Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетическая природа первичных гемофагоцитарных лимфогистиоцитозов в России

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическая природа первичных гемофагоцитарных лимфогистиоцитозов в России"



На правах рукописи

Мнлованова Наталья Викторовна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ПРИРОДА ПЕРВИЧНЫХ ГЕМОФАГОЦИТАРНЫХ ЛИМФОГИСТИОЦИТОЗОВ В РОССИИ

03.02.07 - генетика 14.01.21 - гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 7 ФЕВ 2011

МОСКВА, 2011

4854286

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Медико-генетическом научном центре РАМН

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Поляков Александр Владимирович

кандидат медицинских наук Масчан Михаил Александрович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Журков Вячеслав Серафимович

кандидат медицинских наук, Бронин Глеб Олегович

Ведущая организация: ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет Росздрава (РГМУ)

Защита состоится « IV» О 3 2011 г. в « I ^ » часов на заседании Диссертационного совета Д 001.016.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук Медико-генетическом научном центре РАМН по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Медико-генетического научного центра РАМН по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1.

Автореферат разослан «01» _ ПХ 2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 001.016.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций,

доктор медицинских наук, профессор Зинченко P.A.

Актуальность проблемы

Гемофагоцитарные лимфогистиоцитозы (HLH - Hemophagocytic lymphohistiocytosis) - группа иммунологических заболеваний, характеризующаяся неконтролируемой пролиферацией цитотоксических лимфоцитов и гистиоцитов со стремительным фатальным течением без специальной терапии. Основными клиническими симптомами HLH являются лихорадка, гепатоспленомегалия, поражение ЦНС. Основными лабораторными показателями являются би- или пан-цитопения, гипертриглицеридемия, гиперферритинемия, гипофибриногенемия. При гистологических исследованиях обнаруживают лимфогистиоцитарную инфильтрацию и гемофагоцитоз (Janka G. E.et al., 1983).

Выделяют две формы HLH: первичные (наследственные) и вторичные. Вторичные формы HLH ассоциированы с различными инфекциями, онкологическими, аутоиммунными и другими заболеваниями, они являются более частыми и встречаются как у детей, так и у взрослых и требуют иной тактики лечения, чем первичные HLH (Janka G.E. et al., 1998). В ряде случаев нельзя клинически различить первичные и вторичные формы HLH. В данных случаях только молекуляр-но-генетическое исследование дает возможность правильно поставить диагноз и выбрать тактику лечения пациента.

Семейный гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз (FHL) и Х-сцепленный лимфопролиферативный синдром (XLP) являются разновидностями первичных HLH. По международным данным частота FHL, наиболее распространенной формы первичных HLH, составляет 1 на 50 ООО новорожденных (Henter J. I. et al., 1991), a XLP - от 1 до 3 на 1 ООО ООО новорожденных мальчиков (Purtilo D. T.et al., 1991). Генетически выделяют пять форм FHL: FHL1 (ген неизвестен, локус 9q21.3-22), FHL2 (ген PRF1, локус 10q21-22), FHL3 (ген UNC13D , локус 17q25), FHL4 (ген STX11, локус 6q24.1) и FHL5 (ген STXBP2, локус 19р13.3-13.2). Наиболее частой генетической формой заболевания в мире является FHL2 (ген PRF1, мутации в котором ответственны за 20 - 50% случаев заболевания). Ген PRF1 кодирует белок перфорин, участвующий в образовании пор в мембране клетки-мишени. Белок Muncl3-4 (ген UNCI 3D, мутации в котором выявляют у 20 - 25% FHL пациентов) отвечает за последние этапы связывания цитотоксической гранулы с мембраной NK-, CTL- клеток. Белки синтаксин (ген STX11, мутации обнаруживают у 10 -20 % FHL пациентов) и Muncl8-2 (ген STXBP2) тесно взаимодействуют друг с другом и регулируют экзоцитоз цитотоксических гранул (http://vww.ncbi.nlm.nih.gov^ooksheli7br.fcgi?book=gene&part=hlh#hlh.Summary).

XLP- редкий первичный иммунодефицит, характеризующийся патологической реакцией организма на инфицирование вирусом Эпштейна-Барр (EBV). EBV вызывает развитие фульминантного инфекционного мононуклеоза, приводящего к HLH. В настоящее время известно две генетические формы заболевания, XLP1 - ген SH2D1A и XLP2 - ген BIRC4. Ген SH2D1A кодирует белок SAP, ответственный за передачу сигнала активации цитотоксического лимфоцита, за созревание NKT-клеток, за последние этапы дифференцировки В-клеток и Т-клеточный го-меостаз. Ген BIRC4 кодирует Х-сцепленный ингибитор апоптоза . По литературным данным мутации в гене SH2D1A находят у 16-60% , а в гене BIRC4 у 20% XLP пациентов (Filipovich А. Н. et al., 2010).

Лечение FHL и XLP больных обычно проводится по протоколу HS2004 с последующим обязательным проведением трансплантации костного мозга (ТКМ). Без специального лечения и ТКМ эти заболевания являются летальными.

И FHL, и XLP являются генетически гетерогенными заболеваниями, и лишь молекулярно-генетическое исследование может определить генетическую форму болезни. До настоящего времени в России не была определена частота распространенности различных генетических форм FHL, не изучен спектр мутаций, приводящих к этому заболеванию, не разработан алгоритм молекулярно-генетического обследования таких пациентов.

Цель исследования:

Исследование молекулярно-генетической природы первичных гемофагоци-тарных лимфогистиоцитозов в группах российский больных.

Задачи исследования

1. В группе российских FHL пациентов исследовать кодирующие последовательности генов PRF1, UNCI 3D, STXI1 и STXBP1, ответственных за развитие FHL, а также генов SH2D1A и BIRC4, ответственных за развитие XLP, включая прилегающие области экзон-интронных соединений. Изучить частоты встречаемости различных генетических форм FHL, определить спектр мутаций, определяющих развитие этого заболевания среди российских больных.

2. В группе российских XLP пациентов провести исследование кодирующих последовательностей генов SH2D1A и BIRC4, ответственных за развитие этого заболевания, включая прилегающие области экзон-интронных соединений. Определить частоты встречаемости двух основных генетических форм заболевания (XLP1 и XLP2).

3. Для наиболее часто встречающихся мутаций определить причины их распространенности в исследуемой выборке, разработать эффективные методы диагностики. Исследовать корреляцию генотип-фенотип и прогностическое значение наиболее распространенных генетических форм.

4. На основании полученных результатов разработать оптимальный алгоритм молекулярно-генетической диагностики первичных гистиоцитозов среди российских больных.

Научная новизна

Впервые в России проведено молекулярно-генетическое обследование российских FHL и XLP пациентов. Определен спектр мутаций в генах PRF1, UNCI 3D, STX11, STXBP2, SH2D1A и BIRC4, определяющих развитие этих заболеваний у российских FHL и XLP пациентов.

Проведен анализ частоты встречаемости различных генетических форм FHL в группе российских больных. Впервые разработан алгоритм молекулярно-генетического анализа российских FHL пациентов.

Впервые в России проведен анализ причин высокой доли отдельных мутаций в исследуемой выборке. Показано влияние эффекта основателя на распространение этих мутаций в России.

Исследована корреляция генотип-фенотип для наиболее распространенной генетической формы - РНЬЗ и выполнена оценка влияния генетической формы заболевания на результаты терапии.

Разработан быстрый, простой и недорогой способ одновременного выявления трех наиболее частых мутаций в гене иыаЗИ с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции.

Проведено молекулярно-генетическое исследование группы российских пациентов с клиническим диагнозом ХЬР (Х-сцепленный лимфопролифератив-ный синдром). Изучен спектр мутаций, приводящих к развитию этого заболевания.

Практическая значимость

Разработанная методика проведения молекулярно-генетического анализа РНЬ и ХЬР может быть использована для подтверждающей, дифференциальной, пресимптоматической и пренатальной диагностики этих заболеваний.

Сочетание методов клинической и молекулярно-генетической диагностики поможет врачам в выборе тактики лечения таких больных, в частности в решении вопроса о целесообразности проведения ТКМ для каждого конкретного больного.

Своевременная молекулярно-генетическая верификация диагноза позволяет ускорить планирование и реализацию программной химиотерапии и трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, и, таким образом, увеличивает вероятность излечения пациентов с РНЬ.

Использование разработанного алгоритма молекулярно-генетического обследования российских больных поможет сделать проведение данной диагностики более эффективной, быстрой и менее дорогостоящей.

Положения, выносимые на защиту

Разработана методика молекулярно-генетического обследования российских РНЬ и ХЬР пациентов.

^ Определен спектр мутаций, приводящих к развитию заболевания в группе российских РНЬ пациентов.

Определен спектр мутаций, приводящих к развитию ХЬР в группе российских пациентов.

Наиболее частой генетической формой РНЬ в исследованной группе российских РНЬ пациентов является РНЬЗ, обусловленная мутациями в гене ШС1Ю.

^ Причиной высокой частоты РНЬЗ в России является распространение в популяции отдельных мутаций в результате эффекта основателя.

^ Разработанный алгоритм молекулярно-генетического обследования российских РНЬ пациентов увеличит эффективность и ускорит проведение анализа.

Апробация работы

Материалы диссертации представлены на следующих конференциях: Ежегодные конференции Европейского общества генетики человека (Е8НО) в 2008 году (г. Барселона, Испания), 2009 году (г. Вена, Австрия), 2010 году (г. Гетеборг,

Австрия)- стендовое сообщение; 24-я Ежегодная конференция международного общества гистиоцитологов в 2008 году (г. Берлин, Германия) - доклад; VI симпозиум «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний» в январе 2009 года (г. Москва) - доклад; 25-я Ежегодная конференция международного общества гистиоцитологов в 2009 году (г. Бильбао, Испания) -стендовое сообщение; XI Всероссийский научный форум с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» в 2009 году (г. Санкт-Петербург) - доклад; Международная научно-практическая конференция «Актуальные вопросы первичных иммунодефицитов» в 2009 году (г. Минск, Беларусь)- доклад; VI съезд Российского общества медицинских генетиков в 2010 году (г. Ростов) -доклад

Личный вклад автора в проведение исследования

Автор лично принимал участие в анализе отечественной и зарубежной литературы по теме диссертации, планировании экспериментов и получении основной части результатов. Автор самостоятельно осуществлял выделение и анализ ДНК из образцов крови пациентов, проводил поиск мутаций в исследуемых генах методом прямого автоматического секвенирования, самостоятельно анализировал все полученные результаты.

Публикации

Результаты диссертационной работы отражены в 11 печатных работах. Из них 3 статьи опубликованы в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ.

Внедрение результатов работы

Результаты исследований и практические рекомендации внедрены в работу МГНЦ РАМН.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 104 страницах машинописного текста состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка использованной литературы. Библиография содержит 72 источника, из них 3 отечественных и 69 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 13 таблицами и 19 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Для исследования использовали образцы геномной ДНК 26 семей с клиническим диагнозом ЕНЬ (28 больных ребенка, 37 здоровых родственников) и 11 мальчиков с клиническим диагнозом ХЬР из различных регионов России (рисунок 1). Все пациенты обследованы или проконсультированы в РДКБ (Республиканской детской клинической больницы) или ФГУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии».

Анализ клинических характеристик и исследование клинико-генетической корреляции проводились на основании ретроспективного анализа доступной ме-

дицинской документации. Статистический анализ выполнен в программе Statis-tica 7.0. Сравнение средних и медиан выполнено с помощью точного теста Фишера. Расчет общей выживаемости по методу Kaplan-Meier. Сравнение выживаемости между группами на основании log-rank теста.

Контрольная выборка взята из банка лаборатории ДНК диагностики МГНЦ РАМН. Её составили 100 необследованных детей того же возраста из различных регионов России (50 мальчиков и 50 девочек).

Выделение геномной ДНК проводили с помощью набора DNA Prep 100 Diatom ™ из образцов периферической крови.

Исследование генов PRFI, UNC13D, STX11, STXBP2, RAB27A, BIRC4 и SH2D1A проведено с помощью прямого автоматического секвенирования кодирующих областей генов, включая области экзон-интронных соединений. Амплификация необходимых фрагментов геномной ДНК проведена методом ПЦР на программируемом термоциклере МС2 фирмы «ДНК-технология» (Россия) Все фрагменты секвенированы с обеих цепей ДНК с использованием Big Dye Terminator's v 1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) и генетического анализатора ABI PRISM 3130x1 (Applied Biosystems), анализ результатов секвенирования проведен с помощью программы Chromas.

В случае обнаружения у пациента двух мутаций в одном гене, проведено исследование образцов ДНК родителей для подтверждения транс-положения обнаруженных изменений нуклеотидной последовательности.

При исследовании гаплотипа основателя для повторяющихся мутаций в гене UNC13D были выбраны 8 микросателлитных маркеров на хромосоме 17q25, расположенных в области размером 7,4 млн.п.н. вокруг исследуемого гена. Физическая и генетическая локализация маркеров на хромосоме оценена с помощью карт Sequence и Marshfield той же базы. Для каждого из маркеров выбраны и синтезированы пары праймеров. Амплификацию фрагментов проводили в стандартных объеме и составе реакционной смеси. Результаты оценены с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с последующим окрашиванием геля раствором бромистого этидия и регистрацией с помощью документирующей системы GelDoc фирмы BIO-RAD в УФ-излучении.

Для одновременного обнаружения трех наиболее часто встречающихся мутаций в гене UNC13D использовали мультиплексную амплификацию. Такая реакция позволяет одновременно амплифицировать и регистрировать несколько фрагментов разной длины. Этот метод значительно дешевле, проще и быстрее, чем прямое автоматическое секвенирование.

При выявлении у пациентов ранее неописанных нуклеотидных замен, которые приводят к изменениям в аминокислотных последовательностях, исследованы частоты их встречаемости в контрольной группе методом ПДАФ- или ПДРФ-анализов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование кодирующей последовательности генов в группе FHL пациентов

При исследовании гена PRF1 выявлен один пациент - носитель двух мутаций:

S ранее описанная миссенс-мутация c.916G>T (p.306Gly>Cys), приводящая к изменению аминокислотной последовательности в области MAC домена (Trizzino et al.,2008).

S ранее не описанная нонсенс-мутация c,1283G>A (р.428 Trp>Stop), приводящая к образованию преждевременного стоп-кодона в области, кодирующей С2 домен белка.

Исследование всех экзонов и прилегающих областей экзон-интронных соединений гена UNCI 3D проведено в 25 образцах ДНК FHL пациентов.

При исследовании гена UNCI 3D найдено 13 мутаций в 13 семьях на 23 хромосомах. Выявлены 1 гомозиготный (GL17) и 9 компаунд-гетерозиготных носителей двух различных мутаций (GL1-5,19,27, 32,33) в этом гене. Три пациента (GL8, GL15, GL18) оказались гетерозиготными носителями одной мутации в гене UNCI 3D.

Три мутации в гене UNCI 3D c.l828insA (на двух хромосомах), c.2346_2349del (на четырех хромосомах) и c.3037insG (на пяти хромосомах)) выявлены на одиннадцати хромосомах в группе российских FHL пациентов. Это составляет 48% всех хромосом с мутацией, найденных в гене UNC13D. Высокая суммарная частота выявляемое™ этих трех мутаций делает целесообразным использование системы с использованием ПЦР-ПДАФ для одновременной диагностики этих мутаций, в качестве первого этапа исследования выборки российских пациентов.

Из 13 мутаций в гене UNCI 3D, выявленных в результате проведенного исследования, 9 впервые описаны в данной работе (табл.1).

По две мутации в гене UNCI 3D найдены у 10 из 26 FHL пациентов. Доля FHL3 формы заболевания в исследованной группе составила 38%. Частота этой формы FHL в мире по литературным данным составляет от 17% в Германии (Zur Stadt U. et al., 2006) до 25% в Японии (Ishii Е. et al., 2005)

Исследование гена STX11 проводилось в образцах ДНК 15 пациентов с неподтвержденным на первых этапах молекулярно-генетически FHL диагнозом. Выявлена одна ранее не описанная мутация c.675_679del во втором экзоне гена STX11 у пациента GL9 в гомозиготном состоянии. Обнаруженная мутация приводит к делеции трех аминокислот, вставке одной новой, исчезновению стоп-кодона и, предположительно, к образованию более длинной мРНК (p.H225_L227delinsHFsX127). Частота этой формы FHL сильно зависит от этнической принадлежности пациентов. Например, у курдов FHL4 выявляют у 20% пациентов, что связано с распространенностью в этой популяции нескольких мутаций, в других странах регистрируют единичные случаи FHL4 (Marsh R.A. et al., 2010).

I i

Петропавловск-Камчатский о л

ОН

OKHOTSK

Комсомольск на Ai^iype

ковородин^ Виро6иджаН1/ ^ 'НО Сахалинск

х Хабаровск

Благовещенск -

ЗМфЦК JJionvHO»

Иркутск ^

*.....••"XvAshgabat .Tashkent i- О^ТГ^ \

'^"""^VjJ**® ^%БИШК6|С '•**..,/

lamic .....

, i s t a n

H \ / Doited line represents approximately the Line of Control

Janiiflu in Jammu and Kashmir agreed upon by India and Pakistan.

. „ i*-. ThP> final stfthiR nf .Inmmn anrt Kashmir hflR nnt vpt hppn

Islamabad о ? Kashmir .... /PAKISTAN

The final status of Jammu and Kashmir ha3 not yet been agreed uoon by the parties.

8i>o

Ulaanbaalar

V

M О N * G О L I

1. ESTONIA 4. REP OF MOLDOVA 7. AZERBAIJAN

2. LATVIA 5. GEORGIA X. TAJIKISTAN

3. I ITHUANIA 6. ARMENIA У. KYRGYZSTAN

0 200 400 600 800 1000 mi The boundones and names shown and -he designations used on this map do not imply official endorsement or acceptance by the United Nations.

Рис. 1 Регионы России, в которых проживают пациенты, составившие исследованную РНЬ группу

FHL4 форма диагностирована только у одного из обследованных пациентов, что соответствует международным данным о доле данной генетической формы заболевания в разных популяциях.

После первых трех этапов исследования диагноз не был подтвержден генетически 14-ти FHL пациентам. При исследовании кодирующих последовательностей гена RAB27A, ответственного за развитие синдрома Griscelli, не выявлено ни одной мутации. Согласно литературным данным до 10% пациентов с клиническим диагнозом FHL имеют мутации в гене RAB27A, что обусловлено тем, что нарушение пигментации у этих пациентов может быть очень незначительным (http://\v\\4V.ncbi.nlm.nih.gov^ookshelf/br.fcgi?book=gene&part=hlh#hlh.Summary). Табл. 1. Мутации в гене UNCI 3D, выявленные в исследованной группе российских FHL пациентов (жирным шрифтом выделены мутации, впервые описанные

Выявленная мутация Изменение аминокислотной последовательности экзон / нитрон На скольких хромосомах выявлена ссылка

с.919С>Т р.307С1п>81ор экзон 11 1 новая

C.1055+5G>A мутация сайта сплайсинга интрон 12 1 новая

c.l592G>A р.531Тгр>81ор экзон 18 1 новая

c.l828insA р.К610НР$Х6 экзон 20 2 новая

c.2216_2239del р.т39_8747с!еНп58 экзон 23 2 новая

С.28670Т р.956Рго>Ьеи экзон 30 1 новая

с.3011Т>С р.1004А$р>С1у экзон 31 1 новая

c.3037insG рЛ)1013СР$Х11 экзон 31 5 новая

с.3173Т>С р.1058Ьеи>Рго экзон 32 1 новая

c.2346_2349del р.117828Рз11 экзон 24 4 Е Яи(1<1 е1 а! 2008

c.627delT Р.Т209ТРБХ40 экзон 8 1 Е ЯисШ й а1 2008

c.322-lG>A мутация сайта сплайсинга интрон 4 1 ЗаШого й а1 2006

с.2782С>Т p.928Arg>Cys экзон 29 2 Е Я.и(М е! а1 2008

После первых четырех этапов исследования диагноз остался не подтвержденным молекулярно-генетически у 14 пациентов. В образцах ДНК этих больных проведен поиск мутаций в гене STXBP2, ответственном за развитие FHL5 формы заболевания. Мутации в этом гене в исследованной FHL группе не выявлены, хотя по литературным данным эта форма заболевания встречается у 16% FHL пациентов в центральной Европе (Johnson J. et al., 2010; Zur Stadt U. et al., 2009).

Из 14 пациентов с неподтвержденным молекулярно-генетическим диагнозом FHL отобраны 10 мальчиков, семейный анамнез которых не позволял исключить Х-сцепленный тип наследования. При исследовании кодирующей последовательности гена SH2DIA обнаружены две мутации c,164G>T (p.55Arg>Leu) CD014961 (Dutz J.P. et al., 2001) у пациента GL14 и c.245_246insA (p.N82KFsX21) CI034488 у пациента GL34. Данные мутации приводят к развитию XLP согласно базе HGMD ( http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/gene.php?pene=SH2DlA). Таким образом, в группе FHL пациентов выявлено два мальчика с Х-сцепленным лимфопро-лиферативным синдромом. Зарубежные исследователи первичных гистиоцитозов подчеркивают возможную клиническую неразличимость FHL и XLP и рекомендуют всем мальчикам с диагнозом, неподтвержденным при исследовании FHL генов, обязательно проводить поиск мутаций в генах SH2D1A и BIRC4, ответственных за развитие XLP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi7book =gene&part=hlh#hlh.Summary). В исследованной FHL группе мутации в гене SH2D1A обнаружены у 2 пациентов из 26 обследованных. При исследовании данной группы пациентов в гене BIRC4 мутации не выявлены.

Исследование кодирующей последовательности генов SH2D1A и BIRC4 в группе XLP пациентов

При исследовании образцов ДНК 11 пациентов XLP группы у шести пациентов (D1, 2, 19, 20, 21 и 24) выявлены мутации в кодирующей последовательности гена SH2D1A.

У пациента D1 обнаружена делеция всего гена. Три пациента (D2, 19 и 20) оказались носителями нонсенс-мутации С.1630Т (p.55Arg>Stop) CD981809 (Coffey A.J. et al., 1998) в гемизиготном состоянии. Также в этом же кодоне выявлена мутация c.164G>T (p.55Arg>Leu) CD014961 (Dutz J.P. et al., 2001) у пациента из FHL группы. Возможно, в области кодона 55 расположена «горячая точка» мутаций гена SH2D1A.

Обнаружены две ранее не описанные мутации в гене SH2D1A. У 8- летнего мальчика с B-клеточной лимфомой и лимфоидным васкулитом выявлена инсер-ция c.53insA, приводящая к сдвигу рамки считывания и образованию преждевременного стоп-кодона (р.КК 18KFs49). 13-летний мальчик с фульминантным инфекционным мононуклеозом оказался носителем дупликации восьми нуклеоти-дов c.257_264dupCATTTCAG, которая проявляется в инсерции трех аминокислот, сдвиге рамки считывания и образовании преждевременного стоп-кодона.

По литературным данным мутации в гене SH2D1A находят у 16-60% XLP пациентов (Filipovich А.Н. et al., 2010; Sumegi J. et al., 2000). По-видимому, раз-

ница частоты выявляемое™ мутаций в гене БН201А обусловлена разными клиническими критериями отбора ХЬР пациентов в исследованные группы.

В нашей работе мутации в гене 8Н201А выявлены у 54% обследованных российских ХЬР пациентов, что хорошо соотносится с литературными данными.

При исследовании кодирующей последовательности гена ВШС4 мутации не обнаружены в ХЬР группе пациентов. А по литературным данным мутации ! гена ВШС4 выявляют в среднем у 20% ХЬР пациентов (^аис! Б. й а1., 2006).

Разработка метода выявления наиболее частых мутаций в гене

и мат

В ходе исследования кодирующей последовательности гена ШС13В в группе российских больных встретились повторяющиеся мутации. Инсерция с.1828т$А выявлена на двух хромосомах, делеция с.2216-2239с1е1 - на двух хромосомах, делеция с.234б_2349с!с1 - на четырех хромосомах, инсерция с.3037шя0 - на пяти хромосомах. Эти три мутации (с.1828тзА, с.2346_2349(1е1, с.3037т$0) составили 48% от хромосом с мутацией, выявленных в гене £/АЮЮ. Эти три мутации обнаружены у 9 РНЬ пациентов, что составляет 34% от всех обследованных больных и 69% от пациентов с мутациями в гене (УЛО.З£>. Были выбраны праймеры и подобраны условия для проведения мультиплексной амплификации, позволяющей регистрировать 3 наиболее частые мутации. Результаты представлены на рис. 2.

Данный метод обладает высокой степенью информативности, исследование продолжается не более двух дней, не требует использования дорогих реактивов и сложных методических подходов. Таким образом, разработан простой, быстрый и недорогой метод диагностики наиболее частых мутаций гена иЫС130.

12 3 4

■■■■■■■■■нн

97 п.н. - ти^

101 п.н. - N

82 п.н. - ти1:;

,., .... ,■■.... ......... 81 п.н. - N

'Д<ЙЙ8| Г V 70 п.н. - ти-^

69 п.н. - N

Рис. 2. Использование мультиплексной ПЦР для выявления наиболее частых мутаций гена ЦЖЛЗБ.

Примечание: Дорожка 1 и 4 - мутация с.1828шзА в гетерозиготном состоянии; Дорожка 2 - мутация с.3037тзС в гетерозиготном состоянии; Дорожка 3 - мутация с.2346_2349с!е1 в гетерозиготном состоянии

Исследование гаплотипов хромосом, несущих мутации с.ЗОЗЛтС и с.2346-2349(1е1

При исследовании кодирующей последовательности гена иИС13й выявлены две наиболее часто повторяющиеся мутации (делеция с.2346_2349(1е1 - на четырех хромосомах в семьях вЫ, 5, 19 и 33, инсерция с.3037шзС - в четырех семьях вЫ, 2, 4, 17, на пяти хромосомах). Для семьи СЬЗЗ не удалось получить образцы крови родителей больного ребенка, поэтому эту семью исключили из дальнейшего исследования. Все эти семьи прибыли из различных регионов России:

вЫ - Свердловская область,

вЬ2 - Ханты-Мансийский автономный округ,

- Кемеровская область, вЬ5 - Новгородская область, ОТЛ7 - Башкортостан, вЬ19 - Брянская область, вЬЗЗ - Ярославская область.

Было предположено, что высокая доля данных мутаций может объясняться, так называемым «эффектом основателя».

Для исследования гагоютипа основателя выбраны восемь микросателлит-ных повторов на хромосоме ^25, расположенных в области размером 7,4 млн.п.н. (9,2 сМ), содержащей исследуемый ген. Для определения гаплотипов хромосом, несущих мутации, проведено-исследование образцов ДНК больных детей, их родителей и здоровых сибсов. Полные гаплотипы всех хромосом с мутациями указаны в табл. 2 и 3. В семье в1Л7 выявлено одно рекомбинационное событие на хромосоме, несущей мутацию с.30371ш0.

Табл. 2 Гаплотипы хромосом с мутацией с.3037т$С по восьми микроса-

Маркер D17S 1831 D17S 1352 D17S 1301 D17S 1839 UNC13 D D17S 1603 D17S 785 D17S 939 D17S 802

сМ 97.60 98.14 100.02 102.46 mut 102.99 103.53 105.68 106.80

GL1 5 3 2 6 mut 7 1 8 8

GL2 5 6 2 6 mut 7 3 8 7

GL4 6 3 2 6 mut 7 2 6 9

GL17.2 ? 1 2 6 mut 7 1 7 7

GL173 ? 5 2 6 mut 7 1 7 7

Примечание: Жирным шрифтом выделены аллели, составляющие сохранившуюся часть гап-лотипа основателя

Табл. 3. Гаплотипы хромосом с мутацией с.2346_2349(1е1 по восьми микро-сателлитным локусам

Маркер 1831 0178 1352 0178 1301 0178 1839 иЛ'С13 й 0178 1603 0178 785 0178 939 0178 802

сМ 97.60 98.14 100.02 102.46 пни 102.99 103.53 105.68 106.8

ей 5 5 2 1 пни 2 3 9 10

3 1 5 1 пни 2 3 10 9

С1Л9 11 6 2 1 пни 2 3 8 7

Примечание: Жирным шрифтом выделены аллели, составляющие сохранившуюся часть гап-лотипа основателя

Для всех хромосом, несущих мутацию с.2346_2349<1е1, выявлен общий гап-лотип Б1781839-В1781603-0178785: 1-2-3. Для всех хромосом с мутацией с.3037тз0 также обнаружен общий гаплотип В1781301-Б1781839-В1781603: 26-7. Можно предположить, что данные гаплотипы являются сохранившимися частями гаплотипов хромосом, на которых исходно в популяции возникли эти мутации. Количественная оценка неравновесия по сцеплению и расчет возраста мутаций в данных случаях не проведены из-за небольшого числа семей с выявленными мутациями. Тем не менее, полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что наблюдаемое распространение мутаций с.2346_2349ёе1 и с.ЗСШшбО в России происходило в результате эффекта основателя. Высокую частоту встречаемости в России БНЬЗ формы заболевания, по-видимому, можно объяснить распространенностью отдельных мутаций, возникшей в результате эффекта основателя.

Исследование корреляции генотип-фенотип

Гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз - генетически гетерогенное заболевание. Различные генетические дефекты приводят к формированию сходного клинического фенотипа. Несмотря на строгие диагностические критерии, индивидуальное клиническое оформление болезни подвержено существенной вариации в части выраженности симптомов и лабораторных признаков болезни, возраста клинической манифестации и ответа на терапию. Соотнесение генетического дефекта с клиническим фенотипом необходимо для оптимизации клинической и лабораторной диагностики болезни, определения индивидуального прогноза, выбора тактики терапии и консультирования семьи.

В рамках настоящего исследования проведено сравнение основных клинических и лабораторных проявлений болезни, возраста манифестации, результатов иммуносупрессивной терапии, трансплантации костного мозга и исхода болезни в двух группах. Группы сравнения сформированы на основании результатов молекулярно-генетического анализа: группа 1 (РНЬЗ) и группа 2 (РНЬ2, РНЬ4, неустановленный дефект). Дополнительный анализ выполнен в группе 1

на основании сравнения пациентов с миссенс-мутациями (5 человек) и пациентов с мутациями, приводящими к сдвигу рамки считывания (5 человек).

Результаты анализа представлены в табл. 4.

Кривые выживаемости представлены на рисунке 3.

На основании проведенного анализа принципиальных различий в основных клинических и лабораторных проявлениях болезни и результатах терапии между выделенными группами не выявлено. Анализ клинико-генетической корреляции ограничен малым объемом выборки, биологической гетерогенностью группы 2 и неоднородностью терапии. Принципиально подтверждено, что единственным излечивающим методом терапии является аллогенная трансплантация костного мозга.

Табл. 4. Клиническая характеристика группы пациентов с клиническим диагнозом первичный гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз

Данные доступны, п Все пациенты (п=26) Группа 1 (РНЬЗ) (п=13) Группа 2 (РНЬ2, РНЫ, ХЬР, РНЬ?) (п=13) Р =

Пол м:ж 26 21:5 9:4 12:1 (10:1)4 0,3217

Возраст, месяцев медиана (разброс)1 26 8,5(0,7-116,5) 3,7(1-116) 16,2(0,7-104) 0,7124

ЦНС-поражение, п (%) 22 18(81) 9(81) 9(81) ПБ

Гемофагоцитоз, п (%) 23 10 (43) 7(64) 3(25) 0,099

ТКМ, п (%? 26 10(38) 7(54) 3(23) 0,22

рОЭ' 26 0,11±0,09 0,29±0,13 0,07±0,07 0,43

Продолжительность жизни, месяцев, медиана (разброс)4 26 9(0,1-171) 10,2 (1,3-87,6) 7,1(0,1-171,3) 0,60

Примечание: 1-возраст на момент клинической манифестации болезни; 2-ТКМ - трансплантация костного мозга; З-рОБ - вероятность общей выживаемости; 4-если исключить пациентов с верифицированным Х-сцепленным лимфопролиферативным синдромом

Алгоритм молекулярпо-генетического обследования российских РНЬ

пациентов

Схема проведенного исследования составлена с учетом частот встречаемости различных генетических форм РНЬ в мире. Но анализ полученных результатов показал, что в российской РНЬ выборке наиболее частой формой заболевания является РНЬЗ. В табл. 5 представлено сравнение доли отдельных форм РНЬ в выборке российских пациентов и в мире. Мутации в гене 1ШС13й, приводящие к развитию РНЬЗ, обнаружены на 23 из 52 исследованных хромосом (44% исследо-

ванных хромосом, FHL3 форма подтверждена у 38% пациентов), в то время как мутации гена PRFI, обуславливающие наиболее частую в мире FHL2 форму, -только на 2 хромосомах. Мутации в гене STXH (FHL4 форма) обнаружены также на 2 хромосомах. Мутации в гене SH2D1A, ответственном за развитие XLP, выявлены у двух пациентов из FHL группы.

•< UNCID vs

""I-I—.

pos-С,10, SE. 0,08 fi ■ "Л. evems - 21

а н « Й ^ и и ta ш ж IM "л uj 152

Бремя, месяца!

1 В

|| : UNCT3D pos» C.23..SE» 0.13. « » U. t r- j - 5.

' uynr* s-OS • e.37. SE « 0 3?. r, ■ 13. * ra»12

X, ■• .......

.....; 1 :•;•■■■;

•. - . • -

3 12 21 U « !3 72 И 15! 121 122 Н4 1« "Л 1Í3 Всемя, месяцы

- VHC!30

Общая выживаемость ТКМ vs. без ТКМ

--Вез ТКМ

Время, месяцы

Рис. 3. Кривые выживаемости РНЬ пациентов Примечание: А) общая выживаемость во всей группе; В) общая выживаемость в зависимости от генетического дефекта: РНЬЗ уб. другие и неустановленные; С) общая выживаемость в зависимости от терапии: ТКМ уз. без ТКМ.

Анализ наших результатов и литературных данных свидетельствуют о том, что высокая частота отдельных генетических форм РНЬ в различных регионах, обусловлена распространенностью отдельных мутаций в определенных популяциях, возникшей в результате эффекта основателя. В результате проведенной работы диагноз подтвержден 14 пациентам из 26 обследованных, что составило 54%. Следовательно, у 46% пациентов в России диагноз остается не подтвержденным молекулярно-генетически. Можно предположить наличие других, еще неизвестных, локусов, ассоциированных с развитием РНЬ у российских пациентов. Также следует подчеркнуть, что у двух пациентов из группы с клинически поставленным диагнозом РНЬ обнаружены мутации в гене БН201А, ответствен-

ном за развитие ХЬР. Поэтому, учитывая возможную схожесть клинических фенотипов БНЬ и ХЬР, следует рекомендовать всем мальчикам с клиникой РНЬ проводить исследование генов БНЮ1А и ВШС4 в случаях, когда семейный анамнез не позволяет исключить Х-сцепленный тип наследования.

Предположить субварианты ШЬ помогают два лабораторных исследования. Это определение экспрессии белка перфорина и маркера СБ 107а в Т-лимфоцитах и >Ж-клетках. Но эти тесты доступны лишь нескольким крупным исследовательским центрам в России, поэтому большинству пациентов эти исследования не проводят.

В результате проведенной нами работы создан алгоритм молекулярно-генетического исследования российских РНЬ пациентов (рис.4).

Таблица 5. Сравнение частот различных генетических форм РНЬ.

Ген Частота в исследованной выборке Частота, согласно литературным данным

ГШ (РЛЕ1) 1 из 26 (4%) 20-50%

РНЬЗ (иМС13й) 10 из 26 (38%) 20-25%

РНЬ4 (БТХИ) 1 из 26 (4%) 10-20%

РНЬ5 (БТХВР2) 0% 16-20%

зттл 2 из 26 (8%) Единичные случаи

втс4 0% Единичные случаи

11АВ27А 0% 10%

Алгоритм молекулярно-генетического исследования российских БНЬ пациентов учитывает:

^ малую доступность в России функциональных методов исследования;

^ распространенность отдельных мутаций в России; ^ доли различных форм БНЬ среди российских РНЬ пациентов; ^ клиническую схожесть ХЬР и РНЬ, синдрома Грисцелли и БНЬ; В алгоритме исследования можно выделить семь этапов:

> 1. Поиск наиболее частых мутаций в гене LWC/5Z) -БНО.

> 2. Исследование всех экзонов и прилегающих к ним областей экзон-интронных соединений гена 1ШС130 - БНО.

> 3. Поиск мутаций в гене БН201А (у мальчиков, у которых семейный анамнез не позволяет исключить Х-сцепленный тип наследования)- ХЬР1.

РН1. пациент

Нет

функционального анализа

Фун щи опальны й анализ

1 й этап

2й этап

Зй этап

4й этап

5й этап

6й этап

девочки

7й этап

мальчики, семейный анамнез которых не позволяет исключить Х-сцепленный тип наследования ** девочки и мальчики, семейный анамнез которых исключает Х-сцепленный тип наследования

Рис. 4. Алгоритм молекулярно-генетического исследования российских пациентов.

> 4. Исследование всех экзонов генов PRF1 и STX11, включая области экзон-интронных соединений (всем пациентам с диагнозом, молекулярно-генетически не подтвержденным на первых трех этапах - FHL2, FHL4.

> 5. Анализ гена STXBP2 - FHL5.

> 6. Исследование гена RAB27A - синдром Грисцелли.

> 7. Поиск мутаций в гене BIRC4 (у мальчиков)- XLP2.

Применение предложенного алгоритма ускорит постановку молекулярно-генетических диагнозов и поможет врачам выработать правильную тактику лечения таких пациентов (например, решить вопрос о целесообразности проведения ТКМ).

ВЫВОДЫ

1. На основе анализа основных генов, ответственных за развитие семейного гемофагоцитарного лимфогистиоцитоза, в группе российских пациентов определен спектр мутаций, ответственных за развитие заболевания. Установлено, что наиболее частой генетической формой заболевания в исследованной выборке является РНЬЗ, обусловленная мутациями гена иЫСИО. РНЬ2 форма заболевания диагностирована у 1, РНЬЗ - у 10, РНЬ4 - у 1 из 26 обследованных пациентов.

2. У двух пациентов РНЬ группы выявлены мутации в гене 8Н2Б1А, что подтверждает клиническую схожесть семейного гемофагоцитарного лимфогистиоцитоза и Х-сцепленного лимфопролиферативного синдрома и необходимость исследования у РНЬ пациентов генов, ответственных за развитие ХЬР. В гене ВШС4 мутации не обнаружены.

3. Установлено, что основной формой Х-сцепленного лимфопролиферативного синдрома в исследованной ХЬР выборке российских пациентов является ХЬР1, обусловленная мутациями в гене 5Я2£)/Л. Эта форма заболевания выявлена у 54% обследованных пациентов. ХЬР2 форма, обусловленная мутациями в гене ВШС4, не обнаружена.

4. Для спектра мутаций гена 1ЖС13Э в выборке российских пациентов характерно наличие повторяющихся мутаций. Для трех из них (с.1828тзА, с.2346_2349с1е1 и с.3037шбО) разработана быстрая и эффективная система диагностики с использованием мультиплексной ПЦР. Эффективность этой системы составляет 48%.

5. Анализ гаплотипов хромосом, несущих делецию с.2346_2349с!е1 и инсерцию с.3037тзС (двух наиболее распространенных мутаций в гене иЫС130) показал, что высокая частота встречаемости этих мутаций в выборке российских РНЬ пациентов, вероятно, обусловлена эффектом основателя.

6. Анализ клинико-генетических корреляций клинических и лабораторных проявлений болезни и результатов терапии не выявил различий между

группами пациентов, выделенными согласно генетическим формам FHL, что, возможно, объясняется малым объемом выборок. Согласно полученным данным подтверждено, что единственным эффективным методом лечения FHL пациентов является трансплантация костного мозга.

7. Разработан алгоритм молекулярно-генетического обследования российских больных с диагнозом семейного гемофагоцитарного лимфогистиоцито-за, определяющий последовательность анализа генов, ответственных за развитие данного заболевания.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

1. N.V. Poltavets (Milovanova), М.А. Maschan, A.V.Polyakov, G.A.Novichkova, A.A.Maschan. Six new mutations in UNCI 3D gene in Russian patients with familial hemophagocytic lymphohistiocytosis (FHL) II Europ. J. Hum. Genet. ESHG, May 2008, Barcelona, Spain. - 2008. - V.16. - suppl 2. - P.247.

2. N.V. Poltavets (Milovanova), M.A. Maschan, A.V.Polyakov, G.A.Novichkova, A.A.Maschan. Mutations in UNCI 3D gene are the most frequent cause of FHL in a group of Russian patients. // Pediatric Blood & Cance. 24th annual meeting of the Histiocyte society, October 2008, Berlin, Germany. -2009. -V.53. - Issue 4,- Р.685-Ч597.

3. M.A. Maschan, N.V. Poltavets (Milovanova), I.G. Sermyagina, V.V. Zab-nenkova, I.V.Kondratenko, G.A. Novichkova, A.A.Maschan , A.V.Polyakov. RAB27 mutations not detected in russian patients with Familial hemophagocytic lymphohistio-cytosis(FHL) and X-linked lymphoproliferative syndrome (XLP).//25th annual meeting of the Histiocyte society, September 2009, Bilbao, Spain. - 2009. - P. 57

4. N.V. Poltavets (Milovanova), M.A. Maschan, I.G. Sermyagina, V.V. Zab-nenkova, I.V.Kondratenko, G.A. Novichkova, A.A.Maschan , A.V.Polyakov. Five SH2D1A mutations on 7 chromosomes detected in russian patients with X-linked lymphoproliferative syndrome (XLP) ).// 25th annual meeting of the Histiocyte society, September 2009, Bilbao, Spain. - 2009. - P.57.

5. N.V.Poltavets (Milovanova), M.A.Maschan, I.G.Sermyagina, A.V.Polyakov, I.V.Kondratenko, A.A.Maschan, G.A.Novichkova (2009) Four SH2D1A mutations on 7 chromosomes detected in Russian patients with X-linked lymphoproliferative syndrome (XLP) // Europ. J. Hum. Genet. ESHG, May 2009, Vienna, Austria. - 2009. -V.17. - suppl 2. - P.347.

6. Полтавец H.B. (Милованова), Масчан M.A., Поляков A.B., Новичкова Г.А., Масчан А.А. (2009) Генетический анализ первичного гемофагоцитарного лимфогистиоцитоза в России. // Онкогематология, Материалы VI симпозиума «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний», январь 2009, Москва. - 2008. - № 4. - с. 40.

7. Полтавец Н.В. (Милованова), Масчан М.А., Масчан А.А., Новичкова Г.А., Поляков А.В. (2010) Мутации в гене UNC13D - наиболее частая причина семейного гемофагоцитарного лимфогистиоцитоза в группе российских больных Медицинская генетика. - 2010. - Т.9, №3. - С.26-33.

8. N.V. Poltavets (Milovanova), M.A. Maschan, A.V.Polyakov, G.A.Novichkova, A.A.Maschan (2010) STXBP2 mutations are not detected in group of Russian patients with Familial hemophagocytic Iymphohistiocytosis (FHL) // Europ. J. Hum. Genet. ESHG, June 2010, Gothenburg, Sweden. - 2010 - V. 18. - suppl.l, -P.317.

9. Полтавец H.B. (Милованова), Масчан M.A., Поляков A.B., Масчан А.А., Новичкова Г.А. (2010) Исследование молекулярно-генетической природы семейного гемофагоцитарного лимфогистиоцитоза (FHL) в группе Российских больных // Медицинская генетика. Материалы IV Съезда Российского общества медицинских генетиков, Май 2010, Ростов-на-Дону. - 2010 - С.143.

10. Масчан М.А., Полтавец Н.В. (Милованова) (2010) Гемофагоцитарный синдром в неотложной и интенсивной терапии // Педиатрическая фармакология. - 2010. - Т. 9, №2. - С. 48-55.

11. Масчан М.А., Полтавец Н.В. (Милованова), Новичкова Г.А.(2010) Гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз в клинике инфекционных болезней // Российский вестник перинатологии и педиатрии. - 2010. - Т.56, № 2. - С. 35-40.

СОКРАЩЕНИЯ

HLH - гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз (Hemophagocytic lympho-histiocytosis)

FHL - семейный гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз (Familial hemophagocytic lymphohistiocytosis)

TKM - трансплантации костного мозга

XLP - Х-сцепленный лимфопролиферативный синдром (X-linked lym-phoproliferative syndrome)

МГНЦ РАМН -Медико-Генетический Научный Центр Российской Академии Медицинских Наук

NCBI - National Center for Biotechnology Information ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПДАФ - полиморфизм длины амплифицированных фрагментов ПДРФ - полиморфизм длины рестрикционных фрагментов

Формат 60x90/16. Заказ 988. Тираж 100 экз.

Печать офсетная. Бумага для множительных аппаратов.

Отпечатано в ООО "ФЭД+", Москва, ул. Кедрова, д. 15, тел. 774-26-96

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Милованова, Наталья Викторовна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРА ТУРЫ.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Милованова, Наталья Викторовна

выводы

1. На основе анализа основных генов, ответственных за развитие семейного гемофагоцитарного лимфогистиоцитоза, в группе российских пациентов определен спектр мутаций, ответственных за развитие заболевания. Установлено, что наиболее частой генетической формой заболевания в исследованной выборке является РНЬЗ, обусловленная мутациями гена 1ШС130. РНЬ2 форма заболевания диагностирована у 1, РНЬЗ - у 10, РНЬ4 - у 1 из 26 обследованных пациентов.

2. У двух пациентов РНЬ группы выявлены мутации в гене 8Н2И1А, что подтверждает клиническую схожесть семейного гемофагоцитарного лимфогистиоцитоза и Х-сцепленного лимфопролиферативного синдрома и необходимость исследования у РНЬ пациентов генов, ответственных за развитие ХЬР. В гене ВШС4 мутации не обнаружены.

3. Установлено, что основной формой Х-сцепленного лимфопролиферативного синдрома в исследованной ХЬР выборке российских пациентов является ХЬР1, обусловленная мутациями в гене 8Н201А. Эта форма заболевания выявлена у 54% обследованных пациентов. ХЪР2 форма, обусловленная мутациями в гене ВШС4, не обнаружена.

4. Для спектра мутаций гена иЫС13И в выборке российских пациентов характерно наличие повторяющихся мутаций. Для трех из них (с.1828т8А, с.23462349с!е1 и с.3037тз0) разработана быстрая и эффективная система диагностики с использованием мультиплексной ПЦР. Эффективность этой системы составляет 48%.

5. Анализ гаплотипов хромосом, несущих делецию с.23462349ёе1 и инсерцию с.3037тз0 (двух наиболее распространенных мутаций в гене (ШС130) показал, что высокая частота встречаемости этих мутаций в выборке российских РНЬ пациентов, вероятно, обусловлена эффектом основателя.

6. Анализ клинико-генетических корреляций клинических и лабораторных проявлений болезни и результатов терапии не выявил различий между группами пациентов, выделенными согласно генетическим формам БНЬ, что, возможно, объясняется малым объемом выборок. Согласно полученным данным подтверждено, что единственным эффективным методом лечения РНЬ пациентов является трансплантация костного мозга.

7. Разработан алгоритм молекулярно-генетического обследования российских больных с диагнозом семейного гемофагоцитарного лимфогистиоцитоза, определяющий последовательность анализа генов, ответственных за развитие данного заболевания.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ

РАБОТЫ

1. N.V. Poltavets (Milovanova), М.А. Maschan, A.V.Polyakov, G.A.Novichkova, A.A.Maschan. Six new mutations in UNCI 3D gene in Russian. patients with familial hemophagocytic lymphohistiocytosis (FHL) // Europ. J. Hum. Genet. ESHG, May 2008, Barcelona, Spain. - 2008. - V.16. - suppl 2. -P.247.

2. N.V. Poltavets (Milovanova), M.A. Maschan, A.V.Polyakov, G.A.Novichkova, A.A.Maschan. Mutations in UNCI 3D gene are the most frequent cause of FHL in a group of Russian patients. // Pediatric Blood & Cance. 24th annual meeting of the Histiocyte society, October 2008, Berlin, Germany. -2009. -V.53. - Issue 4.- P.685-697.

3. M.A. Maschan, N.V. Poltavets (Milovanova), I.G. Sermyagina, V.V. Zabnenkova, I.V.Kondratenko, G.A. Novichkova, A.A.Maschan , A.V.Polyakov. RAB27 mutations not detected in russian patients with Familial hemophagocytic lymphohistiocytosis(FHL) and X-linked lymphoproliferative syndrome (XLP).//25th annual meeting of the Histiocyte society, September 2009, Bilbao, Spain. - 2009. - P. 57

4. N.V. Poltavets (Milovanova), M.A. Maschan, I.G. Sermyagina, V.V. Zabnenkova, I.V.Kondratenko, G.A. Novichkova, A.A.Maschan , A.V.Polyakov. Five SH2D1A mutations on 7 chromosomes detected in russian patients with X-linked lymphoproliferative syndrome (XLP) ).// 25th annual meeting of the Histiocyte society, September 2009, Bilbao, Spain. - 2009. - P.57.

5. N.V.Poltavets (Milovanova), M.A.Maschan, I.G.Sermyagina, A.V.Polyakov, I.V.Kondratenko, A.A.Maschan , G.A.Novichkova (2009) Four SH2D1A mutations on 7 chromosomes detected in Russian patients with X-linked lymphoproliferative syndrome (XLP) // Europ. J. Hum. Genet. ESHG, May 2009, Vienna, Austria. - 2009. -V.17. - suppl 2. - P.347.

6. Полтавец H.B. (Милованова), Масчан M.А., Поляков A.B., Новичкова Г.А., Масчан A.A. (2009) Генетический анализ первичного гемофагоцитарного лимфогистиоцитоза в России. // Онкогематология, Материалы VI симпозиума «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний», январь 2009, Москва. - 2008. - № 4. - с. 40.

7. Полтавец Н.В. (Милованова), Масчан М.А., Масчан A.A., Новичкова Г. А., Поляков A.B. (2010) Мутации в гене UNCI 3D - наиболее частая причина семейного гемофагоцитарного лимфогистиоцитоза в группе российских больных Медицинская генетика. - 2010. - Т.9, №3. - С.26-33.

8. N.V. Poltavets (Milovanova), M. A. Maschan, A.V.Polyakov, G.A.Novichkova, A.A.Maschan (2010) STXBP2 mutations are not detected in group of Russian patients with Familial hemophagocytic lymphohistiocytosis (FHL) // Europ. J. Hum. Genet. ESHG, June 2010, Gothenburg, Sweden. - 2010 -V.18. - suppl.l. - P.317.

9. Полтавец H.B. (Милованова), Масчан M.А., Поляков A.B., Масчан A.A., Новичкова Г.А. (2010) Исследование молекулярно-генетической природы семейного гемофагоцитарного лимфогистиоцитоза (FHL) в группе Российских больных // Медицинская генетика. Материалы IV Съезда Российского общества медицинских генетиков, Май 2010, Ростов-на-Дону. — 2010 - С.143.

10. Масчан М.А., Полтавец Н.В. (Милованова) (2010) Гемофагоцитарный синдром в неотложной и интенсивной терапии // Педиатрическая фармакология. - 2010. - Т. 9, №2. - С. 48-55.

11. Масчан М.А., Полтавец Н.В. (Милованова), Новичкова Г.А.(2010) Гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз в клинике инфекционных болезней // Российский вестник перинатологии и педиатрии. - 2010. - Т.56, № 2. - С. 35-40.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Милованова, Наталья Викторовна, Москва

1. Гинтер Е.К.Медицинская генетика//Р. 3012. Arceci, R. J.When Т cells and macrophages do not talk: the hemophagocytic syndromes//Curr. Opin. Hematol. 2008. - Vol. 15. - P. 359-367.

2. Berke, G.The CTL's kiss of death//Cell 1995. - Vol. 81.1. P. 9-12.

3. Blott, E. J. and Griffiths, G. M.Secretory lysosomes//Nat.

4. Rev. Mol. Cell Biol. 2002. - Vol. 3. - P. 122-131.

5. Bryceson, Y. Т., Rudd, E., Zheng, C., Edner, J., Ma, D.,

6. Coffey, A. J., Brooksbank, R. A., Brandau, 0., Oohashi, Т.,

7. Cooper, N., Rao, K. , Gilmour, K., Hadad, L., Adams, S.,

8. Cale, C., Davies, G., Webb, D., Veys, P., and Amrolia, P.Stem cell transplantation with reduced-intensity conditioning for hemophagocyticlymphohistiocytosis//Blood 2006. - Vol. 107. - P. 1233-1236.

9. Cote, M., Menager, M. M., Burgess, A., Mahlaoui, N.,

10. Dell1 angelica, E. C., Shotelersuk, V., Aguilar, R. C.,

11. Gahl, W. A., and Bonifacino, J. S.Altered trafficking of lysosomal proteins in Hermansky-Pudlak syndrome due to mutations in the beta ЗА subunit of the AP-3 adaptor//Mol. Cell 1999. - Vol. 3. - P. 11-21.

12. Devlin, B. and Risch, N.A comparison of linkagedisequilibrium measures for fine-scale mapping//Genomics 1995. - Vol. 29. - P. 311-322.

13. Dufourcq-Lagelouse, R., Jabado, N., Le, Deist F., Stephan,

14. J. L., Souillet, G., Bruin, M., Vilmer, E., Schneider, M., Janka, G., Fischer, A., and de Saint, Basile

15. G.Linkage of familial hemophagocytic lymphohistiocytosis to 10q21-22 and evidence for heterogeneity//Am. J. Hum. Genet. 1999. - Vol. 64. -P. 172-179.

16. Dutz, J. P., Benoit, L., Wang, X., Demetrick, D. J.,

17. Junker, A., de, Sa D., and Tan, R.Lymphocytic vasculitis in X-linked lymphoproliferative disease//Blood 2001. - Vol. 97. - P. 95-100.

18. J1.А.Животовский Микросателитная изменчивость в популяцияхчеловека и методы её изучения//Вестник ВОГиС Vol. 10. - Р. 74-96.

19. И.В.Кондратенко Первичные иммунодефициты//2005. Р. 72-83.

20. Egeler, R. М. , Shapiro, R., Loechelt, В., and Filipovich,

21. A.Characteristic immune abnormalities in hemophagocytic lymphohistiocytosis//J. Pediatr. Hematol. Oncol. 1996. - Vol. 18. - P. 340-345.

22. Enders, A., Zieger, В., Schwarz, K., Yoshimi, A.,

23. Ericson, K. G., Fadeel, В., Andersson, M., Gudmundsson, G.

24. H., Gurgey, A., Yalman, N., Janka, G., Nordenskjold, M., and Henter, J. I.Sequence analysis of the granulysin and granzyme В genes in familial hemophagocytic lymphohistiocytosis//Hum. Genet. -2003. Vol. 112. - P. 98-99.

25. Farquhar J.W.Familial haemophagocytic reticulosis//Arch Dis

26. Child 1952. - Vol. 27. - P. 519-525.

27. Feldmann, J., Callebaut, I., Raposo, G., Certain, S., Bacq,

28. D., Dumont, C., Lambert, N., Ouachee-Chardin, M., Chedeville, G., Tamary, H., Minard-Colin, V., Vilmer,

29. E., Blanche, S., Le, Deist F., Fischer, A., and de Saint, Basile G.Muncl3-4 is essential for cytolytic granules fusion and is mutated in a form of familial hemophagocytic lymphohistiocytosis (FHL3)//Cell -2003. Vol. 115. - P. 461-473.

30. Filipovich, A. H., Zhang, K., Snow, A. L., and Marsh, R.

31. A.X-linked lymphoproliferative syndromes: brothers or distant cousins?//Blood 2010.

32. Grakoui, A., Bromley, S. K., Sumen, C., Davis, M. M., Shaw, A. S., Allen, P. M., and Dustin, M. L.The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation//Science 1999. - Vol. 285. - P. 221-227.

33. Henderson, S. T. and Petes, T. D.Instability of a plasmidborne inverted repeat in Saccharomycescerevisiae//Genetics 1993. - Vol. 134. - P. 57-62.

34. Henter, J. I., Elinder, G., and Ost, A.Diagnosticguidelines for hemophagocytic lymphohistiocytosis. The FHL Study Group of the Histiocyte Society//Semin. Oncol. 1991. - Vol. 18. - P. 29-33.

35. Henter, J. I., Elinder, G., Soder, 0., and Ost, A.Incidencein Sweden and clinical features of familial hemophagocytic lymphohistiocytosis//Acta Paediatr. Scand. 1991. - Vol. 80. - P. 428-435.

36. Henter, J. I., Home, A., Arico, M. , Egeler, R. M. ,

37. Filipovich, A. H., Imashuku, S., Ladisch, S., McClain, K., Webb, D., Winiarski, J., and Janka, G.HLH-2004: Diagnostic and therapeutic guidelines for hemophagocytic lymphohistiocytosis//Pediatr. Blood Cancer 2007. - Vol. 48. - P. 124-131.

38. Henter, J. I., Samuelsson-Horne, A., Arico, M., Egeler, R.

39. Huizing, M. , Anikster, Y., and Gahl, W. A.Hermansky-Pudlaksyndrome and Chediak-Higashi syndrome: disorders of vesicle formation and trafficking13//Thromb. Haemost. 2001. - Vol. 86. - P. 233-245.

40. Ishii, E., Ueda, I., Shirakawa, R., Yamamoto, K., Horiuchi,

41. J.OttAnalysis of Human Genetic Linkage//1999. P. 38230. Janka, G., Imashuku, S., Elinder, G., Schneider, M., and

42. Henter, J. I.Infection- and malignancy-associated hemophagocytic syndromes. Secondary hemophagocytic lymphohistiocytosis//Hematol. Oncol. Clin. North Am. -1998. Vol. 12. - P. 435-444.

43. Janka, G. E.Familial hemophagocyticlymphohistiocytosis//Eur. J. Pediatr. 1983. - Vol. 140. - P. 221-230.

44. Johnson J, Kissell D Huizenga K Filipovich A Jordan M Zur

45. Stadt U Zhang K.STXBP2 (Muncl8) mutations in North American patients with familial hemophagocytic lymphohistiocytosis. //2010.

46. Kaplan, J., De, Domenico, I, and Ward, D. M.Chediak-Higashisyndrome//Curr. Opin. Hematol. 2008. - Vol. 15. - P. 22-29.

47. Kogawa, K. , Lee, S. M., Villanueva, J., Marmer, D., Sumegi,

48. J., and Filipovich, A. H.Perforin expression in cytotoxic lymphocytes from patients with hemophagocytic lymphohistiocytosis and their family members//Blood 2002. - Vol. 99. - P. 61-66.

49. Kong, A., Gudbjartsson, D. F., Sainz, J., Jonsdottir, G.

50. Lacorazza, H. D., Miyazaki, Y., Di, Cristofano A.,

51. Lee, S. M., Sumegi, J., Villanueva, J., Tabata, Y., Zhang,

52. K., Chakraborty, R., Sheng, X., Clementi, R., de

53. Saint, Basile G., and Filipovich, A. H.Patients of African ancestry with hemophagocyticlymphohistiocytosis share a common haplotype of PRFl with a 50delT mutation//J. Pediatr. 2006. - Vol. 149. - P. 134-137.

54. Lu, Q., Wu, A., Ray, D., Deng, C., Attwood, J., Hanash, S.,

55. Pipkin, M., Lichtenheld, M., and Richardson, B.DNA methylation and chromatin structure regulate T cell perforin gene expression//J. Immunol. 2003. - Vol. 170. - P. 5124-5132.

56. Mancebo, E., Allende, L. M., Guzman, M. , Paz-Artal, E.,

57. Marcenaro, S., Gallo, F., Martini, S., Santoro, A.,

58. Marsh, R. A., Madden, L., Kitchen, B. J., Mody, R.,

59. Marsh, R. A., Satake, N., Biroschak, J., Jacobs, T.,

60. Johnson, J., Jordan, M. B., Bleesing, J. J., Filipovich, A. H., and Zhang, K.STX11 mutations and clinical phenotypes of familial hemophagocytic lymphohistiocytosis in North America//Pediatr. Blood Cancer 2010. - Vol. 55. - P. 134-140.

61. Meeths, M. , Bryceson, Y. T., Rudd, E., Zheng, C., Wood, S.

62. Menager, M. M., Menasche, G., Romao, M., Knapnougel, P.,

63. Ho, C. H., Garfa, M., Raposo, G., Feldmann, J.,

64. Fischer, A., and de Saint, Basile G.Secretory cytotoxic granule maturation and exocytosis require the effector protein hMuncl3-43//Nat. Immunol. 2007. - Vol. 8. - P. 257-267.

65. Menasche, G., Feldmann, J., Fischer, A., and de Saint,

66. Basile G.Primary hemophagocytic syndromes point to a direct link between lymphocyte cytotoxicity and homeostasis//Immunol. Rev. 2005. - Vol. 203. - P. 165-179.46. ' Menasche, G., Pastural, E., Feldmann, J., Certain, S.,

67. Ersoy, F., Dupuis, S., Wulffraat, N., Bianchi, D., Fischer, A., Le, Deist F., and de Saint, Basile

68. G.Mutations in RAB27A cause Griscelli syndrome associated with haemophagocytic syndrome 1//Nat. Genet. 2000. - Vol. 25. - P. 173-176.

69. Molleran, Lee S., Villanueva, J., Sumegi, J., Zhang, K.,

70. Kogawa, K., Davis, J., and Filipovich, A.

71. H.Characterisation of diverse PRFl mutations leading to decreased natural killer cell activity in North American families with haemophagocytic lymphohistiocytosis44//J. Med. Genet. 2004. - Vol. 41. - P. 137-144.

72. Morton, N. E.Linkage disequilibrium maps and associationmapping//J. Clin. Invest 2005. - Vol. 115. - P. 1425-1430.

73. Nichols, K. E., Harkin, D. P., Levitz, S., Krainer, M.,

74. Ohadi, M., Lalloz, M. R. , Sham, P., Zhao, J., Dearlove, A.

75. M., Shiach, C., Kinsey, S., Rhodes, M., and Layton, D. M.Localization of a gene for familial hemophagocytic lymphohistiocytosis at chromosome 9q21.3-22 by homozygosity mapping//Am. J. Hum. Genet. 1999. -Vol. 64. - P. 165-171.

76. Orange, J. S.Formation and function of the lytic NK-cellimmunological synapse//Nat. Rev. Immunol. 2008. -Vol. 8. - P. 713-725.

77. Pritchard, J. K. and Przeworski, M.Linkage disequilibriumin humans: models and data//Am. J. Hum. Genet. 2001. - Vol. 69. - P. 1-14.

78. Purtilo, D. T., Grierson, H. L., Davis, J. R., and Okano,

79. M.The X-linked lymphoproliferative disease: from autopsy toward cloning the gene 1975-1990 2//Pediatr. Pathol. 1991. - Vol. 11. - P. 685-710.

80. Rigaud, S., Fondaneche, M. C., Lambert, N., Pasquier, B.,

81. Mateo, V., Soulas, P., Galicier, L., Le, Deist F., Rieux-Laucat, F., Revy, P., Fischer, A., de Saint, Basile G., and Latour, S.XIAP deficiency in humans causes an X-linked lymphoproliferative syndrome//Nature 2006. - Vol. 444. - P. 110-114.

82. Risma, K. A., Frayer, R. W., Filipovich, A. H., and Sumegi,

83. J.Aberrant maturation of mutant perforin underlies the clinical diversity of hemophagocytic lymphohistiocytosis//J. Clin. Invest 2006. - Vol. 116. - P. 182-192.

84. Rizo, J. and Rosenmund, C.Synaptic vesicle fusion//Nat.

85. Struct. Mol. Biol. 2008. - Vol. 15. - P. 665-674.

86. Rudd, E., Goransdotter, Ericson K., Zheng, C., Uysal, Z.,

87. Santoro, A., Cannella, S., Bossi, G., Gallo, F., Trizzino,

88. A., Pende, D., Dieli, F., Bruno, G., Stinchcombe, J.

89. Santoro, A., Cannella, S., Trizzino, A., Bruno, G., De,

90. Sayos, J., Wu, C., Morra, M., Wang, N., Zhang, X., Allen,

91. Scott, F. L., Denault, J. B., Riedl, S. J., Shin, H.,

92. Renatus, M., and Salvesen, G. S.XIAP inhibits caspase-3 and -7 using two binding sites: evolutionarily conserved mechanism of IAPs//EMBO J. 2005. - Vol. 24. - P. 645-655.

93. Stepp, S. E., Dufourcq-Lagelouse, R., Le, Deist F., Bhawan,

94. S., Certain, S., Mathew, P. A., Henter, J. I., Bennett, M. , Fischer, A., de Saint, Basile G., and Kumar, V.Perforin gene defects in familial hemophagocytic lymphohistiocytosis//Science 1999. -Vol. 286. - P. 1957-1959.

95. Sumegi, J., Huang, D., Lanyi, A., Davis, J. D. , Seemayer,

96. Trizzino, A., Zur, Stadt U., Ueda, I., Risma, K., Janka,

97. Uren, A. G., Pakusch, M., Hawkins, C. J., Puis, K. L., and

98. Vaux, D. L.Cloning and expression of apoptosis inhibitory protein homologs that function to inhibit apoptosis and/or bind tumor necrosis factor receptor-associated factors//Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A -1996. Vol. 93. - P. 4974-4978.

99. Wulfing, C., Purtic, B., Klem, J., and Schatzle, J.

100. D. Stepwise cytoskeletal polarization as a series of checkpoints in innate but not adaptive cytolytic killing//Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 2003. - Vol. 100. - P. 7767-7772.

101. Yamamoto, K. , Ishii, E., Horiuchi, H., Ueda, I., Ohga, S.,

102. Yamamoto, K., Ishii, E., Sako, M., Ohga, S., Furuno, K.,

103. Suzuki, N., Ueda, I., Imayoshi, M., Yamamoto, S., Morimoto, A., Takada, H., Hara, T., Imashuku, S., Sasazuki, T., and Yasukawa, M.Identification of novel

104. MUNC13-4 mutations in familial haemophagocytic lymphohistiocytosis and functional analysis of MUNC13-4-deficient cytotoxic T lymphocytes 41//J. Med. Genet. 2004. - Vol. 41. - P. 763-767.

105. Zhao, M., Kanegane, H., Ouchi, K., Imamura, T., Latour, S.,and Miyawaki, T.A novel XIAP mutation in a Japanese boy with recurrent pancytopenia andsplenomegaly//Haematologica 2010. - Vol. 95. - P. 688-689.

106. Zur, Stadt U., Beutel, K., Kolberg, S., Schneppenheim, R.,

107. Kabisch, H., Janka, G., and Hennies, H. C.Mutation spectrum in children with primary hemophagocytic lymphohistiocytosis: molecular and functional analyses of PRFl, UNC13D, STX11, and RAB27A//Hum. Mutat. -2006. Vol. 27. - P. 62-68.

108. Zur, Stadt U., Rohr, J., Seifert, W., Koch, F., Grieve, S.,

109. Zur, Stadt U., Schmidt, S., Kasper, B., Beutel, K., Diler,