных экстремальных воздействиях на организм. Такие 01 постельные функциональные дефициты, коюрмс в конечном счете также могу: бы и. 1спстически. запрограмиронанными, имеют место при самой разнообразно» патологии, и их коррекция является весьма важной для рациональной зерапин множества 'заболеваний. Эмпирически функциональные дефиншы корре! ируются введением различных природных продукюв, в частности белков или лекарственных вешеств, модулирующих свойства них белков.
В претлатаемой работе исследовались молекулярные основы двух шболевапий, которые обусловлены, во-первых, генегическимн дефектами (об I заболевания являются аулосомно-репесспиными), а, во-вторых, оба заболевания связаны с дефнцию.м белков плазмы крови, которые относятся к так н.пываемым белкам острой фазы. Речь ндег о болезни Вильсона (геилзолентикулярной дегенерации) и о наследственном дефиците а1-аптпфипсина (и!-ЛТ), при коюрых в плазме крови резко снижены уровни соответственно медьсодержащего гликопрогеина церулоп.тазмина (ЦП) » ипгибнюра прок-аз «1-АТ. С целью выяснения роли патогснстнческой роли дефицитов проводились исследования ненаследственных функциональных дефицитов лих белков как у человека, так и в эксперименте на животных.
Полешь Вильсона, или гепатолентикулярная дегенерация, представляет собою тяжелое неврологическое заболевание с сопутствующим поражением печени, при котором нарушается обмен меди и постоянно обнаруживается низкая концентрация активного ЦП в плазме крови. Несмотря на существенны» прогресс в выяснении первичных звеньев, измененных при болезни Вильсона н при другом наследственном нарушении обмена меди • при боле .ни Менксса ( к настоящему времени идентифицированы и »зучены гены, измененные при данных заболеваниях), до сих нор не имеется окончательных сведений о патогенезе этих болезней на белковом уровне и более того не известны делали обменных превращений мели в организме, которые вторично страдают при этих видах патологии. Не исключено, что » некоторые другие заболевания в большей или меньшей степени связаны с неявным» нарушениями обмена меди или белков, участвующих в метаболизме этого жизненноважного микроэлемента. Поэтому детальные исследования белков, участвующих в обмене меди, и в частности ЦП. в состав которого входит около 95% общего количества меди плазмы крови, помимо выяснения механизмов патогенеза болезни Вильсона, дают возможность установить общие закономерности обмена меди в организме и роль изменений этого обмена при других видах патологии. В то же время изучение метаболизма меди позволяет раскрыть основные пути всасывания, транспорт, распределения и дегокенкацпп попов других тяжелых металлов,
которые в ряде случаев конкурируют с ионами меди за специфические самна связывания на белковых переносчиках.
В связи с тем, что в последнее время появились сообщения о благоприятном лечебном эффекте препаратов ЦП, п чао мост мри терапии анемии, воспалительных заболеваний, лучевых повреждении и даже стенокардии, один из разделов работы посвящен разработке промышленного способа получения препарата ЦП для диагностических и лечебных целей. Учитывая известные физиологические функции ЦП и его феноменологическое денегг.'е, разработка лечебного препарата на основе этого медьсодержащего б ел а л является весьма актуальной задачей.
Для выяснения общих закономерностей развития патологических процессов при белковых дефицитах часть работы проведена на примере недостатка антинротеазы плазмы кропи - а!-АТ. Наследственные дефицит а1-АТ достаточно широко распространены в популяциях челопска и проявляются в виде серьезных поражений легких и печени. Анализ наследственной и ненаслсдствснной нсдостагочносги этого белка позволяет оптимизировать пути диагностики и специфической терапии данных состояний. Исследование проводилось на контингенте больных с легочной патологией. Па основании анализа наследственного и непаследстпенпого дефицитов ЦП и «1-АТ высказана концепция о функциональных дефицитах белков и роли этих дефицитов в патогенезе любых заболеваний.
Исследование молекулярных основ болезни Вильсона и недостатка сх1-АТ, проявляющихся на биохимическом уровне в виде резкого снижения концентрации соответствующих белков плазмы крови, позволяет выявить общие черты и особенности патогенеза наследственных и ненаследствепмых функциональных белковых дефицитов. Кроме того установление закономерностей развития заболеваний при функциональных дефицитах белков дает возможность изыскивать рациональные пути терапии этих состояний, в частности открывает возможности заместительного исправления нарушений обмена.
Цель и задачи исследования. Цель настоящего исследования заключалась в выяснении общих закономерностей проявления дефицита белков при наследственных заболеваниях и при других видах патологии на примерах недостаточности ЦП и а!-АТ, в разработке способов диагностики и подходов к лечению состояний, обусловленных недостатком функциональной активности белков, а также в выяснении некоторых механизмов нарушения обмена меди и ЦП при болезни Вильсона
Непосредственными задачами работы являлись:
1) разработка способов выделения и очистки белков, в частности ЦП человека и экспериментальных животных, а также <*1-АТ человека;
2) разработка способов промышленного получения препарата ЦП человека, анализ токсикологических и фармакологических свойств препарата;
3) изучение физико-химических свойств и структурных особенностей 11П человека и животных и «1-ЛТ человека;
4) сравнительный анализ ЦП здоровою донора и больных болезнью Кильсона, моделирование биохимических нарушений, имеющих место при до чеши Вильсона па экспериментальных животных;
5) изучение особенностей обмена меди в эмбриогенезе и у взрослых млекопитающих, а также выяснение роли ЦП в этом процессе;
0) изучение распространенности вариантов а1-АТ, выявление постелей редких мутантных аллелей, анализ взаимосвязей между Фенотипом «1-ЛТ и характером патологии.
Ниччнос шачсиис и нопизиа работы определяются следующими
мимепыми:
1. Изучены физико-химические свойства и особенности структурной оркпипаиии ЦП человека и ЦП экспериментального животного крысы.
2. Изучены фармакологические свойства ЦП человека и показана ;ффекминюсть препаратов ЦП при репарации лучевых поражений. Усыновлена безвредность препаратов ЦП.
3. Произведен сравнительный анализ структурной организации ЦГ1 норового человека и больных болезнью Вильсона, показано, что оксида юиоложителытый ЦП при данной наследственной патологии прукпрпо не изменен.
4. Шутсно влияние искусственного дефицита ЦП, вызванного цветением солей серебра, на физиологические функции экспериментального живомюю. Усыновлено выраженное эмбрнотокснческое действие солей серебра и показана возможность коррекции этого действия препаратами ЦП. Выявлено изменение биосинтеза ЦП иод влиянием солей серебра и встраивание ионов этою металла в синтезируемый ЦП.
6. Ра фаботаны способы синтеза аффинных сорбентов для выделения и очистки ЦП.
7. Выделен и охарактеризован и 1-ЛТ человека. Исследована частота встречаемости функциональных дефицитов этого белка и изучена распространенность отдельных фенотипическнх вариантов белка среди больных с легочной патологией.
8. Сформулирована концепция о роли первичных и вторичных функциональных дефицитов белков в патогенезе заболеваний
Практическая цепное ть. Разработаны промышленные способы получения высокоочпщенных препаратов ЦП человека для диагностических целей и для лечебного применения. Проведена большая часть доклинических испытании препарата. Показана безвредность препарата ЦП и ею положительный эффект при лечении лучевых поражений. Показана диагностическая значимость определения функциональной активности ЦП и «1-ЛТ при различной патологии.
Публикации. Основные результаты представленных к защите исследований опубликованы в 29 печатных работах в отечественных и международных научных журналах.
Апробация. Материалы, использованные в диссертационной работе, докладывались на 2-ом Всесоюзном съезде генетиков и селекционеров (Москва, 1972); Фом Международном биофизическом конгрессе (Москва, 1972); 3-ем Всесоюзном симпозиуме по химии пептидов и белков (Киев, 1974); 3-ем Всесоюзном биохимическом съезде (Рига, 1974); 3-ей Всесоюзной конференции "Конформационные изменения биополимеров в растворе" (Тбилиси, 1975); 1-ой Всесоюзной конференции по медицинской генетике (Москва, 1975); Советско-французском симпозиуме по физико-химии белков и пептидов (Пущино, 1975); Советско-американском симпозиуме по химии и физике белка (Рига, 1976); 3-ем Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов"( Москва, 1976); 3-ем Всесоюзном съезде генетиков и селекционеров (Ленинград, 1977); 14-ом Международном генетическом конгрессе (Москва, 1978); 4-ом Всесоюзном биохимическом съезде (Москва, 1979); 3-ем Всесоюзном симпозиуме по медицинской этимологии (Астрахань, 1979;; 6-ои Конференции по биохимии Прибалтийских республик и Ленинграда (Юрмала, 1981); 4-ом Всесоюзном съезде общества генетиком и селекционеров им. Вавилова (Кишинев, 1982); 1-ом Всесоюзном съезде медицинских генетиков (Москва, 1983); 16-он Конференции ФЕБО (Москва, 1983); Научной конференции Биохимия -Медицине" (Ленинград, 1988); Всесоюзном симпозиуме "Проблемы изучения наследственности человека на уровне продуктов генной экспрессии" (Москва, 1989); 2-ом Всесоюзном съезде медицинских генетиков (Алма-Лга, 1990). Тезисы сообщении опубликованы в материалах съездов, конференций и симпозиумов.
На защиту выносятся следующие положения:
1) Доказано, что оксидазоположнтельные ЦП здорового человека и больных болезнью Вильсона структурно идентичны. Дефицит ЦП при болезни Вильсона носит вторичный характер. По крайней мере одна из функции ЦП заключается в межорганном транспорте ионов меди.
2) Разработаны способы получения препаратов ЦП в качестве лечебных средств, получены данные о фармакологических свойствах данного медьтранспортного гликопротеида. Показана перспективность применения препаратов ЦП при некоторых видах патологии.
3) Установлены некоторые узловые моменты транспорта меди в организме и гомеостаза меди.
4) Высказано предположение о роли ЦП в механизмах детоксикации ионов хяжелых мегалчов.
5) Показана диагностическая >■ прогностическая значимость определения функциональной активности п фенотнпических вариантов а1-А'1 при воспалительных заболеваниях легких.
6) Предложена концепция о роли функциональных дефицитов белков н па 101 енезе заболеваний.
CipyKijpa днссергацин. Диссертация изложена на 300 машинописных страницах, состоит из следующих разделов: введения, двух основных глав, посвященных роли ЦП и al-ЛТ при различной патологии, заключения и выводов. Список цитированных литературных источников включает 253 рабо1Ы. Диссертация содержит 29 таблиц и 44 рисунка.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ /. Hcpy.wrLiasMitii и его роль в нарушениях обмена меди
1.1. Церу.юи.тазмин и обмен меди у человека. В последние годы крупным успехом завершились молекулярио-и'нетические исследования двух наиболее распространенных и известных наследственных дефектов обмена меди. Речь идем о аутосомно-рецесснвиой болезни Вильсона и рецессивной связанной с Х-хромосомой болезни Менкеса.В результате исследований mciодами тонкого теистического картирования удалось идентифицировать и определить строение генов, поврежденных при болезни Вильсона и. болезни Мепкеса. Оказалось, что эти гены кодируют гомологичные крупные мембранные белки, которые структурно сходны с АТФазамп Р-типа и, предположительно, участвуют в транспорте ионов меди. Ни ген болезни Вильсона, ни ген болезни Менкеса не идентичны гену, кодирующему структуру ЦП. Таким образом, дефицит ЦП при болезнях Вильсона и Менкеса носит опосредованный характер.
Результат прямого анализа генов подтвердили проведенные нами ранее исследования препаратов ЦП, полученных от разных больных боле шью Вильсона", при помощи модифицированного метода пептидных карт. Эш исследования позволили сделать заключение об структурной ндсншчносш обладающего окендазноп активностью ЦП здоровых и больных людей. Метод включал выделение ЦП из сыворо1ки крови при помощи ионообменной хроматографии с дополнительной очисткой путем электрофореза, полирование белка 1:М. последующий полный гндролтз ipniiciiiioM и анализ пептидного материала на тонком слое целлюлозы при помощи электрофореза, хромаioi рафии и авторадпо!рафнп. Таким образом, бы по показано, что при болезни Вильсона пмест место только количественный дефицит ЦГ1 в результате изменений его сшпеза без структурных нарушений зрелою холо-белка.
Снижение концещрацнн ЦП в крови больных отражает блок встраивания меди в :hoj белок с последующим снижением скорости синима. Альтсрнашвным является предположение о том. что на начальных ггапа>. болезни Вильсона нарушения синтеза ЦП минимальны, и юлько при отравлении клеток печени ионами мели за счет нарушений функции мель-трапепоршой АТФазы »иорнчио подавляется ciuuet ЦП. Последнее
предположение согласуется с повышением концентрации не связанной с ЦП меди в крови и с отложением меди в различных тканях больных.
В процессе выснения особенностей ЦП больных болезнью Вильсона были детально изучены свойства белка здоровых допоров. Интересной особенностью ЦП оказалась его лабильность в отношении экзогенных и эндогенных протеаз, специфически расщепляющих полипептидную цепь до фрагментов строго определенной молекулярной массы.
С целью сопоставления структурных особенностей фрагментов ЦП нами был исследован аминокислотный состав отдельных фрагментов и фракций после гель-фильтрационного разделения. В результате анализа оказалось, что высокомолекулярные фракции по аминокислот ному составу в пересчете на молекулярную массу 22 кД соответствовали фрагменту с молекулярной массой 22 кД. Эти результаты подтверждали факт существования повторяющихся структур в полипептидной цепи ЦП. Таким повторяющимся блоком мог быть 22 кД-фрагмент, хотя не исключалась возможность гетерогенности этого фрагмента, представленного участками сходной длины из различных районов белковой молекулы. Впоследствии эти результаты были подтверждены прямым анализом полнпептидной цепи ЦП.
Для выяснения вопроса о степени сходства строения отдельных фрагментов ЦП были определены М-концевые аминокислотные последовательности фрагментов в составе фракций и в изолированном состоянии. Оказалось, что все высокомолекулярные фрагменты обладают сходной ЬЬконцевой аминокислотной гексапоследователыюстыо, которая отличается от последовательности фрагмента с молекулярной массой 18 кД. Как впоследствии выснилось, Ы-концевая последовательность высокомолекулярных фрагментов соответствует N-концевой
последовательности полнпептидной цепи зрелого ЦП. Очевидно, что нее высокомолекулярные фрагменты так или иначе содержат М-концевую последовательность исходной молекулы ЦП. Содержащие такую последовательность фрагменты являются преобладающими во всех хроматографических фракциях.
Факт обнаружения единственной 1М-концевой последовательности во фракциях с различными наборами фрагментов заставило нас осуществить С-концевой анализ этих фрагментов. Для этого мы воспользовались модифицированным нами методом [Ма1зио, 1966] включения 5Н в С-концевые аминокислоты с последующим карбоксипептидазным гидролизом. Образцы белка растворяли в ?НгО (до 100 мК) при добавлении мочевины до конечной концентрации 9М. Затем к полученному раствору добавляли безводный пиридин и уксусный ангидрид. Смесь инкубировали с интервалами в 10 минут в течение двух часов при температурах 70 и 20 "С. Далее образцы диализовали против большого избытка дистиллированной воды и лиофилнзнровали. Полученные препараты модифицированного белка гпдролнзовалн 6 и НС1 или карбокеппептида юн А с последующим аминокислотным анализом.
Как показали результаты такого анализа исходные препараты ЦП включают метку (41) в Asp, Gly и Leu (Ile). Как известно Asp включает метку некшпенмо от местоположения в полипептндной цепи, в то время как другие ociuiKii метя ich только в С-концевом положении. Поэтому С-концевыми являлись остатки Gly и Leu (lie). Дополнительная обработка меченых образцов ЦП карбоксппептндазоП А позволила обнаружить последовательности -Scr-Gly-COOH и -Ser-Tyr-Leu-COOH.
Последовательность -Scr-Gly-COOH является С-концевой
последовательностью фрагмента с молекулярной массой 18 кД и соответственно С-концевой последовательностью ннтактной полипептндной цепи белка. К сожалению в связи с недостатком материала мы не смогли анализировать отдельные фрагменты пли фракции ЦП. Однако, результаты С -концевого анализа соответствовали результатам N-копцевого анализа. Как и в первом случае определялось всего 2 последовательности, из которых одна coolветствовала С-концевому фрагменту с молекулярной массой 18 кД. 11осле установления полной первичной структуры ЦГ1 человека выяснилось, 41 о, действительно, последовательность Scr-Gly является С-концевой для полной подписигмлпоп цени. В то же время последовательности Ser-Tyr-Leu не является С-концевой для какого-либо из фрагмента. Однако, С-концевая последовательность фрагмента с молекулярной массой 50 кД соответствует Гут-Leu, а фрагмент с молекулярной массой 67 кД содержит С-концевой остаток Ser. Особенность фрагментации заключается также в том, что ocraiKii Arg и Lys, локализующиеся на стыках фрагментов с молекулярной массой соответственно 67 и 50 кД и 50 и 19 кД в процессе протеолиза выщепляются. Подобный характер фрагментации объясняет полученные памп результаты по идегпнфикацип С-концевых остатков и последовательностей в препаратах ЦП.
Результаты изучения характера фрагментации белка и структурных особенностей образующихся крупных фрагментов позволяли предполагать, что ЦП состоит из отдельных структурных к, возможно, функциональных доменов с высокой степенью внутренней гомолопш. Для доказательства этого отдельные фрагменты белка были подвергнуты анализу при помощи пептидных карг полированных триитпческих гидролнзатов.
Попарное сравнение осуществлялось путем зеркальною сопоставления, при лом сходные по свойства пептиды pacno.Taiалпсь симметрично относительно вертикальной осп и формировали рисунок, напоминающий крылья бабочки. Результаты анализа фрагментов при помощи трпптичеекпх нептпдных карт показали высокую степень сходства фрагментов 11 - КЗ. Следует отметить также выраженное сходство пептидных наборов гидролнзатов К4 и К5 + Кб. Полученные нами результаты со всей очевидностью говорили о наличии повторяющихся структур в молекуле ЦП человека. Детальный анализ внутримолекулярной гомолопш в ЦП с ¡ал возможным после определения полной аминокислотной последовательности белка. Поданным прямого анализа первичной стрилуры ЦП [Ortel. I'JS-'-Jj
белок состоит из 3 гомологичных доменов со степенью сходства от ?и до
попарное сравнение фрагмента ИЗ и фрагментов Р6, П5 и 175+Р6
Как известно, все индивидуальные белки представлены молекулами, которые не являются полностью идентичными. Чаще всего существует несколько изоформ молекул белка. Изоформы могут возникать как реализация внутренних свойств белка (субъедииичная структура и формирование олнгомеров из разных субъединиц). Другая причина возникновения гетерогенности - это различные пути иосттрансляционной модификации (гликозилироваиие, протеолиз, включение прост егнчсских труни и т.д.). И, наконец, гетерогенность обусловливается 1 енетическими факторами, то есть, существованием многочисленных аллелей гена.
45%.
Рисунок I. Схемы пептидных карт фрагментов ЦП
кодирующего конкретный белок, а также существованием очень близких по структуре иеаллельных генов.
ЦП как и другие белки обладает микрогетсрогенностью. Один из 1ИИОВ мпкротетерогенности ЦГ1 связан с различиями nociтрансляционного г.чпкошлированпя полипептидной цепи, другой тип обусловлен полиморфизмом генов и обнаруживается только при анализе первичной структуры ( гетерогенность но остаткам Gly и Lys в положениях 79 и 449). '»ют тин мнкрогегерогенпости обычными методами электрофореза не определяется.
В ю же время уже даыю было показано, что в популяциях встречаются лица, в плазме крови которых содержатся электрофоретнчески отличающиеся генетические варианты ЦП. Частота встречаемости этих вариантов достаточно низка. Все описанные аллельные варианты ЦП не связаны каким-либо образом с состоянием здоровья пробандов.
С целью выяснения частоты встречаемости генетических вариантов ЦП в Российских популяциях нами было произведено обследование значительного контингента здоровых доноров при помощи эиектрофорсгического метода. Образцы сыворотки крови от 1330 человек анализировали путем электрофореза в 7,5% Г1ЛАГ с последующей окраской па оксидазную активность о-днанизпдином. В результате исследования у 17 человек были обнаружены изменения электрофорептческой подвижности ЦП. Па электрофоре!раммах образцов сыворотки крови всех носителей аномального но подвижности ЦП выявлялось по 2 оксидазоположительных зоны. 1 зона соответствовала по подвижности часто встречающемуся варианту В. Другая зона (быстро мигрирующая к аноду) по подвижности была оценена как соответствующая варианту А. Гомозиготных носителей, которые бы содержали единичный редкий вариант ЦГ1, обнаружено не было. Основываясь на числе выявленных носителей аномальною ЦП были рассчитаны частоты генов ЦПли ЦП" в анализируемой выборке. Оказалось что р (частота гена ЦП") оставляет 0,9936, a q (частота гена ЦПЛ)- 0,0064. Таким образом, вариант ЦП А является достаточно редким для населения Петербурга (Ленинграда), что соответствует литературным данным (q = 0,0025 - 0,1490 в зависимости от популяций).
Функциональная роль ЦП прямо или косвеио связана с наличием в молекуле белка попов меди. Поэтому исследователей всегда интересовала природа лтпандов ионов меди в ЦП. Прямым способом определения координационной сферы ионов меди в белках является
ренпсиоструктуриый анализ, позволяющий точно локализовать ионы меди и их окружение. Учитывая высочайшие возможности рентгеноструктурного анализа как в плане изучения центров связывания ионов меди, так и в выявлении отличий в белке больных с наследственными заболеваниями, были предприняты попытки исследовать ЦП при помощи этою метода. На первом этапе были получены крупные кристаллы иагнвного ЦП, а также его модифицированных форм, в частности бессиалового белка.
Рисунок 2. Кристаллы ЦГ1
г
---
( ) >)
С.) О ' /
Кристаллы нативиою ЦП (а) и бессиалового ЦП (б)
Анализ показал, что параметры ячейки кристаллов натпвного ЦП соответствуют а = Ь = 268,2 + 0,5 А, с = 129,1 ± 0,2 А. Поле максимального разрешения рентгенограмм составляет 6 А. Параметры ячейки кристаллов бессиалового ЦП соответствуют : а = Ь = 215.0 + 1,0 А, с = 84,2 + 0,1 А. П асимметричной части кристаллической ячейки нативного ЦП содержится 2 молекулы белка, в то время как в асимметричной части ячейки кристаллов бессиалового белка - 1 молекула. Кристаллические формы ЦП человека были впоследствии использованы для рентгеноструктурного анализа с разной степенью разрешения.
1.2.Сгроение и свонста нерулоилазмнна крысы. Исследование ЦП человека г норпе и при наследственной патологии пе иозвочнчо нам
имнсяип, роль этого белка в обмене меди и причастность дефицита белка к ралинию симптомов болезни Вильсона. Поэтому были предприняты попытки исследовать некоторые из физиологических функций ЦГ1 и модельных условиях. Для эюго предполагалось изучить ЦП экспериментального животного - крысы и исследовать некоторые параметры обмена ЦП у этого животного в норме и при экзогенных воздействиях.
Для осуществления этой работы были необходимы очищенные препараты белка и специфические антитела к нему. Поэтому в задачи исследования входило в первую очередь получение гомогенного ЦП крысы. Нами был разработан модифицированный способ выделения ЦП. Но этому способу выделение ЦП осуществлялось в три стадии, включающие хроматографию сыворотки крови на ДЭАЭ-Сефадексе А-50, повторное осаждение белка смесью хлороформ - этанол и гель-фильтрацию на Сефадексе G-I00. Полученный данным способом препарат ЦП при необходимости концентрировали путем улырафнль грации, стерилизовали фильтрацией через нитроцеллюлозные мембраны, запаивали в стерильные ампулы и хранили в темном месте при О "С. Для предотвращения нротсолншчсскон деградации ЦП на стадиях выделения и в процессе хранения во все растворы, употребляющиеся для выделения белка, вводили Е-аминокапроновую кислоту. Кроме того забор крови осуществляли в сосуды, содержащие г.-нминокаироновую кислоту и
фенил.мсгилсульфонилфторид. Приведенный способ позволяет получать препарат ЦП с выходом 75 - 77%, который по данным электрофореза в ПААГ (иолиакрнламндном геле) представляет собою гомогенный белок. Для наиболее чистых свежевыделенных препаратов ЦП человека соотношение Б,и)/П:кп достигает 0,05 (обычно 0,045). Для ЦП крысы, полученного модифицированным нами способом, величина соотношения непосредственно после выделения достигала 0,054. Однако, довольно быстро ( в течение нескольким суток) даже при хранении в темном месте при низкой температуре соотношение снижалось до 0.045 - 0,047. В ходе дальнейшего хранения падение соотношения происходило достаточно медленно, и за 1 год снижение данного параметра составляло 15 - 25%, что характерно и дня ЦП человека.
Основным параметром, необходимым для проведения дальнейших физико-химических исследований белка, установления его состава и выяснения деталей структурной организации, является его молекулярная масса. Известно, что молекулярная масса холо-ЦП человека составляет 132 кД. Молекулярные массы ЦП человека и крысы по данным седиментационного анализа Весьма сходны. Однако, при электрофорезе этих белков в градиенте ПААГ удалось обнаружить, что ЦП крысы но сравнению с белком человека проникает в более плотные слои ПААГ. Этот результат указывает на меньшую молекулярную массу белка или на более компактную упаковку глобулы.
Рисунок 3. Электрофорез ЦП крысы и человека в ПААГ с градиен шо возрастающей плотностью.
1 и 2 соответственно ЦП человека и крысы; количество ЦП крысы превосходит количество ЦП человека в 5 раз. Окраска о-дианиэидином на окендазную активность
При электрофорезе в присутствие ДДС-№ (додецилсульфата Ыа) ЦП крысы мигрирует в виде трех зон, окрашиваемых на белок. Главный компонент ЦП крысы мигрирует как полнпептнд с молекулярной массой 130 кД, минорные компоненты - как полипептиды с молекулярной массой 110 и 18 кД. Данные величины вычислены на основании сравнения с подвижностью маркерных белков, для которых молекулярные массы точно известны, а также с подвижностью фрагментов ЦП человека. Исходная молекула ЦП крысы и фрагменты белка по электрофоретической подвижности полностью соответствуют таковым ЦП человека. Известно, что компоненты с молекулярными массами 110 и 13 кД в ЦП человека являются продуктами ограниченного спонтанного протеолиза за счет разрыва единичной пептидной связи в белке. Обнаружение аналогичных фрагментов в ЦП крысы указывает на сходство протеолитической деградации белков человека и крысы. В то же время необходимо отметить, что получаемые по нашему способу препараты ЦП крысы содержат лишь незначительную долю деградированного белка.
Фрагменты с молекулярными массами 110 и 18 кД являются минорными, других фрагментов обычно не наблюдается. Таким образом, Можно предположить либо более стабильную в отношении протеолиза структуру белка крысы, либо нную активность протеолитической системы
?
плазмы кропи этого животного. В любом случае ЦП крысы гораздо легче получить в нсдеграднрованном состоянии. Действительно, при выделении ЦП крысы в присутствии ингибиторов сернновых протеаз удается получить практически недеграднрованный белок, целиком состоящий из иолипешидпых цепей с молекулярной массой 130 кД.
Для более наглядной демонстрации сходства молекулярных масс ЦП человека и крысы был осуществлен следующий эксперимент. ЦП из свежей сыворотки крови человека и крысы сорбировали на ДЭЛЭ-Сефадексе в присутствии фепилметилсульфонилфторида, как описано ранее, элюнровали стунепчашм градиентом концентрации N'aCl и фракции, содержащие ЦП, быстро обессоливали и подвергали электрофореiy в ПЛАТ без денатурации. После элскфофорсшческого разделения блоки геля извлекали из аппарата, окрашивали о-днанизнднном до появления едва заметных окрашенных зон и о1мывалп 10% уксусной кислотой для полного удаления красителя, который прсиякчвуег дальнейшему анализу. Окрашенные зоны, соответствующие 1111, вырезали н нодперюлн йодированию.
Кусочки теля пнкубнрова: III Ь 1- " расiворе бикарбоната Na для иейфализации уксусной кислоты и далее помещали в 7 M раствор |уанидннхлоридл на 0.2 M бора гном буфере, pli 8.6. Гель в этом буфере roMoi оптировали и добавляли 1 - 2 мКи Nai:5J . Заюм пробы инкубировали в ючепие 30 минут для растворения белков и проникновения метки в , структуру юля и добавляли раавор хлорамина Т. После згою материал переносили в диализные мешки и осуществляли диализ в течение двух суток ятя полного удаления нссвязавшсйся мсткн. Иодированные данным способом белки разделяли при помощи электрофореза в присутствии ДДС-Na. Блоки геля после электрофореза фиксировали как обычно и подпер!ати авторадиографин. используя для этого рентгеновскую пленку l'M-l. Указанный способ обработки способствуст предоiвращению деградации белка за счет примесных нротеаз.
ЦП крысы и человека, полученные эшм способом при электрофорезе в ДДС-Na мигрирует в виде единичных высокомолекулярных компонснюв с молекулярными массами, равными 130 кД. При этом необходимо oimctiiii>, что белки крысы и человека не различаются по подвижности и будучи помещенными в одну и ту же лунку мигрируют виде единичной доспи очно узкой зоны.'Гаким образом, можно ирпйш к заключению, «но молекулярные массы зрелых нолноразмерных полнпешпдных цепей ЦП крысы и человека идентичны. Выявляемые другими методами огличия связаны с особенностями упаковки полнпептпдных цепей в белковые глобулы.
Па основании анализа физико-химических и ферментаишных свойств, аминокислотного состава и углеводною состава было установлено, чю ЦП крысы и человека весьма сходны. В связи с тем что время начата наших исследований первичная структура ЦП крысы не была ншестна. степень гомологии ЦП крысы и человека оценивали методом пептидных карт. По данным анализа тринтнчеекпх гндролизатов карбоксимешлпрованных белков человека и крысы методом нешплпыч карт на бумаге и по данным
анализа тонкослойных пептидных карт йодированных производных ti их белков ЦП крысы и человека гомологичны более чем на 90%. На основании анализа последовательности кДНК степень гомологии белков крысы и человека составляет 93%. Несмотря на высокую степень сходства белков человека и крысы кроличьи антитела к ЦП человека и крысы строго специфичны.
Результаты сравнительного изучения ЦП крысы и человека показали высокую степень сходства этих белков по физико-химическим и ферментативным свойствам и по общему плану строения, что позволяет использовать лабораторное животное крысу для модельных исследований обмена ЦП in vivo. Антигенные отличия ЦП крысы и человека открывают возможности прослеживать судьбу ЦП человека в организме крысы.
1.3. Влияние солей серебра на обмен меди н церулоплазмина in vivo. ГТри наследственных заболеваниях (болезнь Вильсона и болезнь Менкеса) наиболее постоянным и выраженным биохимическим дефектом являет ся резкое снижение концентрации ЦП в плазме крови. В связи с этим возникает вопрос, в какой степени симптоматика этих заболеваний обусловлена снижением содержания данного мегаллогликопротенна. Возможно, что этот биохимический дефект, являющийся к тому же вторичным, не имеет прямого отношения к развитию симптомов заболевания, а отражает лишь общие нарушения обмена меди в организме.
В конце семидесятых - начале восьмидесятых годов появились работы, в которых было показано, что введение крысам солей серебра (AgNOi) приводит к нарушениям роста аденогипофиза и к снижению оксидазной активности ЦП в плазме крови. С целью выяснения причин изменения оксидазной активности ЦП при введении солей серебра нами были предприняты попытки исследовать влияние солей серебра на синтез и свойства ЦП. Было показано, что при пероральном введении животным солей серебра в течени 18 суток оксидазная активность в сыворотке крови снижалась до 5% от нормы, а содержание иммунореактивного материала падало только на 31%. Несоответствие снижения оксидазной активности и содержания иммунореактивного материала в сыворотке заставило нас исследовать возможность изменении оксидазных. свойств ЦП, что скорее всего связано с исключением ионов меди из молекул белка. Для подтверждения этого предположения была осуществлена частичная очистка ЦП из сыворотки крови крыс, получавших с пищей соли серебра. Было найдено, что при хроматографии сыворотки крови этих крыс на ДЭАЭ-Сефадексе А-50 иммунореактивный белок элюируется в виде бесцветного материала, содержащего серебро. В таблице 1 представлены результаты определения содержания серебра и иммунореактивного ЦП в хроматографических фракциях. На рисунке 4 приведен профиль элюцни иммунореактивного белка с ДЭАЭ-Сефадекса и содержание Ag в хроматографических фракциях.
Таблица I.
Содержание ннмунореактнвиого элюирусмых с ДЭАЭ-Сефадекса
ЦП и серебра во фракциях,
№ фракции Пммунореактмвный ЦП в мкМ Концентрация серебра в мкА Число ионов серебра на молекулу ЦП
1-3 1,00 5.0 -
4 1,23 5,6 4,55
5 2,77 9,2 3,32
6 3,38 10,4 3,08
7 4,23 20,0 4.73
8 3,85 13,6 3,53
9 2,08 10,0 4,8
10- 13 1,0 5,0 -
среднее
4,002 ± 0,708
Рисунок 4.
Концентрации иммунореактнвного ЦП и во фракциях элюага с ДМЭ-С'сфадекса
20 т
18 |
I
•16!
<5 14 • X
« 12 •
о 1 <
¥10;
Ж
о с =» 6
в
Ряд1 Ряд2
4 1
2 ! О ■
■ • • а
Ю N й ^ О
N фракций
Ряд I - концентрации ЦП во фракциях, ряд 2 - копией Iрации А^' во фракциях
Для легальною изучения свойств и структурных особенное!ей ЦП с заменой ионов меди на ионы серебра было осуществлено выделение данно) о белка из сыворотки крови животных, получавших соль серебра в течение 16 суток. На рисунке представлены результаты электрофоре!пческого анализа
ЦП, выделенного путем хроматографии на ДЭЛЭ-Сефадексе и
двойного осаждения смесью этанол-хлороформ.
Рисунок 5.
Электрофореграмма препарата Ag-ЦП крысы в 7,5% ПЛЛГ.
I
'Г
I - Ag-ЦП-l, 2 - Ац-ЦП-2, 3 - нормальный ЦП крысы. Окраска геля на белок.
Выделенный белок мигрирует в виде двух электрофоретических компонентов. Один из компонентов (А£-ЦГ1-2) по подвижности соответствует природному медь-содержащему ЦГТ и слабее чем нормальный ЦП окрашивается о-дианизидином, другой компонент (А^-ЦП-1) обладает существенно меньшей подвижностью и практически лишен окендазнон активности. Окончательная очистка Ag-ЦП была осуществлена при помощи гель-фильтрации на Сефадсксе С-200. Оба варианта ЦП образуют зоны преципитации со специфическими антителами к природному ЦП крысы. В состав Л[:-ЦП-1 и Л^'-ЦГ1-2 входит Ай.
Известно, что ЦП разных видов по спектральным свойствам весьма сходны. Спектры поглощения этих белков характеризуются максимумами при 610 и 330 нм за счет голубых центров связывания меди тина 1 и центров связывания меди типа 3. В отличие от природного ЦП, Лц-ЦП лишен поглощения в видимой части спектра. Это указывает на существенные
п imciiciiiih петров связывания ионов мели runa I скорее всего за счет встраивания в эти центры ионов серебра, которые не образуют окрашенных комплексов. Результаты иммунохимического, спектрального и элементарного анализов позволяют утверждать, что при скармливании крысам солей серебра происходит синтез аномальных ЦП с частичной заменой ионов меди на ионы серебра и с разрушением по крайней мере специфических центров связывания меди типа I.
С целыо выяснения структурных особенностей вариантов Ag-содержащего ЦП был произведен анализ этих вариантов при помощи электрофореза в присутствии ДДС-Na. Как исходный природный ЦП крысы, так и Ag-содержашне варианты являются частично дет радированными. Для более детальною сопоставления особенностей деградации вариантов эти белки отделяли путем электрофореза, йодировали и подвергали электрофорезу в ПААГ с ДДС-Na. Па рисунке б приведены радиоавтографы гелей и соответствующие деисшограммы. В таблице представлены результаты анализа молекулярновесового распределения фрагментов в препаратах ЦП.
Рисунок 6.
Электрофоре!раммы нормальною ЦП крысы и Ag-Ull-I и -2 в 7,5% ПААГ в присутствии ДДС-Na
Си-ЦП
IT > 1-7
I I - 1:7 - обозначения фрагмешов ЦП в зависимости от их подвижности ( кажущейся молекулярной массы) к ai юлу (мо теку тярные массы фрат мен топ приведены в таблице 2).
Таблица 2.
Молекулярные массы фрагментов Си-ЦП и вариантов Лу-ЦП
Фрагмент Си-ЦП Лр-ЦП-1 Лк-ЦП-2
II 130 - -
Р2 110 по 110
КЗ 65 65 -
Я4 - 58 -
Р5 - - 48
Р6 23 - -
Г7 18 18 18
Результаты электрофоретического анализа указывают на существенные различия в характере фрагментации отдельных вариантов ЦП. Во-первых, следует отметить, что Ад-ЦП в большей степени подвержен начальному циклу деградации с образованием 18 кД-фрагмента. В препаратах Ау-ПМ отсутствуют полноразмерные полипептидные цепи с молекулярной массой 130 кД. Учитывая, что С-концевой 18 кД-фрагмент предположительно содержит Си-связывающий центр тина 1, весьма вероятно изменение его конформацпи при замене ионов меди на ноны серебра с возрастанием чувствительности к протеазам. Си-ЦГ1 представлен полноразмернон полнпептпдпой цепью (130 кД) и четырьмя фрагментами с молекулярными массами 110, 65, 23 и 18 кД. В то же время Ау-ЦП-1 состоит из фрагментов с молекулярными массами 110, 65, 58 и 18 кД, а Ад-ЦГ1-2 - из фрагментов с молекулярными массами 110, 48 и 18 кД. В составе Ай-ЦГ1-1 выявляется дополнительный фрагмент с молекулярной массой 58 кД, а в Ац-ЦП-2 -дополнительный фрагмент с молекулярной массой 48 кД.
Результаты этих исследований показывают, что встраивание ионов серебра сопровождается существенными структурными перестройками белка при сохранении основных антигенных свойств. При этом образуются отличающиеся по ряду параметров 2 варианта белка. Вышеприведенные данные заставили нас попытаться выяснить, обусловлены ли наблюдаемые отличия только перестройками на уровне высших уровней организации белковой молекулы, или же имеют место более серьезные изменения на уровне первичной структуры.
Для того, чтобы установить структурные особенности отдельных фрагментов двух вариантов ЦП был использован разработанный нами метод пептидных карт с йодированием электрофоретических компонентов. Отдельные фрагменты Си-ЦП, Ад-ЦП-1 н Ад-ЦП-2 подвергали триптическому гидролизу с последующим анализом меченых пептидов в тонком слое целлюлозы. Оказалось, что пептидные наборы полноразмерной полипептидной цепи (Си-ЦП с молекулярной массой 130 кД) и фра1 ментов с молекулярной массой 110 кД Си-ЦП И Ад-ЦП-2 практически не различаются. С другой стороны все фрагменты Ае-ЦП-1 независимо от молекулярной массы сходны по наборам пептидов, и распределение
нет плов па картах эгих фрагментов соответствует-распределению пептидов на картах зрннптчсских гидролизатов 18 кД-фрагментов Си-ЦГ1 и Ag-ЦП-2.
К сожалению найти однозначное объяснение подобному изменению первичной структуры белка при встраивании ионов серебра пока что не представляется возможным. Очевидно только, что ноны серебра оказывают вчпяние на тонкие механизмы биосинтеза ЦГ1. Косвенным подтверждением ткому предположению служит факт обнаружения аномальной по размерам мР11К в печени крыс, получавших солтт серебра.
Основной келью наших исследовании по влиянию солей серебра на биосинтез и свойства ЦП являлось выяснение степени адекватности механизмов нарушения обмена меди при отравлении серебром и при наследственных дефицитах ЦП. В настоящее время не вызывает сомнений, что некоторые наследственные дефициты ЦП (болезни Вильсона и Менкеса) обусловлены не дефектом церулоплазминового гена, и недостаток ЦП является вторичным. Отсюда весьма важным представляется выяснение роли дефицита ЦП в развитии симптоматики наследственных дефектов (болезни Вильсона, болезни Менкеса и других синдромов, связанных с нарушениями обмена меди). Обусловлены ли накопление меди в тканях при болезни Вильсона шш недостаток меди при болезни Менкеса дефицитом ЦП, или же нн нарушения обмена меди и ЦП лишь параллельны и независимы друг от друта? Такая неоднозначность объясняется частично тем, что до сих пор не установлена главная функция ЦП.
11зучснне влияния индуцированного солями серебра функционального дефицита ЦП на обмен меди позволяет получить информацию и о роли ЦП в ортанизме и о значимое!и недостатка этого белка в условиях патологии. Поэтому быгш предприняты попытки исследовать эффект недостатка активного ЦП на жизнеспособность экспериментальных животных. Оказалось, что даже при достаточно длительном скармливании крысам солей серебра ( по 50 мг в сутки в течение нескольких недель), общее состояние животных не нарушается. Вес тела, поведение, состояние кожных покровов п потребление пищи не изменяются, выделительные и другие функции не страдают. В то же время при введении крысам солей серебра уже через неделю в сыворотке крови окендазното ЦП не обнаруживается. Таким образом даже резкое снижение окепдазоиоложнтелытот о ЦП в плазме крови не ска ¡ывается па основных фи отологических функциях организма.
Таким образом, на предложенной модели нам не удалось выявить взаимосвязь между снижением оксидазной активности ЦП в плазме крови и возникновением каких либо патологических изменений в ортанизме животных. Учитывая возможность существования компенсаторных механизмов транспорта и утилизации меди у взрослою организма, было решено исследован, влияние солей серебра пли снижения уровня оксида ЮМОЛОЖИТСЛЫЮ1 о ЦП в плазме крови у беременных крыс на параметры обмена меди и на жизнеспособность .»морионов .
Для :ишо беременным крысам весом 180 - 220 г. которые содержались на обычной диете, н брикетированный корм добавляли АцС'1 из расчета 50
мг/животное в сутки. Количество пищи и воды не ограничивали. К. ч и ранее, было показано, что уже через неделю после начала скармливания животным АеС1 в сыворотке крови исчезает оксидазная активность ЦП- В сыворотке крови контрольных крыс оксидазная активность соответствует концентрации ЦП в пределах 50 мг%.
С целью выяснения влияния сроков введения на эмбрногенет первоначально АдС1 вводили в корм с 7 по 15 сутки беременности. При этом, как видно из таблицы 3, поступление АуСТ на этой стадии беременное!и (стадия органогенеза) не влияет на развитие эмбрионов. Показатели до- и ностимплантацнонной гибели не отличались от контрольных. Среди живых плодов на момент вскрытия { 20 сутки беременности) внешне различимых аномалий не выявлялось. Средняя масса плодов не отличалась о г контрольной. Таким образом, на этой стадии развития плодов эмбриотокснческого действия солей серебра не обнаруживалось. Возможно, что отсутствие эффекта связано с краткосрочностью воздействия. АрС! поступал в организм в течение недели, активность ЦП снижалась в течение 2 - 3 суток и полиостью исчезала только к концу срока опыта. То есть достаточно низкая концентрация Ц11 в крови самок имела место лишь на поздних стадиях развития эмбрионов и как будет видно из дальнейших результатов поступление меди к плодам уменьшалось, но не блокировалось полностью. Однако, эти данные ценны тем, что косвенно покатывают отсутствие прямого токсического действия ионов серебра на эмбрионы.
Совершенно другой эффект имеет место в опытной группе крыс, которые получали АрС1 с пищей в течение всей беременности (с 1 но 20 сутки). Результаты исследования эмбрионов этой опытной группы также приведены в таблице 3. Видно, что донмнлантационная гибель эмбрионов в этой группе (те отличается от контрольной. В то же время постнмплантационная гибель дистнгает 36% (р < 0,001). У 5 из 145 эмбрионов (2,5%) выявлялись макроскопические аномалии развития, идентифицированные как омфалонеле, эвентсрация, укорочение хвоста. Особенно бросается в глаза резкое отставание в приросте массы тела эмбрионов. Средняя масса плодов на момент вскрытия составляет 1,75 г, в то время как в контрольной группе средняя масса плода составляет 2,26 г (р < 0,001). В опытной группе повышено также число эмбрионов с внутрнортанными повреждениями, в частности существенно увеличено число плодов с гидронефрозом и крииторхизмом.
В связи с выраженным эмбрпотоксическим действием АцС1 весьма интересно было исследовать влияние введения этого агента беременным крысам на жизнеспособность новорожденных животных. Оказалось, что при содержании крыс на диете с А^С1 в течение всего срока беременности новорожденные абсолютно нежизнеспособны. Все новорожденные погибали в течение первых суток (см. таблицу 4.)
В результате проведенных исследований оказалось, что несмотря на кажущуюся негоксичиость ЛgCl для взрослых животных, этот агент обладает фатальным действием на внутриутробное развитие плода. При
Таблица 3. Эчбриотоксическос действие АеС1
Группы ЖЛВОП1ЫХ Периоды юксическою воздействия Л£С] Кошролыюя фуппа Исюричсския
КОИТрОЛЪ
сутки бсремениэсти |
7-15 1-20 |
Число беременных крыс в опыте 5 20 36 237
Число лелшх 1ел 63 231 430 2758
число эмбрионов:
. имплантировавшихся 59 222 384 2537
попюшихдо имплантации (в т.ч." ■>) 4(6.3) 9(3.9) 46(10,7) 221 (8,0)
погибших после ичгша1гтащш 3(5.0) 80 (36,0) 37(9.6) 220 (8.7)
Число плодов:
ЖИВЫХ 56 142 347 2317
с уродствами 0 5 0 0
Срс, тяя масса плода (I) 2.2 1.75 2.24 2,26
11;1!о.|счпя внутренних ор1анов число плодов . 51 98 150 2317
Лнляшаия прсдсср;шй (в 1.ч%) 2 (3.9) 1 (1.0) 0 0
Кровоминяние в гру;и1>ю полос п.(в т.ч.3«) 0 8(8.2) 1(0,7) 78(11,8)
КроВОН!ЛНЯ!!ИС в брюшную ПО л ОСП, (в Г.Ч." о) 0 19(19,4) 7(4.7) 48(7.3)
Кройсшлнямис в печень (в т.ч.*») 0 8 (8.2) 0 6(0,9)
Гндронефроэ (В Т.Ч.1 о) 2(3.9) 30 (30,6) 8(5,3) 8(1.2)
Крчшорхнзм (в 1.Ч.°о) 0 34(34.7) 2(1,3) 5(0,8)
Таблица 4.
Токсический эффект ЛцС1 на постнатальное развитие животных и коррегирующее действие ЦП человека
Экспериментальные [руппы леа (1 - :о сутки > (1 - 20) + ЦП (214 супа!) -20) +ЦП (8 - 21 сутки) Контроль
Число крыс с потомством 5* . 6 6 4
Число новорожденных 33 61 51 32
Из них погибло (В Т.Ч. ° о) 33 (100) 21 (34,5) з (5,9) 0
Индекс жизнеспособности о. 0,26 0,53 0.84
Индекс лактации 0 0,58 0,89 0,85
Средняя масса животного на 18 сутки после рождения 0 . 24,0 28,8 ' 27,0
Индекс прироста массы тела 0 3,9 3,6 3,2
* - у одной самки при вскрытии на 23 сутки беременности обнаружена внутриутробная гибель всех плодов
Примечания: индекс жизнеспособности означает отношение (число крысят на 4 сутки после рождения)/(число крысят на 1 сутки после рождения); индекс лактации - (число крысят на 21 сутки после рождения)/(число крысят ка 4 сутки); индекс прироста массы тела - (масса тела на 18 сутки)/(масса тела на 4 сутки)
Таблица 5.
Содержание меди ( и мкг/r сухого веса ткани) в органах жнвошых при введении AgCI и влияние экюгенного ЦП на распределение меди при отравлении AgC!
Opi ним м ткани Нведение в течение все» беремешюстн Контроль
АвП AjiCI + ЦП
Печень ¡простых крыс 11.5 i 2.7 16,4 ± 1,7 17.512.7
Сердце шрослых крыс 11,2+ 1.3 16,310.7 17,6 + 2.6
11очкм юроелмх крыс 8.6 + 0,9 10.6 ± 0.7 13,4 + 0.7
1 1л;:иен ы 0 4 1 + 0.6 7.3 + 0,6
\)мГ>риомы 0 4.6 ± 0,6 5.Х + |,|
CblOopolKU крови взрослых крыс ( п mki/m.t) (1 0,7 + 0,05 . . 1,3 + 0,05
введении AgCi в течение всей беременности нмеег место либо внутри} тробная гибель эмбрионов, либо тоталытыя ранняя посгнатальная гибель плодов. Можно предполагать как прямое токсическое действие ионов серебра, так н опосредованное влияние на развитие эмбрионов за счет резкого снижения концентрации ЦП в крови матери. Необходимо также учесть тот факт, что при беременности концентрация ЦП обычно существенно возрастает, и таким образом, в условиях отравления солями серебра относительный дефицит ЦП в крови беременных значительно выше, чем у исбеременных. Анализ закономерностей действия солен серебра на эмбрнотенсз позволил нам склониться к предположению об опосредованном токсическом влиянии солей серебра за счет угнетения активности ЦП. Для проверки такою предположения было изучено содержание меди в различных органах беременных, в плаценте и в эмбрионах. Результаты проведенного анализа представлены в таблице 5. Видно, чю в органах взрослых животных (беременных самок) содержание меди к концу срока беременности и соответственно введения AgCI незначительно, но достоверно (р < 0,001) снижается. В это же время концентрация меди в тканях плаценты и в эмбрионах падает до значений. не peí нстрирусмых использованным методом. В плазме крови концешрация меди также резко снижается, что хорошо коррелирует с падением окендазной активности ЦП. Учитывая снижение концентрации меди в тканях взрослых крыс п в эмбриональных тканях, весьма интересно было выяснить насколько выраженно изменяется при этом активность важнейших медь-содержащих ферментов нитохромоксидазы и супероксидднсмутазы.
Как показали наши исследования, несмотря на резкое снижение концентрации меди в тканях плода в эмбриональных митохондриях активность ишохромоксидаш не изменяется. Цито.хромоксидазнач активность сохраняется также интакгноп в митохондриях печени взрослых беременных крыс. В то же время в печени взрослых животных п особенно в
Таблица 6 Коррегирующее влияние экзогенного ЦП на повреждающее действие А2С1
| Экспериментальные группы Введение в течение всей беременности
! Л8С] АдС1 + ЦП
1 Число беременных крыс в опыте 20 22
I Число желтых тел 231 267
| Число имплантировавшихся эмбрионов 222 262
Погибших до имплантации эмбрионов (в т.н. в %) 9(3,9) 5(1,9)
Погибших после имплантации эмбрионов (в т.ч. в %) 80 (36) 25 (9,5)
Живых плодов 142 237
Плодов с уродствами 5 0
Средння масса 1 плода 1,75 2,04
Оценка состояния внутренних органов:
исследовано плодов 98 220
дилятация предсердий (вт.ч. в %) 1(1) 22(10)
кровоизлияния в грудную полость (в т.ч. в %) 8(8,2) 24(10,9)
кровоизлияния в брюшную полость (в т.ч. в %) !9 (19,4) 38(17,2)
кровоизлияния в печень (с т.ч.в %) 8 (8,23) 23(10.5)
гидронефроз (в т.ч. в %) 30 (30,6) 8 (3.6) 1
хрипторхизм (в т.ч.з.%) 34 (34.7) 0 ■
жанчх эмбрионов снижается активность циюзольнон СмГ/.п-(\нерокснд,'П1смугазы. Данные но изменению активности этого фермента представлены па рисунке 7.
Рисунок 7.
Активность суперокспддисмутазы в растворимой фракции тканей ^мбрщлюв п взрослых крыс, получавших ЛцС; влияние ЦП человека
0 1 2 3 4 5 6 7
[супероксндиыс радикалы) х 10 1 N1
I - контроль (восстановление цтпихромл с супероксидными радикалами в отсутствие суиероксидднсму кпы), 2 - активность суперокснддисмутаты в тканях эмбрионов при отравлении ЛцС1, 3 - то же на фоне введения беременным крысам препарата ЦП. 4 - то же в тканях нормальных эмбрионов. 5 - активность пмерокснддисмукпы в печени взрослых крыс при ограв.тении Л£С1, 6 - то же в печени нормальных животных, 7 - иктшшоегь очищенной сунерокснддисмутаты х 10-" N1) из эритроцитов человека
Резкое снижение активности суисроксилдисмугазы можег объяснять раннюю гибель новорожденных животных за счет повреждений ле1 очной ткани или друптх тканеГ| при переходе от эмбриональною дыхания к легочному. Выявление изменений в содержании меди и активности медьсодержащих ферментов при введении животным АуС1 подтверждают наши предположения о том. что ноны серебра, вызывая дефицит активною медьсодержащего ЦП, способствуют блокаде поступления меди через плацентарный барьер. Правильность такого объяснения была установлена при анализе влияния ЦП человека на эмбриотокснческое действие АрС1.
/(ля этого беременным крысам, получающим с пищей АуС1, в определенные сроки пнутрибрюшпино вводился препарат очищенного ЦП человека в дозах 10,5 мг на крысу. Предварительно было показано, что впутрпбрюншнное введение ЦП приводит к быстрому проникновению зкзогеиното белка в кровоток. По данным иммуноэлектрофоретнческого
анализа высокая концентрация ЦП человека в крови крысы удерживается в течение 2 суток.
Введение ЦП с 2 по 14 сутки беременности приводит к частичной нормализации показателей внутриутробного развития (см. таблицу 6). Полсе выраженный эффект достигается при введении ЦП с 8 но 21 сутки беременности. В какой-то степени различия в эффективности действия ЦП в разные сроки беременности можно объяснить тем, что в теченн нерпой недели беременности (первой недели введения АуСТ) эндогенный ЦП еще не полностью исчезает из кровотока, а эмбрионы еще не требмот значительного притока меди. При отравлении животных АрС1 на фоне введения экзогенного ЦП в течение второй половины беременное! и внутриутробная смертность не отличается от контрольной, не обнаруживается аномалий развития эмбрионов, средняя масса плодов составляет 2,04 г (средняя масса плодов крыс, получавших АуС1, без коррекции ЦП составляет 1,75 г; р < 0,001). Снижается доля плодов с гидронефрозом и крннгорхнзмом. Разительное действие оказывает ЦП на ностнатальное развитие новорожденных (см. таблицу 4). Гибель новорожденных составляет только 34%, при 100% гибели в условиях отравления А^'С1 без коррекции ЦП. Если гибель новорожденных у крыс, получавших только АуС1, наступает в первые сутки, то на фоне введения ЦП продолжительность жизни возрастает. ЦП способствует повышению индекса жизнеспособности до 0,26. индекса лактации - до 0,58. Несколько неожиданным результатом является увеличение индекса прироста массы тела в условиях введения ЦП. Этот показатель в контрольной группе меньше, чем в опытных в условиях введения ЦП. Из таблицы 5 видно, что введение ЦП сказывается и на концентрации меди н тканях взрослых животных и в эмбриональных тканях. Если в тканях взрослых крыс увеличение концентрации меди выражено незначительно, то в тканях эмбрионов эти изменения весьма показательны. Отмечается также возрастание активности суперокснддисмутазы как в тканях взрослых крыс, так и особенно выражеппо в эмбриональных тканях.
В связи с обнаруженным влиянием поступления меди в составе ЦП на эмбриогенез было исследовано влияние двух дополнительных агентов пенпин.т.тамнна, способствующего выведению меди, и бинирпдпла, вызывающего выведение железа. Оба хелатора обладают
собственным эмбриотокснческим и тератогенным действием и для обнаружения синергизма АцС1 и хелаторов последние вводились в субэмбрпотокснческнх дозировках. Оказалось, что в этих дозировках хелагоры вызывают усиление токсического действия солей серебра. В пересчете на гибель эмбрионов эффект пеницплламина может быть оценен в 79%, эффект бипирндила - в 55%. Пеницпллампн, являющийся эффективным хелатором ионов меди, способствует возрастанию частоты крипторхнзма и гидронефроза. Эти же повреждения наиболее часто обнаруживаются у эмбрионов, матери которых получали с пищей А^СМ. Таким образом, имеет место косвсное подтверждение механизма действия Л;»-, заключающегося в
подавлении синтеза активного ЦП и последующего транспорта меди в составе ЦП через плацентарный барьер. Нарушение поступления меди в развивающийся организм из-за дефицита ЦП, действительно, приводит к множественным нарушениям развития.
1.4. Разработка способа промышленного получения препарата нерулоплазмпна человека н анализ его свойств. В ходе работ по изучению физико-химических свойств ЦП здорового человека и больных болезнью Вильсона на определенном этапе потребовались большие количества высокоактивного очищенного белка из донорской крови. Кроме того появились сообщения о положительном фармакологическим действии иреиаиатов ЦП при некоторых видах патологии. Эти причины заставил)! нас изыскивать пути для получения значительных количеств ЦП из плазмы крови человека.
Первоначально выделение ЦП осуществляли из цельной сыворотки крови доноров или чаще из рстроплацентарной крови. Однако, для получения требуемых количеств белка необходимы были весьма большие обьемы дорогостоящего исходного сырья. В связи с этим были предприняты попытки использования более приемлемого исходного материала.
Известно, что в процессе промышленного производства белков сыворотки крови человека (иммуноглобулинов и альбумина) другие компоненты сыоротки в том числе и ЦП отбрасываются в виде неутнлизируемых спиртовых осадков. Эти отходы производства сывороточных белков (осадки, получаемые на различных стадиях фракционирования сыворотки крови по модифицированным схемам Кона) были исследованы нами на содержание ЦП. Было показано, что практически все осадки содержат наряду с другими белками активный ЦП. Наиболее обогащенным по содержанию ЦП оказались осадки, образующиеся при выделении альбумина. Эти осадки содержали на 1 г влажного веса 2 - 3 мг ЦП. Для сравнения в 1 мл сыворотки крови содержится всего около 0,3 мг ЦГ1. На основе известных способов выделения ЦП был разработан способ получения очищенного ЦП из отходов производства сывороточных белков крови человека.
Предложенный способ получения ЦП, включающий хромаюграфию целевого продукта на ДЭАЭ-Сефадексе А-50 и кристаллизацию, был положен в основу промышленного производства белка. 'Технические условия" и "Регламент производства" для препарата "Церулонлазмнн диагностический очищенный жидкий человеческий" были утверждены в Министерстве здравоохранения СССР в 1983 г.
■ Как явствует из названия данный препарат мог бьиь использован только дня научно-исследовательских и диагностических целей. В частности препарат использовался для исследований строения и свойств ЦП. В основном препарат Предлагалось применять в целях стандартизации определений содержания ЦП в крови в клинической лабораторной практике. Препарат может быть использован :
1. для диагностики и прогноза болезни Вильсона (гепатолентикулярной дегенерации), болезни Менкеса и других синдромов со снижением активности ЦП в крови, а также при отравлениях метиловым спиртом;
2. для анализа изменений активности ЦП при различных видах острофазной патологии;
3. для оценки степени тяжести стрессовых состояний, вызванных травмами или другими причинами, так как активность ЦП при этих состояниях в условиях адекватной реакции должна возрастать;
4. дня контроля за применением транквилизаторов и ангидепрессантов в неврологической и психиафической практике, поскольку ЦП, выполняя функции оксидазы биогенных аминов, регулирует уровень серотоннна и норадреналипа в крови и в мозгу.
Кроме того препарат ЦП может использовался в качестве стандартного при различного рода физико-химических исследованиях белков благодаря тому, что физико-химические параметры ЦП надежно установлены: молекулярная масса зрелого холо-белка составляет- 132 кД, известны молекулярные массы продуктов спонтанного ограниченного протеолиза, константа седиментации равняется 7,3 ед. Сведберга, коэффициент диффузии - 4.5 х И) 7 см:/сек, нзоэлектрическая точка - 4,4, характеристическая вязкость - 4,5 мл/г, общее число аминокислотных остатков - 1046, число остатков маннозы, галактозы, фукозы и сналовых кислот - соответственно 14, 12, 2 и 9.
В последнее время появляется все больше данных в пользу возможности применения ЦП в качестве лечебного средства при различных заболеваниях. В частности было показано, что ЦГ1 оказывает протнвовоспалнтельное действие. Весьма благоприятный лечебный ЦП эффект быт продемонстрирован японскими исследователями. Па обширном клиническом материале ( суммированы результаты обследований в 24 лечебных учреждениях) было показано, что введение препаратов ЦП в значительном числе случаев (56,2%) способствует улучшению клинического течения »пластической анемии.
Выявленное гемоиоэтическое действие ЦП может оказывать благоприятный эффект при других видах патологии, в частности при лучевых поражениях, например, при анемиях в результате радиационной терапии опухолей. Помимо гемопоэтнческой функции ЦП обладает способностью стимулировать атногенез. Необходимость в плскуляризацни может проявляться в любых ситуациях, когда требуется формирование анасгамозов. например, при стенозах основных органных сосудов.
Недавно появилось сообщение о позитивном лечебном эффекте ЦП при ишемической болезни сердца, что как раз п может быть связано с ангиогеииым действием белка. Описаны случаи мутаций собственно в гене ЦП. которые обусловливают резкое снижение содержания и акшвности ЦП п плазме крови и клинически проявляются в виде различных неврологических расстройств, а гистологически в виде гемоендероза главным образом в клетках мозга, печени и поджелудочной железы. С
у чего м вышесказанного имеется достаточно оснований говорить о возможности коррекции некоторых патологических состояний, сопровождающихся функциональным дефицитом ЦП, препаратами этого белка.
Принимая во внимание вышеуказанные физиологические функции ЦП, в частности в условиях нарушений обмена меди, а также клинические наблюдения корреляций между уровнем активности ЦП в плазме крови и прогнозом было весьма привлекательно на базе диагностического препарата ЦП разработать лекарственное средство, обладающее полезными фармакологическими свойствами.
В процессе этих исследований изначальная схема получения ЦП из отходов производства сывороточных белков была несколько модифицирована. По модифицированной технологии из 50 кг бросовых Ьсадков удается извлекать до 100 г очищенного ЦП, который по своим показателям превосходит аналогичные препараты, полученные иными способами. Получаемые нами препараты ЦП не содержат пирогенных примесей и характеризуются 95 - 97% чистотой по результатам ^лектрофоретического анализа.
Как известно для предложения какого-либо вещества в качестве лечебного средства необходимы специальные испытания, подтверждающие фармакологическую эффективность препарата и его относительную безвредность для человека в терапевтических дозировках. В связи с этим были произведены испытания препарата ЦП. "
В литературе имеются сведения, что ЦП обладает радиопротекторным действием. Поэтому нами была предпринята попытка выяснить, насколько наши препараты ЦП эфективны при лучевых поражениях у экспериментальных животных. В качестве тест-системы была использована модель лучевой болезни у мышей в условиях летальной и сублегальной доз облучения. Предварительные эксперименты показали, что ЦП радиопротскторным эффектом не обладает. Введение ЦГ1 в различных дозировках не защищает животных от последующего облучения.
В связи с этим было исследовано влияние ЦП на картину крови и выживаемость мышей после облучения. Для этого животных облучали летальной (7 Грей) или сублетальной (6 Грей) дозами и вводили ЦП в различных дозировках через определенные промежутки времени после воздействия.
При эюм каждая из групп включала следующие .подгруппы:
1. контрольная подгруппа (интактные животные);.
2. контрольная подгруппа (животные без облучения, введение ЦГ1 на I и 3 сутки после начала Эксперимента);
3. контрольная подгруппа (облучение без введения 1ДГ1);
■ 4. опытная подгруппа (введение ЦП через 4 часа и на I и 3 сутки после облучения); • "' .
5. опытная подгруппа (введение ЦП на I и 3 сутки после облучения);
(•>. опытная подгруппа ( введение ЦП на 1, 3 и 5 сутки после облучения).
Препарат ЦП вводился внутрибрюшннно в дозе 20 мг на животное весом 20 г. Учитывали ежедневную гибель животных и определяли число лейкоцитов в крови выживших животных через 1, 3,6, 10, 16 и 21 сутки после облучения. Для того, чтобы исключить влияние уменьшения числа животных за счет гибели от лучевой болезни на результаты определения числа лейкоцитов у выживших на момент анализа была применена специальная методика обработки данных. В данном случае обычные параметрические методики не могли быть применены и был использован непараметрический критерий ранговой корреляции. При этом все данные о количественном содержании лейкоцитов в крови животных в независимости от времени забора крови (1, 3, 6, 10, 16 или 21 сутки) распределялись по рангам, шпрота ранга соответствовала 995 лейкоцитам на 1 мм' крови. Такая широта рангов отвечала наивысшей репрезентативности полученных данных. Таких рангов для животных, получивших сублетальную или легальную дозы, оказалось по 27. включая ранг 0. Для обеих групп общим контролем служили необлученные животные, которым не вводился препарат ЦП или вводился на I и 3 сутки от начала эксперимента. Оказалось, что введение ЦП без облучения вызывает повышение числа лейкоцитов в крови мышей. Таким образом, двукратное введение ЦП необлучениым животным само но себе оказывало стимулирующее действие на гемопоэз. По-видимому, неспецнфическое действие самого вмешательства (внутритбрюшинное введение раствора ЦП) может быть исключено, так как аналогичное введение стерильного физиологического раствора подобным эффектом не обладает, а вводимые препараты ЦП тестировались на стерильность и отсутствие бактериальных пнрогенов.
Оказалось, что даже в случае летальной дозы облучения введение ЦП оказывает определенный эффект. Результаты анализов крови облученных животных без введения ЦП и на фоне введения препарата указывают на тенденцию повышения содержания лейкоцитов под влиянием ЦП. Отмечается также некоторое увеличение продолжительности переживания после облучения летальной дозой в условиях введения ЦП.
При сублегалыгой дозе облучения эффект от введет» ЦП имеет те же тенденции, что н при летальном воздействии. Однако, этот эффект значительно более выражен. Большая часть результатов анализов попадает в более высокие рант. В почти 50% случаев при введении ЦП отмечается нормализация картины крови. Животные с нормализованной картиной крови оставались живыми к концу срока эксперимента (21 сутки) и не обнаруживали признаков ( вес, волосяной покров, поведение), которые отлнчалн бы их от контрольных необлученных особей. Также как и в первом случае наиболее эффективной оказалась схема введения препарата через 4 часа после облучения н далее на I и 3 суткн.
Таким образом, результаты проведенных экспериментов показывают, что ЦП, не обладая истинным радиопротекторным действием, способствует репарации пострадиационных повреждений. Благоприятное влияние на процессы репарации, но-виднмому, не ограничивается исправлением
картины белой крови. В связи с более эффективной нормализацией общего состояния животных на фоне введения ЦП можно предполагать его участие в различных репаративных процессах н в других тканях. Все эти данные указывают на возможности применения препаратов ЦП при радиационных поражениях, как дополнительное средство общестнмулирующего действия.
С учетом известных механизмов действия ЦГТ как фермента н транспортера меди препарат ЦП может найти применение в клинической практике, например, для защиты от повреждающего действия суперокендных радикалов (супсроксндднсмутазиая активность ЦП) в хирургической практике и при вирусных заболеваниях (например, при гриппе), для стимуляции каииллярогенеза, для нормализации нммунореактивцосги, для ускорения купирования воспалительных процессов, в частности для оптимизации заживления ран, н для других целей.
Возможности использования ЦП в клинической практике не только как диагностическою препарата, но и как лечебного средства, предопределили наш интерес к разработке; лечебного препарата ЦП. Полученный по усовершенствованной схеме белок был исследован частично по программе, предусмотренной Фармкомитетом. Па Сазе Института ядерной физики (СПИЯФ) была осуществлена экспериментальная проверка острой и подострой токсичности препарата ЦП человека на трех видах лабораторных животных (мыши, крысы и кролики). Однократное внутримышечное или внутривенное введение животным препарата в дозах до 40 мг на кг веса тела по крайней мере в течение двух недель наблюдении не вызывает нарушении общего состояния и поведения животных, а также изменении со ¡стороны кожных покровов, слизистых и внутренних органов. Патологоанатомические и гистологические исследования не выявляют каких-либо макроскопических или клеточных изменении. В местах введения препарата не обнаруживается локальных изменений тканей. При введении животным препарата ЦП ежедневно в теченн 8 суток (тест на подострую токсичность) в дозе 40 мг на кг веса тела также не выявляется каких либо физиологических нарушений или местных реакций. Легальных исходов не наблюдалось. , . , .
Общее состояние и поведение животных вплоть до 20 суток после последней инъекции ЦП не изменялось. Исследования органов и тканей через 4, 10 и 20 суток после прекращения введения препарата не выявили как,т;х-либо специфических повреждений. Токсическою и кумулятивного действия обнаружено не было. Одним из важных показателей, которые необходимо учитывать при лечебном применении препаратов в клинической практике, является их способность оказывать влияние на эмбриогенез. ИдучрщеэмбриотоксПческого действия предлагаемого в качестве лечебного средства препарата ЦП человека проводилось в соответствии с "Методическими указаниями по, изучению эмбриотоксического дейепшя фармакологических веществ и влияния их на репродуктивную функцию", утвержденными МЗ СССР 14 марта 1986 г.
Исследованию подвергались серии препарата ЦП человека, полученного на базе предприятия по производству бактерийных препаратов НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера согласно временной нормативно-технической документации. В качестве модельных животных использовали беспородных белых крыс (самок). Так как препарат ЦП предлагается в качестве инъекционного, вещество вводилось беременным животным внутрибрюшинно на физиологическом растворе в дозах, соответствующих терапевтическим (10 мг белка на кг веса тела) и в дозах, превышающих терапевтическую в 10 раз (100 мг белка на кг веса тела).
Препарат вводили соответственно четырем группам животных в следующие сроки от начала беременности: 1 - 5 сутки, 6-10 сутки, 11-15 сутки и 16 - 19 сутки. Крысам контрольной группы в те же сроки вводили физиологический раствор, который использовался в качестве растворителя для ЦП на стадиях приготовления препарата. Результаты экспериментов оценивали на 20 сутки беременности. Показателями эмбрпотокснчностн служили: предимплантационная гибель ( разность между числом мест имплантации в матке и числом желтых тел в яичниках), постнмплантационная гибель (разность между числом живых плодов и числом мест имплантации), средняя масса плодов, наличие у плодов внешних морфологических аномалии (наружный осмотр под бинокулярной луппой), наличие аномалий внутренних органов (фиксация половины плодов каждого помета в жидкости Нуэна с последующим анализом плодов по методике Вильсона в модификации Отдела эмбриологии НИИЭМ), наличие аномалий скелетной системы (фиксация половины плодов каждого помета в 96" этаноле с последующим просветлением и окрашиванием ализарином но методике Доусона в модификации Отдела эмбриологии НИИЭМ). За единицу наблюдения принимался помет, то есть результаты анализа после вскрытия одной беременной самки. Статистическую обработку результатов осуществляли с использованием обработку результатов осуществляли с использованием критерия Вилкоксона-Манн-Витней.
Анализ результатов влияния ЦП в различных дозировках на эмбриогегнез у крыс показал, что
1. При введении ЦП человека на сроках беременности с 1 по 6 и с 16 по 19 сутки в терапевтической дозе (10 мг/кг) на 20 сутки беременности вес плодов достоверно увеличивается по сравнению с контролем. При введении ЦП на сроках с 6 по 10 и с 11 по 15 сутки в десятикратной дозе вес плодов достоверно спижается.
2. В фуппе животных, коюрым инъецировался ЦП в десятикратной дозе, заметно повышена предимплантационная смертность. Однако, это повышение характерно для всех четырех групп, получавших ЦП в разные сроки беременности, в том числе и после имплантации. В связи с этим скорее всего эти отличия обусловлены превходящими факторами, а не действием ЦП-
3. Постимпламтацпонная смертность по сравнению с контрольной группой достоверно увеличена в группе крыс, которым препарат вводился на 16 - 19
сутки в независимости от дозы. Однако, этот показатель не превышает показателя спонтанной внутриутробной гибели плодов для обобщенного (исторического) контроля. Кроме того гибель плодов скорее всего происходила до введения ЦП.
4. Внешне различимые уродства развития обнаружены в трех случаях. Эмбрион с редукцией хвоста выявлен в помете крысы, которой ЦП вводился с 1 по 5 сутки беременности в терапевтической дозе. Эмбрион с анофтальмиен и кожным выступом на голове выявлен в помете крысы, котрой вводился препарат в десятикратной дозе с 1 по 5 сутки беременности. Эмбрион со сращением фаланг пальцев и отеком левой задней конечности обнаружен в помете крысы, которой вводился ЦП в десятикратной дозе с 11 по 15 сутки.
5. Независимо от дозировки препарата и сроков введения у незначительной части эмбрионов обнаружены повреждения внутренних органов, в частности - одно- и двухсторонний гидронефроз.
6. Патология развития костной системы (наличие дополнительного ребра) обнаружена у одного эмбриона в помете крыпл, которой вводился препарат с 1 по 5 сутки в десятикратной дозе. Кроме того у эмбрионов крыс, которым вводился ЦП в десятикратной дозе, выявлены признаки отставания в окостенении костей конечиостсй( уменьшение числа центров окостенения костей пястья и плюсны). Два эмбриона с гиперплазией г рудины выявлены в помете крыс, которым вводился препарат в терапевтической дозе.
Выявленные нарушения развития наружных и внутренних органов, а также скелета по частоте достоверно не отличаются от контрольных цифр, однако, вся совокупность представленных данных указывает на возможное слабое эмбриотоксическое действие препарата ЦП человека при введении беременным крысам в независимости от дозы.
С целью выяснения возможности усугубления эмбриотоксического действия ЦП при совместном введении с веществами, обладающими выраженным тератогенным действием, было исследовано влияние ЦГ1 человека на эффект от введения тератогенных доз салицнлата и бнпиридпла. Салицилат вводился в дозе 600 мг на кг массы тела, биппрндил - в дозе 40 мг на кг массы тела соответственно в критические для данных тера гогенов сроки беременности (салицилат - на 10 сутки, бппирндил - на 14 сутки). ЦП в терапевтической дозе (10 мг/кг) вводился соответственно на 8, 9 и 10 сутки (салицилат) и на 12, 13 и 14 сутки (бнпнридил). Оказалось, что ЦП не потенцирует тератогенное действие бипиридила и салицнлата. В то же время в обоих случаях имеется тенденция к снижению эмбриотоксического действия этих веществ по всем показателям. Для числа погибших до рождения зародышей выявлен достоверный ( р < 0,05) положительный эффект от введения ЦП. Таким образом, помимо слабо выраженного эмбриотоксического влияния ЦП оказывает противоположный эффект при совместном воздействии с некоторыми достаточно сильными тератогенами (салицилат, бипиридил). Исследование свойст полученных в промыпшениых
условиях препаратов ЦП показывает их пригодность для использования в лечебных целях.
1.5. Разработка способа аффинном хромаioip-лфии иерулоилазмина. Для выделения и очистки ЦП в течение длительного времени мы применили традиционные способы хромают рафии. Для увеличения выхода продукта и сокращения временных затрат весьма перспективной являлась разработка методов аффинной очистки ЦП. До 1985 г. сведении о аффинном способе выделения ЦП не имелось.
При разработке способа аффинной хроматографии ЦП предполаталось в качестве лнгапда использовать неприроднып субстрат -11ФДЛ (||-феиплепдиам1Ш), к-отрый эффективно окисляется ферментом и содержит функционально акшвные труппнровкн для связывания с матрицей носителя. Известно, чго ЦП образует с ПФДД фермент-субстратный комплекс, который при оптимальных условиях характеризуется Кт равной 300 мкМ. Эта величина К,„ позволяла предполагать, с одной стороны, достаточно прочное удержание фермента на пост еле, а, с другой стороны, возможность мяткото отделения белка от носителя при десорбции. Блокирование одной из аминогрупп субстрата в ходе иммобилизации предполагало снижение способности ПФДД к окислению с образованием окрашенных продуктов. Для обеспечения доступности лнгапда в отношении активною центра ЦП между матрицей носителя и лагаидом предлагалось сиптешровать снейсер на основе гексамсшлендиамнна и янтарного ангидрида или с-аминоканроновон кислоты. Эти спенсеры обеспечивают удаление лит аила от матрицы на расстояние в 20 А .В качестве матрицы был псполыован коммерческий атарозный тель - Сефароза 4В. Синтез специфических носителей включал активацию Сефарозы 4В бромциаиом и иос тедутошее присоединение спенсеров и специфического лигаида. Вместо ПФДД использовали также другой лиганд - нара-мегокснаналин. При этом все стадии синтеза сорбента осуществляли сходным образом. Емкость сорбетна (чисто функциональных групп ira единицу объема влажного геля) аиа ипироиали па всех с.алиях спгпеза.
Покатано, чю емкость сорбента, определенная на основании числа реакциопноспособиых ipyrin, снижается но мере присоединения спенсеров п лигандов. Конечная емкость по концевым аминогруппам составляет 7 - 10 мкМ/ мл тетя, а по ЦП 0.2 - 0.3 мкМ/ мл сорбента, что объясняется стернческой нелосгуииосгыо части лигаида для активных центров белка. Kj при pl I 5.5 ятя связывания лигаида в составе носителя с ЦГ1 составляет 280 мкМ. чго хорошо соответствует параметрам взаимодействия фермента и субстрата в волной фаге.
Обычно активность ЦП но его способности окислять ПФДД определяется при рП 5.5 в 0.4 M N-апетатиом буфере. Однако, при этой концентрации соли ЦП не сорбируется на иммобилизованном ПФДД. С'вятывание белка с сорбентом имеет место при снижении концентрации эуферпот о раствора до 0.05 М. Связывание усиливается также при снижении
значения рН, но, как известно, понижение рН способствует удалению ионов меди из молекулы ЦП. Поэтому все процедуры по сорбции и десорбции ЦП осуществлялись при рН не ниже 5,5.
Для извлечения ЦП из сыворотки крови человека исходный материал после удаления форменных элементов и сгустка фибрина подвергали диализу против 0,05 М ^-ацетатного буфера, рН 5,5. Колонку с сорбентом предварительно тщательно отмывали тем же буфером. 1»ыло показано, что при фильтрации подготовленной сыворотки через сорбент в колонке в несорбируемом материале ЦП отсутствует, то есть весь ЦП достаточно прочно связывается с носителем. Последующее отмывание колонки исходным буфером также не сопровождается десорбцией ЦП, но способствует удалению балластных белков. Часть более прочно сорбированных за счет гидрофобных взаимодействий балластных белков вымывается при фильтрации через колонку исходного буфера, содержащего 10% димстилформамида. При этом дополнительно удаляется около 3% балластных белков. Удерживаемый на сорбенте ЦП извлекается при помощи 0,05 М №-ацетатного буфера, содержащего 0,3 М КС1.
Попытки избирательной десорбции ЦП при помощи аналогов субстрата ( бензамиднн, пара-метоксианилнн) не привели к желаемому результату. В то же время было показано, что сорбент с иммобилизованным пара-метоксианилином способен избирательно связывать ЦП. По параметрам сорбции и десорбции ЦП этот носитель почти полностью аналогичен сорбенту с иммобилизованным ПФДА.
Известно, что в исходной сыворотке крови человека содержится 0,3 -0,5% ЦП в пересчете на общий белок. После единичной стадии сорбции и десорбции на предложенных носителях в получаемом материале содержание ЦП составляет 80 - 85%. Таким образом за одну стадию аффинной .хроматографии удается добиться очистки в 200 - 250 раз. Выход ЦП по активности достигает 80%.
Таким образом, синтезированные носители на основе Ссфарозы, содержащие в качестве лнгандов ПФДА или пара-мегокснанилпн. обладают специфическим сродством к ЦП и могут быть использованы для выделения • этого белка с минимальными потерями. Дополнительная очистка может быть осуществлена методами традиционной хроматографии. Аффинные сорбенты впоследствии были с успехом использованы для выделения аномальных форм ЦП из своротки крови больных болезнью Вильсона.
После разработки аффинных сорбентов, пригодных для использования в . лабораторных : условиях, были предприняты • попытки создания высокоирочнь1х аналогичных сорбентов на. основе пористого стекла, которые в с'илу своих свойств оптимальны для производственных целен. В предложенном нами способе пористое стекло обрабатывали раствором дёкстрана н далее высушивали, после чего проводили активацию бромциан^м в водном рдстворе диоксаиа. В 50 - 60% диоксане деке гран не растворяется, а только набухает, в результате чего активация происходи! при, высокой, фокальной концентрации (более 1 N1) вещества на поверхности
стекла. При такой концентрации имеет место многоточечное поперечное сшивание декстраиа с образованием протяженных полимерных пленок, которые прочно удерживаются в порах стеклянных гранул и которые легко модифицируются спенсерами и лигандамн. Все это в комплексе с благоприятными свойствами пористого стекла обеспечивает необходимую для сорбентов многократного действия прочность полимерного защитного покрытия. Емкость полученного сорбента (лиганд - ПФДА) по концевым аминогруппам составила 19 мкМ/мл, по ЦП - 0,01 мкМ/ мл. Синтезированные биоспецнфические сорбенты могут найти применение в ходе аналитических исследований ЦП человека и животных, а также для практических целей.
II. Недостаточность а 1-антитрипсииа у человека
Данный раздел работы посвящен изучению функциональных дефицитов другого острофазного белка плазмы крови человека - а1-/\Т. Особый ишерес к этому защитному белку стал проявляться после того, как в 1963 году 1.аиге!1 и Нпкяхоп описали случай семейного дефицита а1-ЛТ, сопровождавшегося поражением легких с ранним развитием эмфиземы. В последующем факт поражения легочной ткани при дефицитах а1-ЛТ был подтвержден в многочисленных работах. Дефицит антппротсазы на фоне хронических воспалительных заболеваний легких приводит к деградации эластпнового каркаса легких за счет безконтрольного действия эластазы лейкоцшарного происхождения, что сопровождается развитием ранних тяжелых эмфизем. Курение в значительной степени способствует манифестации заболевания. В задачи наших исследований входило: разработка способов выделения и количественного тестирования а!-АТ, идентификация фенотипов, выявление дефицитов и редких вариантов белка, а также обнаружение корреляций между фенотипом а1-АТ и особенностями па голо! пи.
Для диагностики функциональных дефицитов а1-АТ в первую очередь требовалось получить очищенные препараты белка и специфические ангшета к нему. Необходимость получения антител диктовалась целесообразностью одновременного определения антитриптической активности сыворотки крови больных и содержания иммунореактнвного а1-АТ. Такое исследование позволяло точнее оценить ингибиторную 'способность сывортки крови при различных патологических состояниях. В процессе очистки ишибптора был разработан способ выделения а1-АТ, включающий хроматог рафнческую стадию, которая позволяет в одну стадию отделять целевой продукт от сывороточного альбумина и иммуноглобулинов. Очищенные препараты а1-АТ тестировались по всом параметрам, известным для данного белка. Было показано, получаемые нами препараты а1-АТ являются высокоочнщеннымн н пригодны для иммунизации.- ' .
С целью изучения распространенности функциональных дефицитов а1-АТ и выявления гомо- и гетерозиготных носителей патологических аллелей гена а1-АТ производились серийные определения антнтрнптнческой активности образцов сыворотки крови здоровых доноров и больных с легочной патологией. Одновременно определяли содержание иммунореактнвного а1-АТ методом ракетного иммуноэлектрофореза.
Трипсин-ингнбнрующую способность сыворотки (ТИСС) крови определяли по величине ннгнбировання активности трипсина, используя в качестве субстрата Ы-бензопл-О.Ь-аргннин-паранитроаннлнд. Истинную концентрацию а1-АТ в образцах крови определяли методом иммуноэлектрофореза в 1% агарозе. Всего было обследовано 110 образцов сыворотки крови здоровых доноров и 666 образцов сыворотки больных с хроническими неспецифнческнмн заболеваниями легких. Возраст больных колебался от 16 до 60 лег. Подавляющее число обследованных (82%) составляли лица моложе 50 лет. Длительность заболевания варннровала от 1 года до 18 лет.
Результаты иследования концентрации а1-АТ и величины ТИСС в образцах сыворотки крови доноров показали, что эти величины составляют соответственно 3,60 ± 0,1 г/л и 1,15 ± 0,01. Сразу же обращает на себя внимание, что уровень содержания иммунореактнвного а1-АТ по нашим данным несколько выше (3,60 г/л), чем следует из литературных источников (2 - 2,5 г/л). Предположительно, это связано с тем, что при иммунологических исследованиях выявляется весь нммунореактивный белок независимо от его антнпротеазной активности, включая частично инактивированный и комцлекснрованный с протеазами. В то же время при определении активности (ТИСС) оценивается содержание только активного белка. Косвенным подтверждением этого предположения являются полученные нами величины для сывороток крови здоровых доноров. Эти величины не выходят за рамки нормы, принятой в литературе при использовании в качестве субстрата трипсина 1^-бензоил-В,Ь-аргиннн-паранитроанилида.
В таблице 7 приведены результаты определения величины ТИСС и концентрации иммунореактнвного а!-АТ у больных с различными заболеваниями легких. В таблице Представлены результаты обследования 217 больных с различной, легочной патологией, для которых вероятность дефицита а1-АТ наиболее высока. Как видно, особенно велик риск для больных с хроническими легочными заболеваниями, которые сопровождаются обструкцией. Эта группа представлена 135 больными, из которых у 78 обнаружено снижение ТИСС. В приведенной таблице изменение величин ТИСС И содержания иммунореактнвного белка составляет не менее 20 - 40%. При острых воспалительных заболеваниях легких содержание а1-АТ, как и следовало ожидать, у всех обследованных повышено. Из таблицы также видно, что величина ТИСС является более чувствительным тестом, чем тест на содержание иммунореактнвного белка.
Таблица 7.
Сол'ржаиие иммунореактнвного а1-Л Г и величины ТИСС у больных с легочной патологией.
ДИЛШО) Число обследованных Содержание а!-ЛТ ТИСС
110ш1ж. ("/.) иовыш. (%•) пониж. (%) п0выш.(%)
Хроничсскнс обегрукгивные заболевания легких 135 15(11%) 106(79%) 78 (58%) 34(21%)
хронические нсснецифическис заболевания легких бс] острукини 66 4(6%.) 57 (86%) 25(38%) 13 (20%)
Острые воспалительные заболевания легких 16 16(100%) 16 (100%)
о
<0
Таким образом, при обструктивмом' компоненте очень часто имеет место функциональный дефицит антнпротеазной активности сыворотки крови. Необходимо учитывать, что концентрация а1-АТ, который является белком острой фазы, при воспалительных заболеваниях должна возрастать. Поэтому факты обнаружения снижения содержания этого белка говорят о явном недостатке синтеза в условиях воспаления. В таблице 8 приведено распределение случаев дефицита а1-АТ у больных с разными нозологическими формами легочной патологии. Из таблицы видно, что снижение активности и содержания а1-А'Г обнаруживается достаточно часто. Всего выявлено 68 случаев снижения этих показателей (частота 0,102). У 40 обследованных отмечено умеренное снижение содержания а1-АТ, у 28 больных - выраженное снижение. В контрольной группе из 40 доноров частота умеренного дефицита достоверно не отличается от частоты среди больных. Однако, в контрольной группе ни в одном случае не выявлен выраженный дефицит ингибитора. С другой стороны, выраженный дефицит а1-АТ имеет место в группах больных с хроническими заболеваниями легких, осложненных признаками обструкции, а также при смешанной форме бронхиальной астмы и при спонтанном пневмотораксе. По-взщимому, выраженный дефицит ингибитора способствует формированию стойких обструктивных нарушений. Хотя, и не исключено, что обстуктнвный синдром вторично сказывается на содержании активного а1-АТ в сыворотке крови. При сравнительном анализе группы больных хроническим бронхитом и бронхиальной астмой с явлениями дефицита а1-АТ и группы больных теми же заболеваниями, но без дефицита ингибитора обнаружилось, что при дефиците а1-АТ достоверно чаще имеют место выраженные и резко выраженные нарушения вентиляции ( р < 0,05), в то время как катаральный эндобронхит чаще встречается в группе без дефицита ннгибитора( р < 0,05). Таким образом, создается впечатление,.что дефицит а1-АТ способствует прогресснрованию обструктивных нарушений у больных с умеренными воспалительными изменениями в бронхиальном древе. Как и следовало ожидать, наиболее часто дефицит а!-АТ имеет место при первичной эмфиземе легких. В этих случаях у больных обнаруживались либо Ъ, либо Б варианты белка.
Как уже отмечалось а!-АТ является типичным представителем группы белков, характеризующихся выраженным полиморфизмом. Множественные формы этого белка представляют собою продукты аллельных генов, которые к тому же по разному модифицируются в ходе посттрансляционного созревания. В результате этого существуют, как минимум, 3 часто встречающихся нормальных варианта М (М1, М2 и МЗ). Эти варианты в свою очередь представлены характерными сериями компонентов, разделяющихся при изоэлёктричесом фокусировании. Поэтому только этот методический, прием позволяет изучить распределение частых и редких генетических вариантов белка у здоровых доноров и у больных с различными заболеваниями. В связи с тем, что в литературе неоднократно
Таблица 8.
Частота встречаемости дефицита а!-АТ у больных с легочной патологией
.шаша! ЧИСЛО ООС1С- ловашплх .1сф|П01га1-АТ обтсс число сл>часв лсфтшга
1 \ мсре1пц.ш вмралсшпш
абсо.1Ю1. чнс ю 0111. час гота абсолют, число от. частота аисо.иог число ото. частота
рспс.ашнрчонши броимк 72 2 0.02Х 1 0,0139 3 0,042
\pomi4CCklUi 1КОЙСф\* П1ВИ1.Ш прети ■ 11 3 0.')ЗЧ - .> 0,039
чрошпи-смш 011Сф\*"П1ВШ.Ш иронии 137 9 0.066 7 0,051 16 0,117
opoiisiia.ii.iua асша: смешанная ннфскнлонно-зависнчая 139 60 15 0,10» 4 0,029 19 0,137
6рои\01К|ап1чсскач 6о ¡¿мы. 62 I 0.016 - . - 1 0,016
ММчОВНСШЦОЛ 42 1 0.024 - - 1 0,024
псрвшшач эчфтсча с лсфшопоч а! - АТ 16 1 0,063 15 0,94 16 1.0
псрвичмая омфнзеча с дсфшоном ш2-макро11об\.пша 11 - - - ■ - -
кнсгошая птрплазпа II 2 0,2 - - 2 0,2
,ф>111С наслслсхвашмс заболевания 1С1М1Х 27 3 0.103 ! 0,034 4 0,038
спонтанный пневмоторакс 12 0.250 - - 3 0,250
всего 666 40 0,060 2К 0,042 6К 0.102
ХОНфОП. * 40 1 0.025 - 1 0.025
'лосговсриосгь: у- = I.96. ( = I. р > 0.0?
Таблица 9.
Фенотипы а1-АТ у больных с различными формами неспецифических заболеваний легких
Диагноз число больных Фенотипы
М1М1 М1М2 М1МЗ МБ мг 5Б ЪЪ
Первичная эмфизема (дефицит а1-АТ) 14 1 2 И
Первичная эмфизема (дефицит а2-члкроглобулина) 11 11
Хронический обструктивный бронхит 136 101 16 3 4 15 7 -
Бронхиальная астма (смешанная) 85 70 - - 3 4 15 7
Синдром Зиверта-Картагенера 6 3 - - 1 2 - -
Кистозная гипоплазия И 9 - - 2 - - -
указывалось на взаимосвязь заболеваний легких с дефицитом «1-А Г, мы н своей работе изучали распределение вариантов в группах больных г различными поражениями дыхательной системы.
Распределение фенотипов а1-АТ в нашей выборке не отличается существенно от частот фенотипов этого белка среди населения других стран. Основную долю составляют варианты М. Наиболее частым вариантом является вариант М1. Частота встречаемости других вариантов находится в обычных пределах. Иная закономерность характерна для больных с различными поражениями дыхательной системы. В таблице 9 представлены результаты фснотипирования а1-АТ у групп больных с легочной патологией. Как видно из таблицы, в независимости от вида патологии наиболее частым фенотипом является М!М1. Однако, при выраженном обструктивном синдроме существенно возрастает вероятность обнаружения редких патологических вариантов Ъ и Б как в гомозиготном, так и в гетерозиготном состояниях. Как и следовало ожидать, фенотипы 77, и характерны для первичной эмфиземы легких с явлениями дефицита а1-Л'Г. В одном случае первичная эмфизема развилась у гетерозиготного носителя редкого патологического аллеля РК-. В анемнезе больного курение и част ые инфекционные заболевания. У 1! больных с первичной эмфиземой легких, этиологически связанной с дефицитом а2-макроглобулина, обнаружены только варианты МI.
Проведенные нами исследования показали, что в группе больных с хроническими обструктнвными заболеваниями количественный дефицит «1-АТ встречается существенно чаще, чем у больных с иными видами патологии легких. В патогенезе обструктнвных расстройств большую роль играют процессы деструктивного характера за счет неконтролируемого действия протеаз, в частности лейкоцитарной эластазы. При этих заболеваниях активность а!-А'Г снижена в 58% случаев, концентрация же этого белка уменьшена только в 12% случаев. Таким образом, обструктивные заболевания легких чаще всего протекают на фоне функционального дефицита а!-АТ. Необходимо также учитывать, что точками отсчета как концентрации, так и активности являются средние показатели для группы лиц без видимой патологии. Выброс протеаз в ходе воспалительных реакций должен усиливать секрецию а1-АТ. При обструктивном компоненте такого увеличения секреции скорее всего не достаточно для существенного возрастания антнпротеазной активности. При повышении содержания нммунореактивного а1-АТ у 79% обследованных возрастание активности выявлено только у 21%.
При необструктпвных хронических процессах число случаев функциональной недостаточности как абсолютной, так и относительной, существенно ниже. При острых воспалительных заболеваниях дыхательной системы в 100% случаев имеет место возрастание как содержания, так и активности а1-АТ. Таким образом, для этой группы соблюдается ожидаемое увеличение секреции ингибитора, как белка острой фазы.
Таким образом, что при воспалительных заболеваниях легких определение количественного содержания и активности а1-АТ может рекомендоваться в целях диагностики и прогнозирования течения заболевания. Оптимальным с клинической точки зрения было бы проведение заместительной терапии препаратами а1-АТ во всех случаях выявления функционального дефицита этого белка, в особенности при наличии обструкзивного компонента. К сожалению в настоящее время подобное лечение не осуществимо в силу недоступности соответствующих препаратов. Потребность в таких препаратах настолько велика, что перерабатываемое количество плазмы крови не в состоянии обеспечить получения требуемых доз препарата. В связи с этим весьма актуальным является разработка геноинженерпых подходов для производства рекомбинантного высокоактивного а1-АТ.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Как уже указывалось особый интерес к исследованиям свойств, структуры и обмена ЦП и а1-АТ появился после того, как выяснилась взаимосвязь дефицитов этих белков с развитием наследственных заболеваний. Многочисленные исследования позволили установить, что выраженный дефицит сс1-АТ, действительно, является чаще всего первично наследственным и обусловлен рецессивными аллелями соответствующего гена. В то же время дефициты ЦП при болезни Вильсона и болезни Менкеса носят вторичный характер. Только в самое последнее время с помощью молекулярно-генетических подходов удалось обнаружить гены, повреждаемые при болезни Вильсона и болезни Менкеса, и в общих чертах установить структуру и функциональную роль соответствующих белков. С учетом тех изменений обмена меди, которые наблюдаются при болезни Вильсона, вильсоновская АТФаза скорее всего обеспечивает транскуприрование по крайней мере в клетках печени и способствует включению меди в ЦП. При болезни Вильсона ионы меди в избытке аккумулируются в гепатоцитах. В какой-то степени начальные этапы обмена меди у больных напоминают эмбриональный обмен меди, .характеризующийся низким синтезом ЦП и накоплением ионов меди в печени.
В эмбриональный период имеет место положительный баланс меди, медь аккумулируется главным образом в гепатоцитах. ЦП матери обеспечивает за счет транскуприрующен системы плаценты доставку ионов меди в ткани эмбрионов. По-видимому, наблюдающееся увеличение концентрации ЦП в крови беременных отражает необходимость такого транспорта. В нормальных условиях поставляемого количества меди доста точно для биосинтеза медьсодержащих белков и для аккумулирования части ионов меди в виде митохондриокупреина. Нарушение процессов доставки ионов меди с ЦП, приводит к развитию медь-дефицитного состояния у плодов, что в конечном итоге не совместимо с жизнью. В период
эмбрионального развития не происходит выведения ионов меди из организма, как это имеет место во взрослом состоянии. В этот период и далее повреждение вильсоновской АТФазы не сказывается видимым образом на жизнеспособности организма. Заболевание обычно манифестирует на втором-третьсм десятилетии жизни. Таким образом, вильсоновская АТФаза не является абсолютно необходимым звеном в обмене меди. Проявление дефекта этой АТФазы скорее всего имеет моею при экстремальных состояниях, что подтверждается клиническими наблюдениями. Привходящие моменты, требующие усиленного синтеза ЦП или выведения меди, вызывают дисбаланс обмена меди. Примером таких дисбалансов могут быть различные висцеральные проявления болезни Вильсона до развития типичных внльсоновскнх симптомов, которые часто провоцируются экстремальными ситуациями (алиментарные причины, интеркуррентные заболевания). Необходимо отметить, что и типичные вильсоновские проявления часто манифестируют после стрессовых ситуаций.
Каковыми же на наш взгляд являются основные моменты молекулярного патогенеза болезни Вильсона и какова роль дефицита ЦП в развитии этого заболевания? Роль ЦГ1 в патогенезе болезни Вильсона невозможно понять, не имея четких представлений об участии данного белка в обмене меди. Ионы меди всасываются в тонком кишечнике и в виде комплексов с альбумином и пизкомолекулярными соединениями поступают в кровоток. При болезни Вильсона всасывание ионов меди не повреждено. В растущем организме баланс меди должен быть положительным, так как чаегь меди аккумулируется в растущих тканях. Кажется вероятным, что именно этот момент и играет роль фактора, сдерживающего манифестацию вильсоновской симптоматики до определенного возраста. У взрослых практически вся медь, поступающая в организм, должна выводиться. В норме почти вся медь экскрегпруется с желчью и только незначительная доля с мочой. При болезни Вильсона возрастает доля выводимой с мочой меди, Скорее всею усиленная почечная экскреция меди при болезни Вильсона связана с повышенной концентрацией нецерулоплазминовон меди в плазме крови. По причине низкой эффективности выведения меди через ночки, этот механизм не полностью обеспечивает удаление ионов меди из организма при заболевании. Таким образом, главным моментом в патогенезе болезни Вильсона является избыточное накопление меди в организме из-за повреждения механизмов выведения этого элемента. Нарушения обмена меди при болезни Вильсона наиболее отчетливо выявляются при исследовании судьбы радиоактивной меди после перорального введения. Эти нарушения указывают на блокаду реакций транскупрпрования в печени с торможением синтеза холоЦП.
Уже давно высказывалось предположение, что именно ЦП является фактором, обеспечивающим гомеостаз меди. Помимо межтканевой медь транспорт ной функции и ферментативных функций этот белок предотвращает перенасыщение организма медью. Для связывания всасываемою количества ионов меди (0,6 мг/суткн) как раз необходимо
такое количество ЦП, которое синтезируется за этот период времени. То есть, почти вся медь, • поступающая в кровоток из кишечника, должна встраиваться в ЦГ1. Косвенно роль ЦП в качестве фактора, обеспечивающего гомсостаз меди, подтверждается тем, что при возрастании до определенного предела поступления меди в организм имеет место усиление биосинтеза ЦП.
Уже давно установлено, что десиалирование ЦП приводит к тому, что белок начинает быстро поглощаться клетками печени за счет рецепторов, связывающих галактозильные остатки глнкопротеинов. Скорее всего, что десиалирование и поглощение клетками печени является главным, если не единственным, путем деструкции и выведения этого белка. В клетках печени ЦП, как и другие десиалированные гликопротеины подвергается деградации в лизосомальном аппарате. Лпзосомальная деградация ЦП осущест вляеться не полностью и медьсодержащий ЦП поступает в желчь, где он постоянно обнаруживается.
При болезни Вильсона нарушение биосинтеза ЦП приводит к повышению концентрации не связанной с этим белком доли ионов меди в крови, к усиленному нерегулируемому поглощению ионов меди клетками организма в том числе и клетками печени, к накоплению ионов меди в клетках печени, к вторичному подавлению синтеза ЦП за счет отравления нонами меди, и к развитию связанных с отравлением медью типичных вильсоновских симптомов. Таким образом, при болезни Вильсона дефицит ЦП не может быть скоррегирован введением препаратов этого белка, так как страдает не биосинтез как таковой, а механизм встраивания меди в ЦП и последующее выведение ионов меди в составе частично деградированного белка. Действительно, попытки лечения болезни Внльсона препаратами ЦП не имели успеха. В то же время терапия, направленная на выведение ионов меди из организма, при болезни Вильсона весьма эффективна. Комплексон пеницилламин, предложенный \Valshe (1956), до сих пор является главным препаратом в практике лечения этого заболевания. Пеницилламин способствует выведению избытка меди с мочой. Из всего вышесказанною следует, что при болезни Вильсона дефицит ЦП как таковой не является г лавным патогенетическим звеном, а отражает лишь нарушение биосинтеза этого белка за счет повреждения механизмов внутрниеченочного транскуприрования. Из этого не следует, что при других видах патологии не могут возникать условия функционального дефицита ЦГ1, играющие не последнюю роль в патогенезе заболеваний. В первую очередь такие дефициты могут иметь место при воспалительных процессах и, возможно, при беременности.
. Литературные данные и эксперименты на животных позволяют , с большой долей вероятности говорить о целесообразности использования препаратов ЦП для лечебных целей. В нашей работе уже отмечалось о создании технологии промышленного производства практически чистою ЦП. Препараты белка по нашим данным не обладаю! какой-либо токсичностью и могли бы быть применены для клинических цепей.
Если возможности применения препаратов ЦП в качестве лечебного средства все еще требует специальных исследований, то необходимость применения а1-АТ не вызывает сомнений. Этот препарат требуется в больших количествах для заместительной терапии при наследственных дефицитах данного белка. Помимо выраженного наследственного дефицита а!-АТ, весьма часто в частности при легочной патологии наблюдается относительный функциональный дефицит. который по нашим соображениям также требует заместительной терапии. Если при наследственных дефицитах весьма перспективно лечение, направленное на исправление генного статуса, то при относительных ненаследсгвенных функциональных дефицитах необходимо краткосрочное корригирование, которое может быть легко достигнуто на уровне соответствующего белка. Таким образом, ненаследствснные функциональные дефициты а1-АТ с успехом могут исправляться введением активных препаратов этого белка.
На протяжении всей представленной работы постоянно употреблялся термин "функциональный дефицит белка". Частично суть данного термина раскрывалась по ходу изложения материала. В завершение мы попытаемся представить рациональность применения термина в биохимической, генетической и клинической практике. Прежде всего следует учитывать, что функциональные дефициты могут носить наследственный пли ненаследственный характер. В нервом случае могут быть первичные (нарушение соответствующего гена) и вторичные (опосредованные) белковые дефициты. Патогенез заболевания определяется биохимической значимостью качественно или количественно измененного белка. При ненаследственных дефицитах чаше ьсего имеет место относительная недостаточность функциональной активности белка. При этом под недостаточностью следует понимать не количественное снижение белка но сравнению с усредненной нормой, а недостаточность его активности в конкретных условиях. Поэтому необходим пересмотр нормы количественного содержания белков в стрессовых ситуациях. Например, концентрация ЦП или а1-А'Г в норме при отсутствии патологических процессов составляет в среднем соответственно 30 и 300 мг%. При воспалительных процессах эти величины возрастают. Однако, даже при увеличении концентрации этих белков важен тот уровень, который достигается в условиях адекватной реакции организма. Если этот уровень не достигаемся, то следует говорить об относительном функциональном дефиците, который требует соответственно коррептрующих мер. Как абсолютный так и относительный функциональный дефицит может устраняться либо усилением синтеза соответствующего белка, либо введением препарата этого белка, либо повышением активности белка за счет лекарственных средств, либо путем преодолением метаболического узкою звена, контролируемого белком, либо, наконец, путем шунтирования метаболической реакции, осуществляемой данным белком. На практике все эти принципы используются, хотя и не всегда осознанно. По-видимому, пошнкновенпе относительных функциональных дефицитов - весьма
распространенное явление. Для выявления этих дефицитов необходимо тщательное исследование взаимосвязей между течением патологического процесса и изменением содержания определенных белков. Целью таких исследований является определения границ нормальной реакции организма на болезнетворный агент. В случаях выявления недостаточной реакции необходимы меры коррекции активности соответствующего белка. В настоящее время можно говорить о подобной коррекции в отношении белков осгрой фазы, хотя данный принцип может распространяться и на другие белковые системы. К сожалению, данный вопрос исследован лишь фрагментарно, н только при некоторых видах патологии заместительная коррегирующая терапия применяется. Очевидно, что в перспективе данный подход должен получить развитие, так как он предполагает терапию на уровне лимитирующих звеньев, определяющих течение заболевания. Наряду с устранением этиологического фактора преодоление функционального дефицита по нашему мнению должно способствовать более быстрой репарации повреждений.
ВЫВОДЫ
1. В сравнительном аспекте исследованы некоторые физико-химические свойства и структурные особенности ЦП человека в норме и при болезни Вильсона. Показано, что ферментатнвно активные медьсодержащие ЦП здорового человека и больных болезнью Вильсона структурно идентичны.
2. Выделен и охарактеризован ЦП экспериментального животного крысы. Выявлены функциональное сходство и выраженная структурная гомология ЦП крысы и человека.
3. Показано, что введение крысам солей серебра вызывает выраженное снижение оксидазной активности ЦП в плазме крови и приводит к изменениям биосинтеза этого белка.
4. Снижение содержания активного ЦП в плазме крови у животных, получающих соли серебра, не оказывает замегного влияния на физиологические отправления.
5. Введение крысам солей серебра в период беременности приводит к тотальной гибели потомства на эмбриональных стадиях или в первые сутки после рождения. ЦП человека оказывает выраженное коррегирующее действие на эмбриотокснч'еский эффект солей серебра. Эмбриотоксический эффект солей серебра обусловлен нарушением трансплацентарного переноса ионов меди, приводящем к резкому снижению концентрации меди в тканях эмбрионов и к снижению активности супероксиддисмутазы.
6. Разработан промышленный способ получения очищенных препаратов ЦП человека, которые могут быть использованы в качестве лечебных для заместительной терапии в условиях функциональных дефицитов данного белка. Изучены фармакологические и токсикологические свойства препарата ЦП. Показана безвредность препарата и его положительный эффект при пострадиационной репарации.
7. Синтезированы сорбенты и разработан способ аффинной хроматографии ЦП.
8. Проведено исследование активности и количественного содержания al-AT в плазме крови больных при воспалительных заболеваниях легких, а также фенотнпирование этого белка острой фазы здоровых доноров и больных с легочной патологией.
9. Обнаружены корреляции между содержанием активного al-AT в плазме крови и его фенотнпической формой, с одной стороны, и с особенностями проявления легочной патологии, с другой стороны.
10. На основании собственных результатов и данных литературы предложена схема обмена меди в норме и при патологии и показана функциональная роль ЦП. Предложена концепция патогенетического значения функциональных дефицитов белков и пути лечения заболеваний при помощи заместительной белковой терапии.
Основные работы, опубликованные по теме диссертации
1. Алейникова Т.Д., Васильев В.Б., Монахов U.K., Шавловский М.М. Синтез и секреция церулоплазмина изолированными гепатоцитамн крысы. Биохимия 1987, 52. 10, 1600 - 1607
2. Баранов B.C., Горбунова В.Н., Пучкова Л.В., Шварцман А.Л., Михайлов В.М., Шавловский М.М., Денежкпна В.В., Гайцхоки B.C. Особенности синтеза церулоплазмина в эмбриогенезе млекопитающих. 2. Желточный мешок как место первичной экспрессии гена церулоплазмина у крыс. Онтогенез 1986, 17, 1,37 - 46
3. Бондарчук А.Р., Вахарловский В.Г., Клиорин А.И., Мслючепа Л.А., Шавловский М.М., Яковкпна Э.О., Нсйфах С.А. Ранняя диагностика гепатолентикулярной дегенерации у детей. Вопр. охраны материнства и детства. 1975, 20, 12, 28 - 32
4. Василек U.M., Каюшина Р.Л., Куранова И.П., Мошков К.А., Шавловский М.М., Нсйфах С. А. Определение размеров и формы молекулы церулоплазмина человека методом рентгеновского малоуглового рассеяния. Биофизика, 1973, 18,6,972 -976
5. Василек U.M., Машкова Е.Т., Тетерина З.К., Рафальсон Д.П., Шавловский М.М., Нсйфах С.А. Генетические варианты церулоплазмина среди населения Ленинграда. Генетика 1974, 10, 12, 144 - 151
6. Василек U.M., Шавловский М.М., Муха Г.В. Физико-химические свойства и гетерогенность церулоплазмина белых крыс. Биохимия 1970, 35, 6, 1139 -1146
7. Васильев В.Б., Захарова Е.Т., Шавловский М.М. Анализ видовых различий радиоактивно меченных церулоплазмина и альбумина с помощью пептидных карт. Вопр. мед. химии 1983, 29, 3. 70 -74
8. Васильев В.Б., Шавловскин М.М., Нейфах С.Л., Прозоровский В.Н., Рашковецкий Л.Г. Внутримолекулярная гомология цсрулоплазмииа человека. Биоорг. химия 1979, 55, 7,10-45 • 1052
9. Вахарловский В.Г., Гайихоки B.C., Киселев О.И., Мошков К.А., Пучкова Л.В., Шавловскин М.М., Шульмаи В.Ш., Нейфах С.А. Генетический дефект синтеза церулонлазмнна в нолирнбосомах печени при болезни Вильсона-Коновалова. Докл. АН СССР 1975, 222, 3, 716 - 719
10. Вахарловский В.Г., Мошков К.А., Шавловскин М.М., Нейфах С.А. Клинический полиморфизм и варианты церулоплазмина при гепатолентикулярной дегенерации. Генетика 1977, 13,7, 1294 - 1304
11. Всрбина H.A., Власов Г.П., Глушенкова В.Р., Шавловскин М.М. Способ получения носителя для аффинной хроматографии. Авторское свидетельство № 1193859, 1985
12. Власов Г.П., Вербина И.А., Глушенкова В.Р., Шавловский М.М. Способ очистки церулоплазмина. Авторское свидетельство № 1007228, 1982
13. Гембицкая Т.Е., Монахов Н.К., Игнатьев В.А., Алейникова Т.Д., Шавловский М.М. Этиологическое значение наследственного дефицита al-ингнбитора иротеаз в формировании заболеваний органов дыхания. Терапевтический архив, 1989, 61, 3, 88 - 90
14. Дамашун Г., Дамашун X., Каюшнна Р.Л., Кробер Р., Мошков К.А., Мюллер И., Нейфах С.А., Пюршсм X., Шавловский М.М. Определение молекулярного веса церулоплазмина человека при помощи гидродинамических методов и рентгеновского малоуглового рассеяния. Биофизика 1976, 21,6, 965 - 969
15. Gaitskhoki V.S., Kiselev O.l., Moshkov К.A., Puchkova L.V., Shavlovski М.М., Shulman V.S., Vacharlovski V.G., Neifakh S.A. On the defect of synthesis ceruloplasmin in the liver polyribosomes in Wilson's disease. Biochcm. Genet. 1975,13,9/10,533 - 550
16. Зайцев B.H., МоШков K.A., Шавловский M.M., Нейфах С.А. Рентгенографическое изучение церулоплазмина человека и его модифицированных форм. Биоорг. химия 1975, 1,10, 1521 - 1527
17. Захарова Е.Т., Васильев В.Б., Горбунова В.Н., Шавловский М.М. Выделение и физико-химическая характеристика церулоплазмина крыс. Биохимия 1983, 48, 10, 1709 - 1719
18. Moshkov К.А., Shavlovski М.М., Zaitzev V.N., Neifakh S.A. Preliminary X-ray crystallographic and physico-chemical investigations of human ceruloplasmin. Int. J. Pept.Prot. Res. 1977, 9,, 187 - 192
19. Нейфах C.A., Васильев В.Б., Шавловский М.М. Строение, каталитические свойства и эволюция церулоплазмина и других голубых белков. Успехи биол. химии 1988, 28. 102 - 124
20. Нейфах С.А., Гайцхоки B.C., Климов H.A., Пучкова Л.В., Шавловский М.М., Шварцман А.Л. Выделение и трансляция частично очищенной мРНК, кодирующей церулоплазмин. ДАН СССР 1977,232,4,957 - 960
21. Ncifakh S.A., Gaitskhoki V.S.. Kiimov N.A., Puchkova L.V., Shavlovski M.M., Schwartwnan A.L. Isolation and partial purification of ccruloplasmin messenger RN'A from rat liver. Mol. Biol. Reports 1977, 3, 235 - 242
22. Нейфах С.Л., Шавловский M.M. Генетически обусловленные нарушения обмена меди при гепатолентнкулярной дегенерации, в кн. "Прогресс в медицинской генетике (гетерогенность наследственной патологии человека)" под ред.Н.П.Бочкова, Москва "Медицина" I978, 106- 150
23. Нейфах С.А., Шавловский М.М., Васидец И.М. Молекулярная гетерогенность церулоцлазмина человека, в сб. Биологическая роль микроэлементов и их применение в сельском хозяйстве и медицине. АН СССР. изд. "Наука", М. 1974, 331 - 387
24. Пржибмл Т., Алейникова Т.Д., Васильев В.Б., Монахов Н.К., Шавловский М.М. Свойства нерулоплазмнна крысы, содержащего серебро. Биохимия 1989, 54, 4, 601 - 609
25. Pribyl Т., Monakhov N.K., Vasilycv V.B., Shavlovsky М.М., Gorbunova V.N., Aleynikova T.D. Silver-containing ccruloplasmin without polyphenol oxidase activity in rat serum. Physiol, bohemoslov. 1982, 31,6, 569 • 571
26. Pro/orovski V.N., Rashkovetski L.G., Shavlovski M.M., Vasiliev V.B., Neifakh S.A. Evidence that human ccruloplasmin molecule consists of homologous parts. Int. J. Peptide Prot.Res. 1982, 19, 40 - 53
27. Шавловский M.M., Борисова О.П., Мошков К.А., Пастухова Е.А. Сырье для получения церулоплаэмина. Авторское свидетельство. № 734902, 1980
28. Шавловский М.М., Чеботарь П.А., Конописцева Л.А., Захарова Е.Т., Качурин A.M., Васильев В.Б., Гайцхоки B.C. Влияние церулоплаэмина на эмбриотокспческнй эффект ионов серебра. Биохимия 1994, 59, 8, 1164 - 1174
29. Shavlovsky М.М., Chcbotar N.A., Konopistseva L.A., Zakharova E.T., Kachourin A.M., Vassilicv V.B., Gaitshoki V.S. Embryotoxicity of silver ions is diminished bv ceruloplasmin - further evidence for its role in the transport of coper BioMctals 1995, 8, 122 -128
Типография ВНПИЖа; 3aK./£tf; Тнр.ЮО; 20.03.1966
-
Шавловский, Михаил Михайлович
-
доктора медицинских наук
-
Санкт-Петербург, 1996
-
ВАК 03.00.04
- Полиморфизм белков зерна и селекция озимых пшениц
- Вклад полиморфных вариантов генов-кандидатов сердечно-сосудистых заболеваний в фенотипическую изменчивость количественного содержания белков клеточных мембран при гипертонической болезни
- Феногенетическое исследование тканеспецифических белков у Drosophila melanogasfer
- Роль вирусных белков в патогенезе гриппозной инфекции
- Изучение особенностей функционирования генетического аппарата лимфоцитов человека и клеток лимфоидных линий на основе анализа белковых продуктов генной экспрессии
