Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярная организация и функциональные особенности структурных белков бактериофага Т4

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярная организация и функциональные особенности структурных белков бактериофага Т4"

РГ.Б од

»роелийдтсая академия медицинских наук

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВИРУСОЛОГИИ ^ ИМ. Д. И. ИВАНОВСКОГО

на правах рукописи УДК 576.858.9 [577.122; 578.23 ]

СЕЛИВАНОВ Николай Александрович

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРНЫХ БЕЛКОВ БАКТЕРИОФАГА Т4

03.00.03 - Молекулярная биология

ДИССЕРТАЦИЯ

НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ ДОКТОРА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

В ФОРМЕ НАУЧНОГО ДОКЛАДА

Москва - 1995

Работа выполнена в НИИ вирусологии имени Д.И. Ивановского Российской Академии Медицинских Наук.

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор В.В. Месянжлнов. Официальные оппоненты: ■

доктор медицинских наук, профессор Б.Н. Ильяшенко; доктор биологических наук С.Ю. Морозов; доктор химических наук В.А. Шибнев.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт химической физики в Черноголовке РАН

Защита состоится Ч£" ОКТЛ&А 1995 г. в 14 часов на заседании Специализированного Совета при Институте Вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН.

Автореферат разослан " 15" (Ц&мТ&'Ъ^Ух 1995 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета, доктор мед. наук

Н.П. Косякова.

I. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Бактериальные вирусы, и особенно бактериофаги Т-четной серии Esherichia coli, явились той модельной системой, при использовании которой были заложены основы молекулярной биологии. Сведения об организации генетического материала, механизмах генетической рекомбинации, коллинеарности гена и полипептидной цепи, регуляции экспрессии генов, а также, во многом, о принципах формирования сложных надмолекулярных структур, базируются на данных, полученных первоначально при изучении бактериофага Т4. В настоящее время, помимо решения фундаментальных задач, таких как исследование механизмов сплайсинга, фолдинга белковых молекул и закономерностей морфоге-нетических реакций, фаг Т4 служит и целям биотехнологии: использование фагоспецифических ферментов для генной инженерии и создание векторов клонирования и экспонирования.

Частица бактериофага Т4 состоит из десяти субструктурных компонентов: капсида или оболочки головки, муфты, шейки, воротничка, во-ротничковых нитей, хвостового стержня, хвостового чехла, базальной пластинки, коротких и длинных хвостовых фибрилл.

Адсорбция фага и введение вирусной ДНК в клетку является сложным многоступенчатым процессом, в котором задействованы три структурно и функционально разделенные системы: сенсорная - длинные и короткие хвостовые фибриллы, сократительная - хвостовой чехол и проводящая - хвостовой стержень. ( Kellenberger Е. et al., 1965, Virology, v. 26. p. 419 - 440; Anderson T.F., 1967, Virology, v.32, p. 279 - 297; Kells S.S., Haselkorn R., 1974, J. Mol.Biol., v. 83, p. 473 - 485 ). Введению нуклеиновой кислоты фага в бактерию предшествует ряд структурных перестроек вирусной частицы. Длинные хвостовые фибриллы, состоящие из дис-тальной ( ВС' ) и проксимальной ( А ) половинок могут находиться в двух альтернативных положениях - поднятом ( неактивная форма ) и опущенном ( активная форма ). В активном состоянии длинные фибриллы обратимо связываются с липополисахаридным рецептором клеточной стенки бактерии. Сигнал от окончания дистальной половинки фибриллы передается через проксимальную половинку на базальную пластинку и вызывает её реорганизацию. Короткие фибриллы, которые в на-тивном состоянии прижаты к базальной пластинке или каким-то образом экранированы, разворачиваются ( их длина при этом достигает 450 А ) и необратимо связываются со сложным липополисахаридно-белковым комплексом. В процессе передачи сигнала от проксимальной половинки

длинных фибрилл на короткие фибриллы важную роль играет продукт гена 9 ( пг 9 )* , который расположен в углах гексагональной базальной пластинки. Далее происходит перестройка базальной пластинки из гексагональной призмы в шестилучевую звезду и сопряженное с этим сокращение хвостового чехла. Сокращение чехла приводит к экспонированию хвостового стержня, который проходит через клеточную стенку, проникает в периплазму и достигает цитоплазматической мембраны. Центральная часть базальной пластинки остается связанной с дистальным окончанием стержня и обуславливает точечный лизис клеточной стенки. ДНК фага из головки по полому стержню поступает в периплазму и через цитоплазматическую мембрану транспортируется в клетку.

Такая строгая специфичность взаимодействия сенсорных систем вируса с клеткой и скоординированность структурных перестроек его специализированных компонентов обеспечивают фагу Т4 самую высокую, эффективность заражения ( равную 1.,) среди всех известных вирусов. .,

Таким образом, частица фага Т4, представляющая собой простейшую надмолекулярную машину, цель которой - эффективная доставка в клетку реципиента генетической информации вируса, является удобной модельной системой для изучения механизмов движения, структурных основ молекулярного узнавания, закономерностей морфогенеза, белок-белковых взаимодействий, транспорта ДНК в клетку.

К моменту начала наших исследований были определены и картированы гены, ответственные за синтез белков, участвующих в формировании большинства структурных компонентов вирусной частицы фага; накоплены предварительные данные о путях их сборки в специализированные органеллы и функционировании. Однако, оставались неизвестными нуклеотидная последовательность ряда поздних генов, способ формирования длинных хвостовых фибрилл из отдельных половинок, структура и механизм действия коротких фибрилл и структурно-функциональные особенности чехольного белка.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы являлось изучение молекулярной организации, физико-химических свойств и функционирования структурных белков бактериофага Т4, участвующих на первых стадиях адсорбции и инфекции данного вируса. В этой связи были поставлены следующие экспериментальные задачи:

* Испсии.юванпые сокращения: ПГ - продукт гена; ММ - молекулярная масса; ПААГ - пшшакрн-ламидцый гель; SDS - sodium doilecyl sulfate; vac- whisker's antigenc control, DTT - jurnio rpim ол.

1. Клонировать и определить нуклеотидные последовательности генов, кодирующих белки, которые участвуют в формировании субструктурных элементов частицы фага Т4.

2. Разработать методы очистки длинных хвостовых фибрилл и их компонентов, коротких фибрилл, бакенбард фага и белка чехла фагаТ4.

3. Изучить физико-химические свойства белков и субструктурных элементов частицы фага Т4.

4. Изучить механизм формирования длинных хвостовых фибрилл и чехла фага Т4.

5. Выяснить механизм бактерицидного действия коротких фибрилл на клетки E.coli в процессе инфекции.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Впервые определена первичная последовательность ряда поздних генов фага Т4 (9, 10, II, 12, wac - whisker's anligene control, 13, 14, 15, 34 и 35 ), что позволило восстановить аминокислотную последовательность кодируемых ими белков.

Разработан комплексный метод получения в гомогенном и биологически активном состоянии субструктурных элементов частицы фага Т4, необходимых для первоначальных стадий инфекции. Сформулирована и доказана модель функционирования воротничковых нитей фага Т4, построенных из продукта гена wac, как бикомплементарной матрицы, с помощью которой происходит заключительный этап формирования длинных хвостовых фибрилл.

Изучена функциональная активность коротких фибрилл бактериофага Т4. Впервые показано, что изменение ионной проницаемости клеточной мембраны и падение трансмембранного потенциала клетки на первых этапах инфекции фага обусловлено действием его коротких фибрилл. '

Определены физико-химические параметры проксимальной и дис-тальной половинок длинных хвостовых фибрилл, коротких фибрилл и воротничковых нитей - "бакенбард" фага.

Впервые показано, что каждая молекула белка хвостового чехла содержит одну молекулу ГТФ.

Изучена молекулярная организация белка хвостового чехла (иг 18 ) в его различных полимеризационных формах. Установлено, что в процессе сокращения чехла происходит структурная перестройка продукта гена 18.

Разработанные процедуры выделения коротких фибрилл (адгезии ), "бакенбард" (фибритин ), чехольного белка фага Т4 или их модификации используются в различных лабораториях ( Makhov A.M. et al., Virology, 1993, v. 194, p. 117-127; Николаева Л.И. и др., Молекулярная биология, 1987, т. 21, стр. 1268-1275 ). Полученные данные позволяют на модели белка чехла фага Т4 приблизиться к решению вопроса о механизмах действия механохимических белков ( Serysheva I.I. et al., J. Mol. Biol., 1992, v.223, p. 23-25 ). Полученные данные о первичной последовательности ряда поздних генов бактериофага Т4 нашли свое применение в работах по моделированию структурной организации фибриллярных, белков (Sobolev B.N., Mesyanzhinov V.V., J. Biomol. Struct. Dynam., 1991, v.8, p. 953-965 ) и разработке векторов экспонирования для антигенных детерминант вирусов человека ( Nepluev I.V. et al., Abstr. Inter. Symp. "100 years of Virology", St.-Petersburg, 1992, p.75 ) Результаты настоящей работы открыли новые возможности для изучения на модели структурных белков фага Т4 закономерностей процесса фолдинга белковых молекул ( Efimov V.P., Nepluev I.V., Mesyanzhinov V.V., 1995, Virus Genes, v. 10; Efimov V.P. et al., 1994, J. Mol. Biol., v. 242, p. 470-486; Sobolev B.N. et al., 1995, Evolut. Biochem. and Reí. Areas of Phys. Chem. / Edit. B. Pogia-zov et al., Moscow, 1995).

Основные положения , выносимые на защиту.

1. Гены фага Т4 с 9 по 14 формируют одну единицу транскрипции, которая контролируется единственным поздним промотором.

2. Гены 9 - 10 - 11 - 12 - кас объединены в кластер, в котором терминирующие кодоны перекрываются с инициирующими кодонами последующего гена. Таким образом, по-видимому, осуществляется регуляция синтеза данных структурных белков в эквимолярных количествах и, возможно, контролируется скорость образования хвоста фага.

3. Комплексный метод очистки отдельных структурных белков и субструктурных элементов вириона бактериофага Т4, участвующих в начальных стадиях инфекции, основанный на использовании множественных амбер-мутантов по поздним генам вируса.

4. Стехиометрия и принцип укладки белков, формирующих дистальную и проксимальную часть длинных фибрилл, а также коротких фибрилл.

5. Механизм бактерицидного действия коротких фибрилл связан с их взаимодействием с липополисахаридом и с белком ( ропп В - ошр Г ) внешней мембраны Е.соН.

6. Продукт гена 18 содержит в эквимолярном соотношении ГГФ. Переход чехла фага из растянутой конфигурации в сокращенную сопровождается конформационной перестройкой пг 18, выражающейся в значительном изменении вторичной структуры.

Апробация работы.

Результаты работы были доложены на ежегодных научных конференциях НИИ Вирусологии РАМН, начиная с 1985 года; 1-м всесоюзном биофизическом съезде ( Москва, 1982 ); международном симпозиуме ФЕМО ( Пущино, 1983 ); Ш-м советско-швейцарском симпозиуме "Биологические мембраны. Структура и функция." ( Ташкент, 1983 ); Всесоюзном симпозиуме "Актуальные проблемы бактериофагии и прикладной иммунологии" (Тбилиси, 1984); V-ой всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1984 ); XVi-м симпозиуме ФЕБО ( Москва, 1984 ); VI 1-м всесоюзном симпозиуме по химии белков и пептидов.( Таллинн, 1987 ); международном симпозиуме "Молекулярная организация биологических структур" ( Москва, 1989 ); Х-м всесоюзном симпозиуме по химии белков ( Тбилиси, 1990 ); VKI-m международном вирусологическом конгрессе ( Берлин, 1990 ); на научных семинарах департамента молекулярной биологии и микробиологии TUFTS University ( Бостон, 1989-1992 V, на летней конференции FAS ЕВ "Сборка вирусов" ( Sixton River, США, 1990 ); на конференциях "Бактериофаг Т4" ( Олимпия, США, 1987, 1989, 1991, 1993).

Работа в основном была выполнена в Институте Вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН как плановая тема. На различных этапах в ней принимали участие: Н.Л. Голицына ( Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, МГУ); А.Г. Прилипов, Е.И. Марусич, И.В. Неплюев ( Институт Вирусологии им. Д.И. Ивановского, РАМИ ); А.С.Тихоненко, А.Ф. Кретова ('Институт молекулярной биологии РАН ); проф. Е.В. Goldberg (TUFTS University, Бостон ); В.П. Зинченко ( Институт Биофизики РАН ); Б.Ф.Поглазов, И.И. Серышева ( Институт Биохимии им. А.Н. Баха); С.Ю. Веньяминов ( Институт Белка, Пущино).

Материалы диссертации опубликованы в 18 журнальных статьях и 13 тезисах докладов на всесоюзных и международных симпозиумах. Автором депонировано в EMBL, в GenBank тесть регионов последовательностей ДНК, включающих десять поздних генов бактериофага Т4.

И. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

1.1 Клонирование и определение нуклеотидной последовательности генов 9, 10,11, 1?, и'яс, 13,14,15,34 и 35.

Одной из основных задач, стоящих перед нами, было определение нуклеотидной последовательности генов, кодирующих структурные белки, ответственные за формирование компонентов, участвующих на начальных стадиях инфекции фага Т4. К моменту начала нашей работы были известны последовательности генов 36, 37 и 18 ( Oliver D.B., Crowther R.A., 1981, J. Mol. Biol., v. 153, p. 545-568: Arisaka F. et al„ 1988, J. Virol., v.62, p. 1186-1193). Нас интересовало, прежде всего, определение последовательностей генов 12, wac, 3.4 и 35.

54 1

921 I

gene 9 gene 10

Eco KV I Kpn i Асо I I pst ¡ i I ЕсоЩ I

I I i_J I

2728 I

3384 I

4964 1

6424 bp 1

gene 11 gene ¡2 I gene vac I Xba I

I Eco RV Nde 1 Kpn I Pst I !

I I IAfcoI| Hind Ul JlindlU

I Eco RI Eco R( ! [ I I

II I II I I I I I

I

3

lpTT15

I

6.5 kb

lpTX4

J pTT4

1

1

Рис. 1 Физическая карта, совмещенная с генетической, фага Т4 в районе генов с 9 по час.

Рестрикционная карта области генома фага Т4, включающей гены 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, wac, 13, 14, и 15 была первоначально установлена Е. Kutter ( Evergreen State College, USA ) и уточнена нами в ходе секвениро-вания ( рис.1 ). Генетическая и рестрикционная карты области генов 34 и 35 были ранее определены Н. Revel и Е. Goldberg.

Плазмиды, несущие гены с 9 по 15, были получены из клонотеки фага Т4, созданной в лаборатории молекулярной генетики И.В.Неллю-евым. Интересующие нас фрагмент!.! ДНК были переклонированы в фаги M13mp8, M13mplS и М13тр19. Кроме того, были созданы конструкции на основе вектора "Bluescript", и в данном случае мы использовали методику однонаправленных делений, разработанную фирмой "Strata-gene" ( Short J.M. et al., 1988, Nucl. Acids Res., v. 16, p. 7583-7600 ).

Соответствие клонированных фрагментов ДНК тем или иным генам фага Т4 определялось с помощью рестрикционного анализа и рекомбинации с различными амбер-мутантами бактериофага методом спасения маркера (Oliver D.B., Crowther R.A., 1981, J. Mol. Biol., v.153, p. 545-568 ). Субклоны с однонаправленными делениями ( около 200 нуклеотидов ) мы получали в двух направлениях. Таким образом, каждая область была прочитана по двум комплементарным цепям ДНК.

1.2 Анализ последовательности генов 9-12, wac, 13- 15, 34 и 35.

На основании полученных экспериментальных данных по секве-нированию и рекомбинации in vivo с амбер-мутантами установлено, что гены 9, 10, 11, 12 и wac представляют собой одну единицу транскрипции. Транскрипция данного региона относительно генетической карты фага направлена по часовой стрелке и инициируется с классического промотора ( TAT A A AT А ), расположенного перед геном 9 в позиции -10. Данная единица транскрипции включает в себя, по всей видимости, гены 13 и 14, продукты которых участвуют в завершении сборки головки, и ген 15, кодирующий белок, завершающий сборку хвоста.

Интересной особенностью области генов 9-15 является то, что инициирующий кодон каждого последующего гена перекрывается с терминирующим кодоном предыдущего. Подобное перекрывание описано для ряда регионов генома фага Т4 ( Broida J., Abelson J., 1985, J. Mol. Biol., v. 185, p. 545-563; Ishimoto L.K. et al., 1988, Virology, v. 164, p. 81-90; Tomaschewsky J., Ruger W., 1987, Nucl. Acids Res., v.15, p. 3632-3633 ) и других бактериофагов. Исключительность данного случая заключается в том, что перекрываются сразу пять генов, причем в описываемой области по типу перекрывания можно выделить две группы генов. В первую входят гены 9 - 10 - 11, и в этом случае перекрывание происходит в последовательности TAATG, где ТАА - терминирующий кодон. Во вго-

рую группу входят гены 11 - 12 - wac, и здесь перекрывание происходит в последовательности ATGA (рис. 2).

Сравнение последовательностей ДНК перекрывающихся генов с 9 по 12 не выявило значительной гомологии. Нужно отметить, что пред-пологаемые сайты связывания рибосомы расположены на одном расстоянии от инициирующих кодонов ( рис.2, подчеркнутые последовательности). Использование кодонов в генах 12 и пас очень схоже с другими поздними генами, кодирующими структурные белки фага Т4: ген 23 ( Parker M.L. et ai., 1984, J. Mol. Biol., v. 180, p. 399-416 ), ген 37 ("Oliver D.B.; Crowther R.A., 1981, J. Mol. Biol., v.153, p. 545-568 ) и ген 21 ( Keller В., Bickle T.A., 1986, Gene, v. 49, p. 245-251 )

Gene region

* Mcl

9 aatactataaactcataaggaaaccgctatcttcattcaagaacca

* Met

9-10 ctacgcagaaaatcggggtggctcaataatcaaacaaaatattaa

* Met

10 - П CAGTTTATCGTTGGATAAGGATTGCATAATGAGTTTACTTAATAAT

* Met

11-12 agtattttatcattttgagagaacagccatgagtaataatacatat

* Met

12 - wac ctttaaactacataattaagotaaaagaaigacagatattgtactg

Рис. 1 Сравнение нуклеотидных последовательностей в области инициаторных сайтов и окончаний генов 9, 10, П. 12, wac фага Т4. Последовательность ДНК была выровнена по инициаторным кодонам ATG.

Анализ нуклеотидной последовательности показал, что не имеется ярко выраженных гомологий в области генов с 9 по wac . Нет значительной гомологии и в белках данного оперона, хотя N-концевые области иг 9 и пг 10 демонстрируют высокую степень гомологии, схожесть в этих белках не выявлена ( рис.3 ). Из этого можно сделать заключение о том, что данные гены в этом опероне не являются продуктом дупликации.

За исключением гена 10 все открытые рамки считывания генов с 9 по .war кодируют белки, ММ которых практически совпадает со значени ями ММ, полученными с помощью электрофореза в ПААГ. Рассчитанная же на основании восстановленной аминокислотной последовательности ММ пг 10 на 22 кДа меньше, чем молекулярная масса пг J0, находящегося в составе вирусной частицы ( Berget Р.В., King J., 1978.

Virology, v. 86, p. 312-328 ). Можно предположить, что продукт гена Ю в зрелой вирусной частице является продуктом слияния двух соседних генов. Перескок с рамки на рамку ( "frame shifting" ) часто встречается в биологических системах и примером может служить gag-pol белок у ретровирусов ( Jacks Т., Varmus Н.Е., 1985, Science, v. 230, p. 1237-1242; Jacks Т. et al„ 1987, Proc. Natl. Acad. Sci„ v. 84, p. 4298-4302; Jacks T. et al„ 1988, Cell, v. 55, p. 447-458 ). Одним из доказательств фрэйм-шифтинга при образовании зрелого пг 10 с молекулярной массой 88 кДа может служить отсутствие ингибирования синтеза пг 10 при изучении кинетики образования поздних белков фага Т4 с использованием радиоактивной метки.

2 kqninignwddgtgdylrkggikin 7 kklxdtgeignastgd^lfdggnkin

28 ENFDELYYELGD 33 SDFNAIYNAFGD

321 agtvgmplfh 184 sgsvdiplfh

4 57 gtiyenavnpnnpvtymgfg

92 gtvtddslppgspitvlvfg

Рис. 3 Места локальных аминокислотных

гомологии продуктов генон 9, 10 и II.

1.3А Структурные особенности пг 12 и пг 34.

N-концевая часть пг 12 имеет шесть тандемно локализованных повторов длиной 40 - 50 аминокислотных остатков, которые ясно видны на самогомологичной матрице ( рис. 4а ). Вычисленная молекулярная масса этих повторов совпадает с молекулярной массой центральной части коротких фибрилл, полученной с помощью метода сканирующей электронной микроскопии ( Makhov A.M. et al., 1993, Virology, v. 194, p. 117-127).

ПГ 10 пг 9

пг 10 пг 9

ПГ 10

пг 9

пг 10 пг 11

Другой фибриллярный белок фаг а Т4 - пг 34 также имеет сходные повторы ( рис. 4Ь ) На матрице гомологии пг 34 - пг 12 ( рис. 4с ) видны параллельные перекрывающиеся участки, которые соответствуют повторяющимся гомологичным регионам обеих последовательностей. Пг 34 имеет десять таких повторов длиной 35 - 50 аминокислотных остатков.

На рис. 5 приведено выравнивание всех fö-ти повторов. Последовательность каждого повтора разделена на 2 субрегиона SRI и SR2, где строго консервативные позиции обозначены знаком * . Последовательность пг 12 имеет также 2 типа других коротких повторов, которые располагаются тандемно сразу же за повтором № 6. У них имеется слабая гомология с SRI участком больших повторов.

а)

Ь)

зрИ

С)

SP12

SP31

Рис. 4 Матрицы гомологии пг 12 и пг 34, рассчитанные с помощью пакета программ GENEBEE. Весовая матрица ВЬО£>иМ 62. Пороговое значение гомологии - 4 стандартных отклонения.

Таблица Л» 1

Аминокилотный состав продуктов генов 9, 10, 11, 12, кас. 34 и 35 бактериофага Т4.

9 10 11 12 мае 34 35

А1а А ) 20 16 О ) 26 (4 Зт) 14 (6 4?! 44 (8 34 22 14 54 105 (8 1-) 26 (8 8»

б1п 0 ) 9 (3 1 I 17 (2 8 5) 9 (4 15) 21 (4 04) 22 14 55) 60 14 7 4 12' (4 15

Не I > 31 (10 8 ) 44 (7 34 16 (7 3*) 32 (6 1?) 49(10 15) 86 (6 75) ' 17 (5 е-.

РЬе Г ) 8 (2. 8 ) 23 (3 84 10 (4 65) 14 (2 7%) 5 (1 05 ) ■47 (3 6-) 16 <5 4 5.

Сув С ) 3 (1 0 ) 5 (0 8') 0 (0 С- ) 3 (0 65) 0 (0 051 ', 0 (0 05) 1 (0 35

Агд К ) 8 (2 8 ) 21-, (3 54 5 12 34 27 (5 14 16 (3 34 66 (5 15) 15 (5 15

э1и Е ) 18 (6 3 ) 38 (6 34 9 (4 1?) 24 (4 6? ) 35>' ч'б 6? ) 65 (5 04 15 (5, 15

1ли I. ) 10 (3 5 ] 38 {6 34 . 15 (6 8*1 27 (5 14 41 (8 45) 88 (£ 84 27 (9, 25

£>го Р ) 6 <2 1 ) 27 (4 5-1 10 (4 6-1 24 (4 64 19 (3 9- ) 53 (4 15) 11 (3 75

Тгр И ) 2 (0 7 ) 11 (1 8;) 2 (0 9- ) 5 (0 95 ) ' 4 (0 85) 18 (1 44 2 (0 75

А»п N ) 19 (6 6 ) 50 (8 3?) 11 (5 0- ) 39 (7 44 47 (9 75) 90 (7 04 16 (5, 45

в1у 0 ) 24 (8 3 ) 57 (9 55) 17 (7 8т) 56(10 64 46 (9 45 ) 97 (7,54 21 (7 15

Ьу» К ) 16 (5 6-1 22 (3 7-) 10 (4 65 > 17 (3 24 20 (4 1- ) 54 (4 25) 10 (3 45

гвг г ) 29(10 15) 47 (7 85) 21 (5 65) 45 (8 54 52 (10 74 95 ( 7 44 31(10 55

Туг * ) 9 (3 15} 25 (4 25) 8 (3 7- ) 18 (3 44 7 (1 44 32 (2 54 12 (4, 15

Аар 13 > 15 (5 2%) 45 (7 5 1) 12 (5 5- ) 24 (4 65) 26 (5 3- ) 79 (5,74 13 (4 4т

Ну» н ) 4 (1 4 •) 7 (1 2:1 4 (1 8- 1 8 (1 54 2 10 4 г ) 8 (0 64 2 (0 7 5

Мег М ) 6 12 1 -) 5 (0 84 3 (1 4 5 ) 5 (1 7 ; 1 3 1 0 6- ) 11 (0 94 5 (1 75

ТЪг Т ) 25 (8 7 ■) 45 (7 54 24(11 0- ) 56(10 6 г 1 40 (8 24 144(11 2- ) 19 (6 55

Уа1 V ) 26 (9 0 г) 49 (8 !•) 19 18 7-) 34 (6 54 34 (7 04 97 (7 54 23 (7 8-

Сумм* 289 603 . 219 527 48 1290 294

(а)

др34 (1) 438

др34 12) 478

др34 (3) 518

др34 {4) 554

др34 (5) 603

др34 (6) 643

др34 (7! 679

др34 (8) 745

дР34 (9) 781

др34 (10) 824

др12 (1) 49

др12 (2) 88

др12 (3) 134

др12 (4) 183

др12 (5) 220

дР12 (6) 255

______SRI_________

1.......10........2 0

**** #**++*+

--STRARLGVIALATQAQANVDLENS PQ --ATETRRGIARIATTAQVNQNTTFS FA --ATETRRGVAEIATQQETNAGTD----

SR2

1.......10 ... .

**** 4-*

------KELAITPETLANRT--------------------------477

------DDIIITPKKLNERT--------------------------517

------DTTIITPKKLQARQ--------------------------553

— GSE5LSGIVTFVSTAGATPAS-RELNGTNVYNKNTDN LVVSPKALD Q Y К----------------------------602

--ATPTQQGAVILAVESEVIAGQSQQG---------W AN AWT PET LH К KT--------------------------64 2

-- STDGRIGLIEIATQS EVNTGTD-------------YTRAVTPKTLNDRR--------------------------67 8

— -ATESLSGIAEIATQVEFDAGVD-------------DTRISTPLKIKTRFNSTDRT--------------720

— ANETQRGTL RVATQ VE AAAGT L-------------DNVLITPKKLLGTК--------------------------780

— -STEAQEGVI KVATQS ETVTGT S-------------ANTAVSPKNLKWIAQSEPTWA------------823

— ATTAIRGFVKTSSGS I T F VGN DT VG S T Q D L E L Y E KN S Y AVS P Y ELN RVL AN----------------------87 4

PDASSTTKGILFIPTEQEVIDGTN-------------NTKAVTPATLATRLSY----------------------87

PNATETVYGLTRYSTNDEAIAGVN-------------N E S S I ТРАК FT VALN N A F ET R V----------133

— STESSN GVI KI SS LPQALAGAD-------------DT T AMTP L KT 0 Q L A I К L I AQ I A P S E T T 182

— ATE S D QGVVQL AT VAQ VR2 GT L R E G------------YAXSPYTFMNSS--------------------------219

— STEEYK GVI К LGT Q S EVN S N-----N---------A S V AVTG AT LN G R G--------------------------254

— - STTSMRGVVKLTTTAGSQSGGD-----------ASSALAWNADVIQQRG--------------------------291

В

(в)

gpl2 (7) gp!2 < e)

253 312

GQ I I Y GTLRI E DT FT I AN G 311 GANITGTVRMTGGiIQGNR 330

Рис. 5 Выравнивание гомологичных повторяющихся участков в последовательностях пг 12 и пг 34 (а). Выравнивание выполнено с помощью пакета программ GENEBEE (Бродский Л.И. и др.. 1991, Биополимеры и клетки, т. 7, стр.10-14; Brodsky L.I. et al., 1992, DIMAGS Series in Discrete Mathematics and Theoretical Computer Science, v.8, p. 127-139), с использованием весовой матрицы BLOSUM62 (HenikofTS.,Henikofr J.G., 1992, Proc.NatI.Acad.Sci..v.89,p.10915-10919 ). Выравнивание проведено вручную на основе парных мотивов, отобранных программой. Мощность выравнивания — 17.4 стандартных отклонения. (6) Короткие повторы в пг 12: *, + — строго и умеренно консервативные позиции: === — Р-тяжи: ллл — повороты и петли.

Повторы, входящие в А-единицу и схожие с регионами SR1 и SR2, обнаруживаются в фибриллярных белках фагов Mul,Pl иР2 ( Sandmeier Н. et al„ 1992, J. Bacteriol., v. 174, p. 3936-3944; Sandmeier H„ 1994, Mol. Microbiol., v. 12, p.343-350 ), неродственных фагу T4, что указывает на широкое распространение данных структурных единиц.

Согласно предсказания вторичной структуры повторов в последовательности в пг 12 и пг 34, каждый их них содержит по-4 коротких р-тяжа длиною от 3 до 5 аминокислотных остатков, которые обозначены как А; В, С и D. Повторы в пг 12 № 7 и № 8 содержат по 2 р-тяжа с 5-ю и 4-мя остатками. Паттерн с р-тяжем из чередующихся гидрофобных остатков ( период 1 - 3 ) может соответствовать позициям 9 - 11 в SR1 субрегионе. Менее строгий паттерн выявляется в позициях 3-5 субрегиона SR2. В SR1 17-й позиции и в SR2 10-й позиции выявляются два, как правило, неполярных остатка. Таким образом, "В" и "D" Р-тяжи содержат меньше гидрофобных остатков ( по одному ), чем типичные р-тяжи глобулярных белков. Возможно, что некоторые консервативные остатки могут формировать водородные связи в ядре тримера, как это обнаружено в p-спиральных структурах ( Yoder M.D. et al., Science, v.260, p. 1503-1507).

1.3Б Вторичная структура повторяющихся последовательностей

пг 12 и пг 34 .

Р-тяжи связаны различными по длине последовательностями. Первый их тип связывает два консервативных субрегиона, а другой связывает соседние повторы. Такие регионы, содержащие встав-ки/делеции, являются обычными для петель, но не для a-спиралей или р-тяжей ( Blundeli T.L. et al., 1987, Nature, v. 326, p. 347-352 ). Границы P-тяжей, также как и укороченные,повороты ( 4 остатка), предсказываются на основании конформационной специфичности консервативных остатков. Например, 7-я и 20-я позиции субповторов SR1 -региона в основном заняты Gly, который, как известно, является наиболее конформациокно подвижным остатком. Дипептиды Thr-Pro и Ser-Pro, занимающие 6-ю и 7-ю позиции в SR2-penioHe, являются обычными в 1-й и 2-й позициях р-изгибов I-типа ( Wilmot С.М., Thornton J.M., 1988, J. Mol. Biol., v. 203, p. 221-232 ). Вычисленная молекулярная масса всех повторов с 1-й по 8-и составляет 88,4 кДа, что очень близко к значению ( 86,0 кДа ), полученному при помощи метода сканирующей электронной микроскопии ( Makhov A.M. et al., 1993, Virology, v. 194, p. 117-127 ).

Наиболее подходящей моделью для центральной части коротких фибрилл является структура ß-пропеллера, содержащего 3 ß-листа, в котором каждый мономер формируег один протяженный антипараллельный ß-лист. Аналогичный трехлопастный пропеллер найден недавно у белка коротких фибрилл фага Р22. Данный фолд включает в себя 47 С -терминальных аминокислотных остатка и сформирован тремя параллельными ß-листами.

Модель тройной ß-спирали на примере фибрилл аденовируса основана на данных малоуглового рентгеноструктурного анализа пара'крис-таллов и анализе первичной последовательности данного белка ( Stouten P.F.W, et al., 1992, J. Mol.Biol., v. 200, p. 351-365 ). Согласно этой модели стержневая часть фибрилл аденовируса построена из трех параллельных ß-листов, причем каждый лист сформирован ß-тяжами всех трех мономеров, сдвинутыми друг относительно друга. Вследствие этого сдвига ß-тяжи расположены не перпендикулярно к оси тримера и шаг спирали ß-тяжа одного мономера возрастает до 0,65 нм. Учитывая вышеизложенное, центральная часть коротких фибрилл, содержащая 28 ß-тяжей в одной цепи, должна составлять 0,65 х 28 = 18,2 нм в длину, что близко к значению, полученному с помощью процессинга изображения ( 23,6 нм ) ( Makhov A.M. et al., 1993, Virology, v. 194, p. 117-127 ).

2.1 Очистка длинных хвостовых фибрилл, их половинок и "бакенбард" фага Т4.

Особенно удобным объектом для изучения роли регуляторных белков при сборке сложных фибриллярных комплексов представляют собой длинные хвостовые фибриллы фага Т4 ( Dickson R.L., 1973, J. Mol. Biol., v. 79, p. 633-647 ). Длинные фибриллы обеспечивают специфическое взаимодействие вируса с липополисахаридными рецепторами хозяина ( Simon L.D., Anderson Т.F., 1967, Virology, v. 32, p. 279-297 ) и запускают "триггерный" механизм сокращения хвостового чехла ( Simon L.D. et al., 1970, Virology, v. 41, p. 77-90; Crowther R.A. et al., 1977, J. Mol. Biol., v. 116, p. 489-523).

Каждая из шести фибрилл вируса состоит из двух дискретных сильно ассиметричных половинок - проксимальной ( А ) и дистальной ( ВС') ( Ward S. et al., 1970, J. Mol. Biol., v. 54, p. 15-31 ). Половинки фибрилл размером примерно 80 нм на 3,5 - 4,5 нм ригидно, но нековалентно, объединены под углом в 165°. Сборку длинных хвостовых фибрилл контролируют 6 генов фага ( гены 37, 36, 35, 34, 38 и 57 ), причем продукты двух

из них - пг 38 и пг 57 не включаются в законченную структуру ( King J., Laemmli U.K., 1971, J. Mol. Biol., v. 62, p. 465-477 ). Кроме того, в регуляции прикрепления фибрилл вирусной частицы участвует фагоспе-цифичёский белок - продукт гена 63, выполняющий также функции РНК-лигазы (Edgar R.S., Wood W.B., 1966, Proc. Natl Acad. Sri., v. 55, p. 498-505; Wood W.B., Henninger M:, 1969. J. Mol. Biol., v. 39, p. 608-618 ) и. другой фибриллярный субструктурный элемент фага - "бакенбарды" ( фибритин ), построенные из продукта гена wac. В клетке формирование головки, хвоста и хвостовых фибрилл у фага Т4 протекает независимо друг от друга. После объединения головки и хвоста к данному комплексу присоединяются длинные фибриллы, однако ясно, что сборка длинных фибрилл из двух половинок является узким местом при формировании полноценных инфекционных частиц фага. Из-за сильной структурной ассимметрии субчастей фибрилл процесс их спонтанного объединения стык - встык должен идти с низкой скоростью даже при высоких концентрациях компонентов. Впервые на скоординированность сборки фибрилл фага Т4 обратил внимание Терзаги, который на основании теста комплементации in vitro предсказал наличие особого "jig"- сайта для объединения субчастей длинных хвостовых фибрилл ( Terzaghi В.Е. et al., 1979, J. Mol. Biol., v. 127, p. 1-15 ). В качестве кандидата для "jig"- сайга рассматривались только "бакенбарды". Утрата "бакенбард" вследствие мутации приводит к уменьшению примерно в 10 - 20 раз числа инфекционных частиц. В данной работе мы поставили перед собой задачу количественно оценить процесс накопления в клетках целых фибрилл и их полноценных субчастей при блокировании сборки головки и хвоста фага. Поэтому, прежде всего, мы разработали метод выделения длинных фибрилл, А- и ВС'- половинок фибрилл, а также воротничковых нитей -"бакенбард" - фибритина.

В качестве источника указанных субструктурных элементов мы использовали экстракт клеток E.coli. зараженных тройным амбер - мутантом по генам 10, 18, 23 ( В255 - Е18 - НИ ). В дальнейшем, после получения нами данных по определению первичных последовательностей генов 9, 10, 11, 12, wac, 13, 14, 15 мы изменили стратегию очистки как длинных хвостовых фибрилл, фибритина, так и других, интересовавших нас структурных белков фага и его субструктурных элементов. Однако, придерживаясь хронологии, мы изложим здесь первоначальный метод очистки длинных хвостовых фибрилл, их половинок и "бакенбард", который впоследствии стал основой для других, более совершенных методик.

Клеточный экстракт 10~18~23~ из 10 л культуры обрабатывали при комнатной температуре ДНК-азой и РНК-азой с конечной концентрацией 40 мкг/мл с добавлением до 0,01% хлороформа. Далее лизат подвергали высокоскоростному центрифугированию ( 140 ООО g, 2 часа ) для удаления рибосом и фрагментов клеточных стенок и мембран. Поскольку дисгальная часть фибрилл обладает способностью взаимодействовать с липополисахаридными рецепторами клетки - хозяина, было очевидно, что большая часть фибрилл должна соосаждаться с бактериальным дебрисом. Известно, что сахароза является конкурентным ингибитором взаимодействия дистапьной части фибрилл с липополисахаридными рецепторами клеточной стенки E.coli ( Dawes J., 1975, Nature, v. 256, p. 127-128 ), поэтому добавление 0,2 М сахарозы в экстракционный буфер позволило нам максимально повысить выход дистальной и проксимальной половинок фибрилл, а также целых фибрилл в процессе их очистки, что было особенно существенно при последующем подсчете количества собранных фибрилл и их отдельных половинок. Многократная промывка осадка и переосаждение 4-5 раз обеспечили практически полный переход фибрилл и их половинок в супернатант. Полученный раствор, содержащий целые фибриллы и их компоненты, преципи-тировали с помощью сульфата аммония до 43 - 50% насыщения. Преципитат осаждали центрифугированием при 20 000 g за 30 минут, причем было достигнуто практически полное отсутствие целых фибрилл и их компонентов в супернатанте, что верифицировалось электрофорезом в ПААГ и комплементацией in vitro. Осадок растворяли в трис-НС1 буфере, рН 7,7, содержащим 0,2 М сахарозы, 1мМ MgCh и наносили на колонку с сефарозой 6В.

Согласно данных электрофореза и комплементации in vitro, длинные хвостовые фибриллы и их компоненты, а также фибритин, элюи-ровались в области, соответствующей высокомолекулярным комплексам ( 300 000 - 500 000 Да ), что соответствует области, близкой к исключенному объему. Далее отобранные фракции наносились на колонку с ДЕАЕ - целлюлозой, уравновешенную 20 мМ трис-HCl буфера, рН 7,7, с добавлением 0,2 М сахарозы. Элюцию проводили с помощью гра" диента концентрации NHd, ( 0,0 М - 0,5 М ), при этом ВС'- половинка элюировалась при 0,3 М Ni-bCl, а длинные хвостовые фибриллы выходили с колонки при концентрации NH-tCl от 0,4 М до 0,5 М размытым пиком. При дополнительной промывке колонки мы обнаруживали мономеры пг 37 и пг 34. Содержание объединенных фибрилл в лизате используемого тройного амбер-мутанта составляет около 10% от общего количества ВС'- и А-половинок (таблица № 2).

«

Дальнейшую очистку проводили на колонке с гидроксилапатитом, уравновешенной 0,01 М №-фосфатного буфера, рН 7.0, а элюцию проводили с помощью градиента концентрации данного буфера от 0,1 до 0,5 М. Полученные препараты белков и субструктурных элементов хранили при 4°С.

Таблица № 2

Результаты выделения половинок фибрилл и целых фибрилл ( в пересчете на одну бактериальную клетку )

Количество частиц

А-половинка ВС'-половинка Целые фибриллы

3,0 х 101 2,5x10' 2,К х 10!

2.2А Спектральные свойства половинок длинных фибрилл.

УФ-спектры поглощения определяли на спектрофотометре "Сагу-219" ( "Varian" ) в области 240 - 400 нм при 20°С в пяти- и десятимиллиметровых кюветах. Для расчета коэффициентов экстинкции проводили коррекцию на мутность растворов ( Winder А.F., Gent W.L., 1971, Biopolymers, v. 10, p. 33-37 ).

Многократные измерения УФ - спектров А- и ВС' - половинок фибрилл при 277 нм показали, что коэффициенты экстинкции данных структур практически совпадают и составляют 0,93 ± 0,06 и 1,01 ± 0,08 соответственно. Спектры КД измеряли на приборе "J-41А ( "Jasko" ). При расчете молярной эллиптичности на один аминокислотный остаток принимали значение его молекулярной массы равным 115 Да. Спектры кругового дихроизма, полученные из усредненных значений при определении в кюветах различной толщины и при нескольких концентрациях белка, приведены на рис. 6.

Результаты расчетов по методу Провинчера и Глокнера вторичной структуры А- и ВС'- половинок на основе полученных спектров КД в области 190 - 243 нм представлены в таблице № 3. По сравнению с ВС'-половинкой А- часть содержит примерно в 2 раза больше участков поли-

. <

пептидной цепи, находящихся в а-спиральной конформации. Обе половинки имеют высокое содержание (3-структуры и р-изгибов (табл. № 4 ).

Таблица № 3

Данные расчета вторичной структуры белков из спектров КД в области 190 - 243 нм.

Половинка а-спираль р-структура р-изгибы Неупорядо-фибрилл в0;. в" » в"о ценная

структура

В "и

А 2К 41 11 20

ВС' 7 54 12 26

Таблица № 4

Физические характеристики фибри пша и половинок длинных фибрилл.

Структура

А-половинка ВС'-половин ка фибритин

Коэффициент седиментации

(5) 9,2 10,0 4,2

Длина волны для максимума поглощения

( А.,нм ) 277,0 277,5 279,0

Коэффициент экстинкции и.|% ( А I см )

0,93 ± 0,06 1,01 ±0,08 0,94 ± 0.06

[в] * IV * ¡fi] • 10

град* см 3àM&a~J 2,0 \ 0,5 \ 0 \ -0,5 A / í

1,0

0 /X V / "-к 250 290 , A, HM

\ N \ 4 / \ \ 1 У / \ V У / \ /

-1,0 2 i ... ._ ■ '

190 210 230

X, нм

Рис. 6 Спектры КД проксимальной ( 1 ) и дисталыюй ( 2 ) половинок фибрилл.Вертикальные отрезки показывают стандартное отклонение от средней величины, полученной при различных концентрациях белка.

2.2Б Анализ распределения элементов вторичной структуры пг 37

В настоящее время известна первичная структура главного компонента дистальной половинки фибрилл - пг 37, который имеет 1026 аминокислотных остатков (Oliver D.B., Crowther R.A., 1981, J. Mol. Biol., V.153, p. 545-568 ). При анализе данной последовательности с использованием "иерархичного" алгоритма ( Chou P.Y., Fasman G.D., 1978, Annu. Rev. Biochem., v. 47, p. 251-276 ) не было выяснено каких-либо определенных участков, находящихся в a-спиральной конформамии ( Wood W.B., Crowther R.A., 1983, In: Bacteriophage T4, p. 259-264 ; Oliver

D.B., Crowther R.A., 1981, J. Mol. Biol., v.153, p. 545-568 J. Однако данные нашей работы по измерению спектров КД показали, что в дистальной половинке фибрилл примерно 7% аминокислотных остатков находятся в a-спиральных участках. Кроме того, использованный ранее "стерео-химический" ( Lim V.l., 1974, J. Mol. Biol., v. 88, p.-857-872; Lim V.l., 1974, J. Mol. Biol., v. 88, p. 873-894 ) анализ вторичной структуры пг 37 показал наличие в белке нескольких областей в a-спиральной конфор-мации ( Лим В.И., Месянжинов В.В., 1984, Докл. АН СССР, т.,/279. стр. 1006-1008 ). В данной работе при анализе последовательности пг 37 мы применили теорию расчета стабильности вторичной структуры белков, основанную на оценке внутренней стабильности отдельных участков и свободной энергии их встраивания в глобулу ( Финкельштейн A.B., 1975, Докл. АН СССР, т. 223, стр. 744-748; Ptitsyn О.В., Finkelstein А.V.. 1983, Biopolymers, v. 22, p. 15-25 ).

С применением данного подхода удалось показать, что большая часть аминокислотных остатков белка находится в конформации коротких ß-тяжей, ß-изгибах и неупорядоченном состоянии. Кроме того, достоверно обнаружено не менее 10 участков полипептидной цепи пг 37, которые могут быть в a-спиральной конформации. Наиболее протяженные из них образованы остатками аминокислот 214 - 260, 521 - 544, 795 - 813. СООН-концевой участок пг 37 ( остатки 1010 - 1026 ) также образует a-спираль. В целом компьютерный анализ показал хорошее совпадение содержания a-спиралей и ß-структур с данными расчетов на основе измерений спектров КД.

2.3 Топография структурных белков, находящихся в составе длинных хвостовых фибрилл.

Локализация многих структурных белков частицы фага Т4, в частности, двух основных структурных белков дистальной половинки фибрилл - пг 36 и пг 37, установлена с помощью иммунноэлектронной микроскопии ( Beckendorf S.K., 1973, J. Mol. Biol., v. 73, p. 37-53 ). Однако локализация пг 35, входящего в состав дистальной половинки, до сих пор не была выяснена.

Мы получили, используя обычную схему иммунизации, кроличью антисыворотку к высокоочищенному препарату фага Т4. Для очистки антител использовали колонку с протеин-A сефарозой из расчета 200 мг антител на 20 мл иммуносорбента. Антитела элюировали раствором

100 мМ глицина, рН 3,3 и сразу нейтрализовали 1 М трис-НС1 буфером, рН 8,0. Активность очищенных антител проверяли на способность комп-лексообразования с помощью теста на подавление инфекционности фага и электронной микроскопией. Для получения специфических антител к отдельным белкам длинных фибрилл препарат антител истощали дефектными лизатами амбер-мутантов фага по генам 34, 35, 36 и 37.

Рис. 7 Топография белков, входящих в состав длинных > хвостовых фибрилл, установленная на основе данных иммунной электронной микроскопии.

Таким образом были получены антитела только к индивидуальным структурным белкам длинных хвостовых фибрилл ( пг 35, пг 36, пг 37 и пг 34 ). Препараты изучали, используя электронный микроскоп "JEM 100В" при 100 кВ с увеличением 50000. С помощью антител к пг 35 нам впервые удалось показать, что данный белок расположен на конце ВС-половинки фибрилл, которая взаимодействует с А- половинкой. Антитела к пг 35 взаимодействуют с участком длиной 5,0 - 7,5 нм. До получения наших данных считалось, что добавление пг 35 к предшественнику дистальной половинки переводит его в функционально активную ВС-половинку, однако, не изменяет её антигенности ( Imada S., Tsugita А., 1972, Mol. Gen. Genet., v. 117, p. 319-336 ). Благодаря применению комплексного метода очистки нам удалось получить специфические антитела к пг 35 и локализовать данный белок в составе дистальной поло-

винки длинных фибрилл. По-видимому, пг 35 имеет всего лишь одну или несколько антигенных детерминант, способных специфически связываться с соответствующими антителами. Согласно нашим данным, пг 35 непосредственно контактирует с иг 34 и с пг 36 дистальной половинки фибрилл.

2.4 Объединение половинок фибрилл in vitro.

Изолированные и биологически активные препараты субструктурных элементов мы использовали для изучения объединения половинок длинных хвостовых фибрилл в условиях in vitro. Скорость сборки фибрилл мы определяли двумя независимыми методами: с помощью разработанного нами методического приема афинного разделения отдельных проксимальных полбёиИок-'фибрилл,,и целых фибрилл, а также методом комплементации in vitro. Это позволило нам дифференцировано изучить процессы объединения половинок и присоединения фибрилл к частице бактериофага.

-Известные физические методы ( седиментационный анализ, электронная микроскопия ) неприемлемы для количественного определения соотношения отдельных половинок и целых фибрилл в смеси. Во-первых, половинки фибрилл и целые фибриллы имеют близкие коэффициенты седиментации, 9 S и 10S соответственно. Во-вторых, в ходе наших исследований выяснилось, что проксимальная и дистальная половинки фибрилл и целые фибриллы адсорбируются на подложке с разной эффективностью. Для изучения объединения половинок фибрилл мы использовали способность ВС'- половинок и целых фибрилл специфически связываться с липополисахаридным рецептором клеточной стенки E.coli ( Wilson J.I i, et al., 1970, J. Mol. Biol., v. 51, p. 432-434).

Мы изолировали липополисахарид из E.coli В/1 и приготовили липосомоподобные шарики, которые количественно можно было осадить на низких скоростях ( 20 ООО g ), При этом также осаждались те ВС'-половинки и целые фибриллы, которые связывались с рецепторами. Проксимальная половинка и "бакенбарды" с Л ПС не взаимодействовали и оставались в супернатанте. Содержание белков в супернатанте анализировали с помощью электрофореза в ПА АР. вырезали полосу, соответствующую пг 34 ( А- половинка ), и после экстракции красителя 25 % пиридином измеряли поглощение при 600 нм.

Инкубацию дистальных и проксимальных половинок фибрилл, смешанных в равных концентрациях ( 0,05 мг/мл ), проводили в буфере ( 0,02 М Na-K-фосфатный буфер, pH 7,0, содержащий 50 мМ NaCl,

10 мМ MgCh и ImM ДТТ ) при температуре 37°C. В этом случае сборка происходила очень медленно и за 5 часов инкубации количество объединенных фибрилл не превышало 4%. Ранее было показано, что при смешивании дефектных клеточных экстрактов, содержащих соответственно бесфибрильные фаги и фибриллы, процесс формирования инфекционных вирусных частиц ускоряется в присутствии индола ( Nashimoto Н., Uchida Н., 1969, Virology, v. 37, p.

Мы обнаружили, что индолилуксусная и индолилпропионовая кислоты ингибируют адсорбцию фага на клетке. Этот эффект, возможно, связан с удержанием длинных фибрилл в поднятом состоянии, что и вызывает замедление процесса адсорбции вируса. Кроме того, было показано, что индолилуксусная кислота может образовываться в клетках Е.саН. как продукт катаболизма триптофана ( Kosuge Т. et al., 1966, J.Biol. Chem., v. 241, p. 3738-3746 ).

Мы использовали в качестве кофакторов сборки фибрилл и идол ил-уксусную кислоту ( ИУК ), индолилпропионовую кислоту ( ИПК ) и триптофан. Добавление ИУК к инкубационной смеси незначительно ускоряло процесс объединения половинок фибрилл ( рис. 8 ). Более сильный эффект наблюдался в присутствии трехкратного избытка препарата изолированных бакенбард фага Т4. При совместном же действии бакенбард и ИУК ( оптимальная концентрация 5 мМ ) происходила резкая стимуляция образования целых фибрилл. За 5 часов инкубации сборка осуществлялась практически полностью. Если же мы предварительно об-

Рис. 8 Влияние "бакенбард" и индо-лилуксусной кислоты на скорость сборки фибрилл.

1 - А + ВС;

2 - А + ВС' + "бакенбарды";

3 - а+ вс' + иук;

4 - а + вс + иук +

"бакенбарды"

<f »

рабатывали "бакенбарды" гомологичной антисывороткой. а затем инкубировали их со смесью А- и ВС- половинок, то скорость объединения не отличалась от контрольной, и добавление ИУК в данном случае не сказывалось на эффективности сборки.

2.5 Роль бакенбард при завершении формирования инфекционных частиц фага Т4.

Исходя из данных, представленных в предыдущем разделе, мы не могли с полной уверенностью полагать, что бакенбарды в присутствии ИУК способствуют регулярной ассоциации дистальных и проксимальных половинок фибрилл. Не исключена была возможность неупорядоченной агрегации половинок фибрилл ( например, бок о бок ) с бакенбардами и связывания таких агрегатов за счет дистальной половинки с лииополисахаридными рецепторами. Для проверки функциональной активности вновь образованных длинных фибрилл мы использовали метод комплементации in vitro.

Прежде всего, мы сравнили скорость образования инфекционных вирусных частиц при добавлении к бесфибрильному фагу исходно объединенных фибрилл ( ABC1) и смеси отдельных половинок. Бесфибриль-ные частицы имели нормально прикрепленные бакенбарды. В экстракте присутствовал также пг 63, который ускоряет присоединение проксимальных половинок фибрилл к базальной пластинке хвоста фага ( Wood W.B. et al., 1978, J. Biol., v. 253, p. 2437-2445 ). Целые фибриллы значительно быстрее достраивали бесфибрильный фаг, чем смесь отдельных половинок. Добавление ИУК в инкубационную смесь в обоих случаях ускоряло образование инфекционных частиц фага. Результаты данных опытов свидетельствует о том, что ИУК, способствуя взаимодействию половинок фибрилл с бакенбардами, обеспечивает ускорение объединения А- и ВС'- половинок фибрилл, а также их присоединение к вирусной, частице. После выдерживания смеси дистальных и проксимальных половинок с бакенбардами в присутствии ИУК скорость образования инфекционных частиц была такой же, как и при добавлении к бесфибрильному фагу исходно объединенных фибрилл. Таким образом, в данной серии опытов мы доказали, что инкубация отдельных половинок фибрилл в присутствии бакенбард и ИУК приводит к образованию функционально активных органелл адсорбции бактериофага Т4.

Для определения стадии, лимитирующей процесс образования целых фибрилл, мы проводили преинкубацию дистальных и проксимальных половинок фибрилл с бакенбардами и ИУК. Затем к преинкуба-

ционной смеси добавляли недостающий компонент и после выдерживания в течение 60 минут ставили реакцию комплементации с бесфиб-рильным фагом. Значительная активация процесса наблюдалась в случае преинкубации проксимальной половинки с бакенбардами и ИУК. По-видимому, взаимодействие А- половинки с бакенбардами нуждается в кофакторе. Связывание ВС'- половинки с бакенбардами происходит значительно быстрее: однако и в этом случае добавление ИУК стимулирует данный процесс.

Дополнительные доказательства важной роли бакенбард в объединении половинок фибрилл мы получили при достраивании амбер-мутанта Т4, утратившего бакенбарды. Инкубация Т4\уас" частиц, суспендированных в 0,01 М №-фосфатном буфере, рН 7,0, с трехкратным избытком препарата изолированных бакенбард приводила к 10-ти кратному возрастанию титра фага.

2.6 Модель формирования длинных хвостовых фибрилл бактериофага Т4.

На основании экспериментальных данных мы предлагаем следующую модель сборки длинных фибрилл. ■

Формирование в клетке длинных фибрилл в отсутствии вирусных частиц идет медленно, что обусловлено сильной структурной ассим-метрией А- и ВС1- половинок. "Бакенбарды" имеют комплементарные поверхности для взаимодействия с обеими половинками фибрилл. Такое бикомплементарное связывание приводит к созданию необходимой локальной концентрации половинок фибрилл и обеспечивает их правильную ориентацию относительно друг друга. В клетке бакенбарды фага, по-видимому, эффективно выполняют свою каталитическую роль по сборке фибрилл лишь после присоединения к частице фага. В условиях in vitro и с низкой эффективностью in viva в отсутствии частиц фага бакенбарды также взаимодействуют с половинками фибрилл и ускоряют процесс их объединения ( рис. 9 ). Связывание А- половинки фибрилл с бакенбардами затруднено, поэтому вначале с бакенбардами взаимодействует дистальная половинка, что облегчает последующее прикрепление проксимальной половинки. ИУК является кофактором этого процесса и усиливает взаимодействие обеих половинок с бакенбардами.

Особо нуждается в кофакторе стадия связывания А- половинки с бакенбардами. В клетке хвостовые фибриллы фага находятся в "ир"-положении. При этом минимизируется возможность инактивации вирусных частиц на клеточных обломках при лизисе. Вероятно, что ИУК и ин-

ABC'

Рис. 9 Модель функционирования фибритина ( пг нос ) в качестве бикомплементарной матрицы для сборки длинных хвостовых фибрилл.

дол, являясь аллосгерическими эффекторами сборки, обеспечивают прочное связывание обеих половинок фибрилл с бакенбардами и тем самым способствуют как ускорению формирования инфекционных частиц, так и сохранению потомства фага.

По всей видимости, образование функционально активных надмолекулярных структур, состоящих из асимметричных субъединиц, с помощью белка-помощника носит универсальный характер и можег использоваться при формировании сложных клеточных комплексов.

3.1 Очистка и изучение физико-химических свойств коротких фибрилл фага Т4.

Частицы Т- четных бактериофагов, лишенные ДНК, - "тени" - способны нормально адсорбироваться и убивать клетки Eshcerichia coli ( Herriot R.M., Barlow J.L„ 1957, J. Gen. Physiol., v. 41, p. 307-315 ). Бактерицидная активность теней связана с короткими фибриллами фага. Взаимодействие коротких фибрилл приводит к быстрому прекращению всех макромолекулярных синтезов в клетке ( Keils S.S., Haselkorn R., 1974, J. Mol. Biol., v. 83, p. 473-485).

Короткие фибриллы представляют собой тример, состоящий из идентичных субъединиц белка, с молекулярной массой 55 ООО дальтон, которые кодируются геном 12 фага ( Mason W.H., Haselkorn R, 1972. J. Mol. Biol., v. 66, p. 445-469; Keils S.S.., 1975, Doct. diss. Univ. of Chicago, Chicago) . Продукт гена 12 является цинксодержащим металлопротеином, причем с каждой субъединицей белка связан один атом металла ( Zorzopulos J„ KozlofT L.M., ,1978, L Biol. Chem.. v. 253, p. 5543-5547 ). Кроме того, пг 12, накапливаясь после синтеза в клетке и взаимодействуя с внутренней мембраной, участвует в регуляции транспорта ионов цинка в бактерию ( KozlofT L.M., Zorzopulos J., 1978, J. Biol. Chem., v. 253, p. 5548-5552).

Для выделения коротких фибрилл мы использовали тройной ам-бер-мутант фага Т4 по генам 10, 18 и 23 ( В255 - El8 - Hl 1 ), у которого блокировано образование головки, хвоста и базальной пластинки.

Клетки E.coli выращивали в 20 л среды М9А при 32°С. Заражали фагом со множественностью 5 при концентрации клеток 4-6 х 10х кл/мл. Инфицированные клетки через 90 минут инкубирования осаждали на холоду, а осадки суспендировали в 100 мл 20 мМ трис буфера pH 7, 25, содержащего 10 мМ MgCh, 0,2 М сахарозы, 1 мМ дитиотриэтола (ДТТ ) и ДНК-азу ( 40 мкг/мл ) и замораживали в жидком азоте. Далее бактериальную массу обрабатывали ультразвуком (2,2 кгц ) и фрагменты бактериальных мембран осаждали при 130 000 g за 40 минут. Осадки мембран дважды промывали 0,05 М трис-HCl буфером, pH 7,25, содержащим 0,01 М №<ЭДТА, 0,2 М сахарозу и 1 мМ ДТТ. После переосаждения проводили трехкратную эксгракцшо тем же буфером, в который дополнительно добавляли 0,15 М KCl. При этом основная масса коротких фибрилл переходила в раствор. К объединенному супер-натанту добавляли (NHí^SOí до .43 % насыщения, затем осадок растворяли в 5-6 мл 0,02 М трис-HCl буфера, pH 7,7, содержащего 0,2 М сахарозы и 1мМ ДТТ, и наносили на колонку с сефарозой 6В.

Пробы анализировали с помощью электрофореза в ПААГ ( Laemmli U.K., 1970, Nature, v. 277, p. 680 - 685 ). а функциональную активность проверяли комплементацией in vitro и с помощью теста на бактерицидность. Для постановки реакции комплементации in vitro использовали дефектный клеточный экстракт E.coli В/1 амбер-мутанта фага по гену 12 - am N69. Аликвоту исследуемого раствора (10-20 мкл ) добавляли к 50 мкл экстракта, смешивали, инкубировали 12-16 часов и высевали на газон E.coli CR-63 ( пермиссивный штамм для амбер-мутантов).

Дальнейшую очистку проводили с помощью последовательной хроматографии на ДЕАЕ- целлюлозе ( DE-52, Watman ) и фосфоцеллюлозе. В случае DE-52 элюцию белков с колонки ( 1,5 на 10 см) проводили 100 мл линейного градиента (NH).iCl ( 0-0,25 M ) в 0,02 M трис-HCl-буфере, pH 7,7, содержащем 0,2 M сахарозы и 0,0001 M DTT. Короткие фибриллы элюировались в интервале концентраций'(NH)<C1 от 0,13 до 0,2 М. В ряде случаев проводили дополнительную хроматографию на колонке с гидроксилапатитом. При данном способе выделения мы получали не менее 1,5 мг белка коротких фибрилл.

По данным электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях полученный препарат коротких фибрилл являлся гомогенным и давал одну зону, соответствующую белку с молекулярной массой 56 000 Да. Обработка коротких фибрилл ЗМ мочевиной ( 2 часа при 25°С ) или 1% додецилсульфатом натрия ( 30 минут при 25°С ) не снижала их биологической активности и не приводила к диссоциации олигомерного комплекса на субъединицы. Подвижность йедиссоциироваиных коротких фибрилл соответствовала подвижности белка с ММ около 185 000 Да. Ранее с помощью гель-фильтрации и равновесного центрифугирования было показано, что ММ интактных коротких фибрилл равна 165 000 Да ( Keils S.S., Haselkorn R„ 1974, J. Mol. Biol., v. 83, p. 473-485; Mason W.H., Haselkorn R, 1972, J. Mol. Biol., v. 66, p. 445-469 ). Таким образом, наши данные дополнительно свидетельствуют в пользу тримерного строения коротких фибрилл, что позднее было подтверждено независимым методом ( Makhov A.M. et al., 1993, Virology, v. 194, p. 117-127).

Для определения изоэлектрической точки пг 12 мы обрабатывали препарат коротких фибрилл в течение двух минут при 100°С в присутствии 6М мочевины, 2% меркаптоэтанола и 1% додецилсульфата натрия ( O'Farrel Р.Н., 1975, J. Biol. Chem., v. 250, p. 4007-4021 ). После изофоку-сирования в ПААГ с амфолинами "3,5 - 10" ( "Pharmacia" ) обнаруживались две белковые зоны в областях pH 7,0 и 7,2 в соотношении, близком к 1 : 2. Однако, согласно нашим данным, препарат коротких фибрилл содержал только один N-концевой остаток - серил, что соответствует и данным по определению первичной последовательности гена 12. Мы полагаем, что короткие фибриллы построены из трех субъединиц пг 12, одна или две из которых, по-видимому, модифицированы. Если бы одна из видимых зон при изоэлектрофокусировании соответствовала бы не пг 12, а другому белку с молекулярной массой 56 000 Да, то при электрофорезе в полуденатурирующих условиях мы наблюдали бы появление дополнительной зоны. Кроме того, при электрофорезе в денатурирующих условиях С14 - меченых-белков фага Т4 при амбер-мутациях по гену

12 не наблюдалось бы полного исчезновения полосы, соответствующей белку с ММ 56 ООО Да. Мы предполагаем, что модификация субъединиц пг 12 определяется функционированием регуляторного белка пг 57.

3.2 Изучение функциональной активности коротких фибрилл.

Известно, что очищенные короткие фибриллы обладают бактерицидной активностью. Мы сравнили действие изолированных коротких фибрилл, интактных частиц и "теней" фага Т4 на проницаемость мембран E.coli для ионов К+ , С2+ , Н+ . Кроме того, мы изучили изменение дыхания клеток, электрического потенциала и A pH на мембране. Фаг Т4 выращивали по обычной схеме и очищали в две стадии дифференциального центрифугирования. "Тени" фага Т4 получали по стандартной методике осмотического шока вирусных частиц.

Для измерения потоков ионов и флуоресценции бактерии помещали в термостатическую ячейку при 37°С с постоянным перемешиванием. Конструкция установки, описанной в ( Холмухамедов Э.Л. и др., 1980, Биофизика, т. 25, стр. 124 - 129 ) , позволяет одновременно измерять концентрацию ионов К+ , Н+ и Са2+ : концентрацию кислорода с помощью закрытого электрода типа Кларка и изменение люминесценции в трех длинах волн. К бактериям добавляли в различных концентрациях бактериофаг Т4Д, тени фага и изолированные короткие фибриллы. За изменением электрического трансмембранного потенциала следили по люминесценции красителя - 3,3 diethilthiodicarbocyanine iodide ( bis - С2 -5) ( Waggoner A.S., 1976, J. Membr. Biol., v.27, p. 317- 325 ): возбуждение люминесценции 580 нм, регистрация 670 нм. pH регистрировали по люминесценции 9 - аминоакридина ( Deamer D.W. et al., 1972, Biochim. et biophys. acta, v. 274, p. 323 - 329 ): возбуждение люминесценции 365 нм, регистрация 465 нм. Транспорт двухвалентных металлов в клетках оценивали по изменению люминесценции хлортетрациклина ( Caswell А.H., Hutchinson J.D., 1971, Biochem. Biophys. Res. Commun., v. 42, p. 4347 ). Возбуждение 436 нм, регистрация 530 нм.

При добавлении к суспензии клеток E.coli В/1 небольших количеств фага Т4, теней фага или коротких фибрилл (1-2 частицы или 5-8 коротких фибрилл на клетку ) наблюдается быстрая активация дыхания бактерий ( рис. 10 А ). В присутствии больших концентраций белка ( 20 -30 коротких фибрилл на клетку ) активация дыхания сменяется торможением вплоть до полного прекращения дыхания клеток.

Активация дыхания сопровождается выходом ионов К+ из бактериальных клеток ( рис. 10 В ), причем скорость этого процесса зависит от концентрации белка и имеет две фазы - быструю ( около 1 минуты ) и медленную. Увеличение ионной проводимости мембран Е.соН В/1 под действием коротких фибрилл и теней фага не является строго специфичным для ионов К+, так как мы наблюдали одновременно перенос через мембрану ионов Н+ и активацию дыхания.

Рис.10 Изменение концентрации кислорода ( А ), ионов К+ ( В ) и ионовН+ (С) в среде при взаимодействии фага Т4 или изолированных коротких фибрилл с клетками Е.соН В/1. Изменение люминесценции 9-аминоакридина (1,2х 10 6 М)- Д сШ-О-З (2хЮлМ)-£ и люминесценции хлортетрациклина ( 2 х 10 5 М ) - Г. Кривые под номером 1 соответствуют 2 частицам фага или 5-8 коротким фибриллам на клетку, а кривые под номером 2-10 частицам фага или 20 - 30 коротким фибриллам на клетку. Среда инкубации: 0,05 М трис-НС1 буфер, рН 7,3; 0,1МЫаС1, 0,1М глюкозы. Температура 37°С. Концентрация клеток 5 х 108 кл/мл.

I I

В период активации дыхания наблюдается увеличение концентрации ионов Н: в среде, которое не выявляется при действии небольших количеств белка или фага ( рис. ЮС). Выход протонов может быть результатом активации дыхательной протонной помпы вследствие возникновения анионной проводимости и движения неидентифициро-ваннйх' анионов наружу.

Наиболее интересным является факт повышения люминесценции хлортетрациклина в суспензии бактерий под влиянием коротких фибрилл ( рис. 10 F ). Этот процесс может быть результатом роста .концентрации двухвалентных катионов в мембране бактерий. При. ингйбировании дыхания в присутствии большого количества белка ( 20 - 30 коротких фйбрилД'на клетку ) или исчерпании кислорода в ячейке рост люминесценции сменяется падением, что указывает на энергозависимость данного процесса. Процесс не зависит от присутствия Mg2+ и Са2+ в среде инкубации и не снимается ЭГТАиЭДТА.

При действии малых концентраций белка отмечен небольшой рост А рН на мембране ( рис. 10 D ). Однако в начальный период активации дыхания, при действии больших концентраций белка, А рН практически не менялось. При ингибировании дыхания Д рН падает со скоростью, пропорциональной концентрации белка. Это свидетельствует о том, что проницаемость мембран клеток для Н+ практически не меняется в условиях эксперимента и дыхательная цепь бактерий в период активации дыхания способна компенсировать увеличение проницаемости для других ионов.

При добавлении небольших количеств коротких фибрилл или ин-тнктных частиц фага Т4 электрический потенциал на мембране обратимо падает ( рис. 10 Е ). Воздействие больших концентраций коротких фибрилл или "теней" фага приводит к необратимому падению потенциала.

Таким образом, зарегистрированные изменения потенциала говорят о том, что при действии коротких фибрилл происходит перемещение заряженных'частиц через мембрану-E.coli. Восстановление потенциала подтверждает наше предположение о сохранении низкой протонной проводимости мембран E.coli В/1 и возможности поддержания потенциала за счет работы Н+ -АТФ-азьг. Наши данные свидетельствуют о том, что нарушение проницаемости мембран бактерий, наблюдаемое на ранних стадиях инфекции фага Т4, обусловлено действием коротких фибрилл. По механизму бактерицидного действия на клетку ( возникновение К+ -проводимости, падение трансмембранного потенциала ) короткие фибриллы схожи с некоторыми колицинами ( К, El ) ( Gold J.M., Cramer W.A., 1977, J. Biol.Chem., v. 252, p. 5491- 5499 ).

о

Быстрое изменение ионного состава клетки при взаимодействии с фагом Т4 за счет действия коротких фибрилл, по-видимому, является основной причиной остановки синтезов макромолекул хозяина и способствует переходу на синтез ранних белков вируса.

Возможно, что молекулярный механизм действия коротких фибрилл на клетку идентичен действию колицина К. Установлено, что под влиянием колицина К происходит увеличение уровня флуоресценции хлортетрациклина в суспензии клеток" Е:coli ( Shein S.J. et al., 1978, Nature, v. 276, p. 159-163 ). Показано, что при использовании меченого хлор-тетрациклина стимуляция флуоресценции напрямую связана с поглощением данного вещества клетками в присутствии колицина К, что коррелирует с результатами наших экспериментов. Это свидетельствует о том, что на начальных стадиях взаимодействия фага и клетки реализуется аналогичный способ модификации клеточной мембраны, приводящий к увеличению ее проницаемости, как и в случае колицина К.

3.3 Идентификация рецепторного участка внешней мембраны E.coli В/1 для коротких фибрилл фага Т4.

Рецептором для связывания длинных хвостовых фибрилл фага Т4 ( обратимая стадия адсорбции ) с поверхностью клетки служит липопо-лисахарид ( ЛПС ) клеточной стенки бактерии. Кроме того, изолированный ЛПС способен инактивировать частицы фага. На основании этого мы предположили, что ЛПС имеет участки для связывания как длинных, так и коротких фибрилл фага. ЛПС из клеточной стенки мы выделяли с помощью экстракционной смеси, содержащей фенол, хлороформ и петролейный эфир в соотношении 2:5:8 по методу (Galanos С. et al., 1969, Eur. J. Biochem., v. 9, p. 245-249 ). Из ЛПС были приготовлены липосомоподобные визикулы, которые количественно осаждались при центрифугировании ( 20 ООО g ). После инкубации коротких фибрилл с ЛПС в течение 1 часа при 37°С их комплексы соосаждались при центрифугировании за 10 минут, что проверялось с помощью электрофореза в ПААГ, комплементацией in vitro и тестом на бактерицидность. Эти данные были подтверждены в независимых исследованиях ( Zorzo-pulos J. et al., 1982, Virology, v. 120, p. 33-41 ), где было показано, что изолированные короткие фибриллы способны связываться с ЛПС , находящемся как в свободном состоянии, так и в составе мембранных визикул.

Ранее было высказано предположение о рецепторной функции структурного белка внешней мембраны E.coli В - omp F ( Zorzopulos J. et al, 1979, J. Bacterio!., v. 137, p. 545-555 ) для фага Т4 на начальных этапах

фаговой инфекции. Для проверки этой гипотезы мы выделили и очистили белок omp F и изучили его способность специфически взаимодействовать с короткими фибриллами в растворе. Порин В экстрагировали из внешней мембраны E.culi В/1 30 мМ трис-HCl буфером, pH 7,1, содержащем 5 мМ ЭДТА и 2% тритона X—100. Очистку порина В проводили с помощью гель-фильтрации на колонке ( 1,5 на 30 см ) с сефа-розой 6В. В качестве элюирующего раствора использовали экстракционный буфер.

Прежде всего, мы исследовали влияние белка omp F на процесс достраивания 12" фаговых частиц в реакции комплементации in vitro. Было показано, что количество вновь образованных в результате комплементации частиц снижается в 10 раз в присутствии эквимолярного количества omp F и в 50 раз при его двукратном избытке. Обнаруженный эффект свидетельствует о том, что белок omp F, связываясь с короткими фибриллами, препятствует их встраиванию в базальную пластинку.

Мы также исследовали эффективность заражения сферопластов E.coli В/1 Т4М-частицами в присутствии белка omp F. Обработка частиц фага Т4 мочевиной приводит к разворачиванию коротких фибрилл и сокращению хвостового чехла. Молекула ДНК при этом остается в головке фага. Хвостовой стержень у Т4М-частиц экспонирован наружу и для инициации выхода ДНК достаточно связывание конца стержня с цитоплазматической мембраной бактерии. Добавление белка omp F в инкубационную смесь, содержащую сферопласты и Т4М-частицы, приводило к значительному снижению скорости инфицирования. Однако, конечное количество зараженных сферопластов при данной множественности заражения не отличалось от контрольной величины. По нашему мнению, это свидетельствует о том, что связывание коротких фибрилл с omp F-белком экранирует окончание хвостового стержня и затрудняет его взаимодействие с мембраной сферопластов.

Известно, что белки, относящиеся к классу поринов, способны встраиваться в бислойные липидные мембраны ( БЛМ ) и образовывать в них каналы. Мы использовали'это их свойство для проверки предположения о взаимодействии коротких фибрилл с белком omp F. Эксперименты с БЛМ мы проводили на установке А.Я. Зильберштейна ( Институт Биологической физики АН СССР, г. Пущино ), позволяющей следить за изменением проводимости мембраны в ответ на добавление в водную среду различных агентов. Добавление белка omp F в концентрации 3 х 10"6 М вызывало ступенчатое нарастание проводимости мембраны ( рис.11 ). В присутствии эквимолярного количества коротких фибрилл белок omp F терял способность встраиваться в мембрану и только

Рис.11 Изменение проводимости бислойной липидной мембраны при воздействии порина В ( ошр Р ) в зависимости от наличия в среде коротких фибрилл фага Т4: А - контроль, В - короткие фибриллы в концентрации 6 х 10"° М.

троекратное увеличение его концентрации по отношению к коротким фибриллам вызывало рост проводимости. Использованные в параллельных контрольных опытах бычий сывороточный альбумин и субкомпоненты длинных хвостовых фибрилл не оказывали ингибирующего действия на исследуемые процессы.

Таким образом, тремя независимыми методами мы продемонстрировали способность коротких хвостовых фибрилл специфически взаимодействовать в растворе с основным структурным белком внешней мембраны Е.соН В/1 - белком ошр Я. Наши результаты позволяют предположить, что ошр И, наряду с Л ПС, участвует в формировании рецеи-торной области для коротких фибрилл бактериофага Т4.

4.1 Очистка и изучение физико-химических свойств чехольного белка ( пг 18) бактериофага Т4.

Сократительный чехол бактериофага Т4 представляет собой простейшую однокомпонентную двигательную систему, состоящую из белковых молекул одного типа. Чехол построен из 144 субъединиц продукта гена 18 с молекулярной массой 71 160 Да ( Arisaka F. et al., 1988, J. Viro!., v.62, p. 1186-1193 ). В составе частицы фага хвостовой чехол может находится в двух крайних состояниях: растянутом и сокращенном. Переход из растянутой формы в сокращённую происходит в процессе адсорбции фага на бактериальную клетку и тем самым инициирует введение вирусной ДНК в бактерию ( Kellenberger Е., Arber W., 1955, Z. Naturforsch. В. v. 10b, p. 598-611). При этом его длина уменьшается от 95 до 38 нм, а диамегр увеличивается на 30%. Сокращение чехла носит необратимый характер и не нуждается в экзогенном источнике энергии.

Согласно трехмерной реконструкции, полученной на основе данных оптической дифракции электронно-микроскопических изображений растянутых и сокращенных чехлов, установлено, что сокращение не вызывает заметных изменений конфигурации субъединиц пг 18, а изменяется только их ориентация относительно продольной оси хвоста ( Amos L.A., Klug А., 1975, J. Mol. Biol., v. 99, p. 51-73; Smith P.R. et al„ 1976, J. Mol. Biol., v. 106, p. 243-275 ). Впервые наличие изменений во вторичной структуре пг 18 в процессе функционирования было установлено в работе (Venyaminov S. Yu. et al. 1975, J. Mol. Biol., v. 98, p. 657-664 ).

Целью настоящей работы являлось дальнейшее изучение свойств пг 18 и молекулярного механизма процесса сокращения чехла.

В качестве источника для выделения и очистки чехольного белка фага Т4 мы использовали амбер-мутант по гену 23 ( am HI 1 ), у которого в непермиссивных условиях ( E.coli В/1 ) блокировано образование головки. Выращивание проводили по стандартной методике при трехкратном заражениии со множественностью 5. Через 90 - 100 минут инкубирования культуры при 37°С бактериальные клетки осаждали ( 5 000 g, 10 минут ) и ресуспендировали в 20 - 30 мл 0,1 М фосфатного буфера, рН 7,0, который содержал 0,2 М сахарозы, 0,01 М MgChn 1 мМ ДТТ. Клетки разрушали при 4°С за 18-20 часов в присутствии 0,1% хлороформа, ДНК-азы ( 40 мкг/мл ), РНК-азы ( 40 мкг/мл ) и 0,01 М ЭДТА. Бактериальный дебрис удаляли с помощью центрифугирования при 10 000 g за 30 минут. Хвосты фага, находящиеся в супернатанте, осаждали за 4 часа при 140 000 g. Осадок суспендировали в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,0 с 1% сахарозой и дальнейшую очистку проводили по стандартной методи-

ке центрифугированием в градиенте концентрации сахарозы (10- 45% ). Для получения мономера чехольного белка проводили дезинтеграцию чехлов в мягких условиях, диализуя препарат хвостов примерно 48 - 60 часов при комнатной температуре против 0,001 М Na-фосфатного буфера, pH 7,0.

Крупные агрегаты белка и так называемые "вилы" ( комплекс базальной пластинки и стержня ) удаляли центрифугированием при 140 000g за 4 часа. Полученный электрофоретически гомогенный препарат концентрировали с помощью насадки СХ-30 ( "Millippre" ). Биологическую активность препарата мономера пг 18 верифицировали в реакции комплементации in vitro по стандартной методике с экстрактами Т418" клеток E.coli. Спектры поглощения пг 18 в мономерном состоянии и в виде полимеризационных форм регистрировали на спектрофотометре "Сагу-219" ("Varían") в области 240 - 400 нм при комнатной температуре в прямоугольных ячейках с длиной оптического пути 5-10 мм. Для вычисления коэффициентов экстинкции вводили поправку на мутность раствора ( Winder A.F., Gent W.L.G., 1971, Biopólymers, v. 10, p. 12431251 ). Концентрацию белка, как и во всех остальных случаях, определяли микрометодом с индофенольным голубым ( Jaenike L., 1974, Anal. Bio-chem., v. 61, p. 623-627 ), считая содержание азота в белке равным 16 %.

Молекулярную массу пг 18 определяли методом электрофореза в иолиакриламидном геле в присутствии ДДС натрия. Согласно нашим данным, пг 18 представляет собой полипептид с кажущейся молекулярной массой 73 000 Да, что совпадает с данными ( Tschop J. et al., 1979, J. Mol. Biol., v. 128, p. 247-258 ), но несколько отличается от более поздней работы ( Arisaka F., 1983, J. Pharm. Dynam., v. 6, p. 47-53 ) по прямому секвенированию гена 18. Согласно расчету, приведенному в данной работе, молекулярная масса пг 18 составляет 71 160 Да. В нашей работе при определении количества аминокислотных остатков в белке мы принимали значение его молекулярной массы равной 73 ООО Да, учитывая, что 3% от общей массы белка приходится на гексозамин. Сравнение наших данных с результатами исследований Ф. Арисака, по изучению аминокислотного состава белка показало, что они практически совпадают. Для пг 18, как и для большинства структурных белков фага Т4, характерно высокое содержание аспарагиновой и глутаминовой кислот, треонина, глицина, аланина и низкое содержание цистеина. В наших экспериментах количество триптофана не определялось.

Мы впервые определели изоэлектрическую точку пг 18. В стандартных условиях ( O'Farrel, 1975, J. Biol. Chem., v. 250, p. 4007 - 4021 ) пг 18 мигрирует как полипептид с изоэлектрической точкой, равной 5,0.

Коэффициент седиментации мономера в 1 мМ Ыа-фосфатном буфе-' ре, рН 7,0 при 20"С равен 4,0 ± 0,2 S. Наши данные несколько отличаются от данных ( Tschop J. et al., 1979, J. Mol. Biol., v. 128, p. 247-258 ), что, по нашему мнению, связано с различной методикой обсчета седименто-грамм.

4.2 Структурные перестройки пг 18 при полимеризации и при сокращении чехла.

При нормальной инфекции фага Т4 пг 18 полимеризуется на стержне ( пг 19 ) как на матрице, что приводит к образованию сократительного чехла. Однако в ряде случаев продукт гена 18 полимеризуется с образованием аберрантных структур - спиралей и поличехлов ( Kellen-berger Е„ Boy de la Tour E., 1964, J. Ultrastruct. Res., v. 11, p. 545-557 ). Подобные структуры могут быть получены и в условиях in vilro (Tschop J. et al., 1979, J. Mol. Biol., v. 128, p. 247-258 ). Для образования спиралей необходимо присутствие в 1 мМ Na-фосфатном буфере, рН 7,0 50 мМ КС1. Повышение ионной силы до 100 мМ КС1 или добавление 5 мМ MgCh приводит к образованию поличехлов. Нами были подобраны ионные условия для образования спиралей и поличехлов, приемлемые для спектрофотометрических измерений. Было установлено, что диффузные спирали, а также ленточные, состоящие из нескольких одиночных спиральных тяжей, образуются в 1 мМ Na-фосфатном буфере, рН 7,0 в присутствии 25 мМ Na2SO< (концентрация белка 0,1 - 0,2 мг/мл ). Повышение ионной силы раствора ( 50 мМ Na¿S04 ) приводило к образованию поличехлов. Однако, следует отметить, что переход мономер - спираль -поличехол наблюдался и при длительном выдерживании пг 18 в фосфатном буфере. В ряде случаев в составе одной субструктуры можно было различить участки, соответствующие разным изомерным формам чехольного белка. Мы предполагаем, что ассоциация одиночных спиралей по принципу "бок о бок" - приводит к формированию "ленточных" спиралей, а коллапс такой структуры вызывает образование поличехла. Полимеризация пг 18 на стержне с образованием растянутого чехла in vitro зависит как от соотношения чехольного белка и "вил" в растворе, так и от ионных условий. Например, при повышении концентрации пг 18 до 0,2 мг/мл и уменьшении концентрации "вил" до 0,4 - 0,5 мг/мл приводило к преимущественному образованию поличехлов. По-видимому, в клетке существует некое динамическое равновесие, которое сдвинуто в ту или иную сторону в зависимости от условий культивирования и уровня синтеза пг 18 и пг 19.

В работе, выполненной в лаборатории Поглазова Б.Ф. совместно с группой спектроскопии Института Белка АН СССР ( Venyaminov S. Yu. et al., 1975, J. Mol. Biol., v. 98, p. 657-664 ) методами кругового дихроизма, дисперсии оптического вращения и инфракрасной спектроскопии было продемонстрировано, что сокращение чехла сопровождается уменьшением а-спиральности пг 18 от 20 % до 10 % и эквивалентным нарастанием р-структуры. Однако несовершенство методов определения концентрации белка, расчета вторичной структуры, а также использование в качестве препаратов сравнения изолированных хвостов, "вил" и сокращенных чехлов, полученных с помощью щелочной обработки, требовало дополнительных исследований для окончательного решения данного вопроса. Прежде всего, мы сняли спектры поглощения мономера, спиралей, поличехлов и сокращенных чехлов в области длин волн 240 - 360 нм. Во всех случаях, при расчете коэффициентов экстинкции проводили коррекцию на мутность раствора по методу ( Winder A.F., Gent W.L.G., 1971, Biopolymers, v. 10, p. 1243-1251 ). В таблице № 5 даны усредненные значения коэффициентов экстинкции, полученные после серии измерений из четырех независимых выделений белка.

Рис.12 Спектры поглощения мономера пг 18 ( I ), спиралей ( 2 ), поличехлов ( 3 ), сокращенных чехлов ( 4 ).

Таблица № 5

Коэффициенты экстинкции и содержание элементов вторичной структуры у различных изомерных форм чехольного белка фага Т4.

Изомерные формы пг18 фага Т4

Относительное содержание элементов вторичной структуры, в "о

Коэффициент экстинкции при 277 нм

а-спираль (3-структура (5-изгибы неуп.стр.

Мономер

Спираль

Поличехол

Сокращенные

чехлы

39 39 39

33 32 37

9 8 9

19 1,15 ±0,04

21 1.2! ±0,06 15 1,25 ±0,07

25

38

11

26 1,33 ±0,04

Увеличение коэффициента экстинкции в ряду мономер-спираль-поличехол-сокращенный чехол свидетельствует о том, что боковые группы ароматических аминокислот при ассоциации субъединиц в процессе сборки и при сокращении экранируются и погружаются в гидрофобную часть молекулы. Кроме того, возрастание коэффициента экстинкции при переходе от спиралей к сокращенным чехлам свидетельствует об увеличении плотности упаковки и числа сайтов взаимодействия субъединиц пг 18 в составе этих комплексов.

Впервые методом кругового дихроизма нами был проведен сравнительный анализ вторичной структуры пг 18 в ряду мономер-спираль -чехол-сокращенный чехол. На рисунке 13 представлены спектры КД всех изомерных форм пг 18 в области дальнего ультрафиолета.

Приведенные данные свидетельствуют о значительном содержании в белке а-спиральных участков.' Этот вывод базируется на наличии минимумов в области отрицательных значений эллиптичности около 208 нм и 222 нм, а также максимума в области 190 нм. Анализ показывает, что полимеризация пг 18 не приводит к изменению количества а-спиральных участков в белке. Содержание а-спиральной структуры в поличехлах, мономерах и спирали практически не отличается, а незначительное увеличение содержания (3-формы в поличехлах происходит, по-видимому, за счет уменьшения доли неупорядоченной структуры. В случае сокращенных чехлов кривая КД имеет один минимум около 216 нм и максимум

Рис.13 Спектры КД пг 18 в дальней ( а ) и ближней ( б ) УФ-областях. Измерения мономера пг 18 ( I ) и сокращенных чехлов ( 2 ) проводили в 0,01 М Na-фосфатном буфере, рН 7.0; спиралей ( 3 ) - в 0,001 М Na-фосфатном буфере, рН 7,0; 0,05 М Na CI; . поличехлов ( 4 )-в 0,001 М Na-фосфзтном буфере, рН 7,0; 0.005 М MgCb.

в районе 195 нм, что свидетельствует о преобладании p-формы в данном состоянии белка. Количество p-формы в сокращенных чехлах и в поличехлах идентично, а уменьшение спиральности белка, находящегося в составе сокращенных чехлов, определяется переходом части а-сгш-ральных участков в неупорядоченную структуру. Таким образом, пг 18 в силу своей структурной организации, может находиться в трех различных конформациях, которые характерны для мономера, поличехла и сокращенного чехла. Пг 18 в составе поличехлов находится в некотором промежуточном конформационном состоянии между мономером ( спирали, растянутый чехол ) и сокращенным чехлом. Сокращение чехла приводит к уменьшению на 14 % а-спиральности пг 18 и увеличению на 5 % содержания p-формы и на 7 % содержания неупорядоченной структуры. Переход мономер-спираль-поличехол - это переход г р ( а - const);

второй переход поличехол-сокращенный чехол - это переход а —> г ( ß = const ). То есть можно утверждать, что суммарный переход от мономера к сокращенному чехлу идет через неупорядоченную форму, а не прямо а -> ß. Мы уверены, что переход ( а -> ß, г ) не происходит на одном и том же участке полипептидной цепи, хотя в этот' процесс вовлечены 30 - 40 аминокислотных остатков.

Сокращение чехла фага может быть вызвано обработкой различными химическими реагентами, изменением pH раствора, а также нагреванием. Мы попытались моделировать процесс сокращения чехла в условиях in vitro нагреванием мономера пг 18 до 60°С. Было установлено, что в случае мономера зависимость дшот температуры носит s - образный характер. Показано, что при температуре 46°С происходит необратимое изменение конформации пг 18. После охлаждения препарата пг 18 мы измерили спектр КД и обнаружили, что он практически идентичен спектру сокращенных чехлов. Зарегистрированный конформационный переход пг 18 iipH 46°С схож с теми структурными перестройками в белке, которые наблюдаются при сокращении чехла. Возможно, однако, что конформационные изменения пг 18 в результате температурной обработки и в процессе сокращения чехла под действием клеточных рецепторов имеют различную природу.

Наши данные были подтверждены в независимых калориметрических исследованиях Арисаки и соавторов ( Arisaka F. et al., 1983, J. Pharm. Dynam., v.6, p.47 - 53), которые показали, что конформационная перестройка чехольного белка, происходящая при температуре 46°С, сопряжена с поглощением тепла. Рассчитанная энтальпия этого эндотермического процесса составляет 248 ккал/моль пг 18.

Мы полагаем, что зарегистрированные изменения вторичной структуры пг 18 при переходе мономер-сокращенный чехол реально отражают те внутримолекулярные перестройки, которые происходят при сокращении хвостового чехла в процессе инфекции. В этом случае индуктором изменений вторичной структуры чехольного белка является базальная пластинка, сигнал от которой передается на субъединицы первого диска чехла. Конформационная перестройка субъединиц нижнего диска влечет за собой последовательное изменение конформации субъединиц прилегающих дисков, что приводит, в свою очередь, к сокращению чехла. При этом происходят изменения в межсубъединичных связях чехла, которые выражаются в изменении ориентации субъединиц пг 18 относительно оси хвоста, и, в итоге, происходит стабилизация всей четвертичной структуры чехла. Эти изменения являются результатом кооперативного взаимодействия между молекулами чехольного белка.

Следует отметить, что в основе всех до сих пор существовавших моделей процесса сокращения хвостового чехла лежат изменения лишь четвертичной структуры ( Moody M.F., 1973, J. Mol. Biol., v. 80, p. 613-635; Amos L.A., Klug A., 1975, J. Mol. Biol., v. 99, p. 51-73; Smith P. R. et al., 1976, J. Mol. Biol., 'v. 106, p. 243-275 ). Результаты, полученные в настоящей работе при изучении конформации чехольного белка в мономерном состоянии, а также в составе спиралей, поличехлов и сокращенных чехлов, позволяют сделать вывод о том, что процесс сокращения чехла бактериофага Т4 сопряжен с изменением вторичной структуры пг 18.

4.3 Идентификация нуклеозидтрифосфата, связанного с пг 18

Первое сообщение о наличии цуклеозидтрифосфата в составе хвоста фага Т4 появилось в 1962 году. Было показано, что в состав хвостового чехла фага входят 144 молекулы НТФ ( нуклеозид-трифосфата ) : АТФ, ЦТФ, УТФ и ГТФ ( KozloíT L.M.,Lute М„ 1959, J. Biol. Chem., v. 234, p. 539-544 ; Wahl R„ KozlofT L.M., 1962, J. Biol. Chem., v. 237, p. 1953-1964 ). Известно, что хвостовой чехол построен из 144 субъединиц пг 18. Поэтому было сделано предположение, что каждая субъединица чехла связана с одной молекулой НТФ и одним ионом кальция. Однако, так как в данных работах для анализа использовались целые вирусные частицы, мы решили проверить специфичность включения НТФ в чехол. Для анализа мы использовали высо-коочищенный препарат мономера чехольного белка. Гомогенность была доказана электрофорезом в ПААГ и седиментационным анализом. Препарат мономера пг 18 обрабатывали HCIOí в течение двух часов при 4°С. Инкубационную смесь нейтрализовали КОН и денатурированный белок с нерастворимой солью КСЮ« удаляли при 12 000 g за 10 минут. Супернатант лиофилизировали, растворяли в минимальном объеме НгО и наносили на хроматографическую пластинку с PEI-целлюлозой. В качестве элюирующего раствора использовали смесь: 1 М UC1 и 1М муравьиной кислоты. На хроматограмме ( рис. 14 ) были идентифицированы два пятна, соответствующие по подвижности гуанозин-дифосфату ( Rf = 0,22) и гуанозинмонофосфату (Rf = 0,3 ). Идентичная картина была получена при использовании в качестве анализируемого объекта очищенных хвостов фага Т4. В качестве дополнительного контроля был использован кислотный экстракт "вил", в котором присутствие нуклеотидов не было зарегистрировано. Далее, оба пятна, соответствовавших ГДФ и ГМФ, были элюированы, и их спектры погло-

6 о

60 «0 6 0 вО

«0

60 а 0 60

аО 60 а 0 6 0

ао а 0 аО аО

1 2 .1 4 5 « 7

Рис.14 Идентификация нуклеозидфосфата, связанного

с пг 18.

1 - АТФ ( а ), АДФ ( б ), АМФ ( в );

2 - УТФ ( а), УДФ (б ), УМФ ( в );

3 - Ц'ГФ ( а ), ЦДФ ( б ), ЦМФ ( в );

4 - ГТФ ( а ), ГДФ ( б ), ГМФ ( в);

5 - образец: ГДФ ( а ), ГМФ ( б ):

6 - дГТФ ( а ), дГДФ ( 6 ), дГМФ ( в );

7 - препарат ГТФ, обработанный HCLOc

ГТФ ( а ), ГДФ ( б ). ГМФ ( в ).

щения были измерены в интервале длин волн 220 - 360 нм. Полученные спектры совпадали со спектрами смеси ГМФ, ГДФ и ГТФ с максимумом поглощения при 253 нм и характерным плечом при 280 нм. Таким образом, нам впервые удалось показать, что продукт гена 18 связан лишь с одним типом азотистого основания - гуанином. Но оставался нерешенным вопрос о том, какой именно из гуанозинфосфатов связан с пг 18 и в каком соотношении. Поэтому мы определили количество общего фосфора в препарате мономера пг 18 по методу ( Baykov A.A., Avaeva S.M., 1981, Anal. Biochem., v. 116, р. 1-9 ). Данные приведены в таблице № 7. Полученный результат позволил нам сделать заключение, что пг 18 связан с ГТФ в соотношении 1:1. Для подтверждения этого вывода был приготовлен кислотный экстракт из препарата пг 18 ( 7 -10 мг/мл ) и проведена тонкослойная хроматография в стандартных условиях. Элюаты пятен ГДФ и ГМФ объединили и измерили их спектр поглощения. Для расчета соотношения пг 18 и связанного с ним ГХФ использовали значение коэффициента экстинкции чехольного белка Au«. Z77,™ = 1,15 ± 0,04 и молярный коэффициент экстинкции для ГХФ

Агя .ш = 13 700 л/моль см. Формальный расчет показал, что в анализируемом препарате мономер пг 18 и ГХФ находятся в соотношении 1: 0,75. В контрольных опытах мы обрабатывали хлорной кислотой стандартный препарат ГТФ и затем проводили хроматографическое разделение в тех же условиях. При этом оказалось, „что основная часть препарата ( около 80 % ) после такой обработки представлена ГДФ.

Таблица № 6

Содержание общего фосфора в составе чехольного белка бактериофага Т4.

№ опыта Кол-во пг 18, Кол-во фосфора. Кол-во атомов фосфора

мг мкг на субъединицу пг

1 3.5 4,96 3,2

2 8,6 10,28 2,7

3 5,6 7,69 3,1

В связи с этим отсутствие в образцах пг 18 ГТФ мы можем объяснить его кислотным гидролизом до ди- и монофосфатов. Так как в процессе приготовления препарата ГХФ из пг 18 для спектральных измерений не исключены определенные потери элюируемого материала, а также, принимая во внимание данные по определению общего фосфора, мы полагаем, что с каждой субъединицей чехольного белка фага Т4 связана одна молекула ГТФ.

Позднее, в работе Серышевой И.И. и др., 1988 (Докл. АН СССР, т. 303, стр. 245-248 ) было высказано предположение, что ГТФ, возможно, является источником энергии для сокращения чехла. В этой работе было продемонстрировано, что пг 18 в сокращенном состоянии является кальций - зависимой ГТФ-азой, причем реакция протекает в две стадии: 1. Замена эндогенной ГДФ на экзогенную ГТФ. 2. Ферментативный гидролиз ГТФ. Однако мы не исключаем, что ГТФ может служить в качестве аллостерического кофактора, поддерживающего определенную конформацию пг 18 и стабилизирующего четвертичную структуру растянутого чехла.

III. выводы

1. Клонированы в бактериальных векторных системах гены бактериофага Т4, кодирующие поздние белки вируса (9, 10, 11, 12, wac, 13, 14, 15, 34 и 35 ). Впервые определены их нуклеотидные и аминокислотные последовательности.

2. Установлено, что гены 9, 10, 11, 12 и wac составляют кластер, в котором терминирующие кодоны перекрываются с инициирующими последующих генов.

3. Разработан комплексный метод изолирования в гомогенном и биологически активном состоянии субструктурных компонентов частицы фага Т4, основанный на использовании множественных амбер-мутан-тов вируса по поздним генам.

4. Выделены в электрофоретически и седиментационно гомогенном состоянии длинные хвостовые фибриллы, их субкомпоненты, короткие хвостовые фибриллы, бакенбарды ( фибритин ) и белок хвостового чехла. Охарактеризованы физико-химические свойства продуктов генов 12, 37, 34, wac и 18.

5. На основании физико-химического анализа адгезина ( пг 12 ) и А-по-ловинки длинных фибрилл ( пг 34 ), а также компьютерного анализа их аминокислотных последовательностей предложена модель структурной организации тримеров данных белков. Модель предолагает наличие трех протяженных Р-листов, симметрично расположенных к оси тримера.

6. Установлена топология белков, формирующих дистальную половинку длинных хвостовых фибрилл. Впервые локализовано расположение пг 35 на одном из окончаний дистальной половинки, обеспечивающем взаимодействие с проксимальной половинкой фибрилл.

7. Впервые показано, что фибритин ( пг wac ) фага является биком-плементарной матрицей, обеспечивающей упорядоченную сборку функционально активной органеллы адсорбции вируса из дистальной ( ВС') и проксимальной ( А ) половинок фибрилл. Кофактором этого процесса в условиях in vitro и, вероятно, in vivo является индол и индолилуксусная кислота.

8. Подтверждено, что короткие фибриллы ( пг 12) как изолированные, так и в составе вирусной частицы, с различной эффективностью способны убивать клетки E.coli. С помощью биофизических методов изучен молекулярный механизм бактерицидного действия коротких

фибрилл на бактериальную клетку, который аналогичен по физиологическому проявлению действию колицинов К и El. Установлено, что после необратимого связывания олигомера пг 12 с рецепторной областью бактерии нарушается мембранная проницаемость, вызывающая остановку макромолекулярных синтезов клетки.

9. Идентифицирован состав рецепторной области на внешней мембране Е. coli, для связывания коротких фибрилл, которая включает в себя основной белок мембраны - порин В ( omp F) и липополисахарид.

10. Впервые доказано, что процесс сокращения чехла фага Т4 при введении ДНК вируса в клетку сопряжен с изменениями во вторичной структуре мономера пг 18 - основного белка чехла. Необратимый переход из конформационного состояния, характерного для мономера пг 18, к конформации его, наблюдаемой в составе.сокращенного чехла, проходит через промежуточную стадию. Таким образом, наблюдаемые изменения во вторичной структуре пг 18 при сокращении чехла не происходят, как считалось ранее, прямо по пути а -> ß перехода, а идут через неупорядоченную структуру.

11. Впервые показано, что каждый мономер пг 18 связан с одной молекулой ГТФ, которая, возможно, является аллостерическим кофактором, стабилизирующим четвертичную структуру сократительного белка чехла фага Т4.

12. Полученные данные о структурной организации белков бактериофага способствовали развитию исследований по разработке векторов экспонирования и изучения закономерностей фолдинга белка.

Список опубликованных работ по теме диссертации.

Научные статьи:

1. Жиленков Е.Л., Месянжинов В.В., Селиванов H.A., Поглазов Б.Ф., Щербухин В.В. Бактериофаг Т4 как модель для изучения кооперативных двигательных процессов. // Доклады АН СССР, 1978, т. 238, стр. 1471-1474.

2. Горбатова Л.П., Селиванова Т.Н., Серышева И.И., Туркина Е.В., Белоус Е.А., Месянжинов. В.В.,, Поглазов Б.Ф., Селиванов H.A. Функциональная роль белков базалыюй пластинки бактериофага Т4. // Доклады АН СССР, 1979, т.247, стр. 738-741.

3. Селиванов H.A., Жиленков Е.Л., Месянжинов В.В., Поглазов Б.Ф., Щербухин В.В., Калмыков П.В. Изучение кооперативнос-ти изменения положения хвостовых фибрилл бактериофагаТ40. // Доклады АН СССР, 1978, т. 242, стр. 949-952.

4. Селиванов H.A., Голицына Н.Л., Рустембеков О.С., Месянжинов В.В. Регуляция сборки и прикрепления длинных хвостовых фибрилл бактериофага Т4. // Доклады АН СССР, 1981, т. 60, стр. 1262 - 1265.

5. Зинченко В.П., Рудик O.A., Селиванов H.A., Месянжинов В.В. Функциональная активность коротких фибрилл бактериофага Т4; // Доклады АН СССР, 1982, т. 267, стр. 974-977. .

6. Голицына Н.Л., Селиванов H.A., Рустембеков О.С., Месянжинов В.В. Выделение биологически активных половинок фибрилл и бакенбард бактериофага Т4. // Биологические науки, 1983, № 4, стр. 27 - 32.

7. Кретова А.Ф., Тихоненко A.C., Беспалова И.А., Голицына Н.Л., Селиванов H.A., Месянжинов В.В. Топология структур пых белков длинных хвостовых фибрилл бактериофагов T4D, DD VI Н+ и DDVI Н.//Молекулярная биология, 1983, т.17, №5, стр. 1103-1107.

8. Куриц Т.С., Селиванов H.A., Месянжинов В.В. Особенности молекулярной организации коротких фибрилл фага Т4. // Доклады АН СССР, 1984, т. 274, стр. 448 - 452.

9. Серышева И.И., Веньяминов С.Ю., Родикова Л.П., Туркин А.И., Селиванов H.A., Поглазов Б.Ф. Определение и идентификация нуклеозидфосфата, связанного с чехольным белком бактериофага Т4. // Доклады АН СССР, 1984, т. 275, стр. 1224-1226.

10. Куриц Т.С., Селиванов H.A., Месянжинов В.В. Структурное разделение функциональных локусов коротких фибрилл бактериофага Т4. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1985, г. 8, стр. 29-31.

П.Селиванов Н.А., Веньяминов С.Ю., Голицына Н.Л., Николаева Л.И., МесянжиновВ.В. Структура и регуляция сборки фибриллярных белков бактериофага Т4. I. Выделение и спектральные свойства длинных хвостовых фибрилл. // Молекулярная биология, т. 21, №5, стр. 1258 - 1267.

12.Серышева И.И., Веньяминов С.Ю., Селиванов Н.А., Родикова Л.П., Поглазов Б.Ф. Изменение вторичной структуры Лри полимеризации чехольного белка бактериофага Т4. // Молекулярная биология, 1990, т. 24, стр. 541 - 547.

13. Selivanov N.A., Prilipov A.G., Mesyanzhinov V.V. Nucleotide and deduced amino acid sequence of bacteriophage T4 gene 12. // Nucleic Acids Research, 1988, v. 16, №5, p. 233.

\4. Selivanov N.A., Prilipov A.G., Mesyanzhinov V.V. Nucleotide and deduced amino acid sequence of bacteriophage T4 gene wac. H Nucleic Acids Research, 1988, v.16, №21, p. 10361.

15. Selivanov N.A., Prilipov A.G., Mesyanzhinov V.V. Nucleotide and deduced amino acid sequence of bacteriophage T4 genes 12 and wac. // T4 News, 1988, v. 2, №1, pp. 2-6.

16. Prilipov A.G., Selivanov N.A., Efimov V.P., Marusich Е.1., Mesyanzhinov V.V. Nucleotide sequence of bacteriophage T4 genes 9, 10 and 11. // Nucleic Acids Research, 1989, v. 17, №8, p.3303.

17. Selivanov N.A., Prilipov A.G., Mesyanzhinov V.V; Nucleotide sequence of bacteriophage T4 genes 13, 14 and 15. // Nucleic Acids Research, 1989, v. 17, №9, p. 3583.

18. Selivanov N.A., Prilipov A.G., Efimov V.P., Marusich E.I., Mesyanzhinov V.V. Cascade of overlapping late genes in bacteriophage T4. // Biomedical Sience, 1990, v.l, pp. 55-62.

Тезисы докладов.

19. Selivanov N.A., Golitzina N.L., Rustembekov O.S., Mesyanzshinov V.V. Regulation of assembly of the long tail fibers of bacteriophage T4; Stady in vitro and in vivo. // Abstracts of Proc. Vll-th Biennial conference bacteriophage assembly. USA. 1980, p. 18.

20. Туркин А.И., Безбородова O.C., Селиванов H.A., Поглазов Б.Ф. Изучение механизма действия аллостерических эффекторов, влияющих на перемещение длинных хвостовых фибрилл бактериофага Т4. // Тезисы докладов 1-го Всесоюзного биофизического съезда. -Москва, 1982, т. 2, стр. 65.

21. Рудик О.А., Селиванов H.А., Месянжинов В.В. Транспорт ионов у E.coli при взаимодействии с бактериофагом Т4. II Тезисы докладов Международного симпозиума ФЕМО. Пущино, 1983, стр. 176.

22. Куриц Т.С., Голицына Н.Л., Селиванов Н.А., Месянжинов В.В. Регуляция формирования в клетке хвостовых фибрилл бактериофага Т4. // Тезисы докладов Международного симпозиума ФЕМО, Пущино, 1983, стр. 127.

23.Голицына Н.Л., Селиванов Н.А., Месянжинов В,В. Особенности молекулярной организации длинных хвостовых фибрилл бактериофага Т4. В кн. - "Актуальные проблемы бактериофагии и прикладной иммунологии". // Тезисы докладов. Тбилиси, 1984, стр. 17- 19.

24. Куриц Т.С., Селиванов Н.А., Месянжинов В.В. Локализация функциональной активности коротких фибрилл бактериофага Т4. -В кн. "Актуальные проблемы бактериофагии и прикладной иммунологии." II Тезисы докладов. Тбилиси, 1984, стр.21 -23.

25. Веньяминов С.Ю., Серышева И.И., Селиванов Н.А., Поглазов Б.Ф. Изменение вторичной структуры при сборке чехольного белка бактериофага Т4. // Тезисы докладов V Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров. Харьков, 1984, стр. 39 - 40.

26. Голицына Н.Л., Куриц Т.С., Селиванов Н.А., Месянжинов В.В. Изучение молекулярной организации фибриллярных компонентов бактериофага Т4. // Тезисы докладов XVI Симпозиума ФЕБО. Москва, 1984, стр. 234.

27. Селиванов Н.А., Прилипов А.Г., Кинцурашвили Е.Г., Месянжинов В.В. Определение нуклеотидной последовательности гена 12 бактериофага Т4. // Тезисы докладов VII Всесоюзного Симпозиума по химии белков и пептидов. Таллинн,1987, стр. 101.

28. Селиванов Н.А., Прилипов А.Г., Зурабишвили Т.Г., Соболев Б.Н., Ефимов В.П., Месянжинов В.В. ' Структурная организация и сборка белков бактериофага Т4, кодируемых поздними генами 9-12, wac, 13 - 15. // Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума по химии белков. Тбилиси, 1990, стр. 19.

29. Rudick О.А., Kuritz T.S., Selivanov N.A., Mesyanzhinov V.V.. The two-component structure of E.coli outer membrane receptor for short tail fibers of bacteriophage T4. Abstracts III Soviet - Switzerland symposium "Biological membranes" // Tashkent, 1983, p. 107.

30. Goldberg E.B., Selivanov N.A., Grinius L.L. Changes in the molecular organization of phage T4 during attachment and injection. // Abstracts of International Symposium "Molecular Organization of Biological Structures." Moscow, 1989, v.l, p.76.

31. Prilipov A.G., Selivanov N.A., Efimov V.P., Mesyanzhinov V.V. The structure of late transcription unit of bacteriophage T4. // VII1 International Congress of Virology, Berlin, 1990, p.116.

HyKjieoraflHtie ocjieAOBaTejibHOcm 6aKTepno(|)ara T4, aenohhpobahhbie b EMBL GenBank.

1. Selivanov N.A., Prilipov A.G. and Mesyanzhinov V.V.

Nucleotide and deduced amino acid sequence of bacteriophage T4 gene 12;. Submitted February 10, 1988, EMBL accesion no. X06729.

2. Prilipov A.G., Selivanov N.A., Nikdlaeva L.I. and Mesyanzhinov V.V. Nucleotide and deduced amino acid sequence of bacteriophage T4 gene »■<«■. Submitted October 5, 1988, EMBL accesion no. X12888.

3. Prilipov A.G., Selivanov N. A., Efimov V.P., Marusich E.I. and Mesyanzhinov V.V.

Nucleotide sequence of bacteriophage T4 genes 9, 10 andl 1 Submitted January 31, 1989. EMBL accesion no. X14192.

4. Selivanov N.A., Prilipov A.G. and Mesyanzhinov V.V. Nucleotide sequence of bacteriophage T4 genes 13, Hand 15. Submitted April 7, 1989. EMBL accesion no. X14868.

5. Selivanov N.A., Revel H.R., Mesyanzhinov V.V. and Goldberg E.B. Phage T4 tail fiber gene 34 sequence.

Submitted May 11, 1991. EMBL accesion no. X59298.

6. Selivanov N.A., Revel H.R., Mesyanzhinov V.V. and Goldberg E.B. Phage T4 tail fiber gene 35 sequence.

Submitted May 11, 1991. EMBL accesion no. X59299.