Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-биологическая диагностика дирофиляриоза в организмах дефинитивного хозяина и переносчиков

ВАК РФ 03.02.11, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-биологическая диагностика дирофиляриоза в организмах дефинитивного хозяина и переносчиков"

На правах рукописи

005534110

РАКОВА Вера Михайловна

МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ДИРОФИЛЯРИОЗА В ОРГАНИЗМАХ ДЕФИНИТИВНОГО ХОЗЯИНА И ПЕРЕНОСЧИКОВ

03.02.11 - паразитология 03.02.05 - энтомология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

з ОКТ 2013

Москва 2013

005534110

Работа выполнена в ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Завойкин Валерий Дмитриевич профессор кафедры тропической медицины и паразитарных болезней медико-профилактического факультета ГБОУ ВПО Первого Московского государственного медицинского университета имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации, доктор медицинских наук, профессор

Кривошеина Марина Геннадьевна доктор биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории почвенной зоологии и общей энтомологии Института проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова Российской Академии Наук

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится — 2013 года в ^^ часов на заседании

диссертационного совета Д 208.040.12 при Первом МГМУ имени И.М. Сеченова (119991, г. Москва,ул. Трубецкая, д. 8, стр.2)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦМБ Первого МГМУ имени И.М. Сеченова (117997, г. Москва, Нахимовский проспект, д. 49)

Автореферат разослан _ 2013 года

кандидат медицинских наук доктор биологических наук

Морозов Евгений Николаевич Ганушкина Людмила Алимпьевна

Ученый секретарь

диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Фролова Александра Александровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

В последние годы дирофиляриоз человека все чаще регистрируют в центральных и северных областях России. До 2005 года, когда случаи дирофиляриоза были выявлены более, чем у 200 жителей 28 эндемичных территорий, его рассматривали как «вновь возникающую» паразитарную болезнь. В 2004 году в России было зарегистрировано около 300 случаев дирофиляриоза, из них в Москве и Московской области за 2000 - 2002 гг - 11, а к 2011 году число случаев достигло 701 [Сергиев В.П., Супряга В.Г. и др. (2011)]. Дефинитивными хозяевами дирофилярий могут быть многие виды млекопитающих, человек, а переносчиками, в основном, кровососущие комары pp. Aedes, Anopheles, Culex и др.

Как правило, диагностическое исследование на дирофиляриоз проводят уже после появления клинических признаков заболевания, поэтому меры борьбы и профилактики неизменно запаздывают. С 2009 года многие исследователи, как за рубежом, так и России и странах СНГ начали проводить ксеномониторинг (поиск возбудителя в организме переносчика) с помощью молекулярно-биологических методов. Эти методы позволяют быстро получить данные о распространении, плотности распределения инвазии, сезонности, оценить вероятность заражения человека дирофиляриозом в тот или иной сезон, а в частных случаях помочь при постановке диагноза.

Цель исследования: обнаружение дирофилярий молекулярно-биологическими методами в организмах дефинитивного хозяина и переносчиков — комаров pp. Culex, Aedes и Anopheles - для оценки пораженности дирофиляриозом некоторых регионов России.

Задачи исследования:

1. Отработать методику постановки ПЦР, включающую в себя подбор праймеров для идентификации возбудителя дирофиляриоза, выделение ДНК дирофилярий из различных биологических сред, подобрать и обосновать оптимальные условия постановки ПЦР-реакции;

2. Провести лабораторные исследования по идентификации дирофилярий в зараженных объектах: дефинитивном хозяине и переносчике;

3. Определить зараженность комаров pp. Aedes, Culex и Anopheles, собранных в различных регионах Средней полосы России. Изучить сезонную зараженность комаров двумя видами дирофилярий - Diroßlaria repens и Dirofilaria immilis .

4. Установить факторы, влияющие на распространение дирофиляриоза.

Научная новизна исследования. Впервые определен уровень зараженности переносчиков дирофиляриоза - комаров pp. Aedes, Culex и Anopheles в течение всего периода их активности для трех регионов России. Максимальный уровень зараженности комаров в Московской области составил 9,29% (август-сентябрь 2011 г), Нижегородской -6,78% (август 2011 г), в Тверской - 6,67% (июнь 2010 г). Средняя зараженность комаров в исследуемых регионах за годы нашей работы (2006-2011 гг) составила 1,85%, из них D. repens - 1,33%, D. immitis - 0,52%.

Уровень зараженности комаров в 2009 - 2011 годах оказался значительно выше, чем в 2006-2008, увеличившись с 0,44% до 3,25%.

Комары pp. Culex и Anopheles по степени зараженности дирофиляриями отличались незначительно: средняя зараженность Culex с 2009 по 2011 год составила - 3,6%, Anopheles — 3,72%. Чуть меньшую степень зараженности регистрировали у Aedes - 2,64%.

При исследованиях, проведенных с 2006 по 2011 год, наибольшая зараженность комаров дирофиляриями зарегистрирована со второй декады августа до середины сентября.

Практическая значимость.

Оптимизированы условия амплификации ДНК дирофилярий при постановке ПЦР на различном биологическом материале. В результате проведенных исследований разработан и внедрен в практику НИИ медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е.И. Марциновского Первого МГМУ им. И.М. Сеченова метод ПЦР-диагностики D. repens и D. immitis.

Установлена возможность и эффективность молекулярно-биологического метода измерения зараженности самок комаров дирофиляриями (ксеномониторинга).

Впервые получены показатели зараженности комаров 2 видами дирофилярий: в Московской области зараженность D.repens составила 1,3%, D. immitis - 0,3%; Нижегородской области зараженность D.repens составила 1,77%, D. immitis 2,46%, в Тверской области - 6,67%.

Внедрение в практику. Разработанные методики и результаты исследований используют в учебном процессе на кафедре тропической медицины и паразитарных болезней МПФ ППО ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова. Утверждены 25 февраля 2013 г.

Положения, выносимые на защиту:

1. Оптимизирован режим выделения ДНК и условий ПЦР с целью идентификации D. repens и D. immitis в организме дефинитивного хозяина и переносчика

позволяющий дальнейшее использование адаптированной ПЦР в качестве инструмента для оценки экстенсивности заражения исследуемых территорий;

2. На основе ксеномониторинга получены данные о зараженности комаров дирофиляриями в Москве и Московской области за 2006-2011 гг, в Нижегородской (20102011гг) и Тверской (20 Юг). Установлено, что с 2006 года по 2011 зараженность комаров дирофиляриями увеличилась почти в семь раз. Сезонный пик зараженности комаров дирофиляриями зарегистрирован во второй половине августа. Доля D. immitis у зараженных дирофиляриями комаров в правобережной части Нижегородской области выше, чем в Московской области.

Публикации. По результатам проведенных исследований опубликовано 5 научных работ, из них 3 - в рецензируемых научных изданиях, включенных в перечень ВАК России.

Апробация результатов исследования. Материалы диссертации были доложены на коллоквиумах МПФ ППО ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова 27.10.2010 г и 27.06.2012 г., на конференции «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» ВИГИС им. К.И. Скрябина 21-23 мая 2013 г, а также на заседании специализированной комиссии ИМПиТМ им. Е.И. Марциновского и кафедры тропической медицины и паразитарных болезней МПФ Первый МГМУ им. И.М. Сеченова, 6 июня 2013 года.

Личный вклад автора. Автором лично оптимизирован режим амплификации, проведено исследование 726 биологических образцов методом ПЦР на наличие возбудителя дирофиляриоза. Освоены различные методы сбора биоматериала и методы пробоподготовки. В течение 6 лет автором проводился сбор и определение комаров, а так же обработка и систематизация полученных материалов. Выполнен анализ и обобщение данных литературы, описание районов исследований и проанализированы основные факторы, способные влиять на показатели зараженности комаров дирофиляриями.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 132 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов и заключения, выводов, практических рекомендаций и списка использованной литературы. Список литературы включает 213 источников: 108 отечественных и 105 зарубежных. Текст иллюстрирован 21 таблицей и 17 рисунками.

Благодарности. Выражаю свою искреннюю благодарность моим научным руководителям: Морозову Евгению Николаевичу, Ганушкиной Людмиле Алимпьевне за неоценимую помощь в моих исследованиях, Супряге Валентине Григорьевне за консультации и постоянное внимание к моей работе, Ястребу Валерию Брониславовичу за

5

предоставленный материал, Барановой Алле Михайловне за консультации, а так же моим рецензентам - Стрелковой Маргарите Витальевне и Дремовой Виктории Петровне за замечания и консультации.

Материалы, основные методы и объем исследования. Для работы использовали ДНК, выделенную из крови собак, больных дирофиляриозом. Взятие проб крови больных собак для отработки методики постановки ПНР производили в Центре Экстренной Ветеринарной помощи ООО «Гала-Сервис». Комаров собирали в разных районах Московского региона, Воротынском районе Нижегородской области и Кимрском районе Тверской области.

Объектами исследования являлись комары родов Anopheles, Culex и Aedes, собранные в разных районах Средней полосы России. Объем проведенных исследований представлен в табл. 1.

Таблица 1 - Объем исследований.

Выполненные работы Годы Всего

2006 2007 2008 2009 2010 2011

Исследовано проб крови собак 12 6 - - - - 18

Поставлено серий ПЦР 26 23 10 6 21 22 108

Проведено сборов комаров 30 26 18 9 34 47 164

Исследовано районов 5 5 5 2 7 7 151

Исследовано проб комаров на зараженность дирофиляриями 136 123 60 15 160 232 726

Всего собрано/исследовано комаров 1358 1030 467 144 1554 2308 6861

1 Некоторые районы изучали повторно, некоторые - на протяжении всего периода исследований.

За период с 2006 по 2011 год были исследованы на зараженность 6861 комаров, собранных в 15 районах, входящих в Московскую, Нижегородскую и Тверскую области. Методика постановки - тестирование проб по 10-15 комаров. Для выделения ДНК из комаров использовали:

1) Набор реагентов Diatom DNA Prep 100 для выделения ДНК из различного биологического материала (ПЦР «Biokom»);

2) Комплект «ДНК-сорб-А» вариант 100 для выделения ДНК из клинического материала (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора);

3) Комплект реагентов для выделения ДНК «Проба НК» (использовался для выделения ДНК из крови) (ООО «ДНК - Технология»).

Постановка ПЦР. Последовательности нуклеотидов, специфические для D. repens и D. immitis, на основании которых были выбраны праймеры, были взяты из опубликованных в периодической научной литературе зарубежных источников, верифицированы в информационной базе Генетического банка Национального центра биотехнологической информации США (Genbank «Blast») и синтезированы ООО «Биоком», Москва. Первая отработка параметров ПЦР проводилась на положительных пробах крови собак. Праймеры D. repens : F - 5' - CCGGTAGACCATGGCATTAT - 3' и R -5' - CGGTCTTGGACGTTTGGTTA - 3'. Праймеры D. immitis-. F - (5' -TGATTGGTGGTTTTGGTAA - 3') и R - (5' - ATAAGTACGAGTATCAATATC -3').

Сбор комаров проводили с помощью ловушек в течение суток, и «на себе» во время пиков их суточной активности, а так же в местах дневок.

Статистическая обработка данных проводилась при помощи программных пакетов BioStat Proffessional 5.8.4 и Microsoft Excel 2010. Статистическую погрешность вычисляли с учетом среднего квадратичного отклонения качественных признаков (т). Для графического отображения вычисляемых величин использовались столбиковые и круговые диаграммы. Оценку зараженности производили как в процентах, так и при помощи индекса MFIR (Minimum field infection rate), который вычислялся по формуле: (количество зараженных проб/количество комаров) хЮОО.

Результаты собственных исследований. Отработка параметров реакции и результаты ПЦР. Первоначально для исследования были использованы параметры ПЦР имеющиеся в литературе (табл. 2).

Таблица 2 - Исходные режимы амплификации.

Для D. repens Для D. immitis

Начальная денатурация - 94°С - 30с Начальная денатурация - 94°С - 30с

Денатурация 55°С - 30с 48 циклов Денатурация 94°С - 1 мин 30 циклов

Отжиг 72°С-25с Отжиг 50°С-2 мин

Элонгация 72°С - 5 мин Элонгация 72°С-3 мин

Хранение - 10°С

Поскольку после проведения электрофореза в агарозном геле не были получены полоски, соответствующие нуклеотидным последовательностям, видоспецифичным для О. ¡ттШя и £>. герет, были изменены условия реакции.

Основными параметрами ПЦР, требующими оптимизации были температура отжига праймеров и время элонгации. В результате проведенной оптимизации, опытным путем, были выбраны следующие режимы амплификации (табл. 3).

Таблица 3 - Итоговые режимы амплификации.

Для D. repens Для D. immitis

Начальная денатурация - 94°С - 5 мин Начальная денатурация - 94°С — 30 с

Денатурация 94°С - 30 с 48 циклов Денатурация 94°С - 1 мин 30 циклов

Отжиг 50°С - 30 с Отжиг 50°С-2 мин

Элонгация 72°С - 1 мин Элонгация 72°С - 3 мин

Элонгация 72°С - 5 мин Элонгация 72°С - 5 мин

Хранение - 10°С

В результате изменений, внесенных нами в режимы амплификации, были получены полоски в агарозном геле, соответствующие нуклеотидным последовательностям D. immitis и D. repetís с длиной фрагмента 656 и 246 Ьр соответственно.

С целью подтверждения результатов были использованы 12 проб крови собак, из которых 9 были положительными на D. repens и 3 - положительными на D. immitis по

результатам микроскопии. Совпадение результатов ПЦР с результатами микроскопии в данном случае составило 100%.

Аналогичные результаты были получены при ПЦР-анализе зараженных самок комаров.

Сбор самок комаров и результаты исследования их на дирофиляриоз.

Таблица 4 - Число собранных комаров в разных районах Московской, Нижегородской и Тверской областей.

Годы Районы^. 2006 2007 2008 2009 2010 2011 Всего собрано комаров

Выхино (мкр) 250 149 41 84 246 230 1000

Жулебино (мкр) 63 40 - - - - 103

Капотня (мкр) - - - - 77 - 77

Покровское-Стрешнево (парк) 96 96

Щербинка (мкр) - - 98 - 122 114 334

Зеленоград (мкр) - - - - - 147 147

Балашиха - - 73 - - - 73

пос. Пирогово ■ 298 • - - 87 385

пос. Клязьма 320 - - - - 320

г. Истра 113 - 30 - - - 143

пос. Снегири 45 - - - - - 45

Волоколамский р-н, Волоколамск 44 44

Шаховской р-н 887 223 225 60 777 1159 3331

Тверская обл., Кимрский район 30 30

Нижегородская обл., Воротынский р-н 258 475 733

Всего собрано комаров 1358 1030 467 144 1554 2308 6861

Сборы комаров проводили в 6 микрорайонах г. Москвы (Выхино, Жулебино, Зеленоград, Капотня, парк Покровское-Стрешнево, Щербинка) и 5 районах ближнего Подмосковья (г.

Истра, поселок Клязьма, Балашиха, поселок Снегири, дачный поселок Пирогово), в Волоколамском и Шаховском районах Московской области, а так же в Воротынском районе Нижегородской области (село Фокино) и в Кимрском районе Тверской области

Нами были выбраны 4 района в разных участках Москвы, характеризующиеся разной степенью и характером застройки, имеющие и не имеющие водоемы, и 8 районов Московской области, расположенных в разных направлениях и на разном удалении от Москвы. В 2010-2011 годах дополнительно к исследованным районам проводили сбор в других областях - Тверской (Кимрский район), примыкающей к Московской, и Нижегородской (Воротынский район), не имеющей общей границы с Московской областью (табл. 4).

Эти территории были выбраны нами как представляющие разные участки центрального региона РФ в зоне умеренного климата.

На каждой из этих территорий имеются различные типы водоемов, которые являются местами выплода комаров, стаи бездомных собак, летом в дачные поселки завозят домашних собак.

Исследование комаров на зараженность дирофиляриями. В 2006 году было исследовано 1358 комаров, собранных в двух микрорайонах Юго-Восточного Административного Округа г. Москвы (Выхино, Жулебино) и трех районах Московской области (Истра, Снегири, Шаховской район), расположенных на разных расстояниях в Северо-западном направлении от Москвы.

Сбор в Жулебино проводили в сентябре, между жилыми и нежилыми районами (стройки). Географические координаты места сбора 55°41'55"с.ш. и 37°51'15"в.д. В 2006 году в Жулебино было собрано 63 самки комаров. Активность нападения составляла 1-2 комара за 20 мин.

Сбор в Выхино производили в районе жилых кварталов и в районе Кузьминского кладбища. Географические координаты 55°42'44"с.щ. и 37°48'19"в.д. 55°42'10"с.ш. и 37°48'8"в.д. соответственно. Активность нападения комаров составляла 10 комаров за 15 мин. В районе иногда попадались единичные бродячие собаки. В Шаховском районе в 2006 году было собрано 887 самок комаров. Активность нападения комаров была различной и в разные дни составляла от 0-1 особи в час до 30 за 15 минут. Сбор проводили в дачном поселке, включающем полторы сотни участков, в прилежащем лесу и в районе двух заболоченных участков, отстоящих друг от друга на 1,5 км, в деревнях и в сквере города Шаховская. Координаты мест сбора - 55°58'40"с.ш. и 35°41'54"в.д., 55°1'37"с.ш. и 35°30'39"в.д., 55°0'35"с.ш. и 35°37'50"в.д., 55°57'59"с.ш. и 35°37'30"в.д.

Сбор в Истринском районе производили в дачном поселке, со всех сторон окруженном лесом. Координаты места сбора 55°55'9"с.ш. и 36°54'7"в.д. Активность нападения комаров составляла в среднем 7 особей за 15 мин. В Истринском районе было собрано 113 самок комаров.

В районе станции «Снегири», в поселке и прилежащем лесу было собрано 45 самок комаров. Координаты места сбора 55°52'56"с.ш. и 37°1'53"в.д.

Из 5 районов, обследованных в 2006 году, наибольшее число зараженных комаров зарегистрировано в Шаховском районе, где зараженные комары обнаружены в июле (из 55 особей - 1 заражена О. герет) и в августе: из 164 самок (1 с О. герет и 2 с £>. ¡ттШх). Из 63 самок, собранных в сентябре в Жулебино, 1 самка была заражена В. герет. Тот же вид паразита зарегистрирован в июне в Истре - 1 самка из 113 была заражена О. герет.

При анализе общей зараженности (£>/го/?/апа ^рр.) за 2006 год в мае зараженных комаров не обнаружено, а в августе (со второй декады) - сентябре зараженность составляла 1,32 ± 0,76%.

В 2007 году было исследовано 1030 самок комаров, собранных в двух микрорайонах Москвы (Выхино, Жулебино) и трех районах Подмосковья. Районы исследования комаров были расширены за счет включения двух районов, расположенных к северу от Москвы - поселки Клязьма и Пирогово.

Сбор комаров в районах Выхино и Жулебино проводился в июне, тех же местах, что и в 2006 году. В Выхино было собрано 149, в Жулебино - 40 самок комаров.

Сбор в поселке Клязьма проводился в мае - июне. Координаты места сбора 55°59'7"с.ш. и 37°50'13"в.д. Активность нападения комаров составляла 3 особи в 15 мин. За период сбора комаров было замечено более четырех десятков собак, постоянно проживающих на улице.

В дачном поселке Пирогово сбор комаров проводился в июне, было собрано 298 самок комаров. Географические координаты места сбора - 55°59'9"с.ш. и 37°42'14"в.д.

В Шаховском районе сбор комаров проводился в мае, августе и сентябре, в тех же местах, что и в 2006 году.

Из 5 районов, обследованных в 2007 г, зараженных комаров не выявлено в 3-х: Выхино, Клязьме и Пирогово. В Жулебино к данным, полученным за сентябрь 2006 г, можно добавить исследование комаров, собранных в июне 2007 г. Результаты аналогичны: в данном районе также обнаружена £>. герет.

В Шаховском районе из 223 исследованных комаров 4 самки оказались заражены, при этом их зараженность £>. герет и О. ттШз составила - 1,35±0,77 и 0,44% (одна положительная проба) соответственно. Высокую зараженность наблюдали в августе,

11

когда показатели по D. repens составили 2,06±1,44, a D. immitis - 1,03% (одна положительная проба). В сентябре зараженность D. repens увеличилась - 2,78±2,73% (р=0,03). Проб, положительных на D. immitis, обнаружено не было.

Следует подчеркнуть, что из обследованных за 2 года 7 районов D. immitis обнаружен только в Шаховском районе. В целом показатели зараженности комаров, собранных в этом районе, сравнимы с 2006 годом.

В 2008 году было исследовано 467 самок комаров из одного микрорайона Москвы (Выхино) и четырех районов Подмосковья. Районы исследования были расширены за счет проведения сбора комаров в Балашихинском районе (Северо-Восточное направление), и Щербинке (Южное направление).

В районе Выхино г. Москвы и Шаховском районе Подмосковья сбор комаров проводили в том же месте, что и 2006-2007 гг. В Балашихе сбор комаров проводили на обочине Горьковского шоссе, географические координаты места - 55°47'59"с.ш. и 37°59'58"в.д. Бродячих собак замечено не было, поблизости имелся небольшой временный водоем. Активность нападения комаров составляла 10 особей за 15 мин.

В Щербинке, Выхино и Балашихе зараженных комаров обнаружено не было. В Истре из 30 собранных самок комаров одна оказалась зараженной (D. repens; р=0,03). В Шаховском районе зараженность комаров была ниже в сравнении с 2006 и 2007 годом: зараженной оказалась одна самка из 225 (D. repens). Самок комаров с D. immitis в исследованных районах не регистрировали.

В 2009 году были исследованы два района - Выхино, микрорайон Москвы, и Шаховской район Московской области. Сбор комаров проводили в тех же местах, что и прошлые годы.

Общее количество самок комаров, собранных в 2009 году, составляло 144 особи. В районе Выхино, в мае, из 8 собранных самок одна оказалась зараженной D. repens. В августе в Шаховском районе из 60 комаров 2 оказались заражены D. repens.

Общая зараженность (Diroßlaria spp.) всех собранных самок за весь сезон составила 2,08±1,19%. Зараженности самок комаров D.immitis в исследованных районах не регистрировали.

В 2009 году при оценке зараженности самок комаров их определяли до рода. Число самок рода Aedes составило 25 особей, число самок рода Culex составило 65 особей, рода Anopheles - 54 особи. В каждой группе 1 проба оказалась положительной на D. repens. Смешанной зараженности и зараженности D. immitis не обнаружено.

В 2010 году комаров собирали в 3 микрорайонах Москвы (Выхино, Капотня, Щербинка), в Волоколамском и Шаховском районах Московской области, а так же в Воротынском районе Нижегородской области и Кимрском районе Тверской области.

Сбор комаров в районе Капотня проводился в роще недалеко от МКАД. По визуальной оценке место сбора характеризовалось густым подлеском и относительно высокой влажностью почвы. Менее чем в двух километрах, отделенный дорогой, находился торговый комплекс «Садовод», включающий в себя «Птичий» рынок. Координаты места сбора 55°40'57" с.ш. и 37°49'41" в.д. В момент сбора беспризорных животных замечено не было, активность нападения комаров составляла 10 комаров за 15 мин. Всего в районе было собрано 77 комаров.

Сбор комаров в Волоколамском районе проводили два раза, активность нападения составляла 1 особь за 15 мин. Координаты места сбора 55°58'57" с.ш. и 35°54'45" в.д.

В Воротынском районе Нижегородской области комаров собирали только в июне, в деревне Фокино, координаты места сбора 56°9'34" с.ш. и 45°49'41" в.д. Активность нападения комаров составляла до 30 особей в 15 мин.

В 2010 году из всех исследованных районов только в Щербинке не выявлено зараженных комаров. Зараженность комаров в остальных районах значительно повысилась. Примером является район Выхино, где зараженные комары зарегистрированы в мае (1 особь из 92), в июне (3 из 56) и в августе (5 из 98). В Шаховском районе зараженных комаров регистрировали на протяжении всего сезона.

Относительно высокий процент зараженности зарегистрирован в Волоколамском районе, где из небольшого числа самок (23), 3 особи оказались зараженными D. repens (13,04±7,02%).

В Воротынском районе Нижегородской области из 258 - 8 особей оказались заражены, причем в равном соотношении D. repens и D. immitis.

Сбор комаров в Кимрском районе Тверской области производили только в июне: из 30 собранных самок комаров 2 оказались заражены D. immitis (табл. 3.3.5.1).

Общая зараженность в 2010 году по сравнению с предыдущими годами увеличилась в 5 раз. Зараженность самок разных родов комаров колебалась незначительно: Aedes 2,5±0,5 (1,7±0,4% D. repens, 0,6±0,3% D. immitis), Anopheles 2,6±1,5%, Culex 2,1±0,6%.

У комаров pp. Aedes и Anopheles отмечали двойное заражение D. repens и D. immitis. Двойного заражения у р. Culex не отмечали.

В 2011 году сбор комаров проводился в семи географических районах - двух микрорайонах Москвы (Выхино и Покровское-Стрешнево), двух районах ближайшего

13

Подмосковья (Щербинка, Зеленоград и Пирогово), удаленном Подмосковье (Шаховской район) и Воротынском районе Нижегородской области.

Сбор комаров в Зеленограде проводили в июне. Координаты места сбора 55°59'7"с.ш. и 37°12'5"в.д. Активность нападения комаров составила 5-10 особей в 15 мин, всего собрано 147 комаров.

Сборы материала в парке Покровское-Стрешнево проводили в июне. Активность нападения комаров составляла 2-3 особи за 15 минут. Недалеко от места сбора была замечена стая бродячих собак (8 особей). Координаты места сбора 55°44'55"с.ш. и 37°26'34"в.д.

В Шаховском комаров собирали в тех же местах, что и в 2006 — 2020 гг, всего было собрано 1159 самок комаров, зараженность которых значительно увеличилась по сравнению с 2010 годом - 3,36±0,53% (39 положительных проб).

В Воротынском районе Нижегородской области комаров собирали в том же месте, что и в 2010 году, в июле и августе. В этом районе была отмечена высокая зараженность с преобладанием D. immitis (D. repens - 1,89±0,63% и D. immitis - 2,95±0,78%).

За 3 года наблюдений в Щербинке впервые были обнаружены зараженные комары -в мае и сентябре (май, D. repens, сентябрь - 2 положительных пробы D. repens и 1 проба -D. immitis ).

В подмосковном дачном поселке Пирогово зараженных комаров не обнаружено. Возможно, это связано с тем, что в этом дачном поселке практически нет бездомных собак - всех домашних собак привозят только на лето, либо на более короткие сроки. Кроме того, в лесных участках, окружающих поселок, уже несколько десятилетий нет диких плотоядных животных.

В районе Выхино за годы исследования образовался очаг дирофиляриоза, показатели зараженности комаров в котором не менялись на протяжении 3-х последних лет исследования (зараженных комаров не обнаружено только в июле).

В парке Покровское-Стрешнево в июне г. Москвы зараженных комаров не обнаружено.

Общая (Diroßlaria spp.) зараженность комаров р. Aedes в 2011 году составила 2,74±0,37% Culex - 6,8±1,63% и Anopheles - 4,95±2,16%.

Общие результаты исследования комаров на зараженность дирофиляриями.

За период с 2006 по 2012 год нами было собрано и исследовано 6891 самок комаров, собранных в разных районах умеренно-климатической зоны России. Комары были объединены в 726 проб и проанализированы методом ПЦР на зараженность D. repens и D.

¡ттШ.ч. Общие результаты ПЦР-анализа комаров на дирофиляриоз в разные годы и в разных географических зонах представлены в табл. 5.

Таблица 5 - Зараженность днрофиляриямн комаров, собранных в Московском регионе, Нижегородской и Тверской областях.

Месяцы Годы Май Июнь Июль Август Сентябрь

2006 250 364 515 164 65

2007 140 459 139 147 145

2008 94 77 56 82 158

2009 8 16 23 60 37

2010 223 853 104 240 134

2011 250 815 700 310 233

Всего 965 2584 1537 1003 772

Положительных проб Зараженность, % о. гсрспь 8 / / 0,83 / ±0,23 21 / / 0,81 / ±0,18 9 / / 0,59 / ±0,19 38 / / 3,79 / ±0,6 15 / / 1,94 / ±0,5

О. |/Я7ЯЙМ 0 11 / /0,42 / ±0,12 6/ / 0,39 / ±0,16 и/ / / ±0,4 4/ / 0,52 / ±0,26

Всего 8 / /0,83 / ±0,23 32 / /1,24 / ±0,22 15 / / 0,98 / ±0,25 54 / /5,38 / ±0,71 19 / / 2,46 / ±0,56

Изучение комаров в разные месяцы теплого сезона года показало, что зараженные комары появляются, начиная с середины мая. В этот период комары заражены П. герет.

15

Комаров, зараженных D. immitis, в мае не зарегистрировано. Данный вид паразита регистрируется в комарах начиная с июня. Зараженность D. immitis практически одинакова в июне, июле, сентябре и в 3-4 раза возрастает в августе.

Общая зараженность обоими видами дирофилярий одинакова в мае, июне, июле (0,86%, 1,24% и 0,98% соответственно). В августе отмечается рост зараженности (5,38%), а в сентябре - снижение до 2,46%.

Так же следует отметить, что 2006-2008 гг зараженность собранных комаров дирофиляриями была практически одинаковой (0,44 - 0,49%). С 2009 года она значительно увеличилась: почти в пять раз в 2009 г, более, чем в 5 раз — в 2010 г, и в 7,5 раз - в 2011 г.

Показатели общей (Diro/ilaria spp.) зараженности всех собранных комаров составили: в 2006 г - 0,44±0,18%, в 2007 г - 0,49±0,22%, в 2008 г - 0,43±0,3%, в 2009 г -2,08±1,19%, в 2010 г - 2,32±0,38%, в 2011 г - 3,25±0,37%.

Таблица 6- Показатели зараженности трех родов комаров, собранных в 2009-2011 гг.

Годы Aedes spp. Anopheles spp. Culex spp. Всего

2009 25 54 65 144

2010 964 114 476 1554

2011 1970 101 237 2308

Всего 2959 269 778 4006

Положительные пробы

2009 1 1 1 3

2010 23 4 11 38

2011 54 5 16 75

Всего 78 10 28 116

Зараженность за три года, % 2,64±0,29 3,72±1,15 3,60±0,67 2,89±0,26

Из таблицы 6 следует, что показатели зараженности у самок р. Aedes показатели зараженности чуть меньше (2,64±0,29%) чем у самок pp. Culex и Anopheles. Известно, что

16

максимальная численность комаров р. Aedes отмечается в конце мая - июне, и зараженность комаров в этот период ниже, чем у комаров, собранных в августе, когда преобладают представители pp. Culex и Anopheles.

Подводя итоги исследования комаров разных родов за 3 года (2009-2011) на зараженность их дирофиляриями, можно констатировать, что для комаров pp. Culex и Anopheles получены схожие показатели (3,60 и 3,72% соответственно), и чуть меньшая зараженность отмечена у комаров рода комаров рода Aedes (2,64%). Зараженность D. repens составляла у комаров р. Culex - 2,31±0,54%, у Aedes - 1,86±0,25%, у Anopheles -3,35±1,1%, а зараженность D. immitis - у Culex составляла 1,29±0,4%, у Aedes -0,78±0,16%. У самок рода Anopheles зараженность D. immitis наблюдалась только в одной пробе, с двойным заражением.

По данным Алексеева А.Н. и Кондрашовой З.Н (1985) организм переносчика и паразита часто взаимодействуют друг с другом по сложной многоступенчатой схеме. Например, в слюне кровососущих членистоногих (Ае. Polinesiens, Сх. pipiens fatigans и др.) содержатся вещества, способствующие положительному хемотаксису микрофилярий к месту укуса. Это приводит к тому, что комары, поглощая всего 2 мм3 крови, в 2-12% заражаются даже тогда, когда в крови донора содержится не более одной микрофилярии на 20 мм3. Способствуют этому и антикоагулянты, содержащиеся в том или ином количестве в слюне комаров разных видов.

Количество микрофилярий в крови донора может существенно отличаться от числа жизнеспособных микрофилярий, попавших в мальпигиевы сосуды комара и доживших до инвазионной стадии.

Например, Culex pipiens, являясь эффективным переносчиком Wuchereria bancrofti в Азии, Африке, Вест-Индии и Южной Америке, не переносит Brugia malayi, или паразитирующую на кошках В. pahangi, несмотря на свое присутствие на эндемичных для этого паразита территориях Южной Азии. Так же Culex pipiens в Айове подвержен заражению W. bancrofti, однако он нечувствителен к заражению Brugia spp. из-за наличия внутреннего барьера в средней кишке, наносящего микрофиляриям Brugia spp. смертельные повреждения. После пероралыгого заражения Brugia, общая зараженность Сх. pipiens значительно меньше, чем комаров, восприимчивых к Brugia.

Ае. polynesiensis, становится более эффективным переносчиком при низкой плотности популяции микрофилярий, в ситуации, которая возникает после нескольких раундов применения филярицидных препаратов.

Таким образом, количество микрофилярий, попавших в среднюю кишку комара зависит от устройства вооружения пищеварительного тракта. Работа мышечных стенок цибариума и глотки у «вооруженных» родов комаров, существенно снижают количество неповрежденных паразитов (определенного размера), попадающих в желудок комара. Комары, не снабженные «филярицидными» структурами часто страдают из-за «перезаражения», а личинки микрофилярий в них могут не доживать до инвазионной стадии из-за перенаселения в комаре.

Чувствительные к заражению микрофиляриями виды комаров реагируют на заражение литическими изменениями цитоплазмы клеток эпителия кишечной стенки, из-за чего микрофилярии вязнут и не могут пройти в гемоцель. Возможно так же меланизирование и инкапсуляция личинок в мышечной или иной ткани. Это происходит, например, в организме Ае. trivitlatus с микрофиляриями D. immitis.

В связи с этим Алексеев и др. (1985) выделяет два типа переносчиков:

К первому типу относятся переносчики, регулирующие концентрацию личинок в крови за счет веществ слюны в сочетании с механическим уничтожением избытка микрофилярий и наличием механизма благоприятствования (гиперплазия клеток эпителия), обеспечивающего проникновение «откалиброваного» количества паразитов в гемоцель.

Второй тип характеризуется повышенной чувствительностью к минимальным количествам микрофилярий в крови, наличием оптимальных заражающих доз и защитной реакцией на «перезаражение» (лизис клеток).

Двойной механизм регулирования (концентрация-разрушение и разрушение -благоприятствование) позволяет переносчикам первого типа сохранять свою эффективность как в очагах с низкой зараженностью, так и в очагах с высокой. Переносчики же второго типа эффективны только в малозараженных очагах.

На основе вышеизложенного мы предполагаем, что наличие ДНК дирофилярий в организме комара р. Aedes свидетельствует, в первую очередь, о заражении самого комара, нежели о его эффективности в качестве переносчика дирофиляриоза. В связи с этим нельзя не отметить эффективность переносчика Сх. pipiens (первого типа), чей пик численности приходится на конец лета.

Сезонная динамика зараженности комаров дирофиляриозом.

Для отображения сезонной динамики зараженности были построены графики, в которых учитывались не только месяцы сбора комаров, но и два периода месяца: с 1 по 15 число и с 15 по 30-31.

Для оценки зараженности комаров мы использовали индекс MFIR (Minimum field infection rate), которым в настоящее время исследователи широко пользуются при изучении зараженности комаров малярией и филяриозами для удобства графического отображения.

Некоторый подъем количества зараженных комаров отмечался в середине июня в 2006-2007 гг. В этот период зараженных комаров было мало, в 2009 году в июне отмечалась одна зараженная проба из 8 исследованных комаров, однако, выборка комаров была незначительной (р > 0,05), поэтому окончательного вывода о повышении индекса MFIR мы не делаем.

Достоверное увеличение числа зараженных комаров на протяжении всех лет исследования (2006-2011 гг) отмечалось в августе, причем максимальная зараженность зарегистрирована в 2011 году (рис. 1).

Рисунок I - Зараженность кровососущих комаров на территории г. Москвы и Московской области за период с 2006 по 2011 гг, но месяцам.

Совместив данные (количество выявленных зараженных собак [Ястреб В.Б. (2007)] и полученные нами сезонные показатели зараженности комаров), можно установить, что самые высокие показатели (пики) зараженности собак по времени примерно на месяц опережают пики зараженности комаров (рис 2).

ЛГ

ЛГ

пики численности комдрон

пики гараженностп кпмапоь

собаки

с чикрофнлярпемнен соблки

без МИК,.оф1!ЛЯрИС*МНП

~^асть гибче,.

лГ т лГ гГ ¿пГ

ноябрь 3(К>брь январь февраль март апрель млн нюнь июль август сентябрь октябрь

Рисунок 2 - Совмещение пиков зараженности собак и комаров дирофиляриями. Сезонная динамика общего эпизоотического процесса при дирофиляриозе.

Обсуждение результатов и заключение. Из 14 обследованных районов Московского региона в пяти - Пирогово, Снегири, Клязьма, Покровское-Стрешнево, Балашиха - не зафиксировано ни одной положительной пробы, свидетельствующей о зараженности комаров дирофиляриями. В остальных девяти районах зарегистрирована зараженность комаров, показатели которой варьировали от 1,2 до 4,23% (табл. 7). Выборку комаров, сделанную в Тверской области (30 шт), в силу ее малых размеров, мы в эту статистику не включали, как статистически недостоверную.

С целью установления возможных факторов, влияющих на зараженность комаров, нами выбраны два района (Шаховской район Московской области и Воротынский район Нижегородской области), удаленных друг от друга на расстояние около 700 км и расположенных на разной широте. В этих районах на протяжении двух последних лет исследований были собраны достоверные выборки комаров (см. табл. 4). Общая зараженность комаров составила: в Воротынском районе Нижегородской области - 4,23, при этом А гереж - 1, 47%, а О. \mmitis - 2,46%, Шаховском районе общая зараженность комаров составила 1,95%, при этом О. герет - 1, 44, а О. \mmitis - 0, 5%.

Таблица 7 - Характеристики зараженных районов.

Районы Координаты Зараженность, % Активность нападения комаров Наличие собак

Широта Долгота D. repens D. immitis Общая

Щербинка 55°30'12" 37°33'11" 0,9 0,3 1,2±0,6 + 1 1 1 1

Капотня 55°40'57" 37°49'41" 1,3±1,3 0 1,3±1,3 + ++

Жулебино 55°41'55" 37°49'41" 1,94±1,35 0 1,94±1,35 + ++

Выхино 55°42'44" 37°48'19" 1,5±0,38 0,2±0,14 1,7±0,41 -Н- +

Истра 55°55'9" 36°54'7" 1,4±0,98 0 1,4±0,98 + +

Шаховской р-н 55°58'40" 35°41'54" 1,5±0,21 0,5±0,12 1,95±0,24 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

Зеленоград 55°597" 37°12'5" 1,36±0,96 0 1,3б±0,96 + +

Нижегор. обл. 56°9'34" 45049.4 г. 1,77±0,48 2,46±0,57 4,23±0,74 1 1 1 1 1 +++++

Для анализа наших данных мы выбрали три фактора влияющих на распространение дирофилярий и пригодных для графического отображения степени риска заражения: 1. Присутствие переносчика.

Практически все самки комаров, собранные нами с конца мая по июль, относились к р. Aedes, и только со второй половины июля по сентябрь их количество уменьшалось, уступая комарам pp. Culex и Anopheles, хотя самки комаров р. Aedes в небольших количествах попадались и до конца сентября.

Показатели общей зараженности всех трех родов комаров были практически одинаковы. Однако первый пик зараженности (начало лета) приходился, в основном, на период массового вылета комаров р. Aedes, а второй (август) совпадал с преобладанием комаров родов Culex и Anopheles.

Очевидно, что на динамику зараженности, как один из факторов, может влиять биология комаров, обладающих различными циклами сезонной актвности. Например, уменьшение зараженности комаров с начала июля до начала августа может в некоторой степени объясняться частичной гибелью первой генерации самок р. Aedes и массовым выплодом еще не успевших заразиться самок р. Culex.

Таким образом, в передаче дирофиляриоза в изученных нами регионах участвуют все три рода комаров, сменяя друг друга в течение сезона.

2. Температура.

Порога +14°С, необходимого для развития дирофилярий в комаре, среднесуточные температуры в Средней полосе России достигают примерно к последней декаде мая. Среднемесячные температуры в исследованных нами районах различаются примерно на 0,5-1"С.

В Воротынском районе Нижегородской области на протяжении всего летнего сезона средняя температура примерно на 1,5 градуса выше, чем в Шаховском районе и на градус выше, чем в Москве и ближайшем Подмосковье. Мы предполагаем, что с этим фактором может быть связано преобладание зараженности комаров D. immitis. G. Cancrini и др (2007). предполагают, что D. immitis, чей период развития в организме комара дольше, чем у D. repens, требует для своего развития более высоких температур 3. Наличие плотоядных.

Два обследованных района (Воротынский и Шаховской) расположены в сельской местности, где практически в каждом дворе имеется одна или несколько собак. В этих районах так же отмечалось наибольшее число комаров, активность нападения которых в период лета составила в среднем от 10 до 30 особей за 15 мин.

На основании вышеизложенных данных мы предполагаем, что динамика эпизоотического процесса может выглядеть следующим образом: взрослые дирофилярии, находящиеся в организме собак, приступают к размножению уже в январе-феврале. К марту регистрируется довольно много собак с микрофиляриемимей в апреле содержание микрофилярий в крови собак достигает пика. В конце апреля - мае заражаются первые комары р. Aedes, чей пик численности приходится на период май-июнь. При избытке микрофилярий в доноре большая часть комаров может р. Aedes может погибнуть, а микрофилярии, попавшие в организм комара в минимальном количестве, доживают до инвазионной стадии. При этом, в силу климатических особенностей Средней полосы России, более благоприятные условия для развития имеют микрофилярии D. repens, которые менее требовательны к показателям температуры воздуха и обладают более коротким циклом развития в комаре (13-14 дней против 15-17 у D. immitis). С последней декады мая по середину июня наблюдается некоторый подъем зараженности в случайных выборках комаров, взятых в неблагополучных по дирофиляриозу районах. К середине июля большая часть зараженных комаров р. Aedes гибнет, а комары р. Culex, вылетевшие в конце июня, заражаются мало, потому что микрофиляриемия у собак в этот период резко падает. В июле, при максимальной численности pp. Culex и Anopheles, наблюдается пик микрофиляриемии у собак, вследствие чего заражается значительно больше комаров, чем в мае-июне, и в августе в некоторых районах зараженность комаров может достигать

22

12%. В этот период микрофиляриемия у зараженных собак спадает значительно медленнее, позволяя, таким образом, заразиться наибольшему числу самок комаров. По этой причине мы считаем, что самым опасным периодом для заражения человека дирофиляриозом в Средней полосе России, очевидно, является конец лета и начало осени.

Выводы

1. При отработке методики постановки ПЦР были изменены:

а) режимы постановки реакции с праймерами D. repens: увеличено время начальной денатурации с 30 с до 5 мин, повышена температура денатурации в цикле с 55 до 94°С, температура отжига понижена до 55°С, а время увеличено с 25 до 30с. Время элонгации сокращено до 1 мин. Добавлен период добавочной элонгации 72°С - 5 мин.

б) в режим постановки ПЦР с праймерами D. immitis добавлена фаза элонгации 72°С — 5 мин.

2. Разработанный метод применим для диагностики дирофиляриоза в крови дефинитивного хозяина (человека и плотоядных), а так же для тестирования комаров на зараженность дирофиляриями;

3. Уровень зараженности комаров различных родов отличался незначительно -Aedes - 2,64±0,29, Anopheles - 3,72±1,15 и Culex 3,59±0,7%;

4. Показатели зараженности за время исследования значительно возросли - с 0,44±0,18% в 2006 г до 3,25±0,37% в 2011г;

5. Изучение зараженности комаров дирофиляриями разных видов показало преобладание D. immitis в Нижегородской области и D. repens - в Московской;

6. Максимальная зараженность комаров в большинстве исследованных районов наблюдалась в период с середины августа до середины сентября и составила в среднем за все годы 8,77%. Зараженность в начале лета (май-июнь) составила в среднем за все годы 2,65%.

Практические рекомендации

1. Молекулярно-биологическая методика обнаружения дирофилярий может использоваться как при проведении санитарно-эпидемиологического надзора для выявления патогена в переносчике, так и для диагностики возбудителя дирофиляриоза в клинико-диагностических лабораториях. Она так же позволит более оперативно и с наименьшими затратами оценивать зараженность комаров в исследуемом районе.

2. Наивысшие показатели зараженности комаров в Средней полосе России наблюдаются с середины августа до середины сентября. Начиная со второй половины августа вероятность заражения человека дирофиляриозом в Средней полосе России

повышается. Это нужно учитывать как при диагностике дирофиляриоза, так и при проведении профилактических мероприятий.

3. Для предотвращения ухудшения эпидемиологической ситуации и эффективного проведения важнейших санитарно-эпидемиологических мероприятий необходим непрерывный и своевременный обмен информацией о сложившейся эпизоотической и эпидемиологической ситуации между ветеринарной и медико-санитарной службами.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Сергиев В.П., Лебедева М.Н., Фролова A.A., Морозов E.H., Ракова В.М. и др. Паразитологические исследования (глава), Методики клинических лабораторных исследований. Справочное пособие. - М. - 2009. - Лабора. - Т. 3, гл. 3. - С. 477-493.

2. Супряга В.Г., Дарченкова H.H., Бронштейн A.M., Лебедева М.Н., Ястреб В.Б., Иванова Т.Н., Гузеева М.В., Тимошенко Н.И., Ракова В.М., Жукова Л.А., Дирофиляриозы в Московском регионе - зоне низкого риска передачи инвазии // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. - 2011. - №1, С. 3-7.

3. Ракова В.М. «Возвращающиеся зоонозы: дирофиляриозы Средиземноморья» (обзорная статья) // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. - М. - 2011. - №3, С. 2-5.

4. Федянина Л.В., Фролова A.A., Плющева Г.Л. Чернышенко А.И., Морозов E.H., Ракова В.М. - Случаи, подтверждающие концепцию, что человек - факультативный хозяин Diroßlaria repens. // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. -2011,-№4, С. 37-38.

5. Федянина Л.В., Шатова С.М., Ракова В.М., Шайтанов В.М, Супряга В.Г., Фролова A.A., Морозова Л.Ф. Микрофиляриемия, вызваная Diroßlaria repens Raiet et Henry,1911, у человека. Описание случая. // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. - 2013. - №1. - С. 3-7.

Список сокращений:

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

Мкр - микрорайон;

bp (basic pair) - нуклеотидные пары(нп);

с - секунды.

Подписано в печать 16.09.2013г. Формат А5 Печать цифровая. Тираж 100 Экз. Заказ № 0819 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-кт, д.28 Тел. 8-495-782-88-39

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ракова, Вера Михайловна, Москва

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ ПЕРВЫЙ МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. И.М. СЕЧЕНОВА, ИМПИТМ ИМ. Е.И. МАРЦИНОВСКОГО

04201362521 гт

На правах рукописи

Ракова Вера Михайловна

МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ДИРОФИЛЯРИОЗА В ОРГАНИЗМАХ ДЕФИНИТИВНОГО ХОЗЯИНА И ПЕРЕНОСЧИКОВ

03.02.11 - паразитология 03.02.05 - энтомология

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: кандидат медицинских наук E.H. Морозов, доктор биологических наук Л.А. Ганушкина

Москва 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список принятых сокращений:........................................................................4

ВВЕДЕНИЕ..................................................................................................................5

Научная новизна................................................................................................7

Практическая значимость.................................................................................7

Внедрение в практику.......................................................................................8

Положения, выносимые на защиту..................................................................8

Публикации........................................................................................................9

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...........................................................................10

1.1 Определение и ситематическое положение возбудителя.....................10

1.2 Морфология и биология возбудителя дирофиляриоза..........................10

1.3 Дирофиляриоз как зооантропоноз...........................................................12

1.3.1 История изучения дирофиляриоза........................................................12

1.3.2 Дирофиляриоз плотоядных..................................................................14

1.3.3 Дирофиляриоз человека.........................................................................15

1.4 Проблема дирофиляриоза в мире - распространение эпизоотология, эпидемиология.................................................................................................17

1.5 Дирофиляриоз в России и странах СНГ..................................................21

1.6. Методы диагностики дирофиляриоза....................................................31

Методы качественной диагностики...............................................................31

Методы количественой диагностики............................................................32

Иммунологические методы............................................................................32

Методы дифференциальной диагностики....................................................34

1.7 Переносчики дирофиляриоза...................................................................35

1.8 Ксеномониторинг......................................................................................37

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ................................39

2.1 Материалы..................................................................................................39

2.1.1 Источник ДНК.......................................................................................39

2.1.2 Реактивы и оборудование для выделения ДНК..................................41

2.1.3 Реактивы и оборудование для постановки ПНР.................................44

2.1.4 Реактивы для электрофореза.................................................................45

2.1.5 Оборудование.........................................................................................45

2.2 Методы.......................................................................................................46

2.2.1 Постановка ПЦР.....................................................................................46

2.3. Исследование комаров.............................................................................49

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.......................54

3.1 Отработка параметров реакции................................................................54

3.2 Сбор комаров и краткая характеристика мест сбора.............................57

3.3 Зараженность комаров дирофиляриями по годам.................................65

3.3.1 Исследование комаров на зараженность дирофиляриями в 2006 году ...........................................................................................................................65

3.3.2 Исследование комаров на зараженность дирофиляриями в 2007 году ...........................................................................................................................71

3.3.3 Исследование комаров на зараженность дирофиляриями в 2008 году ...........................................................................................................................73

3.3.4 Исследование комаров на зараженность дирофиляриями в 2009 году ...........................................................................................................................77

3.3.5 Результаты исследования комаров на зараженность дирофиляриями

в 2010 году........................................................................................................79

3.3.6 Результаты исследования комаров на зараженность дирофиляриями в 2011 году........................................................................................................83

3.4 Анализ результатов исследования комаров на зараженность дирофиляриями................................................................................................88

3.5 Сезонная динамика зараженности комаров дирофиляриями...............96

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ.......................104

ВЫВОДЫ.................................................................................................................112

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................................................115

I

1

Список принятых сокращений:

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота; РНК - рибонуклеиновая кислота; ПЦР — полимеразная цепная реакция; Регистр, - регистрировали; Мкр - микрорайон; с - секунды;

pm/ml - пикомоль/миллилитр;

bp («basic pair» или «нп», нуклеотидных пар) - единица измерения фрагментов нуклеотидной цепи в ПЦР-продукте.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

В последние годы дирофиляриоз все чаще регистрируют в центральных и северных областях России. Это единственный из филяриозов, способный распространяться в умеренном климате. До 2005 года, когда случаи дирофиляриоза были выявлены более, чем у 200 жителей 28 эндемичных территорий, его рассматривали как «вновь возникающую» паразитарную болезнь [2; 76].

С 1997 г. в группе т.н. «редких» гельминтозов, заболеваемость которыми не превышает 1,0 на 100 тыс. населения, случаи дирофиляриоза составляли примерно 15% [31]. За период 1915-2008 гг в России зарегистрировали 564 случая дирофиляриоза [35] (из них только в 2004 году - около 300 случаев [87]), а к 2011 году число зарегистрированных случаев дирофиляриоза в России возросло до 701 [77].

Дефинитивными хозяевами дирофилярий могут быть многие виды плотоядных сем. Canidae, Felidae и др., иногда человека, который является факультативным хозяином, а переносчиками - в основном, кровососущие комары сем. Culicidae родов Aedes, Anopheles, Culex и др.

Диагностическое исследование проводят после появления клинических признаков дирофиляриоза у людей и плотоядных, поэтому меры борьбы и профилактики неизменно запаздывают. Молекулярно-биологические методы обнаружения возбудителя в организме переносчика позволяют получить данные об общей распространенности, плотности распределения инвазии, сезонности, а так же оценить вероятность заражения человека дирофиляриями в тот или иной период теплого сезона года. С 2009 года исследования подобного рода начали активно проводить за рубежом, в местах, неблагополучных по дирофиляриозу, и граничащих с эндемичными районами

[121; 152]. Внедрение в практику молекулярно-биологических методов исследования переносчиков способствует получению новых данных о распространенности этого заболевания, а в частных случаях - облегчить его диагностику.

Цель исследования:

обнаружение дирофилярий молекулярно-биологическими методами в организмах дефинитивного хозяина и переносчиков (комаров pp. Culex, Aedes и Anopheles) для оценки пораженности их дирофиляриями в разных регионах России.

Задачи исследования:

1. Отработать методику постановки ПЦР, включающую подбор праймеров для идентификации возбудителя дирофиляриоза, выделение ДНК дирофилярий из различных биологических сред, подобрать и обосновать оптимальные условия постановки реакции.

2. Провести лабораторные исследования по идентификации дирофилярий в зараженных объектах: дефинитивном хозяине и переносчике.

3. Определить зараженность комаров pp. Aedes, Culex и Anopheles, собранных в различных регионах Средней полосы России. Изучить сезонную зараженность комаров видами дирофилярий Dirofilaria repens, D. immitis.

4. Определить или уточнить природно-климатические и социально-экономические факторы, влияющие на распространение дирофиляриоза.

Научная новизна

Впервые определен уровень зараженности переносчиков дирофиляриоза -комаров pp. Aedes, Culex и Anopheles в течение всего периода их активности для трех областей. Максимальный уровень зараженности комаров в Московской области составил 9,29% (август-сентябрь 2011 г), Нижегородской - 6,78% (август 2011 г), в Тверской - 6,67% (июнь 2010 г). Средняя зараженность комаров в исследуемых в 2006-2011 гг составила 1,85%, из них D. repens -1,33%, D. immitis - 0,52%.

Уровень зараженности комаров в 2009 - 2011 годах увеличился до 3,25%, что значительно выше, чем в 2006-2008 гг (0,44%).

Впервые было установлено, что комары pp. Culex и Anopheles по степени зараженности дирофиляриями отличались неначительно: средняя зараженность Culex с 2009 по 2011 год составила 3,6%, Anopheles - 3,72%, у Aedes - 2,64%.

При исследованиях, проведенных с 2006 по 2011 год, впервые установлена наибольшая зараженность комаров дирофиляриями, которая была отмечена со второй декады августа до середины сентября.

Практическая значимость

Оптимизированы условия амплификации ДНК дирофилярий при постановке ПНР на различном биологическом материале («Методики клинических лабораторных исследований», Москва, Набора, 2009, с. 477-493).

В результате проведенных исследований разработан и внедрен в практику клинико-диагностической лаборатории Первого МГМУ им. И. М. Сеченова метод ПЦР-диагностики D. repens и D. immitis.

Впервые в России установлена возможность и эффективность молекулярно-биологического метода скрининга зараженности самок комаров (ксеномониторинга).

Впервые получены показатели зараженности комаров 2 видами дирофилярий: в Московской области зараженность D. repetís составила 1,3%, D. immitis — 0,3%; в Нижегородской области зараженность D. repens составила 1,77%, D. immitis 2,46%, в Тверской области - 6,67% (D. immitis).

Внедрение в практику

Разработанные методики и результаты исследований используются в учебном процессе на кафедре тропической медицины и паразитарных болезней МПФ ППО ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова. Утверждены 25 февраля 2013 г.

Положения, выносимые на защиту

1. Оптимизирован режим выделения ДНК и условий ПЦР с целью идентификации D. repens и D. immitis в организме дефинитивного хозяина и переносчика, который впервые позволил дальнейшее использование адаптированной ПЦР для мониторинга ситуации и оценки экстенсивности инвазии на исследуемой территории.

2. На основе ксеномониторинга получены данные о зараженности комаров дирофиляриями в Москве и Московской области за 2006-2011 гг, в Нижегородской (2010-2011гг) и Тверской (20 Юг). Установлено, что с 2006 года по 2011 зараженность комаров дирофиляриями увеличилась почти в семь раз. Сезонный пик зараженности комаров дирофиляриями зарегистрирован во второй половине августа. Доля D. immitis у зараженных дирофиляриями

й}

комаров в правобережной части Нижегородской области выше, чем в Московской области.

Апробация работы

Результаты исследований были доложены на коллоквиумах ИМПиТМ им. Е.И. Марциновского Первого МГМУ им. И.М. Сеченова 27.10.2010 г и 27.06.2012 г., а также доложены на конференции 21-23 мая 2013 г «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» ВИГИС им. К.И. Скрябина.

Публикации

По результатам проведенных исследований опубликовано 3 статьи в рецензируемых научных издания, включенных в перечень ВАК России, и 2 - в периодических научных изданиях.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 132 страницах машинописного текста и состоит из 5 глав: введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы и приложений. Список литературы включает 213 источников: 108 отечественных и 105 зарубежных. Текст иллюстрирован 21 таблицей и 17 рисунками.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Определение и ситематическое положение возбудителя

Дирофиляриоз — гельминтоз, вызываемый нематодами рода Dirofilaria, вызывающий поражения глаз, подкожной жировой клетчатки и внутренних органов. Дирофилярии относятся к подотряду Filariata (Skrjabin, 1915), семейству Onchocercidae (Leiper, 1911), роду Dirofilaria (Railliet et Henry, 1911). В этот род входят более 27 видов, из которых в России паразитируют два - у плотоядных D. immitis (Leidy, 1856) и у плотоядных и человека - D. repens (Railiet et Henry, 1911).

Известно около 20 видов комаров, которые могут являться промежуточными хозяевами D. repens и около 60 видов комаров, способных быть промежуточными хозяевами для D. immitis [153].

1.2 Морфология и биология возбудителя дирофиляриоза

Дирофилярия - нитевидная нематода белого цвета. Длина тела самки D. repens - до 150 мм, ширина 0,447 - 0,552 мм. Кутикула с четкой продольной и слабой поперечной исчерченностью. Рот простой, ротовая капсула рудиментарная. Нервное кольцо на расстоянии 0, 305-0,368 мм [73] от головного конца, вульва - на расстоянии 1,84 - 1,92 мм (по другим данным -1,16 - 1,62 мм [82]) от головного конца. Длина тела самца - 40 - 58 (по другим данным - до 70[82]) мм, ширина 0, 32-0,41мм [73]. Нервное кольцо на расстоянии 0, 24 мм от головного конца. Спикулы неравные. Длина правой спикулы 0,13, левой - 0, 30 мм. Длина микрофилярий составляет 640 - 1080 цм [164].

Длина тела самца D. immitis - 120-180 мм, толщина 1,124 - 1,286 мм. Хвостовой конец снабжен двумя боковыми крыльями. Спикулы неравные, расширены на проксимальном и заострены на дистальном концах. Имеются 4-5 стебельчатых хвостовых преанальных сосочков с правой и 3-4 — с левой стороны. Количество постанальных — от 3 до 6 пар. Длина тела самки D. immitis 250-300, максимальная ширина 0,75 - 1, 514 мм. Хвостовой конец закруглен. Анус открывается субтерминально. Вульва располагается на расстоянии 1,651 -2,272 мм от головного конца. Длина микрофилярий 0,22 - 0,29, ширина 0,005 -0, 007 мм или 800 - 1040 jim [164]. Микрофилярии без чехлика [203]. Головной конец закругленный, задний - заострен.

Цикл развития D. immitis

Цикл развития дирофилярии впервые описан в 1900 году [136].

Продолжительность жизни дирофилярии в организме собаки - более 2,5 лет. С момента попадания в организм дефинитивного хозяина до наступления половой зрелости дирофилярий проходит 6-9 месяцев. Взрослые дирофилярии локализуются в правом желудочке сердца собак и легочной артерии. За 7-9 месяцев гельминты достигают половой зрелости, после чего спариваются и продуцируют микрофилярий [53].

При укусе комара микрофилярии попадают в желудок и кишечник насекомого, откуда мигрируют в мальпигиевы сосуды. При температуре 26°С и 80% влажности развитие до инвазинной стадии длится примерно 15-17 дней [202]. При температуре 27,8°С микрофилярии в организме комаров достигают инвазионной стадии через 10 дней, а при температуре 17,8°С срок их развития увеличивается до 48 дней [146; 147].

Первая линька происходит на 6-й день, после чего микрофилярии выходят в просвет мальпигиевых сосудов, где линяют второй раз (13-14 день) и превращаются в инвазионные личинки, которые мигрируют в голову комара.

«Ii - ,

1 1

При сильной зараженности процент выживаемости комаров значительно снижается [141].

На 13-14 день инвазионные личинки проникают в полость тела и ротовые органы комаров. В хоботке одного комара может присутствовать 7-9 микрофилярий, при благоприятных условиях сохраняющих жизнеспособность не менее 15 дней. При контакте с теплокровным животным в момент укуса микрофилярии активизируются и через разрыв нижней губы насекомого проникают в ранку и продолжают развитие до половозрелой стадии только в организме специфического дефинитивного хозяина [19].

Цикл развития D. repens

Цикл развития D. repens аналогичен циклу развития D. immitis, но взрослые дирофилярии локализуются в подкожной клетчатке. Кроме того, препатентный период развития D. repens в организме собак составляет примерно 26 недель, что значительно короче периода развития D. immitis. Половой зрелости D. repens достигают через 6-8 месяцев [53].

Продолжительность жизни микрофилярий составляет 2 - 2,5 года. По данным W.L. Newton (1968) [165], микрофиляриемия может наблюдаться в течение 7,5 лет после заражения, однако J.D. Dunsmore, S.F.Shaw (1990) [128] считают, что микрофилярии живут в крови не больше полугода. Однако каждая генерация микрофилярий живет, морфологически не изменяясь и накапливаясь в крови дефинитивного хозяина.

1.3 Дирофиляриоз как зооантропоноз

1.3.1 История изучения дирофиляриоза

Впервые дирофиляриоз у человека был описан португальским врачом Amato Lusitano (1511—1568), удалившим паразита из глаза трехлетней

i . , ' М i .

пациентки и описавший его в своем труде «Curationum medicinalium Centuria séptima». Можно предположить, что речь идет о D. repens. Схожий случай вскоре был описан итальянским учёным Ulisse Aldrovandi в книге «De animalibus insectis» (1602) [113; 174]. В 1867 итальянский врач Angelo Pase (Палермо) обнаружил паразита в кисте верхнего века девятилетнего мальчика [196]. Первый документированный случай описан в 1885 в Италии [108]. По другим сведениям первый случай обнаружения дирофилярии в сердце диагностирован у мальчика в Бразилии в 1887 году [10].

На протяжении 400 лет этот гельминт был известен под названием Filaría или Dirofilaria conjunctiva - по месту наиболее частой локализации. И только в начале 20 века гельминт был определен как Dirofilaria repens (Robinson N.B. et al., 1977) [189].

О первом случае микрофиляриемии у человека сообщали J.P. Nozáis, О. Bain, М. Gentilini в 1994 году, а первый случай обнаружения взрослых дирофилярий обоего пола у 3-х летнего мальчика в Шри-Ланке описали S.D. Fernando, R.I. Mamulla, W.A. de Silva в 2000 году [13