Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетическая ревизия беспозвоночных Кандалакшского залива Белого моря

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетическая ревизия беспозвоночных Кандалакшского залива Белого моря"

9 15-3/170

На правах рукописи

Г

НЕРЕТИНА Татьяна Владимировна

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ РЕВИЗИЯ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ КАНДАЛАКШСКОГО ЗАЛИВА БЕЛОГО МОРЯ

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва 2015

Работа выполнена на Беломорской биологической станции им. H.A. Перцова биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: кандидат биологических наук Кондратов

Алексей Симонович, Мичиганский университет, США, профессор

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Мокиевский Вадим Олегович,

Институт океанологии им. П.П. Ширшова РАН, заведующий лабораторией

доктор биологических наук Голубцов Александр Серафимович,

Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова, старший научный сотрудник

Ведущая организация: федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Ю

Защита состоится «т» октября 2015 г. в¡5 часов на заседании диссертационного

совета Д 002.238.01 в Институте биологии развития им.

Н.К. Кольцова РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 26.

С диссертацией и авторефератом можно познакомиться в библиотеке и на сайте Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН: http://idbras.ru/.

Автореферат разослан «13 » И К?А _2015 года

Ученый секретарь

диссертационного совета, /7 . \ _ О.В. Бойко

кандидат биологических наук

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ I ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ ВИБЛИОТЕКА J

Актуальность темы исследования. Применение молекулярно-

генетических методов в настоящее время признано необходимым для изучения биоразнообразия, разделения видов и уточнения ареалов их распространения. Молекулярно-генетические методы особенно важны для изучения беспозвоночных животных, часто характеризующихся высокой пластичностью и разнообразием морфологических форм в сочетании с низким генетическим полиморфизмом, а также бедностью морфологических признаков и (или) малыми размерами, затрудняющими их определение с использованием классических морфологических методов. Крайне недостаточно изучен современный видовой состав арктических сообществ, в первую очередь морских. Это обусловлено труднодоступностью материала, а также сложностью идентификации видов с использованием лишь морфологических признаков.

В связи с осознанием острой необходимости изучения биоразнообразия все больший интерес в настоящее время стало вызывать исследование высокоширотных экосистем (напр., Программы по Арктике: Международный полярный год (2007-2008); The Western Arctic Shelf-Basin Interactions (SBI) (2001-2005), Arctic Ocean Exploration Program (NOAA, 2002-2009), Система моря Лаптевых (1993-2012)). Главным образом это обусловлено заметным влиянием на них современных климатических изменений в Арктике (Comiso, 2008). Арктические экосистемы и природные комплексы очень уязвимы и высоко чувствительны к действию глобальных климатических и локальных средовых факторов. Существенное сокращение площади ледового покрытия в летний сезон, зарегистрированное в последние три десятилетия и достигающее в некоторых регионах 30-35% (данные National Snow and Ice Data Center, USA), влияет на организмы разных трофических уровней арктических сообществ. Ненормированная техногенная нагрузка и техногенные катастрофы (например, разлив нефти при аварии танкера Эксон Валдиз у побережья Аляски) влекут за собой глубокие и продолжительные последствия для арктических акваторий. Изменения климата могут вызвать замещение арктических видов субарктическими, что может привести к коренной перестройке арктических планктонных экосистем, изменению их продуктивности и необратимым последствиям для более высоких трофических уровней. Для того, чтобы понимать толерантность арктической биоты к меняющимся условиям и своевременно отслеживать происходящие изменения, необходимо иметь точное представление о её видовом составе, структуре популяций и способах адаптации.

з

В 2003 году был предложен метод «ДНК-штрихкодирования» или метод молекулярного «баркодинга». В основе этого метода лежит предположение, что небольшой по размеру участок генома (до 600-800 нуклеотидов) является одинаковым у особей одного вида и различается у разных видов. Такой участок найден, фрагмент гена COI - расшифровка, и назван ДНК-штрихкодом (barcode). Для полноценного использования подобного признака необходима база данных (IBOL) - расшифровка, в которой находятся сведения о последовательностях этого участка у всех изученных видов. Определив последовательность этого участка ДНК у объекта и сравнив его с базой данных, можно достоверно определить вид изучаемого объекта.

Однако у этого метода существует большое число недостатков, на которые не без основания указывают его критики. В первую очередь, естественно, возражения касаются возможности определения видовой принадлежности организма по фрагменту митохондриального генома, так как в этом случае необходимо учитывать возможность митохондриальной интрогрессии, наличия псевдогенов и многое другое. Кроме того, изучение последовательности только митохондриальной ДНК не дает возможности оценить полиморфизм другой природы, в частности, ядерной ДНК. Тем не менее этот метод по-прежнему является одним из основных молекулярно-генетических методов, применяемых для изучения биоразнообразия.

Таким образом, особую важность для исследования арктической биоты представляет правильный подбор молекулярных методов и использование их в комплексе с изучением морфологических данных.

Цели и задачи исследования. Цель работы - изучение генетического полиморфизма морских беспозвоночных для оценки видового состава, структуры популяций и способов адаптаций арктической биоты Кандалакшского залива. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1) Получение последовательностей фрагментов ядерных и митохондриального генов массовых видов беспозвоночных Кандалакшского залива.

2) Оценка уровня внутривидовой изменчивости ядерной ДНК беспозвоночных Кандалакшского залива; поиск видов с высоким уровнем полиморфизма генома.

3) Сравнение результатов анализа последовательностей фрагментов ДНК с данными, полученными с использованием методов классической таксономии. Уточнение видового состава, выявление изолированных генофондов.

4) Сравнение результатов, полученных с использованием только ДНК-штрихкодирования (молекулярного «баркодинга») с результатами совместного анализа митохондриальных и ядерных маркеров.

Научная новизна. Получены последовательности митохондриального (фрагмента гена СО1) и ядерного (фрагмента гистона 3) маркеров для 244 видов, из них 86 видов Polychaeta, 4 вида Bryozoa, 16 видов Cnidaria, 6 видов Chaetognatha, 5 видов Chordata, 40 видов Crustacea, 16 видов Echinodermata и 65 видов Mollusca. На обширном материале показана необходимость применения ядерных маркеров для молекулярно-генетического анализа биоразнообразия.

В результате генетической ревизии обнаружено семь случаев, когда под одним видовым названием объединялись комплексы видов: Cyanea capillata (Cnidaria, Scyphozoa), Scoloplos armiger (Annelida, Polychaeta, Orbiniidae), Eteone longa (Annelida, Polychaeta, Phyllodocidae) Terebellides stroemii (Annelida, Polychaeta, Terebellidae), Harmothoe imbricata (Annelida, Polychaeta, Polynoidae), Psolus phantapus (Echinodermata, Holothuroidea), Dendronotus dalli (Mollusca, Gastropoda, Dendronotidae). На основании генетических данных и впервые обнаруженных значительных морфологических различий описан новый вид рода Cyanea, С. tzetlinii sp. nov. Kolbasova, Neretina. Показано наличие митохондриальной интрогрессии для видов Lumbrineris fragilis (Annelida, Polychaeta, Lumbrineridae) и Brada inhabilis (Annelida, Polychaeta, Flabelligeridae), что свидетельствует о необходимости использовать ядерные маркеры для изучения биоразнообразия. Был подтвержден статус вида-космополита для Pygospio elegans (Annelida, Polychaeta, Spionidae) и, в противоположность этому, показано, что вид гарпактикоид Nannopus palustris (Crustacea, Copepoda, Harpacticoida), считавшийся ранее видом-космополитом, представляет из себя комплекс видов, причем вид, обитающий в Белом море, наиболее сильно отличается от всех других.

Теоретическая и практическая значимость работы. Биота Арктики

представляет исключительный научный и практический интерес. Уязвимость

арктических сообществ, вызванная относительно малой способностью

противостоять неблагоприятным воздействиям, связанным с локальной

деятельностью человека и глобальными изменениями климата, делает их

изучение неотложной практической задачей. Некоторые данные позволяют

предположить, что труднообратимые изменения многих арктических экосистем

5

уже зашли довольно далеко. Прогнозирование их дальнейших изменений невозможно без детального понимания состава и структуры входящих в них популяций и сообществ. Полученные в диссертации данные вносят значительный вклад в пополнение существующих баз нуклеотидных последовательностей арктической биоты. В результате анализа полученных последовательностей показан низкий внутрипопуляционный уровень геномного полиморфизма морских беспозвоночных Белого моря.

Результатом данной работы стало выявление нескольких криптических видов и случаев митохондриальной интрогрессии. Описан новый массовый вид сцифоидных медуз. На обширном материале показана необходимость применения ядерных маркеров для молекулярно-генетического анализа биоразнообразия. Работа вносит важный вклад в методологию изучения, а также в понимание состава и структуры биоты Арктики.

Положения, выносимые на защиту

1. Применение молекулярно-генетических методов при изучении биоты с относительно низким уровнем биоразнообразия, которая исследуется в течение более чем 60 лет с применением морфологических методов специалистами по различным группам беспозвоночных животных, дает возможность выявить криптические и даже псевдокриптические виды и, более того, в некоторых случаях исправить некоторые ошибки определения.

2. Использование только мтДНК приводит к значительным ошибкам в определении таксономической принадлежности. Совместное использование ядерных и митохондриальных маркеров позволило выявить возможные криптические виды и случаи митохондриальной интрогрессии

3 Популяции морских беспозвоночных Кандалакшского залива Белого моря характеризуются низким (< 0,3%) уровнем изменчивости ядерной ДНК (по данным анализа последовательностей фрагмента гистона 3 и внутренних транскрибируемых спейсеров ITS).

Апробация работы. Материалы исследования были представлены на Юбилейной конференции, посвященной 75-летию ББС МГУ им. H.A. Перцова (МГУ, 2013), 48-м Европейском симпозиуме по морской биологии (Галвей, Ирландия, 2013), симпозиуме «Современные достижения в популяционной, эволюционной и экологической генетике (MAPEEG-2013)» (Владивосток, 2013), 6-м съезде Международного биогеографического общества (Флорида,

США, 2013), конференции «Молекулярно-генетические подходы в таксономии и экологии» (Ростов-на-Дону, 2013).

Личное участие автора. Автор лично участвовал в планировании и проведении экспериментов, обработке и интерпретации полученных результатов, подготовке и написании научных публикаций, апробации результатов и представлении их на конференциях. Сбор материала и морфологический анализ проводились студентами, аспирантами и сотрудниками кафедры зоологии беспозвоночных и Беломорской биологической станции биологического факультета и Зоологического музея МГУ им. М.В. Ломоносова. Вся работа по молекулярному анализу была проведена лично автором. Выводы сделаны на основании собственных оригинальных данных.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них в журналах, соответствующих Перечню ВАК — шесть.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов, списка литературы и Приложения. Текст изложен на 127 страницах, содержит 4 таблицы. Библиографический список включает 162 наименования, из них 158 - на иностранных языках.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы, поставлены цель и задачи исследования.

ГЛАВА 1. Обзор литературы: применение молекулярно-генетических методов для изучения биоразнообразия. В главе 1 приведено определение понятия «биоразнообразие» согласно Конвенции о биологическом разнообразии, утвержденной на Конференции Организации Объединенных Наций по окружающей среде и развитию (Рио-де-Жанейро, 3-14 июня 1992 года), дана краткая характеристика типов биоразнообразия. Проведен краткий обзор литературы, посвященной видам-двойникам (криптическим видам). Показано, насколько сильно изменилось за последние десятилетия в связи с применением молекулярно-генетических методов число выделяемых криптических видов. Проведено обсуждение понятия симпатрических криптических видов. Рассмотрено понятие «вид-космополит» и принципы выделения аллопатрических криптических видов.

Дана характеристика внутривидового генетического полиморфизма. Проведен краткий обзор литературы по этой теме и обсуждение вопросов, касающихся изменчивости генома, на которые до сих пор не найдено ответов.

Далее приведена краткая характеристика применяемых молекулярно-генетических методов. В частности, описан метод ДНК-штрихкодирования, показаны причины и история его возникновения и развития. Проведено подробное обсуждение достоинств и недостатков этого метода, понятий «псевдоген» и «митохондриальная интрогрессия».

Представлен обзор ядерных и митохондриальных генов, которые наиболее часто используются для изучения биоразнообразия и проведения филогенетических построений.

В конце главы дан краткий обзор современного состояния изучения биоразнообразия Арктики. Сформулирована проблема подбора и правильного применения молекулярно-генетических методов для изучения арктической биоты.

ГЛАВА 2. Методы исследования. В главе 2 описано, как проводился сбор материала для исследования, методы фиксации (96%-м этанолом), а также документирования собранных образцов. Для каждого образца сохранялись данные о месте и времени сбора, фамилии сборщика, точном таксономическом положении образца и т.д. Описаны методы выделения ДНК, в том числе разработанная автором модификация протокола производителя для метода выделения ДНК на колонках фирмы «Promega» «Wizard SV Genomic DNA Purification System», позволяющая значительно уменьшить количество исходного материала для выделения ДНК, что является крайне важным для изучения мелких планктонных и мейобентосных организмов. В диссертации приведена таблица праймеров, примененных для амплификации фрагментов митохондриальных и ядерных генов, используемых в работе, в которой даны последовательности праймеров и температуры их отжига. Описан метод очистки ПЦР-продукта и последующее секвенирование с использованием ABI Prism_3500 sequencer (Applied Biosystems). В главе 2 также сообщается, что множественное выравнивание полученных последовательностей проводили с помощью программы ClustalW (Wang, Jiang, 1994). Для филогенетического анализа все выровненные последовательности для каждого вида в отдельности обрезали по самой короткой цепочке, в результате чего все анализируемые последовательности имели одинаковую длину. Построение филограммы

выполняли, каждый раз подбирая метод для решения конкретной задачи. Оценку достоверности топологии реконструированного дерева определяли методом бутстреп -анализа (bootstrap analysis) (Felsenstein, 1985). Индексы бутстрепа подсчитывали для 1000 псевдореплик.

Кроме того, описаны использованные в данной работе методы, такие как TA-клонирование, выделение тотальной РНК и постановка обратной транскрипции.

ГЛАВА 3. Результаты.

Получение данных о последовательностях фрагментов генов COI, гистона 3 и транскрибируемого спейсера ITS ряда морских беспозвоночных Кандалакшского залива. Были получены данные для 244 видов. В большинстве случаев был проведен анализ 5 образцов каждого вида из Белого моря, однако не для всех видов были получены данные по трем генам. В некоторых случаях (например, в случае гидроидов), когда было заранее известно, что стандартные методы ДНК-штрихкодирования по СО1 в данном случае не результативны, проводилась амплификация фрагмента 16S и (или) ITS, в том случае, если в базе данных присутствовали последовательности для этого фрагмента у близких видов.

Данные были получены для 86 видов Polychaeta, 4 видов Bryozoa, 16 видов Cnidaria, 6 видов Chaetognatha, 5 видов Chordata, 40 видов Crustacea, 16 видов Echinodermata и 65 видов Mollusca.

Анализ полученных последовательностей ядерных и митохондриальных маркеров. Низкий внутривидовой полиморфизм изученных видов беспозвоночных Кандалакшского залива. Результаты первичного анализа приведены в диссертации в виде таблицы, содержащей данные о проценте гомологии с последовательностями из базы данных GenBank, а также различий между последовательностями одних и тех же маркеров у разных особей в популяции.. К сожалению, в большинстве случаев последовательности фрагмента НЗ в базе данных GenBank отсутствовали, что не позволило оценить степень межпопуляционного полиморфизма. Анализ полученных данных показал, что у исследованных видов внутрипопуляционная изменчивость по гену, кодирующему гистон 3, практически полностью отсутствует (0-1 замена на 300 нуклеотидов фрагмента гистона 3, 0-1 замена на 700-900 нуклеотидов фрагмента, состоящего из участка 18S, ITS1, 5.8S, ITS2 и

участка 28S). В некоторых случаях последовательности НЗ строго делились на два и более кластеров, что, как правило, оказывалось свидетельством существования криптических видов, а не внутривидового полиморфизма.

При наличии данных о последовательностях гистона изучаемого вида в базе данных GenBank удавалось получить данные по межпопуляционной изменчивости. В этом случае для большинства изучаемых видов было показано абсолютное отсутствие изменчивости по гистону (данные по ITS в базе данных GenBank присутствуют только для гидроидов, у которых этот фрагмент используется для видоидентификации).

Выявление видов-двойников.

В этом разделе рассмотрены наиболее интересные результаты анализа ядерных и митохондриального маркеров, причем отдельно отмечены случаи, когда проведенный анализ способствовал уточнению таксономического положения, а также привел к выявлению генетически изолированных генофондов или случаев митохондриальной интрогрессии.

Catablema vesicarium (Cnidaria, Hydrozoa, Panndeidae). Медузы Catablema vesicarium, жизненный цикл которой неизвестен, были собраны в 2012-2014 гг. возле Беломорской биостанции. В целях определения вида найденных в море полипов и точной взаимной идентификации найденных ранее медуз с. vesicarium и полипов, обитающих на раковинах Е. elliptica, проведен молекулярно-генетический анализ с использованием в качестве маркеров последовательностей ITS и /65, оказавшихся идентичными. Таким образом, были впервые обнаружены и достоверно идентифицированы полипы С. vesicarium.

Cyanea capillata. Анализ последовательностей COI пяти беломорских представителей Cyanea capillata выявил наличие значительного полиморфизма внутри этой группы. Результаты анализа последовательностей фрагмента НЗ совпали с данными, полученными в результате анализа митохондриального маркера. Для более подробного исследования был проведен дополнительный сбор особей С. capillata, и кроме COI и НЗ получены последовательности ITS, фрагмента гена 16S (рис. 1, Б, Г). Можно видеть, что результаты анализа по всем четырем (двум ядерным и двум митохондриальным маркерам) полностью совпадают друг с другом. Было проведено тщательное изучение морфологии представителей двух групп, разделенных на основании генетического анализа.

А)

-A. aunta (JX995320)

--m С пажякН (n»3) (JQ353734-35, JX906329)

--US— С ршрит» (п*2) (00353736-37)

—————«С annaskala (n«4) (AYB02815-17, AY802823) 0 i

-J С. lammrckll (п* IB) (JXBQ5347-67, J*»5323-24, JXB9S36042) "100

-С гемм (n-4) (АУ90291&-22)

Б)

-A. aurte (AY35206)

WS3101 W53100 WS30M WS3087 WS30Q2 WS3062 WS3077

WS3074 WS3015 WS3075 W83078 WS3084 WS 3055 WS3087

WS30M WS30M WS3090 WSS093 WS3005 WS30ee

wssoee

WS3103 WS3105 WS3104

W S3080 WS9O70 W S3085 WSB5 WS3101 WS3100 wssoee

WS3007 WS3092 WS3062 WS3077 WS3036 WVS87

[— C. capitate (JXB95331) —J^ С сарШЫа (n-8) (HF930525-20, AY902911, JX99535-38) 30 IL С capillota (п-в) (J»e5332. J»95342-4«) IL С. capiUata (n-2) (JX995330, JXD95340) |]г CcapJIata (JW95333)

С с up* lata (n-2) (JX995334. JX995341) WS3078 94 i WS3121

94 | "

1 v\

В)

-Л aunta (HM1U4813)

Ш(г>-в)

-С пожвкИ (JXB45355)

С аппошкЫв (НМ19477В)

С. lamarckk (n»2) (JXBB5325-2e) W887 м WS3082 - W83080 W83077 W3303e . W83078 W83075 W83074 VWS3079 WS 3081 W83084 1 W S3085 WS3088 W83089 WS88 WS84

С capitlata (3)Фд5328) С capillata (JX995327) С cafullute (IIM104O2O)

WS3115 WS3106 WS3120 WS3119 WS3117 WS3111

wssoee

W83093 WS3085 W83079

- W83113 WS3112 WS3102 W S3094 WS3089 WS3081 WS3034 WS3118

- WS3035 WS3118 W83110

wssoee

WS3001 WS3084 WS3075 WS3074 WS3083

wssoeo

WS3095 WS3104 W884 WS3087

iwsee ■wssoee

C. taatllnu fn-13)

C. capHlata (п-6в)

1001^3062 1 (—lwS3080 с WS3077 J

- A omit» (JX393252) -С погвкй (J)®45345)

WS3062 WS3080 WS3077 WS3076 W S3085 WS3075 WS3074 WS3079 WSSOfll WS3084 W83087 WS3088

wssoee

WS3091 W63090

Рис. 1. Филогенетические деревья, построенные по результатам анализа последовательностей Cyanea sp. с использованием метода ближайшего соседа: А -фрагмента С01\ Б - внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS); В - гена 1SS рРНК; Г -16SрРНК. Длина фрагмента составила 595 п.и. Статистическая поддержка, подсчитанная по результатам бутстреп-теста (модель К80 1000 реплик), указана рядом с ветвями. Беломорские особи имеют аббревиатуру WS.

Было показано, что исследованные медузы имеют не только генетические, но и значительные морфологические различия, что позволило выделить и описать новый вид рода Суапеа - Cyanea tzetlinii sp. nov. Морфологические отличия нового вида заключаются в наличии содержащих статоцисты полостей в основании каждого рапалия. Принимая во внимание геологическую молодость Белого моря, можно предположить, что С. tzetlinii является массовым видом и в других морях Арктического бассейна.

Комплекс видов Scoloplos armiger. S. armiger долгое время считался видом-космополитом, встречающимся во всех зоогеографических районах. Впервые предположение о существовании по крайней мере двух видов-близнецов, входящих в комплекс видов S. armiger, было выдвинуто зоологом А.Э. Жадан на основе изучения морфологии. Для того, чтобы выяснить, сколько видов, относящихся к комплексу S. armiger, обитает в Белом море, для генетического анализа были собраны животные из разных мест обитания. Первоначальный анализ был проведен с использованием данных о последовательностях фрагментов гистона НЗ и COI (рис. 2, 3). Так как в базе данных GenBank отсутствовали последовательности фрагмента НЗ для рода Scoloplos, было решено получить последовательность ядерного гена, кодирующего 18S рРНК. Беломорские представители рода Scoloplos разделяются на три отдельных клады. Одна, наиболее удаленная клада (WS1324 и WS1326) объединяет представителей рода Scoloplos, имеющих значительные морфологические отличия и выделенных в результате в отдельный вид S. acutus (А. Э. Жадан). Две других группы представляют собой изолированные генофонды, однако морфологические различия между ними не были найдены. Полученные данные представлены на рис. 3. Различия в последовательностях гена 18S составляют 0,5% между ближайшими группами. Внутри групп полиморфизм отсутствует.

100

100

100

100

FJ612493 Scoloplos сГ. armiger rypc locality chide Sale 001

WS22

WS35

WS67

WS6H

WS69

WS937

WS93«

WS939

WS940

— FJ612492 Scoloplos cf. armiger sublidnl cladc Sasc 001

— FJ6I2491 Scoloplos cf. armiger inlcnidal cladc Saic 001

FJ6I2487 Scoloplos cf. armiger Malibu с lade Same 001

FJfi 12490 Scoloplos acmcccps Sac 003

00|—

- FJ6I248I Leitoscoloplos mbustus Lra 003

100] WS1324 WS1326

-Pvgospio elegans WS 1279

■ FJ612494 Scoloplos normuUs Sno 001

0,02

Рис. 2. Филогенетические деревья, построенные по результатам анализа последовательностей I8S Scoloplos sp. с использованием метода ближайшего соседа. Длина фрагмента составила 1700 п.н. Статистическая поддержка, подсчитанная по результатам бутстреп-теста (1000 реплик), указана рядом с ветвями. Метод изображения деревьев позволяет рассчитывать генетические расстояния по длине ветвей. Эволюционные расстояния рассчитывали согласно методу Tamura-Nei. Беломорские особи имеют аббревиатуру WS.

Топология филогенетических деревьев, построенных по результатам анализа митохондриальных маркеров (COI и сохЗ-trnQ -nad6), совпадала с топологией деревьев, построенных по данным анализа последовательностей 18S и фрагмента гистона 3. На основании сравнения последовательностей митохондриальных и ядерных маркеров был сделан вывод о наличии в Белом море под названием S. armiger трех генетически изолированных групп. Одна из них выделена в отдельный вид Sacutus. Для изучения двух других групп были подобраны селективные праймеры и проведено генотипирование большого числа образцов. Было показано, что при отсутствии морфологических различий, представители этих групп различаются по экологическим нишам: были выделены литоральная и сублиторальная группы Scoloplos. Показано, что сублиторальные сколоплосы образуют общую группу со сколоплосами из разных частей Атлантического океана, тогда как литоральные сколоплосы образуют отдельную группу (рис. 3).

0,01

WS922 WS923

JN617869 Scoloplos armiger Subtidol-13C' -WS22

-Jn617875 Sculoptw urtitigvr Sublidal-21A

_I WS34

W- WS67

__100| JN617H73 Scnluplo.s urmiger lnli:nidal-2A Jnfi 17876 Scohplos urmiger lnlcrtidal-2B WS 1688 WS937 —WS 1635 WS1645 — WS939 WS940 WS 1644

Рис. 3. Филогенетические деревья, построенные по результатам анализа последовательностей фрагмента сохЗ-trnQ-nadö Scoloplos sp. с использованием метода ближайшего соседа. Длина фрагмента составила 510 п.н. для Статистическая поддержка, подсчитанная по результатам бутстреп-теста (1000 реплик), указана рядом с ветвями. Метод изображения деревьев позволяет рассчитывать генетические расстояния по длине ветвей. Эволюционные расстояния рассчитывались согласно методу Tamura-Nei. Беломорские особи имеют аббревиатуру WS.

Всего на основании анализа последовательностей ядерных и митохондриальных маркеров среди беспозвоночных Кандалакшского залива было выявлено семь случаев, когда под одним названием были объединены генетически изолированные генофонды: Scoloplos armiger (Annelida, Polychaeta, Orbiniidae), Eteone longa (Annelida, Polychaeta, Phyllodocidae), Terebellides stroemii (Annelida, Polychaeta, Terebellidae), Harmothoe imbricata (Annelida, Polychaeta, Polynoidae), Psolus phantapus (Echinodermata, Holothuroidea), Dendronotus dalli = Dendronotus niveus sp. nov (Mollusca, Gastropoda, Dendronotidae), Cyanea capillata (Cnidaria, Scyphozoa). В последнем случае были найдены также значительные морфологические различия и описан новый вид рода Cyanea, Cyanea tzetlinii.

Выявление случаев митохондриальной интрогрессии. Наличие митохондриальной интрогрессии было показано для Lumbrineris fragilis (O.F. Müller, 1776) (Annelida, Polychaeta, Lumbrineridae), Strongylocentrotus pallidus, Strongylocentrotus droebachiensis и ряда других видов.

Митохондриальная интрогрессия у Lumbrineris fragilis (O.F. Müller, 1776) (Annelida, Polychaeta, Lumbrineridae). Были получены последовательности фрагмента COl для 5 особей Lumbrineris fragilis. При

14

сравнении этих последовательностей выявлено различие в 65 нуклеотидных замен (10%) между фрагментами COI у особей одного и того же вида. При сравнении этих последовательностей с данными, полученными из базы данных GenBank, оказалось, что один из вариантов полученных последовательностей совпадает с представленными в базе данных Genbank. Последовательностей другого варианта в базе данных не обнаружено. С точки зрения сторонников теории баркодинга такие различия безусловно свидетельствуют об обнаружении двух криптических видов. Никаких морфологических различий у организмов, относящихся по COI к разным кладам, однако, обнаружено не было. Были получены последовательности фрагмента НЗ, которые оказались для беломорских особей абсолютно идентичными друг другу. Сравнение последовательностей ITS также не показало никаких отличий, все 5 изученных фрагментов не отличались ни на один нуклеотид.

Митохондриальная интрогрессия у морских ежей Strongylocentrotus pallidus, Strongylocentrotus droebachiensis (Echinodermata, Echinoidea, Echinoida). На основании анализа последовательностей ядерной (фрагментов гена (Sir), кодирующего белок - рецептор белка bindin, и ITS) и митохондриальной ДНК (фрагмента COI) были получены данные, представленные в табл. 1. Таким образом было показано наличие митохондриальной интрогрессии у морских ежей, S. droebachiensis и S. pallidus.

Таблица 1. Разделение двух видов S. droebachiensis и S. pallidus на основании анализа морфологии, а также ядерных и митохондриальных маркеров.

S. droebachiensis, определение специалистом по морфологическим критериям 10 особей S. pallidus определение специалистом по морфологическим критериям 20 особей

ITS 10 ITS 20

STR 10 STR 20

Гаплотип S. droebachiensis 7 Гаплотип 5. droebachiensis 4

Гаплотип S. pallidus 3 Гаплотип S. pallidus 16

Виды-космополиты. В Белом море обитает некоторое число видов, имеющих повсеместное распространение, так называемых видов-космополитов. В главе 3 приведены примеры подробного изучения

представителей этих видов (как из Белого моря, так и из других мест обитания), с применением ядерных и митохондриальных маркеров.

Pygospio elegans Claparède, 1863, (Annelida, Polychaeta, Spionidae). Было показано его широкое распространение в бореальных водах северного полушария, в частности, в Белом море. Кроме того, в нашем распоряжении находился материал из Калифорнии, Орегона, Шотландии и Охотского моря. Были получены последовательности фрагментов 4 генов: митохондриальной 16S, 18S, 28S, и НЗ (в целом, 2576 п.н). Последовательности фрагментов всех 4 генов особей из Калифорнии, Орегона, Шотландии и Белого моря оказались очень близки (средние дистанции между этими четырьмя группами составляют от 0,08 до 0,16%). Таким образом, подтверждается, что P. elegans - вид-космополит, имеющий амфибореальное распространение и очень низкий уровень внутривидового генетического полиморфизма.

Nannopus palustris Brady, 1880 (Crustacea, Copepoda, Harpacticoida) -

вид, относящийся к свободно живущим гарпактикоидам (Crustacea, Copepoda), до недавнего времени считавшийся видом-космополитом, имеющим очень широкое распространение, несмотря на отсутствие у них свободноживущих пелагических личинок (Wells 1986; Chertoprudetal. 2010), ограниченние возможности для распространения и обмена генетической информацией между популяциями. Такое явление получило название «парадокса мейофауны» (Giere 2009).

В связи с этим была предпринята попытка сравнения нескольких беломорских популяций N. palustris, которые из-за отсутствия у вида свободно плавающей личинки должны были быть изолированы друг от друга. Для изучения были взяты образцы из двух точек, находящихся на расстоянии более 15 км друг от друга. Для анализа были использованы фрагменты митохондриапьного гена цитохрома Ь и ядерного гена, кодирующего 28S рРНК. Было показано, что все изученные последовательности всех особей из беломорских популяций идентичны друг другу (рис. 4), что подтверждает существование «парадокса мейофауны». Однако на основании анализа двух независимых маркеров вид-космополит N. palustris разбивается на несколько независимых, очень сильно отличающихся по нуклеотидным последовательностям клад, из которых беломорская клада является наиболее удаленной. Таким образом показано, что в данном случае название N. palustris объединяет несколько значительно разошедшихся друг с другом видов.

NSF2 NSF3 NSM4 NSM3 NS M2 NSMt BSF3 BS F2

, BSMA

- as or as oe

BSOS BS04 BS03 as 02 as 01

NS F4 — NS Ft NSF5

SC F straight SC F straight SC F straight SC F straight SC F straight SC F straight SC F straight SCF straight 98% SCF straight , SC F straight SCF straight SC F straight SC F straight SC F straight SC F straight SC F straighl SC F straight SC F straight SC F notched SC F notched SC F notched SC F notched SC F notched SC F notched SC F notched SC F notched WS Ml WSW2 WS M5 WS Ft

100* W!F3

-r WS F4

1 WSF5 WSF6 WSF7 WS F8 WSF9

-Tigriopus calilomicus

<b)

93%

■ NS M2 I NS F4 75% NS M4 |-4NSF3 64% 11 NS Mt

SC F straight SC F straight SC F straight SC F straight SC F straight SC F straight SC F straighl SC F straight SC F straight SC F straight SC F straight SC F straight SC F straight SC F straight SC F straight SC F straight SC F straight SC F straight SC F straight SC F straight SC F straight SC F straight SC F straighl SC F straight SC F straight SC F straight SC F straight SC F straight

0.99

NS Mt BS 03 BS 05 BS 04 BS 01 BS 02 BS 06 BS 07

90%

fSC F notched SC F notched SC F notched SC F notched SC F notched SC F notched SC F notched SC F notched SC F notched SC F notched SC F notched SC F notched SC F notched SC F notched WSM2 WS F9 WSF7 WSM1 WSF3 WSF8 WS F4 WSF2

Trgnopus свИГоткиз

Рис. 4. Филогенетическое дерево, построенное по результатам анализа методом максимального правдоподобия последовательностей фрагментов 28S (слева) и cytB (справа) N.palustris с использованием метода ближайшего соседа. Длина фрагмента составила 631 п.н. для cytB и 314 п.н. для 2 HS. Статистическая поддержка, подсчитанная по результатам бутстреп-теста (1000 реплик), указана в %. Метод изображения деревьев позволяет рассчитывать генетические расстояния по длине ветвей. Эволюционные расстояния рассчитывали согласно методу Tamura-Nei.

ГЛАВА 4. Обсуждение результатов.

В главе 4 дано обсуждение полученных результатов, сравнение полученных данных с существующими базами данных. Глава поделена на следующие разделы:

Получена база данных последовательностей фрагментов генов COI, I метопа 3 и транскрибируемого спейсера ITS морских беспозвоночных Кандалакшского залива Белого моря. Сравнение объема представленных

результатов с накопленными к началу данной работы данными о последовательностях арктических видов приведено в таблице 2.

Таким образом, одним из результатов данной работы можно считать пополнение базы нуклеотидных последовательностей для морских беспозвоночных Арктики.

Таблица 2. Число видов морских беспозвоночных, для которых получены последовательности фрагмента СО1 (проведен «молекулярный баркодинг»)

Тип Класс Число Число Число Число

видов, в особей видов, особей

базе изученных

данных в данной

1ВОЬ работе

Annelida Polychaeta 177 1301 86 543

Arthropoda Malacostraca 101 1302 40 200

Maxillopoda 36 152 3

Ostracoda 6 21 -

Pycnogonida 6 42 3

Brachiopoda 3 11 1

Chaetognatha 4 8 1 10

Chordata Actinopterygii 159 806

Elasmobranchii 19 61

Ascidiacea 5 35

Cnidaria 18 45 16 103

Echinodermata 37 333 16 100

Echiura 1 1

Mollusca Bivalvia 15 35 23 100

Cephalopoda 9 83

Gastropoda 18 84 40 200

Polyplacophora 3 30 2 15

Nematoda 9 12

Sipuncula 1 1

Общее число 631 4345 244 1405

Сравнение результатов молекулярно-генетического анализа с морфологическими данными. Район Кандалакшского залива в окрестностях ББС МГУ в настоящее время, возможно, изучен лучше, чем любой другой участок Мирового океана. В течение последних 60 лет на Беломорской биостанции во время полевого сезона работают специалисты по самым разным

18

группам морских беспозвоночных. В результате создан каталог биоты Белого моря, издан атлас его флоры и фауны. Таким образом, реализуется одна из самых ответственных и трудоемких стадий - точное определение видовой принадлежности объекта. Однако до настоящего времени при исследованиях использовали лишь методы классической зоологии. Хорошо известно, что применение молекулярно-генетических методов в зоологии нередко приводит к пересмотру таксономического положения многих отдельных видов и групп животных. В данном исследовании появилась возможность сравнить результаты применения морфологических методов с молекулярно-генетическими данными.

Показано, что из 244 исследованных беломорских видов только в 7 случаях были найдены комплексы видов, объединенные под одним названием. Единственным примером недостаточной изученности морфологии и, как следствие, существования псевдокриптических видов может служить медуза Cyanea capillata, при дополнительном морфологическом исследовании которой были найдены заметные морфологические различия.

Необходимо отметить, что число несоответствий между результатами молекулярного анализа и данными морфологии и, как следствие, число обнаруженных криптических видов в случае полихет больше (4) по сравнению со всеми другими таксонами (0 для ракообразных, 1 для всех моллюсков и т.д.). В случае моллюсков это может объясняться тем, что именно при изучении представителей этого таксона, обитающих в Белом море, ранее уже интенсивно применялись молекулярно-генетические методы (Vainola and Strelkov, 2010). В случае ракообразных это объяснить сложнее, возможно, в будущем эта ситуация изменится.

Сравнение результатов анализа митохондриальных и ядерных маркеров. Результаты проведенного исследования показали, что во многих случаях использование только митохондриальных маркеров приводило бы к значительным ошибкам и искажениям имеющейся картины. Это позволяет критически относится к данным, представленным в статьях и обзорах по «баркодингу» Арктики, и с значительной осторожностью - к оценкам биоразнообразия, полученным на основании использования только этого метода. В данном разделе рассматриваются примеры несовпадения результатов, полученных при использовании последовательностей митохондриальных и ядерных маркеров.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Получены последовательности митохондриального (фрагмента гена COI) и ядерного (фрагмента гистона 3) маркеров для 244 видов, из них 86 видов Polychaeta, 4 вида Bryozoa, 16 видов Cnidaria, 6 видов Chaetognatha, 5 видов Chordata, 40 видов Crustacea, 16 видов Echinodermata и 65 видов Mollusca. На обширном материале показана необходимость применения ядерных маркеров для молекулярно-генетического анализа биоразнообразия. Впервые проведен анализ внутрипопуляционной изменчивости ядерной ДНК по фрагментам двух ядерных генов. Показан чрезвычайно низкий уровень геномного полиморфизма в популяциях беспозвоночных Кандалакшского залива. При изучении 244 видов с применением молекулярно-генетических методов обнаружено семь случаев, когда под одним видовым названием объединялись комплексы видов: Cyanea capillata (Cnidaria, Scyphozoa), Scoloplos armiger (Annelida, Polychaeta, Orbiniidae), Eteone longa (Annelida, Polychaeta, Phyllodocidae), Terebellides stroemii (Annelida, Polychaeta, Terebellidae), Harmothoe imbricata (Annelida, Polychaeta, Polynoidae), Psolus phantapus (Echinodermata, Holothuroidea), Dendronotus dalli (Mollusca, Gastropoda, Dendronotidae). На основании генетических данных и впервые обнаруженных значительных морфологических различий описан новый вид рода Суапеа, С. tzetlinii sp. nov. Kolbasova, Neretina. Показано наличие митохондриальной интрогрессии для видов Lumbrineris fragilis (Annelida, Polychaeta, Lumbrineridae) и Brada inhabilis (Annelida, Polychaeta, Flabelligeridae), что свидетельствует о необходимости использовать ядерные маркеры для изучения биоразнообразия. Был подтвержден статус вида-космополита для Pygospio elegans (Annelida, Polychaeta, Spionidae) и, в противоположность этому, показано, что вид гарпактикоид Nannopus palustris (Crustacea, Copepoda, Harpacticoida), считавшийся ранее видом-космополитом, представляет из себя комплекс видов, причем вид, обитающий в Белом море, наиболее сильно отличается от всех других.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что применение молекулярно-генетических методов при изучении биоты с относительно низким уровнем биоразнообразия, которая исследуется в течение более чем 60 лет с применением морфологических методов специалистами по различным группам беспозвоночных животных, дает возможность выявить криптические или псевдокриптические виды и уточнить таксономический статус большого числа видов.

2. На основании анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов ядерных и митохондриального генов проведена генетическая ревизия 244 видов беспозвоночных Кандалакшского залива и обнаружены 7 новых видов-двойников у Scoloplos armiger (Annelida, Polychaeta, Orbiniidae), Eteone longa (Annelida, Polychaeta, Phyllodocidae), Terebellides stroemii (Annelida, Polychaeta, Terebellidae), Harmothoe imbricata (Annelida, Polychaeta, Polynoidae), Psolus phantapus (Echinodermata, Holothuroidea), Dendronotus dalli = Dendronotus niveus sp. nov (Mollusca, Gastropoda, Dendronotidae), Cyanea capillata (Cnidaria, Scyphozoa).

3. В результате комплексного генетического и морфологического анализа описан новый вид рода Cyanea, Cyanea tzetlinii sp. nov. Kolbasova, Neretina.

4. Показано, что использование только мтДНК приводит к значительным ошибкам и искажениям таксономической принадлежности. Совместное использование ядерных и митохондриальных маркеров позволило выявить криптические виды и случаи митохондриальной интрогрессии.

5. На основании анализа последовательностей фрагмента гистона 3 и внутренних транскрибируемых спейсеров (ITS) сделан вывод об очень низком (< 0,3%) полиморфизме ядерной ДНК изученных популяций морских беспозвоночных Кандалакшского залива.

6. Низкий уровень внутрипопуляционного полиморфизма морских беспозвоночных Белого моря свидетельствует об их особой уязвимости при резких изменениях окружающей среды, что обосновывает необходимость строгих мер по охране биоразнообразия этого региона.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

Статьи в рецензируемых журналах:

1. Ekimova I., Korshunova T., Schepetov D., Neretina T., Sanamyan N., Martynov A. Integrative systematics of Northern and Arctic nudibranchs of the genus Dendronotus (Mollusca, Gastropoda) with descriptions of three new species // Zoological Journal of the Linnean Society. - Blackwell Publishing Inc. (United Kingdom). -2015. -V.173. -P.841-886.

2. Garlitska L., Neretina T., Schepetov D., Mugue N., De Troch M., Baguley J.G., Azovsky A. Cryptic diversity of the 'cosmopolitan' harpacticoids copepod

Nannopuspalustris: genetic and morphological evidence // Molecular Ecology. -Blackwell Publishing Inc. (United Kingdom). -2012. -V.21. -P.5336-5347.

3. Kolbasova G. D., Zalevsky A.O., Gafurov A. R., Gusev P. O., Ezhova M.A., Zheludkevich A.A., Konovalova O.P., Kosobokova K. N., Kotlov N.U., Lanina N.O., Lapashina A. S., Medvedev D. O., Nosikova K.S., Nuzhdina E.O., Bazykin G.A., Neretina Т. V. A new species of Cyanea jellyfish sympatric to C. capillata in the White Sea // Polar Biology. - 2015. - DOI: 10.1007/s00300-015-1707-y

4. Petrunina A.S., Neretina T.V., Mugue N.S., Kolbasov G.A. Tantulocarida versus Thecostraca: inside or outside? First attempts to resolve phylogenetic position of Tantulocarida using gene sequences // Journal of Zoological Systematics and Evolutionary Research. -2014. -V.52. -P.100-108.

5. Radashevsky V. I., Neretina Т. V., Pankova V. V., Tzetlin А. В., Jin-Woo Choi. Molecular identity, morphology and taxonomy of the Rhynchospioglutaea complex with a key to Rhynchospio species (Annelida, Spionidae) // Systematics and Biodiversity. -Cambridge University Press (United Kingdom). - 2014. -V.12. -P.424-433.

6. Неретина T.B., Мюге H.C., ДНК-штрихкодирование организмов // Природа. -2013. -N2. - С. 73-75.

Заказ №41-А/06/2015 Подписано в печать 22.06.2015 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,0

^•'-■■■.'д ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30

I'Л?)\ \vw\v.с/г.ги ; е-таИ:гак@с/г.ги

2015674553

1 5 - - 8 9 2 8

2015674553