Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выявление и функциональный анализ геномных и транскриптомных различий между сигом и омулем озера Байкал

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Выявление и функциональный анализ геномных и транскриптомных различий между сигом и омулем озера Байкал"

УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

На правах рукописи

БЫЧЕНКО ОКСАНА СТАНИСЛАВОВНА

ВЫЯВЛЕНИЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ГЕНОМНЫХ И ТРАНСКРИПТОМНЫХ РАЗЛИЧИЙ МЕЖДУ СИГОМ И ОМУЛЕМ ОЗЕРА БАЙКАЛ

Специальность 03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва-2010

2 5 мдр 2010

003494261

Работа выполнена в лаборатории структуры и функций генов человека Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук Татьяна Леодоровна Ажикина Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Георгий Вячеславович Шпаковский

доктор биологических наук Дмитрий Владиславович Политов

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт биологии гена РАН

диссертационного совета Д .. Российской академии

наук Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117997, ГСП-7, г.Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая 16/10.

С текстом диссертации можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Защита состоится « 1(? »

часов на заседании

Автореферат разослан « » февраля 2010 г.

Учёный секретарь диссертационного совета доктор физ.-мат. наук

ВЛ.Олейников

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Одной из ключевых задач современной эволюционной биологии является выяснение

генетических причин и механизмов формирования биоразнообразия. Приспособляемость к различным условиям среды путём занятия доступной экологической ниши приводит к дивергенции популяций и впоследствии к образованию новых видов. Очевидно, что независимая эволюция адаптивно дивергировавших близкородственных линий одного и того же вида является следствием естественного отбора. Поскольку отбор действует в конечном итоге на генотип, выявление генов, ассоциированных с параллельными эволюционными изменениями среди популяций, существенно для идентификации кандидатных генов, вовлеченных в адаптивную фенотипическую дивергенцию. Обнаружение этих генетических изменений и их функциональная значимость являются фундаментальной проблемой молекулярной эволюционной биологии.

Среди наиболее интересных модельных организмов эволюционной биологии выделяются Сиговые (Coregonidae). Для этого рода рыб описано множество всевозможных форм, морф, популяций, экотипов и межвидовых гибридов (Попов, 2003; Решетников, 1980). В качестве объектов исследования нами была выбрана пара озйрный сиг (С. 1амагеШ5 Ьа1са1еп51я йуЬ.) и байкальский омуль (С. аиШтпаНз migratorшs Georgí). Байкальский озерный сиг (С. 1тагеЫ$ Ьа1са1епз!$ ОуЬ.) - глубоководный бентофаг, обитающий в основном на глубинах 30 -100 м и нерестующий в самом озере. Байкальский омуль (С. аШитпаЫ т^Могшв Сеог%1) -пелагический планктофаг, обитающий на глубинах до 350 - 400 м.

Байкальский омуль С. Autumnalis migratorius (С. Lavaretus)

Озёрный сиг (С. Lavaretus baicalensis Dyb.)

Долгое время по морфологическим признакам этих рыб относили к различным видам. Так, омуля считали подвидом ледовитоморского омуля С. autumnalis (Pallas) (Nikolsky et al, 1970; Решетников, 1980). Однако проведенные анализ вариабельности мтДНК и изоферментный анализ показали близость байкальского омуля к истинным сигам и, прежде всего, к виду С. lavaretus L. (Politov et al, 2000, 2002; Sukhanova et al, 2000, 2002). Последующий детальный филогеографический анализ структуры мтДНК Палеоарктических и Неоарктических

сиговых (Politov et а), 2004), а также генеалогические реконструкции байкальских сиговых (Суханова, 2004) позволили сделать окончательный вывод о принадлежности байкальского омуля к виду С. lavaretus L.. Таким образом, байкальский омуль и озёрный сиг являются ближайшими родственниками, их дивергенция от общего предка произошла всего 10-20 тыс. лет назад, по-видимому, в связи с освоением разных трофических ниш (Sukhanova et al, 2004; Скрябин, 1969,1977,1979; Решетников, 1980; Смирнов, 1974; Карасёв, 1987).

Очевидно, пара сиг - омуль хорошо подходит в качестве модели эволюционной биологии. Можно полагать, что довольно короткий срок дивергенции байкальского омуля и сига в масштабе эволюционного времени позволит выявить именно те генетические факторы, которые в данном случае играют определяющую роль при дивергенции популяций и, в конечном итоге, в видообразовании.

Цели и задачи работы

Целью настоящей работы являлось проведение поиска элементов генома (как кодирующих, так и некодирующих), различных по структуре в геномах омуля и сига, и выяснение их функциональной значимости; а также проведение сравнительного анализа транскриптомов мозга байкальских сига и омуля и выявление генов, вовлечённых в адаптивную дивергенцию исследуемых рыб.

Для достижения цели работы были поставлены следующие задачи:

- С помощью метода вычитающей гибридизации провести геномное сравнение байкальских сига и омуля. Получить и проанализировать ранжированные библиотеки дифференциальных геномных фрагментов.

- Провести количественное сравнение геномных последовательностей, транскрибирующихся в мозге байкальских сига и омуля, для чего получить библиотеки коротких репрезентативных последовательностей кДНК мозга этих рыб с использованием метода SAGE. Провести сравнительный анализ этих библиотек.

- Выявить мРНК, соответствующие количественно различающимся коротким репрезентативным последовательностям кДНК в библиотеках сига и омуля.

- Подтвердить дифференциальную экспрессию найденных мРНК методом ПЦР в режиме реального времени (RealTime PCR).

Научная новизна и практическая ценность работы

В ходе данной работы впервые было проведено геномное сравнение байкальских сига и омуля с использованием модифицированного нами метода вычитающей гибридизации. В результате, не было выявлено протяженных последовательностей, специфичных только для одного из геномов. Все найденные дифференциальные фрагменты различаются

однонуклеотидными заменами и короткими (до 35 нукл.) деления ми/инсерциям к и относятся к иекодирующим геномным участкам: интронам, микро- и мини-сателлитам, транспозоноподобным структурам. Полученные нами данные подтверждают близкое родство байкальских омуля и сига и их эволюционно недавнюю дивергенцию от общего предка.

Практическую ценность представляют полученные нуклеотидные последовательности фрагментов геномных ДНК и кДНК мозга байкальских сига и омуля, депонированные в международную базу данных GenBank. Эти последовательности могут быть использованы как при изучении непосредственно геномов этих рыб, в популяционной генетике, так и в межвидовых эволюционных исследованиях при сравнении различных видов.

Впервые нами были получены библиотеки коротких репрезентативных кДНК последовательностей (тагов) мозга байкальских сига и омуля с использованием метода Serial Analysis of Gene Expression (серийный анализ генной экспрессии). Сравнительный анализ библиотек показал количественные различия 3.9% тагов у исследуемых рыб. На основании сходства этих тагов с кДНК известных организмов, были выявлены кандидатные гены, участвующие в адаптивной дивергенции байкальских сига и омуля. Большинство из них относится к генам клеточного метаболизма, нервной и иммунной систем, белкового синтеза и регуляторным генам.

Многие дифференциальные фрагменты сига, обнаруженные нами с помощью метода вычитающей гибридизации, сходны с широко распространенными среди рыб Тс1-подобными транспозонами. Дифференциальную экспрессию транспозонов этого семейства мы обнаружили в тканях мозга исследуемых рыб. Не исключено, что высокая фенотипическая пластичность сиговых (и вообще рыб) отчасти обеспечивается активностью многочисленных транспозонных копий в их геноме, особенно при активации их в стрессовых условиях окружающей среды, например, при резком похолодании климата. Полученные нами данные еще раз подтверждают имеющееся в научной литературе мнение о важной роли мобильных элементов в эволюции геномов живых организмов.

Таким образом, результаты проведённого сравнительного анализа транскриптомов близкородственных рыб расширяют современное представление о влиянии окружающей среды на формирование фенотипов организмов. Очевидно, существует непосредственная связь между поведенческими различиями сиговых и транскриптомными вариациями в их мозге.

Структура диссертации

Диссертация изложена на //¡Глистах машинописного текста, имеет традиционную структуру и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, экспериментальной части,

изложения результатов работы и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего ^^сылки, и $ приложений.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Геномное сравнение байкальских сига и омуля 1.1. Вычитающая гибридизация

Для проведения геномного сравнения байкальских сига и омуля был выбран модифицированный нами метод вычитающей гибридизации (ВГ)- Этот метод даёт возможность находить последовательности, специфические для геномной ДНК одного организма, так

трейсер драйвер

Денатурация и совместная ренатурация

Достройка концов

ПЦР амплификация дифференциальных фрагментов

Рис. 1 Общая схема вычитающей гибридизации. Линиями показаны фрагменты геномной ДНК. Прерывистые линии - специфические последовательности трейсера. Прямоугольники -олигонуклеотидные адаптеры, на которые отжигаются праймеры при дальнейшей ПЦР амплификации отобранных специфических последовательностей.

называемого трейсера, которых нет в геномной ДНК другого организма - драйвера (рис. 1). При использовании метода вычитающей гибридизации образцы двух геномных ДНК фрагментируют с помощью рестрикционной эндонуклеазы на отрезки небольшой длины (3002000 п о.). Один из образцов (трейсер), меченный тем или иным способом (на рисунке 1 -

олигонуклеотидные адаптеры), смешивают с большим избытком другого (драйвер), ДНК сначала денатурируют, а затем ренатурируют. В ходе ренатурации цепи ДНК трейсера, идентичные драйверу, образуют с ним гибриды, в то время как уникальные трейсер-специфические последовательности гибридизуются сами на себя, образуя гомодуплексы трейсера или «мишени». Удаление гибридов и гомодуплексов «драйвер/драйвер» приводит к значительному обогащению «мишеней» в дифференциальном продукте.

Структура геномов сиговых неизвестна, однако, по аналогии с Danio rerio и Tetraodon, полногеномные последовательности которых определены [ZFIN, The Zebrafish Information Network, www.cns.fr/tetraodon], можно ожидать, что в них присутствует большое количество повторяющихся элементов, которые затрудняют как саму вычитающую гибридизацию, так и последующий анализ полученных клонов. Учитывая эти трудности, а также высокое сходство сравниваемых геномов, нами была разработана модифицированная схема вычитания, объединяющая в себе несколько различных методических идей, основанных на схеме вычитания кДНК (Diatchenko et al, 1996; Gurskaya et al, 1996) и ПДРФ вычитающей гибридизации.

Одна из проблем, возникающих при сравнении близкородственных организмов в пределах одного и того же вида, заключается в невозможности различить фрагменты двух геномов, отличающиеся небольшими инсерциями или делециями. Такие фрагменты способны гибридизоваться друг на друга, что исключает их из набора результирующих последовательностей. Для решения этой проблемы был предложен метод ПДРФ вычитающей гибридизации (Rosenberg et al, 1994) (рис.2). Фрагменты, полученные при расщеплении двух сравниваемых геномов одинаковой ресгрикционной эндонуклеазой, можно разделить на три типа: (I) фрагменты, имеющие идентичные нуклеотидные последовательности в двух геномах и т.о. имеющие одинаковые длины (фрагменты 1 и 2); (11) фрагменты одинакового эволюционного происхождения, но мутировавшие, т.е. имеющие небольшие инсерции или делеции относительно предшествующей последовательности, длины таких фрагментов будут различны (фрагменты 3, 5). Такие фрагменты могут быть легко утеряны при проведении стандартной процедуры вычитания, т.к. существует возможность их совместной гибридизации, благодаря наличию комплементарных участков. Вероятность такой гибридизации будет тем выше, чем меньше размер инсерции или делеции.

Геном 1

Геном 2

i 1 t \-rj t i i —Г

1 2 3 4 5 1 2 З1 41 42 51

Зона 1.1

Зона 2.1

Геном 1 Геном 2

ч1

4

-1 -1

—

-2 -4'

Зона 1.2

Вычитание наборов ДНК из разных зон : зона 1.1 - зона 1.2 = фрагменты 3,4 зона 1.2 - зона 1.1 = фрагмент 51 зона 2.1 - зона 2.2 = фрагмент 5 зона2.2 - зона2.1 = фрагменты 341,42

Зона 2.2

Рис. 2 Основной принцип ПДРФ вычитающей гибридизации. Геномная ДНК обозначена горизонтальными линиями. Чёрный прямоугольник - инсерция в геномной ДНК, белый прямоугольник - делеция. Стрелками указаны сайты рестрикции; точечная мутация, приводящая к возникновению дополнительного сайта рестрикции, обозначена звездочкой. Получаемые рестрикционные фрагменты пронумерованы. Электрофореграмма рестрикционных фрагментов представлена в нижней части схемы.

Также существует третий тип фрагментов (III), чьи длины различаются из-за точечных мутаций в сайте узнавания рестрикционными эндонуклеазами (фрагмент 4 на рис.2).

Параллельное электрофоретическое разделение двух наборов рестрикционных фрагментов, полученных при фрагментировании сравниваемых образцов геномных ДНК, приводит к тому, что идентичные фрагменты появляются в идентичных положениях электрофореграммы, в то время как гомологичные фрагменты, несущие инсерции или делеции, оказываются в различных частях (рис.2).

Схема ВГ, использованная нами для сравнения двух близкородственных геномов сиговых представлена на рис.3. Электрофоретическое разделение двух наборов рестрикционных фрагментов сравниваемых геномных ДНК проводили на стадии 1. Также мы применили стадию предварительной «нормализации» сравниваемых фрагментированных геномов, широко используемую в схемах вычитающей гибридизации кДНК (рис.3, стадия 2). На этой стадии происходит образование быстро ренатурирующей фракции, обогащенной

1 1 1

Rsa I рестрикция

геном трейсера геном драйвера

(сиг) , (омуль)

1. Разделение рестрикционных фрагментов на зоны в агарозном геле

Лигирование адаптеров |

к трейсеру из нижней зоны ИСШ / \ I Ш

7 \

2. Нормализация. Обогащение — — — — —

Iрейсе;::! иизкопредставленными Гибридизация с избытком

последовательностями драйвера из нижней зоны

ГТТЛ

ГТ~1

Достройка концов

3. Удаление неспецифических гетеродуплексов путём обработки продуктов гибридизации нуклеазой Mung Bean

I I........J

'"•t"..... Mung bean

TT~1

Mung bean

ПЦР амплификация

_ ГТ~1

XJ

CHZL

Экспоненциальная амплификация

Линейная амплификация

Нет амплификации

Рис. 3. Модификации метода вычитающей гибридизации. Линиями показаны фрагменты геномной ДНК. Прямоугольники - олигонуклеотидные адаптеры, на которые отжигаются праймеры при дальнейшей ПЦР амплификации отобранных специфических последовательностей. Внутренние (белые) и внешние (чёрные и серые) прямоугольники - места отжига, соответственно, внутреннего (Т7) и внешних (МоиЯяа и МоиЗгО адаптерных праймеров.

высокопредсгавленными последовательностями, в случае геномного сравнения повторяющимися элементами генома. Далее эта фракция удаляется из последующего сравнения. Тем самым, происходит обогащение трейсера низкопредставленными, в т.ч. кодирующими, последовательностями генома.

Кроме того, чтобы исключить из рассмотрения гетеродуплексы, образованные сходными фрагментами близкой длины (и находящимися после электрофоретического разделения в одном пуле), нами введена модификация, заключающаяся в обработке смеси после вычитающей гибридизации нуклеазой золотистой фасоли (Mung bean) (рис.3, стадия 3).

С учетом вышеописанных модификаций нами проведено вычитание пулов геномных фрагментов длиной до 800 п о. и получена ранжированная клонотека, обогащенная сиг-специфическими геномными последовательностями. Клоны библиотеки анализировали методом дифференциальной гибридизации с радиоактивно меченными зондами, приготовленными из продуктов вычитания «сиг-омуль» и «омуль-сиг» (рис.4). Количество дифференциально гибридизующихся клонов составило 79. Для каждого клона была определена нуклеотидная последовательность и проанализирована с использованием доступных баз данных по программе BLASTn (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) (анализ клонов приведен в табл. 1).

£

♦

фт ■ 5 i . . + w •*

* ш t « Q • * « * *

i*

..Л»*.-,*

Рис. 4. Примеры Саузерн-гибридизации библиотеки геномных фрагментов сига с радиоактивно меченными зондами, представляющими собой продукты ВГ : а -«сиг-омуль» (сиг-специфические геномные фрагменты) и б - «омуль-сиг» (омуль-специфические геномные фрагменты). Кружками показаны примеры дифференциальной гибридизации геномных фрагментов сига.

Для всех проанализированных фрагментов не было найдено существенного сходства с известными кодирующими последовательностями. Большинство дифференциально гибридизующихся клонов содержат фрагмент, идентичный на 84-88% внутреннему спейсеру гена 28S рРНК Salvelinus namaycush (clone 26А2, gb U17965.1). Среди остальных проанализированных клонов библиотеки два содержат вставку мтДНК, для 11 вставок нет существенной гомологии в банке данных, 15 гомологичны различным некодирующим участкам генов иммунной системы: Т-клеточного рецептора (TCR), IgA, МНС, а также зонадгезин-подобного гена (zlg), при этом 5 различных фрагментов картируются в интронах zlg гена, а 7 -перед первым экзоном в 5' области.

Таблица 1. Результаты сравнения геномных фрагментов сига, полученных в результате вычитания, с геномными последовательностями различных организмов.

Номер клона (accession) Сходство с аннотированными геномными последовательностями Длина участка клонированного фрагмента, идентичная геномной последовательности, %; (в скобках приведен процент сходства) Положение в геноме (локализация относительно гена)

31,20 (gs88758l, gs887582) О. mykiss, локус Igfi.A (ay872257.i) О. mykiss, район гена МНС класса 1а (ав162342.1) 100(88) 99 (87) интрон -8 т.п.о. от последнего экзона

21, 100 (gs887583, gs887584) S. salar, ген зонадгезин-подобного белка (ay785950.1) S. salar, ген CD3 гамма/дельта-А (ef421418.1) 99 (90) 98 (86) -100 т.п.о. до 1-го экзона интрон

75, 82, 86, 84,08 (gs887585 -gs887589) S. salar, ген зонадгезин-подобного белка, (ay785950.1) 5. salar, клон 249L01, TCR-альфа/дельта локус (ef467299.i) 28-97 (94-76) 94-99 (76-86) интроны интроны

30, 26, 29, 32,27 (gs887590 -gs887594) S. salar, клон 15J19 TCR-альфа/дельта локус (ef467295.1) S. salar, ген зонадгезин-подобного белка, (ay785950.1) 62 (88) 63 (86) интроны -100 т.п.о. до 1-го экзона

25 (gs887596) О. tshawytscha, ген инсулин-подобного фактора роста I (IGF-1.1), (ayi00012.1) S. salar, ген интерферона альфа 1 (IFNA1)(dq354152.1) 90 (90) 90 (88) интрон интрон

51 клон (gs887620 -gs887670) Salvelinus namaycush, клон 26А2, ген 28S рРНК (U17965.1) 23-25 (84-88) внутренний транскрибируемый спейсер, ITS

76, 14 (gs887597, gs887598) С. lavaretus, митохондриальная ДНК (ав034824.1) 48 (97) митохондриальная ДНК

11 клонов (gs887610 -gs887620) Zebrafish, различные геномные последовательности 13-24 (91-98) некодирующие участки

ACCESSION - номер депонирования нуклеотидных последовательностей в международном

банке данных ОепВапк.

Геномные ПЦР с праймерами, подобранными на найденные нуклеотидные последовательности, показали, что ни одна из проанализированных последовательностей не

является сиг-специфической, а, возможно, представляет собой ПДРФ - результат точечных мутаций в сайте узнавания рестрикционной эндонуклеазой, которой проводилось фрагментирование сравниваемых геномов.

1.2. Анализ фрагментов, найденных как дифференциальные в ВГ

Для подтверждения ПДРФ природы фрагментов, найденных как дифференциальные в ВГ, были проведены эксперименты по установлению нуклеотидной последовательности Rsal рестриктных сайтов для нескольких найденных фрагментов в геномах сравниваемых видов. Для анализа были отобраны фрагменты, которые, во-первых, расположены вблизи генов, согласно сходству с геномными райономи Danio rerio, Salmo salar, Oncorhynchus mykiss и, во-вторых, расположены в геноме рядом друг с другом, что даёт возможность быстро определить наличие между ними Rsal рестриктных сайтов. Так, например, вставки клонов № 31 и 20 обладают наибольшей идентичностью (91%) с геномным участком Oncorhynchus mykiss, находящимся между 3-м и 4-м экзонами генаIgH.A (GenBank: AY872257.I) (рис. 5-а).

В геноме Oncorhynchus mykiss сходные последовательности разделены расстоянием -570 п.о. Мы предположили, что в геномах сига и омуля соответствующие последовательности также расположены рядом и, следовательно, могут быть амплифицированы с помощью одной общей пары праймеров. Для проверки этого предположения нами была сконструирована пара праймеров 31_20 for/ 31_20 rev, дающая продукт амплификации, включающий последовательности клонов 31 и 20, а также разделяющий их геномный участок. ПЦР продукты, полученные при амплификации геномных ДНК сига и омуля с использованием этой пары праймеров, были клонированы, для нескольких клонов определена нуклеотидная последовательность. Выявлены многочисленные однонуклеотидные различия между ДНК разных клонов, в одном случае (омуль) приведшие к изменению последовательности Rsal сайтов рестрикции (GTAC изменена на АТАА). При этом первичная структура клонированных последовательностей различается не только между сигом и омулем, но и внутри одного вида. Для последовательности одного клона генома сига найдена делеция длиной 38 п о.

Мутации в сайте расщепления Rsal объясняют, почему последовательности, присутствующие в обоих видах, оказываются обогащенными при вычитании. В результате исчезновения рестрикционного сайта образуются длинные фрагменты трейсера, которые не находят подобных последовательностей среди равнодлинных фрагментов драйвера.

Oncotbynchus ittykiss, ло^ус IgH^i (AYS72257.1)

экзон 3 зкзон 4

б

Salmo salar, зонадгезин-подобный ген (AY78S9S0)

IfOOn.o.

Рис. 5. Картирование сиг-специфических последовательностей в следующих геномных локусах: а - локус IgH.A (AY872257.1) О. mykiss. б - локус зонадгезин-подобного гена (AY785950) S. salar. Серые прямоугольники - найденные дифференциальные фрагменты с соответствующими номерами клонов библиотеки, белые стрелки - подобранные к ним уникальные праймеры, черные стрелки - продукты геномных ПЦР, полученные с использованием этих праймеров.

Рис. 6. Относительное количество копий геномных фрагментов 31,20,31_20 в геноме сига по сравнению с геномом омуля, нормализованное по гену y-IFN.

Названия фрагментов приведены по оси абсцисс, относительное количество копий, определенное по результатам 12 независимых экспериментов - по оси ординат.

Различие последовательностей внутри вида в случае фрагмента 31_20 составило 3.7% для сига и 2.7% для омуля, между сигом и омулем (усреднённое) - 3.5%. Поскольку, согласно полученным нами данным, внугригеномный полиморфизм рассматриваемых организмов примерно равен различиям между ними, можно предполагать, что мы имеем дело не с аллельными вариантами, а дуплицированными локусами геномов сига и омуля. Для проверки этого предположения с геномными ДНК сига и омуля были проведены ПЦР в режиме реального времени для локуса 3120 с тремя парами праймеров (31 for/rev, 20for/rev, 31for/20rev). Для контроля количества матрицы был выбран ген y-lFN, который присутствует в одной копии у многих организмов, в том числе рыб. Поскольку нуклеотидная последовательность локуса этого гена в геномах сиговых неизвестна, праймеры для амплификации подбирали по наиболее консервативным участкам последовательности мРНК у-IFN гена (Salmo Salar) (GenBank: AJ841811). Проведенные эксперименты свидетельствуют о том, что отношение количества копий каждого из трёх фрагментов в геноме сига к количеству копий этих фрагментов в геноме омуля примерно равно единице (рис.6), то есть рассматриваемые нами фрагменты присутствуют в геномах в одинаковом числе копий, а кроме того, фрагменты 31 и 20 действительно картируются в общем геномном локусе как в геноме сига так и в геноме омуля.

Аналогично нами было исследовано ещё два геномных участка сига и омуля. Клоны № 75, 82 и 86 имеют различную степень идентичности с геномными участками 20-го интрона зонадгезин-подобного гена (GenBank: AY785950). Для анализа данного фрагмента длиной ~ 2,2 т.п.о. он был разделен на два перекрывающихся участка, которые были амплифицированы (ПЦР продукты 1200 п о. и 1500 п.о. на рис.5-б). Клоны № 21 и 100 также картировались нами в районе зонадгезин-подобного гена (GenBank: AY785950) на расстоянии примерно 100 т.п.о до 1-го экзона. Подобранная пара праймеров (21_100for и 21_100rev) позволила амплифицировать

продукты ожидаемой длины для геномов обоих видов. Все полученные ПЦР продукты были клонированы и проведено секвенирование ряда клонов. Как и в случае фрагментов № 31 и 20, описанных выше, сравнение нукпеотидных последовательностей клонов между собой и с последовательностями фрагментов, найденных как дифференциальные в вычитающей гибридизации, показало существование различий не только между организмами, но и внутри каждого из геномов. Выявлено наличие многочисленных однонуклеотидных замен, делеций (435 п.о.), измененных сайтов Rsal.

В целом, полученные нами данные свидетельствуют о малых различиях в геномах сига и омуля. Это может свидетельствовать о том, что, как предполагается в настоящее время, омуль и сиг образуют две субпопуляции одного вида. Однако, неясно, насколько далеко зашла дивергенция этих популяций, которая может идти по пути регуляторной эволюции, то есть сравнительно малых изменений в регуляторных системах организма, которые, тем не менее, обусловливают значительные различия в уровнях экспрессии генов и в тканеспецифичности их экспрессии.

Неоднократно было показано, что существует непосредственная связь между генной экспрессией в мозге и поведением особей, а вариации в нейронном транскригггоме прямо или косвенно связаны с их поведенческими различиями (Robinson et al, 2005; Aubin-Horth et al, 2007). Сравнивая наборы генов, транскрибирующихся в мозге дивергировавших недавно рыб, мы имеем возможность не только найти гены, вовлечённые в адаптивную дивергенцию, но и выявить генетическую основу поведенческих изменений, приводящих в конечном итоге к дивергенции популяций (Whitleley et al, 2008).

2. Сравнительный анализ транскрнптомов мозга сига и омуля 2.1. SAGE - серийный анализ генной экспрессии

Сравнительный анализ транскриптома мозга сиговых был проведен с использованием

метода SAGE (Velculescu et al, 1995) (рис.7). Этот метод основан на анализе вместо целых транскриптов коротких репрезентативных фрагментов (тагов) их кДНК, однозначно определяющих те транскрипты, из которых они происходят. Лигирование этих тагов в конкатамеры и последующее их секвенирование даёт возможность одновременно установить нуклеотидные последовательности многих коротких фрагментов и определить не только качественный состав транскриптома, но и количественное соотношение между отдельными его компонентами. Представленность того или иного транскрипта в общей смеси будет напрямую определять число репрезентативных фрагментов, получаемых в эксперименте. Конкатамеризация коротких репрезентативных фрагментов важна для снижения расходов и времени проведения эксперимента и позволяет осуществлять прямое сравнение

последовательностей, не прибегая, например, к гибридизации, и избегать всех искажений, связанных с использованием гибридизационных методов. Таким образом, определяя нуклеотидную последовательность лишь 3' концевых фрагментов ДНК, мы имеем возможность

рнк

сига омуля

1. Выделение РНК из

мозга сига и омуля юо(г м мм

400^" ' 1 * ■ ■

2. Связывание поли А+ РНК с магнитными шариками

3. Синтез кДНК

4. Рестрикция Rsal

5.Лигирование адаптеров А и В к рестриктным фрагментам

6. Рестрикция Mme I Образование тагов

7. .Цитирование тагов Образование дитагов

8. Амплификация дитагов

9. Конкатамеризация дитагов

Рис. 7 Схема метода SAGE (серийный анализ генной экспрессии). Линиями показаны фрагменты геномной ДНК, точки на линиях - сайт Mme I рестрикции, прерывистая линия -мРНК. Прямоугольники - олигонуклеотидные адаптеры, на которые отжигаются праймеры (чёрные стрелки) при дальнейшей ПЦР амплификации дитагов. Кругами изображены магнитные шарики с пришитыми к ним олигосГГ.

выявить все типы экспрессирующихся ро1уА РНК и составить полноразмерную картину генной транскрипции в данной ткани.

Нами получены библиотеки коротких репрезентативных последовательностей (тагов) кДНК мозга сига и омуля. Были определены нуклеотидные последовательности для 250 клонов из каждой библиотеки. Получено 1894 тага для библиотеки сига и 2670 тагов для библиотеки омуля. Для определения дифференциально экспрессирующихся генов проводили сравнение нуклеотидных последовательностей тагов между двумя библиотеками. Поскольку количество полученных тагов сравниваемых библиотек различалось, был введен поправочный коэффициент 1.41, равный отношению общего кол-ва тагов омуля (2670) к общему кол-ву тагов сига (1894). Количественное отношение содержания каждого тага в сравниваемых библиотеках вычисляли с учетом этого коэффициента:

Difc„r=(N сиг /N0My ль ) х 1.41 Где Nc„r - количество тага в библиотеке сига, a N0M>lb - количество тага в библиотеке омуля.

Например, таг структуры 5 ■ -GTACCACTAGAGCATCACTCG-3' найден 86 раз в библиотеке тагов сига и 94 раза в библиотеке тагов омуля. Отношение содержания тага в сравниваемых библиотеках рассчитывается как Dif7c„r= (86/94) х 1.41=1.29, следовательно, можно считать, что этот таг одинаково представлен в сравниваемых библиотеках.

Таблица 2. Сравнение количества одинаковых Сравнительная характеристика

тагов библиотеки сига с библиотекой тагов , , __

библиотек тагов сига и омуля

омуля.

представлена в таблице 2. В результате статистической обработки полученных данных обнаружено, что 3.9% тагов количественно различаются у сига и омуля. Последовательности этих

репрезентативных фрагментов кДНК сравнивали с известными последовательностями кДНК различных организмов, аннотированными в международных базах данных. Оказалось, что большинство тагов, встречающихся у сига в 2-3 раза чаще, чем у омуля, имеют сходство с участками генов белкового синтеза (рибосомальных белков 40S S5, S11 и 60S L7, L13a, L39, L15 и др.) и регуляторных генов (Sox9a2, Cdc23, tnfsfiipl, GRBIO, btf2p44, PRKA). А таги, встречающиеся, наоборот, у омуля в 2-3 раза чаще, чем у сига, имеют сходство в основном с участками генов метаболизма (белков АТФ синтазы (Н+ транспортера, субъединицы Ь), карбоновой ангидразы 5В, цитохрома Р450, Na/K АТФазы (а субъединицы 1с изоформы и др.). Однако четыре кДНК генов метаболизма преобладают, наоборот, у сига (цитохрома Р450 7В1, АТФ синтазы (субъединицы d), АТФазы ((3-233 субъединицы), Na/K

Di5:„r Количество тагов библиотеки сига, %

2.7-3.7 2.0

1.7-2.6 1.2

0.6-1.6 96.1

0.3 - 0.5 0.7

АТФазы (al субъединицы). А одна кДНК 60S рибосомального белка L31 (ssal-rgh-513-300, Salmo salar) сходна с тагами, преобладающими у омуля.

кДНК некоторых генов нервной и иммунной систем встречаются чаще в библиотеке сига (например, эпендимин-связанного белка, Н-2 антигена гистосовместимости II класса (у цепь), других - в библиотеке омуля (например, комплексина-1 и главного комплекса гистосовместимости). Несколько тагов, которых в библиотеке сига больше, сходны с последовательностью DTSsa4 Tel-подобного ДНК транспозона.

2.2. Поиск мРНК, соответствующих некоторым количественно различающимся тагам в библиотеках сига и омуля

В международных базах данных нет сведений о кДНК байкальских сига и омуля. Поэтому, мы отобрали несколько тагов сига для поиска соответствующих им генов (схема эксперимента представлена на рис.8). Двухцепочечную кДНК мозга сига и омуля обрабатывали рестриктазой PvuII. К полученному рестрикту лигировали супрессионные адаптеры T7NotRsa и проводили

"ААААА

.ААААА "ТТТТТ

_ААААА "ТТТТТ

Выделение мРНК из мозга сига и омуля

Синтез кДНК Рестрикция Руц11

Лигирование адаптеров

Достройка концов

ПЦР с адаптерным праймером и тагом

Клонирование

Секвенирование

Нет амплификации ЙТЛЯТ *

Рис. 8. Поиск мРНК, соответствующих отобранным тагам. Линиями показаны фрагменты кДНК. Прямоугольники - олигонуклеотидные адаптеры, на которые отжигаются праймеры при ПЦР амплификации.

два раунда ПЦР. В качестве одного из праймеров использовали внешний Т7 (для первого раунда) и внутренний NotlRsa (для второго раунда) адалтерные праймеры, а другого -олигонуклеотид, соответствующий последовательности отобранного тага. Для каждого тага были получены по несколько (1 - 2) ПЦР продуктов различной длины. Эти кДНК фрагменты были заклонированы, отсеквенированы, нуклеотидные последовательности депонированы в международный банк данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Полученные нуклеотидные последовательности сравнивались с известными кДНК различных организмов. В итоге, нуклеотидные последовательности фрагментов кДНК оказались сходны с высокой степенью идентичности (70-90%) с участками кДНК генов таких белков, как фактор роста фибробластов 12 (Danio rerio), эпендимин-связанный белок 1 (Danio rerio), Na/K АТФаза (а субъединица 1с) (Oncorhynchus mykiss) и др. (табл. 3).

Для определения уровня экспрессии найденных кДНК в мозге байкальских сига и омуля к каждому из найденных кДНК фрагментов были подобраны уникальные олигонуклеотидные праймеры, с которыми проводился ПЦР в режиме реального времени (RealTime PCR), с использованием в качестве матрицы кДНК тех особей сига и омуля, на которых был проведен SAGE (табл. 3). Результаты RealTime PCR подтвердили увеличение в 2-3 раза уровня транскрипции в мозге сига по сравнению с омулем генов белков нервной (белок, сходный с нетрин-Gl лигандом (similar to netrin-Gl ligand), эпендимин-связанный белок 1 (ependimin related protein)) и иммунной систем (рецептор фактора некроза опухоли (tumor necrosis factor receptor superfamily, member 9), а также гена фактора роста фибробластов 12 (fibroblast growth factor 12). Были подтверждены данные по сравнению библиотек тагов и для генов метаболизма NADH дегидрогеназы (NADH dehydrogenase subunit 5), уровень экспрессии которой выше у сига, и Na/K АТФазы (Na/K ATPase alpha subunit isoform lc), транскрипция которой понижена в мозге у сига по сравнению с омулем.

Таблица 3. Сравнительный анализ уровня транскрипции некоторых генов в мозге байкальских сига и омуля.

accession Сходство с мРНК известных генов, % ACCESSION мРНК известных генов QcHri SEM Qom±SEM R± SEM

1 [GenBank: GR918015] ependimin related protein 1 [Danio rerio], 79 [GenBank: NM_001002416.1] 3.7xl0'2 ±0.4x10"2 1.5x10" ±0.12x10"2 2.79±0.6

2 [GenBank: GR918016] similar to netrin-Gl ligand [Macaca mulatto], 78 [GenBank: XMOO 1090447.1] 3.9x10" ±0.9x10"4 0.89X10-4 ±0.2x104 4.12±0.8

3 [GenBank: GR918017] signal transducer/ activator of transcription Stat3 [GenBank: OMU6Q333] 8.2 x 10" ±3.1 xlO"4 29.09 x 10" ±5 xlO"4 0.33±0.05

(rbtstaü) mRNA [Oncorhynchus mykiss], 97

4 [GenBank: GR918020] fibroblast growth factor 12 [Danio rerio], 81 [GenBank: ВС 124640.1] 3.1x10"' ±0.42x10"2 1.05x10"' ±0.09x10"4 2.62±0.6

5 [GenBank: GR918021] tumor necrosis factor receptor superfamily, member 9 [Pan troglodytes], 89 [GenBank: XM_001157779.1] 0.61±0.04 0.27±0.02 2.45±0.6

6 [GenBank: GR918018] DTSsa4 Tel-like DNA transposon [Salmo salar], 86 [GenBank: EF685957.1] 4.43±0.41 1.3±0.18 3.48±0.5

7 [GenBank: GR918022] NADH dehydrogenase subunit 5 [Thymallus thymallus], 85 [GenBank: AF270855] 8.2x10"' ±0.9 xlO"2 3.5x10"' ±0.42 xlO"2 2.27±0.24

8 [GenBank: GR918019] Na/K ATPase alpha subunit isoform lc mRNA [Oncorhynchus mykiss], 97 [GenBank: AY319389.1] 0.86±0.05 2.38±0.21 0.35±0.03

Представлены усреднённые данные по 6 независимым экспериментам.

ACCESSION - номер депонирования нуклеотидных последовательностей в международном банке данных GenBank.

Q - относительное количество транскрйптов, определенное с помощью ПЦР в режиме реального времени, нормализованное по количеству транскрйптов гена GAPDH R - отношение уровня транскрипции у сига к уровню транскрипции у омуля ~Q\vf/Qomul

Чтобы доказать ортологичность амплифицируемых фрагментов кДНК, продукты RealTime PCR лигировали в вектор, клонировали и секвенировали по 10 клонов сига и омуля для нескольких фрагментов кДНК. Сравнение полученных нуклеотидных последовательностей показало их 99% сходство между собой для каждой проанализированной кДНК. Различия заключались лишь в редких однонуклеотидных заменах в отдельных клонах без нарушения рамки считывания, что может быть связано либо с ошибками ДНК полимеразы при амплификации, либо аллельными вариантами одинаковых генов.

Найденные нами различия в уровне экспрессии носят общий характер, а не являются индивидуальной особенностью сравненных методом SAGE особей. Подтверждение этому было получено методом ПЦР в режиме реального времени для 7 генов на панели кДНК мозга из 5 особей каждого вида (рис.8).

1 2 3 4 5 омуль

3_signal transducer/activator of transcription Stat3 (rbtStat3) mRNA [Oncorhynchus mykiss], 97%

0005 00045 0004 000Э5 0003 00025 0002 00015 0001 00005

Г"П I

■ I I I

ft

L 2 3 4 5 омуль

5_tumor necrosis factor receptor superfamily, member 9 [Pan troglodytes], 89%

1 2 3 4 5 омуль

7_NADH dehydrogenase sub unit 5 [Tkymalhis thymallus], 85%

1 и

Iii 1 1

ill 1

111 k i i

III В rUninñrfi

1 2 3 era 4 5 1 2 3 4 5 омуль

4_fibroblast growth factor 12 [Danio rerio], 81%

1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 омуль

6_DTSsa4 Tel-like DNA transposon [Salmo salar], 86%

1 2 3 4 5 омуль

8_ Na/K ATPase alpha subunit isoform lc niRNA [Oncorhynchus mykiss], 97 %

Рис. 8. Результаты RealTime PCR с кДНК мозга байкальских сига и омуля на примере пяти особей каждого вида.

На оси ординат показано относительное число транскриптов, нормализованное по GAPDH гену. Для каждой особи представлены усреднённые результаты по 6 независимым экспрериментам. % - сходство амплифицируемых фрагментов кДНК сига и омуля с мРНК известных генов.

2.3. Дифференциальная транскрипция Tcl-подобного транспозона DTSsa4 семейства

При сравнительном анализе транскриптома сиговых нами была найдена последовательность длиной 110 п.о., сходная на 86% с аннотированной последовательностью DTSsa4 Tcl-подобного ДНК транспозона (GenBank: EF685957.1). Анализ уровня экспрессии

этого мобильного элемента также был проведен методом ПЦР в режиме реального времени на панели кДНК мозга сигов и омулей (рис.8). Продемонстрировано, что во всех случаях уровень транскрипции Tcl-подобного транспозона в мозге сига в 2-3 раза выше, чем у омуля. Для того чтобы показать, что данные ПЦР определяются разницей в уровне транскрипции транспозона семейства DTSsa4, а не количеством его копий в сравниваемых геномах, мы провели количественную оценку содержания этого мобильного элемента в геноме методом RealTime PCR. Для нормализации содержания копий DTSsa4 транспозона в геноме был выбран ген y-lFN, который присутствует в одной копии у многих организмов, в том числе и рыб. Согласно полученным данным, количество копий Tcl-подобного транспозона в геномах сига и омуля одинаково (рис.9). Таким образом, различия в уровне экспрессии исследуемого мобильного элемента определяются только его различной транскрипционной активностью.

ПЦР продукты, полученные при амплификации кДНК сига и омуля (особи №№1 на рис.8), лигировали в вектор, клонировали и определяли нуклеотидные последовательности для 10 клонов сига и 10 клонов омуля. Все они имели высокую степень идентичности с последовательностью DTSsa4 Tcl-подобного транспозона, однако различались между собой однонуклеотидными заменами и делециями, то есть полученные нами последовательности представляют собой транскрипты разных копий этого транспозона.

С одной стороны, известно, что у рыб Tel-подобные транспозоны нередко экспрессируются, а после встраивания их в геном происходит быстрое накопление мутаций, с другой стороны, существует немало доказательств участия некодирующих РНК-мобильных элементов в регуляции экспрессии генов на разных уровнях. Действительно, картирование найденного нами фрагмента транспозона в геномах Salmo salar и Danio rerio продемонстрировало, что в ряде случаях он локализован в 5'- и 3'- областях, а также в

1000000

сиг омуль

Рис. 9. Относительное количество копий Тс1-подобных транспозонов ОТ8эа4 семейства в геномах байкальских сига и омуля. На оси

ординат показано относительное количество копий, нормализованное по гену у-интерферона (ШЫ). Представлены усреднённые результаты по 6 независимым экспериментам.

промоторных участках различных генов, таких как, например, гены гормона роста (growth hormone), белка StAR (steroidogenic acute regulatory protein), транскрипционного коактиватора Ь2 (coiled-coil transcriptional coactivator Ь2), гомеобоксного белка HoxC13bb (homeobox protein), гуанин-нуклеотид-связываюшего белка G(o) (guanine nucleotide binding protein), yb рецептора ретиноевой кислоты (retinoic acid receptor gamma b), зонадгезин-подобный ген (zonadhesin-like gene). Поскольку транскрипция этого транспозона была выявлена нами в кДНК, полученной из полиА фракции РНК, то нельзя исключить возможность его транскрипции в составе этих различных генов, и таким образом прямо или опосредованно влиять на их уровень транскрипции.

Таким образом, в данной работе мы показали, что изменение поведения особей, адаптирующихся к новым условиям окружающей среды, например, освоению новых экологических ниш, сопровождается изменениями уровня транскрипции многих важных генов нейрального транскриптома. Такая дифференциальная транскрипция генов может обуславливаться как эпигенетическими механизмами без изменения последовательности геномной ДНК, так и однонуклеотидными инсерциями и делециями в регуляторных участках генов.

Выводы

1. Методом вычитающей гибридизации впервые на геномном уровне исследованы различия близкородственных представителей байкальских сиговых рыб - озерного сига (С. lavaretus baicalensis Dybovsky) и омуля (С. autumnalis migratorius Georgi). Показано, что данным методом не обнаруживаются устойчивые межвидовые различия. Все найденные нуклеотидные последовательности соответствуют полиморфным некодирующим участкам геномов, варьирующим в результате однонуклеотидных замен и коротких делеций.

2. Проведён сравнительный анализ транскригггомов мозга байкальских сига и омуля с использованием метода SAGE. Продемонстрировано различие в уровне экспрессии в мозге для ряда генов клеточного метаболизма, нервной и иммунной систем, белкового синтеза и регуляторных генов.

3. Обнаружено повышение экспрессии Tcl-подобных транспозонов семейства DTSsa4 в мозге сига по сравнению с мозгом омуля. Картирование последовательностей этих транспозонов в геномах Salmo salar и Danio rerio показало, что в ряде случаях они локализованы в 5'- и 3'- областях, а также в промоторных участках различных генов. Вероятно, Tcl-подобные транспозоны могут влиять на активность близлежащих генов, тем самым играя важную роль в адаптивной дивергенции популяций сиговых.

4. Полученные данные геномного и транскриптомного сравнения могут свидетельствовать о высокой близости видов С. lavaretus baicalensis Dybovsky и С. autumnalis migratorius Georgi, а также об их недавней эволюционной дивергенции, сопровождающейся изменением уровня транскрипции ряда генов в мозге этих рыб.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

Быченко, О.С., Суханова, Л.В., Уколова, С.С., Скворцов, Т.А., Потапов, В.К., Ажикина, Т.Л., Свердлов, Е.Д. Геномная близость байкальского омуля и сига. // Биоорганическая химия, 2009, том 35, №1, с. 95-102.

Быченко, О.С., Суханова, Л.В., Ажикина, Т.Л., Свердлов, Е.Д. Дифференциальная экспрессия Tcl-подобных транспозонов семейства DTSsa4 в близкородственных популяциях байкальских сиговых. // Биоорганическая химия, 2009, том 35, № 6, с. 853-856.

Bychenko, O.S., Sukhanova, L.V., Azhikina, T.L. Comparison of Baikal coregonids brain transcriptomes - a way for understanding of coregonids adaptive evolution mechanisms. International Conference on Evolutionary Ecology of Fishes Diversification, Adaptation and Speciation, Berlin, Germany, 2009, Abstract book, 94.

Bychenko, O.S., Sukhanova, L.V., Azhikina, T.L. and Sverdlov, E.D. Identification and functional analysis of genomic differences between the Baikal lake white-fish and omul. 10th International Symposium on the Biology and Management of Coregonid Fishes, Winnipeg, Canada, 2008 , Abstract book, 9.

Быченко, О.С., Суханова, Л.В. и Ажикина, Т.Л. Выявление и функциональный анализ геномных различий между омулем и сигом озера Байкал. IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, 11-15 мая 2008, Новосибирск 2008, Тезисы докладов, 255.

Быченко, О.С., Суханова, Л.В., Ажикина, Т.Л. и Свердлов, Е.Д. Байкальские сиговые как объект эволюционной биологии. XX зимняя международная молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", Москва, 2008, Тезисы докладов, 38.

Bychenko, O.S., Sukhanova, L.V., Azhikina, T.L. and Sverdlov, E.D. Evolutionary relations of lake Baikal Coregonidae. Ill International Young Scientists Conference "Biodiversity. Ecology. Adaptation. Evolution." Odessa, Ukraine, 2007, Abstract book, 241.

Быченко, О.С., Суханова, Л.В., Ажикина, Т.Л. и Свердлов, Е.Д. Байкальские сиговые как объект эволюционной биологии. Международная молодежная научно-методическая конференция "Проблемы молекулярной и клеточной биологии", Томск, 2007, Тезисы докладов, 38-39.

Подписано в печать:

01.02.2010

Заказ № 3237 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Быченко, Оксана Станиславовна

Список сокращений и биологических терминов

1. Введение

2. Обзор литературы «Сиговые как объект эволюционной биологии»

2.1. Фенотипическая пластичность сиговых

2.2. Выбор маркера для эволюционных исследований

2.3. Молекулярно-филогенетические исследования сиговых

2.4. Механизмы видообразования

2.5. Дифференциальная генная транскрипция между близкородственными популяциями сиговых

2.6. Генетические основы фенотипической изменчивости

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выявление и функциональный анализ геномных и транскриптомных различий между сигом и омулем озера Байкал"

Одной из ключевых задач современной эволюционной биологии является выяснение генетических причин и механизмов формирования биоразнообразия. Приспособляемость к различным условиям среды путём занятия доступной экологической ниши приводит к дивергенции популяций и впоследствии к образованию новых видов. Очевидно, что независимая эволюция адаптивно дивергировавших близкородственных линий одного и того же вида является следствием естественного отбора. Поскольку отбор действует в конечном итоге на генотип, выявление генов, ассоциированных с параллельными эволюционными изменениями среди популяций, существенно для идентификации кандидата ых генов, вовлечённых в адаптивную фенотипическую дивергенцию. Обнаружение этих генетических изменений и их функциональная значимость являются фундаментальной проблемой молекулярной эволюционной биологии.

Среди наиболее интересных модельных организмов эволюционной биологии выделяются Сиговые (Coregonidae). Для этого рода рыб описано множество всевозможных форм, морф, популяций, экотипов и межвидовых гибридов (Попов, 2003; Решетников, 1980). В качестве объектов исследования нами была выбрана пара озёрный сиг (С. lavaretus baicalensis Dyb.) и байкальский омуль (С. autumnalis migratorius Georgi). Байкальский озерный сиг (С. lavaretus baicalensis Dyb.) - глубоководный беитофаг. обитающий в основном на глубинах 30 - 100 м и нерестующий в самом озере. Байкальский омуль (С. autumnalis migratorius Georgi) - пелагический планктофаг, обитающий на глубинах до 350 - 400 м.

Байкальский омуль С. Autumnalis migratorius (С.

Lavaretus)

Озёрный сиг (С. Lavaretus baicalensis Dyb.)

Долгое время по морфологическим признакам этих рыб относили к различным видам. Так, омуля считали подвидом ледовитоморского омуля С. autumnalis (Pallas) (Nikolsky, 1970; Решетников, 1980). Однако проведенные анализ вариабельности мтДНК и изоферментный анализ показали близость байкальского омуля к истинным сигам и, прежде всего, к виду С. lavaretus L. (Politov, 2002; Politov, 2000; Sukhanova, 2000; 5

Sukhanova, 2002). Последующий детальный филогеографический анализ структуры мтДНК Палеоарктических и Неоарктических сиговых (Politov, 2004), а также генеалогические реконструкции байкальских сиговых (Суханова, 2004) позволили сделать окончательный вывод о принадлежности байкальского омуля к виду С. lavaretus L. Таким образом, байкальский омуль и озёрный сиг являются ближайшими родственниками, их дивергенция от общего предка произошла всего 10 — 20 тыс. лет назад, по-видимому, в связи с освоением разных трофических ниш (Sukhanova, 2004; Скрябин, 1969; Скрябин, 1977; Решетников, 1980; Смирнов, 1974; Карасев, 1987).

Очевидно, пара сиг — омуль хорошо подходит в качестве модели эволюционной биологии. Можно полагать, что довольно короткий срок дивергенции байкальского омуля и сига в масштабе эволюционного времени позволит выявить именно те генетические факторы, которые в данном случае играют определяющую роль при дивергенции популяций и, в конечном итоге, в видообразовании.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Сиговые как объект эволюционной биологии

Биологов всего мира всё больше привлекают исследования механизмов взаимодействия организм/окружающая среда на генетическом уровне (Bernatchez, 1999; Lu, 1999; Turgeon, 2003). Наиболее подходящий объект для таких исследований - популяции, осваивающие отличающиеся экологические ресурсы, а самый информативный подход -мультидисциплинарный, включающий популяционную и количественную генетику, молекулярную биологию, генетическое картирование, функциональную геномику, экологию поведения и физиологию (Rogers, 2005; Rogers, 2002). Фундаментом же для таких исследований являются филогеографические и филогенетические работы, позволяющие проследить эволюционную историю видов, приведшую к образованию их популяционной структуры, существующей сегодня (Avise, 2000; Bernatchez, 1998; Turgeon, 2001а; Turgeon, 2001b). Особой популярностью пользуются виды, обитающие в умеренных и северных широтах и способные быстро реагировать на меняющиеся условия обитания. Именно к таким видам или комплексам близкородственных видов относится исключительно фенотипически пластичный политипичный вид Coregonus lavaretus.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Быченко, Оксана Станиславовна

5. ВЫВОДЫ

1. Методом вычитающей гибридизации впервые на геномном уровне исследованы различия близкородственных представителей байкальских сиговых рыб - озерного сига (С. lavaretus baicalensis Dybovsky) и омуля (С. autumnalis migratorius Georgi). Показано, что данным методом не обнаруживаются устойчивые межвидовые различия. Все найденные нуклеотидные последовательности соответствуют полиморфным некодирующим участкам геномов, варьирующим в результате однонуклеотидных замен и коротких делеций.

2. Проведен сравнительный анализ транскриптомов мозга байкальских сига и омуля с использованием метода SAGE. Продемонстрировано различие в уровне экспрессии в мозге для ряда генов клеточного метаболизма, нервной и иммунной систем, белкового синтеза и регуляторных генов.

3. Обнаружено повышение экспрессии Тс 1-подобных транспозонов семейства DTSsa4 в мозге сига по сравнению с мозгом омуля. Картирование последовательностей этих транспозонов в геномах Salmo salar и Danio rerio показало, что в ряде случаях они локализованы в 5'- и 3'- областях, а также в промоторных участках различных генов. Вероятно, Тс 1-подобные транспозоны могут влиять на активность близлежащих генов, тем самым играя важную роль в адаптивной дивергенции популяций сиговых.

4. Полученные данные геномного и транскриптомного сравнения могут свидетельствовать о высокой близости видов С. lavaretus baicalensis Dybovsky и С. autumnalis migratorius Georgi, а также об их недавней эволюционной дивергенции, сопровождающейся изменением уровня транскрипции ряда генов в мозге этих рыб.

Заключение

Анализ генной экспрессии в близкородственных популяциях, подвергающихся адаптивной дивергенции, даёт возможность выявить, каково влияние естественного отбора на генную экспрессию, и понять, какая существует связь между генотипом и фенотипом дивергирующих организмов. Исследование байкальских сига и омуля, разошедшихся совсем недавно в масштабах эволюционного времени, показали минимальные различия в геномах этих организмов, затрагивающие лишь их некодирующие участки. Однако транскрипция генов у сига и омуля, определенная нами в тканях мозга, значительно отличается. Наиболее важные выявленные нами кандидатные

87 гены, участвующие в эволюционных процессах этих рыб, относятся к генам нервной и иммунной систем, белкового синтеза, клеточного метаболизма и регуляторным генам. Очевидно, немалую роль в дивергенции сиговых играют и дифференциально транскрибирующиеся в мозге Тс 1-like транспозоны. Располагаясь нередко вблизи кодирующих участков генов иммунной системы, стрессового ответа и регуляторных генов, эти мобильные элементы, могут оказывать значительное влияние на их транскрипцию.

Таким образом, в данной работе мы показали, что изменение поведения особей, адаптирующихся к новым условиям окружающей среды, например, освоению новых экологических ниш, сопровождается изменениями уровня транскрипции многих важных генов нейрального транскриптома. Такая дифференциальная транскрипция генов может обуславливаться как эпигенетическими механизмами без изменения последовательности геномной ДНК, так и однонуклеотидными инсерциями и делециями в регуляторных участках генов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Быченко, Оксана Станиславовна, Москва

1. Allendorf F, Thorgaard G. 1984. Tetraploidy and the evolution of salmonid fishes. В J T, editor. In The evolutionary genetics of fishes. Plenum Press: 53.

2. Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ. 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res 25:3389-402.

3. Amheim N. 1983. Concerted evolution of multi-gene families. In: Nei M and Koehn RK (eds.) Evolution of genes and proteins. Sinauer. Sunderland: 38-61.

4. Aubin-Horth N, Desjardins JK, Martei YM, Balshine S, Hofmann HA. 2007. Masculinized dominant females in a cooperatively breeding species. Mol Ecol 16:1349-58.

5. Aubin-Horth N, Landry CR, Letcher BH, Hofmann HA. 2005a. Alternative life histories shape brain gene expression profiles in males of the same population. Proc Biol Sci 272:165562.

6. Aubin-Horth N, Letcher BH, Hofmann HA. 2005b. Interaction of rearing environment and reproductive tactic on gene expression profiles in Atlantic salmon. J Hered 96:261-78.

7. Audic S, Claverie JM. 1997. The significance of digital gene expression profiles. Genome Res 7:986-95.

8. Avise JC. 2000. Phylogeography: the hystory and formation of species. Press HU, editor. Cambridge, Massachussets-London, England: 447.

9. Avise JC, Giblin-Davidson C, Laerm J, Patton JS, Lansman RA. 1979. Mitochondrial DNA clones and matriarchal phylogeny within and among geographic populations of the pocket gopher. Geomys pinetis. Proc. Natl. Acad. Sci.USA 76:6694-6698.

10. Avise JC, Walker D, Johns GC. 1998. Speciation durations and Pleistocene effects on vertebrate phylogeography. Proc Biol Sci 265:1707-12.

11. Barluenga M, Stolting KN, Salzburger W, Muschick M, Meyer A. 2006. Sympatric speciation in Nicaraguan crater lake cichlid fish. Nature 439:719-23.

12. Barrick JE, Yu DS, Yoon SH, Jeong H, Oh TK, Schneider D, Lenski RE, Kim JF. 2009. Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature 461:1243-7.

13. Bermingham F, Moritz C. 1998. Comparative phylogeography: concepts and applications. Molecular Ecology 7:367-369.

14. Beraatchez L, Chouinard A, Lu G. 1999. Integrating molecular genetics and ecology in studies of adaptive radiation: whitefish, Coregonus sp., as a case study. Biological Journal of the Linnean Society 68:173-194.

15. Beraatchez L, Colombani F, Dodson JJ. 1991. Phylogenetic relationships among the subfamily Coregoninae as revealed by mitochondrial DNA restriction analysis. Journal of Fish Biology 39:283-290.

16. Bernatchez L, Wilson CC. 1998. Comparative Phylogeography Of Nearctic And Palearctic Freshwater Fishes. Molecular Ecology 7:431-445.

17. Blomme T, Vandepoele K, De Bodt S, Simillion C, Maere S, Van de Peer Y. 2006. The gain and loss of genes during 600 million years of vertebrate evolution. Genome Biol 7:43.

18. Bodaly RA, Vuorinen DA, Luczynski M, Reist JD. 1991. Genetic comparison of New and Old World coregonid fishes. Journal of Fish Biology 38:37-51.

19. Bodaly RA, Vuorinen DA, Reist JD, Reshetnikov YuS, Reist JD, Luczynski M. 1993. Genetic relatedness of Goregonid Generas and species: recent results. Abstract. V Symposium on Biology and Management of Coregonid Fishes. Olsztyn. Poland: 25.

20. Bodaly RA, Vuorinen DA, Reshetnikov YuS, Reist JD. 1994. Genetic relationships of five species of Coregonid fishes from Siberia. Journal of Ichthyology 34:117-130.

21. Bonni A, Sun Y, Nadal-Vicens M, Bhatt A, Frank DA, Rozovsky I, Stahl N, Yancopoulos GD, Greenberg ME. 1997. Regulation of gliogenesis in the central nervous system by the , JAK-STAT signaling pathway. Science 278:477-83.

22. Buckler ESt, Holtsford TP. 1996. Zea systematics: ribosomal ITS evidence. Mol Biol Evol 13:612-22.

23. Carranza S, Giribet G, Ribera C, Baguna, Riutort M. 1996. Evidence that two types of 18S rDNA coexist in the genome of Dugesia (Schmidtea) mediterranea (Platyhelminthes, Turbellaria, Tricladida). Mol Biol Evol 13:824-32.

24. Castro J, Rodriguez S, Pardo BG, Sanchez L, Martinez P. 2001. Population analysis of an unusual NOR-site polymorphism in brown trout (Salmo trutta L.). Heredity 86:291-302.

25. Chu WM, Ballard R, Carpick BW, Williams BR, Schmid CW. 1998. Potential Alu function: regulation of the activity of double-stranded RNA-activated kinase PKR. Mol Cell Biol 18:58-68.

26. Colosimo PF, Hosemann KE, Balabhadra S, Villarreal G, Dickson M, Grimwood J, Schmutz J, Myers RM, Schluter D, Kingsley DM. 2005. Widespread parallel evolution in sticklebacks by repeated fixation of Ectodysplasin alleles. Science 307:1928-33.

27. Culver M, Menotti-Raymond MA, O'Brien SJ. 2001. Patterns of size homoplasy at 10 microsatellite loci in pumas (Puma concolor). Mol Biol Evol 18:1151-6.

28. Derome N, Bernatchez L. 2006. The transcriptomics of ecological convergence between 2 limnetic coregonine fishes (Salmonidae). Mol Biol Evol 23:2370-8.

29. Derome N, Duchesne P, Bernatchez L. 2006. Parallelism in gene transcription among sympatric lake whitefish (Coregonus clupeaformis Mitchill) ecotypes. Mol. Ecol. 15:1239-1249.

30. Dijkstra JM, Kiryu I, Yoshiura Y, Kumanovics A, Kohara M, Hayashi N, Ototake M. 2006. Polymorphism of two very similar MHC class lb loci in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Immunogenetics 58:152-67.

31. Dover G. 1982. Molecular drive: a cohesive mode of species evolution. Nature 299:111-7.

32. Dziennis S, Alkayed NJ. 2008. Role of signal transducer and activator of transcription 3 in neuronal survival and regeneration. Rev Neurosci 19:341-61.

33. Ellegren H. 2000a. Heterogeneous mutation processes in human microsatellite DNA sequences. Nat Genet 24:400-2.

34. Ellegren H. 2000b. Microsatellite mutations in the germline: implications for evolutionary inference. Trends Genet 16:551-8.

35. Feinberg AP. 2007. Phenotypic plasticity and the epigenetics of human disease. Nature 447:43340.

36. Ferguson A, Himberg MK-J, Svardson G. 1978. Systematics of the Irish pollan (Coregonus pollan Thompson): an electrophoretic comparison with other Holarctic Coregoninae. J. Fish. Biol. 12:221-233.

37. Freimer N, Sabatti C. 2003. The human phenome project. Nat Genet 34:15-21.

38. Gasowska M. 1960. Genus Coregonus L. discussed in connection with a new systematic feature that of shape and proportion of os maxillare and os supramaxillare. Annales Zoologici. Polska AkademiaNauk. Warshava. XVIII:471-513.

39. Gibson G, Honeycutt E. 2002. The evolution of developmental regulatory pathways. Curr Opin Genet Dev 12:695-700.

40. Gibson G, Wagner G. 2000. Canalization in evolutionary genetics: a stabilizing theory? Bioessays 22:372-380.

41. Gibson G, Weir B. 2005. The quantitative genetics of transcription. Trends Genet. 21:616-623.

42. Harlton CE, Lyvesque CA, Punja ZK. 1995. Genetic diversity in Sclerotium (Athelia) rolfsii and related species. Phytopathology 85:1269-1281.

43. Hendry АР, Taylor ЕВ, McPhail JD. 2002. Adaptive divergence and the balance between selection and gene flow: lake and stream stickleback in the Misty system. Evolution 56:1199-216.

44. Hillis DM, Dixon MT. 1991. Ribosomal DNA: molecular evolution and phylogenetic inference. Q Rev Biol 66:411-53.

45. Hunt PN, Wilson MD, von Schalburg ICR, Davidson WS, Koop BF. 2005. Expression and genomic organization of zonadhesin-like genes in three species of fish give insight into the evolutionary history of a mosaic protein. BMC Genomics 6:165.

46. Jensen I, Larsen R, Robertsen B. 2002. An antiviral state induced in Chinook salmon embryo cells (CHSE-214) by transfection with the double-stranded RNA poly I:C. Fish Shellfish Immunol 13:367-78.

47. Jeukens J, Bittner D, Knudsen R, Bernatchez L. 2009. Candidate genes and adaptive radiation: insights from transcriptional adaptation to the limnetic niche among coregonine fishes (Coregonus spp., Salmonidae). Mol Biol Evol 26:155-66.

48. Johnson TC, Scholz CA, Talbot MR, Kelts K, Ricketts RD, Ngobi G, Beuning K, Ssemmanda II, McGill JW. 1996. Late Pleistocene Desiccation of Lake Victoria and Rapid Evolution of Cichlid Fishes. Science 273:1091-3.

49. Koskinen MT, Haugen TO, Primmer CR. 2002a. Contemporary fisherian life-history evolution in small salmonid populations. Nature 419:826-30.

50. Koskinen MT, Nilsson J, Veselov AJ, Potutkin AG, Ranta E, Primmer CR. 2002b. Microsatellite data resolve phylogeographic patterns in European grayling, Thymallus thymallus, Salmonidae. Heredity 88:391-401.

51. Mamontov AM, Yakhnenko VM. 1995. Ecological, morphological and izo-enzyme differentiation of coregonid populations in Lake Baikal. Arch. Hydrobiol. Spec. Issues Advanc. Limnol. 46:13-21.

52. Meyer A, Van de Peer Y. 2005. From 2R to 3R: evidence for a fish-specific genome duplication (FSGD). Bioessays 27:937-45.

53. Moss T, Stefanovsky VY. 1995. Promotion and regulation of ribosomal transcription in eukaryotes by RNA polymerase I. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 50:25-66.

54. Odorico DM, Miller DJ. 1997. Variation in the ribosomal internal transcribed spacers and 5.8S rDNA among five species of Acropora (Cnidaria; Scleractinia): patterns of variation consistent with reticulate evolution. Mol Biol Evol 14:465-73.

55. Pfaffl MW, Horgan GW, Dempfle L. 2002. Relative expression software tool (REST) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR. Nucleic Acids Res 30:36.

56. Politov DV, Bickham J, Patton JS. 2004. Molecular phylogeography of Palearctic and Nearctic ciscoes. Annales Zoologici Fennici. 41:13-24.

57. Politov DV, Gordon NYu, Makhrov AA. 2002. Genetic identification and taxonomic relationships of six Siberian species of Coregonus. Arch. Hydrobiol. Spec. Issues Advance. Limnol. 57:21-34.

58. Politov DV, Gordon NYu, Afanasiev KA, Altukhov YuP, Bickham JW. 2000. Identification of palearctic coregonid fish species using mtDNA and allozyme genetic markers. Journal of Fish Biology 57(Supplement A):51-71.

59. Presa P, Pardo BG, Martinez P, Bernatchez L. 2002. Phylogeographic congruence between mtDNA and rDNA ITS markers in brown trout. Mol Biol Evol 19:2161-75.

60. Purugganan MD. 1998. The molecular evolution of development. Bioessays 20:700-11.

61. Ramakers C, Ruijter JM, Deprez RH, Moorman AF. 2003. Assumption-free analysis of quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR) data. Neurosci Lett 339:62-6.

62. Reshetnikov YS. 2004. Coregonid fishes in Arctic waters. Annales Zoologici Fennici. 41:3-12.

63. Robertsen B. 2006. The interferon system of teleost fish. Fish Shellfish Immunol 20:172-91.

64. Robinson GE, Grozinger CM, Whitfield CW. 2005. Sociogenomics: social life in molecular terms. Nat Rev Genet 6:257-70.

65. Rogers SM, Bernatchez L. 2005. Integrating QTL mapping and genome scans towards the characterization of candidate loci under parallel selection in the lake whitefish (Coregonus clupeaformis). Mol. Ecol. 14:351-361.

66. Rogers SM, Gagnon V, Bernatchez L. 2002. Genetically based phenotype-environment association for swimming behavior in lake whitefish ecotypes (Coregonus clupeaformis Mitchill). Evolution 56:2322-9.

67. Rosenberg M, Przybylska M, Straus D. 1994. "RFLP subtraction": a method for making libraries of polymorphic markers. Proc Natl Acad Sci U S A 91:6113-7.

68. Rubin CM, Kimura RH, Schmid CW. 2002. Selective stimulation of translational expression by Alu RNA. Nucleic Acids Res 30:3253-61.

69. Sayers ST, Khan T, Shahid R, Dauzvardis MF, Siegel GJ. 1994. Distribution of alpha 1 subunit isoform of (Na,K)-ATPase in the rat spinal cord. Neurochem Res 19:597-602.

70. Sverdlov ED. 2003. Genome-wide non-sequencing strategies for bacterial genome comparison: the necessity and an analysis of the variable bacterial world Vestn Ross Akad Med Nauk 1:15-20.

71. Schluter D, Clifford EA, Nemethy M, McKinnon JS. 2004. Parallel evolution and inheritance of quantitative traits. Am Nat 163:809-22.

72. Smirnov VV. 1992. Intraspecific structure of baikal omul, Coregonus autumnalis migratorius (Georgi). Pol. Arch. Hydrobiol. XXXIX:325 -333.

73. Stern D. 2000. Perspective: evolutionary developmental biology and the problem of variation. Evolution 54:1079-1091.

74. Stevenson DS, Jarvis P. 2003. Chromatin silencing: RNA in the driving seat. Curr Biol 13:13-15.

75. Suarez-Castillo EC, Garcia-Arraras JE. 2007. Molecular evolution of the ependymin protein family: a necessary update. BMC Evol Biol 7:23.

76. Sukhanova LV, Smirnov VV, Kirilchik SV. 2000. The phylogenetic relationships of Lake Baikal coregonids as revealed by mitochondrial DNA D-loop analysis. Biodiversity and dynamics of ecosystems in North Eurasia 5:199-201.

77. Sukhanova LV, Smirnov VV, Kirilchik SV, Shimizu I. 2004. Grouping of Baikal omul Coregonus autumnalis migratorius Georgi within the C. lavaretus complex confirmed by using a nuclear DNA marker. Annales Zoologici Fennici. 41: 41-49.

78. Takeda K, Noguchi K, Shi W, Tanaka T, Matsumoto M, Yoshida N, Kishimoto T, Akira S. 1997. Targeted disruption of the mouse Stat3 gene leads to early embryonic lethality. Proc Natl Acad Sci U S A 94:3801-4.

79. Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S. 2007. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Mol Biol Evol 24:1596-9.

80. Turgeon J, Bernatchez L. 2001a. Clinal variation at microsatellite loci reveals historical secondary intergradation between glacial races of Coregonus artedi (Teleostei: Coregoninae). Evolution 55:2274-86.

81. Turgeon J, Bernatchez L. 2001b. Mitochondrial DNA phylogeography of lake cisco (Coregonus artedi): evidence supporting extensive secondary contacts between two glacial races. Mol Ecol 10:987-1001.

82. Velculescu VE, Zhang L, Vogelstein B, Kinzler KW. 1995. Serial analysis of gene expression. Science 270:484-7.

83. Woods R, Schneider D, Winkworth CL, Riley MA, Lenski RE. 2006. Tests of parallel molecular evolution in a long-term experiment with Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA 103:9107-12.

84. Zhuo L, Reed KM, Phillips RB. 1995. Hypervariability of ribosomal DNA at multiple chromosomal sites in lake trout (Salvelinus namaycush). Genome 38:487-96.

85. Каукоранте M, Медников Б. 1988. Генетическая дифференциация сигов Фенноскандии. М.: Наука: 38-48.

86. Марков А. 2009. Подведены итоги эволюционного эксперимента длиной в 40 000 поколений. Элементы 2:2.

87. Марков АВ, Куликов AM. 2006. Гипотеза иммунологического тестирования партнеров -согласованность развития адаптаций и смены половых предпочтений. Известия РАН, Серия биологическая. 3:261-274.

88. Мац ВД, Покатилов АГ 1976. Кайнозойские отложения о.Ольхон на Байкале. Геология и геофизика 11:55-67.

89. Мина MB, Клевезаль ГА 1976. Рост животных. М.:Наука:291.

90. Мухомедиаров ФБ. 1942. Расы байкальского омуля, их морфологические и биологические особенности и роль в промысле Изв. Биол.-геогр. ин-та при Иркут. ун-те. 3/4:35 -96.

91. Наймарк Е. 2006. Видообразование — личное дело каждого. Элементы 2:16.

92. Попов ИЮ. 2003. Квинтэссенция эволюции. Эволюционная биология: история и теория. 2:172-189.

93. Северцов АС. 2005. Теория эволюции: М.:Гум. изд. центр ВЛАДОС: 380.

94. Скрябин АГ. 1969. Биология байкальских сигов. М.:Наука: 125.

95. Скрябин АГ. 1977. Рыбы Баунтовских озер Забайкалья.: Новосибирск: Наука: 231.

96. Скрябин АГ. 1979. Сиговые рыбы юга Сибири. Новосибирск: Наука: 229.

97. Слободянюк СЯ, Кирильчик СВ, Мамонтов AM, Скулин ВА. 1993. Сравнительный рестрикционный анализ митохондриальной ДНК байкальского Coregonus lavaretus baicalensis и баунтовского С. lavaretus bounti озерных сигов Вопросы ихтиологии 5: 631 -636.

98. Смирнов ВВ, Поляков ВК. 1987. Изменения морфоэкологических показателей омуля при вселении в высокогорные озера Саяна. В сборнике: Морфология и экология рыб. Серия «Фауна Байкала». Новосибирск: Наука:2б-41

99. Смирнов ВВ. 1997. Экология байкальского омуля Coregonus autumnalis migratorius (Georgi). Автореф. дис. докт. биол. наук. Екатеринбург: 42.

100. Смирнов ВВ, Моложников ВН. 1981. Популяции омуля в бассейне реки Кичеры. Второе Всесоюзн. совещ. по биологии и биотехнике разведения сиговых рыб: Тез. докл.-Петрозаводск:92-93.

101. Смирнов ВВ, Шумилов ИП. 1974. Омули Байкала. Новосибирск: Наука: 160.

102. Смирнова-Залуми НС. 1971. Гетерохронии в оогенезе байкальского омуля. Докл. АН СССР 198:989-992

103. Суханова JIB. 2004. Молекулярно-филогенетическое исследование байкальского омуля Coregonus autumnalis migratorius (Georgi) Дис. канд. биол. наук: 03.00.15. Иркутск: 88.

104. Суханова JIB, Смирнов ВВ, Смирнова-Залуми НС, Кирильчик СЯ. 1999. Новые данные по рестрикционному анализу мтДНК популяций байкальского омуля Coregonus autumnalis migratorius (Georgi). Вопросы ихтиологии 6:655 658.

105. Талиев ДН. 1941. Серологический анализ рас байкальского омуля. Тр. ин-та/ Зоол. ин-т АН СССР 6:68 69

106. Черешнев ИА. 1994. Сравнительная краниология Голарктических ciscoes. Труды 5-й национальной конференции "Биология и разведение сиговых рыб". Москва 1:157161.

107. Черняев ЖА. 1968. Эмбриональное развитие байкальского омуля. М.: Наука:91.

108. Черняев ЖА. 1973. Размножение и развитие байкальского озерного сига в связи с вопросами его искусственного разведения. Вопр. ихтиологии 139:259-274.

109. Шапошникова ГХ. 1968. Сравнительно-морфологический анализ сигов Советского Союза. Морфология низших позвоночных животных. JL: Наука. Ленинг. отд-ние: 206-265.

110. Шатуновский МИ. 1980, Экологические закономерности обмена веществ морских рыб. М.: Наука: 288.