Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетические и морфологические исследования криптических видов Copepoda континентальных вод России и сопредельных территорий

ВАК РФ 03.02.04, Зоология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетические и морфологические исследования криптических видов Copepoda континентальных вод России и сопредельных территорий"

На правах рукописи

СУХИХ Наталья Михайловна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ И МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ КРИПТИЧЕСКИХ ВИДОВ СОРЕРОЭА КОНТИНЕНТАЛЬНЫХ ВОД РОССИИ И СОПРЕДЕЛЬНЫХ ТЕРРИТОРИЙ

03.02.04— зоология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург - 2013

1 2 СЕН 21113

005533023

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Зоологическом институте Российской академии наук

Научный Алексеев Виктор Ростиславович,

руководитель: доктор биологических наук

Официальные Гранович Андрей Игоревич,

оппоненты: доктор биологических наук, профессор,

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Санкт-Петербургский государственный университет, заведующий кафедрой зоологии беспозвоночных

Котов Алексей Алексеевич, доктор биологических наук,

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН,

ведущий научный сотрудник лаборатории экологии водных сообществ и инвазий

Ведущая Федеральное государственное бюджетное учреждение

организация: науки институт биологии внутренних вод

им. И.Д. Папанина Российской академии наук

Защита диссертации состоится 23 октября 2013 г. в 14м часов на заседании диссертационного совета Д 002.223.02 на базе ФГБУН Зоологического института РАН по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., д.1, факс (812)328-29-41.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Зоологического института Российской академии наук

Автореферат разослан ^ сентября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук Сиделева Валентина Григорьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Свободноживущие Copepoda играют важную роль в водных экосистемах: служат пищей для многих гидробионтов и являются главными консументами I порядка в морях и пресных водоемах. Исследования таксономии и систематики многочисленных представителей этого отряда нередко позволяют выявить присутствие криптических видов в его составе [Frost, 1989; Ganz, Burton, 1995; Монченко, 2003 и др.].

Критические виды - это виды практически неразличимые по морфологическим признакам, но имеющие видовые различия на генетическом уровне. Неспособность идентифицировать биологически важные виды обуславливает неправильные оценки состояния биоресурсов и формирует ложные представления о механизмах образования и расселения видов. Проблемы ошибочного определения видов Copepoda в результате могут стать проблемами экологического мониторинга, биологического контроля, предупреждения и лечения заболеваний, переносимых данными ракообразными. Неверное определение биологически важных видов затрудняет их изучение, культивирование или использование [Rnowlton, 1993].

Важный вопрос, неразрывно связанный с критическими видами - вселение чужеродных видов. Так называемые криптические инвазии [Geller et al., 2009] (вселение видов - двойников), как и любые другие инвазии, могут вызвать изменения в функционировании экосистем и их продуктивности, а, в конечном счете, имеют важные последствия для биоразнообразия, биогеографии, природоохранной деятельности и рыбного хозяйства [Lee, 2000; Lee, Frost, 2002; Gelembiuk et al., 2006]. Примером такой «ползучей» (неидентифицированной) инвазии является вселение в Балтийское море Eurytemora carolleeae Alekseev et Souissi, 2011, североамериканского вида, ранее не отличаемого от нативной для Балтики Е. affinis [Sukhikh et al., 2013; Сухих и др., 2009].

Степень разработанности темы исследования

Для исследований в рамках трех основных подотрядов копепод были выбраны три надвидовых группировки, ранее известные как валидные виды: Eurytemora affinis (Poppe, 1880), Eucyclops serrulatus (Fischer, 1851) и Canthocamptus staphylinus (Jurine, 1820). Для всех этих видов отмечали широкое распространение (от голарктического до космополитного) и высокую морфологическую изменчивость, что могло указывать на присутствие в каждой группе криптических видов или подвидов. Для Е. affinis на момент начала исследований это предположение подкреплялось еще и географической изменчивостью по

молекулярно-генетическим признакам (участки генов 16SrRNA и COI) [Lee, 2000]. Все эти факты определили выбор объектов для данного исследования.

Цель и задачи работы

Целью настоящей работы было изучение роли критических видов Copepoda в биологическом разнообразии континентальных водоемов России и сопредельных территорий.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

• Оценить морфологическую изменчивость видов копепод Е. affinis, Е. serrulatus и С. staphylinus по принятым в систематике Copepoda признакам.

• Выявить новые морфологические признаки и изучить возможность их использования при описании и разделении морфологически близких форм внутри исследуемых таксонов.

• Оценить изменчивость у широко распространенных видов копепод Е. affinis, Е. serrulatus и С. staphylinus по молекулярно-генетическим признакам.

• Выявить и описать критические виды внутри исследуемых таксонов для фауны России и сопредельных территорий.

• Изучить исследуемые таксоны в связи с возможностью вселения родственных форм.

Научная новизна

Впервые проведены обширные исследования группы криптических видов копепод России и сопредельных территорий с использованием комплекса анализов (морфологического и генетического), описаны новые микроструктуры, выделены специфические для данных групп ранее не использованные морфологические признаки. Впервые получены данные по структуре участков генов цитохром оксидазы 1(С01) для исследуемых представителей подотрядов Calanoida, Cyclopoida и Harpacticoida, все последовательности депонированы в базах данных GenBank и BOLD. Выяснены филогенетические взаимоотношения внутри исследуемых групп. Основаны и переданы для хранения в федеральную коллекцию неотипы С. staphylinus и Е. affinis affinis, голотипы Eurytemora caspica Sukhikh et Alekseev, 2013, Eucyclops sp.n., E. affinis ssp.n.l и E. affinis ssp.n.2.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные данные являются вкладом в развитие как фундаментальной, так и прикладной зоологии. Описаны новые для науки виды и подвиды копепод. Расширены видовые списки фауны копепод России, США, Тайваня и ряда Европейских стран. Предложены новые ключи для их определения.

Созданы и помещены в федеральную коллекцию неотипы С. staphylinus и Е. afflnis afflnis, голотипы Е. caspica и Е. sp.n., Е. affinis ssp.n.l и Е. affinis ssp.n.2. Проведенное исследование внесло существенный вклад в понимание таксономической структуры сложных и давно изучаемых групп криптических видов Е. affinis, Е. serrulatus и С. staphylinus. Получены и помещены в международные базы данных GenBank и BOLD порядка 200 сиквенсов 14 видов копепод из разных мест обитания. Основные результаты настоящей работы являются базой для дальнейшего изучения видовых комплексов Copepoda. Разработаны новые морфологические признаки для выделения и диагностики криптических видов каждой из исследованных групп Copepoda. Результаты данной работы также могут быть использованы для моделирования последствий влияния видов-интродуцентов на водные экосистемы и в целом для исследования процессов интродукции видов. Полученные при работе над диссертацией материалы были использованы при выполнении российских и международных научных проектов: 2009, 2010 Грант правительства Санкт-Петербурга для студентов и аспирантов, 2010-2011 проект BIODISEINE Seine Aval (Франция), а также поддержаны грантами РФФИ: 2006-2008 двусторонний Российско-Тайваньский проект "Study on diapausing stage resistance for the elaboration of a new biotechnology to prevent the spreading of invasive species with ships' ballast waters and sediments", 2010-2011 Российско-Украинский проект "Study on biodiversity and cryptic speciation in aquatic organisms of Russia and Ukraine with barcode using". Материалы исследования были использованы при подготовке и чтении лекций для студентов-магистрантов на кафедре ихтиологии и гидробиологии СПбГУ по специальности гидробиология.

Методология и методы исследования

При проведении настоящей работы подбирались актуальные на данный момент методы, широко применяющиеся в таксономических исследованиях. К ним относятся: методы сбора материала и его первичной обработки (сбор, фиксация зоопланктона); определение материала; морфологические методы, связанные с приготовлением препаратов (ручное анатомирование под бинокуляром, анализ и измерение (при помощи окуляр-микрометра) принятых в ситематике данной группы таксономических признаков, а также поиск новых, ранее не использованных признаков); изготовление иллюстраций; проведение сравнительно-морфологического анализа организмов разных популяций исследуемых видовых комплексов; молекулярно-генетические методы, включающие выделение геномной ДНК, ПЦР, гель-электрофорез и секвенирование участков генов COI и 18S rRNA; выравнивание полученных последовательностей и построение филогенетических деревьев.

Положения, выносимые на защиту

• Виды Copepoda с широким ареалом часто представляют собой комплексы критических видов, для выявления которых необходимо проведение внутривидовых и внутриродовых ревизий.

• Выявление критических видов Copepoda должно основываться на использовании нескольких методов исследования (морфологических, молекулярных, гибридологических и др.).

Степень достоверности и апробация результатов

Результаты работы были представлены на Международном симпозиуме «Эстуарные системы: структура, функции и управление» (Калининград, 2007), Международной школе-конференции молодых ученых (Борок, 2007), Молодежной научной конференции «Экологические проблемы севера» (Архангельск, 2008), Международной конференции «Поведение зоопланктона, экология и аквакультура» (Килунг, Тайвань, 2009), Международном совещании «Влияние изменения климата на прибрежные экосистемы» (Булонь-сюр-Мер, Франция, 2010), Международном рабочем совещании и научной конференции "Исследование биоразнообразия и криптического видообразования у организмов водных экосистем России и Украины с применением баркодинга" (Санкт-Петербург, 2011), 11-ой Международной конференцией по Копеподам (Мерида, Мексика, 2011), 8-ом Международном научном конгрессе по Балтийскому морю (Санкт-Петербург, 2011), Научной конференции СПбГУ «Наш общий Финский залив» (Санкт-Петербург, 2012), Международной конференции «Актуальные проблемы планктологии» (Калининград, 2012), научном семинаре лаборатории пресноводной и экспериментальной гидробиологии (Зоологический институт РАН, Санкт-Петербург).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, из них 3 статьи в изданиях рекомендованных ВАК, 2 - в сборниках статей, 1 - в определителе зоопланктона и зообентоса пресных вод России и 8 - в материалах конференции.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, 5 глав (Литературный обзор, Материал и методы, Группа криптических видов Eurytemora affinis (Poppe), Группа критических видов Eucyclops serrulatus (Fischer), Внутривидовая неоднородность Canthocamptus staphylinus (Jurine)), 6 выводов и списка литературы. Работа изложена на 166 страницах, включает 16 таблиц, 48 рисунков. Библиографический список состоит из 140 источников, из которых 29 русскоязычных.

Благодарности

Автор выражает глубокую признательность научному руководителю В.Р. Алексееву за всестороннюю помощь и поддержку на всех этапах выполнения работы.

Автор благодарен сотрудникам лаборатории пресноводной и экспериментальной гидробиологии за всемерную помощь при подготовке этой работы, сотрудникам лаборатории молекулярно-генетической систематики ЗИН РАН за обучение и помощь в работе, сотрудникам лаборатории генетики растений Университета г. Лилля во Франции, где была выполнена значительная часть молекулярно-генетических исследований, Канадскому Центру Баркодинга (Институт Биоразнообразия в г. Онтарио, Канада) и биотехнологической компании "Бигль" за секвенирование части материала, а также К.Э. Ли (С.Е. Lee) (Университет Висконсина, США) за предоставленные сиквенсы и ценные замечания и A.A. Мовилу за помощь в дизайне праймеров для Е. affinis.

Автор признателен коллегам, помогавшим в сборе материала для данной работы: С.А. Малявину, E.H. Науменко, Л.В. Самчишиной, Е.Б. Фефиловой, С. Соуисси (S. Souissi) и Д.Л. Лайусу. Автор благодарен С. Соуисси (S. Souissi) за предоставленную возможность выполнить часть исследований в Университете г. Лилля, Д.Л. Лайусу за помощь в статистической обработке данных. Автор признателен С.Я. Цалолихину, Э.Н. Егоровой, Н.И. Абрамсон, А.Ю. Костыгову и В.А Лухтанову за ценные указания и советы.

Автор благодарит всех сотрудников кафедры ихтиологии и гидробиологии СПбГУ за теплую атмосферу во время обучения в университете и, особенно, за внимательное отношение к оформлению работы и ее устному представлению.

Автор выражает искреннюю признательность своей семье за понимание, безграничное терпение и всестороннюю поддержку, оказанную в процессе подготовки диссертации.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Обзор литературы представлен четырьмя разделами. Первый раздел посвящен возникновению и формированию понятия «критические виды», в нем описано многообразие терминов, используемых при обсуждении критических видов. Второй раздел посвящен анализу литературных источников по инвазиям криптических видов среди гидробионтов. Третий раздел включает обзор литературы по видам-двойникам среди Copepoda, методам их выявления и исследования. В последнем разделе обсуждается литература по видам, выбранным для изучения: Е. affinis, Е. serrulatus и С. staphylinus, и дается информация о

предшествующих таксономических, генетических и гибридологических исследованиях групп, выполненных другими авторами.

2 МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В работе использовался материал по Сорерос1а, собранный лично автором и хранящийся в личных и музейных коллекциях (Таблица 1). Фиксацию проб зоопланктона проводили 85% спиртом. Пробы обработаны стандартным методом с использованием бинокулярного микроскопа (МБС-1).

Таблица 1 - Места сбора материала для молекулярно-генетических* и морфологических исследований*. Материал без меток обработан обоими методами.

№ Страна, регион, место сбора Дата сбора Происхождение

ЕигуЧетога с/.

1 Россия, Балтийское море, Выборгский залив 09.2007, 08.2009 Н.М.Сухих

2 Россия, Балтийское море, Невская губа 08.2009- 08.2012 Н.М.Сухих

3 Россия, Балтийское море, Лужская губа 06. 2006-09.2011 Н.М.Сухих

4 Латвия, Балтийское море, г.Рига, Рижский залив 09.2008 В.Р. Алексеев

5 Финляндия, Балтийское море, г.Хельсинки, порт* 08. 2009 В.Р. Алексеев

6 Россия, Балтийское море, г.Балтийск, Вислинский залив 10. 2007 E.H. Науменко

7 Швеция, Балтийское море, г.Умео* 09.2010 Л.В. Самчишина

8 Германия, г.Росток, Морской порт* 07.2009 В.Р. Алексеев

9 Германия, г.Любек, р.Дессау * 07.2009 В.Р. Алексеев

10 Германия, г. Гамбург, эстуарий р.Эльба 03.2006 G. Winkler

11 Голландия, Г.Амстердам, каналы города* 08.2009 В.Р. Алексеев

12 Бельгия, Северное море, эстуарий р.Шельда* 08.2009 В.Р. Алексеев

13 Франция, Атл. побережье, эстуарий р. Сена 07.2010 В.Р. Алексеев

14 Франция, Атл. побережье, эстуарий р.Луара 07.2009 В.Р. Алексеев

15 Франция, Атл. побережье, эстуарий Жиронда 07.2009 В.Р. Алексеев

16 Франция, Париж, Булонский лес, пруд* 07.2010 В.Р. Алексеев

17 Испания, г.Севилья, р.Гвадалкивир 01.2009 В.Р. Алексеев

18 США, Атл. побережье, Чесапикский залив 04. 2008 S. Souissi

19 Каспийское море, северная часть 06.2011 КаспНИРХ

20 Россия, г.Астрахань, р.Волга* 08.2011 В.Р. Алексеев

Еисус1орз с/^еггиЫиз

21 Россия, г.Санкт-Петербург, Таврический парк, пруд 05.2010 В.Р. Алексеев

22 Россия, г.Стрельна, Орловский пруд 11.2010 Н.М. Сухих

23 Россия, Удмуртия, с.Курья, р. Уть * 07.2010 Н.М. Сухих

24 Украина, Одесская обл., Днестровский лиман 08.2010 Л.В. Самчишина

25 Украина, Закарпатская обл., с.Голубинное, пруд 08. 2010 Л.В. Самчишина

26 Франция, г.Париж, оз.Кретьель 04.2010 В.Р. Алексеев

27 Испания, г. Валенсия, р. Чука* 07.2009 В.Р. Алексеев

28 Норвегия, г. Осло, пруд* 06.2009 В.Р. Алексеев

29 Китай, о. Тайвань, оз. Лю Шад 10.2009 В.Р. Алексеев

30 Китай, о. Тайвань, оз. Абвил 10.2009 В.Р. Алексеев

СаШкосатрЛя $1аркуИпт

31 Россия, г.Санкт-Петербург, Таврический парк, пруд 11.2010 Н.М. Сухих

32 Россия, респ. Коми, г.Сыктывкар, пруд* 10.2011 Е.Б. Фефилова

33 Швейцария, Женева, Женевское озеро 02.2011 В.Р. Алексеев

2.1 Описание станций

Пробы были получены из акваторий и бассейнов Балтийского, Северного, Каспийского морей, а так же из внутренних водоемов России и сопредельных территорий. Сбор проб производили летом 2006-2012 г.г. в основном в прибрежных акваториях (Таблица 1).

2.2 Материал и методы генетической части работы

Всего было проанализировано 272 последовательности ДНК копепод из Европы и Тайваня. Часть материала была обработана лично автором в лаборатории молекулярно-генетической систематики ЗИН РАН г. Санкт-Петербурга и в лаборатории генетики растений Университета г. Лилля во Франции, часть была отправлена на анализ в Канадский Центр Баркодинга.

Основные этапы молекулярно-генетического анализа включали: выделение ДНК, амплификацию нужного участка, его очистку, секвенирование, обработку полученных сиквенсов и филогенетический анализ. Выделение геномной ДНК производили при помощи стандартного солевого метода с использованием лизирующего буфера и протеиназы К.

Для амплификации и секвенирования использованных в работе генов COI (650 п.о.) и 18SrRNA (373 п.о.) применяли 4 опубликованных ранее и 3 специально разработанных праймера. Ген 18SrRNA был выбран как вспомогательный и в основном анализ производился по гену COI.

Нуклеотидные последовательности выравнивали с помощью программы BioEdit 7.2.0 [Hall, 1999] по алгоритму Clustal W [Thompson et al.,1994]. Подбор моделей эволюции для нуклеотидных последовательностей каждого вида осуществлялся в программе Jmodeltest 2.1.3 [Darriba, 2012]. Филогенетическая реконструкция выполнена по методу Байеса при помощи программы MrBayes 3.2.1 и методом максимального правдоподобия в программе PhyML v.3.0. В качестве статистического теста применяли метод бутстрепа с использованием 1000 псевдорепликаций. Для построения сетей гаплотипов была использована программа Network 4.611. Нуклеотидное (я) и гаплотипическое (А) разнообразие и их стандартные отклонения (±SD) были посчитаны в пакете программ DNASP V.5.10.0001.

2.3.Материал и методы морфологической части работы

Сравнительно-морфологический анализ был выполнен на более чем 880 особях при помощи окуляр - микрометра и микрофотосъемки на бинокулярном стереомикроскопе, а также оптическом микроскопе и фотомикроскопе IMAGER А-1. При исследовании морфологического полиморфизма каждого вида были использованы как признаки классической биоморфологии так и новые признаки, ранее не применявшиеся в таксономии данных групп.

Статистический анализ различий между популяциями был проведен на основании полученных индексов при помощи стандартного пакета статистических программ ANOVA и Statistica -7.

3 ГРУППА КРИПТИЧЕСКИХ ВИДОВ EURYTEMORA A F FINIS (POPPE, 1880)

Отряд Copepoda H. Milne Edwards, 1840 Подтряд Calanoida Sars, 1903 Надемейство Diaptomoidea Baird, 1850 Семейство Temoridae Giesbrecht, 1893 Род Eurytemora Giesbrecht, 1881 Euryíemora afflnis (Poppe, 1880)

3.1 Оценка генетического полиморфизма Eurytemora afflnis (Poppe)

Результаты анализа материала из Рижского, Вислинского, Финского заливов, а так же из других эстуарных районов и рек бассейнов Северного, Балтийского и Каспийского морей соответствуют литературным данным [Lee, 2000]. Последовательности ДНК, полученные из материала акватории Балтийского моря, в большинстве своем принадлежат к Европейской кладе. Сиквенсы Eurytemora из р. Волга (Каспийский бассейн) относятся к Азиатской кладе и формируют общий гаплотип с сиквенсом из Каспийского моря (Рисунок 1). Генетическое расстояние между данными кладами по гену COI составляет от 13,8% между Европейской и Американской кладами до 16 % между Азиатской и Европейской.

Весь материал из Европейской части по нашим данным распадается на 3 основных группы: Балтийская, Североморская и Восточно-Атлантическая. Балтийская группа включает материал из Финского, Рижского и Вислинского заливов. К Североморской группе относятся ракообразные, отобранные в реках Сена, Шельда и их эстуариях. В Восточно-Атлантическую группу вошел материал из реки Луары, эстуария Жиронды и пруда в Булонском лесу в г. Париже.

Генетическое расстояние между группами составляло от 1,7% между Балтийской и Североморской группами до 2,1% между Североморской и Восточно-Атлантической группами (Рисунок 1). Подобные результаты были получены коллегами из Франции и Канады, которые также проводили исследования на E.affinis из эстуариев Европы [Winkler et al., 2011].

0.75/82

t VL272 [t-R349

0.76/74

0.97/97

0.99/90

0.56/58j j.

1/97

0.9/TO

У7Ш

1/100

0.8/8:

0.6/64 Г

-VL267 -U-L329 -V1269 U-L311 -R338 -V273 -V198 BallSea rV294 LU-L167

— V289 W-V288 •-V287 -U-L318 -V281 r U-L332

— V104 V274 -R351 N120 U-L313

V280

— U-L325 j S63GN4 L-L1711DN3 I S63BN4 r- S78AN4 -TamR S710FN4 D10BN2 S78CN4 S710HN4 - Ijssehi S76HN4 S7eßN4

rL212BN4 l L212HN4 L175DN3 rL211GN4 ' L174EN3 j L178BN3 l- P5FN1 A7DN1 -L179DN3 P5EN1 P5GN1 GiiR L211DN4 — L211CN4 L2112GN3 0.8/89i MarthVin JL GraysHarb 0.85 88M.San-Fr

Hl-IsleVer

077/761 1_NHO

— CapeF J-L331

- U-L98

- Chesap -CoopR

г U-L12 I LK.322 -U-L330 4 U-L4

-Casp

Балтийская форма

Североморская форма

Восточно-

Атлантическая

форма

Eurytemora affmis

l/100r OhnumaL

-AkankoL lttOOi—Columb I '-Nitinatl

Eurytemora carolleeae

Eurytemora caspica Северо-Тихоокеанская E. cf. affmis

- E-padfica

Рисунок 1 - Филогенетическое дерево, построенное по гаплотипам гена COI Eurytemora affinis (Poppe), Eurytemora caspica Sukhikh et Alekseev и Eurytemora carolleeae Alekseev et Souissi методом Байеса. В узлах указаны Байесовы апостериорные вероятности и проценты бутстрепа (для ML) соответственно. Значения менее 0.5 или 50% не указаны.

3.2 Сосуществование Европейской и Североамериканской форм Eurytemora

afßttis (Poppe) в Европе

В процессе исследования организмов из Финского залива Балтийского моря было обнаружено присутствие североамериканского вселенца наряду с Европейской формой Eurytemora [Alekseev et al., 2009; Sukhikh et al., 2013]. Американская форма, недавно описанная как самостоятельный вид Е. carolleeae, впервые была выявлена в Невской и Лужской губах в результате анализа участка митохондриального гена С01. Исследование популяций Е.affinis и Е. carolleeae из Финского залива в 2006-2012 г.г. показало, что в зависимости от года численность вселенца колебалась от 4 до 100 процентов от общей численности обоих видов.

При помощи морфологического анализа чужеродный вид был также найден в Выборгском и Рижском заливах Балтийского моря и в некоторых эстуариях рек Германии, Голландии и Франции.

3.3 Морфологический полиморфизм Eurytemora afflnis (Poppe)

По результатам морфологических исследований был выделен и зарегистрирован неотип Е. affinis из р. Эльба, поскольку типовой экземпляр был утрачен. Еще один новый вид Е. caspica Sukhikh et Alekseev, 2013 из Каспийского моря был выделен и описан в рамках комплекса видов Е. afflnis. Морфологически новый вид представляет собой промежуточную форму между североамериканским и европейским представителями. Различия трех новых видов в рамках бывшего комплекса Е. afflnis указаны на Рисунке 2.

В пределах вида Е. afflnis, обитающего в водоемах Европы, нами было выделено три подвида: Е. afflnis afflnis - из р. Эльба (Германия), Е. afflnis ssp.n. 1- из эстуария р. Луга (Россия) и Е. affinis ssp.n. 2- из эстуария Жиронда (Франция).

Для описания всех видов и подвидов исследуемого комплекса были использованы как принятые для систематики данной группы признаки (длина и ширина фурок, промеры 1-4 пар плавательных ног (PI-4)), так и новые, ранее не применявшиеся для данной группы признаки: форма генитального сегмента самок, относительные размеры маленького шипика 5-ой пары плавательных ног (Р5) самок, форма левого базиподита и дистального членика Р5 самцов, форма мандибул, сегментация щетинок плавательных ног и фуркальных щетинок (Рисунок 2). В конце раздела приведен определительный ключ с использованием этих признаков.

Рисунок 2 - Основные различия между Eurytemora affinis (Poppe) (а-д), Eurytemora caroüeeae Alekseev et Souissi (е-к) и Eurytemora caspica Sukhikh et Alekseev (л-п): а, e, л — генитальный сегмент самок; б, ж, м - дистальный сегмент Р5 самок и маленький шипик (указан стрелкой); в, з, н - Р5 самца с левым базиподитом, указанным овалом, и с дистальным сегментом правой ноги, указанным стрелкой; г, и, о - мандибулы самцов, стрелка указывает пробел; д, к, п - щетинки плавательных ног, стрелкой указана сегментация.

4 ГРУППА КРИПТИЧЕСКИХ ВИДОВ EUCYCLOPS SERRULA TUS (FISHER, 1851)

Отряд Copepoda Н. Milne Edwards, 1840 Подотряд Cyclopoida Burmeister, 1834 Семейство Cyclopidae Rafinesque, 1815 Род Eucyclops Claus, 1893 Eucyclops serrulatus (Fisher, 1851)

4.1 Генетический полиморфизм группы видов Eucyclops serrulatus

По результатам анализа участка гена COI, вид Е. serrulatus распался на несколько клад (Рисунок 3). Клада 1, объединяла последовательности,

полученные из водоемов с. Голубиное (Закарпатская обл., Украина), г. Осло, г. Париж и Таврического сада (г. Санкт-Петербург). Клада 2, включала сиквенсы из Днестровского лимана (Одесская обл., Украина) и из реки в Удмуртии. Интересно, что популяция из Орловского пруда (г. Стрельна) (terra typica) распределялся между кладами 1 и 2. Клада 3 включала только материал из водоемов Тайваня. В среднем генетические дистанции между кладами составляли 27%.

Последовательности ДНК ракообразных из Испании (р.Чука, г. Валенсия) также формируют отдельную кладу. Возможно, эти сиквенсы принадлежат к одному из недавно описанных в пределах данного региона видов: Е. albuferensis Alekseev, 2008; Е. miracleae Алексеев, 2010 или E.romaniensis Алексеев, 2010.

0.98/В7

1/79

1/81

0.89/90 J

1/100

0.66/63 1/100

509 587 535 537 ■548 01.C0IH £81 580 579 578 540

Закарпатская группа E.serrulatus

Днестровская группа E.serrulatus

0.8/83: 1/100

0.62/64

1/100

0.55/60

519

520

521 528

530

531

E.macruroides

Тайваньская группа E.serrulatus

0.58/3 J-

- E.macrurus ■ E.speratus

Í532

533

534

Испанская группа E.seirulatus

0.97/87Г

1/99

0.71/48

i/ioof

-С. abyssorum

■ С. ins ignis

- C.strenuus

- M. viridis M.atbidus

0,3

Рисунок 3 - Филогенетическое дерево, построенное по гаплотипам гена COI групп Eucyclops serrulatus (Fischer) методом Байеса. В узлах указаны Байесовы апостериорные вероятности и проценты бутстрепа (для ML) соответственно. Значения менее 0.5 или 50% не указаны.

4.2 Морфологический полиморфизм группы видов Eucydops serrulatus (Fischer)

Сравнение популяций Е. serrulatus из Закарпатья и Одесской области Украины по морфологическим признакам позволило выявить достоверные качественные и количественные различия между ними (Рисунок 4), в том числе были использованы новые признаки, ранее не применявшиеся для исследования данной группы (Рисунки 4 а, в, г, е).

Анализ данных признаков у ракообразных Е. serrulatus из Орловского пруда (г. Стрельна) показал, что популяция достаточно однородна, хотя и обладает высоким уровнем морфологического

полиморфизма.

Все признаки, разделяющие украинские популяции, встречаются у ракообразных из Орловского пруда в различных сочетаниях, что можно рассматривать как результат гибридизации двух морфотипов, выявленных в водоемах Украины. Подобная картина наблюдается в популяциях Е. serrulatus из Таврического пруда (СПб), водоемов Башкирии, Тюмени и Гента.

Неясный статус особей, обнаруженных в перечисленных выше водоемах, на данном этапе исследований позволяет нам говорить о популяциях из разных точек Украины, как о морфологических типах, несмотря на довольно высокий, как минимум подвидовой, процент нуклеотидных замен между ними- 26%.

В конце раздела приведено подробное описание самки и самца одной из негибридных популяций данного вида на примере ракообразных из Днестровского лимана.

Рисунок

между

Основные

различия популяциями Eucyclops serrulatus (Fischer) из Днестровского лимана (а, в, д) и пруда в Закарпатской области (б, г, е); а, б -каудальная сторона Р4 с обозначениями определительных признаков; в, г - базиподиты АН с каудальной стороны; д, е -фуркальные ветви с дорзальной стороны с обозначениями

определительных признаков.

4.3 Eucyclops cf. serrulatus и

Сравнительно - морфологический анализ Е. cf. serrulatus из прудов Тайваня с использованием признаков, разработанных для европейских популяций Е. serrulatus (Рисунок 4), выявил качественные и количественные различия между ними. На Рисунке 5 приведены наиболее показательные качественные различия в строении гиалиновой мембраны и коксального шипика Р4 у ракообразных из водоемов Тайваня и Европы. Принимая во внимание результаты молекулярно-генетического анализа (генетическая дистанция между видом Е. serrulatus и ракообразными с о. Тайвань составляет 29%), тайваньской популяции может быть присвоен статус вида.

В конце раздела приведено описание типовых экземпляров самца и самки Eucyclops sp. п. Составлен определительный ключ для изучаемых таксонов.

5 ВНУТРИВИДОВАЯ НЕОДНОРОДНОСТЬ CANTHOCAMPTUS STAPHYLINUS (JURINE, 1820)

Отряд Copepoda Н. Milne Edwards, 1840 Подотряд Harpacticoida Sars, 1903 Семейство Canthocamptidae Sars, 1903 Подсемейство Canthocamptinae Brady, 1880 Род Canthocamptus Westwood, 1836 Canthocamptus staphylinus (Jurine, 1820)

5.1 Генетический полиморфизм вида Canthocamptus staphylinus (Jurine)

По результатам молекулярно-генетического анализа гаплотипов участка гена COI, образцы из пруда Таврического сада (SPb590, SPb588, b SPb589) и Женевского озера (Geneva 1, Geneva2) образуют 3 клады, удаленные друг от друга на 1,8 - 3,5 % (Рисунок 6). Причем Санкт-Петербургская популяция (SPb) представлена двумя кладами.

По полученным данным сложно говорить о внутривидовой структуре исследуемого вида. С одной стороны такие дистанции могли бы

Тайваня

с гиалиновой пластинкой (а, б) и коксальная щетинка Р4 (в, г) самок Eucyclops cf. serrulatus (Fischer) а, в- из Днестровского лимана; б, г-из Тайваня.

соответствовать рангу подвида, с другой стороны, внутрипопуляционные расстояния примерно соответствуют межпопуляционным: так для Женевы эта величина составляет 3,3 %, а для Санкт-Петербурга - 2%.

Следует заметить, что для особей из Женевской популяции были получены сравнительно короткие последовательности ДНК (277 п.о.). Исследуемая группа организмов достаточно сложна для изучения, как с точки зрения морфологии (мелкие организмы, слабо разработанная система определительных признаков), так и с точки зрения генетики, по крайней мере, с использованием гена С01 (несколько лабораторий в разных странах не смогли выполнить этот анализ). Прогресс технологий исследования на наш взгляд позволит прояснить эту картину в ближайшее время.

Учитывая небольшое количество сиквенсов на данном этапе исследований, автор не берет на себя ответственность присваивать какой-либо статус изучаемым популяциям, а только обсуждает полученные результаты.

0.96/891 0.99/10СГ

1/100

ЗРЬ590 1ЗРЬ588

с:

-ЗРЬ589

- вепеуаг

• А. ЬатопсИ

Е1арЬоШе11а ИитрИгвуБ!

Клада 1

Клада 2 Клада 3

Рисунок 6 - Филогенетическое дерево, построенное методом максимального правдоподобия по 7 нуклеотидным последовательностям участка гена С01 Сап^осатрЫБ зГарИуНпт (.Гиппе) из Женевского озера и пруда в Таврическом саду. В узлах указаны Байесовьт апостериорные вероятности и проценты бутстрепа (для МЬ) соответственно. Значения менее 0.5 или 50% не указаны.

5.2 Морфологический полиморфизм вида СапГ/юсатр/ия ¡¡арЬуНпих (Липпе)

Утрата типового экземпляра определила необходимость для автора выделить и зарегистрировать неотип из Женевского озера для вида С. з1арИуИпт (Рисунок 7).

Сравнение ракообразных из водоемов Санкт-Перебурга, Сыктывкара и Женевы позволило установить различия между ними в количестве шипов (Рисунок 8) и соотношении промеров пятой пары плавательных ног.

Рисунок 7 - СаШ/госатрт МарИуНпия (1игше) самка, гш 55093 (голотип): а - общий вид, б - каудальные ветви, дорсальная сторона. Масштаб: а 200 щп, б 100 цт.

Представители Сыктывкарской популяции достоверно отличаются от Санкт-Петербургской и Женевской популяций СаЫкосатрШз также по соотношению промеров фуркальных ветвей.

Несмотря на отсутствие данных генетического анализа для популяции С. з1арИуНпш из Сыктывкара, есть все основания полагать, что именно она окажется наиболее отличающейся от двух других исследуемых популяций. На это указывает, проведенный морфологический анализ - Сыктывкарская популяция обнаруживает наибольшие отличия от ракообразных из водоемов Санкт-Петербурга и Женевы. Самое важное, что эта популяция обнаруживает расхождения в жизненных циклах, способах размножения и скорости постэмбрионального развития [Фефилова, 2009], что позволяет нам сделать предположение о наибольшей удаленности данной группы организмов от западноевропейских популяций и продолжить поиски критических форм в рамках этого вида в направлении к востоку от типовой популяции.

Рисунок 8 - Различия в морфологических индексах у самок СапЛосатрШз згарЬуИпш (1иппе) из водоемов г. Женевы, г. Санкт-Петербурга и г. Сыктывкара. Графики построены на основании фуркального индекса (соотношение длины открытой части фурок (Ь) к их ширине (\\0) по оси абсцисс и количества шипов на анальной пластинке (И шипов).

1/\Л/

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования ряда массовых видов Copepoda, имеющих широкую область распространения, позволили установить, что Е. affinis и Е. serrulatus представляют собой группы критических видов. По результатам работы было выделено два новых вида и три подвида копепод.

В рамках видового комплекса Е. affinis был описан новый вид Е. caspica, сам же вид Е. affinis, обитающий в водах Европы в свою очередь распался на три подвида: Североморский Е. affinis affinis, Балтийский Е. affinis ssp.n.l и Восточно-Атлантический Е. affinis ssp.n.2.

Анализ популяций Е. serrulatus из различных мест России, Украины и Тайваня также позволил выявить новый вид на о. Тайвань - Eucyclops sp. п. и два морфологических типа в Закарпатской и Одесской областях Украины.

Для каждого нового вида и подвида выделены голотипы и созданы определительные ключи. В связи с утратой голотипов номинальных видов Е. affinis и С. staphylinus в водах, откуда впервые были описаны типовые виды, собран материал, позволивший осуществить переописание и выделить неотипы. Все голотипы и неотипы пронумерованы и помещены в коллекцию ЗИН РАН.

Практически для каждой из исследуемых популяций получены последовательности участка гена COI, которые помещены в международные базы данных GenBank и BOLD. Данные базы были пополнены также еще последовательностями 14 других видов, информация о которых до сих пор отсутствовала.

Исследование критических видов оказалось важным не только для оценки биоразнообразия, но и для выявления критических инвазий. В популяции Е. affinis Балтийского моря был обнаружен североамериканский сородич данного комплекса видов, описанный недавно как Е. carolleeae, который при определенных условиях способен вытеснять нативный вид.

Как показали проведенные исследования, определение таксономического статуса требует комплексных исследований с использованием различных методов анализа. Использование какого-то одного метода зачастую приводит к воз1гакновению ошибочных представлений о таксономической принадлежности критических организмов.

В ходе выполнения данной работы автор столкнулся с проблемой подобного рода при исследовании вида Е. serrulatus из водоемов Европы. Результаты молекулярно-генетического анализа этого вида свидетельствовали о присутствии двух удаленных на 26% нуклеотидных замен клад из разных водоемов Украины. Те же клады были получены при исследовании ракообразных из Орловского пруда г. Санкт-Петербурга. Анализ ракообразных из водоемов Закарпатья и Одесской области Украины позволил выявить различия видового уровня и по морфологическим признакам. В то же время, морфологический анализ Eucyclops из

Орловского пруда не показал присутствия морфологических групп в популяции, при столь высоком уровне генетических различий. Вероятно, популяция в Орловском пруду является гибридной, что делает невозможным рассматривать полученные в Украине группы, как новые виды. С другой стороны, именно на основе генетического анализа вида Е. affinis было выявлено 3 подвида, что объяснило высокую морфологическую неоднородность данного вида, а также помогло в определении границ ареалов исследуемых подвидов. Морфологические же различия между популяциями С. staphylinus из водоемов Женевы и Санкт-Петербурга не подкрепляются результатами генетического анализа, поскольку в Таврическом пруду обнаружено две клады, генетические дистанции между которыми примерно соответствуют дистанциям между популяциями из разных мест. Возможно, при увеличении количества материала и длины исследуемых последовательностей ДНК мы получим другую картину, которая будет точнее соответствовать результатам морфологических исследований.

Проведенные исследования позволяют предположить, что многие виды с широким ареалом являются на самом деле группами критических видов, выявлению которых поможет комплексный подход с использованием нескольких методов исследований.

ВЫВОДЫ

1. В ходе морфологических и молекулярно-генетических исследований трех широко распространенных в континентальных водах видовых комплексов из подотрядов свободноживущих копепод Calanoida, Cyclopoida и Harpacticoida выделено 2 новых вида и 3 подвида, генетические дистанции между видами составляли от 13,8 до 29%, подвидами - от 1,7 до 2,1%.

2. Установлено, что комплекс криптических видов Е. affinis представлен тремя видами Е. affinis, Е. carolleeae и E.caspica, вид Е. affinis включает три подвида. Таксоны демонстрируют высокий уровень дивергенции по участку гена COI, и по ряду морфологических характеристик, в том числе ранее не использованных для данной группы: строение мандибул, плавательных ног и фуркальных ветвей, форма генитального сегмента у самок.

3. В рамках вида Е. serrulatus выделен вид Е. sp.n., обитающий на Тайване. Новый вид отличается от номинального, как по принятым для систематики Cyclopoida морфологическим признакам, так и по новым ранее не использованным для данной группы: строению фуркальных ветвей, и 4-й пары плавательных ног. Выявленные морфологические различия подкрепляются высоким уровнем дивергенции по гену COI - 29%.

4. Полиморфный вид С. staphylinus представлен двумя формами ранга подвида, обитающими в центральной Европе (Женевское озеро) и на Севере Европейской России (г. Сыктывкар). Формы достоверно различаются по следующим

морфологическим признакам: количество шипов на анальной пластинке, форма фурок и строение 5-ой пары плавательных ног.

5. Виды континентальных Copepoda с широким ареалом часто представляют собой комплексы критических видов, для выявления которых необходимо проведение внутривидовых и внутриродовых ревизий основанных на использовании комплекса методов исследования (молекулярные, морфологические, гибридологические и т.п.).

6. Установлено участие критических видов комплекса Е. affinis в процессах биологических инвазий. Североамериканский вид Е. carolleeae обтает в Балтийском море совместно с нативным для Европы видом Е. affinis. Доля вселенца от общей численности обоих видов составляла в разные годы от 3 до 100%.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Работы, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК

1. Сухих Н.М. Вселение видов-двойников в экосистему Балтийского моря/ В.Р. Алексеев, Н.М. Сухих, Н.И. Абрамсон// Доклады Академии Наук,- 2009.- Т.429, вып. 5,- С. 694-697.

2. Sukhikh N. Eurytemora caspica sp.n. from the Caspian sea - one more new species within the E. affinis complex (Copepoda: Calanoida)/ N. Sukhikh, V.R. Alekseev// Proceedings of the Zoological Institute RAS.- 2013,- Vol. 317, №. 1. - P. 85-100.

3. Sukhikh N. Invasion of Eurytemora affinis sibling species (Copepoda: Calaniformes) from North America into the Baltic Sea and European Atlantic coast estuaries/ N. Sukhikh, A. Souissi, S. Souissi, V. Alekseev// Journal of Natural History.- 2013.-V.47, №5-12.- P. 753-767.

Работы, опубликованные в других изданиях

1. Сухих Н.М. Введение. Пресноводный зоопланктон. В кн. Определитель зоопланктона и зообентоса пресных вод России. Т.1. Зоопланктон/ В.Р. Алексеев, Е.Ю. Наумова, Н.М. Сухих// под ред. В.Р. Алексеева, С.Я. Цалолихина. - М.: КМК,- 2010,- 500 с.

2. Сухих Н.М. Вселение копеподы американского происхождения Eurytemora carolleeae Alekseev et Souissi, 2011 в Финский залив/ Н.М. Сухих, Д.Л. Лайус, В.Р. Алексеев// Сборник материалов 1 научной конференции СПбГУ «Наш общий Финский залив»,- Санкт-Петербург.- 2012,- С. 252-256.

3. Сухих Н.М. Зоопланктон Лужской губы Финского залива в условиях повышенной мутности воды/ Н.М. Сухих// Материалы докладов XI11 Международной школы-конференции молодых ученых,- Рыбинск,- 2007,- С. 222-229.

4. Сухих Н.М. Зоопланктон приустьевой части Лужской губы Финского залива/ Н.М. Сухих, Н.В. Полякова, В.Р. Алексеев// Материалы докладов молодежной научной конференции «Экологические проблемы севера». - Архангельск.- 2008.-С. 211-213.

5. Сухих Н.М. О нахождении североамериканской Eurytemora affmis (Рорре, 1880) в Финском заливе Балтийского моря с помощью методов молекулярной генетики/ Н.М. Сухих, Н.И. Абрамсон, В.Р. Алексеев// Материалы докладов X Съезда Гидробиологического Общества при РАН.- 2009.-С.389.

6. Сухих Н.М. Роль молекулярно-генетической и морфологической диагностики в исследовании криптических видов-вселенцев копепод в водных сообществах Балтийского моря/ Н.М. Сухих, В.Р. Алексеев// Сборник научных трудов "Биологическое разнообразие континентальных водоемов Евразии".- Изд. Русская коллекция СПб.- 2011.- С. 15-26.

7. Сухих Н.М. Являются ли виды комплекса Eurytemora affmis криптическими?/ Д.Л. Лайус, Н.М. Сухих, В.Р. Алексеев// Сборник научных трудов "Биологическое разнообразие континентальных водоемов Евразии".- Изд. Русская коллекция СПб.- 2011.- С. 32-45.

8. Sukhih N. Molecular-genetic and morphological study on Eurytemora affmis (Poppe, 1880) cryptic species invasion in Baltic and Atlantic coast waters/ N. Sukhih, S. Souissi, J.-S. Hwang, V.R.. Alekseev// Materials of International Conferences on Dormancy in Crustations: Research Findings and Applications.- 2009,- P. 14.

9. Sukhih N. Some negative effects of sea-port construction on zooplankton of the Ust-Luga estuary/Estuarine ecosystems: structure, function and management/ N. Sukhih, V. Alekseev// Materials of International Symposium ECSA 42. - Kaliningrad.- 2007.-P.107-108.

lO.Sukhikh N. Morphological characterization of Eurytemora affmis sibling species/ N. Sukhikh, A. Souissi, S. Souissi, V.R. Alekseev// Materials of the 11-th International Conference on Copepoda.- Merida: Mexico.- 2011.- P.138.

11. Sukhikh N. Successful invasion of Eurytemora affmis from atlantic coast USA to the Baltic Sea/ N. Sukhikh, V. Alekseev// Материалы Международной конференции «Актуальные проблемы планктологии». - Калининград,- 2012.- С. 67-68.

Подписано в печать 29.08.13 Формат 60x84'А6 Цифровая Печ. л. 1.2 Тираж 100 Заказ 04/08 печать

Отпечатано в типографии «Фалкон Принт» (197101, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Пушкарская, д. 54, офис 2)

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сухих, Наталья Михайловна, Санкт-Петербург

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИИ НАУКИ ЗООЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи I

С

Сухих Наталья Михайловна

Молекулярно-генетические и морфологические исследования криптических видов Сореро{1а континентальных вод России и

сопредельных территорий

Специальность 03.02.04- зоология

СО

00 ДИССЕРТАЦИЯ

^у^ на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

со 8

т— с\]

О ^ СМ §

Научный руководитель доктор биологических наук В.Р.Алексеев

Санкт-Петербург 2013

Оглавление

Введение...................................................................................................................4

1 Литературный обзор..........................................................................................13

1.1 Критические виды......................................................................................13

1.2 Инвазии криптических видов.....................................................................21

1.3 Виды-двойники среди Copepoda................................................................23

1.4 Обзор литературы по объектам, выбранным для исследования.............26

2 Материал и методы............................................................................................36

2.1 Описание станций........................................................................................36

2.2 Материал и методы генетической части работы......................................39

2.3 Материал и методы морфологической части работы..............................42

3 Группа криптических видов Enrytemora affinis (Poppe).................................48

3.1 Оценка генетического полиморфизма Eurytemora affinis (Poppe)..........48

3.2 Описание неотипа Eurytemora affinis (Poppe) из типового местообитания в р. Эльба (Германия)........................................................................................60

3.3 Морфологический полиморфизм Eurytemora affinis (Poppe)...............64

3.4 Описание подвидов Eurytemora affinis (Poppe).........................................71

3.5 Eurytemora caspica Sukhikh et Alekseev, 2013...........................................77

4 Группа криптических видов Eucyclops serrulatus (Fischer)...........................92

4.1 Генетический полиморфизм группы видов Eucyclops serrulatus (Fischer)..............................................................................................................92

4.2 Морфологический полиморфизм группы видов Eucyclops serrulatus (Fischer).............................................................................................................101

4.3 Eucyclops.cf serrulatus из Тайваня............................................................115

Описание Eucyclops sp.n.....................................................................................117

5 Внутривидовая неоднородность Canthocamptus staphylinus (Jurine)..........127

5.1 Генетический полиморфизм вида Canthocamptus staphylinus (Jurine)........127

5.2 Описание неотипа Canthocamptus staphylinus (Jurine) из типового местообитания в Женевском озере (Швейцария).........................................130

5.3 Морфологический полиморфизм вида СаШкосатрШБ 81арНуИпи8

(7иппе)..............................................................................................................134

Заключение..........................................................................................................140

Выводы.................................................................................................................143

Список литературы.............................................................................................145

Приложение.........................................................................................................162

Приложение 1...................................................................................................162

Приложение 2...................................................................................................163

Введение

Актуальность исследования

Свободноживущие Copepoda играют важную роль в водных экосистемах: служат пищей для многих гидробионтов и являются главными консументами I порядка в морях и пресных водоемах. Исследования таксономии и систематики многочисленных представителей этого отряда нередко позволяют выявить присутствие криптических видов в его составе [Frost, 1989; Ganz, Burton, 1995; Монченко, 2003 и др.].

Криптические виды - это виды практически неразличимые по морфологическим признакам, но имеющие видовые различия на генетическом уровне. Проблема криптических видов стала особенно актуальной в последние несколько десятилетий, о чем свидетельствует резкое возрастание числа публикаций на данную тему. Произошло это во многом в связи с развитием молекулярных технологий и в первую очередь в связи с возможностью секвенирования ДНК [Bickford et al., 2006].

Существует ряд причин, почему изучению этого вопроса стоит уделять больше внимания. Прежде всего, большинство биологических исследований (поведенческие, экологические, физиологические и многие другие) теряют смысл при неверном определении вида, поскольку результаты таких работ, скорее всего, будут ложными [Knowlton, 1986]. Во-вторых, неспособность идентифицировать биологически важные виды обуславливает неправильные оценки состояния биоресурсов и формирует ложные представления о биологическом разнообразии. Стоит отметить, что именно знание того, сколько видов и как они расселены, во многом обуславливает понимание биогеографических процессов и открывает новые возможности исследования механизмов видообразования и расселения близкородственных видов.

Проблемы неверного определения видов в результате могут стать также проблемами экологического мониторинга, управления природными ресурсами, биологического контроля, предупреждения и лечения заболеваний. Неверное определение биологически важных видов затрудняет их сохранение, изучение, содержание или использование.

Другой вопрос, неразрывно связанный с криптическими видами -вселение чужеродных видов. Так называемые криптические инвазии требуют к себе большого внимания, поскольку, как и любые другие инвазии, могут вызвать изменения в функционировании экосистем и их продуктивности, а, в конечном счете, имеют важные последствия для биоразнообразия, биогеографии, природоохранной деятельности и рыбного хозяйства [Knowlton, 1993; Lee, 2000; Lee, Frost, 2002; Gelembiuk et al., 2006].

Примером такой «ползучей» (неидентифицированной) инвазии является ситуация с Eurytemora affmis (Poppe, 1880) в Европе [Sukhikh et al., 2011]. Проведенные автором генетические исследования показали, что в Финском заливе наряду с нативным видом Е. affinis обитает и Eurytemora carolleeae Alekseev et Souissi, 2011- вид-вселенец, занесенный к нам, по всей вероятности, с Атлантического побережья США [Алексеев и др., 2009]. Этот вид был в дальнейшем обнаружен и в других районах Балтики и связанных морей [Sukhikh et al., 2013]. Е. affinis является центральным видом пелагической экосистемы, на который замыкаются трофические сети молоди большинства обитающих здесь видов рыб. Возможное вытеснение/замещение аборигенного вида вселенецем с узким полиморфизмом, а значит и меньшей возможностью адекватно противостоять изменениям среды обитания в условиях значительной антропогенной нагрузки и климатических перестроек, может привести к глобальным для моря негативным последствиям.

Наличие и быстрый рост портов на Балтике, как и сам характер водной массы (солоновато-водной), делает этот водоем удобным

транзитным пунктом для проникновения инвазивных видов смешанного (континентального и морского) происхождения и повышает риск их акклиматизации и дальнейшего расселения по бассейну моря и связанных с ним искусственными каналами бассейнов других морей (прежде всего Белого, Черного и Каспийского). Не случайно именно в Балтике было выявлено уже более 120 видов-вселенцев [http://www.corpi.ku.lt], наиболее сложной для установления и изучения последствий группой, среди которых являются виды двойники.

Аналогичная ситуация сложилась на другом конце континента -странах Юго-Восточной Азии с активнейшим потоком судовых перевозок, таких как Тайвань, Сингапур и т.п., что привело к появлению локальных пятен расселения ряда видов (к примеру Eucyclops serrulatus (Fischer, 1851)) вне естественных границ ареалов [Alekseev, Defaye, 2011]. В зоогеографическом отношении это грозит быстрой утратой важнейшей информации об истинных границах обитания видов [Монченко и др., 2011].

Таким образом, исследование криптических видов в выбранном нами регионе Евразии является своевременным и важным вопросом, актуальность которого быстро растет [Сухих и др., 2011].

Степень разработанности темы исследования

Для исследований в рамках трех основных континентальных подотрядов копепод были выбраны три надвидовых группировки, ранее известные как валидные виды: Eurytemora qffinis (Poppe, 1880), Eucyclops serrulatus (Fischer, 1851) и Canthocamptus staphylinus (Jurine, 1820). Для всех этих видов отмечали широкое распространение (от голарктического до космополитного) и высокую морфологическую изменчивость, что могло указывать на присутствие в каждой группе криптических видов или подвидов. Для Е. affinis на момент начала исследований это предположение подкреплялось еще и географической изменчивостью по молекулярно-

генетическим признакам (участки генов 16SrRNA и COI) [Lee, 2000]. Все эти факты определили выбор объектов для данного исследования.

Цель работы

Изучить роль криптических видов Copepoda в биологическом разнообразии континентальных водоемов России и сопредельных территорий.

Задачи работы

• Оценить морфологическую изменчивость видов копепод Е. affinis, Е. serrulatus и С. staphylinus по принятым в систематике Copepoda признакам.

• Выявить новые морфологические признаки и изучить возможность их использования при описании и разделении морфологически близких форм внутри исследуемых таксонов.

• Оценить изменчивость у широко распространенных видов копепод Е. affinis, Е. serrulatus и С. staphylinus по молекулярно-генетическим признакам.

• Выявить и описать криптические виды внутри исследуемых таксонов для фауны России и сопредельных территорий.

• Изучить исследуемые таксоны в связи с возможностью вселения родственных форм.

Научная новизна

Впервые проведены обширные исследования криптических видов копепод России и сопредельных территорий с использованием морфологического и генетического анализов, описаны новые микроструктуры, выделены специфические для данных групп ранее не использованные морфологические признаки. Впервые получены данные по структуре участков генов цитохром оксидазы 1(С01) для исследуемых представителей подотрядов Calanoida, Cyclopoida и Harpacticoida, все

последовательности депонированы в базах данных GenBank и BOLD. Выяснены филогенетические взаимоотношения внутри исследуемых групп. Основаны и переданы для хранения в федеральную коллекцию неотипы С. staphylinus и E.affinis affinis , типы Eurytemora caspica Sukhikh et Alekseev, 2013, Eucyclops sp.n., E. affinis ssp.n.l и E. affinis ssp.n.2.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные данные являются вкладом в развитие как фундаментальной, так и прикладной зоологии. Описаны новые для науки виды и подвиды копепод. Расширены видовые списки фауны копепод России, США, Тайваня и ряда Европейских стран. Предложены новые ключи для их определения. Созданы и помещены в федеральную коллекцию неотипы С. staphylinus и Е. affinis affinis, типы Е. caspica и Е. sp.n,, Е. affinis ssp.n.l и Е. affinis ssp.n.2. Проведенное исследование внесло существенный вклад в понимание таксономической структуры сложных и давно изучаемых групп криптических видов Е. affinis, Е. serrulatus и С. staphylinus. Получены и помещены в международные базы данных GenBank и BOLD порядка 200 сиквенсов 14 видов копепод из разных мест обитания (Приложение 1). Основные результаты настоящей работы являются базой для дальнейшего изучения видовых комплексов Copepoda. Разработаны новые морфологические признаки для выделения и диагностики криптических видов каждой из исследованных групп Copepoda. Результаты данной работы также могут быть использованы для моделирования последствий влияния видов-интродуцентов на водные экосистемы и в целом для исследования процессов интродукции видов.

Полученные при работе над диссертацией материалы были использованы при выполнении российских и международных научных проектов: 2009, 2010 Грант правительства Санкт-Петербурга для студентов и аспирантов, 2010-2011 проект BIODISEINE Seine Aval (Франция), а также поддержаны грантами РФФИ: 2006-2008 двусторонний Российско-

Тайваньский проект "Study on diapausing stage resistance for the elaboration of a new biotechnology to prevent the spreading of invasive species with ships' ballast waters and sediments", 2010-2011 Российско-Украинский проект "Study on biodiversity and cryptic speciation in aquatic organisms of Russia and Ukraine with barcode using". Материалы исследования были использованы при подготовке и чтении лекций для студентов-магистрантов на кафедре ихтиологии и гидробиологии СПбГУ по специальности гидробиология.

Методология и методы исследования

При проведении настоящей работы подбирались актуальные на данный момент методы, широко применяющиеся в таксономических исследованиях. К ним относятся: методы сбора материала и его первичной обработки (сбор, фиксация зоопланктона); определение материала; морфологические методы, связанные с приготовлением препаратов (ручное анатомирование под бинокуляром, анализ и измерение (при помощи окуляр-микрометра) принятых в ситематике данной группы таксономических признаков, а также поиск новых, ранее не использованных признаков); изготовление иллюстраций; проведение сравнительно-морфологического анализа организмов разных популяций исследуемых видовых комплексов; молекулярно-генетические методы, включающие выделение геномной ДНК, ПЦР, гель-электрофорез и секвенирование участков генов COl и 18S rRNA; выравнивание полученных последовательностей и построение филогенетических деревьев.

Положения, выносимые на защиту

• Виды Copepoda с широким ареалом часто представляют собой комплексы криптических видов, для выявления которых необходимо проведение внутривидовых и внутриродовых ревизий.

• Выявление криптических видов Copepoda должно основываться на использовании нескольких методов исследования (морфологических, молекулярных, гибридологических и др.).

Степень достоверности и апробация результатов

Результаты работы были представлены на Международном симпозиуме «Эстуарные системы: структура, функции и управление» (Калининград, 2007), Международной школе-конференции молодых ученых (Борок, 2007), Молодежной научной конференции «Экологические проблемы севера» (Архангельск, 2008), Международной конференции «Поведение зоопланктона, экология и аквакультура» (Килунг, Тайвань, 2009), Международном совещании «Влияние изменения климата на прибрежные экосистемы» (Булонь-сюр-Мер, Франция, 2010), Международном рабочем совещании и научной конференции "Исследование биоразнообразия и криптического видообразования у организмов водных экосистем России и Украины с применением баркодинга" (Санкт-Петербург, 2011), 11-ой Международной конференцией по Копеподам (Мерида, Мексика, 2011), 8-ом Международном научном конгрессе по Балтийскому морю (Санкт-Петербург, 2011), Научной конференции СПбГУ «Наш общий Финский залив» (Санкт-Петербург, 2012), Международной конференции «Актуальные проблемы планктологии» (Калининград, 2012), научном семинаре лаборатории пресноводной и экспериментальной гидробиологии (Зоологический институт РАН, Санкт-Петербург).

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, 5 глав (Литературный обзор, Материал и методы, Группа криптических видов Eurytemora affinis (Poppe), Группа криптических видов Eucyclops serrulatus (Fischer), Внутривидовая неоднородность Canthocamptus staphylinus (Jurine)), 6 выводов и списка литературы. Работа изложена на 166 страницах, включает 18 таблиц, 48

рисунков. Библиографический список состоит из 140 источников, из которых 29 русскоязычных.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, из них 3 статьи в изданиях рекомендованных ВАК, 2 - в сборниках статей, 1 - в определителе зоопланктона и зообентоса пресных вод России и 8 - в материалах конференции.

Благодарности

Автор выражает глубокую признательность научному руководителю В.Р. Алексеву за ценные советы, обучение новым методикам, поиск литературы, всестороннюю помощь на всех этапах выполнения работы, а так же за предоставлеенный материал для выполнения работы.

Автор благодарен сотрудникам лаборатории персноводной и экспериментальной гидробиологии за всемерную помощь и поддержку при подготовке этой работы, всем сотрудникам лаборатории молекулярно-генетической систематики ЗИН РАН (особенно Н.И. Абрамсон, E.H. Родченковой и А.Ю. Костыгову) за обучение и помощь в работе, а также сотрудникам лаборатории генетики растений Университета г. Лилля во Франции (особенно Винсенту Кастрику), где была выполнена значительная часть молекулярно-генетических исследований, Канадскому Центру Баркодинга (Институт Биоразнообразия в г. Онтарио, Канада; в особенности Д. Штейнке и А. Борисенко за помощь в продвижении проекта) и биотехнологической компании "Бигль" за секвенирование части материала, а так же К.Э. Ли (Университет Висконсина, США) за предоставленные сиквенсы и ценные замечания и A.A. Мовилу за помощь в дизайне праймеров для Е. affinis.

Автор признателен коллегам, помогавшим в сборе материала для данной работы: С.А. Малявина (Институт Озероведения), Проф. E.H.

Науменко (АТЛАНТ НИРО), Л.В. Самчишину (НЦЭБМ НАНУ), Е.Б. Фефилову (Лимнологический институт СО РАН), С. Соуисси (Университета г. Лилля, Франция) и Д.Л. Лайусу (СПбГУ). Автор благодарен С. Соуисси также за предоставленную возможность выполнить часть исследований в Университете г. Лилля. Автор благодарен Д.Л. Лайусу за помощь в статистической обработке данных. Автор признателен С.Я. Цалолихину, В.А Лухтанову и Э.Н. Егоровой за ценные указания и советы.

Автор благодарит всех сотрудников кафедры ихтиологии и гидробиологии СПбГУ за тепл