Молекулярно-генетическая характеристика астровирусов, циркулирующих в Новосибирске

Тикунов, Артем Юрьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетическая характеристика астровирусов, циркулирующих в Новосибирске
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическая характеристика астровирусов, циркулирующих в Новосибирске"

На правах рукописи

Тикунов Артем Юрьевич

Молекулярно-генетическая характеристика астровирусов, циркулирующих в Новосибирске

03.01.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических

наук

1 9 МАЙ 2011

Кольцово-2011

4846858

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России, Учреждении Российской академии наук Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН, Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Новосибирский государственный университет

Научный руководитель

член-корреспондент РАН,

доктор биологических наук, профессор

Сергей Викторович Нетесов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Иван Алексеевич Разумов

доктор биологических наук, профессор Эдуард Владимирович Карамов

Ведущая Учреждение Российской академии медицинских

Организация наук Научно-исследовательский институт

молекулярной биологии и биофизики Сибирского отделения РАМН

Защита состоится « 10 » июня 2011 г. в _13°°_ часов на заседании диссертационного совета Д.208.020.01 при ФГУН Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу: ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Кольцово Новосибирской области, 630559, тел. (383)336-74-28

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»

Автореферат разослан «¿Ж 2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Г.П. Трошкова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Острые кишечные инфекции (ОКИ) являются одной из важных проблем здравоохранения как в развивающихся, так и в развитых странах. ОКИ могут быть вызваны патогенными и условно-патогенными бактериями, простейшими и вирусами. Особое значение ОКИ имеют для детей раннего возраста, у которых в связи с незрелостью системы гомеостаза наиболее часто возникают состояния, угрожающие жизни. По данным ВОЗ в мире регистрируется ежегодно около 700 миллионов случаев ОКИ, и ежегодно смертность, ассоциированная с гастроэнтеритами, составляет более 3-х миллионов (Wilhelmi et al., 2003). Ввиду социальной значимости острых кишечных инфекций человека актуальным является эпидемиологический мониторинг вызывающих их этиологических факторов.

Астровирус человека (HAstV) по данным зарубежных исследователей является второй по значимости причиной вспышек ОКИ в таких регионах, как Юго-Восточная Азия, Северная и Латинская Америка, а вклад в спорадическую заболеваемость варьирует от 4 до 17% в различных регионах (Palombo et al., 1996; Pang et al., 1999; Naficy et al., 2000; Bhattacharya et al., 2006; Nguyen et al., 2008; Guo et al., 2010). В Российской Федерации санитарно-эпидемиологический контроль астровирусной инфекции не проводится.

Важной частью эпидемиологического мониторинга вирусного заболевания является установление циркулирующих серотипов/генотипов вируса, доминирующих в данное время в конкретном географическом районе. Происходящие в человеческой популяции смена или появление новых серотипов HAstV также требуют детального изучения их геномов. Исследование изменчивости геномов этого патогена важно для прогнозирования появления новых вариантов вируса, кроме того этот анализ может пролить свет на распространение и эволюцию астровирусов.

Систематические исследования астровирусной инфекции и молекулярно-генетического разнообразия изолятов HAstV, циркулирующих на территории Российской Федерации, начаты недавно. В Западно-Сибирском регионе такие исследования начаты нами в 2005 г.

Цель работы - комплексное исследование молекулярно-генетического разнообразия изолятов астровируса человека, выявленных в Новосибирске.

Задачи исследования:

- оценить этиологическую значимость астровирусов в структуре ОКИ у детей раннего возраста и эпидемические особенности астровирусной инфекции;

- исследовать молекулярно-генетическое разнообразие изолятов астровируса человека, выявленных с 2003 по 2010 гт.;

- определить нуклеотидные последовательности геномов изолятов астровируса человека, принадлежащих к редко встречающимся генотипам;

провести филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей и оценить скорость изменчивости генома астровируса человека.

Научная новизна. Впервые проведено многолетнее комплексное молекулярно-эпидемиологическое исследование астровирусной инфекции у детей раннего возраста в Новосибирске. Установлено, что НАб^ являются относительно редкой этиологической причиной ОКИ у детей раннего возраста в Новосибирске, но их вклад в этиологию этого заболевания может резко возрастать в отдельные эпидемические периоды. Получены новые данные, свидетельствующие о распространенности астровирусной инфекции в сочетании с кишечными инфекциями другой этиологии.

Впервые проведено исследование молекулярно-генетического разнообразия изолятов Н/ЫУ, циркулирующих в Новосибирске. Выявлено доминирование изолятов астровируса первого генотипа, показано постепенное изменение спектра генетических линий этого генотипа с течением времени.

Определены нуклеотидные последовательности полных геномов трех изолятов астровирусов третьего генотипа и изолята астровируса шестого генотипа. Впервые установлена скорость изменчивости генома НА^У, продемонстрировано, что она в целом соответствует скорости изменчивости для вирусов с РНК геномом. Филогенетический анализ показал, что российские изоляты третьего генотипа вероятно дивергировали от общего предшественника около 20 лет назад.

Практическая значимость. Проводившееся оперативное выявление этиологической причины ОКИ у детей раннего возраста, госпитализированных в специализированную клинику, позволило врачам этой клиники оптимизировать курс лечения, что сокращало время пребывания пациентов в стационаре и снижало стоимость лечения.

Результаты проведенного исследования позволили определить этиологическую причину в случаях, ранее относившихся к кишечным инфекциям неустановленной этиологии (КИНЭ). Полученные данные включены в статистические отчеты детской городской клинической больницы №3 и вошли в Государственные доклады о санитарно-эпидемиологической обстановке на территории Новосибирской области.

Многолетний мониторинг генетического спектра циркулирующих изолятов HAstV является актуальным ввиду социальной значимости ОКИ, а исследование изменчивости геномов этого патогена важно для прогнозирования появления новых эпидемически значимых вариантов HAstV.

Результаты проведенных исследований будут использованы для подготовки практических рекомендаций для клиницистов, специалистов СЭС и эпидемиологов по контролю и профилактике вирусных кишечных инфекций и внедрению современных методов диагностики.

Положения, выносимые на защиту.

Астровирус человека является третьей по значимости этиологической причиной спорадических случаев ОКИ у детей раннего возраста в Новосибирске.

В Новосибирске циркулируют преимущественно изоляты астровируса человека первого генотипа, при этом с течением времени происходит постепенная смена спектра генетических линий этого генотипа. Вторыми по встречаемости являются изоляты второго генотипа астровируса человека.

Скорость эволюции генома астровируса человека в целом соответствует скорости изменчивости для вирусов с РНК геномом.

Апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 6 статей. Результаты работы были представлены на 5-ти российских и 3-х международных конференциях: Российская научно-практическая конференция «Генодиагностика инфекционных болезней», Новосибирск, 2005; П1 Российская научная конференция «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера», Новосибирск, 2006; Российская научно-практическая конференция «Молекулярная диагностика инфекционных болезней», Москва, 2007; XLV Международная Научная Студенческая Конференция, Новосибирск, 2007; Научная конференция «Медицинская геномика и протеомика», Новосибирск, 2009; 8l International Symposium on Positive-Strand RNA Viruses, Washington DC, USA, 2007; 26'h Annual Meeting of the European Society for Paediatric Infectious Diseases (ESPID), Graz, Austria, 2008; 9,h International Symposium on Positive-Strand RNA Viruses, Atlanta, USA, 2010.

Вклад автора. Выявление РНК астровирусов методом ОТ-ПДР, определение генотипической принадлежности выявленных изолятов и филогенетический анализ осуществлялись автором лично. Дизайн олигонуклеотидных праймеров для определения полных нуклеотидных последовательностей геномов изолятов астровируса человека, секвенирование полных последовательностей геномов изолятов

астровирусов и анализ полученных последовательностей также проводился автором лично. Выделение препаратов РНК из лизированных образцов фекалий осуществлялось соискателем совместно с к.б.н. Е.В. Жираковской, к.м.н. С.А. Бодневым и С.Н. Соколовым. Расчет скорости эволюции генома астровируса человека проводился совместно с к.б.н. И.В. Бабкиным.

Диссертационная работа выполнялась с 2005 по 2008 гг. в Лаборатории разработки средств экстренной профилактики ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора в рамках выполнения проекта МНТЦ №2935р, а с 2008 по 2011 гг. в Лаборатории молекулярной иммунологии ИХБФМ СО РАН и в Лаборатории бионанотехнологий НИЧ НГУ в рамках гранта НШ-65387.2010.4 по государственной поддержке ведущих научных школ Российской Федерации и госконтракта № 02.740.11.0767 «Выявление вирусных возбудителей заболеваний, актуальных для здравоохранения Западной Сибири (гепатиты, гастроэнтериты, серозный менингит), изучение их генетического разнообразия в целях разработки и совершенствования диагностикумов»

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 129 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы "Материалы и методы", главы "Результаты», главы «Обсуждение результатов", выводов и списка литературы. Библиография включает 161 публикацию. Работа проиллюстрирована 29 рисунками и включает 8 таблиц. Кроме этого, в работе содержится два приложения.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Основная характеристика обследованных больных

В данной работе проведено исследование образцов фекалий, полученных от 4808 детей преимущественно до 3-х лет, госпитализированных с диагнозом ОКИ в МУЗ Детская городская клиническая больница №3 Новосибирска. В эту специализированную клинику поступают больные дети из всех районов города и части Новосибирского сельского района. Среди обследованных были дети, находившиеся на лечении с июля 2003 по июнь 2004 г. (660 детей), с марта 2005 по июнь 2008 г. (3486 детей) и с марта 2009 по июнь 2010 г. (662 ребенка). Также проведено исследование 102 образцов фекалий, полученных от взрослых, госпитализированных с диагнозом ОКИ с марта по август 2009 г. в МУЗ Городская инфекционная клиническая больница №1 Новосибирска.

На проведение этих исследований были получены одобрения Этического комитета Государственного научного центра вирусологии и

биотехнологии "Вектор" (ГНЦ ВБ "Вектор") (регистрационный номер IRB0001360). Согласно нормативно-правовым документам, регламентирующим проведение научно-исследовательских работ с привлечением человека в качестве объекта биомедицинского исследования, мы получали письменное информированное согласие пациентов. В случае обследования детей получали письменное информированное согласие законных представителей детей, включенных в данное исследование. Каждому участнику исследования присваивался уникальный идентификационный номер, с помощью которого он идентифицировался во всех документах исследования. Конфиденциальная информация не использовалась в публикациях и отчетах.

Данные из медицинских карт пациентов вносили в единую базу данных, структура которой была разработана на основе Microsoft Office Access. В структуру базы данных входило несколько связанных таблиц, что позволяло при использовании запросов Access производить анализ имеющейся информации.

Исследование эпидемических особенностей астровирусной инфекции в Новосибирске Для изучения эпидемических особенностей астровирусной инфекции на территории Новосибирска было проведено исследование образцов фекалий детей раннего возраста, госпитализированных в МУЗ ДГКБ №3 с диагнозом ОКИ. Пробы от всех больных инфекционного отделения №2 собирали в течение трех лет с 1 июля 2005 по 30 июня 2008 года и еженедельно передавали нам на анализ. На каждого заболевшего составлялась подробная карта пациента, где указывались клинические и эпидемиологические данные. На основании этих карт данные переносились в специально разработанную базу данных.

Всего за 3-х летний период протестировали на наличие РНК HAstV 3095 образцов фекалий. Мы разделили весь исследуемый период на три эпидемических сезона с июля по июнь следующего года и назвали их соответственно первый, второй и третий эпидемический сезоны. Выделение эпидемических сезонов таким образом было обусловлено наблюдениями других исследователей о том, что встречаемость вирусных патогенов, вызывающих ОКИ, часто повышается в холодное время года.

РНК HAstV выявляли методом ОТ-ПЦР, визуализацию продукта реакции вели электрофоретически. РНК HAstV были обнаружены в 209 пробах, что составило почти 7% от общего числа образцов. В первом эпидемическом сезоне астровирусы были обнаружены в 7,5% пробах (70/937), во втором встречаемость составила почти 9% (93/1042), а в третьем чуть более 3% (46/1116). Данные приведены на рисунке 1. Таким

июль ZOOS - июнь 200?

июль 2005 - июнь 2006

41Л«%

июль 2007 - июнь 2008

июнь 2005 - июль 2008

■астромоно Настро микст ■ рота gjHopo Цбактерии □микст ПКИНЭ

Рис. 1. Этиологическая структура ОКИ в различные эпидемические сезоны и за весь исследуемый период. КИНЭ - кишечные инфекции неустановленной этиологии.

образом, в Новосибирске астровирусы являлись третьей причиной спорадических ОКИ среди вирусных патогенов, уступая ротавирусам группы А и норовирусам 2 геногруппы.

Все исследуемые пробы фекалий от больных с диагнозом ОКИ были протестированы на наличие не только РНК астровирусов, но и на наличие РНК ротавирусов группы А и норовирусов 1 и 2 геногрупп, а также на наличие ДНК патогенных бактерий: сальмонелл, кампилобактерий, шигелл и энтероинвазивных Е. coli. В связи с этим можно было оценить вклад HAstV в составе моноинфекций и ОКИ сочетанной этиологии. За весь исследуемый период ОКИ, вызванные моноинфекцией HAstV, были выявлены в 44,5% случаев от всех обнаруженных случаев астровирусной инфекции (Рис. 2), однако этот показатель существенно варьировал в различные эпидемические сезоны. Чаще всего они встречались в сочетании с самым распространенным патогеном -ротавирусами, почти в 32% случаев, на втором месте по встречаемости в сочетании с астровирусами были норовирусы. Более 10% выявленных случаев астровирусной инфекции были обнаружены в сочетании более чем с одним патогеном. Встречаемость астровирусов в сочетании с

□ астро moho ■ астро микст с бактериями

О астро микст с рота л астро микст более чем

■ астро микст с норо с одним патогеном

Рис. 2. Встречаемость астровирусов в моноинфекциях и в составе инфекций сочетанной этиологии в различные эпидемические сезоны и за весь период исследования.

июль 2007 - июнь 2008

июль 2005 - июнь 2008

бактериальными патогенами составила более 6%.

Анализ сезонной встречаемости НАв^ показал, что они выявлялись в течении всего периода исследования, кроме декабря 2008 года. Выявляемость астровирусов по отношению к общему числу поступивших с диагнозом ОКИ в различные месяцы варьировала от 0% до 25,8% (Рис. 3). Наибольшее число выявленных астровирусов было обнаружено в декабре 2006 года, причем в этом месяце астровирусы вышли на второе после норовирусов место по встречаемости, опередив ротавирусы, которые, как правило, выявлялись значительно чаще, чем астровирусы и норовирусы. Каких либо закономерностей в распределении астровирусов по сезонам выявить не удалось.

При анализе возрастного распределения больных с астровирусной инфекцией за весь исследуемый период были выявлены следующие особенности. Чаще всего астровирусы выявлялись у детей в возрасте от 6 до 8 месяцев, при этом более 85% заболевших были младше одного года и более 96% заболевших астровирусами были младше полутора лет (Рис. 4). Еще одной особенностью являлось то, что чем старше были дети, тем чаще у них астровирусы детектировались в составе инфекций сочетанной

¡ И 1 ¡ 1 i i | r 1 I I м I I 1 i I f t 1 ¡ 1 i i i I i i i í 11

Кастро ке го ■ другие вирусы Щ бактерии О микст вирусов с бактериями О кию

Рис. 3. Сезонность выявления астровирусов по месяцам в период с июля 2005 по июнь 2008. КИНЭ - кишечные инфекции неустановленной этиологии.

ИЮЛЬ 2005 - июнь 2006

■ 100% 5 1 36

ва% f га

г «0*/. f 1в ■

40% 110

20% i

, п , В с% 1 S о

18-23 24-3 В

Возраст пациентов, мес

ИЮЛЬ 2QOO - ИЮНЬ 2007

Шл

в-в 9-11 12-1¡ Возраст пациентом, иве

18-23 М-Зв

ИЮЛЬ 2007 - июнь 2008

июль 2GOS - ИЮНЬ 2008

12-17 1в-аз 2«-Зв Возраст пациентов, мес

12-17

Возраст пацпент он,

астро моно

3 астро микст

нуммулита

Рис. 4. Возрастное распределение пациентов с выявленной астровирусной инфекцией в различные эпидемические сезоны и за весь период исследования.

этиологии. Больше всего моноинфекций выявлялось у детей первых трех месяцев жизни, при этом с увеличением возраста пациентов уменьшался вклад астровирусной моноинфекции. В целом, возрастное распределение пациентов в каждом эпидемическом сезоне отличалось от распределения за весь период исследования, общим было то, что более 95% пациентов с выявленной астровирусной инфекцией — это дети младше полутора лет.

Генотипирование изолятов астровирусов, выявленных в Новосибирске

За период с июня 2003 года по июнь 2010 года проанализировано 4910 образцов фекалий на наличие РНК HAstV. 4808 образцов были собраны у детей, 102 образца - у взрослых, госпитализированных с ОКИ в профильные стационары Новосибирска. Всего в 289 образцах была обнаружена РНК HAstV 132 изолята астровирусов были генотипированы путем прямого секвенирования участка ОРТ2 длиной 373 и.о., подобранного ранее (Noel et al., 1995) таким образом, чтобы генотипы соответствовали существующим серотипам. Нуклеотидные последовательности представлены базе данных GenBank. Из описанных кнастоящему времени восьми генотипов астровирусов человека (HAstV-1 - HAstV-8) в Новосибирске были обнаружены: HAstV-1 - 107 изолятов (81,06%), HAstV-2 - 15 изолятов (11,36%), HAstV-З - 5 изолятов (3,79%), HAstV-4 - 4 изолята (3,03%) и HAstV-6 - один изолят (0,76%). Таким образом, за исследуемый период чаще всего выявлялись HAstV-1, при этом были обнаружены изоляты трех из четырех описанных к настоящему времени линий: HAstV-la, HAstV-lb и HAstV-ld, при этом 46% от всех изолятов первого генотипа принадлежали к линии HAstV-Id. Следует отметить, что вклад каждой линии в различные эпидемические сезоны различался (Рис. 5). Так, за период с июня 2003 года по июнь 2007 года вклад линий HAstV-lb и HAstV-ld был сопоставим. С 2003 по 2008 гг. включительно изоляты линии HAstV-1а встречались лишь в единичных образцах, в то время как с января 2009 г. изоляты этой линии стали преобладать. Начиная с эпидемического сезона июль 2009 - июнь 2010 г., наибольший вклад в заболеваемость астровирусной инфекцией вносили астровирусы, принадлежащие линии HAstV-Id.

В эпидемическом сезоне с июля 2007 по июль 2008 года произошли значительные изменения, чаще всего выявлялись астровирусы второго генотипа, принадлежащие линии HAstV-2a, а вклад прежде доминантной линии HAstV-Id снизился. Изоляты, принадлежащие к генотипам HAstV-2, HAstV-З и HAstV-4, выявлялись не в каждый эпидемический сезон, и спектр выявленных генотипов отличался в разные эпидемические сезоны (Рис. 5).

90%

80% 70% 60%

50%

40%

30% 20%

10% 4— ---- £--М-И—

^Н — ШЯ ^Н ^В

2003-04 2005-06 2006-07 2007-08 2009-09 2009-10

■ НАзМ-1а □ НАвЛМЬ □ НАзМ-1с Ш НАвА/-2

Ш НА»«ЛЗ Н НА>ПМ @ НАзМ-б Рис. 5. Представленность генотипов НАэ^, выявленных в Новосибирске в разные эпидемические сезоны.

Среди нуклеотидных последовательностей генотипирующего участка изолятов НАб1У-1 было вьмвлено 26 различных генетических вариантов (Рис. 6). Всего в этом участке было определено 70 позиций, в которых присутствовали нуклеотидные замены, причем лишь пять из них были значимыми. Для нуклеотидных последовательностей генотипирующего участка изолятов НАв1У-2 были обнаружены 3 различных генетических варианта (Рис. 6), при этом было определено 57 нуклеотидных позиций, в которых присутствовали различия. Все они были не значимыми. Для нуклеотидных последовательностей генотипирующего участка пяти изолятов ВД^У-З были определены три различных генетических варианта (Рис. 6). При этом было выявлено всего три позиции, в которых присутствовали различия в нуклеотидных остатках. В выведенных аминокислотных последовательностях замен найдено не было. Все четыре изолята НАэ1У-4, выявленные в Новосибирске, имели разные нуклеотидные последовательности генотипирующего участка (Рис. 6).

77 | D108(4)-MAYCje-SEP0fl H393(1)-MAR04 D6(2bJAN09 N142(1)-MAR10 3015<10>^EBOS-MAR10 B62-MAY-09 1639(1>-NOVOS Нц/2987/1999/ОН USA ■i N552(1 )-JUN 10 I KAstV-1 (Oxford) H278(1b>AN04 H18(6) JUN03-MAY04 H u/352/M a г-2002/ТМА

1850(1 HAN07 1818(1)-JAN0r (8 )>J U L0 S-OE COS В eljln»/131/Nov-2007/CHN 3458(2)-JUNOa-MAY09 >258(1 K>CT09 H491(1)-APR04 Tumen/11094/Sep»2006/RUS 2252(1 HUNQ7 1854(1 )-JAN07 1812(14 >-NO V O6-AUGO 7 N43(18}-MAR10-JUN10 N133(1 )-MAR10 H435( 10}-M A R04-AUG10 3360(6)-AP R08-JAN09 1736<3)-OEC06-JAN07 • HAstV-1 (Dresden)

CheJabinsk/8022/S ep-2005/RUS 1602(8)-NOV0e-JAN07 1738(3)-OE CO &-JA N 07 B4(1 )-M AR-0 9 HAstV-6(Osaca)

HAstV-1

• HA3tV-5(Golana) Ф HAstV-7(Oslo) ■ ■ ■■■ Ф H Ast V-3(B eiji ng)

K- 342(3) FEB04-SEP05 H191(1>NOV03 3384(1) APR09 74j 430(12) AUG05-FEB0S 100 Moscow/10685/2006/RUS

L 3028(1) FEB08 i» i 1029(2) APROe-OECOe — • HAstV-2 (Ox ford)

j 1183(1) JUN08

■ 623(1) О СТО 5 U 1217(1) JUN08 -N358(1) MAY 10

► HA* tV-4(Dres den)

► HAstV-B(MaxiCO)

HAstV-6

Л H AstV-6 □ HAstV-7

HAstV-3

7tj 118^

"1-е -111 liar

li I— N358(

I t Y

HAstV-2

Э HAstV-8

Рис. 6 Филограмма генетических вариантов изолятов НАб^, выявленных с 07.2003 по 06.2010, построенная методом объединения ближайших соседей. В указаны статистические индексы поддержки. Черными кружками обозначены последовательности референсных штаммов, взятых из СепВапк.

Всего было определено 11 нуклеотидных позиций, в которых присутствовали различия, но все они были не значимыми.

Изоляты линии HAstV-lb представлены наибольшим количеством генетических вариантов - 11 вариантов (Рис. 6). Изоляты линий HAstV-la и HAstV-ld содержали по 8 и 7 генетических вариантов, соответственно (Рис. 6). Для трех линий HAstV-lb, HAstV-lc и HAstV-ld характерно наличие как генетических вариантов, обнаруженных в единичных образцах, так и генетических вариантов, выявленных во множестве образцов. При этом один из генетических вариантов линии HAstV-ld встречался в течение почти всего периода наблюдения - с марта 2004 по август 2010 г. Таким образом, изоляты астровирусов первого генотипа обладали наибольшими различиями как в нуклеотидном составе генотипирующего участка, так и наибольшими различиями в аминокислотном составе белков капсида.

Секвенирование геномов изолятов астровирусов, выявленных в Новосибирске Изоляты, принадлежащие к генотипам HAstV-3, HAstV-4 и HAstV-6, были выявлены лишь в единичных образцах фекалий пациентов, госпитализированных с ОКИ в Новосибирске. В Международной базе GenBank представлены три полные нуклеотидные последовательности генома HAstV-4, одна последовательность генома HAstV-З, и к началу наших исследований отсутствовала полная последовательность генома HAstV-б (к настоящему времени представлены 3 такие последовательности, включая полученную в данной работе). Поэтому мы провели определение нуклеотидных последовательностей четырех российских изолятов, выделенных в Новосибирске с 2003 по 2009 гг., относящихся к третьему и шестому генотипам HAstV.

Для определения нуклеотидной последовательности изолятов астровирусов, были разработаны 41 оригинальный праймер, также для получения ПЦР-продуктов использовали три ранее описанных праймера: топ340, mon348 (Beliot et al., 1997а), mon245 (Noel et al., 1995) и один широко используемый праймер - oligo_dT(20). При сборке полногеномных последовательностей из отдельных фрагментов последовательности праймеров удалялись, а перекрывающиеся области сопоставлялись. Таким образом, получены последовательности четырех геномов изолятов астровируса, в которых отсутствовали последовательности первых 30 нуклеотидов, которые входят в 5' нетранслируемую область.

Для последовательностей каждой открытой рамки считывания (ОРТ) в отдельности, а также для полных последовательностей были построены филограммы (Рис. 7). можно отметить, что дерево, построенное на основе

последовательности ОРТ2 в целом соответствует таковому, рассчитанному по полной последовательности генома, в то время как топология филограмм для двух оставшихся ОРТ отличается. Обнаруженные различия свидетельствуют о вероятной рекомбинации между различными изолятами HAstV. Это согласуется с литературными данными, полученными при изучении как астровирусов человека, так и астровирусов птиц (Lukashov et al., 2002; Belliot et al., 1997a; Jonassen et al., 1998). Вместе с тем видно, что последовательности ОРТ изолятов, выявленных в Новосибирске, кластеризовались с таковыми последовательностями изолятов астровирусов человека генотипов HastV-З и HAstV-6 соответственно, выявленных в различных регионах, что означает, что рекомбинационные события в геномной РНК изолятов этих генотипов не происходили.

При анализе последовательности изолята шестого генотипа, которая составила 6715 нуклеотидов без 3'-концевой поли-А последовательности, было обнаружено, что она ближе всего кластеризовалась с последовательностью изолята HAstV-б, выявленного в ноябре 2007 г. в Китае (Guo et al., 2010). Длина OPTla составила 2763 н., а полипротеин, кодируемый этой рамкой, состоял из 921 а.о. Длина ОРТ16 составила 1545 н., а кодируемый этой ОРТ полипротеин состоял из 515 а.о. Длина ОРТ2 составила 2334 н., а полипротеин, кодируемый этой рамкой, состоял из 778 а.о. Число позиций, в которых присутствовали нуклеотидные замены относительно изолята, выявленного в Китае, составило 178 позиций. Из них всего 3 замены приходились на 5' нетранслируемую область, 72 замены присутствовали в OPTla, 40 замен в ОРТ 16 и 63 замены в ОРТ2. Замен в 3' нетранслируемой области не было. Из 178 нуклеотидных замен 40 замен были значимыми (Рис. 8), причем 17 приходились на OPTla, 8 замен на ОРТ16 и 15 замен на ОРТ2. В среднем показатель изменчивости составил 2,65x10"2 замен на сайт, причем самой консервативной оказалась ОРТ16 с показателем 2,59х10~2 замен на сайт, а самой изменчивой была ОРТ2 с показателем 2,7х 10'2 замен на сайт, показатель изменчивости для OPTla составил 2,61 0"2 замен на сайг (Таблица 1).

Анализ трех нуклеотидных последовательностей изолятов HAstV-3, выявленных в Новосибирске, которые составили по 6787 н. каждая без 3'-концевой поли-А последовательности, проводился с использованием нуклеотидной последовательности изолята HAstV-З, выявленного в марте 1998 года в Германии (AF141381). В последовательностях всех трех изолятов, выявленных в Новосибирске, присутствовала делеция 69-го н. из 5'-нетранслируемой области. Кроме того, в последовательностях всех трех изолятов присутствовала инсерция триплета AAA после 2409 н. Таким

I—•

К I-

■-Ато

Г]_|—«

ш1-1

1—1—• «I_Г"

1оо1—I

• Н191 Н355

ззн

АР»13а((НА1«Л АУ720в91(НА81\Л4) АУ7авИ(НАЯ1М)

ТЛ55ЩИММ) И755404(НА$1У-1) П7Й402(НА5|\М) РЛ55405(НА5ГУ-1) -ЮШЗЗ(КА!№5|

-изн^имм)

АР260508(НА51У-8) —ЮМ4027|НА5М) —— М070852(НА5|У-4)

—22577|{НА5М) -НН237363{НА8||Л6) -«Н9ОТ(НА5«-6)

№55Щ4(НА$ЙМ) Н755402(НА«№() 1МI—РЛ7554Ю{НА51У-1) ИШ852|НА5»М1 ¡3(НАз№5) (э049560в{НА8№^) • 14 НМ23736Э(ИЛ5|У<)

АГШЗОЧНАМЧ-З) Н355 Н191 3364

ратемщнАями)

АУ720892[НА«|У-1) РЛ5540Э{НА5П/-1)

225771(НА81*1) И3745{НА9№-2} АР26О5О0(НА,1У-Й)

Р0344027(НА5М)

ЛТ720891(НА8ПМ)

Са070852(НА1№4)

[ХХЙ96ЭЗ<НАЛУ-5)

НМ23736Э(Нм«-61

0,02

Рис. 7. Филограммы нуклеотидных последовательностей (А - ОРТ1а, Б -ОРТ 16, В - ОРТ2 и Г - полные геномные последовательности) изолятов астровирусов, построенные методом объединения ближайших соседей, в узлах указаны статистические индексы поддержки. Черными кружками отмечены изоляты астровирусов выявленных в Новосибирске.

OPTla

OPT16

13344444

OPT2

11233355666688 794470112401360-7 24278824854877352 #GQ495608 (HAstV-6) TEHSRRDLREASTVIKG RRDDNKNV NRGAIAMATITSELG #Eus-Nsc09-B4 AVYTKHNMLDVNIIMRS KKEEDEDA YKSTVTLTILSRDFA

344556666677 76812578 579237572444645 83305105 087980121178251

Рис. 8. Конденсированное выравнивание различий в выведенных аминокислотных последовательностей рамок трансляции изолятов Нав^-6, выявленных в Новосибирске и в Китае. Номера соответственных позиций а.о. указаны по вертикали.

Таблица 1.

Показатели попарной изменчивости нуклеотидных последовательностей изолятов НАб^-З и НАэ^-б, выявленных в Новосибирске, относительно наиболее гомологичных последовательностей НАб1У соответствующих генотипов.

Изолят OPTla ОРТ 16 ОРТ2 Вся посл-ть

Сравнение с HAstV-3 (AF141381)

Rus-Nsc03-H191 4,60*102 замен/сайт 2,20х10"2 замен/сайг 3,82х10"2 замен/сайт 3,80хЮ'2 замен/сайт

Rus-Nsc04-H355 4,42x10"' замен/сайт 2,33* 10"2 замен/сайт 3,78*10"2 замен/сайт 3,74x10" замен/сайт

Rus-Nsc08-3364 4,92* 10"2 замен/сайг 2,3 9*10"2 замен/сайт 4,28x102 замен/сайт 4,18хЮ"2 замен/сайт

Сравнение с HAstV-6 (GQ495608)

Rus-Nsc09-B4 2,61xl0"2 замен/сайт 2,59х10"2 замен/сайт 2,7х 10"2 замен/сайт 2,65х Ю"2 замен/сайт

образом, последовательности OPTla всех трех изолятов HAstV-3, выявленных в Новосибирске, были длиннее последовательности OPTla референсного изолята на три н. и составили по 2784 н., а полипротеины, кодируемые этими рамками трансляции, были длиннее на один остаток лизина и состояли из 928 а.о. Длины ОРТ16 составили по 1545 н., а полипротеины, кодируемые этими рамками, состояли из 515 а.о. Длины ОРТ2 составили по 2382 н., а полипротеины, кодируемые этими рамками, состояли из 794 а.о.

В нуклеотидной последовательности изолята HAstV-З, выявленного в Новосибирске в 2003 г. (Н191), было обнаружено 258 позиций, в которых находились нуклеотидные замены относительно последовательности

изолята, выявленного в Германии (АР141381), 5 из них располагалось в 5'-нетранслируемой области, 128 замен присутствовало в ОРТ 1а, 34 замены -в ОРТ16 и 91 замена - в ОРТ2. Замен в З'-нетранслируемой области не было. Из 258 замен 32 были значимыми (Рис. 9), причем 17 значимых замен приходилось на ОРТ 1а, 3 на ОРТ 16 и 12 на ОРТ2. В нуклеотидной последовательности изолята Н355 было обнаружено 254 позиции, в которых были нуклеотидные замены относительно последовательности изолята, выявленного в Германии (АН41381), 5 из них располагалось в 5'-нетранслируемой области, 123 замены присутствовало в ОРТ1а, 36 замен в ОРТ16 и 90 замен в ОРТ2. Замен в З'-нетранслируемой области не было. Из 254 замен 29 были значимыми (Рис. 9), причем 14 значимых замен приходилось на ОРТ1а, 2 на ОРТ16 и 13 на ОРТ2. В нуклеотидной последовательности изолята 3364 было обнаружено 284 позиции, в которых были нуклеотидные замены относительно последовательности изолята, выявленного в Германии (АР141381), 8 из них располагались в 5'-нетранслируемой области, 137 замен присутствовало в ОРТ 1а, 37 замен в ОРТ 16 и 102 замены в ОРТ2. Замен в З'-нетранслируемой области не было. Из 284 замен 35 были значимыми, причем 18 значимых замен приходилось на ОРТ 1а, 3 на ОРТ16 и 14 на ОРТ2.

ОРТ1а

1133667777778888

12368897819126777890011 79912716464145017440928 #А?141381НАзСТ-3 НЗУАУОХЗАЬУААЗМЖАЕЕШЗ .Р1Т.Е.КТ1А^т>.УА.З.Т

#Еиз-нзс04-нз55 .р л .Етаттлгга)____Э..

♦Ииз-НзсО8-3364 ЗР.ТАЕ.КТ1АУ\тП5С. .ОЭЗ.

ОРТХб ОРТ2

223 334444456666777

2334 010344501457488

9274 961308019688703

А«^ УТМШТТАЬЗОЬСИ

ТЕО. ЬАТТ..АЕЕТИ.ИТМ

■ЕО. LATTV.AEFTN.DTM

•ЕОЬ ЬАТТ.АЗЕЕТЫЕОТМ

Рис. 9. Конденсированное выравнивание различий в выведенных аминокислотных последовательностях ОРТ изолятов Нав^-З, выявленных в Новосибирске, относительно выведенных последовательностей ОРТ изолята НаБ^-З, выявленного в Германии. Номера соответственных позиций а.о. указаны по вертикали.

Нуклеотидные последовательности изолятов НАяГУ-З, выявленных в Новосибирске, между собой имели большую степень гомологии, чем с последовательностью референсного изолята НАб^-З, выявленного в Германии (АП41381). Самой консервативной была последовательность ОРТ16, с показателями изменчивости от 2,20х10"2 замен/сайт до 2,39*10"2

замен/сайт, самой изменчивой была последовательность ОРТ 1а с показателями от 4,42x10"2 замен/сайт до 4,92x10"2 замен/сайт. Показатели изменчивости последовательности ОРТ2 были от 3,74* 10'2 замен/сайт до 4,18* Ю"2 замен/сайт. Такие закономерности наблюдались для всех последовательностей изолятов HAstV-3, выявленных в Новосибирске (Таблица 1).

Определение скорости молекулярной эволюции астровируса человека

Для дальнейшего анализа кроме полных геномных последовательностей четырех изолятов HAstV, выделенных в Новосибирске, использовали также полные геномные последовательности девяти штаммов HAstV разных генотипов с известными данными о времени их изоляции, представленные в GenBank. В анализ не вошли последовательности штаммов, культивированных на культурах эукариотических клеток, а также штаммов, время изоляции которых не известно.

Выравнивание 13 нуклеотидных последовательностей проводили в программе ClustalX. На основе полученного выравнивания были определены значения отношений (со) числа несинонимичных замен к числу синонимичных замен для нуклеотидных последовательностей отдельных ОРТ. Анализ выявил, что все гены находятся под действием консервативной селекции, так как во всех случаях со<1. Значения ю составили для генов РНК-полимеразы - 0,05, сериновой протеазы - 0,09 и капсидного белка - 0,17. Это свидетельствует о более жестком отрицательном отборе в случае генов неструктурных белков.

Для поиска наиболее вариабельных районов в геноме HAstV изучили межштаммовые различия с помощью программы DNAsp, рассчитав показатель дивергенции я, представляющий среднее число нуклеотидных замещений, нормированное на сайт. Из рассмотрения были исключены позиции, содержащие делеции нуклеотидов. График показателей дивергенции приведен на рисунке 10А. Проведенное исследование выявило районы с наибольшим полиморфизмом нуклеотидных последовательностей.

Для выявления возможных рекомбинационных событий проанализировали полученное ранее выравнивание в программе GARD. Было детектировано 11 потенциальных статистически значимых сайтов рекомбинации в геномах анализируемых изолятов (рис. 10Б), из них 2 точки в ОРТ 1а, 3 точки в ОРТ 16 и 6 - в ОРТ2. Для сайтов №1, 2 и 6 возможность рекомбинации подтверждается КН-тестом в этой же программе с индексом р=0,01.

О-1-->--1—I-1-Il-----1---

о looo 2tioo зооо «oto soco еооо тате

Расположение точек рекомбинации

Рис. 10. Графики генетической дивергенции л (А) и локализация вероятных точек рекомбинации в геноме астровирусов человека (Б). Ось Y - индекс вероятности сайта рекомбинации в геноме астровирусов человека. Серыми стрелками обозначены ОРТ, Прямыми отрезками обозначены фрагменты генома, использованные для эволюционного анализа.

Для исследования скорости накопления мутаций, в геномах HAstV были локализованы районы с наименьшей вероятностью рекомбинационных событий, которые бы искажали эволюционную картину. Для дальнейшего анализа использовали три наиболее протяженные последовательности, расположенные между сайтами рекомбинации 0 и 1, 1 и 2 и 9 и 10, не содержащие таких точек по результатам применения программы GARD (рис. 10Б). Для этих районов дополнительно методом SBP (Single Break Point) был проведен скрининг возможных рекомбинационных событий. По результатам данного теста в дальнейшем анализе были использованы последовательности a, b и с (рис.

10Б). Длина выравнивания последовательности а составила 1076 и.о., b -784 н.о. и с - 664 н.о. Затем помощью программы Раир выполнили филогенетический ML анализ последовательностей каждого выравнивания, применяя модель эволюции и параметры, предварительно установленные с помощью программы Modeltest3.7.

Расчет скорости накопления мутаций проводили в программе Beast, использующей методы байесовской статистики и МСМС (Markov chain Monte Carlo) анализа. При этом была применена эволюционная модель HKY+Г, выбранная с использованием программы Modeltest?.7. Оказалось, что скорости накопления нуклеотидных замен составили: для фрагмента а - (3,3±0,l)xl0-3, b - (З,8±0,14)х10-3 и с - (4,0±0,2)х10"3 замен на сайт в год. Показатели приведены со стандартным отклонением. Дополнительно были оценены эти значения на основе синонимичных нуклеотидных замен. Скорости накопления мутаций составили: для фрагмента а-{2,6±0,09)х10"3, b - (2,6±0,1)хЮ"3 и с - (З,2±0,15)х10"3 замен на сайт в год. Затем с помощью программы Tracer из пакета программ Beast рассчитали скорость эволюции на основе объединенных данных для фрагментов a, b и с. Она составила (З.7±0.1)х10"3, а для синонимичных замен - (2.7±0.07)х10'3 замен на сайт в год.

Скорость накопления замен в геноме РНК-содержащих вирусов определяется ошибочностью их РНК-зависимой РНК полимеразы и динамикой репродукции вируса. По современным представлениям эта величина в основном варьирует от 10"4 до 10'2 в зависимости от вида вируса и составляет в среднем 10"3 замен на сайт в год (Jenkins et al., 2002; Duffy et al., 2008). Таким образом, HAstV демонстрируют типичную для вирусов с РНК геномом скорость изменчивости (Рис. 11).

Для последовательности фрагмента "а" генома HAstV была построена хронограмма с помощью программы TreeAnnotator vi .5.4 из пакета Beast, которая далее была визуализирована в программе FigTree (рис. 12). Можно предположить, что российские изоляты третьего генотипа дивергировали от общего со штаммом Berlin предшественника около 20 лет назад. Наиболее удалены от остальных изолятов HAstV штаммы шестого генотипа. Время их независимой эволюции вероятно насчитывает около 110лет.

Таким образом, мы показали, что рекомбинация играет важную роль в эволюции HAstV. Впервые установленная скорость изменчивости HAstV в целом соответствует скорости изменчивости для вирусов с РНК геномом. Исследование изменчивости геномов этого патогена важно для прогнозирования появления новых вариантов вируса, также этот анализ может пролить свет на распространение и эволюцию астровирусов.

Рис. 11. Скорость нуклеотидных замен на сайт в год для вирусов с РНК-геномом. Значения приведены с доверительным интервалом 0,95. Данные для всех вирусов, кроме астровируса человека, приведены по Jenkins et al., 2002.

111

—HE

HAst-1

— Goiania/GO/12/95/Brazil Rus-Nsc03-H191 RUS-NSC09-H355 Rus-Nsc08-3364 Berlin

г- Beijing/291/2007/CHN

ii- Beijlrig/176/2006/CHN

j- Beijing/293/2007/CHN

"LIS. Beijing/128/2005/CHN Goiania/GO/12/94/Brazil r—— Rus-Nsc09-B4 Li 192-BJ07-CHN

I-

Рис. 12. Хронограмма, построенная на основе нуклеотидных последовательностей полных геномов различных штаммов HAstV (обозначения штаммов приведены в табл. 5). Времена дивергенции оценены с использованием программы Beast. Значения времен дивергенции в годах приведены в узлах дерева.

выводы

1. Впервые проведено комплексное исследование молекулярно-эпидемиологических особенностей астровирусной инфекции у детей раннего возраста, госпитализированных с диагнозом ОКИ с 01.07.2005 по 30.06.2008 гг. в Новосибирске и показано, что

• астровирусы человека, выявленные в среднем в 6,8% (209/3095) клинических образцов, являются третьей по значимости этиологической причиной этих заболеваний;

• выраженной сезонной зависимости астровирусной инфекции за исследуемый период не обнаружено, однако в отдельные эпидемические периоды встречаемость астровирусов как причины ОКИ резко возрастала, достигая 25 %;

• астровирусы выявлялись в виде моноинфекций менее чем в половине случаев (44,5%), чаще всего они встречались в сочетании с ротавирусами группы А (23%).

2. Проведено исследование молекулярно-генетического разнообразия изолятов астровируса человека, выявленных у больных, госпитализированных с ОКИ в период с 2003 по 2010 гг., и продемонстрировано, что в Новосибирске доминировали изоляты астровируса первого генотипа (HAstV-1, 81%), при этом с течением времени происходило изменение спектра генетических линий (субгенотипов) этого генотипа. Изоляты астровируса второго генотипа HAstV-2 встречались в 11% случаев, изоляты HAstV-3, HAstV-4 и HAstV-6 обнаруживались в единичных образцах.

3. Впервые определены нуклеотидные последовательности полных геномов трех изолятов HAstV-З и изолята HAstV-б, выявленных в Новосибирске, и показано, что последовательности ОРТ новосибирских изолятов кластеризовались с таковыми изолятов астровируса человека генотипов HastV-З и HAstV-б соответственно, выявленных в различных регионах. Во всех исследованных нуклеотидных последовательностях самой консервативной была последовательность ОРТ 16. В последовательностях всех трех изолятов HAstV-З, выявленных в Новосибирске, присутствовала делеция 69-го нуклеотида в 5'-нетранслируемой области и инсерция триплета AAA после 2409 нуклеотида относительно референсного штамма HAstV-3 Berlin.

4. Впервые установлена скорость изменчивости генома HAstV, которая составила в среднем З,7х10"3, а для синонимичных замен - 2,7х10"3 замен на сайт в год, что в целом соответствует скорости изменчивости для вирусов с РНК геномом. Проведена оценка скорости дивергенции изолятов и показано, что новосибирские изоляты HAstV-З дивергировали от общего предшественника со штаммом Berlin, выделенным в 1998 г., около 20 лет назад.

Список статей опубликованных по теме диссертации

1. Тикунов А.Ю., Жираковская Е.В., Юн Т.Э., Боднев С.А., Нетесов C.B., Тикунова Н.В. Молекулярно-генетическая характеристика астровирусов, циркулирующих в Новосибирске // Вопросы вирусологии - 2010 - № 6 - с. 19-23.

2. Тикунов А.Ю., Жираковская Е.В., Соколов С.Н., Тикунова Н.В., Никифорова H.A., Клемешева В.В., Морозов И.В., Бреннер Е.В., Курильщиков A.M., Локтев В.Б., Нетесов C.B. Генетическое разнообразие астровирусов, выявленных в 2008-09 годах в Новосибирске // Бюллетень СО РАМН - 2010 - № 6 - с. 144-149.

3. Тикунов А.Ю.,. Жираковская Е.В, Боднев С.А., Юн Т.Э., Клемешева В.В., Никифорова H.A., Корсакова Т.Г., Тикунова Н.В. Исследование астровирусной инфекции у детей раннего возраста в г. Новосибирске в 2006 году // Сибирский медицинский журнал - 2008. - т. 82 - № 7. - с. 133135.

4. Боднев С.А, Малеев В.В, Жираковская Е.В, Никифорова H.A., Корсакова Т.Г., Тикунов А.Ю., Нетесов C.B., Тикунова Н.В. Этиологическая значимость ротавирусов, норовирусов и астровирусов в структуре острых кишечных инфекций у детей раннего возраста Новосибирска в период сезонного подъема заболеваемости // Инфекционные болезни - 2008 -т. 6 - № 1 - с. 61-64.

5. Жираковская Е.В., Тикунов А.Ю., Боднев С.А., Дроздов И.Г., Индикова И.Н., Горбунов М.А., Игнатьев Г.М., Тикунова Н.В. Оценка новой ПЦР тест-системы «АмплиСенс Rotavirus/Norovirus/Astrovirus-FEP» с гибридизационно-флуоресцентной детекцией по «конечной точке» // Биопрепараты - 2008 - № 2 - с. 15-18.

Тикунов А.Ю., Жираковская Е.В., Тикунова Н.В., Игнатьев ГМ. Апробация ПЦР тест-системы "АмплиСенс Rotavirus/Norovirus/Astrovirus-FEP" для выявления вирусных патогенов, вызывающих острые кишечные инфекции // Молекулярная диагностика - 2007: Сборник трудов 6-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием (28-30 ноября 2007 г., Москва) - Москва -2007. - т. 3 - с. 298-300.

Доклады и тезисы конференций

1. Тикунов А.Ю., Жираковская Е.В., Боднев С.А., Никифорова H.A., Юн Т.Э., Корсакова Т.Г., Клемешева В.В., Тикунова Н.В. Исследование роли астровирусов в этиологии острых кишечных инфекций у детей раннего возраста в г. Новосибирске // III Российская научная конференция «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера», 27-29 сентября 2006 - Новосибирск - с. 123.

2. Тикунов А.Ю. Молекулярная эпидемиология астровирусной инфекции в Новосибирске // XLV Международная Научная Студенческая Конференция, 10-12 апреля 2007 г. - Новосибирск - т. Биология, с. 114.

3. A.Y. Tikunov, S.A. Bodnev, E.V. Zhirakovskaya, Т.Е. Yun, A.V. Kachko, N.V. Tikunova. Genetic diversity of Human Astrovirus circulating in Novosibirsk, Russia // 8th International Symposium on Positive-Strand RNA Viruses, 26-30 May 2007 - Washington DC, USA - p. 110.

4. Tikunov A., Bodnev S., Zhirakovskaya E., Yun Т., Tikunova N. Molecular epidemiology of human astrovirus infections among young children in Novosibirsk, Russia, 2005-2007//26Л Annual Meeting of the European Society for Paediatric Infectious Diseases (ESPID), 13-17 May 2008 - Graz, Austria - p. 212.

5. Тикунов А.Ю., Жираковская E.B., Нетесов C.B., Демина А.В., Тикунова Н.В. Астровирусная инфекция среди взрослых больных острыми кишечными инфекциями в г. Новосибирске // Научная конференция «Медицинская геномика и протеомика» 9-13 сентября 2009 г. -Новосибирск - с. 109.

Научное издание

Тикунов Артем Юрьевич

Молекулярно-генетическая характеристика астровирусов, циркулирующих в Новосибирске

03.01.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 28.04.2011 г. Формат 60x84 1/16. Уч.-изд. л. 1,5. Усл. печ. л. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ №136 Редакционно-издательский центр НГУ. 630090, Новосибирск-90, ул. Пирогова, 2.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Тикунов, Артем Юрьевич

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Семейство Astroviridae.

1.2. История открытия астровирусов.

1.3. Классификация астровирусов.

1.4. Физические особенности астровирусов.

1.5. Структура вириона астровируса.

1.6. Состав астровирусного вириона.

1.7. Структура и организация генома астровирусов.

1.7.1. Продукт трансляции OPTla.

1.7.2. Продукт трансляции ОРТ 16.

1.7.3. Продукт трансляции ОРТ2.

1.8. Жизненный цикл астровирусов.

1.9. Патогенез астровирусной инфекции.

1.10. Клинические особенности астровирусной инфекции

1.11. Лечение астровирусной инфекции.

1.12. Диагностика астровирусной инфекции.

1.13. Эпидемиология астровирусной инфекции.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Основная характеристика обследованных больных.

2.2. Материалы.

2.3. Основные методы.

2.3.1. Сбор образцов.

2.3.2. Осветление экстракта фекалий.

2.3.3. Выделение вирусной РНК.

2.3.4. Синтез комплементарной ДНК.

2.3.5. Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР).

2.3.6. Электрофоретический анализ образцов.

2.3.7. Проведение полимеразной цепной реакции с гибридизационнофлуоресцентной детекцией «по конечной точке».

2.3.8. Амплификация участков геномов астровируса для определения нуклеотидной последовательности.

2.3.9. Очистка продуктов ПЦР.

2.3.10. Постановка реакции Сэнгера.

2.3.11. Очистка продуктов реакции Сэнгера.

2.3.12. Филогенетический анализ.

2.3.13. Статистический анализ.

2.3.14. Анализ нуклеотидных последовательностей.

2.3.15. Определение скорости молекулярой эволюции.

Глава 3. Результаты.

3.1. Исследование эпидемических особенностей астровирусной инфекции в Новосибирске.

3.2. Генотипирование изолятов астровирусов, выявленных в Новосибирске.

3.3. Секвенирование геномов изолятов астровирусов, выявленных в Новосибирске.

3.4. Определение скорости молекулярной эволюции астровируса человека.

Глава 4. Обсуждение результатов.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетическая характеристика астровирусов, циркулирующих в Новосибирске"

Систематические исследования астровирусной инфекции и молекулярно-генетического разнообразия изолятов HAstV, циркулирующих 5 на территории Российской Федерации, начаты недавно. В ЗападноСибирском регионе такие исследования начаты нами в 2005 г.

Цель работы - комплексное исследование молекулярно-генетического разнообразия изолятов астровируса человека, выявленных в Новосибирске. Задачи исследования:

- исследовать молекулярно-генетическое разнообразие изолятов астровируса человека, выявленных с 2003 по 2010 гг.;

- провести филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей и оценить скорость изменчивости генома астровируса человека.

Научная новизна. Впервые проведено многолетнее комплексное молекулярно-эпидемиологическое исследование астровирусной инфекции у детей раннего возраста в Новосибирске. Установлено, что НАэ^ являются относительно редкой этиологической причиной ОКИ у детей раннего возраста в Новосибирске, но их вклад в этиологию этого заболевания может резко возрастать в отдельные эпидемические периоды. Получены новые данные, свидетельствующие о распространенности астровирусной инфекции в сочетании с кишечными инфекциями другой этиологии.

Впервые проведено исследование молекулярно-генетического разнообразия изолятов НА^У, циркулирующих в Новосибирске. Выявлено доминирование изолятов астровируса первого генотипа, показано постепенное изменение спектра генетических линий этого генотипа с течением времени.

Определены нуклеотидные последовательности полных геномов трех изолятов астровирусов третьего генотипа и изолята астровируса шестого 6 генотипа. Впервые установлена скорость изменчивости генома НА^У, продемонстрировано, что она в целом соответствует скорости изменчивости для вирусов с РНК геномом. Филогенетический анализ показал, что российские изоляты третьего генотипа вероятно дивергировали от общего предшественника около 20 лет назад.

Практическая значимость. Проводившееся оперативное выявление этиологической причины ОКИ- у детей раннего возраста, госпитализированных в специализированную клинику, позволило врачам этой клиники оптимизировать курс лечения, что сокращало время пребывания пациентов в стационаре и снижало стоимость лечения.

Многолетний мониторинг генетического спектра циркулирующих изолятов НАб^ является актуальным ввиду социальной значимости ОКИ, а исследование изменчивости геномов этого патогена важно для прогнозирования появления новых эпидемически значимых вариантов Ш^У.

Положения, выносимые на защиту.

Апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 6 статей. Результаты работы были представлены на 5-ти российских и 3-х международных конференциях: Российская научно-практическая конференция «Генодиагностика инфекционных болезней», Новосибирск, 2005; III Российская научная конференция «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера», Новосибирск, 2006; Российская научно-практическая конференция «Молекулярная диагностика инфекционных болезней», Москва, 2007; XLV Международная Научная Студенческая Конференция, Новосибирск, 2007; Научная конференция «Медицинская геномика и протеомика», Новосибирск, 2009; 8th International Symposium on Positive-Strand RNA Viruses, Washington DC, USA, 2007; 26th Annual Meeting of the European Society for Paediatric Infectious Diseases (ESPID), Graz, Austria, 2008; 9th International Symposium on Positive-Strand RNA Viruses, Atlanta, USA, 2010.

Вклад автора. Выявление РНК астровирусов методом ОТ-ПЦР, определение генотипической принадлежности выявленных изолятов и филогенетический анализ осуществлялись автором лично. Дизайн олигонуклеотидных праймеров для определения полных нуклеотидных последовательностей геномов изолятов астровируса человека, секвенирование полных последовательностей геномов изолятов астровирусов и анализ полученных последовательностей также проводился автором лично. Выделение препаратов РНК из лизированных образцов фекалий осуществлялось соискателем совместно с к.б.н. Е.В. Жираковской, к.м.н.

СЛ. Бодневым и С.Н. Соколовым. Расчет скорости эволюции генома астровируса человека проводился совместно с к.б.н. И.В. Бабкиным.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Тикунов, Артем Юрьевич

выводы

2. Проведено исследование молекулярно-генетического разнообразия изолятов астровируса человека, выявленных у больных, госпитализированных с ОКИ в период с 2003 по 2010 гг., и продемонстрировано, что в Новосибирске доминировали изоляты астровируса первого генотипа (НАб1У- 1, 81%), при этом с течением времени происходило изменение спектра генетических линий (субгенотипов) этого генотипа. Изоляты астровируса второго генотипа НАз1У-2 встречались в 11% случаев, изоляты НАз1:У-3, НАб1:У-4 и НА^У-б обнаруживались в единичных образцах.

3. Впервые определены нуклеотидные последовательности полных геномов трех изолятов НАб1У-3 и изолята НАб1У-6, выявленных в Новосибирске, и показано, что последовательности ОРТ новосибирских изолятов кластеризовались с таковыми изолятов астровируса человека генотипов HastV-З и HAstV-6 соответственно, выявленных в различных регионах. Во всех исследованных нуклеотидных последовательностях самой консервативной была последовательность ОРТ 16. В последовательностях всех трех изолятов HAstV-З, выявленных в Новосибирске, присутствовала делеция 69-го нуклеотида в 5'-нетранслируемой области и инсерция триплета AAA после 2409 нуклеотида относительно референсного штамма HAstV-3 Berlin.

4. Впервые установлена скорость изменчивости генома HAstV, которая составила в среднем 3,7х 10"3, а для синонимичных замен - 2,7x10"3 замен на сайт в год, что в целом соответствует скорости изменчивости для вирусов с РНК геномом. Проведена оценка скорости дивергенции изолятов и показано, что новосибирские изоляты HAstV-З дивергировали от общего предшественника со штаммом Berlin, выделенным в 1998 г., около 20 лет назад.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тикунов, Артем Юрьевич, Новосибирск

1. Васильев Б.Я., Васильева Р.И., Лобзин Ю.В. Острые кишечные заболевания: Ротавирусы и ротавирусная инфекция // СПб.: Лань. — 2000.-С. 272.

2. Гудков В.Г., Коржев М.О., Виринская A.C. Современные проблемы инфекционной патологии человека // Материалы II научно-практической конференции Мн., - 2001. - С. 217-222.

3. Лагир Г.М., Горегляд Н.С., Булдык Е.А. Диагностика и лечение острых кишечных инфекций у детей в условиях поликлиники // Методические рекомендации. 2000. - Москва: Мн.: МГМИ. - С. 41.

4. Подколзин А.Т., Мухина A.A., Шипулин Г.А. Изучение этиологии острых кишечных инфекций у детей, госпитализированных в инфекционные отделения стационаров Москвы // Инфекционные болезни. 2004. - Т. 2. - №2. - С. 85-91.

5. Учайкин В.Ф. Руководство по инфекционным болезням у детей: Учебное пособие для студентов медицинских вузов // М.: ГЭОТАР Медицина 1998. - С. 540.

6. Фатеева Е.М., Гмошинская М.В. Естественное вскармливание и кишечные инфекции: концепция протекторных эффектов женского молока // Вопросы детской диетологии. 2003. - Т. 1. - № 2. - С. 60-63.

7. Abad F.X., Villena С., Guix S., Caballero S., Pintó R.M., Bosch A. Potential role of fomites in the vehicular transmission of human astroviruses // Appl. Environ. Microbiol. -2001. V. 67(9). P. 3904-3907.

8. Al-Mutairy B., Walter J.E., Pothen A., Mitchell D.K. Genome prediction of putative genome-linked viral protein (VPg) of astroviruses // Virus. Genes. -2005.-V. 31(1).-P. 21-30.

9. Appleton H., Higgins P.G. Viruses and gastroenteritis in infants // Lancet. -1975.-V. 1 (7919).-P. 1297.

10. Armitage P., Berry G., Matthews J.N.S. Statistical Methods in Medical Research // Blackwell Science 2002.

11. Aroonprasert D., Fagerland J.A., Kelso N.E., Zheng S., Woode G.N. Cultivation and partial characterization of bovine astrovirus // Vet. Microbiol.-1989.-V. 19(2).-P. 113-125. '

12. Ashley C.R., Caul E.O. Potassium tartrate-glycerol as a density gradient substrate for separation of small, round viruses from human feces // J. Clin. Microbiol. 1982. -V. 16(2). -P. 377-381.

13. Ashley C.R., Caul E.O., Paver W.K. Astrovirus-associated gastroenteritis in Children // J. Clin. Pathol. 1978. - V. 31(10). - P. 939-943.

14. Bass D.M.; Qiu S. Proteolytic processing of the astrovirus capsid // J. Virol. -2000.-V. 74(4).-P. 1810-1814.

15. Baxendale W., Mebatsion T. The isolation and characterization ofastroviruses from chickens // Avian Path. 2004. - V. 33(3). - P. 364-370.

16. Behling-Kelly E., Schultz-Cherry S., Koci M., Kelley L., Larsen D., Brown C. Localization of astrovirus in experimentally infected turkeys as determined by in situ hybridization // Vet. Pathol. 2002. - V. 39(5). - P. 595-598.

17. Belliot G., Laveran H., Monroe S.S. Detection and genetic differentiation of human astroviruses: phylogenetic grouping varies by coding region // Arch. Virol.- 1997a.-V. 142(7).-P. 1323-1334.

18. Belliot G., Laveran H., Monroe S.S. Capsid protein composition of reference strains and wild isolates of human astroviruses // Virus. Res. — 1997b. — V. 49(1).-P. 49-57.

19. Belliot G., Laveran H., Monroe S.S. Outbreak of gastroenteritis in military recruits associated with serotype 3 astrovirus infection // J. Med. Virol. — 1997c. V. 51(2).-P. 101-106.

20. Beuret C. Simultaneous detection of enteric viruses by multiplex real-time RT-PCR//J. Virol. Methods. -2004. V. 115(1).-P. 1-8.

21. Bhattacharya R., Sahoo G.C., Nayak M.K. Molecular epidemiology of human astrovirus infections in Kolkata, India // Infection, Genetics and Evolution 2006. - V. 6. - P. 425-435.

22. Bridger J.C. Detection by electron microscope of caliciviruses, astroviruses and rotavirus-like particles in the faeces of piglets with diarrhoea // Vet. Rec. 1980. - V. 107.-P. 532-533.

23. Brinker J.P., Blacklow N.R., Herrmann J.E. Human astrovirus isolation and propagation in multiple cell lines // Arch. Virol. 2000. - V. 145(9). - P. 1847-1856.

24. Brown D.W., Gunning K.B., Henry D.M., Awdeh Z.L., Brinker J.P., Tzipori S., Herrmann J.E. A DNA oligonucleotide microarray for detecting human astrovirus serotypes // J. Virol. Methods. 2008. - V. 147(1). - P. 86-92.

25. Caballero S., Guix S., El-Senousy W.M., Calico I., Pinto R.M., Bosch A. Persistent gastroenteritis in children infected with astrovirus: association with serotype-3 strains // J. Med. Virol. 2003. - V. 71(2). - P. 245-250.

26. Caballero S., Guix S., Ribes E., Bosch A., Pintó R.M. Structural requirements of astro virus virus-like particles assembled in insect cells // J. Virol. 2004. - V. 78(23). - P. 13285-13292.

27. Caul E.O., Appleton. The electron microscopical and physical characteristics of small round human fecal viruses: an interim scheme for classification // J. Med. Virol. 1982. - V. 9(4). - P. 257-265.

28. Cook S.M., Glass R.I., LeBaron C.W., Ho M.S. Сезонность ротавирусных инфекций в мире // Бюл. ВОЗ. 1990. - Т. 68. - С. 24-29.

29. Cruz J.R., Bartlett A.V., Herrmann J.E., Cáceres P., Blacklow N.R., Cano F. Astrovirus-associated diarrhea among Guatemalan ambulatory rural children // J. Clin. Microbiol. 1992. - V. 30(5). - P. 1140-1144.

30. Dalton R.M., Pastrana E.P., Sánchez-Fauquier A. Vaccinia virus recombinant expressing an 87-kilodalton polyprotein that is sufficient to form astrovirus-like particles // J. Virol. 2003. - V. 77(16). - P. 90949098.

31. Donelli G., Superti F., Tinari A., Marziano M.L. Mechanism of astrovirus entry into Graham 293 cells // J. Med. Virol. 1992. - V. 38(4). - P. 271277.

32. Drummond A.J., Rambaut A. BEAST: Bayesian evolutionary analysis by sampling trees // BMC Evolutionary Biology. 2007. - V. 7. - P. 214.

33. Duffy S., Shackelton L.A., Holmes E.C. Rates of evolutionary change in viruses: patterns and determinants // Nat. Rev. Genet. 2008. - V. 9(4). - P. 267-276.

34. Egglestone S.I., Caul E.O., Yipond I.B., Darville J.M. Absence of human astrovirus RNA in sewage and environmental samples // J. Appl. Microbiol. 1999. - V. 86(4). - P. 709-714.

35. Englund L., Chriel M., Dietz H.H., Hedlund K.O. Astrovirus epidemiologically linked to pre-weaning diarrhoea in mink // Vet. Microbiol. -2002. V. 85(1).-P. 1-11.

36. Gallei A., Pankraz A., Thiel H.J., Becher P. RNA recombination in vivo in the absence of viral replication // J. Virol. 2004. - V. 78. - P. 6271-6281.

37. Geigenmuller U., Chew T., Ginzton N., Matsui S.M. Processing of nonstructural protein la of human astrovirus // J. Virol. 2002a. - V. 76(4). -P. 2003-2008. .

38. Geigenmuller U., Ginzton N.H., Matsui S.M. Construction of a genome-length cDNA clone for human astrovirus serotype 1 and synthesis of infectious RNA transcripts // J. Virol. 1997. -V 71(2). - P. 1713-1717.

39. Geigenmuller U., Ginzton N.H., Matsui S.M. Studies on intracellular processing of the capsid protein of human astrovirus serotype 1 in infected cells // J. Gen. Virol. 2002b. - V. 83(Pt 7). - P. 1691-1695.

40. Geigenmuller U., Mendez E., Matsui S.M. Studies on the molecular biology of human astroviruses // Perspectives in Medical Virology, ed. Desselberger U. and Gray J.J // Elsevier, Amsterdam 2003. - P. 573-586.

41. Giedroc D.P., Theimer C.A., Nixon P.L. Structure, stability and function of RNA pseudoknots involved in stimulating ribosomal frameshifiting // J. Mol. Biol.-2000.-V. 298(2).-P. 167-185.

42. Giordano M.O., Martinez L.C., Isa M.B., Paez Rearte M., Nates S.V. Childhood astrovirus-associated diarrhea in the ambulatory setting in a Public Hospital in Cordoba city, Argentina // Rev. Inst. Med. Trop. Sao Paulo. 2004. - V. 46(2). - P. 93-96.

43. Gough R.E., Collins M.S., Borland E., Keymer L.F. Astroviras-like particles associated with hepatitis in ducklings // Vet. Rec. 1984. - V. 114(11).-P. 279.

44. Green K.Y., Ando T., Balayan M.S., Berke T., Clarke I.N., Estes M.K., Matson D.O., Nakata S., Neill J.D., Studdert M.J., Thiel H.J. Taxonomy of the caliciviruses // J. Infect. Dis. 2000. - V. 181. - P. 322-330.

45. Grimm A.C., Cashdollar J.L., Williams F.P., Fout G.S. Development of an astrovirus RT-PCR detection assay for use with conventional, real-time, and integrated cell culture/RT-PCR // Can. J. Microbiol. 2004. - V. 50(4). -P. 269-278.

46. Guix S., Bosch A., Ribes E., Dora Martínez L., Pintó R.M. Apoptosis in astrovirus-infected CaCo-2 cells // Virology. 2004a. - V. 319(2). - P. 249-261.

47. Guix S., Caballero S., Bosch A., Pintó R.M. C-terminal nsPla protein of human astrovirus colocalizes with the endoplasmic reticulum and viral RNA // J. Virol. 2004b. - V. 78(24). - P. 13627-13636.

48. Guix S., Caballero S., Bosch A., Pintó R.M. Human astrovirus C-terminal nsPla protein is involved in RNA replication // Virology. 2005. - V. 333(1).-P. 124-131.

49. Guix S., Caballero S., Villena C., Bartolomé R., Latorre C., Rabella N., Simo M., Bosch A., Pinto M. Molecular epidemiology of astrovirusinfection in Barcelona, Spain. // J.Clin. Microbiol. 2002. - V. 40. - P. 133139.

50. Guo L., Gonzalez R., Wang W., Li Y., Paranhos-Baccala G., Vernet G., Wang J. Complete genome sequence of human astrovirus genotype 6 // Virol. J. -2010a. -http://www.virologyj.eom/content/7/l/29.

51. Guo L, Xu X, Song J, Wang W, Wang J, Hung T. Molecular characterization of astrovirus infection in children with diarrhea in Beijing, 2005-2007 // J. Med. Virol. 2010b. - V. 82(3). - P. 415-423.

52. Herrmann J.E., Hudson R.W., Perron-Henry D.M., Kurtz J.B., Blacklow N.R. Antigenic characterization of cell-cultivated astrovirus serotypes and development of astrovirus-specific monoclonal antibodies // J. Infect. Dis. -1988.-V. 158(1).-P. 182-185.

53. Herrmann J.E., Nowak N.A., Perron-Henry D.M., Hudson R.W., Cubitt W.D., Blacklow N.R. Diagnosis of astrovirus gastroenteritis by antigen detection with monoclonal antibodies // J. Infect. Dis. 1990. - V. 161. - P. 226-229.

54. Hoshino Y., Zimmer J.F., Moise N.S., Scott F.W. Detection of astroviruses in faeces of a cat with diarrhoea // Arch. Virol. 1981. - V. 70. - P. 373376.

55. Huelsenbeck J.P., Rannala B. Maximum likelihood estimation of phylogeny using stratigraphic data // Paleobiol. 1997. - V. 23. - P. 174-180.

56. Jeong A.Y., Jeong H.S., Jo M.Y., Jung S.Y., Lee M.S., Lee J.S., Jee Y.M., Kim J.H., Cheon D.S. Molecular epidemiology and genetic diversity of human astrovirus in South Korea from 2002 to 2007 // Clin. Microbiol. Infect. -2011,-V. 17(3).-P. 404-408.

57. Jenkins G.M., Rambaut A., Pybus O.G., Holmes E.C. Rates of molecular evolution in RNA viruses: a quantitative phylogenetic analysis // J. Mol. Evol. -2002. V. 54.-P. 156-165.

58. Jonassen C.M., Jonassen T.O., Grinde B. A common RNA motif in the 3' end of the genomes of astroviruses, avian infectious bronchitis virus and an equine Rhinovirus // J. Gen. Virol. 1998. - V. 79 (Pt 4). - P. 715-718.

59. Jonassen C.M., Jonassen T.T., Sveen T.M., Grinde B. Complete genomic sequences of astroviruses from sheep and turkey: comparison with related viruses // Virus.Res.-2003.- V. 91(2).-P. 195-201.

60. Khamrin P., Dey S.K., Chan-it W., Thongprachum A., Satou K., Okitsu S., Maneekarn N., Ushijima H. Evaluation of a rapid immunochromatography strip test for detection of astrovirus in stool specimens // J. Trop. Pediatr. -2010.-V. 56(2).-P. 129-131.

61. Kishino H., Hasegawa M. Evaluation of the maximum likelihood estimate of' the evolutionary tree topologies from DNA sequence data, and the branching order in hominoidea // J. Mol. Evol. 1989. - V. 29(2). - P. 170-179.

62. Kjeldsberg E., Hem A. Detection of astroviruses in gut contents of nude and normal mice // Arch. Virol. 1985. - V. 84. - P. 135-140.

63. Koci M.D. Immunity and resistance to astrovirus infection // Viral. Immunol.-2005.-V. 18(1).-P. 11-16.

64. Koci M.D., Moser L.A., Kelley L.A., Larsen D., Brown C.C., Schultz-Cherry S. Astrovirus induces diarrhea in the absence of inflammation and cell death // J. Virol. 2003. - V. 77(21). - P. 11798-11808.

65. Koci M.D., Shultz-Cherry S. Avian astroviruses // Avian Pathology. 2002. -V. 31(3).-P. 213-227.

66. Koci M.D., Seal B.S., Schultz-Cherry S. Molecular characterization of an avian astrovirus 11 J. Virol. 2000. -V. 74(13). P. 6173-6177.

67. Konno T., Suzuki H., Ishida N., Chiba R., Mochizuki K., Tsunoda A. Astrovirus-associated epidemic gastroenteritis in Japan // J. Med. Virol. -1982.-V. 9(1). — P. 11-17.

68. Koonin E.V. The phylogeny of RNA-dependent RNA polymerases of positive-strand RNA viruses // J. Gen. Virol. 1991. - V. 72 (Pt 9). - P. 2197-2206.

69. Koopmans M.P., Bijen M.H., Monroe S.S., Vinje J. Age-stratified seroprevalence of neutralizing antibodies to astrovirus types 1 to 7 in humans in The Netherlands // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1998. - V. 5(1). -P. 33-7.

70. Kozak M. Recognition of AUG and alternative initiator codons is augmented by G in position +4 but is not generally affected by the nucleotides in positions +5 and +6 // EMBO J. 1997. - V. 16(9). - P. 2482-2492.

71. Kosakovsky Pond S.L, Posada D., Gravenor M.B., Woelk C.H., Frost S.D. Automated Phylogenetic Detection of Recombination Using a Genetic Algorithm // Mol. Biol. Evol. 2006. - V. 23(10). - P. 1891-1901.

72. Kosakovsky Pond S.L., Frost S.D. Datamonkey: Rapid detection of selective pressure on individual sites of codon alignments // Bioinformatics. 2005. -V. 21.-P. 2531-2533.

73. Krishna N.K. Identification of structural domains involved in astrovirus capsid biology // Viral. Immunol. 2005. - V. 18(1). - P. 17-26.

74. Kurtz J.B., Lee T.W. Human astrovirus serotypes // Lancet. 1984. - V. 2. -P. 1405-1407.

75. Kurtz J.B., Lee T.W. Astroviruses: human and animal // Ciba. Found. Symp. 1987. - V. 128.-P. 92-107.

76. Kurtz J.B., Lee T.W., Craig J.W., Reed S.E. Astrovirus infection in volunteers // J. Med. Virol. 1979. - V. 3(3). - P. 221-230.

77. Lai M.M. RNA recombination in animal and plant viruses // Microbiol Rev. 1992.-V. 56.-P. 61-79.

78. Le Cann P., Ranarijaona S., Monpoeho S., Le Guyader F., Ferré V. Quantification of human astroviruses in sewage using real-time RT-PCR // Res. Microbiol. 2004. - V. 155(1). - P. 11-15.

79. Lee T.W., Kurtz J.B. Serial propagation of astrovims in tissue culture with the aid of trypsin// J. Gen. Virol. 1981. -V. 57. -P. 421-424.

80. Lew, J.F., Moe, C.L., Monroe, S.S., et al., Astrovirus and adenovirus associated with diarrhea in children in day care settings. // J. Infect. Dis. -1991.-V. 164. P. 673-678.

81. Lewis D.C., Lightfoot N.F., Cubitt W.D., Wilson S.A. Outbreaks of astrovirus type 1 and rotavirus gastroenteritis in a geriatric in-patient population // J. Hosp. Infect. 1989. - V. 14(1). - P. 9-14.

82. Lewis T.L., Matsui S.M. Astrovirus ribosomal frameshifting in an infection-transfection transient expression system // J. Virol. 1996. - V. 70(5). - P. 2869-2875.

83. Lewis T.L., Matsui S.M. Studies of the astrovirus signal that induces (-1) ribosomal frameshifting // Adv. Exp. Med. Biol. 1997. - V. 412. - P. 323330.

84. Librado P., Rozas J. DnaSP v5: A software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data // Bioinformatics. 2009. - V. 25. - P. 1451-1452.

85. Lukashov V.V., Goudsmit J. Evolutionary relationships among Astroviridae // Journal of General Virology. 2002. - V. 83. - P. 1397-1405

86. Madeley C.R. Comparison of the features of astroviruses and caliciviruses seen in samples of feces by electron microscopy // J. Infect. Dis. 1979. -V. 139(5).-P. 519-523.

87. Madeley C.R., Cosgrove B.P. 28 nm particles in faeces in infantile gastroenteritis // Lancet. 1975a. - V. 2 (7932). - P. 451-452.

88. Madeley C.R., Cosgrove B.P. Viruses in infantile gastroenteritis // Lancet. -1975b.-V. 2 (7925).-P. 124.

89. Matsui S.M., Kiang D., Ginzton N., Chew T., Geigenmüller-Gnirke U. Molecular biology of astroviruses: selected highlights // Novartis Found Symposium. 2001. - P. 219-233. - Review

90. Matsui S.M., Kim J.P., Greenberg H.B., Young L.M., Smith L.S., Lewis T.L., Herrmann J.E., Blacklow N.R., Dupuis K., Reyes G.R. Cloning and characterization of human astrovirus immunoreactive epitopes // J. Virol. -1993.-V. 67(3).-P. 1712-1715.

91. Maunula L., Kalso S., Von Bonsdorff C.H., Ponka A. Wading pool water contaminated with both noroviruses and astroviruses as the source of a gastroenteritis outbreak // Epidemiol. Infect. 2004. - V. 132(4). - P. -737743.

92. Medina S.M., Gutierrez, M.F., Liprandi, F., Ludert, J.E. Identification and type distribution of astroviruses among children with gastroenteritis in Colombia and Venezuela // J. Clin. Microbiol. 2000. - V. 38.,- P. 34813483.

93. Mendez E., Arias C. Astroviruses // Fields Virology fifth edition. 20071 -V. l.-P. 981-1000.

94. Méndez E., Fernández-Luna T., López S., Méndez-Toss M., Arias C.F. Proteolytic processing of a serotype 8 human astrovirus ORF2 polyprotein // J. Virol. 2002. - V. 76(16). - P. 7996-8002.

95. Méndez E., Salas-Ocampo E., Arias C.F. Caspases mediate processing of the capsid precursor and cell release of human astroviruses // J. Virol. -2004. V. 78(16). - P. 8601-8608.

96. Méndez E., Salas-Ocampo M.P., Munguía M.E., Arias C.F. Protein products of the open reading frames encoding nonstructural proteins of human astrovirus serotype 8 // J. Virol. 2003. - V. 77(21). - P. 1137811384.

97. Méndez-Toss M., Griffin D.D., Calva J., Contreras J.F., Puerto F.I., Mota F., Guiscafré H., Cedillo R., Muñoz O., Herrera I., López S., Arias C.F.

98. Prevalence and genetic diversity of human astroviruses in Mexican children122with symptomatic and asymptomatic infections // J. Clin. Microbiol. 2004. -V. 42(1).-P. 151-157.

99. Méndez—Toss M., Romero-Guido P., Munguía M.E., Méndez E., Arias C.F. Molecular analysis of a serotype 8 human astrovirus genome // J. Gen. Virol. 2000. - V. 81(Pt 12). - P. 2891-2897.

100. Miller W.A., Koev G. Synthesis of subgenomic RNAs by positive-strand RNA viruses // Virology. 2000. - 273(1). - P. 1-8.

101. Molberg O., Nilsen E.M., Sollid L.M., Scott H., Brandtzaeg P., Thorsby E., Lundin K.E. CD4+ T cells with specific reactivity against astrovirus isolated from normal human small intestine // Gastroenterology. 1998. - V. 114(1). -P. 115-122.

102. Monceyron C., Grinde B., Jonassen T.O. Molecular characterisation of the 3'-end of the astrovirus genome // Arch. Virol. 1997. - V. 142(4). - P. 699-706.

103. Monroe S.S. Molecular epidemiology of human astroviruses // Perspectives in Medical Virology, ed. Desselberger U. and Gray J.J // Elsevier, Amsterdam 2003. - P. 607-j616.

104. Monroe S.S., Jiang B., Stine S.E., Koopmans M., Glass R.I. Subgenomic RNA sequence of human astrovirus supports classification of Astroviridae as a new family of RNA viruses // J. Virol. 1993. - V. 67(6). - P. 36113614.

105. Monroe S.S., Stine S.E., Gorelkin L., Herrmann J.E., Blacklow N.R., Glass R.I. Temporal synthesis of proteins and RNAs during human astrovirus infection of cultured cells // J. Virol. 1991. - V. 65(2). - P. 641-648.

106. Myint S., Manley R., Cubitt D. Viruses in bathing waters // Lancet. 1994. -V. 343(8913).-P. 1640-1641.

107. Naficy A.B., Rao M.R., Holmes J.L., Abu-Elyazeed R., Savarino S.J., Wierzba T.F., Frenck R.W., Monroe S.S., Glass R.I., Clemens J.D. Astrovirus diarrhea in Egyptian children // J. Infect. Dis. 2000. - V. 182. -P. 685-690.

108. Noel J.S., Lee T.W., Kurtz J.B., Glass R.I., Monroe S.S. Typing of human astroviruses from clinical isolates by enzyme immunoassay and nucleotide sequencing//J. Clin. Microbiol. 1995. -V. 33. - P. 797-801.

109. Palombo E.A., Bishop R.F. Annual incidence, serotype distribution, and genetic diversity of human astrovirus isolates from hospitalized children in Melbourne, Australia // J. Clin. Microbiol. 1996. - V. 34. - P. 1750-1753.

110. Pang X.L, Vesikari T. Human astrovirus-associated gastroenteritis in children under 2 years of age followed prospectively during a rotavirus vaccine trial // Acta Paediatr. 1999. - V. 88. - P. 532-536.

111. Pinto R.M., Villena C., Le Guyader F., Guix S., Caballero S., Pommepuy M., Bosch A. Astrovirus detection in wastewater samples // Water Sci. Technol. 2001. - V. 43(12). - P. 73-76.

112. Pusch D., Oh D.Y., Wolf S., Dumke R., Schroter-Bobsin U., Hohne M., Roske I., Schreier E. Detection of enteric viruses and bacterial indicators in German environmental waters // Arch. Virol. 2005. - V. 150(5). - P. 929947.

113. Reynolds D.L., Saif Y.M. Astrovirus: A cause of an enteric disease in turkey poults // Avian Dis. 1986. - V. 30. - P. 728-735.

114. Risco C., Carrascosa J.L., Pedregosa A.M., Humphrey C.D., Sanchez-Fauquier A. Ultrastmcture of human astrovirus serotype 2 // J. Gen. Virol. -1995. V. 76(Pt8). - P.2075-2080.

115. Romalde J.L., Ribao C., Luz Vilarino M., Barja J.L. Comparison of different primer sets for the RT-PCR detection of hepatitis A virus and astrovirus in mussel tissues // Water Sci. Technol. 2004. - V. 50(1). P. 131-136.

116. Schultz-Cherry S., King D.J., Koci M.D. Inactivation of an astrovirus associated with poult enteritis mortality syndrome // Avian. Dis. 2001. -V. 45(1).-P. 76-82.

117. Sebire N.J., Malone M., Shah N., Anderson G., Gaspar H.B., Cubitt W.D. Pathology of astrovirus associated diarrhoea in a paediatric bone marrow transplant recipient // J. Clin. Pathol. 2004. - V. 57(9). - P. 1001-1003.

118. Singh P.B., Sreenivasan M.A., Pavri K.M. Viruses in acute gastroenteritis in children in Pune, India // Epidemiol. Infect. 1989. - V. 102(2). - P. 345353.

119. Snodgrass D.R., Angus K.W., Gray E.W., Menzies J.D., Paul G. Pathogenesis of diarrhea caused by astrovirus infections in lambs // Arch. Virol. 1979. - V. 60. P. 217-226.

120. Snodgrass D.R., Gray E.W. Detection and transmission of 30 nm virus particles (astroviruses) in faeces of lambs with diarrhoea // Arch. Virol. -1977.-V. 55.-P. 287-291.

121. Suzuki H., Sakai T., Tanabe N., Okabe N. Peak rotavirus activity shifted from winter to early spring in Japan // Pediatr. Infect. Dis. J. 2005. - V. 24 -P. 257-260.

122. Sugiura N. Further analysis of the data by Akaike's information criterion and the finite corrections // Commun Stat. Theory Meth. 1978. - V. A7. - P. 13-26.

123. Taylor M.B., Cox N., Vrey M.A., Grabow W.O. The occurrence of hepatitis A and astroviruses in selected river and dam waters in South Africa // Water Res. 2001a. - V. 35(11). - P. 2653-2660.

124. Taylor M.B., Walter J., Berke T., Cubitt W.D., Mitchell D.K., Matson D.O. Characterisation of a South African human astrovirus as type 8 by antigenic and genetic analyses // J. Med. Virol. 2001b. - V. 64(3). - P. 256-61.

125. Thouvenelle M.L., Haynes J.S., Reynolds D.L. Astrovirus infection in hatchling turkeys: histologic, morphometric, and ultrastructural findings // Avian. Dis. 1995. - V. 39(2). - P. 328-336.

126. Turcios R.M., Curns A.T., Holman R.C. et al. Temporal and geographic trends of rotavirus activity in the United States, 1997-2004 // Pediatr. Infect. Dis. J. 2006. - V. 25 (5). - P. 451-454.

127. Tzipori S., Menzies J.D., Gray E.W. Detection of astroviruses in the faeces of red deer//Vet. Rec. 1981.-V. 108.-P. 286.

128. Van de Perre P. Transfer of antibody via mother's milk // Vaccine. 2003. -V. 21 (24).-P. 3374-3376.

129. Walter J.E., Mitchell D.K. Astrovirus infection in children // Curr. Opin. Infect. Dis. 2003. - V. 16(3). - P. 247-253.

130. Wang Q.H., Kakizawa J., Wen L.Y., Shimizu M., Nishio O., Fang Z.Y., Ushijima H. Genetic analysis of the capsid region of astroviruses // J. Med. Virol. 2001. - V. 64(3). - P. 245-255.

131. Willcocks M.M., Ashton N., Kurtz J.B., Cubitt W.D., Carter M.J. Cell culture adaptation of astrovirus involves a deletion // J. Virol. 1994b. - V. 68(9).-P. 6057-6058.

132. Willcocks M.M., Boxall A.S., Carter M.J. Processing and intracellular location of human astrovirus non-structural proteins // J. Gen. Virol. 1999. - V. 80 (Pt 10). - P. 2607-2611.

133. Willcocks M.M., Brown T.D.K., Madeley C.R., Carter M.J. The complete sequence of a human astrovirus // J. Gen. Virol. 1994a. - V. 75. - P. 17851788.

134. Willcocks M.M., Carter M.J. Identification and sequence determination of the capsid protein gene of human astrovirus serotype 1 // FEMS Microbiol. Lett. 1993. - V. 114(1). - P. 1-7.

135. Willcocks M.M., Carter M.J., Laidler F.R., Madeley C.R. Growth and characterization of human faecal astrovirus in a continuous cell line // Arch. Virol. 1990.-V. 113(1-2).-P. 73-81.

136. Williams F.P. Astrovirus-like, coronavirus—like and parvovirus-like particles detected in the diarrheal stools of beagle pups // Arch. Virol. -1980.-V. 66.-P. 216-226.

137. Woode G.N., Gourley N.E., Pohlenz J.F., Liebler E.M., Mathews S.L., Hutchinson M.P. Serotypes of bovine astrovirus // J. Clin. Microbiol. -1985.-V. 22(4).-P. 668-70.

138. Woode G.N., Bridger J.C. Isolation of small viruses resembling astroviruses and caliciviruses from acute enteritis of calves // J. Med. Microbiol. 1978. -V. 11.-P. 441-452.

139. Woode G.N., Pohlenz J.F., Gourley N.E., Fagerland J.A. Astrovirus and Breda virus infections of dome cell epithelium of bovine ileum // J. Clin. Microbiol. 1984. -V. 19(5). - P. 623-630.

140. Yan H., Yagyu F., Okitsu S., Nishio O., Ushijima H. Detection of norovirus (GI, Gil), Sapovirus and astrovirus in fecal samples using reverse transcription single-round multiplex PCR // J. Virol. Methods. 2003. - V. 114(1).-P. 37-44.

Информация о работе

Тикунов, Артем Юрьевич
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2011
ВАК 03.01.03

Диссертация

Молекулярно-генетическая характеристика астровирусов, циркулирующих в Новосибирске - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы