Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение природы эндогенного сенсибилизатора В-адренорецепторов и других факторов, регулирующих сократимость и адренореактивность гладкой мускулатуры

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение природы эндогенного сенсибилизатора В-адренорецепторов и других факторов, регулирующих сократимость и адренореактивность гладкой мускулатуры"

^ ,¿5-4

^ 4-"

^Ч/ На правах рукописи

ТУМАНОВА Татьяна Витальевна

ИЗУЧЕНИЕ ПРИРОДЫ ЭНДОГЕННОГО СЕНСИБИЛИЗАТОРА р-АДРЕНОРЕЦЕПТОРОВ

И ДРУГИХ ФАКТОРОВ, РЕГУЛИРУЮЩИХ СОКРАТИМОСТЬ И АДРЕНОРЕАКТИВНОСТЬ ГЛАДКОЙ МУСКУЛАТУРЫ

Специальность 03.00.13 - физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учепой степени кандидата биологических наук

Москва 1998

Работа выполнена на кафедре анатомии и физиологии человека и животных Вятского государственного педагогического университета

Научные руководители:

доктор медицинских наук,

профессор ЦИРКИН В.И.

кандидат медицинских наук,

доцент ДВОРЯНСКИЙ С.А.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, старший научный сотрудник ВАСИЛЕВСКАЯ Л.С.

доктор биологических наук, профессор ЧЕПУРНОВ С.А.

Ведущая организация: Российский государственный медицинский университет

Защита диссертации состоится 23 ноября 1998 г. в 16 часов на заседании Диссертационного Совета К 053.01.01 в Московском педагогическом государственном университете по адресу: 129243, Москва, ул. Кибальчича, д. 6, корпус 4, ауд. 205.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского педагогического государственного университета по адресу: 119435, Москва, ул. Малая Пироговская, д. 1.

Автореферат разослан "/2" -V 1998 года

Ученый секретарь

Диссертационного Совета

ХОЛМОГОРОВА Н.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время большое внимание уделяется выявлению различных гуморальных факторов, участвующих в регуляции цеятельности висцеральных систем (Розен В.Б., 1994; Ноздрачев А.Д, Янцев A.B., 1995; Циркин В.И., Дворянский С.А., 1997), в том числе факторов, которые способны модулировать физиологические эффекты гормонов, медиаторов и биологически активных веществ (Манухииа Е.Б., 1990; Chuang Tsu Tshen et al., 1992; Агаджанян А.Н., 1992; Брин В.Б. и соавт., 1994). При изучении механизмов регуляции сократительной деятельности матки (СДМ) человека и животных в крови и других жидких средах организма путем исследования их сократительных и адреномодулирующих свойств обнаружены 'Помаскин И.Н. и соавт., 1989: Циркин В.И. и соавт., 1992, 1996, 1997; Цжергения С.Л., 1995; Братухина C.B., 1997; Дворянский С.А. и соавт., 1996, 1997; Циркин В.И., Дворянский С.А., 1997; Шушканова Е.Г., ¡997; Сизова E.H., 1998) ранее неизвестные факторы, которые были названы эндогенным 3-адреномиметиком (ЭВМ), эндогенным утеростимулятором, эндогенным сенсибилизатором ß-адренорецепторов (ЭСБАР), эндогенным блокатором 3-адренорецепторов (ЭББАР). Все эти факторы, на наш взгляд, представляют эольшой интерес, так как играют важную роль в регуляции СДМ беременных кенщин и являются компонентами ß-адренергического механизма, На сегодняшний день в определенной степени дана физиологическая сарактеристика ЭБМ, ЭСБАР, ЭББАР и эндогенного утеростимулятора. Однако трирода этих факторов остается не установленной, а, следовательно, )тсутствуют прямые доказательства наличия их в организме человека и кивотных. Актуальность всего сказанного позволила сформулировать :ледующие цель и задачи.

Цель исследования. Изучить природу эндогенного сенсибилизатора 5-адренорецепторов и других факторов, регулирующих сократимость и щренореактивность гладкой мускулатуры.

Задачи исследования:

1. Изучить устойчивость утероактивных и адреномодулирующих эффектов :ыворотки крови, околоплодных вод, мочи и ликвора к кипячению, закисленшо ;реды и длительному хранению при 18°С и 37°С.

2. Исследовать утероактивные и адреномодулирующие свойства сыворотки :рови, подвергнутой различным видам фракционирования, включая гель-шльтрацию и ультрафильтрацию.

3. Изучить влияние двадцати аминокислот на сократительную активность и i-адренореактивность изолированного миометрия крысы.

4. Изучить способность 1-гистидина, ¿Ц-тирозина и 1-триптофана оказывать i-адреносенсибилизирующее влияние на различные гладкомышечные объекты.

Научная новизна. Впервые показано, что содержащиеся в сыворотк крови, околоплодных водах, моче и ликворе человека ЭБМ, угнетающий CCL продольных полосок рога матки небеременных крыс, и ЭСБАР, повышающий и p-адренореактивность, устойчивы к кипячению, длительному (до 14 суто* хранению при 18°С, суточному хранению при 37°С, 2-4 месячному хранению замороженном виде и к закислению среды (рН=5.0). Фракции сыворотки кров* лишенные фибриногена, альбумина и глобулинов, а также полученные при гел! фильтрации на сефадексе G-10, предназначенном для разделения биополимеро с молекулярной массой 100 - 1000 дальтон, и при ультрафильтрации чере мембранные фильтры, пропускающие вещества с молекулярной массой менып 5000 дальтон, сохраняют утероингибирующую, р-адреносенсибилизирующу* и, частично, утеростимулирующую активность. Это указывает на то, чт ЭБМ и ЭСБАР являются низкомолекулярными, а утеростимулятор среднемолекулярным веществом (ориентировочно их молекулярная масс составляет 100-150 Д, 100-200 Д и 800-2000 Д соответственно).

Впервые в опытах с продольными полосками рога матки небеременно] крысы показано, что 1-аргинин, 1-гистидин, 1-лизин, 1-триптофан, d.l-фенила ланин, 1-аспарагин, 1-аспарагиновая кислота, 1-глутамин и ёД-тирозин, а также и: смесь вызывают частичное угнетение ССА продольных полосок рога матю крыс, которое, в отличие от подобного эффекта биожидкостей, не снимаете: обзиданом. Это означает, что, скорее всего, ЭБМ не является аминокислотой Впервые показано, что три из 20 исследованных аминокислот - 1-гистидин 1-триптофан и dj-тирозин в полном объеме воспроизводят эффек ЭСБАР: подобно биожидкостям они оказывают выраженно (3-адреносенсибилизирующее действие, которое наиболее ярко проявляется пр] использовании их в концентрациях Зх(10"5-10"8), 1х10"5 и 2х(10"5-10"6) г/м. соответственно. Для этого эффекта характерны устойчивость и последействие возможность проявления на фоне спонтанной и вызванной гиперкалиевыь (60 мМ КС1) раствором или окситоцином (5x10"3 МЕ/мл) активности, а также \ условиях сниженной Р-адренореактивности. Этот эффект выражен npi использовании в качестве агониста р-АР адреналина и норадреналина в меньшей степени - дофамина и полностью отсутствует при применешп Р-адреномиметика гинипрала. Помимо миометрия крьк Р-адреносенсибилизирующий эффект гистидика, триптофана и тирозин; проявляется в опытах с миометрием беременных женщин и гладкими мышцам! коронарных' артерий свиньи и трахеи коровы. Подобно биожидкостям эт! аминокислоты не обладают М-холиномодулирующей активностью. Предложенс рассматривать ЭСБАР как фактор, состоящий из нескольких низкомолекулярныэ веществ, в том числе из гистидина, триптофана и тирозина, « (с учетом отсутствия у имидазола как предшественника гистидиш p-адреносенсибилизирующей активности) его б-адреносенсибилизирующш

эффект объяснять аллостерическим влиянием на каталитический центр Р-адренорецепторов имидазолыюго, фенольного или индольного кольца (но не бензольного), имеющего карбоксильную группу и аминогруппу.

Получено доказательство, что ЭСБАР (и, следовательно, гистидин, триптофан и тирозин) играет важную роль в регуляции деятельности внутренних органов и нейронов мозга в условиях нормы и патологии. В частности показано, что при депрессивном состоянии у женщин с климактерическим синдромом снижено содержание в крови ЭСБАР, что коррелирует с данными литературы о низком содержании у них триптофана и его высокой эффективности как антидепрессанта (Сметник В.П. и соавт., 1988). Таким образом, впервые описано новое свойство аминокислот - оказывать модулирующее влияние на здренергические процессы в организме.

Показано, что ни одна из 20 аминокислот не обладает р-адре-ноблокируняцей или утеростимулирующей активностью, что согласуется с вашим предположением об эндогенном утеростимуляторе и ЭББАР как ;реднемолекулярных факторах. Экспериментальные данные подтверждают аажную роль ЭСБАР, ЭББАР, ЭБМ и утеростимулятора в процессах регуляции 2ДМ человека и животных.

Практическая значимость. Полученные нами данные о том, что физиологический эффект ЭСБАР в полной мере воспроизводится гистидином, тирозином и триптофаном, существенно расширяет возможности исследования тайного феномена, механизмов, лежащих в его основе, а также использования 'истидина, триптофана и тирозина з клинической практике, благодаря полученным данным, становится возможным определение }-адреносенсибилизирующей активности крови и других жидких сред организма гомимо биологического метода - биохимическим. Результаты исследования шеют значение для физиологии, медицины и ветеринарии.

Внедрение. Результаты диссертации используются в научной и учебной )аботе кафедры анатомии и физиологии человека и животных Вятского •осударственного педагогического университета, а также кафедры акушерства и инекологии и кафедры нормальной физиологии Кировского государственного 1едицинского института.

Апробация работы. Материалы исследования доложены и обсуждены на [аучных конференциях: "Актуальные проблемы современной биохимии" Киров, 1996), на заседании Кировского отделения Российского общества зизиологов им. И.П. Павлова (Киров, 1998), а также нашли отражение в шнографии Циркина В.И и Дворянского С.А. «Сократительная деятельность гатки (механизмы регуляции.)» (1997).

Положения, выносимые на защиту.

1. Способность сыворотки крови и других биожидкостей человека ! животных оказывать (3-адреносенсибилизирующее действие по отношению Р-адренореактивным структурам обусловлена наличием водорастворимогс устойчивого к кипячению и длительному хранению низкомолекулярног фактора, условно названного эндогенным сенсибилизатором Р-адренорецепторо (ЭСБАР).

2. Из 20 аминокислот, содержащихся в организме человека и животные 3 аминокислоты - 1-гистидин, 1-триптофан и d.l-тирозин (каждая в отдельност] или при совместном воздействии) в полном объеме воспроизводя [3-адреносенсибилизирующий эффект сыворотки крови и других биожидкоста человека и животных.. Это позволяет рассматривать данные кислоты в качеств наиболее вероятных претендентов на роль эндогенного сенсибилизатор; p-адренорецепторов.

3. 1-Гистидин, 1-триптофан и с!,1-тирозин повышают чувствительност гладких мышц матки, сосудов и трахеи к адреналину как ингибитору С/ миоцитов за счет, аллостерического воздействия на fS-адренорецепторы; это-эффект реализуется независимо от уровня деполяризации мембраны, наличия i среде веществ - активаторов и протекает без выраженного явлена десенситизации. Очевидно, что в условиях организма эти три аминокислоть помимо других многочисленных функций участвуют в регуляции деятельносп внутренних органов (и, возможно, нейронов) в качестве модуляторо! адренершческих процессов.

Структура и объем диссертации. Диссертация представлена на 150 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов, библиографического указателя (185 источников) и приложений, содержащих 84 таблицы и 39 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования. Проведено 84 серии, в которых исследовались сократительные и адреномодулирующие эффекты биожидкостей, подвергнутых различным воздействиям (кипячению, длительному хранению, фракционированию), а также эффекты 20 аминокислот, включая гистидик, триптофан и тирозин. С этой целью были проведены опыты на 1318 продольных полосках рога матки 159 небеременных крыс (2500 тестирований), на 40 полосах миометрия 11 беременных (со сроком гестации 35-40 нед) женщин (79 тестирований), на 36 циркулярных полосках трахеи 6 коров (36 тестирований) и на 35 полосках коронарных артерий 7 свиней (35 тестирований). Всего проведено 2650 тестирований. Исследованы сыворотка венозной крови 10 небеременных здоровых женщин репродуктивного возраста, 14 небеременных женщин с климактерическим синдромом, ' 15 беременных

женщин со сроком гестации 26-34 недели; сыворотка ретроплацентарной крови 5 рожениц; околоплодные воды 14 беременных женщин со сроком гестации 1924 недели; моча 6 небеременных женщин (18-25 лет; фолликулиновая и пютеиновая фазы цикла); ликвор 2 женщин и 9 мужчин; 4 порции (п=58) безбелкового фильтрата сыворотки донорской крови. Кроме того, изучены утероактивные и адреномодулирующие свойства сыворотки крови 30 беременных (со сроком гестации 5-13 недель) женщин, а также 12-36 фракций (общее число исследованных фракций - 274), 4 ультрафильтратов (п=33) и 4 концентратов (п=17) сыворотки этих женщин.

Все биожидкости перед исследованием центрифугировались (15 минут, 2000 об/мин) и разводились в 10, 50, 100, 500, 103, Ю4, 10б, 108, Ю10 и 1012 раз. Часть образцов изучали только после определенной обработки: 60-минутное кипячение в условиях водяной бани (цельная и 100-кратно разведенная эиожидкость); длительное хранение в не разведенном виде при 18°С (1-14 дней) или 37°С (24 ч); ультрафильтрация с использованием мембранных фильтров фирмы Sartorius (Германия), пропускающих биополимеры с молекулярной массой не более 5000 Д; гель-фильтрация на колонках фирмы Toyo-Soda 'Япония), заполненных сорбентом Sefadex G-10 фирмы Pharmacia (Швеция), пропускающим вещества с молекулярной массой от 100 до 1000 Д.

Регистрацию СА гладкомышечных полосок, размеры которых достигали 810 мм в длину и 2-3 мм в ширину, проводили по принятой в лаборатории методике (Циркин В.И. и соавт., 1996) с помощью 6-канального 'Миоцитографа" конструкции А.Г. Гусева и Циркин В.И. при 38°С и скорости перфузии, равной 0.7 мл/мин в условиях пассивной аэрации рабочих камер. Для эпределения утероактивных и адреномодулирующих свойств биожидкостей применяли комплексную методику Циркина В.И. и соавт. (1996, 1997) и ее модификацию. В работе использовали адреналина гидрохлорид (Россия; 10'12" I О"6 г/мл), норадреналина гидротартрат (Россия; 10 г/мл), дофамин (Россия; 10" ~/мл), гинипрал (Австрия, Никомед; 10"10 г/мл), ацетилхолина хлорид (Россия; 10"6 г/мл), окситоцин (Венгрия, Гидеон Рихтер; 5x10'3 МЕ/мл), обзидан Германия; 10"6 г/мл), имидазол (Россия, 1.4x10"8 - 10"3 г/мл), аминокислоты 1>ирмы Реанал (Венгрия) - 1-аргинин (2x10"s - 10'3 г/мл), 1-гистидин (2x10"25 - 10"5 -/мл), 1-лейцин (2х10'8 -10" г/мл), 1-лизин (ЗхЮ"8 - 10'5 г/мл), 1-триптофан (10'8 ■ 10'5 г/мл), (5-аланин (5x10"8 - 10"5 г/мл), 1-аспарагин (10"? - 10"5г/мл), -аспарагиновая кислота (10'8 - 10'5 г/мл), 1-глутамин (4х10"8 - 10"5 г /мл), -цистеин (4x10"8 - 10"5 г/мл) и отечественного производства - с!,1-валин (ЗхЮ'8 -10'5 г/мл), с!,1-изолейцин (10'8 - 10"5 г/мл), (1,1-метионин (4x10"8 - 10"5 г/мл), 1,1-треонин (10'8 -10"5 г/мл), сЦ-фенилаланин (ЗхЮ"8 - 10'5 г/мл), глицин (4хЮ'8 -Ю'5 г/мл), сЗ,1-глутаминовая кислота (5х10'8 - 10"5 г/мл), ё,1-пролин (2x10"8 - 10"5 '/мл), (1,1-серин (2хЮ"8 - 10'5 г/мл), d.l-тирозин (2xl0"8 - 10'5 г/мл). Раствор

Кребса ,(рН=7.4) имел следующий состав (мМ): NaCi - 136, KCl - 4.7, СаС12 -2.52, MgCl2- 1.2,KH2P04-0.6,NaHC03-4.7, С6Н1206- 11.

Результаты исследования подвергнуты статистической обработке.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследования подтвердили данные литературы (Помаскин И.Н и соавт. 1989; Джергения СЛ., 1995; Циркин В.И. и соавт., 1996, 1997; Братухина C.B., 1997; Циркин В.И., Дворянский С.А., 1997; Сизова E.H., 1998) о том, что сыворотка крови небеременных и беременных женщин, моча небеременных женщин, ликвор мужчин и небеременных женщин, а также околоплодные воды в зависимости от степени разведения в опытах на продольных полосках рога матки небеременных крыс при использовании в качестве агониста ß-AP адреналина (Ю'МО"2 г/мл) оказывают утеростимулирующий (исключение ликвор и околоплодные воды), утероингибирующий, ß-адреносенсибилизирующий и ß-адреноблокирующий эффекты. Утеростимулирующий эффект биожидкостей (1:10, 1:50, 1:100) проявлялся в повышении исходного тонуса, частоты генераций спонтанных фазных сокращений, их амплитуды, а также суммарной

сократительной активности; утероингибирующий (!:103.....1:1012) - в снижении

этих показатели; ß-адреносенсибилизирующий (1:10 - 1:104) - в увеличении ингибирующего действия адреналина, а ß-адреноблокирующий эффект (1:10, а также 1:103, .., 1:10й) - наоборот, в снижении ингибирующего действия адреналина. Это дает основание согласиться с мнением указанных выше авторов о наличии в биожидкостях эндогенного утеростимулятора, ЭВМ, ЭСБАР и ЭББАР, а так же о способности ЭБМ (при больших, разведениях биожидкости) блокировать ß-AP за счет их оккупации.

Для определения природы указанных факторов цельные биожидкости и их 100-кратные разведения подвергались 60-минутному кипячению в условиях водяной бани. На миометрии крысы показано, что ß-адреномиметический, ß-адреносенсибилизирующий, а также ß-адреноблокирующий (больших • разведений, т.е. обусловленный ЭБМ ) эффекты в этих условиях сохранялись; в то же время вероятность наблюдения утеростимулирующего и ß-адреноблокирующего (для малых разведений, т.е. обусловленного наличием ЭББАР) эффектов существенно снижалась. Это дает основание считать, что утеростимулятор и ЭББАР, в отличие от ЭБМ и ЭСБАР, являются более сложными веществами и, возможно, полипептидной природы. .

Уже первые исследования (Братухина C.B.,1997; Циркин В.И. к соавт., 1996, 1997; Циркин В.И., Дворянский С.А., 1997; Сизова E.H., 1998) указывали на стабильность утероакхивных и адреномодулирующих свойств биожидкостей при хранении в условиях комнатной температуры в течение 2-6 часов от момента их получения. Нами показано, что после суточного хранения сыворотки крови, мочи и околоплодных вод при 38°С их утероингибирующая.

Р-адреносенсибилизирующая и Р-адреноблокирующая (больших разведений) активность воспроизводятся с почти такой же частотой, как и до хранения. Это указывает на то, что ЭБМ и ЭСБАР, действительно, являются стабильными факторами, которые не подвергаются ферментативному гидролизу и не используются микроорганизмами. Вопрос об устойчивости утеростимулирующего эффекта в этих опытах остался открытым - для сыворотки крови (но не для мочи) отмечено снижение вероятности наблюдения этого эффекта. Т.е. результаты экспериментов не исключают, что уте-ростимулятор (как относительно сложное вещество) в процессе суточного хранения подвергается ферментативному гидролизу, в том числе с участием микроорганизмов.

В конце длительного хранения сыворотки крови (7 суток) и околоплодных вод (14 суток) при комнатной температуре вероятность наблюдения утеростимулирующего (сыворотка крови), утероингибируюшего и Р-адреносенсибилизирующего эффектов заметно не снижалась. Это позволяет считать, что все исследуемые факторы, включая утеростимулятор, скорее всего не подвергаются ферментативному гидролизу. Вопрос об устойчивости ЭББАР, в связи с тем, что этот эффект в наших опытах наблюдался редко, остается открытым.

Промышленное производство различных белковых препаратов крови позволяло оценить способность сыворотки донорской крови после ее длительного хранения в замороженном состоянии и очищения (в процессе многоступенчатой обработки при комнатной температуре в течение 4 дней с использованием этилового спирта и уксусной кислоты) от фибриногена, альбумина и глобулинов оказывать утероактивные и адреномодулируюшие эффекты. Кислые (рН=5) безбелковые фильтраты сыворотки донорской крови проявляли утеростимулирующий, утероингибирующий и 3-адреносенсибилизирующий и р-адреноблокирующий (большие разведения) зффекты. При нейтрализации кислых фильтратов до рН=7.4-7.5 их ;пособность оказывать утеростимулирующий, утероингибирующий и 3-адреносенсибилизирующий эффекты сохранялась. 60-минутное кипячение сислых (но не нейтральных) фильтратов снижало их способность оказывать ггероингибирующий и Р-адреносенсибилизирующий эффект. Следовательно, ЭБМ, ЭСБАР и утеростимулятор не являются фибриногеном, альбумином и "лобулинами, не разрушаются в процессе замораживания и размораживания, остойчивы к длительному воздействию высоких концентраций этилового :пирта, способны проявлять свой эффект в кислой среде. Утеростимулятор >азрушается при кипячении в кислой и нейтральной среде, а ЭСБАР и ЭБМ гастично разрушаются при кипячении в кислой среде. Эти данные еще раз оказывают на то, что ЭБМ и ЭСБАР являются низкомолекулярными

s

веществами, а утеростимулятор - это полипептидный фактор, устойчивый к этиловому спирту.

На следующем этапе изучения природы утероактивных и адрено-модулирующих факторов нами совместно с сотрудниками НИИ микробиологии МО РФ Дармовым И.В. и Дробковым В.И*, сыворотка крови беременных женщин со сроком гестации 5-13 нед. была подвергнута ультрафильтрации, при которой применялись мембранные фильтры фирмы Sartorius (Германия), пропускающие биополимеры с молекулярной массой не более 5000 Д. Былс показано, что содержащиеся в исходном материале утеростимулятор, ЭБМ и ЭСБАР обнаруживаются в концентрате и в ультрафильтрате. Следовательно, молекулярная масса ЭБМ, ЭСБАР и утеростимулятора меньше 5000 Д Эксперименты с этой же сывороткой, подвергнутой хроматографическом) фракционированию на колонках, заполненных сорбентом Sefadex G-10. который пропускает биополимеры с молекулярной массой от 100 до 1000 Д., показали, что в 36 фракциях, получаемых при использовании в качестве элюатг раствор Кребса, утеростимулирующий эффект наблюдается редко - в 13-33°/ опытов (преимущественно его оказывали фракции, содержащие вещества, поглощающие длину волны 280 нм). Это позволяет считать, чтс утеростимулятор представляет собой смесь веществ, большая часть, из которых имеет молекулярную массу, превышающую 1000 Д (но меньше 5000 Д), г другая - менее 1000 Д (вероятно, в пределах 800 Д). С учетом представленных выше данных, в том числе свидетельствующих о низкой устойчивости утеростимулятора к кипячению, это позволяет утверждать, что утеростимулято;: является смесью среднемолекулярных пептидов с молекулярной Maccoí порядка 800 - 2 000 Д. Утероингибирующий эффект оказывали практически все фракции, хотя и с разной частотой (от 70-100% до 29-30%). Следовательно. ЭБМ, скорее всего, является низкомолекулярным веществом (с массой i пределах 100-150 Д), способным сорбироваться на молекулах средних размеров ß-Адреносенсибилизирующий эффект оказывали также практически все фракции: в одних (преимущественно, это фракции, содержащие вещества поглощающие свет с длиной волны 280 нм) этот эффект наблюдался в 33-40°/< опытов, в других - в 13-29%. Эти данные позволяют утверждать, что ЭСБАР представляет собой низкомолекулярное вещество (молекулярная масса его не превышает 100-200 Д) или смесь этих веществ, способных так же, как и ЭБМ сорбироваться на молекулах средних размеров.

Проведенная серия экспериментов не исключала, что ЭБМ и ЭСБАР могуч быть аминокислотами. Поэтому в следующих 25 сериях экспериментов изучал» способность 20 аминокислот в концентрациях, близких .к содержании: их в сыворотке крови (10'5 г/мл и ниже), оказывать утероактивные и

* - автор приносит им свою искреннюю благодарность.

Габл. 1. Суммарная сократительная активность (в % к исходному уровню) продольных полосок рога матки небеременных крыс при воздействии аминокислоты и адреналина, в концентрации 10"8 г/мл.

Аминокис- Число Суммарная сократительная активность

лота и ее концентрация, г/мл. наблю дений Исходная, мН/10 мин На фоне аминокис На фоне адреналина На фоне адреналина с

лоты аминокислотой

1-Гистидин,

ЗхЮ'5 19 67.8±10.2 93±5.9 105±7.4 52±8.6*

3x10"6 18 60.0±8.9 79±6.7* 90±7.2 36±10.4*

ЗхЮ"7 18 56.3±8.7 93±6.8 93±5.2 33±8.9*

3x10"8 17 55.6±6.5 49±9.8Х 90±6.1 35±4.3*

1-Триптофан 10"5 10 64.2±16.5 74±19.1 93±16.4 24±14.3*

йД-Тирозин 2xl0-i И 52.9±7.0 91±10.2 85±11.1 7±2.1*

2x10"6 14' 54.4±21.1 64±13.Г 98*14.6 39±14.4*

Примечание: * - различие с исходным уровнем (для аминокислоты) достоверно, р<0.05.;

* - различие между эффектом адреналина и эффектом, адреналина совместно с

аминокислотой достоверно, р<0.05.

црепомодулирующие эффекты на продольных полосках рога матки ебеременных крыс. Установлено, что ни одна из 20 исследованных линокислот (каждая в отдельности или в смеси) не вызывала увеличение араметров ССА, т.е. не оказывала утеростимулирующего эффекта. Десять линокислот в концентрации 10"5 г/мл и меньше (вплоть до 10' г/мл), в том деле 1-аргинин, 1-гистидин, (1,1-изолейцин, 1-лизин, d.l-метионин, 1-триптофан, ■аланин, 1-аспарагин, 1-аспарагиновая кислота и с1,1-тирозин (каждая в гдельности или в смеси) оказывали утероингибирующий эффект, т.е эстоверно снижали частоту СА, амплитуду и суммарную активность, но этот Ьфект не блокировался обзиданом (10"6 г/мл), и, скорее всего, обусловлен юсобнсстыо аминокислот оказывать прямое блокирующее влияние на тьциевые каналы миоцитов матки. Другие десять аминокислот - dj-валин, 1ейцин, dJ^TpeomiH, с!,1-фенилаланин, глицин, ¿,!-глутамиповая кислота, -лутами, dj-пролин, dj-серин и 1-цистеин не проявляли утероингибирующего )фекта.

В этих же экспериментах было показано (табл. 1; рис. 1.), что 3 аро-яические аминокислоты - 1-гистидин (3x10" - 3x10"5 г/мл), 1-триптофан х!0"5 г/мл) и ¿.¡-тирозин (2хЮ"6 и 2х10'5 г/мл) - каждая в отдельности или

1Лки

Рис. 1. Влияние различных концентраций триптофана (А - 10"* г/мл, Б - 10'7 г/мл) и тирозина (В - 2х10 6 г/мл, Г - 2х10"7 г/мл) на спонтанную сократительную активность и р-адренореактивность продольных полосок рога матки небеременных крыс. А 10"8 -адреналин, 10"8 г/мл. Калибровка - 10 мН, ] 0 ми я.

в их смеси оказывали выраженное р-адреносенсибилизирующее действие, т.е усиливали ингибирующий эффект адреналина. Например, в опытах с 1-гистидином (3x10'6 г/мл) адреналин в концентрации 10" г/мл при первом тестировании снижал суммарную активность до 90±7.2 % от исходного уровня, на фоне аминокислоты - до 36±10.4 %, а после нее - незначительно повышал суммарную активность до 102±7.7%. Остальные 17 аминокислот не изменяли Р-адренореактивность тест-объекта, но и не препятствовали проявлению р-адреносенсибилизирующего эффекта гистидина, триптофана и тирозина. Таким образом, наше предположение о том, что ЭСБАР является . низкомолекулярным веществом, в определенной степени, подтверждалось результатами данной серии исследований.

Для доказательства идентичности ЭСБАР с этими тремя аминокислотами были проведены 42 серии экспериментов, основная часть которых выполнена на продольных полосках рога матки небеременных крыс по аналогии с экспериментами, проведенных ранее в нашей лаборатории (Циркин В.И. и соавт., 1996, 1997; Циркин В.И., Дворянский С.А., 1997; Сизова Е.Н., 1998) при использовании в качестве источника ЭСБАР сыворотки крови и других биожидкостей. В этих опытах нами были получены убедительные доказательства способности гистидина, триптофана и тирозина в полной мере воспроизводить физиологические эффекты ЭСБАР. Кратко эти результаты можно суммировать следующим образом.

бл. 2. Влияние 1-гистидина на релаксиругащий эффект адреналина в условиях тонического сокращения изолированных гладких мышц.

ест-объект Число наб-лю- Вещество, повышаю- Величина исходного Концентрация вещества (г/мл) и величина тонуса (в % к исходному уровню) в его присутствии

де-ний щее исходный тонус тонуса, мН Адреналин 1-Гистидин Адреналин совместно с 1-гис-тидином

[иометрий )ысы 12 KCl, 60 мМ 5.8±0.7 Ю"8, 88±6.61 ЗхЮ"6, 86±4.9 40±8.6*

рахея >ровы 16 Ацетил холин, 10"6 г/мл 11.3±1.3 Ю"8, 81±5.1 ЗхЮ"6, 91±2.0 45±7.1*

оронары 1иньи 26 KCl, 25 мМ 11.0±1.3 10"0, 59±4.6 ЗхЮ'7, 92±2.0 41±6.0*

Примечание: изменения исходного тонуса под влиянием адреналина, 1-гистидина или при ix совместном воздействии - во всех случаях достоверны, р<0.05.; * - различие с >ффектом адреналина и с эффектом 1-гистидина достоверно, р<0.05.

1. Гистидив (Зх1(Г25 до ЗхЮ"5 г/мл) достоверно проявлял дреносенсибилизирующий эффект, начиная с концентрации ЗхЮ'8 г/мл и ше (в 90-100% опытов); в диапазоне от ЗхЮ"25 г/мл до Ю'9 г/мл вероятность >людения этого эффекта была намного ниже (в пределах от 20 до 70%). Это гачает, что ß-адреносенсибилизирующий эффект гистидина эквивалентен гьной сыворотке крови, а также 10-, 100- и 10 -кратным ее разведениям.

2.1-Гистидин в концентрациях 3x10" и ЗхЮ"6 г/мл, что эквивалентно 10 - и кратному разведению сыворотки крови, снижал константу диссоциации (Кд) шарного эффекта в 1.7 и 10.6 раза соответственно. Следовательно, подобно )-кратно разведенной сыворотки крови как источнику ЭСБАР, личивающей, согласно Сизовой E.H. (1998), чувствительность миометрия к юналину в 10-100 раз, ]-гистидин способен повысить ß-адренореактивность эметрия крысы также не менее чем в 10 раз.

3.1-Гистидин (ЗхЮ'7 г/мл) подобно сыворотке крови как источнику ЭСБАР фкин В.И. и соавт., 1994; Джергения C.JL, 1995), способствовал проявлению эзидана (Ю"6 г/мл) ß-адреномиметической активности.

4. 1-Гистидин (ЗхЮ"11 - ЗхЮ"5 г/мл) при непрерывном воздействии на

шетрий проявлял ß-адреносенсибилизирующий эффект также долго (не

Гисзхю"6 Тка 20 мм

10 мН

10 мин

Рис. 2. Влияние различных концентраций гистидина (Гис) Р-адренореактивность продольной полоски (А) рога матки небеременных кры условиях длительного воздействия гиперкалиевого (КС120 мМ) раствора. А К

адреналин Ю"8 г/мл. Стрелка вниз - начало действия гиперкалиевого раствора, стре. вверх - конец действия гиперкалиевого раствора. Калибровка - 10 мН, 10 мин

менее 60 минут), как и сыворотка крови (Сизова E.H., 1998); кроме того, < препятствовал развитию десенситизации к адреналину.

5. 1-Гистидик (ЗхЮ"8 - ЗхЮ"6 г/мл) подобно сыворогке как исхочни] ЭСБАР (Сизова E.H., 1998), восстанавливал сниженную под влиянием длительного воздействия шперкалиевого (20 мМ KCl) раство] ß-адренореактивность продольных полосок рога матки крысы (рис. 2.)

6. 1-Гистидин (ЗхЮ"6 г/мл), 1-триптофан (10"6 г/мл) и а,1-тирозин (2х1( г/мл) проявляли ß-адреносенсибилизирующий эффект (Табл. 2) в услови) деполяризации, вызванной гиперкалиевым (60 мМ KCl) раствором, т.е. i фоне калиевой контрактуры. Следовательно, ß-адре н о с ен си би лиз иру ю пи эффект аминокислот, как и сыворотки крови (Сизова E.H., 1998), не зависит < уровня мембранного потенциала.

7. 1-Гистидин, I-триптофан и с!,1-тирсзйн, подобно ЭСБАР, оказывав ß-адреносенсибилизирующий эффект избирательно: существенно повышаг реакцию тест-объекта на адреналин и норадреналин и не изменяли ее i дофамин и ß-адреномиметик гинипрал.

8.1-Гистидин (ЗхЮ"6 г/мл), 1-триптофан (Ю"6 г/мл) и (1,1-тирозин (2х10"6 г/мл подобно сыворотке крови как источнику ЭСБАР (Циркин В.И. и соавт., 199 Осокина A.A., 1998), не изменяли стимулирующий эффект ацетилхолина (1С г/мл), т.е они не проявляли М-холиномодулирующих свойств, чте

JVI/VvaJ^^

Гис 3x10 А 10" 7

ХУиШШАли

А 10 е Гис 3*10"® A10-S

Рис. 3. Влияние различных концентраций гистпдина (Гис: 3x10Л г/мл - панель А; КГ6 г/мл - панель Б) на спонтанную сократительную активность и дренореактивпость изолированных полосок миомегтрии беременных женщин, эеделяемую по адреналину, 10'7 г/мл и 10"8 г/мл. Калибровка - 10 мН, 10 мин.

казызает на Еысокую специфичность ß-адреносенсибилизирующего эффекта минокислот.

9. 1-Гистидин (ЗхЮ"7 и ЗхЮ"6 г/мл) в опытах с полосками миометрия временных женщин, прооперированных накануне срочных родов, эепятствовал проявлению стимулирующего действия адреналина (рис. 3), что уьясняется повышением ß-адренореактивности миометрия. Это впервые ¡монстрирует возможность срочной регуляции ß-адренореактивности аометрия беременных женщин с помощью 1-гистидина и указывают на :рспективность применения гистидина, триптофана и тирозина в акушерстве.

10. Исследуемые аминокислоты, подобно сыворотке крови (Циркин В.И. и авт., 1996; Сизова E.H., 1998), существенно повышали способность реналина (Ю-0 г/мл и 10"8 г/мл) снижать тонус циркулярных полосок ронарных артерий свиньи (1-гистидин, ЗхЮ"7 г/мл; табл. 2; рис.4, А) и трахеи ровы (1-гистидин, ЗхЮ"6 г/мл; табл. 2; рис.4, Б; 1-триптофан, 10"6 г/мл; -тирозин, 2х] О"6 г/мл), повышенный гиперкалкевым (25 мМ KCl) раствором и етилхолином (10"6 г/мл) соответственно. Это говорит об универсальности эдреносенсибшгазирующего эффекта гистидина, триптофана и тирозина по ношению ко всем клетках организма, содержащих ß-AP, а также о важной пи этих аминокислот в регуляции деятельности внутренних органов, в работе зга и о необходимости изучения вопроса относительно их использования для эфилакгики и лечения ишемической болезни сердца (в условиях стрессовых

7

А 10

А10*« Г не Эх10"7 А10-*

Д1Г® 1ка25*М

Рис. 4. Влияние адреналина (А, 10"8 , ШО"6 г/мл) и гистидшгл (Гис, ЗхЮ"6 г/мл, 3x10' г/мл) на тонус циркулярных полосок коронарных артерий свиньи (панель - А) и трахе! коровы (панель - Б), повышенный ацетилхолнном (АХ, 10"6 г/мл) или гиперкалиевы» (КС1 25 мМ) раствором соответственно. Стрелки вниз, вверх указывают на начало и коне) действия утеротопических растворов. Калибровка -10 мН, 10 мин.

ситуаций), бронхиальной астмы, депрессивных состояний, а также ] акушерской практике.

11. В рамках гипотезы об ЭСБАР как комплексе веществ, включающеи гистидин, триптофан и тирозин, и основываясь на данных литературь (Западшок В.И. и соавт., 1982; Сметник В.П., Тумилович Л.Г., 1995) ос эффективности использования триптофана для лечения депрессивны: состояний при климактерическом синдроме, показано, что у 14 женщин (40-5: лет) с климактерическим синдромом, у которых наблюдалось выраженно< депрессивное состояние, р-адреносенсибилизирующая активность сыворотю крови была ниже, чем у 10 молодых здоровых женщин: 103-кра.тное разведенш * сыворотки крови проявляло этот эффект соответственно в 50% и 90% опыто] (р<0.05). Это подтверждает наше предположением о том, что основные симптомы климактерического синдрома, в том числе депрессивное состоянш обусловлены недостаточностью ЭСБАР (а, следовательно, низким содержанием гастидина, триптофана и тирозина) и объясняет эффективность терапш триптофаном.

Таким образом, результаты экспериментов убедительно свидетельствуют с том, что гистидин, триптофан и тирозин в полном объеме воспроизводят физиологические эффекты, характерные для ЭСБАР. Полагаем, что каждая и: этих аминокислот за счет аминогруппы и карбоксильной группы ) ароматического кольца - имидазольного, индольного и фенольногс соответственно - оказывает аллостеркческое влияние на каталитический центр

АР, в результате которого возрастает сродство Р-АР к агонисту и эфективность этого взаимодействия. Частично такое представление жазывается результатами экспериментов с имидазолом (1.4х10~9 - 1.4X10"4 ил), отличающимся от гистидина отсутствием карбоксильной группы и шногруппы при имидазольном кольце, который на миометрии крысы подобно -истидину оказывал утероингибирующий эффект, но не влиял на его адренореактивность.

В целом, мы полагаем, что ЭСБАР представляет собой фактор, состоящий нескольких низкомолекулярных веществ, часть из которых - гистидин, иптофан и тирозин. Все исследованные нами факторы - ЭСБАР, ЭБМ и еростимулятор, а также ЭББАР, вопрос о существовании и свойствах торого пока остается открытым, играют важную роль в регуляции ятельности внутренних органов и поэтому дальнейшее их изучение следует ссматривать как одно из перспективных направлений физиологии и

1дицины.

ВЫВОДЫ

1. В опытах с миометрием крысы подтверждена способность сыворотки рови, мочи, ликвора и околоплодных вод человека в зависимости от степени х разведения оказывать утеростимулирующий (исключение - ликвор и колоплодные воды), утероингибирующий, p-адреносенсибшшзирующий

р-адреноблокирующий эффекты, обусловленные наличием эндогенного геростимулятора, эндогенного ' Р-адреномиметика, эндогенного жибилизатора Р-адренорецепторов и эндогенного блокатора -адренорецепторов соответственно.

2. Утероингибирующая и p-адреносенсибилизирующая активности иожидкостей устойчивы к кипячению в нейтральной среде, к 24-часовому гри 38°С), к 7-14 суточному (при 18-20°С) и 2-4 месячному (в замороженном зде) хранению; эти виды активности у сыворотки крови сохраняются при калении из нее альбумина и глобулинов, при ее ультрафильтрации через ильтр, пропускающий биополимеры с молекулярной массой до 5000 Д, при !ль-фильтрации на сефадексе G-10, предназначенном для разделения веществ

молекулярной массой от 100 до 1000 Д. На основании этих шных предполагается, что эндогенный p-адреномиметик и эндогенный ясибилизатор Р-адренорецепторов являются низкомолекулярными ■ществами (с массой, не превышающей 150-200 Д).

3. Утеростимулирующая активность сыворотки крови сохраняется при калении альбумина и глобулинов, при ультрафильтрации, при многомесячном >анении в замороженном виде, но существенно снижается при гель-шьтрации, 24-часовом хранении и, особенно (как и р-адрёноблокирующая тивность), при кипячении. Это позволяет считать, что эндогенный

утеростимулятор (и, вероятно, эндогенный блокатор ß-адренорецепторо! представляет собой смесь среднемолекулярных пептидов.

4. На изолированном миометрии крысы показано, что ни одна из 2 аминокислот (10'3 г/мл и ниже) не обладает утеростимулирующей активность« 10 аминокислот - 1-аргинин, 1-гистидин, с!,1-изолейцин, 1-лизин, ё,1-метиони] 1-триптофан, ß-аланин, 1-аспарагин, 1-аспарагиновая кислота и сЦ-тирозин каждая в отдельности или совместно проявляют утероингибирующий эффек не связанный с активацией ß-AP; 3 из них - 1-гистидин (3x10'8 - ЗхЮ"5 г/мл 1-триптофан (10'5 г/мл) и d,l-тирозин (2х10'6 и 2х10'5 г/мл) - в отдельности или смеси, в том числе с другими 17 аминокислотами оказывают выражение ß-адреносенсибилизирующёе действие. Предшественник гистидина имидазс (1.4х10"9-1.4х10"4г/мл) подобным эффектом не обладает.

5. 1-Гистидин, 1-триптофан и й,1-тирозин в полной мере воспроизводя физиологические эффекты эндогенного сенсибилизатора ß-адренорецепторо] они избирательно увеличивают чувствительность миометрия крысы адреналину (в 10 раз) и к норадреналину, но не к дофамину и гинипрал; способствуют проявлению ß-адреномиметической активности у обзидана (10 г/мл); не влияют на М-холинореактивность миометрия; и ß-здреносенсибилизирующий эффект сохраняется длительно (не менее б минут), проявляется в условиях деполяризации (60 мМ KCl), на фог сниженной ß-адренореактивности, а также на других гладкомышечнк объектах (миометрии беременных женщин, трахея коровы, коронарная артерь свиньи).

6. Эндогенный сенсибилизатор ß-адренорецепторов представляет собс фактор, состоящий из низкомолекулярных веществ, часть из которых гистидин, триптофан и тирозин. Его физиологический эффект обусловлен ai лостерическим влиянием имидазольного, фенольного или индольного (но г бензольного) кольца, имеющего карбоксильную группу и аминогруппу, t

- каталитический центр ß-адренорецептора. Этот фактор играет важну физиологическую роль. Его снижение у женщин в период угасаю репродуктивной функции является одной из причин развития депрессивног состояния при климактерическом синдроме.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Туманова Т.В., Куноф В.К., Пьянкова Л.Г., Артемьева Т.П., Дворянски! С. А., Циркин В.И. Влияние температурных воздействий н: ß-адреносенсибилизирующую способность сыворотки крови и друга биожидкостей человека // Актуальные проблемы современной биохимии: Мат научн. конф. КГМИ. - Киров, 1996. - С. 50 - 51.

2. Циркин В.И,, Дворянский С.А., Заугольников B.C., Братухина C.B. Сизова E.H., Морозова М.А., Осокина A.A., Щушканова Е.Г., Туманова Т.В.

дякина Г.Я. Лекарственная терапия и эндогенные адреномодуляторы// карственное обозрение,- 1996, N 2. -С. 3-10.

3. Туманова Т.В., Дармов И.В., Дробков В.И., Циркин В.И., Дворянский V. Влияние аминокислот на сократительную активность и дренореактивность миометрия // Вестник Вятского педуниверситета,- 1997.-[п. 2,- С. 20-21.

4. Циргшн В.И., Дворянский С.А., Абдуллаев Д.Н., Сазанов A.B., занова М.Л., Туманова Т.В., Анисимова О.В., Митюкова А.Р. Влияние гагонистов кальция на спонтанную и вызванную сократительную активность эдольной мускулатуры рога матки крысы // Лекарственное обозрение.- 1997.-3.-С. 44-51.

5. Циркин В.И., Дворянский С.А., Братухина C.B., Сизова E.H., (розова М.А., Шушканова Е.Г., Осокина A.A., Туманова Т.В., Снигирева Н.Л. догенные модуляторы адрено- и холинореактивности органов и тканей и их (можная роль в развитии патологических процессов// Тез. 1 съезда гологоанатомов России. - М., 1997,-С. 116-117.

6. Циркин В.И., Дворянский С.А., Братухина C.B., Неганова М.А., зова E.H., Шушканова Е.Г., Осокина A.A., Туманова Т.В., Березина Г.П., дякина Г.Я. Эндогенный блокатор ß-адренорецепторов //Бюлл. эксп. биол. и цицины,- 1997,- Том 123, N 3,- С. 248-252.

7. Циркин В.И., Дворянский С.А., Джергения С.Л., Неганова М.А., тгухина C.B., Сизова E.H., Шушканова Е.Г., Видякина Г.Я., Туманова Т.В. ^дреномиметический эффект сыворотки крови человека и животных// :зиология человека -1997.- Т.23, N 3.- С. 88-96.

8. Циркин В.И., Дворянский С.А., Ноздрачев А.Д., Братухина C.B., >розова М.А., Сизова E.H., Осокина A.A., Туманова Т.В., Шушканова Е.Г., дякина Г.Я. Адреномодулирующие эффекты крови, ликвора, мочи, слюны и )лоплодных вод человека // Доклады Академии наук,- 1997. - Том 352, N 1. -

9. Туманова Т.В., Дворянский С.А., Циркин В.И., Дармов И.В., Дробков 1, Сизова E.H., Морозова М.А., Братухина C.B. Эндогенный сенсибилизатор дренорецепторов: природа и его роль в процессах адаптации организма// териалы VIII международного симпозиума "Эколого-физиологические зблемы адаптации". -М., 1998. - С.383 - 384.

124-126.