Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-филогенетическое исследование байкальского омуля Coregonus autumnalis migratorius (Georgi)

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-филогенетическое исследование байкальского омуля Coregonus autumnalis migratorius (Georgi)"

На правах рукописи УДК 597 08.575.1

СУХАНОВА ЛЮБОВЬ ВАСИЛЬЕВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ БАЙКАЛЬСКОГО ОМУЛЯ

Coregonusautumnalismigratorius(Georgi)

Генетика-03.00.15

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск-2004

Работа выполнена в лаборатории биологии рыб и водных млекопитающих Лимнологического института СО РАН, г. Иркутск.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук С.Я. Слободянюк Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Д.Ю. Щербаков Лимнологический институт СО РАН, г. Иркутск

кандидат биологических наук А.Г. Блинов

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Ведущее учреждение:

Институт Общей Генетики СО РАН, г. Москва

Защита диссертации состоится d Q^t кяЪр ff) 2004 Г. на утреннем заседании диссертационного совета по защити диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д - 003.011.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 10. Факс: (3832) 33-12-78; e-mail: dissov@bionet.nsc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН

Автореферат разослан _

ИЗ

2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

А. Д. Груздев

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Комплекс сиговых рыб бассейна оз. Байкал представляет большой интерес для исследования процессов формирования биоразнообразия уникального озера. Сиговые в Байкале освоили практически все реки и заливы, а в открытом озере глубины до 400 м., не образовав при этом большого количества видов (Черепанов, 1986). В свою очередь, байкальские сиговые, как обитатели ультра глубоководного озера, -уникальный объект для изучения закономерностей эволюции самого семейства Coregonidae, поскольку фенотипическая пластичность его наиболее полиморфных групп особенно ярко проявляется в условиях озерного обитания (Скрябин, 1979; Решетников, 1980; Bernatchez et al., 1999; Turgeon, Bernatchez, 2003).

Исследования байкальских сиговых рыб имеют более чем 200-летнюю историю. Прошедшие пол века детально изучалась их морфо-экологическая дифференциация в Байкале (Крогиус, 1933; Мишарин, 1953; Скрябин, 1969, 1979; Смирнов, Шумилов, 1974; и др.). В последние 15-20 лет активно проводятся генетические работы (Мамонтов, Яхненко, 1987; Слободянкж и др., 1993; Brzuzan et al., 1998; Politov et al., 2000, 2002, 2004; и др.). Вместе с тем, целостной картины об эволюции байкальских сиговых не составлено, т.е., до сих пор нет единого мнения относительно путей, времени появления сиговых рыб в озере Байкал и их филогенетических взаимоотношений. Филогенетическим реконструкциям в семействе Coregonidae, основанным на морфологических различиях, мешала исключительная фенотипическая пластичность сиговых рыб (Мауг, 1963), а генетические исследования байкальских сиговых ограничивались изучением отдельных видов.

Наиболее дискутируемый вопрос, связанный с эволюционной историей байкальских сиговых рыб - вопрос о происхождении и таксономическом статусе байкальского омуля. На протяжении практически всего периода его исследований сосуществуют 2 основные гипотезы:

1 - Произошел от арктического омуля, Coregonus autumnalis (Pallas), проникнув в Байкал из окраинных морей Северного Ледовитого океана по системе рек в межледниковый период (Березовский, 1927; и др.).

2 - Является эндемиком Байкала (Черешнев, 1994; Смирнов, 1997). Как и все сиговые виды рыб Восточной Сибири, байкальский омуль имел предковую форму, обитавшую в тепловодных водоемах олигоцен- миоценового возраста (Дрягин и др., 1969; Мац, Покатилов, 1976; Лут, 1978; Попова и др., 1989).

В данном исследовании осуществлены молекулярно-филогенетические реконструкции, объединившие всех байкальских сиговых, их ближайших родственников из соседствующих с Байкалом водоемов и других представителей семейства Coregonidae. Такой подход позволил сделать выводы о происхождении и родственных связях как байкальского омуля, так и сиговых рыб Байкала в целом (Sukhanova et al., 2000,2002,2004а, b).

ЮС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА СПггс О» »

Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы - изучение эволюционной истории байкальского омуля: исследование меж- и внутрипопуляционного полиморфизма и установление филогенетических взаимоотношений с представителями семейства СО^отдае. В конкретные задачи работы входило:

1. Исследование генетического полиморфизма трех наиболее многочисленных популяций байкальского омуля (селенгинской, северобайкальской и посольской) с помощью рестрикционного анализа митохондриального генома.

2. Определение нуклеотидных последовательностей контрольной области мтДНК, митохондриального гена цитохрома и первого внутреннего транскрибируемого спейсера (ГГ81) рибосомной ДНК для байкальского омуля, а также некоторых представителей семейства Coгegonidae, обитающих в оз. Байкал и за его пределами.

3. Обработка полученных последовательностей, изучение вариабельности последовательностей данных участков генома, построение филогенетических схем и оценка времени отделения байкальского омуля от других представителей семейства Си^ошдае.

4. Реконструкция истории расселения сиговых рыб в бассейне оз.Байкал, происхождения байкальского омуля и формирования его популяционной структуры - на основе филогенетических схем, построенных по нуклеотидным последовательностям фрагментов митохондриального и ядерного генома, и данных рестрикционного анализа.

Научная новизна работы. Впервые для исследования эволюционных взаимоотношений байкальских организмов применен молекулярно-филогенетический подход, совмещающий использование независимо наследуемых генетических маркеров, имеющих разный характер и скорость эволюции. Определение полных нуклеотидных последовательностей гена Су! Ь мтДНК, контрольной области мтДНК и ГГ81 рДНК ядерного генома у представителей сиговых разного таксономического ранга позволило подтвердить на исследуемой группе рыб закономерности эволюции данных участков генома. Впервые проведен анализ родственных связей всех байкальских сиговых с другими представителями Coгegonidae, позволивший проследить генеалогическую историю их появления в озере. Доказана принадлежность байкальского омуля к политипичному виду Соте%опш lavaтetus Ь. Впервые показаны возможные связи эволюции комплекса байкальских сиговых рыб с геологическими и климатическими событиями истории Байкала.

Научно-практическое значение. Для научно обоснованного сохранения и рационального использования природных ресурсов оз. Байкал необходимо прогнозирование характера и степени изменений его экосистемы под воздействием тех или иных факторов, что требует знания истории формирования современного биоразнообразия озера. Байкальские представители вида Coтegonus lavaтetus Ь. (озерный сиг, озерно-речной сиг -пыжьян и омуль), будучи объектами интенсивного промысла и искусственного разведения, направленного на поддержание их численности, в большей степени, чем остальные

обитатели Байкала, подвержены влиянию хозяйственной деятельности человека. Исследование истории формирования сложившихся в озере взаимоотношений между экологическими формами вида - один из необходимых этапов на пути разработки методов генетического мониторинга байкальских сиговых рыб.

Апробация работы и публикации. Результаты работы представлены: на Международной конференции: "Байкал - природная лаборатория для исследования изменений окружающей среды и климата" в г.Иркутске (Май 11-17, 1994г.); на VI, VII и VIII Международных симпозиумах: "Биология и использование сиговых рыб" (Констанца, Германия, 1996 г.; Энн Арбор, Америка, 1999 г.; Рованиеми, Финляндия, 2002 г.); на Международной конференции "Биоразнообразие и динамика экосистем Северной Евразии", 21-28 августа 2000 г., Новосибирск, Россия; Ежегодной конференции Экологического общества Японии, 2001 г., Кумамото; на Международном семинаре "Байкал и Хубсугул, проект - бурение" в г. Улан-Батор, Монголия, 2002 г.; на 3-ем Международном совещании: "Видообразование в древних озерах мира" (SIAL) Иркутск, Россия 2002. По результатам работы опубликовано 14 печатных работ (четыре из них в рецензируемых журналах).

Объем И структура диссертации. Диссертация включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, заключение, выводы, список цитируемой литературы (196 ссылок); изложена на 88 страницах машинописного текста, содержит 5 таблиц и 13 рисунков..

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Сбор образцов тканей байкальских сиговых рыб и ирландского омуля проводился сотрудниками Байкальского музея СО РАН В.В. Смирновым и Лимнологического института СО РАН Н.С. Смирновой, А. М. Мамонтовым. Ткани сиговых рыб из прибайкальских водоемов любезно предоставлены И.Б.Книжиным, А.Н. Матвеевым (Иркутский Государственный университет), А.В. Соколовым, А.И. Бобковым (Востсибрыбцентр). Ткани арктического омуля получены при содействии Н.М. Пронина (Институт общей и экспериментальной биологии, г. Улан-Удэ). Список, места сбора и систематическое положение байкальских и внебайкальских представителей сиговых рыб, для которых проводилось определение нуклеотидных последовательностей фрагментов митохондриального и ядерного геномов, а также номера последовательностей в банке данных, представлены в таблице 1 и на рисунке 1. Икра рыб посольской, селенгинской, и северобайкальской популяций байкальского омуля собрана в основных притоках озера Байкал в нерестовый период, в 1991 -1993 гг. (рис.1).

Выделение ДНК из тканей и митохондрий рыб проводили методом фенольной экстракции (Sambrook et al., 1989). Препараты интактных митохондрий для выделения мтДНК получали из гомогената икры половозрелых самок методом дифференциального центрифугирования (Jones et al.,1988).

Рис. 1. Схема расположения мест отлова сиговых рыб на территории Байкальской рифтовой зоны: 1 — 12 — расположение мест сбора сиговых рыб, ДНК которых использовалась для определения нуклеотидных последовательностей (номера соответствуют перечню рыб в таблице 1). 13 • 15 • места отлова рыб для рестрикционного анализа мтДНК популяций байкальского омуля: селенгинской, северобайкальской и посольской, соответственно. Светло-серый фон - бассейн р. Лена. Темно-серый фон - бассейн оз. Байкал.

Рестрищионный анализ мтДНК проводили десятью эндонуклеазами рестрикции:

Kpn2I, Pvu2 , Xbal, Cfr9I, Pstl, Hpal, Sfel, Ecol30I, Eco47I, Cfrl3I. Продукты рестрикции

анализировали электрофорезом в агарозном геле (Sambrook et al., 1989).

Определение нуклеотидных последовательностей фрагментов ДНК проводилось с

использованием радиоактивных изотопов, согласно Муррею (Murrey, 1989), и на

автоматическом секвенаторе ABI373A. Фрагменты ДНК для определения

последовательностей получали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Cyt Ь

мтДНК амплифицировали с использованием праймеров L 14727, L 15162, Н 15149 и Н 15915

(Irvin et al., 1991). Контрольную область мтДНК амплифицировали с помощью внешних

праймеров L«t И Htxt (Bernatchez et al., 1992) и внутренних праймеров

выбранных с

помощью программы Primer 3 (Rozen, Skaletsky, 2000). Для амплификации ITS1 рибосомной ДНК использовали набор праймеров, описанных в работе Сайдака и Филлипса (Sajdak, Phillips, 1997).

Компьютерная обработка данных рестрикционного анализа мтДНК выполнена с помощью пакетов программ RESTSIT 1.2. (Miller, 1990, 1991,1994) и ARLEQUIN (Schneider et al., 2000). Для первичного анализа нуклеотидных последовательностей и построения филогенетических схем использовались программы CLUSTAL W (version 1.7) и MEGA 2.1 (Kumar etal., 1993-2001).

Таблица 1. Список исследованных представителей сиговых рыб

Таксон Место сбора Координаты К сп-вс Дм» .Ni псспедаватвльностив банке данные EMBL

эвэ Cftb | контр область | ITS1 рДНК

Байкальский 0!*р?ль Coregoms aiiturmaln migratortus (Geoigy, 1775) Бассейн Байкала.

1. р. Баргузин 2. р. Малый Чивыркуй 53°65N/109°75 Е 53° 55' N/109° 5' Е 10 2 10/1993 10/1994 AJ251588 -II- AJ250997 -II- AJ417730

3 оз Кулинда 55° 92'N/109° 95'Е 2 10/ 1996 AJ617502 AJ617509 -

Байкальский озерный сиг С lavaretus bakalemts Dybowsh Бассейн Байкала:

4. оз Байкал 53° 60 N/109° 5 Е 2 12/1995 AJ251589 AJ250993 AJ417728

(Чивыркуйский залив)

Сиг - пыжьян, сибирский сиг С. lavaretuspidschtan (Gmdm, 1789) Бассейн Байкала

5. р. Вехняя Ангара 55° 70 N/110° 00 Е 2 09/1998 AJ25159G AJ250994 AJ417729

б. р Баргузин Бассейн Енисея 53°65 N/ 109° 75 Е 2 09/2000 -//- -//- -и-

7. р. Иркут 52° 00' N / 103° 75 Е 1 08/1998 AJ617501 AJ617510 -II-

Бассейн Лены 56° 70' N/117° 50' Е

8. оз. Леприндо 2 07/1998 AJ617499 AJ617507 -II-

9. оз. Ничатка 57° 40 N/117° 85 Е 2 07/1998 AJ617497 AJ617505 -11-

10 оз Орон 57° 50' N / 116° 25' Е 2 08/2000 AJ617498 AJ617506 -II-

11 оз Баунт 55° 87'N/112° 30" Е 2 08/2000 AJ617496 AJ617504 -II-

12 р Ичикта 56° 60'N/107°50'E 2 07/1999 AJ617500 AJ617508 -II-

Арктический омуль С aulumnala (Pallas, 1776) Море Лаптевых. дельтар Лена 73° Ю' N / 129° 40' Е 2 04/1998 AJ617503 AJ250996 AJ417731

Ирландский омуль С. pol/an Tompson, 1835 Северная Ирландия озЛохНей 54° 65'N/6° 35'W 2 10/1996 AJ251591 AJ250995 AJ417732

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Популяционная структура байкальского омуля.

Рестрикционный анализ мтДНК 165-ти особей байкальского омуля из трех наиболее многочисленных популяций, принадлежащих к различным морфо-экологическим группам,

не выявил четко выраженной популяционной структуры Для десяти ферментов рестрикции обнаружено от 44 до 48 сайтов узнавания на митохондриальный геном, что составляет, в среднем, 260 пар нуклеотидов (п н) или около 1.57% от всей последовательности мтДНК омуля

Найдено 70 независимых сайтов рестрикции, из которых 24 полиморфны. Получено 33 различных гаплотипа, один из которых преобладал во всех популяциях, 7 - общие, как минимум, для двух популяций, остальные 26 -популяционноспецифичны и встречались с низкой частотой (рис. 2). Анализ распределения гаплотипов между популяциями, проведенный с помощью модифицированного критерия Х*0 (Животовский, 1991), свидетельствует о статистической достоверности межпопуляционных различий (х2с=274,48, р<0,001), и, соответственно, о наличии независимого генетического дрейфа Однако, коэффициент Нэя (Gsi_0,023) показал, что большая доля полиморфизма мтДНК (97,7%) приходится на внутрипопуляционные различия Несмотря на существенные генетические расстояния между отдельными гаплотипами, достигающими 2,11% (что может говорить о большом возрасте байкальского омуля), средняя величина дивергенции последовательностей МТДНК ()Г) для всех 165-ти исследованных особей составила только 0,18% замен нуклеотидов на сайт. Генетические расстояния между популяциями оказались в пределах ошибки эксперимента Отсутствие четко выраженной популяционной структуры и большое количество популяционно-специфичных гаплотипов, встречающихся с низкой частотой на фоне одного доминирующего (рис. 2.), свидетельствуют о происхождении существующих ныне популяций в недавнем геологическом прошлом.

Согласно байкальской записи изменений содержания биогенного кремнезема и створок диатомовых водорослей в осадках озера Байкал, в рамках плейстоцена выделяется не менее 30 периодов похолоданий и потеплений климата (Grachev et al, 1998; Карабанов, 1999), вызванных изменениями орбитальных параметров Земли. Эти колебания, или так

Рис. 2 Диаграмма распределения частот гаплотипов мтДНК в наиболее многочисленных популяциях байкальского омуля (рестрикционный анализ)

называемые осцилляции Миланковича, имели место в миоцене и плиоцене, однако в плейстоцене их амплитуда достигла ледниковых условий (Карабанов, 1999). Образование ледников в горном обрамлении Байкала сопровождалось иссушением климата, значительным снижениям уровня озера за счет сокращения объемов речного стока (Mats, 1993) и даже исчезновением отдельных притоков. Поскольку омуль использует озеро как место нагула, а размножение, эмбриональный и личиночно-мальковый этапы развития проходят в реках, сорах и на мелководьях озера, в периоды похолоданий происходила, по-видимому, кардинальная трансформация популяционной структуры омуля, вплоть до исчезновения некоторых популяций. Каждое очередное потепление сопровождалось возрождением, но уже новой популяционной структуры. Если принять предлагаемую гипотезу, то при любом сценарии появления омуля в Байкале, т.е. независимо от продолжительности его обитания непосредственно в озере, существующие сегодня популяции могли образоваться не ранее окончания последнего похолодания. Максимум последнего похолодания в байкальской диатомовой записи датируется 11,3 - 9,5 тысячами лет назад. Тогда выявленный статистический сдвиг частот гашютипов мтДНК может быть следствием эффекта "выборки" и дальнейшего относительно независимого генетического дрейфа при возникновении популяций. Такая ситуация типична для популяций, обособившихся не ранее конца плейстоцена, даже при условии их полной изоляции друг от друга (Billington and Hebert, 1991; Avis, 2000).

2. Филогенетические взаимоотношения байкальского омуля с другими представителями семейства Coregonidae.

2.1. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей

Cytb мтДНК. Сравнение полных последовательностей (1140 пар нуклеотидов - п.н.) гена Cyt Ъ (табл. 1) выявило 69 вариабельных позиций, что составляет 6% от всей проанализированной последовательности гена. 53 позиции являются филогенетически информативными. Только 2 вариабельных сайта находились в первой и второй позиции кодона, мутация в одном из которых привела к несинонимичной замене. Среднее попарное соотношение транзиции/трансверсии составило 4,6. Попарная дивергенция последовательностей варьировала от 0.1% до 4.8% замен нуклеотидов.

Контрольная область мтДНК. Полные длины последовательностей контрольной области были определены для 5-ти таксонов (табл. 1) и составили от 1080 до 1163 п.н. Неполные последовательности ДНК контрольной области (отсутствует центральная часть, длиной 390 п.н.) определены для семи представителей С. lavaretus из прибайкальских водоемов. Полиморфизм длины вызван присутствием тандемно повторяющихся последовательностей в участке, соседствующем с фенилаланиновой тРНК. Попарные значения дивергенции последовательностей близки таковым для Cyt b и варьировали в близких пределах (0.1% - 4.1%). Сходство значений дивергенции последовательностей

контрольной области и Cytb, кодирующего белок со сравнительно невысоким темпом эволюции, подтверждает низкую скорость эволюции некодирующей области мтДНК у лососевидных рыб (Shedlock et al., 1992), вызванную наличием высоко консервативных районов. В свою очередь, выявленное более низкое среднее попарное соотношение транзиции/трансверсии, чем в последовательностях гена Cytb (2,6 против 4,6, соответственно), можно объяснить наличием высоко полиморфных районов, в которых проявляется эффект насыщения по транзициям.

/71S7 рибосомной ДНК ядерного генома. Определены 12 последовательностей ITS1 (табл. 1). За исключением байкальского озерно-речного сига (пыжьяна) и пыжьяна из р. Иркут, у представителей С. lavaretus L. из Ленского и Байкальского бассейнов, а также байкальского и кулиндинского омулей, последовательности ITS1 идентичны. Среднее попарное соотношение транзиции/трансверсии оказалось в 5-10 раз ниже, чем для мтДНК, что может свидетельствовать о еще большем, чем в контрольной области мтДНК, насыщении по транзициям. Подтвержден характер полиморфизма длины ITS 1 сиговых рыб, обусловленный различным количеством копий палиндромной последовательности (Sajdak, Phillips, 1997). В генетически отдаленных парах сравниваемых таксонов (в которых значения дивергенции последовательностей мтДНК превышают 2%) скорость накопления замен в ITS1 последовательностях близка скорости полученной для митохондриальных фрагментов, что согласуется с отмеченной для ряда животных высокой скоростью эволюции некодирующих внутри- и межгенных фрагментов тандемных повторов рДНК и ее сопоставимостью с таковой для мтДНК (Presa et al., 2002). Выявленная низкая (на порядок ниже, чем в мтДНК) скорость накопления мутаций в последовательностях близких таксонов, по-видимому, объясняется гомогенизацией последовательностей вследствие согласованной эволюции тандемных повторов, резко уменьшающей внутривидовую изменчивость ядерных рДНК (Carranza et al., 1996).

2.2. Таксономический статус байкальского омуля

Для анализа родственных связей байкальского омуля построены филогенетические схемы, объединяющие полученные нами последовательности митохондриального генома (Cyt b и контрольная область) и ITS1 рДНК ядерного генома байкальского, арктического, ирландского омулей и байкальских озерного и озерно-речного сигов с известными последовательностями ДНК для небайкальских членов семейства Coregonidae (рис. 3). Филогенетические схемы строились методом максимальной экономии (МР) и методом ближайших соседей (NJ), с использованием опций как попарного, так и полного исключения недостающих данных (делеции\вставки, неопределенные нуклеотиды), и различных вариантов оценки генетических расстояний (Джукса и Кантора, 2-х параметровая модель Кимуры). Независимо от способа построения, по всем трем маркерам получены филогенетические схемы, свидетельствующие о близости байкальского омуля к байкальским формам С. lavaretus L. (и, прежде всего, к байкальскому озерному сигу) и удаленности от

арктического и ирландского омуля. Байкальский омуль вместе с байкальскими сигами кластеризуется с группой сигов с нижним ртом, а арктический и ирландский омули - с омулевидными сигами. Достоверность узлов ветвления схем А к В (рис. 3), невелика, поскольку в анализе задействованы короткие фрагменты сравнительно большого количества видов (длины консенсусной части последовательностей Cyt b и контрольной области мтДНК составили 240 п.н. и 289 п.н., соответственно). Тем не менее, положение одних и тех же таксонов относительно друг друга в схемах А и В совпадает, и согласуется с филогенетическими реконструкциями, осуществленными для семейства сиговых на основе рестрикционного анализа полного митохондриального генома (Bernatchez, 1991) и изоферментов (Bodaly et al., 1991). Причем, на схемах А и В байкальские сиги и омуль образуют монофилетичную группу внутри группы сигов с нижним ртом, которые, за исключением муксуна, С. muksun, являются представителями С. lavaretus L.

При построении филогенетических схем по фрагменту ядерного генома (рис. 3, С) анализировались полные последовательности ITSI. Полученные схемы не дают представления о родственных взаимоотношениях внутри группы сигов с нижним ртом. Это может быть связано с гомогенизацией последовательностей рДНК вследствие согласованной эволюции, которая уменьшает скорость накопления замен внутри видов (Presa et al., 2002). Вместе с тем, независимо от способа построения, схемы имеют идентичную топологию и высокую поддержку монофилетичности групп омулевидных сигов и сигов с нижним ртом.

Таким образом, результаты молекулярно-филогенетического анализа свидетельствуют, что байкальский омуль - один из представителей вида С. lavaretus L. Этот вид имеет циркумполярное распространение, считается комплексом близкородственных видов С. lavaretus complex или одним политипичным видом (Bernatchez, 1994, Атлас пресноводных рыб России, 2002; Reshetnikov, 2004), принадлежит к группе сигов с нижним положением рта, хотя у С. lavaretus L. оно может варьировать от типично нижнего до почти конечного. Обитая в водоемах с различным водообменом, различной численностью и биомассой планктона и бентоса, С. lavaretus образует многочисленные экологические формы. Это озерные, озерно-речные, речные и проходные (анадромные) сиги. В больших озерах C.lavaretus L. образует прибрежные, глубоководные и пелагические формы с различными типами питания, от типичных бентофагов, до типичных планктофагов (Решетников, 2002). В озере Байкал обитают следующие формы: 1) озерно-речной сиг (пыжьян) - прибрежный бентофаг, с нижним ртом и небольшим количеством тычинок, обитающий не глубже 30 м, нерестящийся в реках; 2) озерный сиг - глубоководный бентофаг с нижним ртом и небольшим количеством жаберных тычинок, обитающий в основном на глубинах 30-100 ми

Рис 3. Схемы филогенетических взаимоотношений байкальских сиговых с другими представителями семейства Coregonidae (NJ-деревья), построенные на основе нуклеотидных последовательностей1 А - гена цитохрома b мтДНК, В - контрольной области мтДНК, С - ITS 1 рДНК ядерного генома. Звездочками отмечены представители, последовательности которых получены автором. Остальные позаимствованы из публикаций Lockwood et al, 1993, - для A, Reist et al, 1998, - для S, Sajdak and Phillips, 1997, - для С В узлах ветвей указаны бутстреп значения (в скобках - бутстреп значения, полученные методом максимальной экономии, МР).

нерестующий в самом озере; и, наконец, омуль - анадромный сиг, пелагический плантофаг, обитающий на глубинах до 350 - 400 м. Омуль имеет конечный рот, большое количество жаберных тычинок (до 55 шт.) и пропорции тела рыбы, питающейся в пелагиали. Т.е., байкальский омуль, является той самой, считавшейся отсутствующей в Байкале (Скрябин,

1969,1977,1979), пелагической многотычинковой формой С. lavaretus L. и одним из крайних вариантов пелагических планктофагов в широком ряду фенотипического разнообразия форм вида. Его общее морфологическое сходство с арктическим омулем - результат пелагического образа жизни. Глубины Байкала сравнимы с глубинами океанов и внутренних морей. Особенности циркуляции и прозрачность его водных масс обеспечивают не только мощный градиент условий, но и их постоянство в пространстве и времени, даже в пелагиали озера (Smirnov, Smirnova-Zalumi, 2002). Осваивая продуктивные зоны пелагиали Байкала (эпипелагиаль, присклоновые придонные слои и прибрежную пелагиаль), омуль образовал в озере три морфо-экологические группы, представленные многочисленными популяциями. Более того, морфо-экологические особенности субпопуляций омуля (групп, отличающихся по времени захода на нерест в одну и ту же реку), свидетельствуют об их адаптации к тем же продуктивным зонам озера (Smirnov, 1992). Таким образом, в уникальных условиях Байкала С. lavaretus L. зашел в освоении пелагиали значительно дальше, чем это наблюдается в других водоемах. Экологическая пластичность позволила ему максимально освоить пищевые ресурсы холодноводного олиготрофного озера и достичь большой численности.

2.3. Происхождение байкальского омуля и его "байкальский" возраст

Для выявления возможных путей и оценки времени появления омуля в Байкале был проведен анализ родственных взаимоотношений байкальских сиговых с представителями вида С. lavaretus L, обитающими в соседствующих с озером Байкал водоемах (рис. 1,4). В анализе использовались фрагменты мтДНК (Cytb и контрольный район).

Построение NJ и МР филогенетических схем проводилось как отдельно по кодирующему (Cyt b) и не кодирующему (контрольный район) фрагментам мтДНК, так и по объединенным последовательностям. При этом использовались опции как попарного, так и полного исключения недостающих данных (делеции\вставки, неопределенные нуклеотиды), а при построении NJ дерева - различные варианты оценки генетических расстояний (Джукса и Кантора, 2-х параметровая модель Кимуры). Топология и значения поддержки узлов ветвления NJ и МР схем, а также длины ветвей полученных NJ схем отличались незначительно. Представители вида С. lavaretus L. со 100%-ной достоверностью образуют три равноудаленные монофилетичные группы: А - сиги бассейна р. Лена; В - байкальский озерный сиг, байкальский и кулиндинский1 омуль; С - пыжьяны бассейна оз.Байкал. Последовательность расположения этих групп относительно предкового узла Е имеет низкую поддержку (менее 50%) и короткие расстояния между узлами ветвления.

- Куливдинский омуль: 1) описан как жилая популяция байкальского омуля, обитающая в оз. Кулинда (Смирнов, Моложников, 1981), одном из группы подпрудных Верхне-Кичерских озер в пойме р. Кичера притока Байкала (рис. 6). Омуль из Байкала туда не заходит. Путь ему преграждают несколько порогов в верховьях р. Кичера; 2) является изолированным реликтом предковой формы байкальского омуля, сохранившимся здесь с того времени, когда рельеф русла р. Кичера был более пологим (Карасев, 1987). Происхождение озер ледниково-тектоническое (Базаров, 1986).

Рис 4 Схема (NJ дерево) филогенетических взаимоотношений представителей вида С lavaretus L, обитающих в водоемах Байкальской рифтовой зоны, построенная на основании объединенных нуклеотидных последовательностей мтДНК (Cyt Ь + контрольная область) Указаны бутстреп значения, как дерева, полученного методом ближайших соседей, NJ, так и методом максимальной экономии, МР (в скобках) Буквами A- D обозначены монофилетичные группы с высокой поддержкой

Сходство средних значений дивергенции между группами А, В и С и неразрешенность последовательности их ветвления в узле Е, по-видимому, свидетельствуют о непродолжительности временного интервала, в течении которого возникло обособление этих трех групп от предковой формы Исходя из известной для мтДНК лососевых скорости накопления нуклеотидных замен (0,5 - 1,0% за один млн лет, (Шедько, 1991, Smith, 1992)), продолжительность периода последующей дивергенции групп можно определить в 1,7 - 3,4 млн лет Начало дивергенции линий А, В и С, можно связать с наступлением 3,5 млн лет назад необайкальской фазы рифтогенеза (Логачев и др 1974, Mats, 1993) Именно в плиоцен-четвертичное время, в связи с прогибанием Северо-Байкальской и Верхнеангарской впадин и поднятиями хребтов, протекало формирование речной сети Северного Прибайкалья, принадлежащей бассейнам оз Байкал и р Лена, (Базаров и др, 1981) Тектонические процессы формирования рельефа и фрагментационные события, вызванные образованием ледников, могли привести к изоляции трех линий С lavaretus на территории БРЗ Исходя из известных палеоклиматических реконструкций, полученных в данной работе филогенетических схем (рис 4), и особенностей сегодняшнего распространения вида на территории БРЗ, можно предположить, что рефугиями для выделяемых линий могли служить рифтовые впадины ВРЗ (рис 5) Убежищем линии А на территории Ленского бассейна с большой вероятностью могла быть Баунтовская (Ципинская) впадина, или какие-либо из впадин, расположенных в северо-восточном направлении от нее Следует отметить, что отсутствие следов ленской линии А в Байкале и наши оценки времени ее дивергенции от двух других линий (1,7 - 3,4 млн лет) не согласуются с существующими оценками

прекращения стока вод озера через реку Лену - 0,8 - 0,4 млн. лет назад (Мац и др., 2001). Аналогичное несоответствие данных молекулярно-генетического и геологического характера наблюдается также в отношении байкальского и ленского хариуса (К«йпеп е1 а1., 2002) и байкальских бычковых рыб, что предполагает существование более продолжительной (чем 0,8 млн. лет) генетической изоляции между обитателями Байкальского и Ленского бассейнов.

Рис. 5. Схема

Байкальской рифтовой зоны (Флоренсов, 1968)

1 - рифтовые впадины;

2 - главные разломы. Цифры на схеме -крупные рифтовые впадины:

1 - Дархатская,

2 - Косогол,

3 - Тункинская,

4 - Южно-байкальская,

5 - Северо-Байкальская,

6 - Усть-Баргузинская,

7 - Баргузинская,

8 - Верхнеангарская,

9 - Цртпинская,

10 - Муйская,

11 • Чарская, 12-Токкинская.

Трудно определить наиболее вероятные места изоляции линий В и С. Такими убежищами могли быть и расположенные рядом с Байкалом рифтовые впадины (Верхнеангарская, Баргузинская, Тункинская), и бассейн Енисея, и сам Байкал. Однако, можно предположить с каких пор линии В к С обитают в Байкале совместно. Так как дивергенция внутри групп В и С связана с байкальским периодом их существования, а средние значения дивергенции составляют 0,4% нуклеотидных замен, то при скорости эволюции мтДНК 0,5-1% за один млн. лет (Шедько, 1991; Smith, 1992) "байкальский возраст" групп соответствует 0,4 - 0,8 млн. лет. Именно этим промежутком времени датируют значительное повышение уровня вод озера в результате поднятия западного плеча байкальского рифта, вызвавшего смену направления стока вод из озера с ленского на иркутное и проникновение вод Байкала в близлежащие впадины (Мац и соавт., 2001).

Эволюционный возраст линий А, В и С по отношению ко всему виду С. lavaretus L можно оценить опираясь на данные о циркумполярной филогеографической структуре распределения полиморфизма его мтДНК (Bernatchez , Dodson, 1994). Авторами проведен рестрикционный анализ полной последовательности мтДНК более 1800 образцов рыб из 95-ти популяций, представленных различными фенотипическими формами со всего ареала вида, за исключением территории Западной и Восточной Сибири. Дивергенция

последовательностей мтДНК составила 0,4 % -1,2 %. Выявлено пять основных клад мтДНК: две в Европе и три в Северной Америке. Дивергенция последовательностей между кладами Северной и Центральной Европы составила около 0,8%. В сравнении с этими результатами, можно предположить, что возраст линий А, В и С, выявленных нами на территории БРЗ, существенно старше европейских (1,7% дивергенции против 0,8%) и сопоставим с возрастом самых дивергентных линий из Северной Америки и Европы (1,7 % дивергенции против 1,2%). Следовательно, линии А, В и С, а, соответственно, и линия байкальского омуля, - одни из наиболее древних из известных на сегодня линий С. lavaretus L. Их возраст составляет 1,7 - 3,4 млн. лет.

2.4. Филогенетические взаимоотношения межу формами вида С. lavaretus L. в бассейне оз. Байкал

Молекулярно-филогенетический анализ взаимоотношений сиговых рыб бассейна Байкала показал их принадлежность к политипичному виду С. lavaretus L. Степень генетических различий между формами вида существенно варьирует (рис.4), связана с историей его расселения в бассейне озера и не соответствует принятой таксономической классификации. Так, дивергенция последовательностей мтДНК байкальского омуля и байкальского озерно-речного сига составляет около 1,8% нуклеотидных замен, байкальского и кулиндинского омулей 0.4%, байкальского омуля и озерного сига 0.1%. Т.е. значения дивергенции последовательностей Cyt b и контрольной области мтДНК байкальского омуля и байкальского озерного сига оказались меньше среднего значения полиморфизма мтДНК (7N),18%) в популяциях байкальского омуля. При этом, с филогенетически далеким озерно-речным сигом омуль легко гибридизуется, используя для размножения некоторые из тех же рек в частично перекрывающиеся сроки, а от филогенетически близкого озерного сига полностью репродуктивно изолирован, т.к. озерный сиг нерестится в озере, а омуль в его притоках (Скрябин, 1965, 1979; Мамонтов, 1988). Гибридные особи обнаружены и при проведении настоящего исследования, благодаря наличию информативных замен в последовательности 1TS1 байкальского пыжьяна. Гибриды несут мтДНК байкальского омуля и 1TS1 байкальского пыжьяна. Поскольку "байкальский возраст" пыжьяна и омуля составляет не менее 0,4 млн. лет (см. подраздел 2.3. раздела РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ), а характерной особенностью эволюции ядерных рДНК является гомогенизация последовательностей (Carranza et a!., 1996), мало вероятно, чтобы выявленные отличия ITS 1 пыжьяна сохранились в течение длительного периода его успешной гибридизации с омулем. Наиболее вероятной причиной несмешиваемости байкальских пыжьяна и омуля, по-видимому, является меньшая жизнеспособность гибридов, по сравнению с родительскими особями, адаптированными к обитанию в разных экологических нишах озера.

Выявленное в данном исследовании сходство фрагментов мтДНК байкальского омуля и байкальского озерного сига и результаты сопоставления всех имеющихся у нас (Суханова,

1996; Sukhanova et al., 2000, 2004) и в литературе (Слободянюк и др., 1996; Мамонтов, Яхненко, 1987; Mamontov, Yakhnenko, 1998; Brzuzan, 1998; Politov, 2002, 2004; Gordon et al., 2004) данных по их генетическому полиморфизму, свидетельствуют, что дивергенция между ними - недавнее событие. Можно предложить следующую гипотезу. Дивергенция между сигом и омулем в Байкале происходила многократно, параллельно процессу формирования популяционной структуры омуля (см. подраздел 1 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ). Периодические колебания климата, сопровождавшиеся значительными колебаниями уровня Байкала, вызывавшие регулярные перестройки популяционной структуры омуля, приводили к полному исчезновению озерного сига, поскольку весь его жизненный цикл приурочен к богатым пищей и хорошо прогреваемым мелководьям и заливам озера. С очередным потеплением эта форма С. lavaretus L появлялась вновь.

Что касается жилой популяции омуля оз. Кулинда, наши результаты не противоречат гипотезе о географической изоляции предковой формы байкальского омуля в озере ледниково-тектонического происхождения (Смирнов, Моложников, 1981, Карасев, 1987).

ВЫВОДЫ

1. Методом рестрикционного анализа митохондриальной ДНК исследован генетический полиморфизм селенгинской, северобайкальской и посольской популяций байкальского омуля.

2. На основании статистического и филогенетического анализа полученных данных, а также сопоставления результатов исследований с данными геолого-климатического характера, предложена гипотеза о недавнем формирования современной популяционной структуры байкальского омуля.

3. Определены нуклеотидные последовательности ITS1 рибосомной ДНК, контрольной области и гена Cyt b митохондриальной ДНК для байкальского, арктического и ирландского омулей, и представителей политипичного вида С. lavaretus L из семи водоемов Байкальской рифтовой зоны. На основании сравнительного анализа полученных последовательностей построены филогенетические схемы, отражающие эволюционные взаимоотношения исследованных таксонов.

4. Байкальский омуль Coregonus autumnalis migratorius (Georgi) не является близким родственником арктического омуля Coregonus autumnalis (Pallas). Он принадлежит к политипичному виду С. lavaretus L.. Таксономический статус байкальского омуля должен быть пересмотрен.

5. Байкальский омуль и байкальский озерно-речной сиг - одни из наиболее старых филогенетических линий С. lavaretus L. Их отделение от остальных представителей вида произошла 3.4 - 1.7 млн. лет назад на территории Байкальской рифтовой зоны и, очевидно, связано с началом необайкальской фазы рифтогенеза.

6. Сходство исследованных нуклеотидных последовательностей байкальского омуля и байкальского озерного сига свидетельствует о недавнем, в геологических масштабах

времени, отделении этих форм от общего предка, вероятно прошедшем параллельно процессу формирования современной популяционной структуры омуля.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Суханова Л.В., Смирнова Н.С., Смирнов В.В. Исследование популяций байкальского омуля Coregonus autumnalis migratorius (Georgi) методом рестрикционного анализа мтДНК // Тезисы. Байкал - природная лаборатория для исследования изменений окружающей среды и климата, Иркутск, Май 11-17,1994. Том 5. С. 96.

2. Суханова Л.В., Смирнов В.В., Смирнова-Залуми Н.С., Слободянюк С.Я, Кирильчик СВ. Исследование популяций байкальского омуля Coregonus autumnalis migratorius (Georgi) методом рестрикционного анализа митохондриальной ДНК // Вопросы ихтиологии. 1996. Т 36(3). С. 667-673.

3. Sukhanova L.V., Skulin, VA, V.V. Smirnov, N.S. Smirnova-Zalumi. Investigation of Baikal omul populations by restriction analysis of mtDNAV/ Abstract. VI International Symposium on Biology and Management ofCoregonid Fishes, Germany, Konstanz, 23-26 September, 1996

4. Суханова Л.В., Смирнов В.В., Смирнова-Залуми Н.С., Кирильчик СВ. Новые данные по рестрикционному анализу мтДНК популяций байкальского омуля Coregonus autumnalis migratorius (Georgiy/Сибирский экологический журнал. 1999. Т. 6. С. 655-658.

5. Sukhanova L.V., Smimov V.V., Smirnova-Zalumi N.S., Kirilchik S.V., Griffiths D. The taxonomic position of the Lake Baikal omul, Coregonus autumnalis migratorius (Georgi), in the family Coregonidae // Abstract. VII Symposium on Biology and Management of Coregonid Fishes, Ann Arbor, Michigan, USA, 9-12 August, 1999. P. 89.

6. Sukhanova L.V., Smirnov V.V., Smirnova-Zalumi N.S., Kirilchik S.V., The phylogenetic relationships of Lake Baikal coregonines as revealed by mitochondrial DNA d-loop analysis.// Proceeding of International Conference: Biodiversity and dynamics of ecosystems in North Eurasia, IC.G, Novosibirsk, 2000. V. 5(2). P. 199-201.

7. Smirnov V.V., Sukhanova L.V., Smirnova-Zalumi N.S., Shimizu I. Limnogenesis of Baikal rift zone and Baikal omul origin // Abstract. International workshop for the Baikal , Hovsgol drilling project in Ulan Bator. Ulan Bator, Mongolia. October 4-7,2001. P. 62.

8. Sukhanova L.V., Kirilchik S. V., Smirnov V. V., Shimizu I. Study ofthe Lake Baikal omul Coregonus autumnalis migratorius (Georgi) from DNA analysis // Abstr. of Annual meeting of Ecologycal Society of Japan, 26-31 March 2001, Kumamoto. P. 301.

9. Sukhanova L.V., Smirnov V.V., Smirnova-Zalumi N.S., Kirilchik S.V., Griffiths D., Belikov S.I. The taxonomic position of the Lake Baikal omul Coregonus autumnalis migratorius (Georgi) as revealed by sequence analysis of mtDNA Cytochrome b gene and control region // Pol. Arch. Hydrobiol. Spec.Issues Advanc. Limnol. 2002. V. 57. P. 97-106.

10. Sukhanova L.V, SmirnovV.V., Smimova-Zalumi N.S., Knizhin I.B., Matveev A.N., Sokolov A.V., Shimizu I. Evolution of the Coregonus lavaretus complex in the Baikal rift zone: A Preliminary Molecular-Biological Study //Abstr. of the Third International Symposium of the Series Speciation in Ancient lakes (SIAL-3): Ancient lakes: speciation, development in time and space, natural history. Novosibirsk: Nauka, 2002. P. 182.

11. Sukhanova L.V., Smirnov V.V., Smirnova-Zalumi N.S., Kirilchik S.V., Shimizu I. Baikal omul as a part of С lavaretus complex // Abstr. of the Third International Symposium of the Series Speciation in Ancient lakes (SIAL-3): Ancient lakes: speciation, development in time and space, natural history.-Novosibirsk: Nauka, 2002. P. 183.

12. SukhanovaL.V., SmirnovV.V., Smirnova-ZalumiN.S., KirilchikS.V., Shimizu 1. The close genetic relationship of Baikal omul, Coregonus autiimnalis migratorius (Georgi), to the C. lavaretus complex, revealed by the mtDNA survey, is confirmed using a nuclear DNA marker // Abstr. ofthe VIII International Symposium on Biology and Management of Coregonid Fishes, Rovaniemi, Finland, 26-29 August, 2002. P. 51.

13. Sukhanova L.V., SmirnovV.V., Smirnova-Zalumi N.S., Kirilchik S.V., Shimizu I. Grouping of Baikal omul Coregonus autiimnalis migratorius (Georgi) within the С lavaretus complex confirmed by using a nuclear DNA marker // Annales Zoologici Fennici. 2004. V.41(1).P.4M9.

14. Sukhanova L.V., Kirilchik S.V., Smirnov V.V. Evolution of Lake Baikal coregonid fishes as revealed by DNA analysis // Abstr. of the First Baikal International Workshop on Evolutionary Biology 'Tracing Past Environmental Changes in the Genetic diversity of Contemporary Faunas", Irkutsk, 6-11 September, 2004.

Отпечатано полиграфическим участком ИСЭМ СО РАН 664033, Иркутск, ул. Лермонтова, 130

Тираж 100 экз. Заказ № 238

119552

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Суханова, Любовь Васильевна

Содержание.

Список используемых в работе сокращений.

Введение.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Таксономический статус и происхождение байкальского омуля.

1.1.1. Краткое описание таксономии и филогении сиговых рыб.

1.1.2. Таксономический статус и происхождение байкальского омуля.

1.2. Внутривидовая структура байкальского омуля.

1.3. Выбор маркера для эволюционных исследований.

1.4. Методы построения филогенетических схем.

1.4.1. Методы генетических расстояний.

1.4.2. Метод максимальной экономии.

1.4.3. Бутстреп анализ.

1.5. Краткая геолого-климатическая история оз. Байкал.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Сбор образцов тканей сиговых рыб.

2.2. Выделение ДНК.

2.2.1. Выделение суммарной ДНК.

2.2.2. Выделение мтДНК из икры рыб.

2.3. Электрофорез ДНК в агарозных гелях.

2.4. Рестрикционный анализ мтДНК.

2.5. ПЦР- амплификация.

2.6. Прямое определение нуклеотидной последовательности амплифицированных фрагментов ДНК.

2.6.1. Определение нуклеотидной последовательности с помощью радиоактивных изотопов.

2.6.2. Определение нуклеотидной последовательности на автоматическом секвенаторе.

2.7. Обработка данных рестрикционного анализа мтДНК.

2.8. Компьютерный анализ последовательностей фрагментов ДНК.

2.8.1. Выравнивание и первичный анализ последовательностей.

2.8.2. Построение филогенетических схем.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Рестрикционный анализ мтДНК байкальского омуля.

3.2. Молекулярная филогения байкальских сиговых, основанная на нуклеотидных последовательностях фрагментов генома.

3.2.1. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей.

3.2.1.1. Cytb мтДНК.

3.2.1.2. Область контроля репликации мтДНК.

3.2.1.3. ITS1 рибосомной ДНК ядерного генома.

3.2.2. Построение и анализ филогенетических схем.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Популяционная структура байкальского омуля.

4.2. Таксономический статус байкальского омуля.

4.3. Происхождение байкальского омуля и его "байкальский" возраст.

4.4. Филогенетические взаимоотношения между сиговыми бассейна Байкала.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-филогенетическое исследование байкальского омуля Coregonus autumnalis migratorius (Georgi)"

Актуальность проблемы. Комплекс сиговых рыб бассейна оз. Байкал представляет большой интерес для исследования процессов формирования биоразнообразия уникального озера. Сиговые в Байкале освоили практически все реки и заливы, а в открытом озере глубины до 400 м., ие образовав при этом большого количества видов (Черепанов, 1986). В свою очередь, байкальские сиговые, как обитатели ультра глубоководного озера, -уникальный объект для изучения закономерностей эволюции самого семейства, поскольку фенотипическая пластичность его наиболее полиморфных групп особенно ярко проявляется в условиях озерного обитания (Скрябин, 1979, Решетников, 1980; Bernatchez et al., 1999; Turgeon and Bernatchez, 2003).

Происхождение ихтиофауны Байкала по сей день является предметом острых споров. Нет единого мнения и относительно появления в озере представителей Coregonidae. Исследования сиговых рыб Байкала имеют очень давнюю историю, со времени описания И. Георги байкальского омуля под названием Salmo migratorius (Georgi, 1775) и П. Палласом байкальского сига под названием Salmo oxyrhinchus (Pallas, 1811). В настоящее время, согласно определителю П.Г.Борисова и Н.С.Овсянникова (1964), за байкальским омулем закрепилось название Coregonus autumnalis migratorius (Georgi), а за байкальским сигом, после детальных исследований Ф.В. Крогиус (1933), названия двух его форм - байкальского озерного сига Coregonus lavaretus baicalensis Dyb. и байкальского озерно-речного сига Coregonus lavaretus pidschian Gmelin. Общепринято, что байкальские сиги произошли от пыжьяна, Coregonus lavaretus pidschian, проникшего в Байкал из рек Сибири. Расхождение на две формы, различные по морфологии и биологии, шло по пути освоения в озере разных экологических ниш (Крогиус, 1933; Скрябин, 1969, 1979). Что касается происхождения байкальского омуля, на протяжении практически всего периода его исследований сосуществовало 2 основные гипотезы:

1 - Произошел от арктического омуля Coregonus autumnalis autumnalis (Pallas) проникнув в Байкал из окраинных морей Северного Ледовитого океана по системе рек в межледниковый период (Березовский, 1927; Берг, 1932, 1948; Мухомедиаров, 1942; Nikolsky and Reshetnikov, 1970; Решетников, 1980).

2 - Является эндемиком Байкала (Черешнев, 1994; Смирнов, 1997). Как и все сиговые виды рыб Восточной Сибири, байкальский омуль имел предковую форму, обитавшую в тепловодных водоемах олигоцен- миоценового возраста (Дрягин и др., 1969; Мац, Покатилов, 1976; Лут, 1978; Попова и др., 1989; Смирнова-Залуми, 1971).

Детальные исследования экологии байкальских сиговых рыб на протяжении более чем полувека (Мухомедиаров, 1942; Мишарин, 1953, 1958; Скрябин, 1969, 1979; Краснощеков, 1981; Смирнов, Шумилов, 1974; Смирнов, 1997 и др.) позволили выстроить достаточно четкую картину их морфо-экологической дифференциации и адаптивной эволюции в Байкале и подготовили хороший фундамент для генетических исследований. Не считая отдельных работ более раннего времени (Талиев, 1941; Ушаков, 1962), генетический анализ байкальских сиговых активно проводился последние 15 лет. Большой материал о степени генетической подразделенности байкальских сиговых внутри озера накоплен В.М.Яхненко и A.M. Мамонтовым в исследованиях, в основу которых был положен изоферментный анализ (Мамонтов, Яхненко, 1987; Яхненко и др., 1992; Mamontov, Yakhnenko, 1995, 1998). Проведена первая оценка дивергенции последовательностей мтДНК байкальского и баунтовского озерных сигов (Слободянюк и др., 1993). Исследовался полиморфизм мтДНК в популяциях байкальских сиговых (Суханова, 1996, 1998; Brzuzan, 1998; Brzuzan et al., 1998). Анализом митохондриальной ДНК (мтДНК) и изоферментов была показана близость байкальского омуля к группе сигов с нижним ртом (Politov et al., 2000, 2002) и, прежде всего к виду С. lavaretus L. (Sukhanova et al., 2000; 2002; Гордон и др., 2004). В связи с этим высказывались предположения о возможном гибридном происхождении байкальского омуля (между арктическим омулем или его предковой формой с одной стороны и какой либо формой С. lavaretus L. с другой) (Politov et al., 2000, 2002). В последующем детальном филогеографическом анализе мтДНК Палеоарктических и Неоарктических пелагических сиговых Д. Политов и соавторы приходят к выводу, что байкальский омуль занимает корневое положение по отношению к комплексу омулевидных сигов, а также делают предположение о возможном базальном положении байкальского омуля по отношению ко всему роду Coregonus (Politov et al., 2004).

В данном исследовании осуществлены молекулярно-филогенетические реконструкции, объединившие всех байкальских сиговых, их ближайших родственников из соседствующих с Байкалом водоемов и других представителей семейства Coregonidae. Это позволило сделать выводы о происхождении и родственных связях как байкальского омуля, так и сиговых рыб Байкала в целом (Sukhanova et al., 2000,2002,2004а, b).

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - изучение эволюционной истории байкальского омуля: исследование меж- и внутрипопуляционного полиморфизма и установление филогенетических взаимоотношений с другими представителями семейства Coregonidae.

В конкретные задачи работы входило:

1. Исследование генетического полиморфизма трех наиболее многочисленных популяций байкальского омуля (селенгинской, северобайкальской и посольской) с помощью рестрикционного анализа митохондриального генома.

2. Определение нуклеотидных последовательностей контрольной области мтДНК, митохондриального гена цитохрома Ъ (Cytb) и первого внутреннего транскрибируемого спейсера рибосомной ДНК (ITS 1) для байкальского омуля, а также некоторых представителей семейства Coregonidae, обитающих в оз.Байкал и за его пределами.

3. Обработка полученных последовательностей, изучение вариабельности последовательностей данных участков генома, построение филогенетических схем и оценка времени дивергенции байкальского омуля от других представителей семейства Coregonidae.

4. На основе филогенетических схем, построенных по нуклеотидным последовательностям фрагментов ядерного и митохондриального геномов, и данных рестрикционного анализа, реконструкция истории расселения сиговых рыб в бассейне оз. Байкал, происхождения байкальского омуля и формирования его популяционной структуры.

Научная новизна работы. Впервые для исследования эволюционных взаимоотношений байкальских организмов применен молекулярно-филогенетический подход, совмещающий использование независимо наследуемых генетических маркеров, имеющих разный характер и скорость эволюции. Определение полных нуклеотидных последовательностей гена Cyt b мтДНК, контрольной области мтДНК и внутреннего транскрибируемого спейсера рДНК у представителей сиговых разного таксономического ранга позволило подтвердить на исследуемой группе рыб закономерности эволюции данных участков генома. Впервые проведен анализ родственных связей всех байкальских сиговых с другими представителями Coregonidae, позволивший проследить генеалогическую историю их появления в озере. Доказана принадлежность байкальского омуля к полиморфному виду Coregonus lavaretus L. Впервые показаны возможные связи эволюции комплекса байкальских сиговых с конкретными геологическими и климатическими событиями истории Байкала.

Научно-практическое значение. Для научно обоснованного сохранения и рационального использования природных ресурсов оз. Байкал необходимо прогнозирование характера и степени изменений его экосистемы под воздействием тех или иных факторов, что требует знания истории формирования современного биоразнообразия озера. Байкальские представители вида Coregonus lavaretus L. (озерный сиг, озерно-речной сиг и омуль), являются важным компонентом экосистемы озера. Будучи объектами интенсивного промысла и искусственного разведения, направленного на поддержание их численности, сиговые рыбы в большей степени, чем остальные обитатели Байкала подвержены влиянию хозяйственной деятельности человека. Исследование истории формирования сложившихся в озере взаимоотношений между экологическими формами вида - один из необходимых этапов на пути разработки методов генетического мониторинга байкальских сиговых рыб.

Апробация работы. Результаты работы представлялись: на международной конференции: "Байкал - природная лаборатория для исследования» изменений окружающей среды и климата" в г. Иркутске (Май 11-17, 1994 г.); на VI, VII и VIII международных симпозиумах: "Биология и использование сиговых рыб" в г. Констанца, Германия (1996 г. 23-26 сентября), в г.Энн Арбор, Америка (9-12 августа, 1999 г.), в г. Рованиеми, Финляндия (26-29 августа, 2002г.); на международной конференции "Биоразнообразие и динамика экосистем Северной Евразии", 21-28 августа 2000 г. в г. Новосибирске, Россия; Ежегодной конференции Экологического общества Японии, 26-31 марта 2001, Кумам ото; на международном семинаре "Байкал и Хубсугул, проект - бурение" в г. Улан-Батор, Монголия 2002 г.; на 3-ем международном совещании: "Видообразование в древних озерах мира" (SIAL) Иркутск, Россия 2002 г.

Публикации. По результатам работы опубликовано 14 печатных работ, в том числе четыре публикации в рецензируемых журналах.

1. Суханова Л.В., Смирнова H.C., Смирнов В.В. Исследование популяций байкальского омуля Coregonus autumnalis migratorius (Georgi) методом рестрикционного анализа мтДНК // Тезисы. Байкал - природная лаборатория для исследования изменений окружающей среды и климата, Иркутск, Май 11-17, 1994. Том 5. С. 96.

2. Суханова Л.В., Смирнов В.В., Смирнова-Залуми Н.С., Слободянюк С.Я, Кирильчик С.В. Исследование популяций байкальского омуля Coregonus autumnalis migratorius (Georgi) методом рестрикционного анализа митохондриальной ДНК // Вопросы ихтиологии. 1996. Т 36(3). С. 667-673.

3. Sukhanova L.V., Skulin, V.A., V.V. Smirnov, N.S. Smirnova-Zalumi. Investigation of Baikal omul populations by restriction analysis of mtDNA.// Abstract. VI International Symposium on Biology and Management of Coregonid Fishes, Germany, Konstanz, 23-26 September, 1996

4. Суханова Л.В., Смирнов В.В., Смирнова-Залуми Н.С., Кирильчик С.В. Новые данные по рестрикционному анализу мтДНК популяций байкальского омуля Coregonus autumnalis migratorius (Georgi) // Сибирский экологический журнал. 1999, Т. 6. С. 655-658.

5. Sukhanova L.V., Smirnov V.V., Smirnova-Zalumi N.S., Kirilchik S.V., Griffiths D. The taxonomic position of the Lake Baikal omul, Coregonus autumnalis migratorius (Georgi), in the family Coregonidae // Abstract. VII Symposium on Biology and Management of Coregonid Fishes, Ann Arbor, Michigan, USA, 9-12 August, 1999. P. 89.

6. Sukhanova L.V., Smirnov V.V., Smirnova-Zalumi N.S., Kirilchik S.V., The phylogenetic relationships of Lake Baikal coregonines as revealed by mitochondrial DNA d-loop analysis.// Proceeding of International Conference: Biodiversity and dynamics of ecosystems in North Eurasia, IC,G, Novosibirsk, 2000. V. 5(2). P. 199-201.

7. Smirnov V.V., Sukhanova L.V., Smirnova-Zalumi N.S., Shimizu I. Limnogenesis of Baikal rift zone and Baikal omul origin // Abstract. International workshop for the Baikal , Hovsgol drilling project in Ulan Bator. Ulan Bator, Mongolia. October 4-7, 2001. P. 62.

8 . Sukhanova L.V., Kirilchik S.V., Smirnov V.V., Shimizu I. Study of the Lake Baikal omul Coregonus autumnalis migratorius (Georgi) from DNA analysis // Abstr. of Annual meeting of Ecologycal Society of Japan, 26-31 March 2001, Kumamoto. P. 301. 9. Sukhanova L.V., Smirnov V.V., Smirnova-Zalumi N.S., Kirilchik S.V., Griffiths D., Belikov S.I. The taxonomic position of the Lake Baikal omul Coregonus autumnalis migratorius (Georgi) as revealed by sequence analysis of mtDNA Cytochrome b gene and control region // Pol. Arch. Hydrobiol. Spec.Issues Advanc. Limnol. 2002. V. 57. P. 97-106.

10. Sukhanova L.V, Smirnov V.V., Smirnova-Zalumi N.S., Knizhin I.B., Matveev A.N., Sokolov A. V., Shimizu I. Evolution of the Coregonus lavaretus complex in the Baikal rift zone: A Preliminary Molecular-Biological Study //Abstr. of the Third International Symposium of the Series Speciation in Ancient lakes (SIAL-3): Ancient lakes: speciation, development in time and space, natural history. Novosibirsk: Nauka, 2002. P. 182.

11. Sukhanova L.V., Smirnov V.V., Smirnova-Zalumi N.S., Kirilchik S.V., Shimizu I. Baikal omul as a part of C. lavaretus complex // Abstr. of the Third International Symposium of the Series Speciation in Ancient lakes (SIAL-3): Ancient lakes: speciation, development in time and space, natural history.- Novosibirsk: Nauka, 2002. P. 183.

12. Sukhanova L.V., Smirnov V.V., Smirnova-Zalumi N.S., Kirilchik S.V., Shimizu I. The close genetic relationship of Baikal omul, Coregonus autumnalis migratorius (Georgi), to the C.lavaretus complex, revealed by the mtDNA sur\ey, is confirmed using a nuclear DNA marker // Abstr. of the VIII International Symposium on Biology and Management of Coregonid Fishes, Rovaniemi, Finland, 26-29 August, 2002. P. 51.

13. Sukhanova L.V., Smirnov V.V., Smirnova-Zalumi N.S., Kirilchik S.V., Shimizu I. Grouping of Baikal omul Coregonus autumnalis migratorius (Georgi) within the C. lavaretus complex confirmed by using a nuclear DNA marker// Annales Zoologici Fennici. 2004. V. 41(1). P. 41-49.

14. Sukhanova L.V., Kirilchik S.V., Smirnov V.V. Evolution of Lake Baikal coregonid fishes as revealed by DNA analysis // Abstr. of the First Baikal International Workshop on Evolutionary Biology "Tracing Past Environmental Changes in the Genetic diversity of Contemporary Faunas", Irkutsk, 6-11 September, 2004.

Благодарности. Автор выражает искреннюю признательность научному руководителю С.Я. Слободянюку за помощь и поддержку; сотруднику Байкальского музея СО РАН В.В. Смирнову и сотрудникам ЛИН СО РАН Н.С. Смирновой, С.В. Кирильчику за всестороннюю помощь и поддержку на всех этапах работы; A.M. Мамонтову за консультации и помощь в сборе материала; И.Б. Книжину, А.Н. Матвееву (Иркутский Госунивеситет), А.В. Соколову, А.И. Бобкову (Воссибрыбцентр, г. Улан-Уде), Н.М. Пронину (Ин-т Общей и экспериментальной биологии, г. Улан-Уде) за помощь в сборе материала; а также сотрудникам ИЦиГ (г. Новосибирск) С.А. Демакову и А.Г. Блинову за ряд ценных предложений, высказанных на этапе подготовки диссертационной работы.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Суханова, Любовь Васильевна

Выводы

1. С помощью рестрикционного анализа митохондриальной ДНК исследован генетический полиморфизм селенгинской, северобайкальской и посольской популяций байкальского омуля.

2. На основании статистического и филогенетического анализа полученных данных, а также сопоставления результатов исследований с данными геолого-климатического характера, предложена гипотеза о недавнем формировании современной популяционной структуры байкальского омуля.

3. Определены нуклеотидные последовательности ITS1 рибосомной ДНК, контрольной области и гена Cyt b митохондриальной ДНК для байкальского, арктического и ирландского омулей, и представителей политипичного вида С. lavaretus L. из семи водоемов Байкальской рифтовой зоны. На основании сравнительного анализа полученных последовательностей построены филогенетические схемы, отражающие эволюционные взаимоотношения исследованных таксонов.

4. Байкальский омуль Coregonus autumnalis migratorius (Georgi) не является близким родственником арктического омуля Coregonus autumnalis (Pallas) Он принадлежит к политипичному виду С lavaretus L. Таксономический статус байкальского омуля должен быть пересмотрен.

5. Байкальские омуль и озерно-речной сиг представляют одни из наиболее старых филогенетических линий С lavaretus L. Их дивергенция от остальных представителей вида произошло 1,7-3,4 млн. лет назад на территории Байкальской рифтовой зоны и, очевидно, связана с началом необайкальской фазы рифтогенеза.

6. Сходство исследованных нуклеотидных последовательностей байкальского омуля и байкальского озерного сига свидетельствует о недавнем, в геологических масштабах времени, отделении этих форм от общего предка, произошедшем параллельно процессу формирования современной популяционной структуры омуля.

Заключение

Проведенное в работе филогенетическое исследование показало, что байкальский омуль является одной из наиболее "старых" линий фенотипически пластичного и циркумполярно распространенного политипичного вида С. lavaretus L. Линия байкальского омуля отделилась от остальных представителей вида 3,4—1,7 млн. лет назад. Разделение произошло на территории Байкальской рифтовой зоны и, очевидно, связано с началом необайкальской фазы рифтогенеза - периода, особенно богатого различными геологическими, климатическими и экологическими изменениями.

Байкальский озерпо-речной сиг пыжьян - такая же древняя линия вида С. lavaretus L., как и линия байкальского омуля. Эти две линии прошли длительную фазу географической изоляции. Контакт их в настоящее время (нерест в одних и тех же притоках Байкала, образование гибридов) вторичен. Несмотря на наличие процесса гибридизации эти два представителя вида С. lavaretus L. остаются репродуктивно обособленными.

Вопрос о продолжительности обитания байкальского омуля непосредственно в Байкале остается открытым. Однако этот период составляет не менее 0,4-0,8 млн. лет. - время, прошедшее с момента изоляции жилой популяции кулиндинского омуля от линии байкальского омуля в подпрудных Верхне-Кичерских озерах ледниково-тектонического происхождения, расположенных в русле р. Кичеры, притока Байкала.

Несмотря на продолжительное обитание байкальского омуля в Байкале, по-видимому, существующая в настоящее время популяционная структура образовалась не ранее 11,3 - 9,5 тыс. лет назад (возраст последнего из 30-ти похолоданий в байкальской диатомовой летописи), после того, как очередной раз сформировались стабильные продуктивные зоны в пелагиали озера, речная сеть и мелководные зоны, необходимые для воспроизводства численности и биомассы омуля.

По-видимому, параллельно с формированием популяционной структуры омуля, от него дивергировал и байкальский озерный сиг. Малотычинковый бентофаг - байкальский озерный сиг, занял в озере свою пищевую нишу, практически не перекрывающуюся с нишей типичного пелагобионта, многотычинкового планктофага - байкальского омуля. Резкое отличие занимаемых экологических ниш, вероятно, и послужило основной причиной быстрого возникновения полной репродуктивной изоляции между этими байкальскими формами вида С lavaretus L.

Эволюционная история С. lavaretus L. в бассейне оз.Байкал служит еще одним примером фенотипической пластичности этого вида и сиговых рыб в целом, в полной мере проявившейся в глубоководном олиготрофном водоеме.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Суханова, Любовь Васильевна, Иркутск

1. Аннотированный каталог круглоротых и рыб континентальных вод России / Отв. ред. Ю.С. Решетников. М.: Наука, 1998.218 с.

2. Атлас пресноводных рыб России: Вып. 2. Т.1. / Отв. ред. Ю.С. Решетников. М.: Наука, 2002. 379 с.

3. Базаров Д.Б., Рязанов И.Н., Будаев Р.Ц. и др. Геоморфология Севернго Прибайкалья и Станового нагорья. М.: Наука, 1981. 197 с.

4. Базаров Д.Б. Кайнозой Прибайкалья и Западного Забайкалья. Новосибирск: Наука, 1986. 128 с.

5. Берг JI.C. Рыбы пресных вод СССР и сопредельных стран. JL: АН СССР. 1932, -Часть. 2.

6. Берг Л.С. Рыбы пресных вод СССР и сопредельных стран. М.; Л.: Изд-во АН СССР, 1948. Ч. I. 466 с.

7. Березовский А.И. К изучению байкальского омуля // Доклады АН СССР, 1927. Т. 21. С. 353 -358.

8. Борисов П.Г., Овсянников Н.С. Определитель промысловых рыб СССР. М.: Пищ. пром-сть, 1964.318 с.

9. Дрягин П.А., Пирожников П.Л., Покровский В.В. Вопросы филогении сиговых (Coregoninae) // Тезисы докл. на VIII Сессии Ученого Совета по проблеме "Биологические ресурсы Белого моря". Петрозаводск, 1969. Т.1. С. 90-92.

10. Животовский Л.А. Популяционная биометрия. М.: Наука. 1991. 271 с.