Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетическая характеристика возбудителей иксодового клещевого боррелиоза в природных очагах на территории России

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическая характеристика возбудителей иксодового клещевого боррелиоза в природных очагах на территории России"

На правах рукописи

Мухачева Татьяна Александровна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ИКСОДОВОГО КЛЕЩЕВОГО БОРРЕЛИОЗА В ПРИРОДНЫХ ОЧАГАХ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИИ

03.02.03 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

28 ОКТ 2015

Екатеринбург - 2015

005564083

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Уральский федеральный университет им. первого Президента России Б.Н.Ельципа»

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Ковалев Сергей Юрьевич Официальные оппоненты:

доктор медицинских паук, главный научный сотрудник, заведующая отделом природно-очаговых бактериальных зоонозов ФБУН Омский НИИ природно-очаговых ипфекций Роспотребнадзора Рудакова Светлапа Анатольевна

доктор медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной микробиологии и биотехнологии ИЭГМ УрО РАН Кузнецова Марина Валептиповна

Ведущая организация:

Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи (123098, Москва, ул. Гамалеи, 18)

Защита состоится "27" ноября 2015 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета ДМ 004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, д. 13. Факс: (342) 280 92 11.

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Министерства образования и пауки РФ (http://vak.ed.gov.ru) и сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (http://www.iegm.ru).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЭГМ УрО РАН и на сайте ИЭГМ УрО РАН (11йр:/Л\^шецт.ги).

Автореферат разослан '' 0£~"С ЬЪла 15 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Максимова Юлия Геннадьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальпость проблемы

Боррелии комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato являются возбудителями иксодового клещевого боррелиоза (ИКБ) — природно-очагового заболевания, регистрируемого на территории 72 субъектов Российской Федерации с ежегодной заболеваемостью от 6,4 до 9,9 тысяч случаев (Ястребов и др., 2012). Было установлено, что повсеместное распространение и преимущественное эпидемическое значение в России имеют виды В. garinii и В. afzelii, а также недавно обнаруженный вид В. miyamotoi. В 2009 году один из серотипов В. garinii был выделен в качестве отдельного вида В. bavariensis на основе данных мультилокусного сиквенс-типирования (МЛСТ) (Margos et al., 2009). Было показано, что метод МЛСТ обладает высокой информативностью и может быть применен как для изучения эволюции боррелий, так и для выявления филогенетических линий, отличающихся повышенной патогенностью для человека. Однако, на момент начала наших исследований в международную базу данных Bonelia MLST Database (http://borrelia.mlst.net) были депонированы последовательности только трех изолятов из России. В связи с изменением классификации боррелий необходимо было проведение сравнительных исследований для уточнения таксономического статуса геногрупп внутри видов В. garinii и В. afzelii, а также их соотношения в разных регионах. Молекулярне генетический анализ В. miyamotoi на территории России выявил отсутствие генетической изменчивости данного вида, что обусловило необходимость разработки новой системы генотипирования, основанной на вариабельных генетических маркерах.

Степень разработанности темы исследования Идентификация первых российских изолятов В. burgdorferi s.l. была проведена с использованием моноклональных антител (Крючечников и др., 1987). В дальнейшем для дифференциальной диагностики видов боррелий широко использовался метод ПЦР-ПДРФ (полиморфизм длин рестршшионных фрагментов продуктов ПЦР) 5S-23S рРНК межгенного спейсера. Этот подход

позволил выделить внутри В. garinii три геногруппы: 20047, NT29 и ChY13p. Было установлено, что в клещах Ixodes persulcatus чаще встречается геногруппа В. garinii NT29, а в 7. pavlovskyi и I. ricinus — геногруппа 20047. На основе данного маркера был также проведен детальный филогенетический анализ В. garinii и В. afzelii (Коренберг и др., 2006; Nefedova et al., 2010). В 2008 г. появились первые данные об обнаружении В. miyamotoi на территории России (Fomenko et al., 2008). Для. изолятов В. miyamotoi, выделенных из одного вида клещей, был показан крайне низкий уровень генетической изменчивости или её отсутствие (Bunikis et al., 2004; Fomenko et al., 2011; Geller et al., 2012; Cosson et al., 2014; Crowder et al., 2014; Takano et al., 2014). В частности, изоляты В. miyamotoi азиатского типа, выделенные на территории России, обладали идентичными последовательностями по таким генетическим маркерам, как гены 16S рРНК,у7а,рбб и glpQ (Fomenko et al., 2010; Fomenko et al., 2011; Platonov et al., 2011).

Цель исследования

— с помощью новых молекулярно-генетических подходов охарактеризовать видовой состав и филогеографическую структуру видов боррелий, циркулирующих на территории России.

Задачи исследования

1. Установить зараженность боррелиями клещей I. persulcatus, I. pavlovskyi и Dermacentor sp., собранных с растительности и от населения в разных регионах России.

2. Разработать систему определения видовой принадлежности боррелий на основе видоспецифичной ПЦР в реальном времени и установить соотношение В. afzelii, В. bavariensis, В. garinii и В. miyamotoi в клещах, собранных в разных регионах.

3. Установить филогеографическую структуру боррелий В. afielii, В. bavariensis и В. garinii на основе MJICT.

4. Разработать систему мультилокусного спейсер-анализа для выявления генетической изменчивости В. miyamotoi и применить её для образцов В. miyamotoi азиатского типа, выделенных на территории России.

Научная новизна работы

В настоящей работе впервые была разработана система дифференцировки видов боррелий, циркулирующих в природных очагах на территории России, на основе ГТЦР в реальном времени с флуоресцентными зондами TaqMan, что дает возможность оценить не только видовой состав, но количественное содержание каждого вида в образце. Впервые данная система была применена для анализа большой выборки клещей из разных регионов страны, что позволило показать ассоциацию В. garinii с клещами I. pavlovskyi в Томской области.

Впервые было проведено исследование популяций боррелий В. afzelii, В. bavariensis и В. garinii, циркулирующих в природных очагах России, с помощью метода мультилокусного сиквенс-типирования (105 изолятов и образцов ДНК); выявлен 51 сиквенс-тип, не представленный в базе данных Borrelia MLST Database (ST431-446 и ST593-627). Показано, что российские изоляты В. afzelii формируют обособленную группу, филогенетически близкую изолятам из Китая и Японии.

Впервые была разработана система мультилокусного спейсер-анализа, которая может быть применена для исследования всех типов В. miyamotoi. Впервые высказана гипотеза о крайне низком генетическом разнообразии азиатского типа и его клональном распространении по территории Евразии, а также показано, что в популяциях клещей I. persulcatus и 1. pavlovskyi циркулирует один и тот же генетический вариант В. miyamotoi.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные в настоящей работе данные позволяют охарактеризовать генетическую структуру видов боррелий, встречающихся на территории России, с точки зрения новых подходов к изучению генетического разнообразия микроорганизмов, главную роль среди которых играет мультилокусное сиквенс-типирование. Разработанная система видовой дифференцировки позволяет эффективно определить видовую принадлежность боррелий и может быть использована другими исследователями, в том числе для исследования клинических образцов. Применение метода MJICT позволило пополнить

международную базу данными о российских изолятах и провести сравнительный анализ с изолятами из других стран по стандартизованной схеме. Разработанная система мультилокусного спейсер-анализа В. miyamotoi может использоваться зарубежными исследователями для выявления генетической изменчивости данного вида в других странах. Полученные в настоящей работе последовательности были депонированы в общедоступные базы данных NCBI GenBank (435 последовательностей) и Borrelia MLST Database (последовательности восьми генов 105 изолятов и образцов ДНК).

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Недавно предложенный вид В. buvuricnsis соответствует геногруппе NT29 В. garinii и встречается в клещах /. persulcatus чаще или с той же частотой, что и В. garinii (объединяет геногруппы 20047 и ChY13p). Напротив, в клещах I. pavlovskyi преобладает В. garinii.

2. Все российские сиквенс-типы В. afzelii были выявлены впервые, большая часть из них формирует обособленную группу, филогенетически близкую изолятам из Китая и Японии.

3. Филогеографическая структура В. bavariensis и В. garinii характеризуется высоким генетическим разнообразием и неоднородным географическим распределением сиквенс-типов.

4. Азиатский тип В. miyamotoi отличается крайне низкой генетической изменчивостью как на уровне кодирующих генов, так и на уровне некодирующих межгенных спейсеров, что может свидетельствовать о быстром клональном распространении В. miyamotoi по территории Евразии.

Апробация работы и публикации

Основные результаты исследований доложены и обсуждены на российских и международных конференциях: 14-15 апреля 2010 г., г. Екатеринбург: 65-ая Всероссийская научно-практическая конференция молодых учёных и студентов с международным участием «Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения»; 1-2 ноября 2011г., г. Омск: Всероссийская конференция с международным участием «Современные аспекты природной

очаговости болезней»; 11-12 апреля 2012 г., г. Екатеринбург: 67-ая Всероссийская научно-практическая конференция молодых учёных и студентов с международным участием «Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения»; 26-29 июня 2012 г., г. Иркутск: международная научная конференция «Клещевой энцефалит и другие инфекции, переносимые клещами»; 1-5 октября 2012 г., г. Екатеринбург: II Всероссийская с международным участием школа-конференция молодых ученых «Биология будущего: традиции и новации»; 15-19 апреля 2013 г., г. Екатеринбург: Всероссийская конференция молодых учёных «Экология: теория и практика»; 5-7 июня 2013 г., г. Санкт-Петербург: международная конференция «Молекулярная эпидемиология актуальных инфекций»; 8-10 октября 2013 г., г. Москва: российская конференция с международным участием «Актуальные проблемы клещевого энцефалита»; 11-13 ноября 2014 г., г. Омск: научно-практическая конференция с международным участием «Актуальные аспекты природной очаговости болезней».

По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них 3 статьи в зарубежных журналах, входящих в международную систему научного цитирования Web of Science и рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Структура п объем диссертации Текст диссертации изложен на 121 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы. Диссертация иллюстрирована 14 таблицами и 22 рисунками. Список литературы содержит 201 наименование работ отечественных и зарубежных авторов.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора Работа была поддержана грантами РФФИ № 10-04-96062_урал, № 12-04-31263_мол_а и № 13-04-96045_урал. Часть работ была выполнена в рамках проведения НИР базовой части государственного задания «Биоразнообразие

s

природных и трансформированных экосистем и технологии его поддержания и восстановления» № 2014/2485.

Основные результаты получены лично автором. Работа по выполнению экспериментальной части проводилась совместно с сотрудниками лаборатории молекулярной генетики Уральского федерального университета. Сбор материала осуществлялся как автором, так и привлеченными людьми. Присвоение номеров аллелей и сиквенс-типов осуществлялось куратором базы данных Borrelia MLST Database Gabriel Margos (Bavarian Health and Food Safety Authority, Германия).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

В качестве материала для исследования использовались: 1) голодные взрослые особи клещей из разных регионов (более 2800 образцов), 2) пулы клещей, собранных с растительности в Свердловской области (2195 образцов) 3) клещи, предоставленные пострадавшими от укуса людьми в Свердловской области (882 образца), 4) 39 изолятов боррелий, полученных путем посева гомогенизированных клещей в жидкую среду BSK-H.

Клещей индивидуально гомогенизировали в физиологическом растворе, нуклеиновые кислоты выделяли с помощью коммерческих наборов «Рибо-преп», «Рибо-сорб» и «Магно-сорб» (ООО «Интерлабсервис», Москва). Определение наличия ДНК боррелий в образцах проводили согласно методике (Ornstein and Barbour, 2006). Позитивные образцы отбирались для определения видовой принадлежности боррелий, которая проводилась в два этапа (Рисунок 1 ). Интересующие образцы, содержащие один вид боррелий в достаточно высокой концентрации (величина порогового цикла Ct<36), были отобраны для проведения мультилокусного сиквенс-типирования. Клещей родов Ixodes и Dermacentor идентифицировали по морфологическим признакам, вид клещей рода Ixodes определяли с помощью видоспецифичной ПЦР.

Клещ

..............I..........

i Выделение НК

1..............т..........

Обратная

транскрипция Borrelia sp.

ПЦР-Р8 отрйцзталькые

{прзймеры из образцы

Omstein, 2005)

3BSpphh|

Borrelia so. I позитивные

\ _ОбрЗЗЦЫ_

8. фе!Н пшигианые ««■А! «—j (набор | прзймероз №1} £61 ß. r,r:yO'r:OfOi i позитивные образцы

uvrAj

1 в. qcrinti s.L ; позитивные ! образцы

j ■ .

B.bavortentä näfi> 6. QcrirM SS.

ПОЗИТИПНЫСг «-\ {набор ПОЗ*: HÖH

Обр&ЗЦЬ: j праймероз Ы$2) образцы

Рисунок 1 - Схема определения видовой принадлежности четырех видов боррелий, циркулирующих на территории России. Гены-мишени указаны над стрелками.

Амплификация восьми фрагментов генома изолятов и образцов ДНК боррелий проводилась со стандартными праймерами (Margos et al., 2008) в два этапа: сначала были амплифицированы фрагменты генов nifS и clpA, затем (при условии получения ПЦР-продукта) - генов clpX, рерХ, pyrG, recG, rplB, uvrA. Сиквенсная реакция проводилась с использованием набора реактивов «Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1» (Applied Biosystems, USA). Секвенирование проводили на ДНК-анализаторе ABI PRIZM 310 (Applied Biosystems, USA). Образцы, содержащие смешанные последовательности, были исключены из анализа. Для 24 образцов параллельно были получены последовательности 5S-23S рРНК межгенного спейсера, согласно общепринятой методике (Postic et al., 1994).

Для образцов В. miyamotoi, выделенных из клещей I. persulcatus, были определены нуклеотидные последовательности фрагментов кодирующих генов: 16S рРНК, рбб, glpQ, а также 16S-23S межгенного спейсера. Для разработки

системы мультилокусиого сиейсер-аиализа (MJICA) было проведено выравнивание полногеномных последовательностей двух штаммов В. miyamotoi: FR64b (GenBank Асс. No. СР004217) и LB-2001 (СР006647) с помощью NCBI Sequence Viewer 3.4. Межгенные спейсеры (всего восемь спейсеров длиной от 383 до 635 п.н.) были отобраны вручную, согласно аннотации последовательностей.

Первичная обработка полученных последовательностей производилась с помощью SeqScape 2.5.0 (Applied Biosystems, USA), филогенетический анализ проводился в программе MEGA 6.0 (Tamura et al., 2013). Для статистической обработки результатов использовали Statistic Calculator v. 4.0 (StatPac Inc.).

Результаты исследования и их обсуждение Анализ видового разнообразия и частот встречаемости видов боррелий в природных очагах разных регионов России

В настоящей работе была проведена оценка зараженности клещей I. persulcatus, I. pavlovskyi и Dermacentor sp., собранных в разных регионах России от Архангельской области до Приморского края.

Средняя зараженность имаго клещей /. persulcatus составила 40,3% (38,442,2%), данная величина статистически не отличалась от зараженности I. pavlovskyi 35,7% (30,6-41,0%) (р>0,05). Зараженность клещей Dermacentor sp. оказалась минимальной - в среднем 1,25% (0,03-6,8%), что свидетельствует о низкой эффективности размножения боррелий в клещах данного рода. В целом, установленные значения зараженности соответствовали ранее представленным в литературе, а наблюдаемые несоответствия могут быть объяснены различиями в чувствительности используемых для детекции методов и репрезентативности выборки, а также особенностями изучаемых природных очагов.

Средний показатель зараженности пулов клещей в 58,7% (56,5-60,8%) превосходил таковой одиночных клещей (48,2% в Свердловской области) в 1,2 раза. Инфицированность клещей, предоставленных пострадавшими от укуса людьми, — 30,2% (27,2-33,3%) - оказалась достоверно ниже таковой одиночных клещей — 48,2% (45,1-51,2%) (р<0,05). Данная закономерность была отмечена

ранее в Новосибирской области (Borgoyakov et al., 2011) и может быть связана с частичным лизисом клеток боррелий под действием человеческой сыворотки.

В настоящей работе была разработана система дифференцировки встречающихся на территории России четырех видов боррелий, включающая в себя наборы праймеров и олигонуклеотидных зондов, а также схему и условия проведения реакций ПЦР. С помощью данной системы было дифференцировано около 90% позитивных образцов (Таблица 1), вид остальных 10% определить не удалось вследствие либо неполной специфичности используемых праймеров и зондов, либо низкой чувствительности праймеров для дифференцировки. В среднем по всем регионам, встречаемость В. miyamotoi оказалась наименьшей — 5,4% (4,5-6,4%) относительно общего числа исследованных клещей, что в целом соответствует ранее определенным величинам (Fomenko et al., 2010; Platonov et al., 2011). Низкая встречаемость В. miyamotoi (по сравнению с боррелиями комплекса В. burgdorferi s.l.) в клещах 1. persulcatus может быть связана с недавним распространением этого вида вследствие адаптации к твердым клещам.

Среди видов В. burgdorferi s.l. наиболее часто встречалась В. afzelii (от 27 до 66% относительно числа позитивных образцов). Особое внимание обращает на себя соотношение В. bavariensis и В. garinii, ранее рассматриваемых в качестве одного вида, а также территориальные особенности их распределения (Рисунок 2). В европейской части России, Тюменской и Курганской областях, Приморском крае В. bavariensis встречалась достоверно чаще, чем R. garinii, тогда как частоты встречаемости этих видов на Урале и в Новосибирской области достоверно не отличались (Рисунок 2).

Было показано, что содержание в клеще нескольких видов боррелий (микст-инфекция) является часто встречающимся явлением: в среднем 18,2% (15,720,8%) от числа зараженных боррелиями клещей I. persulcatus микст-инфицированы (Таблица 1). При этом микст-инфекции В. bavariensis и В. garinii встречаются крайне редко - в среднем 2,2% (1,4-3,4%), а микст-инфекции В. bavariensis и В. afzelii, напротив, достоверно чаще - 8,6% (6,8-10,6%) (р<0,05), что может быть объяснено особенностями экологии этих видов. Известно, что В.

Ьа\аг1епш (как и В. а/гсШ) использует в качестве основного резервуарного хозяина мелких млекопитающих, тогда как В. garinii - птиц (КийепЬасЬ е! а1., 2002; Мащоэ & а1., 2009).

Одной из важнейших задач настоящей работы стала разработка и оценка системы видовой дифференцировки для обнаружения «чистых» видов боррелий для последующего типирования изолятов с помощью МЛСТ. Для этого 118 образцов, в которых был детектирован только один вид боррелий, были типированы методом МЛСТ. По результатам секвенирования, 2 образца содержали смесь двух видов, 22 - смеси двух генетических вариантов внутри вида. Для остальных 94 образцов были получены «чистые» последовательности восьми генов. При этом не было зарегистрировано ни одного случая несовпадения определения вида по результатам ПЦР-РВ и филогенетического анализа.

Таблица 1 - Встречаемость видов Borrelia sp. и микст-инфекций в клещах на территории России

Место сбора Вид Число Borrelia sp. B.a. B.g. B.b. B.m. микст н/т

(год) клеща клещей (%) (%)' (%) (%) (%) (%) (%)

Архангельская обл. (2012) l.pers 100 32 (32%) 21 (65,6) 0 15 (46,9) (9,4) 10 (31,3) 3 (9,4)

Пермский край (2011-2012) I.pers 145 83 (57,2%) 49 (59,0) 1 (1,2) 42 (50,6) 7 (8,4) 20 (24,1) 5 (6,0)

Республика Коми (2014) l.pers 148 17(11,5%) 0 2 (11,8) 14 (82,4) 5 (29,4) 3 (17,6) I (5,9)

Свердловская обл. (2013) I.pers 527 244 (46,3%) 93 (38,1) 56 (23,0) 73 (29,9) . 17 (7,0) 41 (16,7) 29 (11,9)

Курганская обл. (2014) i.pers 105 29 (27,6%) 9 (31,0) 1 (3,4) 9 (31,0) 22 (75,9) 10 (34,5) 0

Тюменская обл. (2009-2011) I.pers 323 68(21,1%) 18 (26,5) 2 (2,9) 22 (32,4) 17 (25,0) 1 (3,3) 7 (10.3) 16 (23,5)

Томская обл. I.pers 73 30(41,1%) П (36,7) 5 (16,7) 11 (36,7) 3 (10.0) 5 (16,7)

(2013) I.pavl 92 41 (44,6%) 0 38 (92,7) 0 0 0 3 (7,3)

Томская обл. (2014) I.pers 405 196 (48,4%) 69 (35,2) 15 (7,7) 105 (53,6) 29 (14,8) 34 (17,3) 14 (7,1)

I.pavl 253 82 (32,4%) 31 (37,8) 21 (25,6) 15 (18,3) 14 (17,1) 11 (13,4) 12 (14,6)

Новосибирская обл. (2013) I.pers 100 48(48,0%) 22 (45,8) 13 (27,1) 14 (29,2) 6 (12,5) 12 (25,0) 4 (8,3)

Приморский край (2013) I.pers 78 28 (35,9%) 18 (64,3) 4 (14,3) 16 (57,1) 5 (17,9) 12 (42,9) 1 (3,6)

* Проценты рассчитаны по отношению к числу Borrelia sp.- позитивных образцов ** нетипируемые образцы (вид установить не удалось)

Было выявлено разное соотношение В. Ьауапет1$ и В. garinii в клещах I. рег$и1саЫз и I. ра\>1оухку1 в Томской области: в /. регзи1саТт преобладала В. Ьауапетчэ (50,4% против 8,8%), а в клещах I. рау1ол>зку1 — В. garinii (48% против 12,2%). Встречаемость В. тгуатогог в двух видах клещей статистически не отличалась, в то время как В. а/геШ достоверно чаще обнаруживалась в I. регБи1сШиз. Преобладание В. garimi над В. bavariensis в клещах I. рау1оуяку1 может быть частично связано с тем фактом, что взрослые особи I. рау1оу$ку1 чаще питаются на птицах - основном резервуарном хозяине В^аппп.

ÄTo

fr

ч

./у-.

*—

4

V.

Казахстан

5.дата : : ß.bamrk>:isis

fW

Россия

/X, Ü

V S

Г>

i

V \ <

> \.Л

' Щ5?

юни

J

Монголия Г"

ш

\......Китай J * i Ж

\ \ * \ (ft

bf

> jf JSöJ

Рисунок 2 - Соотношение В. §агти и В. Ьа\аг1еш15 в разных регионах России. Частота встречаемости каждого вида указана относительно числа позитивных образцов.

Молекулярно-генетическая характеристика популяций боррелий В. burgdorferi s.l. на основе MJICT

За период 2011-2014 гг. в настоящей работе было получено и проанализировано 105 объединенных последовательностей восьми генов

домашнего хозяйства В. burgdorferi s.l. общей длиной 4785 п.н. в соответствии с методикой MJICT. Изоляты и образцы ДНК боррелий были выделены в нескольких регионах России - от Санкт-Петербурга до Владивостока. В дальнейшем изоляты и образцы ДНК будут обозначаться как «изоляты» для краткости. Общее число изолятов из России, включая три ранее опубликованных японскими учеными сиквенс-типа (ST86, ST373 и ST374), составило 108, что позволяет составить представление о генетической структуре популяций боррелий на территории страны. Типированные изоляты принадлежали трем видам боррелий - В. afzelii (29 изолятов), В. garinii (41) и недавно предложенному виду В. bavariensis (35). При этом был выявлен 51 новый сиквенс-тип, не представленный в базе Borrelia MLST (ST431-446 и ST593-627). Последовательности 34 изолятов относились к восьми установленным сиквенс-типам: ST128 (Китай, Монголия, Япония), ST154 (Китай), ST244 (Англия, Германия), ST328 (Монголия, Китай), ST364 (Япония), ST366 (Япония), ST372 (Япония) и ST374 (Россия, Московская область).

Для выяснения вопроса о соответствии групп боррелий, выявляемых на основе MJ1CT и анализа 5S-23S рРНК межгенного спейсера, было исследовано 24 изолята согласно обеим методикам. В целом, выделяемые ранее геногруппы соответствовали видам по новой классификации: 20047 — В. garinii, a NT29 - В. bavariensis. Геногруппа В. garinii ChY13p, хотя и характеризуется особым профилем рестрикционных фрагментов при ПЦР-ПДРФ, сближающим эту группу с В. afzelii (Livanova et al., 2003), при анализе консервативных генов домашнего хозяйства была отнесена к виду В. garinii. Аналогичная ситуация наблюдалась и для В. afzelii NT28, последовательность IGS которой имеет общие признаки как с В. afzelii, так и с В. garinii (Li et al., 1998). Несмотря на то, что анализ последовательностей IGS позволяет считать группы В. afzelii NT28 и В. garinii ChY13p промежуточными формами между этими двумя видами, данные MJICT не поддерживают эту гипотезу.

Для каждого вида боррелий были построены филогенетические деревья и проанализировано географическое распределение сиквенс-типов (филогеографическая структура). Наиболее выраженной оказалась филогеографическая структура В. afzelii. Все последовательности изолятов этого вида из России были получены впервые. Было выявлено четкое разделетгае сиквенс-типов на европейские и азиатские (Рисунок 3). Все сиквенс-типы, выделенные в России (за исключением ST599, Кировская область), формировали обособленную группу на филогенетическом древе. Данная группа делилась на две: одна объединяла сиквенс-типы из Приморского края, Китая и Японии, вторая — из европейской части страны, Урала и Сибири, а также один ST из Приморского края (Рисунок 3). Изоляты из европейской части страны, Урала и Сибири не формировали обособленных групп, что свидетельствует о возможности их перемещения между разными регионами. Наблюдаемая генетическая структура В. afielii в какой-то степени может объясняться преимущественной ассоциацией этого вида с мелкими млекопитающими, обладающими относительно небольшой подвижностью.

В. bavariensis выделяется преимущественно на территории России и Азиатских стран. В Западной Европе В. bavariensis (ранее серотип 4 или группа NT29) встречается в клещах крайне редко (Glatz et al., 2014; Huegli et al., 2002) и представлена всего двумя сиквенс-типами (ST84 и ST85), место изоляции одного из которых и дало название виду. В настоящей работе изоляты В. bavariensis были выделены на территории всех изученных регионов страны, причем анализ сиквенс-типов не выявил каких-либо географически обособленных групп внутри вида. Аналогичная ситуация наблюдается и для изолятов В. garinii, что может отражать экологическую ассоциацию вида с птицами, обладающими высокой подвижностью. Это предположение было подтверждено и другими исследованиями (Margos et al., 2011; Vollmer et al., 2011).

Сйкаенс-пдаы из бэзы данньж ВощШа ä^LST:

<Q> Европа

С^квенс-тйпы, полученяы« в /гшииой раёете:

Q Европейская часть Расти

Урал

Западная Сибирь Дальний Востой

Рисунок 3 - Филогенетическое древо, построенное на основе конкатенированных последовательностей фрагментов генов домашнего хозяйства В. afzelii (общая длина 4785 п.н.). Овалами выделены филогенетические группы.

Молекулярно-генетическая характеристика популяций В', miyamotoi

Для выявления генетической структуры В. miyamotoi были получены последовательности участков генов 16S рРНК (632 п.н,). рбб (540 п.н.), 16S-23S IGS (545 п.н.) десяти образцов В. miyamotoi и последовательности гена glpQ (688 п.н.) тринадцати образцов. Последовательности всех образцов были полностью идентичны друг другу, а также последовательностям референсного штамма FR64b и (за единственным исключением) изолятов, полученных на территории России ранее (Platonov et al., 2011; Фоменко и др., 2011). Недостаточная информативность используемых маркеров побудила к разработке метода, основанного на анализе более вариабельных участков генома - межгенных спейсеров.

Для проведения мультилокусного спейсер-анализа (МЛСА) было отобрано по 11 образцов В. miyamotoi, выделенных из клещей I. persulcatus и I. pavlovskyi. Сравнение образцов из разных регионов и переносчиков не выявило никаких различий в последовательностях межгенных спейсеров, за исключением двух образцов из Пермского края, у которых была обнаружена одна нуклеотидная замена (транзиция G/A в позиции 238 спейсера IGS4). Филогенетическое древо, построенное на основе анализа конкатенированных последовательностей восьми спейсеров, а также места выделения образцов В. miyamotoi представлены на Рисунке 4. За исключением указанной замены, изменчивости не было обнаружено также и по сравнению с известной полногеномной последовательностью штамма FR64b (СР004217).

Принимая во внимание полученные данные, а также результаты мультилокусного сиквенс-типирования, свидетельствующие об отсутствии генетического полиморфизма изолятов В. miyamotoi на территории Японии (Takano et al., 2014), можно предположить отсутствие генетического разнообразия всего азиатского типа В. miyamotoi на территории от Балтийского моря до Японских островов. В 2014 г. Takano А. с соавторами была высказана гипотеза о клональности популяции В. miyamotoi на территории Японских островов (Takano

et al., 2014). Наши данные позволяют распространить эту гипотезу на весь ареал клещей Ixodes, в которых может поддерживаться азиатский тип В. miyamotoi.

Логично предположить два варианта, которые могли бы объяснить такую ситуацию. Во-первых, отсутствие вариабельности может быть результатом недавнего возникновения азиатского типа в результате адаптации к клещам рода Ixodes, распространенными на территории Азии. Во-вторых, могло произойти быстрое распространение одного клона при наличии исходного разнообразия в месте происхождения. Так как для некоторых переносимых клещами патогенов как вирусной, так и бактериальной природы, было показано быстрое распространение в результате влияния человеческой деятельности на природные очаги (Kovalev et al., 2009; Parola and Raoult, 2001; Pfeffer and Dobler, 2010), мы считаем логичным предложить такой путь распространения и для В. miyamotoi

/Фч —*

А

'v

I ':. \ V 1Ц

Арем / rxirsuicdtus •"> Ареал!. pavtovskyi О Образф! из /. persulc&tus Образцы из!. pavíovskyi

Рисунок 4 - Филогенетическое древо В. т1уато1о1, построенное на основе конкатенированных последовательностей восьми межгенных спейсеров общей длиной 3686 п.н. (азиатский тип) и географическое происхождение образцов.

Заключение

Изучение филогеографической структуры возбудителей ИКБ на территории России было основано преимущественно на анализе отдельных генетических маркеров и с трудом поддавалось стандартизации. Разработанная в настоящей работе система дифференцировки позволяет быстро и эффективно оценить видовой состав боррелий, циркулирующих в природных очагах, частоту микст-инфекций, а также идентифицировать одиночные виды, пригодные для дальнейших исследований. В перспективе предложенная система может быть адаптирована для определения видов боррелий в клиническом материале. Мультилокусное сиквенс-типирование представляется наиболее надежным и информативным методом изучения В. burgdorferi s.l., а унифицированная схема исследования и созданные электронные ресурсы могут послужить основой для международного сотрудничества исследовательских групп в изучении эпидемиологии боррелиозов.

Поднятая в данной работе проблема несвойственного для микроорганизмов отсутствия изменчивости В. miyamotoi требует проведения дальнейших исследований как с точки зрения обнаружения внутритиповой изменчивости на уровне анализа полных геномов, так и выяснения причин вероятного быстрого распространения клонов В. miyamotoi на большие расстояния.

Выводы

1. В настоящей работе разработана система дифференцировки четырех встречающихся в России видов боррелий, основанная на ПЦР в реальном времени. Данная система позволила определить видовую принадлежность около 90% позитивных образцов.

2. Показано, что В. bavariensis соответствует геногруппе NT29 В. garinii и в клещах I. persulcatus встречается чаще или с той же частотой, что и В. garinii (объединяет геногруппы 20047 и ChY13p). В клещах I. pavlovskyi преобладает В. garinii, в то время как встречаемость В. miyamotoi в обоих видах клещей статистически не отличается.

3. Установлено, что большая часть сиквенс-типов нзолятов В. afzelii, выделенных в России, формирует обособленную группу, филогенетически близкую изолятам из Китая и Японии.

4. Показано высокое генетическое разнообразие и неоднородное географическое распределение сиквенс-типов В. bavariensis и В. garinii.

5. Разработана система мультилокусного спейсер-анализа В. miyamotoi, а также показана крайне низкая генетическая изменчивость азиатского типа В. miyamotoi как на уровне кодирующих генов, так и на уровне некодирующих межгенных спейсеров. Выдвинута гипотеза о быстром клональном распространении В. miyamotoi по территории Евразии.

Публикации соискателя по теме диссертационной работы

Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ

1. Mukhacheva Т.A. Multilocus sequence analysis of Borrelia burgdorferi s.l. in Russia / T.A. Mukhacheva, S.Y. Kovalev // Ticks and Tick-borne Diseases. - 2013. -V. 4,-№4.-P. 275-279.

2. Mukhacheva T.A. Borrelia spirochetes in Russia: Genospecies differentiation by real-time PCR / T.A. Mukhacheva, S.Y. Kovalev // Ticks and Tick-borne Diseases. -2014. - V. 5. - № 6. - P. 722-726.

3. Mukhacheva T.A. Multilocus spacer analysis revealed highly homogenous genetic background of Asian type of Borrelia miyamotoi / T.A. Mukhacheva, I.I. Salikhova, S.Y. Kovalev//Infection, Genetics and Evolution. -2015. -V. 31. - P. 257262.

Публикации в других журналах и сборниках

4. Якушкина А.Ю. Иксодовый клещевой боррелиоз на территории Свердловской области. Молекулярно-эпидемиологические особенности возбудителя / А.Ю. Якушкина, Т.А. Мухачева, А.А. Федотова // Материалы 65-й Всероссийской научно-практической конференции молодых учёных и студентов с международным участием «Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения». - Екатеринбург. - 2010. - С. 452-455.

5. Мухачева Т.А. Боррелии на Среднем Урале: оценка зараженности клещей разными геновидами и их сочетаниями / Т.А. Мухачева, С.Ю. Ковалев //

Материалы Всероссийской конференции с международным участием «Современные аспекты природной очаговости болезней». - Омск. — 2011. — С. 105-106.

6. Мухачева Т.А. Мультилокусное типирование возбудителей иксодового клещевого боррелиоза на Урале / Т.А. Мухачева, Е.В. Жуйкова, С.Ю. Ковалев // Материалы IV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Биологические системы: устойчивость, принципы и механизмы функционирования», Ч. 2. - Нижний Тагил. - 2012. — С. 85-87.

7. Мухачева Т.А. К вопросу о классификации возбудителей иксодового клещевого боррелиоза / Т.А. Мухачева, Е.В. Жуйкова // Материалы 67-й Всероссийской научно-практической конференции молодых учёных и студентов с международным участием «Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения». — Екатеринбург. — 2012. — С. 387-390.

8. Мухачева Т.А. Мультилокусное типирование в изучении структуры популяций Borrelia burgdorferi s.l. на территории России / Т.А. Мухачева, С.Ю. Ковалев // Материалы международной научной конференции «Клещевой энцефалит и другие инфекции, переносимые клещами». — Иркутск: Журнал инфекционной патологии. —2012. - Т. 19. — № 3. — С.37.

9. Мухачева Т.А. Видовая дифференциация боррелий методом ПЦР в реальном времени / Т.А. Мухачева, Ж.М. Меркушина И Материалы II Всероссийской с международным участием школы-конференции молодых ученых «Биология будущего: традиции и новации». — Екатеринбург. — 2012. — С. 157-160.

10. Мухачева Т.А. Borrelia miyamotoi в клещах на территории Среднего Урала и Западной Сибири / Т.А. Мухачева, С.Ю. Ковалев // Материалы международной конференции «Молекулярная эпидемиология актуальных инфекций». - СПб: Инфекция и иммунитет. - 2013. - Т. 3. - № 2. - С. 156.

11. Мухачева Т.А. Оценка разнообразия боррелий в клещах на территории Урала и Западной Сибири методом RT-PCR / Т.А. Мухачева, С.Ю. Ковалев // Материалы российской конференции с международным участием «Актуальные проблемы клещевого энцефалита. — М.: Медицинская вирусология. - 2013. — Т. XXVII. - № 1. - С. 65.

12. Мухачева Т.А. Оценка видового разнообразия боррелий в клещах на территории Урала и Западной Сибири методом ПЦР в реальном времени / Т.А.

Мухачева, Ж.М. Меркушина // Материалы конференции молодых ученых «Экология: теория и практика». - Екатеринбург. - 2013. - С. 70-77.

13. Мухачева Т.А. Генетическое разнообразие Borrelia miyamotoi на территории России / Т.А. Мухачева, И.И. Салихова // Материалы 81-ой всероссийской конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные вопросы современной медицины». — Иркутск. — 2014. — С. 322.

14. Мухачева Т.А. Зависимость генетического разнообразия боррелий от вида клеща-переносчика / Т.А. Мухачева, С.Ю. Ковалев // Материалы 4-го Съезда военных врачей медико-профилактического профиля «Обеспечение санитарно-эпидемиологического благополучия военнослужащих и населения в современных условиях». - Санкт-Петербург. - 2014. - С. 136.

15. Мухачева Т.А. Мультилокусное сиквенс-типирование боррелий на территории России: промежуточные итоги и перспективы / Т.А. Мухачева, С.Ю. Ковалев И Материалы научно-практической конференции с международным участием «Актуальные аспекты природной очаговости болезней». - Омск: Национальные приоритеты России. - 2014. - Т. 13. - № 3. - С. 110-113.

Список сокращений, использованных в автореферате

ИКБ — иксодовый клещевой боррелиоз MJICA — мультилокусный спейсер-анализ MJICT — мультилокусное сиквенс-типирование п.н. - пара нуклеотидов ПЦР — полимеразная цепная реакция

ПЦР-ПДРФ — полиморфизм длин рестрикционных фрагментов продуктов полимеразной цепной реакции

ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в реальном времени BSK - культуральная среда Barbour-Stoenner-Kelly fla — ген флагеллина (flagellin)

glpQ - ген, кодирующий глицерофосфодиэфир-фосфодиэстеразу IGS - межгенный спейсер (intergenic spacer) ST (CT) - сиквенс-тип (sequence type)

МУХАЧЕВА Татьяна Александровна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ИКСОДОВОГО КЛЕЩЕВОГО БОРРЕЛИОЗА В ПРИРОДНЫХ ОЧАГАХ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИИ

03.02.03 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 26.09.2015 Формат 60x90/16

Усл. печ. л. 1. Тираж 120 экз. Заказ № 67 ООО «Копи Мастер» 620014 г. Екатеринбург, Шейнкмана, д.57 тел/факс 379-50-28, е-таП: copymaster@list.ru