Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ СОКРАТИТЕЛЬНОГО ЧИСЛА ПИОЦИНА R1

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ СОКРАТИТЕЛЬНОГО ЧИСЛА ПИОЦИНА R1"

AK Asidla H A 7 1 СССР ОДОНА 1ЕШША ВВОГИТЛ БКОШШ ИМ. А.В.БАХА

На правах pjvoino«

mXHH Акдрай Шгореич

И01Ш1ЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ СОКРАТИТЕ!ЬНОГО 4X111 ШОЦША 81

03*00.0% - баохогкчаетех яшм

Авторе фв рас дмоертацш ва оолсмшжо учекоМ огвпеш

жаядкдаса бвмогачвокшс boje t

■овоа - I960 г.

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДШ ЛЕНИНА, ИНСТИТУТ БИОХИМИИ ИМ. ¿»Н.ВАХА

На прав от рукописи

ТУРКИН Андрей Игоревич

МОЛ ВЕЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ СОКРАТИТЕЛЬНОГО ЧКХ1А ШЮЦИНА В1

03*00.04 - биологическая хшя

А в т о р в фе р а * диссертации на соискание ученой отвпввм жандщдата биологических наук

Москва - 1960 г.

Центр, каугааз Сн5л :атсга Мш. с^д. Я;й8Еа пл^з, шд. км. К. А. Твиурлз^а КЛтЖШЗ

Работа выполнена в лаборатории молекулярной организации бнояогичесма структур Института биохимии им. А.В.БахаАН СССР в отдела функциональной биохимии Сиоволииеров Нежфакультегской проблемной НИЛ молекулярной биологии в Сиооргавмческой химии ш. академика А.Н.Балозерокого 1117*

Научные руководители: доктор биологических наук« профессор

Б.ф.йоглааов кандидат биологических наук .

А.В.Иепшва

Официальные оппоненты: доктор биологических лауя, профессор

И.Г.Атабеков кандидат биологических ваук Р.А.Волкова

Ведуяая организация: Институт вирусологии им. Д.И»Ивановского АМН СССР

- 8зщнта диссертации состоится " 22 " мая___ 1980г.

в " Ю.ЗО " час» ка заседании специализированного совета (К 002.96.01) поврисужденя» ученой степени кандидата наук г Институте биохимииим. ¿.Ц.Баха АН СССР (II707I, Москва, Леневский проспект 33* ворп* 2)

. С диссертацией мо*но ознакомиться в библиотеке бяологвчео-кой литературы АН СССР (ЛенвновиЯ проспект 33» корп..X)

Автореферат разослан * * ' ■ 1580 г.

Ученый секретарь специализированного совета^ : кандидат бвологичеоких ваук^ :

M.0*UwwasoB

Актуальность проблема f Изучение молекулярных овнов двойная является одной иэ актуальных проблем современной биология. В настоящее врайи известии несколько типов биологического движения, такие как мцвечное сокращение, движение бахториалышх кгуткков, движение ресничек и другие, Определенный интерес представляет собой совратительный акт чахла бактериофага - наиболее просто организованного двигательного аппарата. 8а последнее девятилетне бил проведен цалыЙ ряд исследований, посвщенных изучении тонкой структуры и механизма сокращения чехлов бактериофагов Т-чотяоИ серии СЛсч>с/у,1971г IW3;Asnos, l¥lb\Sm¡+h е/ Tsc.hofi>J> Однако изучение сократительного чехла s составе целой частица бактериофага затруднено наличкой у него других структурных компонентов, в частности, головки, которая составляет около 90$ от общей пассы частицы. В онясх в в:им существенный интерес вызывают структуры* морфологически сходные о хвостом бактериофага, но лишенные других структурных компонентов. Таким объектом является пиоциа Я i - бактерицидный продукг итаика PI5 Ps ае.-ги^по£<к (рис. I). Так ке как и хвостовой отросток бактериофага пиоцин Я d состоит иэ стержня« длинной 1200 1 и диаметром 80 А, баэальной пластинки диаметром 190 X и толщиной 70 А, коротких фибрилл и чехла* Чехол шоцина EÍ» как и чехол бактериофагов, обладает способностьи к необратимому сокращении. В несокращенной состоянии чехол ниоцина Rí представляет собой полый цилиндр длиной ЮЮ I, тшешши дяшетрои 150 £ а внутренним 80 I , состоящий иэ белковых субьодпннц, уло-кекяых в 34 диска по 6 субъедиидц в каждой диске. Ори сокращения длина чахла уиапыаеток доАбй А,внешний диаметр увеличивается до. 180 X, а внутренний остается бее изменений (рис* 2)*

Цель и задачи работы. Деаьа данной работы явилось изучаете тонкой структуры чехла пиоцана Ri и его двигательного процесса -необратимого сокращения. 5 соответствии с этой целы» были поставлены следуюдие ведачн:

1. Разработать метод выделения ниоцина Ri в преферативных количествах;

2. Научить размер, белковый состав и стдотуру сократительного чехла пгоциад Ri .

3. Научать возиохние' структурны« перестройки в чехле пяоци-на Ri яри его сокрацеюы.

Ватчвая новизна работы. На основании проведанных жссдздова-ввй разработав в применен метод индукция i выделенля бактерицидного агента легиулело. пиоцина R-t . С помощь» несома елек-трофореэа в аодищриланидном геле показано, что оовратихельннй алпараг пноцлна Л i соогоит аз одною типа белковых оубъединмц. Обнаружено присутствие нуклеотидфоофаткых соединений (АД®) я неорганического фосфата в эквимолярных соотношениях в соотав» сократительного чехла пиоцина H-i, Используя расочеш спектров КД, определены изменения вторичной структуры пиоцина R1 при оокраце-ввн его чехла. Выполнена трехмерная оптическая реконструкция в на ее основании предложена трехмерная модель чехаа пиоцина Ш • Практическое значение работы ашшэчаетоя в том» что предложенный метод индукции а выделения гшоцкна Ri может бить ирака-нен дая получения других видов пиоцинов, используеиыг для классификации и идентификации различных гидов в итаммов рода PstKdb-топлс£йс% многие из которых патогенны* как в медицинских целях« тая в в целях свстеиатш-д (пиоцинотшшрование).

Полученные данные о структуре и функциональной активности сократительного чехла плоцина дают дополнительные сведения об одном из типов биологического движения и могут быть попользованы при изучении аволяции двигательных систем.

Результаты и методические подходы, разработанные при шпох-нзнии настоящей работы, используются наыи в дальнейших исследованиях структурно-функциональной организации бактериальных вирусов*

, Структура в обьеи диссертации. Диссертация состоят из введения, ннтератрувогс обзора, описания методов в материалов после* дования, взлокения результатов, их обсуждения, выводов в епиока цитируемой литературы. Работе вхзочает 115 страниц машинописного текста я содержит XI таблиц в 16 рисунков. Библиография вхлвчаат Z3Q наименований, в том числе 115 иностранных работ.

Апробация работы, результаты исследований доложена на Язжду-народнок симпозиуме "Сборка биологических в предбиологяческвх структур* (Поезда, 1979 г.), на семинарах Института биохимия имени Веха АН СССР* Материалы дассортадия опубликованы в трех печатных работах«

I. ОБЩ; И 1ДО0ВЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Бахтериалъныо атвмид. В качестве пяоциндродучврувдаго немка нсподьзовнля ахами PJ5", а в качестве пмцянчхвотвятельного -PiV 'fis. aetti.^iпе>ла.

Среда: a) G -среда: а0 г гдютамата ыатряя; 5 г глюкозы; 0,12 р ; 5,63 Т^НРО^К^О \ 0,25 Р 0,5 г

дрожжевого экстракта, i а воды.

<3) мясо-паатоаный Судьов (Ш1Б): а г питательнаго бутоояа; 5 г Л^а. C¿ i I л вода. ■

Fue. I. Элемронвая михрофотография чаотнц пиоцава R¿ •

Вырадиааша пводяаогвяаого втаика P¡$Pí.<x¿i<sfiftósa, и кн-^укцжя биосинтеза ^ моцниа £ Í проводим» следутдим образом*. £00 м швокудятввырададам 7,5 чаоов при37°С а перосевалв в 2,5 х средн. Культуру виракыада в магресах, содоржадях 300 нх среда, е поддожкоХ вз ыйсопоптонаого агира оря 37°С я воотоякаок пвреиеялваш». Черпа Z часа в культуру воО&лдяла ивтоаицвн С

(г нг/д). Через 3 часа после добавления интомицина С для усиления начавшегося лизлса в культуру добавляли хлорофос (3 ил на 2,5 л среды) к оставляли на ночь при 4°С, Осаждение бактериальной кассы проводили на центрифуге при ГСООО 9 г течение 30 минут.

Вырадиваниа пиодинчувствительного втамма ЙМ Рх. проводили следующим образом: 200 из яиокуляте выращивали в течение ?»5 часов при 37°С и пересевали в 10 литров среди» Варавдва-виа проводили яри 37°С и активном аэрирования в течение 3 часов* Полученную биомассу осаждали центрифугированием ори 6000 9 30 шш*

Выделение и очистка пвоцина Ив лизата» освобожденного ох бактериальной массы и обработааного ДНКазой (I иг/ил, 37 °С, I чае), высаливали все белки насыщенным раствором сульфата аммо-вия г/л) и осаждали ори 10000 £ 40 шш. Осадок диализоваля против 0*01 11, трис-ВСХ буфера рН 7,5» содержаяего 0,1 II ,

подвергали двффе ревциальному центрифугировании. Последующую очист-ху пяоцияа проводили о помощь» методов хроматографии ва колота о ДЕАЕ целлюлозой и центрифугирования в градиенте плотности сахарозн (13—2656) .

Биолпгичесаоз гесуироваалэ пиоцина проводили по методу Жалоба (7а«>^1953) и »кслреос методом (Горяов и др., 1969),

Внделвиие уветочтас рецепторов пиоцивай^ проводили о по-иодью модифицированного метода выделения <2-антигена ( Сз <»/а<?.,1973).

Выделение И счистку чегяов пиоцина проводили по методу Си (Ум/, 2971) и предложенному нами методу. Для этого таотув фракция пиоцква подщелачивали Z и Л'а, ОЦ до рН 13 И тврио-стамроваля 15 минус при 37°С. В эти условиях все составное чао-ги сиодняа £ диссоциировали до субыздвниц в лишь чехлы сохраняли свое структуру. Очистку чехлов проводили с помощью метода дифферэпця&яышго центрифугирования и центрифугирования в градиенте плотности сахарозы {13-26?),, Оценку,степени чистоты препарата проводили исходами электронной микроскопии и седииентацион-ього анализа.

Ксспстовзние белкового состава чехга пиоцина £{ проводили поиолшо метода диск-электрофореза в полиахрмлаыилном геле \ЕИВО,С*«г ¿>/ ал<:е*>7"/э

Й<\ .г^ <'').

СедиментадиовныЙ| анализ частой пнодияд р. ^ проводив на аналитической цевтрифуго 5р > >> со со скавврущей адсорбционной системой, настроенной на «¿80 юс яре 17000 об/икз при темпоратурэ ао°С.

Йм>. 2. Эдекгровная шясрофо*ография сокращенных чехлов падцяна Щ *

Одраледвнве общего' фосфора проводили по «иоду Геоса ж Пврц Ре.*.-?, 1975).

Идентификацию итклэотидов проводили о ноиоцы) хроиагографая на бумаге по методу Хакеса и Шервуда (Нл*) к с ),

Определение нейтральных Сахаров проводили по протеях, приведенных в обзоре Ходжи и Хофрейтора i/Vos/леtгf 1962).

Опраделекие гексозамяяов проводили по ыездду Рэвдала в Моргана

Измерение оптической плогяосги здекгронноиижросяолячвскях изображений пиощгаа проводили ва девсвтоиетре фиркы '^лУлл* е размерами цела в плоскости объекта 4,5 A х 11,5 А.

Оптическая дифракция электронномккроекопяческих изобпякаиид . пиоцика fti * Для получения дифракционных картин использовали оптический двфрактометр о постоянной L А - I им2.

Ыетоя кругового дихроизма. Спектра КД эадяоывалиоь на дя-хрографе " J as е-о у 2,0" . Отсутствие рассеивания в образцах устанавливалась ко ндевтнчкоети спектров УФ, записанных оа приборе "¿ín/camобычно« кюввтвом отделении в отделении для мутных оред.

D. ПОЛУЧШЕ ПИОЦННА И КОНТРОЛЬ ЕГО БИОЛОШЧЕСКОИ АКТИВНОСТИ

1, Разработка реюта ивдштра пиопина Я£

Индукция пиоцяна Щ осуществляется родом таких агентов, хек УФ, ыитомщив С« флавомяцин. Первоначально в навей работе а качестве индуктора биосинтеза пиоцвяаК^ мы использовали УФ облучение. Вирациванив культуры fif. аеги^/nosá штампа PI5 проводили в £0*одтровнх булаях на среде фраЯэере пря 3?°С к умеренной аэрация в течение 4- часов* что соответствовало середине логарифмической фазы росса. С этого момевта начинали облучать культуру УФ-еветом, пропуская через квардевую трубку диаметром 8 мм и длиной 500 км, котору» осгелахя о трехоторон равноудаленными лампами БУДОО (15 ватт каждая). Облучение продолхалось вестернльво в течение 20 шш (скорость протекания во трубке I л/мвв). В результат» использования только метода , биосинтез пиодана ÍÍ иди совсем новел, юм выход был настолько май, что выделить б актера цкн в преоаративнмх количествах не представлялось возможный.

Варьировал!« времен* облучекхя кикрооргашпмов несколько сдвинуло биосинтез пиоциваХ£ в сторон! «го увеличения. Выбор оптимальных условии показал, что облучение культуры в середине ло-гара$»«чэской фаза розга нецелесообразно, а яучижй виход наблюдается при облучении в первое четверти логарифмичеехой фазы роста» т.е. через два часа после посева» . ■.""■ .■

Время пропускания культуры череа кварцевую трубку, т.е. фактически время облучения, тохе играло больиу» роль* Скорое» про-

дусяакия иввти от I л/миа до 0,3 л/мян. Пропускание рсгтуцеа биоиассы с низкой скорость» приводило я гону, что часть кулыуда облучалась на мадии иавсвмальноЗ чувствительности, а другая« большая» после прохождения атой точки, что соответственна отражалось на эффективности индукции.

Следовательно, выращивание суспензии микроорганизмов в 6o*i-ишх объемах в длительность периода оол^ченяя растущей культура несет сведущий негативный аффект: ве все клетки получает необходим?» дозу 7Ф в период м&ксииазьной чувствительности, что влечет за собой резкое сшгхешт биосинтеза пиоцина Ri *

Применение л качестве индуктора митоыяцнна С в концентрации 2 кг/л ори использовании вышеуказанной среды, значительно увеличивало выход лиодина Ht . но не настолько, чтоб» сократить обгони выращивания культуры» а использована© этого антибиотика хотя бы для одноразового индуцировании 50-литрового объема растуией биомассы паи не представилось возможным»

* Таких образом, пх'заналиэнровав описании« выше методы со получению пиоцина Ri , vu приели х выводу о необходимости значительной модификации оущеотвующих адн созданию нового истода.

При оравнешм нарастания биомассы штамм PI5

в синтетической среде Фрайзера и НИБ, нами было замечено, что увеличение количества биомассы в последнем происходит вначитель-но активнее* 8го послужило толчком к применена» МПБ а качестве основной среда для выращивания исследуемых организмов* В результате длительного подбора оптимальных условий выращивания иы остановились на следушей методике: 20 мл ивокулята пересевали в литровый матрас, содержаний 300 мл КПБ о подложкой из 1ÍIU. Выраыгаа-ние проходило s 9 катрасаХ, т.е. использовались одновременно около 2,7 л среды* После пересева матрасы укрепляли на механической подотавке и помещала в термостат на 37°С, где культура взращивалась в течение Z часов при активном перемешивании. Через 2 часа в рветущуо биокассу добавляли индуктор - млтонидан С из расчета 2 мг/л* Этот период соответствовал концу первой четверти логарифмической фазы роста* Культуру терюстагировали еще два часа, а затеи помещали на ночь иа холод дав дальнейшего лнзвса*

' Больное виачеине имеет время выращивания ввокузяте. Резжое увеличение выхода пиоцина^ было достигнуто сокращением времени выращивания ивокулята до 7,5 часов. Вероятно ото схЗздояяотоя тем,

- го -

что к ?,5 часам выралшвання культура достигает конца логарифмической фазы роста перед самым выходом ва плато. Пересов внокуля-га именно je этот иоиект значительно облегчает микроорганизмам адоптацию к новой свежей среде и позволяет молодым клеткам ектив-но делиться» что в своп очередь увеличивает способность этих молодых клеток синтезировать пиоцин Щ % Поэтому косвенный выводок мелет быть следующее предположение: способность к биосинтезу яио-цина К i внаадтелько вьгпз у молодых клеток, ислользоваишд в качестве посевного материала.

Таким обрезом, в результате разработка этого метода мы получила выход пяоцнна Ы IOO-I5Q иг аа 2,7 дигра культуры, что а среднем в 50-€0 раз превышает выход пиоцияа Я4 , достигнутый другими исследователями.

Z* Биологическое тестирование пиопянд fl i

Практически едияствешшм методом контроля биологической активности пиоцика Ri является его титрование. Оно довольно затруднительно потому, что пиоцян ßi в противоположность, например, фагу Т2, образует ва гааоне чувствительных бактерий очень мелкие стерильные лягаа (0,2-0*5 ни). £ качества своеобразного экспресс-катода определения, насколько эффективно прошла индукция, использовалась следухцая процедура. Капле лиэата, предварательно про-пудеялу» через бактериальный фильтр, наносили ва край чшквд Оетрж о высеянной ваней чувствительным птаммом PK и наклоняла чаплу, давая капле стечь. Мякубироэаяв в течеаие15-15 часовпри37°С. По степени подавления роста чувствительных клеток визуально оценивали, насколько интенсивно прошел биосинтез пиоцина £ i » а следовательно, несколько зффектявен тот или иной способ индукции.

Совместный высев пиоцияпродуцирухщего я пиоциячувотвительно-го BiajoíOB Н.Асгиумо&йъ показал, что далеко ав все колонка штампа PI5 образуют вокруг себя зовы водавлсавя роста птамма PI4. Это понятно, rax как спонтанный сянтез шюцваа Ri неволил. Однако облучение таких совместных посевов УФ-лучамя приводило к обра-эовагат ебамряых зон лизиса, что свидетельствовало об иядухцяж синтеза виоцква KÍ . 8 контрольных высотах только одного чувствительного стемна PI4 зон лизвса при его облучении по наблюдалось.

а. изучение специфических: клеточных рецепторов шющна т

I* Определение рецепторпой активности

Фракция липополисахарида выделенную до указанному выше иэ-тоду 1973) центрифугировали в течение часа при 15000 <}

Осадок» названный Р1, отделяли, а супернатант, наэвашшл Л 2, и осадок, названный Р2, разделяли и одновреиендо о Р1 подвергали диализу против води в течении гч часов, а затеи лиофилизовали.

Для определения рсцепгорной активности из каждого полученного препарата отбирали навеску з 2 мг и растворяли в 0,2 ил 0,01 II трис-НСЯ-буфоре рН 7,5. Полученную суспензию добавляли и различным разведениям препарата пиоцина и инкубировали в точение 40 мин при 37°С. В качестве контроля к препарату пяоцика Щ добавляли 0,2 мл исходного буфера. Титрование пиоцива Ш проводили на двуслойном агаре* В 5 мл мягкого агара (0,5-0,7$) вносили петлей две капли чувствительных бактерий штампа Р14 и 0,1мл раствора скоси пиоцина^ и рецепторов в выливали на твердый агар. Аашки Петри с агаром культивировали в течение ночи при 37°С и подсчитывали количество стерильных лакун. Результаты исследояа-ВИЙ Приведены в таблице I.

Таблица I*

Рецепторная активность различных фракцвй дшюлохисахарида из клеточной стенки ятат/а Р14

К Количество мерилышх лакун * ю3

без рецептор» : И I У 2 : Р2

I 12 ЭЬ 57

г 87 5 51 29

3 48 3 20 12

20 0 12 3

Таким образом, роцепторнаи витивжость обяарухеиа во всех трех фракциях, и&кскмальная рецепторная активьсот* обнаружена яо фракции Р1,

- в -

2* Изучение яшнческого состава липополисагаридной фракция. обладающей рецепторвой активностью к пиоциат

Обцее содержание нейтральных Сахаров, входящих в состав полисахаридов рецепторов виоцина'Й* составляет примерно 20%. Для идентификации и количественного определения Сахаров использовала метод хроматографии ва бумаге. В качестве растворителя служила спесь - бугаяол;пиридин;впда в соогнояении 6:4:3* Пятка Сахаров вырезали, алпировали водой и определяли яо методу Парка я Джон-оона (1949). Содержание нейтральных Сахаров приведено в таблице 2*

". Таблица 2»

Содержание Сахаров в составе полисахарида рецепторов пиоцияа И

Саха^ : . Содерваове в:)6 ;

Рамиова ■ 5*8 ■

Ркбоэа 1,1

Пнжоэа £0,2 •

Гептоза 5,2

Гатктоэакт 5,7 Ппжозаняг ' 8,2 ■

КДО .. • . 7,1

КДО - еахар, дажжЯ положительную реакции о тюбарбитуровой кяелотюЖ с мсдользовшшж л'-ацетялне Ирами нов ой кио-аоти как стандарта.

Общее содержание гексозакиков оказалось равным 13,3^. Содержание белков в составе рецепторов пиоцика равввхооь

Чтобы убедиться а наличии или отсутствии ДНК « РНК, а так же соединений типа яуклеотвдов, мы провела качеотвеннуп решсци» о дифениламином в орцивои* 11 та в другая реакции были отрицательными* Следовательно * можно говорить, что нуклеиновый компонентой рецепторы пиоцива Ж ка обладают*

Химический аналиа показал, что в состав пиоцика Я* - рецепторов входит (3,4%).

IT. ИЗУЧЕНИЕ ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА ХВОСТОВОГО ЧЕХЛА ПИОЦИНА КГ

I, Исследование болтового состава чоха а пиоцянаК/

Определение состава субкеднниц сокращенного чехла пиоцика Ri затруднено сложностью выделений высокоочиаеншос чехлов в препаративных количествах. Так, на!рис. За представлены данные глбххрофореза чехлов, проведенного на различных этапах очистки mix частиц. Результаты свидетельствуют о постепенной уыеньвеинн числа белковых полос по мере очистки чехлов пноцяна Я{ . В конце концов обнаруживается единственная полова, соответствующая белку в «йлеиулярвой массой 36000 ± 2000 давьгоа.

поав— « юоод— «— шов— «

т-

29ПРО —

.гнию— 4fieifs — twos —

г. S

P»o. 5.

Рис* 3. Влектрофорегршшы чехлов пхоцина Hi на разпых стадиях очистки, в - изменение белкового состава препарата чах* лов в яроцеооо четырехкратной очисткн чехлов в Градиенте плотности сахарозы (I3-2S3S); а - белковый состав препарата чехлов, полученных я очищенных по методу; в - белковый соотав препарата чехжов, очищенных по методу Чи! о последующей четырехкратной очисткой в градиенте плотности сахарозы (I3-26JÎ).

Рис. алоктрофорегргшма кинетики диссоциации пиоцина К i в

вависимости от температуры. I - 60°; 2 - 65°; 3 - 70°.

Для сравнения наших результатов до определении белкового состава чехла пиоцина Ri, с данными, нолученкыии в другой работе (Va/, 1971), мы использовали для электрофореза препарат чехла» полученный по указанной в ней летодико. Электрофорез чехольного белха пиоцина Rí , полученного по методу Ии, обнаружил сходство о результатами промежуточной стадии очистки белков чехла пиоцина Ri по нашему методу ;рис. 36). Препарат чехлов пиоцина Ж выделенный и очищенный по методу Юи, и подвергнутый дополнительной очистке ло некому методу обнаружил в своем составе тодьхо один тип белка с молекулярной массой 36000 ± 2000 дальток {рис.3в). Очевидно, дополнительные белковые полосы, имевшие место в алектро-форетрашах-чзхольного белка, полученного по методу Ви, соответствует структурным единицам стержня, базальной пластинки, а так жл минорным белкам вершины чехла пиоцина Ri * На возможное присутствие подобных минорных белков в пиоцине Ri. указывают результаты исследования кинетики диссоциации пиоцина R-i в зависимости от температуры. Нами была определена тейперагура, соответствующая точке перехода чехла из растянутого в сокраденное состояние, которая соответствует 57-58°С. При атом, как показал электрофоров, происходит отделение белковых субьединиц с молекулярной массой I7C00 и 26000 (рис» 4)< Возможно, что субъединицы в состава на-тивной частицы пиоцина Ri находятся на терминальном конце чехла и нх отделение связано с сокращением этой структуры*

2» Исследование нуклеотвдтрифосфатяых соединений в составе чехла пиоцина И

В веотвдесятые годы Козловым с соавторами 1962) было поваэаво, что в состав хвоста фага Т2. входит d -¿Гф в некоторые другие нуклеозядтрифосфаты. При втем было высказано предположение, что Ы-Xtt участвует в акте сохранения чехла как источник энергия. К сожалению, в течение длительного времени к »тому вопросу не возвращались, хстя он имеет принципиальное значение. руководствуясь этими данными, мы предположили, что * составе чекла дгогдяа fcí том могут присутствовать некоторые нуклео-

- IS -

гиды. Дня подтверждения этого предположения в первую 0"аредь определяла общий фосфор в составе пкоцияа Щ . Результаты измерений показаны в таблице 3»

Таблица 5.

Определение общего фосфора а составе лкоцина Ц.1

* Иссло-: Кол-во : Кол-во Р * * Кол-во атомов * * * Кол-во атомов

дования ; пиояажа * ■ » В МГ * • Р на одну час- Р па субьедя-

* * В МГ : тицу пиоцина * няцу чехла

I 0,15 31 653 3,2

г 0,30 59 621 > 3,1

3 0,45 ЭЗ 653 3,2

Идентификация яуялеотидов, входгадех в состав плодива R1 проводилась с помоадю хроматография на бумаге. На xpouarorpatwa были обнаружены пятна с2-/ 0,23 н 0,7V, соответствующие положению АДФ я свободного ¿осфата* АДФ в фосфат находились в ахвимо-лярных количествах, т.е. яа одну молекулу АДф приходился один атом фосфора* Это позволяло вам сделать предположение, что в со« ставе пиодена RI АДф я неорганический фосфор объединены в одну молекулу АТФ. Волн в» так, то возникает вопрос об общности механизмов сокрацакяячехлов пяояина Rt я более сложных двигательных аппаратов* Хотя, несомненно, для окончательного реиеявя необходимо прямое выявление КГФ в составе растянутого чехла пиоцияа Ж. Сделать это представляется нал пока трудным, т.к. влементарвая экстракция АТФ.из чехла гсегда приводит я сохранения этой весьма неустойчивой структура, а сокращение, возмоэгао, сопрпхеао с гидролизом АТф.- Очевидно, здеоь правомочно сравнена;, с актином, во-торыЭ, пах хорошо известно, существует в двух формах - фибриллярной (Я-виин) в глобулярной (G-актин). При этом глобула <Г -ак-тяяа содержит молекулу АТФ, а при arperaiym в Я-сктен на одяой . из стадий изменения ее вокфорнадви происходит гидролиз АТФ* Не ио-ялючеиа возможность, что при начальной стадия сокрадения чехла , его субьед&ница в определенный момент оказываются способными глд-ролязовать ДГФ^ и именно втот гидролиз играет роль "спускового . яричка* для дальнейшего оокрасевля. Однако, возможно, АТФ играет роль только пря взаимодействия оубыэдикид со стержнем во вреиа

- & -

сборка чехла, т.к. в отсутствии "вид" собираются похкчехли в спирали (ПсА1979).

У. ИЗУЧЕНИЕ СТРЛСТУИ СОКРАТИТЕЛЬНОГО ЧЕХЛА ПИОЦИНА И

И КОНФОШЦИОЙНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ ЕГО БЕЛКОВ ПШ СОКРАЩЕНИЙ.

i» научение структуры сократительного чэхлд пиоцина ^ методом третаеркой| оптаческо Й рекоистрткдии

Трехмерная оптическая реконструкция чахла пиоцина /Ц прово-дилаоь на базе Института биологической физики АН СССР в лаборатории Г.Р.Ив&ницхого.

Параметры чехла пиоцина определялись по положение осоов-1шх максимумов в оптических дифракционных картинах, полученных о ялектронномивроскопичееких изображений (рис. I, ) о помощь» оптического дифрактоиетра о постоянной А * I мм2.

Измерения характерам* расстояний показали, что впирали* формирующие структуру, правив. Равные дифракционные максимумы лехат на слоевых линиях - ^ ^ 2 _ , ^ о-1

Период прерывности спирали 455 угол наклона спирали к горизонтали 53°. Наиболее вероятные значения параметров дифракционных^ картин соответствует правилу отбора С* 13т + 4«'; где « =■

номер слоевой; т ■ О; I.*.,; п - порядок Бесселя, Получению данные достаточно близки результатам изменений, приведенным » работе Такеды и Кагеямы (1975).

7 многих частиц рефлекс на 13 слоевой липни оказываема смененным о меридвава. Направление I величина смешения нмевт случай-куй характер. Предельные значения отклонения 13°. Причиной смеае-ния является, по-видимому, изгиб чехла, что свидетельствует о нестабильности структуры.

Анализ дифракционных картин, полученных о влектронноиикроо» ионических снимков пиоцина обнаруживает необычайное распределение интенсивно и ей между иервди аваль ныв я первым боковым рефлексами. Этот аффект оказался связанным о наличием г электрон-воникроокопжческхх изображениях частиц пиоцина структуры ...

описанной впервые Донелля с соавторами (1972) в препаратах бактериофага. Появление »той структуры, по-видимому.

преднествуе* процессу сояракеквячехла, я аналкз пространствен-вой организации чеша в атом состояние полет бвгь интересным.

Ряс. 5. Раосчлтаяньге яа ВВП распределения вхектроняой

плотное св. я трех сечеяяях дисков, расстояяне * : между которыми примерно 12

1-е сечение - «шовная лияля

2-е сечевие - пунктир

3-ю сечение- точки

Серия намерений, проведенных в оптических дифракционных . слекграх и анадйэ цифрового преобразования фурье показала, что дая типичной "дисковой* структуры (отростка бактериофага Т4) отношение явтеясявностей первого бокового а неридядлькою рефлексов составляет примерно 0,3-0,4* Это же отпоиенне дня чехла пио-цлва - 1,1-1,2» Другими словами, степень вырахеиноота мех-субъедннмчных связей в направлении спиралей; обраэуедих структуру (спиралсй 16,4), у пяоцива примерно в 3,3 раза

сильнее по сравнению с кежсубьединичныкя связями в направлении спиралей (6,5) у растянутого отростка фага Г4.

Талим образом, воре распределение иягвнсивносгей между медиальным я боковым рефлексами в "чисгой"псгопке дисков" я в частицах со структурой свидетельствует о реорганизации мексубъединичных контактов и об изменение направления преимущественных связей* Анализ распределения интенсивности в определенных рефлексах дифракционных картин позволили дагь этому феномену количественную оценку»

Методом модифицированного обратного проектирования (Ваа-штойн, Орлов. 2972) был выполнен расчет распределения ахектроивой плотности в сечениях, перпендикулярных вертикальной оси частицы.

Характерной особенностью реконструкции является угловой сдвиг сечений субъодннйц чехла в пределах днска в направлении со часовой стрелке при движения к базальвой пластинке* Величина угаа составляет примерно 18° между первым к третьим сечением (рис. 5)* Зто свидетельствует Об ориентации субъединиц вдоль витка спирали* Субъедицица имеет коническую форму: максимальный ее размер в тангенциальном направлении в 1-ом сечении 55 I, во 2-ом - 40 1, в 3-ем - 30 1; в радиальном направлении средний размер ее составляет 30 А* Субьеддница пиоцина примерно в 1,5 раза меньше субъединиц некоторых других фагов (Кдинцав в др., 1975; Ш к/их ¡¿в г, Уан-2971). Таким образом, на стадии непосредственно предшест-вуюцвй сокращенно. субьединиды чехла претерпевают ряд модификаций: реорганизуется связи между еубьедяянцамя в направления диенов, оубъедяннцы ориеатяругтоя вдоль направления витков опирали (6,4-); в этом направления и устанавливаются контакты между субьединяца-мн соседних дисков.

Если считать, что сокращение чехла происходит по механизму смещения ( МлйУ^,1Э73), то спирали (6,4) путей идентичного ново- рота ж трансляционного смещении дисков переходят в спирали о навык периодов сокращенного чехла* В атом случае установление жестких связей вдоль спиралей (6,4) делает возможным вращательное движение всех дисков при повороте оъного диска, связанного с Завальной пластинкой*

Основные парапетри чехла пиоцина , полученные о помощью метода трехмерной оптической реконструкции хорошо совпадают с данными, полученными при малоупговоЯ рентгеновской дифракции

(Баркао и др., 1979).

Ва ооаоваяии вшевзложеиних данных нами была предложена трехмерная модель сократительного чехла оиоцииа R4. (рас. 6).

Pío. б. Трехмерная модель структуры чехла диоцяаа И.

2* Изучение изменений вторичной структуры белков пнодниа Rt при сок^аненив его чехла

Сокрашенке чехла» как ухе упоминалось выле, вызывается действием ряда химических реагентов, температурой, измененном рН. Но все ати воздействия достаточно далеки от наткакого оокрицзаия чехла in v'^o . В нашей работе мы стрекались как можно ближе вое создать условия катанного сокращения. Зля »того в качестве агента

вызывала,« го оокраиевие, мы использовали специфические клеточнно рецепторы пмоцина Я1 , наряду о традиционными химическими ж тем« пврагуршди воздействиями. Изменение вторичной структуры белков пиоцина Ri , ввязанное а сокращением его чехла, ре гнет раро в&лось

Рио. 7. Спектр« кругового дихроизма пноцина Ri о

несокращенным чехлом (I); сокращение чехла которого вызвало нагреванием до 60°С (2); сокра-яеяие чехла которого вызвано взаимодействие* о рецептором <3),

Для инициации сохранения к 2 мл препарата пиоцина Ri (кон-пютрация О.Х иг/мл) добавляли 0,1 мл клеточных рецепторов Pi,. сотворенных в В^О» Снеси термоетатхровалн в течениеЗО минут при Для температурной инициации сокращения препарат пиоцива Ы тедоьстатираваян и течение S мян при 60°С* Наконец, сохранение

вызывала заболачиванием препарата плоцина Я£ до рН Ц о помощью 0,1/^ЛЪ.ОЦ ндв 0$1/У 50Я»

Спактр кд пиоцина Я4, в несокращенным чехлом имеет иянамуы в области отрицательных значений ажиптичноста при длине волны £00 нм а плечо в района 220 вы (рас. 7), При сокращении чехла происходит изменение спеитра КД по амплитуде» ссответотвутцео увеличения спирального содержания. Приведенные кривые является средним дая нескольких измерения.

Спектры пиоцина , сокращение чехла которого вызвано температурной обработкой прж 58°С, защелачивакием до рН II и подкис-леннем до рН 3,2 в пределах овибкв измерений не отличались. Изменение условий терыоствроваааа ниоцина М в дяапозоне 5В°-?0°С н времени инкубации от 5 ыкн до 60 мин дая инициации сокращения гак же не влияли на структуру ниоцина Ш<з сокращенным чехлом, т.к. спектры КД в пределах ошибки были одинаковы.

Спектр КД ниоцина Я-£ , сокращение чехла которого инициировано взаимодействием с клеточными рецепторами, качественно отличается- от спектров натнвного пиоцина М и подвергнутого температурной или химической обработкам и похож на спектры стандартных «С-спиральных пол«пептидов с двумя характерными минимумам! в отрицательной Области При дпиниах воли 209 и 222 ни.

Расчет содержания «С-спирали в белках пиоцина из спектров КД в области ££0-200 км проводился в предположении равенства:

т « *

(ОЛ ~ эллипгнчнооть белка на фиксированной длине водны -I • (н,та,{я. ~ Доля '¿-спирали, ^-формы я неупорядоченной структуры соответственно;[&2ан > / К " млиятичпос-

ти трех базисных спектров, предложенных в работе е-/

1974) для '^ -спирали, -формы к неупорядоченной структуры. Средний молекулярный вео аминокислотного остатка 133. Сглаживание КД спектров проводили с помощы» стандартного катода налмень-аах квадратов о условием: -¿и* ■(# * ,<е =

Расчет спектров КД показал, что в нахивиои состоянии белки пиоцина Я1 содержат 26* <-спирааи. Этот результат практически совпадает о данными, полученными при расчете кривых ДОЗ ниоцина

о помоаьп расширенного уравнения Уофмта, по которым «С -спа-ральность пиоцина составляет 22% (Горяев ш др., 1%9).

Сокрадение чехла о помощью нагревания к изменения р9 вызывало изменение вторичной структуры в одинаковой степени: ы -спирально с ть увеличивалась до 36%. Содержание сС -спирали в белках пиоцина Ш , сокращение чехла которого было вызвано добавленной клеточных рецепторов составляла т.е. практически увеличивалась вдвое. Вместо с тем было бы необоснованно предполагать, что изменение -спнральностп при сокращении чеша связано только о атой структурой, т.к* в стой превращения участвуй и другие структурные компонента, в первую очередь, баэальная пластинка.

ВЫВОДЫ

1. Разработан новый метод получения пиоцина * В результате выход пиоцина составил 100-150 мг на 2,5 литра культуры Р2, штамм Р15, что в 50-60 раз превышает результаты, достигнутые другими методами.

2. Показано, что сохуаздиие чехла происходит ори 57-58°С. Выделены и очищены чвгш писцеяа НС .

3. Методом лиск-алектрофореза я ооямахрклаындном геле опредалеа ОелковцЧ состав чехлов пмоцвиа Ш . Чехлы состоят из одного типа полипептидной «епм с молекулярной массой 36000 £ 200О дальтон.

В составе пиодаша Я1 обваружеыо акммодярное количество АД» и неорганического фосфата.

5. изолирована фракция кишиюяжсахардда клеточкой стенки ятам-ма Р14 » обладанием рецепторной активностью в яиодяау . Исследовал ее суммарный химический состав*

6. Выполнена трехмерная «вютеиеая реконструкция чехла пиоцина

Иегодом трешерной оптической реконструкции изучена структура чехла пиоцина ££ в определены его основные параметры»

7. ¡Еотодом дифракционно го анализа обнаружено наличие в злектрон-номикроокопнческих изображениях частиц пиоцина -ёоне" структуры* Появление втой структуры, возможно, предшествует сокращению чехла.

В* С поиоцью метода кругового дихроизма (КА) показано, что сократительный акт чахла пноцина Ri. сопряжен о изменением вторичной структуры ею белков.

По материалам даосертацви опубликованы следующие работы:

I. Туркяя ¿.И., Метлика А.Л., Вотааяов Б.Ф., 1978. Изучение белкового состава шноцина R¿ . Доклада АН СССР, £39, 74Q.

Z* Туркин А.И., Петляла А.Л.* Погаазов Б.Ф., 1979* О наличии зкввваяенхкых количествах АДФ и свободною фосфата в составе пноцина . Доклады АН СССР ¿tó, 5, 564.

Бдшадов И.Ii., Иваницвий Г.?** КунвсекиЙ A.C., Поглазев Б.Ф., Туркин А.И., 1979. Грегмерная организация чехла шшцнка Доклады АН СССР» 2V7. 5, 420.

100554