Молекулярная характеристика и генетические особенности плюрипотентных клеток человека и их производных

Лагарькова, Мария Андреевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярная характеристика и генетические особенности плюрипотентных клеток человека и их производных
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярная характеристика и генетические особенности плюрипотентных клеток человека и их производных"

003494122

На правах рукописи

ЛАГАРЬКОВА Мария Андреевна

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ

Специальности 03.02.07 - «генетика» и 03.03.04 - «клеточная биология, цитология, гистология»

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

МОСКВА-2010

2 5 Щ? 2010

003494122

Работа выполнена в лаборатории генетических основ клеточных технологий Учреждения Российской академии наук Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор Киселев Сергей Львович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Серов Олег Леонидович доктор биологических наук Гривенников Игорь Анатольевич доктор биологических наук Васильев Андрей Валентинович

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт цитологии РАН

Защита диссертации 2010 года в У часов

на заседании Диссертационного совета Д 002.214.01 при Институте общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Губкина, дом 3. факс (499) 132-8962, электронная почта iogen@vigg.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, Москва, ул. Губкина, д.З. Автореферат разослан -/^ь-^Сеу^т^^? 2010 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета

К.б.н. Синелыцикова Т.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. В процессе индивидуального развития многоклеточный организм млекопитающих проходит путь от одной единственной клетки, зиготы, до целого организма. В результате четвертого деления зиготы эмбрион на стадии морулы подразделяется на наружные, более крупные клетки и внутренние клетки меньшего размера. На пятый день развития эмбриона человека - на стадии бластоцисты, наружние клетки морулы формируют экстраэмбриональный внешний слой -трофоэктодерму, необходимые в дальнейшем для имплантации эмбриона. Внутренняя часть клеток морулы образует компактную внутреннюю клеточную массы (ВКМ) бластоцисты. Из ВКМ образуются в дальнейшем эмбриональные и экстраэмбриональные ткани организма. Таким образом, в процессе эмбрионального развития организма млекопитающих существует короткий период, когда группа клеток ВКМ способна дать начало многим, если не всем, тканям будущего организма. Клетки внутренней массы бластоцисты, культивируемые в лабораторных условиях, получили название эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) (Evans & Kaufman 1981, Thomson 1998). Можно подобрать такие условия культивирования, что программа дальнейшего развития ЭСК in vitro не реализуется, они сохраняют свойство плюрипотентности неограниченное время. В то же время, сменив условия культивирования, можно получить контролируемую дифференцировку ЭСК во все производные трех зародышевых листков. На сегодняшний день исследования биологии стволовых клеток и, особенно, биологии эмбриональных стволовых клеток являются интенсивно развивающимся направлением современной науки. ЭСК мыши стали незаменимым инструментом для изучения функции гена, сделав возможным получение генетических нокаутов. ЭСК человека представляют собой уникальный объект для исследования раннего эмбрионального развития человека. С помощью ЭСК можно изучать генетические процессы, происходящие в раннем онтогенезе, особенности поддержания плюрипотентности, исследовать механизмы регуляции экспрессии генов. Помимо перечисленных фундаментальных аспектов, все более реальной становится возможность практического применения технологий с использованием эмбриональных стволовых клеток, как, например, создание модельных систем для поиска путей лечения заболеваний человека или скринига лекарственных средств. Самые большие надежды на применение ЭСК человека в медицине связаны с тем, что в процессе направленной дифференцировки из них можно получить специализированные дифференцированные клетки (кардиомиоциты, клетки сосудов, инсулин-

продуцирующие клетки и др.), которые, в свою очередь, при решении проблемы иммунологической совместимости, можно использовать в терапевтических целях. Именно эти фундаментальные и практические аспекты биологии ЭСК определяют актуальность темы настоящей диссертационной работы, которая посвящена молекулярно-генетическим и эпигенетическим особенностям новых линий ЭСК и изучению возможностей их дифференцировки.

Цель и задачи исследования. Проведение фундаментальных и прикладных исследований по изучению линий эмбриональных стволовых клеток человека. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Получить линии ЭСК человека, в том числе в отсутствии ^охарактеризованных компонентов среды. Создать Российскую коллекцию линий ЭСК человека. Охарактеризовать способность полученных линий ЭСК к самоподдержанию на протяжении длительного временени.

2. Продемонстрировать генетическую стабильность ЭСК на уровне кариотипа при оптимальных условиях культивирования. Провести детальный молекулярно-цитогенеггический анализ аномальных хромосом для установления возможных причин их возникновения.

3. Используя ЭСК человека как модель раннего эмбрионального развития, изучить контактное взаимодействие клеток в пределах структурно-морфологической единицы в шпорипотентном и дифференцированных состояниях.

4. Изучить статус инактивации X хромосомы в женских полюрипотентных клетках и в их дифференцированных производных.

5. С целью стандартизации линий ЭСК человека в отношении их потенциала дифференцировки разработать генетические и эпигенетические критерии характеристик линий ЭСК на основе известных генов раннего эмбрионального развития

6. С целью возможного дальнейшего практического применения специализированных производных ЭСК человека для скринига или терапии разработать протоколы дифференцировки ЭСК человека в функциональные клетки нескольких типов.

7. Доказать, что полученные из ЭСК человека специализированные производные соответствуют их взрослым аналогам на генетическом и эпигенетическом уровнях. Научная новизна и практическая ценность работы. Новым является создание российской коллекции линий ЭСК человека, полученных с использованием различных методов культивирования, в том числе и с использованием нового метода выделения ВКМ. Новым является установление линий ЭСК в среде с полностью

охарактеризованными компонентами не животного происхождения. Впервые при изучении линий обнаружены эпигенетические различия между линиями ЭСК человека. Показана кариотипическая стабильность ЭСК на протяжении более 100 пассажей. Выявлены и охарактеризованы сублинии ЭСК человека с аномальными хромосомами 9 и 18, аналогичные ранее описанным аномалиям у пациентов с рядом патологий. Таким образом, впервые получены модельные объекты для изучения и терапии этих патологий. В ходе исследований разработаны новые протоколы получения и селекции функциональных дифференцированных производных из ЭСК человека. Впервые показано, что статус метилирования промоторных областей генов, связанных с клеточной специализацией, коррелирует с изменением их экспрессии в процессе дифференцировки ЭСК в эндотелий. Эти и другие результаты работы являются оригинальными и получены впервые, о чем свидетельствуют публикации в рецензируемых международных журналах. Результаты работы имеют практическую значимость. Получены «терапевтические» линии ЭСК, разработаны технологии дифференцировки ЭСК и селекции специализированных производных, которые могут в будущем найти применение в регенеративной медицине. Технологии запатентованы. Работа выполнена в соответствии с темой госрегистрации №01200802669. Апробация работы. Основные научные результаты диссертационной работы были представлены на Wilsede Meeting "Modern trends in human leukemia" (Wilsede, Germany, 2005), всероссийских конференциях "Фундаментальные науки - медицине" (Новосибирск, 2005,2007), VI Международной конференции по молекулярной генетике соматических клеток (Звенигород, 2005), Всероссийском симпозиуме "Биология клетки в культуре" (Санкт-Петербург, 2004, 2005, 2006), I-st Congress of the German society for SC research (Cologne, Germany, 2006), Британско-Российском совещании "Стволовые клетки: законодательство, исследования и инновации" (Москва, 2007), на конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2004, 2008), Международной конференции Mechanisms of early differentiation (Barsinghausen, Germany, 2008), German-Russian Bilateral Symposium (Санкт-Петербург, 2008), на II съезде Общества клеточной биологии, (Санкт-Петербург, 2007), на П, IV, VI съездах International Society of Stem Cell Research (Boston, USA 2004, Cairns, Australia, 2007, Barselona, Spain, 2009). Личный вклад автора заключается в проведении экспериментальных и теоретических исследований. Основные результаты работы получены лично автором, под его непосредственным руководством или при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 40 печатных работ, в том числе 20 статей в российских и международных журналах и 18 тезисов докладов и материалов конференций, получено 2 патента.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на^-^-Ь страницах и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы и список литературы. Диссертация содержит5"3>"~рисунков. Библиография включает ссылок.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Получение и характеристика ЭСК человека. В качестве источника клеток, с информированного согласия пациентов, нами были использованы бластоцисты, не вошедшие или оставшиеся после завершения программы по вспомогательным репродуктивным технологиям. Для получения 4 линий ЭСК ЬЕ8М01-04 на фидере

Рисунок 1. Морфология ЭСК в культуре (А) ВКМ, выделенная методом гипотонического лизиса, на фидере. (В) колония ЭСК линии ЬЕвМОЗ на фидере; (С) колония ЭСК линии ЬЕБМК-Об на матригеле. Масштабная линейка= 100 цМ

было использовано 46 бластоцист различного качества. Указанные линии были получены с использованием фидерного слоя из инактивированных мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ), а культивирование происходило в среде содержащей сыворотку животных. Несомненно, неохарактеризованные компоненты не

Рисунок 2. Характеристика ЭСК человека. (А-Г) Иммуногистохимическнй анализ чЭСК, культивируемых на фидере. Показана линия ЬЕ8М01. (А) активность щелочной фосфатазы, (В) ввЕА-З, (С) ввЕАЧ (О) Т11А1-60, (Е) ТКА1-8), (I7) ОСТ-4, (С-Ь). Иммуногистохимическнй анализ ЭСК, полученных и культивируемых на матригеле. Показана линия ЪЕвМКОб. (С) ОСТЧ, (Н) 88ЕА-4, (I) активность щелочной фосфатазы, (Д), ТКА1-60, (К) СБ 30, (I.), 1ЧАЖ)0. Ядра окрашены ОАР1 (синий). Масштабная линейка =100цМ. (М) ОТ-ПЦР анализ экспрессии траискриппионных факторов, характерных для ЭСК. Показана линия ЬЕвМ04.

М к«*1)3 Н«Х1 И«) 4^111 5а114 !*«2

позволяют работать в стандартизованных условиях, а клеточные линии в связи с присутствием компонентов животного происхождения не могут в дальнейшем применяться в практических целях. В связи с этим было решено получить линии ЭСК в

коммерчески доступной среде с определенным составом и в бесфидерной системе. Традиционно для получения ВКМ используется комплемент-зависимый лизис с использованием компонентов животного происхождения или механическое извлечение ВКМ, что приводит к ее повреждению. Нами была разработана оригинальная технология выделения ВКМ, основанная на различной чувствительности трофобласта и ВКМ к гипотонической обработке. Это позволили существенно повысить эффективность получения линий ЭСК человека. Четыре бластоцисты качества АА был использованы для получения бесфидерной линии ЬЕ8МК05. Новая линия ЭСК человека - ЬЕ5М(С05, полученная и поддерживаемая на среде тТЕБЮ, постоянно культивируется более 2 лет, прошла более 80 пассажей и перенесла несколько криоконсерваций (рис.1). Все линии ЭСК, как фидерные, так и бесфидерные, экспрессируют характерные маркеры ЭСК, включая ОСТЗ/4, Иаш^, 88ЕА-4, ТЫА-1-81, обладают высокой теломеразной активностью и активностью щелочной фосфатазы. ОТ-ПЦР анализ показал, что все линии ЭСК экспрессируют гены транскрипционных факторов, связанных с плюрипотентностью (рис. 2, таблица 1).

При переводе в суспензионную культуру все линии образуют эмбриоидные тельца А В С Б

Рисунок 3. Плюрипотентность линий ЭСК. (А) Морфология ЭТ 8 дней культивирования, линия hESM04. (B-D) Иммуиогвстохимический анализ ЭТ 14 дней культивирования. Линия hESMOl. Ядра окрашены DAPI (синий). (В) Двойное иммунофлюоресцентиое окрашивание антителами к CD105 (зеленый) and МОС-31 (красный), (С) окрашиваниеантителами к десмину (D) окрашивание антителами а альфа-фетопротеину. (E,F) Тератомы, образованные ЭСК после введения нммуиодефицитным мышам. Окраска гематоксилином-эозином. Показаны линии h£SM03 и hESMOl»

(ЭТ), содержащие клетки-производные трех зародышевых листков (рис.3). Таким образом, линии ЭСК человека проявляли свойство плюрипотентности при спонтанной дифференцировке in vitro. Одним из основополагающих тестов на плюрипотентность линий ЭСК человека in vivo является их способность формировать тератомо-подобные структуры при введении клеток иммунодефицитным животным. Мы проверили способность клеточных линий hESMOl-04 к спонтанной дифференцировке in vivo. В результате введения чЭСК nu/nu мышам были получены тератомо-подобные структуры (рис.3). Гистологический анализ образований показал, что они состоят из тканей, происходящих из трех зародышевых листков (кость, эпителий, мышцы, железы и т.д.). В настоящий момент наша коллекция пополнилась тремя линиями HUES7-9 из лаборатории Д.Мелтона, США, и двумя линиями Н9 и HI4 из лаборатории Дж. Томсона. В сотрудничестве с коллегами из Красноярского Медицинского Университета получено и охарактеризовано еще 2 линии ЭСК человека. Таким образом, нами создана коллекция и криобанк линий ЭСК человека (всего 15 линий) на различных пассажах после их подробной характеристики и подтверждения

плюрипотентности.

Л«ны\ хярактерястюсн hESMOl hESM 02 hESM03 hESM04 bESMKOS hESKM06

Кариотип 46ХХ 46XY 46XX 4«XX 4«XX 46XX

Гол получена» 2003 2003 2003 2003 2008 2009

Среда при получении KO-DMEM 20%FBS KO-DMEM 20%FBS KO-DMEM 20V.FBS KO-DMEM 20%FBS mTESR-1 +ROCK inhibitor mTESR-1 +ROCK inhibitor

Подложка при получении MEF MEF MEF MEF MatriECl Matrigel

Среда для культивирования KO-DMEM SR bFGFor mTeSRl KO-DMEM SR bFGFor mTeSRl KO-DMEM SR bFGFor mTeSRl KO-DMEM SR bFGFor mTeSRl mTeSRl mTeSRl

Подложка при культивировании MEF, HS-27, Matrikel MEF, MatriRel MEF, HS-27, Matrigel MEF, Matrigel Matrigel Matrigel

Субяинии Да, 1сгабильяаж 46,ХХД18Х:Т 11.31—MJ21.2:: q21.2-.pll.31) Нет Да, «Два стабидьнаяе 4í,XX,<Jd(4)(q25 43.1),dup(9Xql2<¡ 33) Нет Да, да

Время удвоения с, МЕГ ч гаТе5Я1 30 24 32 tJA 36 30 42 32 Н/д 26 н/д 23-30

Экспрессия маркеров плюряпоте нтн ости Ос*4, папо& на 1-60, БЕЕА-Д, БЗЕА-З + + + + +

Другие маркеры ЭСК:АР, тсломсразы, СШО, <1рра 3, <1рра 5 + + + + + +

Статус Х-инактивации Ж - однаХ хромосома инактявироеана Хг- обе X активкы 20% клеток Xi 80% клеток Xa Xi Xi Xa Xa

Образ оваис тератом + + + + M n/d

Формирова + + + + + ■+

Максимальное число пассажей 100 70 75 72 60 20

Доступность для научного сообщества ДА

Таблица 1. Характеристика линий ЭСК человека серии hESM.

Изучение стабильности карнотита эмбриональных стволовых клеток человека серии hESM в процессе культивирования in vitro. Изменение целого ряда свойств ЭСК, таких как скорость роста, плюрипотентность, экспрессия специфических маркеров, и, наконец, туморогенность может быть обусловлено генетической нестабильностью клеток в культуре. Так, при длительном культивировании первичных культур клеток можно отобрать клетки, в которых произошла генетическая трансформация и они приобрели возможность неограниченного роста в культуре. В случае ЭСК, самоподдержание клеток в культуре в отсутствии трансформации является ключевым свойством, отличающим стволовые клетки от первичной культуры дифференцированных клеток организма. В связи с этим, при работе с ЭСК человека необходимо проведение тщательного контроля за численными и структурными изменениями хромосом. Нами был предложен новый метод кариотипирования линий ЭСК человека, который позволил эффективно получать метафазные пластинки высокого качества. Клети линии hESMOl анализировали на пассажах от 11 до 100, линии hESM03 - на пассаже 8 и на пассажах от 36 до 75, клетки линии hESM04 - на пассажах 14,22 и на пассажах между 36 и 75, клетки линии hESM02 - на пассажах 16 и 17, 45, 56, линии bESKM05 - на пассажах 5, 10, 27, 40, 60, 80. В результате проведенных на протяжении пяти лет исследований по мониторингу кариотипической стабильности линий выявлены два субклона линий hESM03 и hESMOl с аберрациями в хромосомах 4, 9 (hESM03) и 18 (hESMOl), которые стабильно наследовались в ряду клеточных поколений на протяжении нескольких десятков пассажей. Детальное исследование этих сублиний было продолжено в сотрудничестве с д.б.н. Н.Б.Рубцовым и к.б.н. Т.В.Карамышевой (ИЦиГ СО РАН). Для описания структурных хромосомных перестроек были использованы методы молекулярно-цитогенетического анализа. Для определения состава аномальной хромосомы в линии ESM01rl8 была получена ДНК-проба, специфичная аномальной хромосоме, для чего несколько ее копий с помощью микроманипуляционной техники было выделено из метафазных пластинок фиксированных митотических клеток, и проведена амплификация их ДНК в полимеразной цепной реакции с частично вырожденным праймером MW6. FISH полученной ДНК-пробы с метафазными хромосомами клеток ESM01rl8 и лимфоцитов здоровых доноров показал, что она представляет собой 46,XX,r(18X"pll.31—»q21.2::q21.2—*р11.31::) (рис. 4).

ABC

Рисунок 4. Анализ кариотипа ЭСК человека. (А) нормальный 46 XX кариотип линии hESKM05. GTG бэндннг. (В) FISH ДНК-пробы г18 (зелёный) с хромосомами клеток линии hESM01rl8 (окраска DAPI). Стрелки указывают на хромосомы 18 и г(18). (С) FISH проб WCP9 (красный) и РСР9С (зелёный) с хромосомами клеток линии hESM03der9 (окраска DAPI). Жёлтый цвет - результат совмещения красного и зелёного сигналов близкой интенсивности. Стрелка указывает на аномальную хромосому 9.

Для анализа организации и состава маркерной хромосомы из сублинии hESM03der9 был получен набор микродиссекционных проб из 9 хромосомы здорового донора и из клеток сублинии. Для определения точного кариотипа линии hESM01der9 был проведен ряд FISH с различными зондами. Результаты проведенных экспериментов возможно суммировать выразив точный кариотип линии как hESM03der9, как 46,XX,del(4)(q25q31.1),dup(9)(ql2q33).

Исследование кариотипа линии hESKM05 на 7 пассаже показало, что культура гетерогенна, встречаются клетки как с нормальным набором хромосом, так и анеуплоидные клетки (от 60 до 65 хромосом) клонального происхождения (до 20% клеток). После двух последовательных субклонирований нескольких колоний линии hESKM05 нам удалось выделить стабильную сублинию, имеющую нормальный диплоидный 46 XX набор хромосом (рис.4А) и сохраняющую нормальный кариотип уже более 80 пассажей. Необходимо отметить, что линия hESKM05 была получена в бесфидерных условиях в среде с определенным составом mTeSRl. Можно предположить два варианта изначальной гетерогенности культуры. Возможно, что в результате применения ВРТ клетки ВКМ исходно имели смешанный кариотип. Во втором случае не исключено, что применение mTeSRl привело к дестабилизации кариотипа на первых пассажах.

Сравнение свойств клеток сублиний ЬЕ8М(Шег9 и ЬЕ8М01г!8 с клетками исходных линий выявило увеличение темпов клеточной пролиферации в ЬЕ8М01г18 и ЬЕ8М03(1ег9 относительно исходных линий. Кроме того, процент выживаемости клеток сублинии ЬЕ8М01г18 после криоконсервации был существенно (в-5-7 раз) выше, чем у исходной линии ЬЕ8М01 (рис.5). Тем не менее, клетки этих сублиний сохранили основные характеристики, присущие ЭСК человека, в том числе экспрессию ОсО/4, 85ЕЛ-4, щелочной фосфатазы и ряда других специфических маркёров. В то же время

Выживаемость после криоконсервации

V»

£ 10-

3 КЕ5М01 I ЬЕЗМОШв

I ИЕ5маз ша ЬЕ8М01

1 ЬЕвМОЗ Йег9 т ЬЕЭМО! г18

Рисунок.5. Изменение ростовых

характеристик сублиий ЭСК с хромосомными аномалиями. (А) выживаемость после криоконсервации. (В) время удвоения

было отмечено изменение спектра типов тканей в тератомах, полученных из клеток ЬЕ8М01г18, снижение способности к спонтанной дифференцировке клеток 1гЕ8М01г18 и 11Е8М03с}ег9, замедление формирования эмбриоидных телец клетками сублинии ЬЕБМОШв.

Таким образом, в результате проведения цитогенетического анализа было показано, что постоянный кариотипический контроль позволяет осуществлять длительное культивирование ЭСК с сохранением их нормального кариотипа. В то же время, при условии детального описания перестроенных хромосом, сублинии с хромосомными аномалиями могут оказаться мощным инструментов в изучении роли конкретных хромосомных районов в поддержании плюрипотентности ЭСК и определении спектра их возможной дифференцировки.

CD-30 как новый маркер недифференцированного статуса ЭСК человека. Как

было упомянуто выше, сохранение нормального кариотипа является необходимым условием и критерием работы с ЭСК человека, поэтому обнаружение удобных маркеров трансформированного состояния ЭСК человека имеет большое значение. Herszfeld и соавторами было показано, что рецептор семейства ФНО CD30 может быть использован для того чтобы отличить клетки с аномальным кариотипом от нормальных ЭСК (Herszfeld et al., 2006). Изначально CD30 был обнаружен как антиген лимфом Рида-Стенберга и Ходжкина. Экспрессия CD30 характерна также для клеток эмбриональной карциномы. Нами был проведен иммуногистохимический и FACS анализ экспрессии CD30 в 6 линиях ЭСК с нормальным кариотипом и 4 - с хромосомными аберрациями. Проведенный анализ показал, что независимо от метода культивирования и от кариотипа все исследованные линии экспрессирут CD30 антиген. Мы также исследовали экспрессию CD30 в ЭСК человека при дифференцировке in vitro и in vivo. В частично дифференцированных колониях ЭСК

Рисунок 6. СВДО является маркером недифференцированных ЭСК человека. Иммуногистохимический (вверху) и ОТ-ПЦР анализ (внизу) экспрессии СШО в ЭСК и их дифференцированных производных. А - Частично дифференцированная колония ЭСК (фазовый контраст). В - Та же колония, окрашенная антителами к СОЗО (зеленый). С - нейроны, дифференцированные из ЭСК (фазовый контраст) О - нейроны, окрашенные антителами к СШО (зеленый). Е-Н - Анализ экспрессии СИЗО в тератомах, происходящих из ЭСК. Е,С Окраска гематоксилином-эозином, Е,Н - окраска антителами к СБЗО. Ядра окрашены ВАР1.1 - СП 30 транскрипт детектируется в недифференцированных ЭСК всех проанализированных линий (дорожки 1-8,10,11) и не детектируется в тканях проанализированных тератом (9, 12,13).

СИЗО не детектировался в участках дифференцировки (рис.6). Дифференцировка ЭСК по нейрональному (рис.бС, В) эндотелиальному пути и в фибробластоподобные клетки также приводила к исчезновению экспрессии СШО. Мы также проанализировали

гистологические срезы тератом, образованных в иммунодефицитных мышах клетками линии ЬЕБМ01 с нормальным кариотипом и сублинией с кольцевой хромосомой 18. Мы не обнаружили экспрессии СБЗО ни в тератомах из клеток с нормальным кариотипом, ни в тератомах, образованных мутантными клетками. Все полученные нами данные свидетельствуют о том, что СБЗО скорее является новым маркером недифференцированного состояния ЭСК, чем маркером генетической нестабильности. Исследование диффузионной связи через щелевые контакты в чЭСК и в процессе из спонтанной диффереицировки. Хорошо известно, что одним из важных элементов при локальном межклеточном взаимодействии являются щелевые контакты (ЩК), которые в своем активом состоянии обеспечивают интенсивную диффузионную связь между соседними клетками. Экспериментально было показано, что локальные межклеточные взаимодействия на основе ЩК имеют важное значение в процессах развития, в процессах эмбриональной индукции и диффереицировки. Однако, до настоящего момента оставалось неизвестным каким образом изменяются щелевые взаимодействия в процессе культивирования ЭСК и их дифференцировке. Проницаемость ЩК определяли методом внутриклеточных инъекций флуоресцентного красителя люцифера желтого в одну из клеток монослоя с последующей регистрацией его распространения в соседние клетки. Количество окрашенных клеток подсчитывалось через 2 мин. после инъекции красителя. Проницаемость ЩК исследовали на разных этапах развития культуры ЭСК человека. В первоначальных небольших колониях шпорилотептных клеток краситель, введенный в одну из центральных клеток, за 2 минуты после инъекции распространяется во все клетки островка (рис.7а, Ь). Иммуногистохимический анализ частично дифференцированных колоний на наличие маркеров плюрипотентности ОсО/4, Каш^ и СЛЭЗО показывает, что в центральных клетках колонии эти маркеры отсутствуют, в то время как в окружающих их мелких клетках эти маркеры еще сохраняются (рис.7Ь, окраска на Осв/4). Это доказывает, что клетки расположенные в центре колонии вступили в процесс диффереицировки и потеряли свойство плюрипотентности, а окружающие их клетки являются исходными плюрипотентными ЭСК. На рисунке 7с1 в одном поле зрения проведено две инъекции красителя в частично дифференцированной колонии ЭСК. Первая инъекция произведена в плюрипотентную клетку (левая часть кадра), а вторая - в дифференцированную клетку (верхняя часть того же кадра). Видно, что при первой инъекции хорошо окрашиваются многочисленные плюрипотентные клетки, а при второй краситель из дифференцированных клеток никуда не распространяется. Существенно отметить, что краситель распространяется только в плюрипотентные

клетки и никогда не переходит в зону дифференцированных клеток, что говорит о потере связи между дифференцированными и недифференцированными клетками в пределах одной структурно-морфологической единицы. Диффузионная связь внутри пула дифференцирующихся клеток не очень устойчива, и может колебаться в значительных пределах - от 10 окрашенных соседних клеток за две минуты после инъекции красителя в одну из клеток до полного отсутствия распространения красителя. Между плюрипотентными клетками в любом случае сохраняется высокий уровень диффузионной связи - до 30 окрашенных соседних клеток за 2 минуты после

ЯМИЩ ШШвВШЯ ■■ИИИЯИИ.'УШШЙз

д и Рисунок 7. Диффузионные межклеточные контакты

отсутствуют между плюрипотентными и дифференцированными клетками внутри одной колонии ЭСК. А - дифференцированная колония ЭСК. В - та же колония, окрашенная антителами к /0-1 (маркер клеточных контактов) (красный) и маркеру плюрипотентности ОСТ-4 (зеленый). Плюрипотентные клетки расположены снаружи, дифференцированные - внутри колонии

С-Е. Исследование плотности диффузионных контактов с помощью инъекция люцифера зеленого в дифференцированные (О на С) и недифференцированные клетки в колонии ЭСК. Места инъекции обозначены звездочками на Ц. Е - распределение люпифера зеленого в течение 20 сек после инъекции. Видно отсутствие связи между пулами плюрипотентных и дифференцированных клеток в колонии.

инъекции. Очень высокая диффузионная связь между плюрипотентными ЭСК указывает на то, что эти клетки весьма интенсивно обмениваются между собой пулом низкомолекулярным растворимых в воде соединений, который может включать в том числе и плюрипотентости. Подобная интеграция или кооперация плюрипотентных ЭСК несомненно создает высокую устойчивость в подержании соответствующего биологического статуса этих клеток, так как любые изменения метаболизма в отдельных клетках, например, при различных отклонениях в работе генома, будут нивелироваться мощными потоками соединений, поступающих из соседних клеток. В этой связи становится очевидным важный функциональный смысл возникающего блока диффузионной связи между общим пулом плюрипотентных ЭСК и отдельными клетками этого же пула, которые стремятся детерминироваться в определенном направлении с потерей плюрипотентности. Полученные результаты позволяют

Шт -I I

предположить, что блокада диффузионной связи в самом начале детерминации ЭСК является одним из ключевых моментов в развитии процесса дифференцировки в культуре ЭСК. Вопрос о неустойчивости диффузионной связи между дифференцированными ЭСК требует более детального изучения. Возможно, в этом случае для дальнейшего развития начавшегося процесса дифференцировки наличие или отсутствие диффузионной связи не является существенным. Возможно и другое объяснение. Потеря диффузионной связи между этими клетками может быть важна для последующих дифференцировок, которые могут развиваться в разных направлениях.

Линии ЭСК человека имеют различный статус инактивации X хромосом. Известно, что в линиях ЭСК мыши с кариотипом XX обе Х-хромосомы активны, а инактивация одной из них происходит в процессе дифференцировки. Однако, ЭСК человека не полностью соответствуют ЭСК мыши, а более близки к ЭСК мыши, полученным из эпибласта, в которых уже произошла инактивация одной из X хромосом. До настоящего момента остается открытым вопрос о статусе инактивации Х-хромосомы в женских линиях ЭСК человека. Показано, что статус инактивации зависит от конкретной линии и условий культивирования (Silva et al., 2008). Мы

хвт

ОАРОН

Рисунок 8. ОТ-ПЦР анализ экспрессия гена Х1ЯТ в различных линиях ЭСК

решили изучить, существуют ли эпигенетические отличия между линиями ЭСК человека на уровне статуса инактивации X хромосомы в женских клетках. Мы проанализировали экспрессию гена ХШ- ключевой молекулы в процессе инактивации X хромосомы. Результат ОТ-ПЦР анализа экспрессии гена Х/8Т в линиях ЭСК человека представлен на рисунке 8. Высокий уровень экспрессии наблюдался в клетках линий ЬЕ8М01 и ЬЕ8М04, в линии НЦЕ89 ген ХКТ экспрессировался очень слабо, а в линии Е8МК-05 экспрессии не было обнаружено. По уровню экспрессии Х!&Т можно предположить, что линии ЫЕ8М01 и ЬЕ8М04 имеют неактивную X-хромосому, а в линиях НиЕЯ9 и кЕ8МК05, по-видимому, инактивированная X-хромосома отсутствует, в то же время ген Л76Т экспрессируется дифференцированными клетками линии ЬЕБМКОб. Для того, чтобы проверить статус Х-хромосом, было решено провести исследование модификаций, характерных для

транскрипционно активного и неактивного хроматина (рис.9). Существует несколько гистоновых модификаций, ассоциированных с транскрипционно активным хроматином, наиболее распространенная - диметилирование гистона НЗ по лизину 4 (НЗК4те2). Было исследовано, каким образом данная модификация распределена на X-хромосомах ЭСК человека. Всего было проанализировано не менее 100 ядер и 40 метафазных пластинок для каждой линии. В линии ЬЕ8М04 четко выявляется неактивная Х-хромосома, на которой отсутствует диметилирование гистона НЗ по лизину 4. В линиях ЬЕ8КМ05 и Н1/Е59 данная модификация обнаружена на всех хромосомах, что свидетельствует об отсутствии неактивной Х-хромосомы. Одновременно было проведено исследование гистоновых модификаций, ассоциированных с транскрипционно неактивным хроматином. Основной из них является триметилирование гистона НЗ по лизину 27 (НЗК27теЗ), данная модификация маркирует неактивную Х-хромосому. При изучении модификации НЗК27теЗ на

Рисунок 9. Различный статус инактивапии X хромосомы в (слетках ЭСК человека с кариотипом XX. Иммуногистохнмическое окрашивание метафазных пластинок и ядер антителами кЮтеЗК27 и Юте2К4 А - линия ЬКЯКМП5. Обе X хромосомы активны. В - линия ЬЕ8М04. Одна X хромосома неактивна во всех проанализированных клетках С- линия ЬЕ8М01. X хромосома инактввирована в 10% клеток, в остальных клетках обе X хромосомы активны.

Стрелками указана позиция инактивированной X.

НЗтеЗК27 НЗте2К4 ОАР1

| 'Ж- *':} - ц

ЛФ ¿в С ■

НЗтеЗК27 НЗте2К4 0АР1

НЗтеЗК27 НЗте2Х4 от

\ \ \

препаратах интерфазных ядер оказалось, что сигнал неактивной Х-хромосомы обнаруживается во всех клетках линии Ы38М04, в 10 % клеток в линии ЬЕБМО], а в линиях ЬЕ8МК05 и НИЕ59 не обнаруживается совсем. В процессе дафференцировки линии ЬЕ5МК05 одна из X хромосом теряла маркер активного хроматина и

приобретала маркер неактивного. Таким образом, мы показали, что линии ЭСК человека имеют эпигенетические различия в статусе инактивации X хромосомы. Учитывая, что все линии культивировались в одинаковых условиях, мы предполагаем, что, скорее всего, различия в статусе инактивации X хромосомы в женских клетках является исходным свойством линии, хотя нельзя полностью исключить возможность влияния длительного культивирования.

Различие в эпигенетическом статусе линий ЭСК человека не затрагивает метилирования регуляторных районов генов ключевых транскрипционных факторов, необходимых для самоподдержания и сохранения плюрипотентности. В регуляции самоподдержания и плюрипотентности ЭСК человека принимает участие ряд ключевых транскрипционных факторов, такие как Oct3/4, Nanog, Sox2 и др. Сложное сочетание разного уровня экспрессии и взаиморегуляции этих факторов необходимо для нормального развития эмбриона in vivo и самоподдержания ЭСК in vitro. Моделью дальнейшего развития ЭСК in vitro, эквивалентной стадии гаструляции, является эмбриоидное тельце. На стадии гаструляции начинается специализация клеток, поэтому функционирование генов, вовлеченных в поддержание плюрипотентного состояния, должно быть надежно заблокировано на этой и дальнейших стадиях развития эмбриона. Эпигененетические механизмы позволяют инактивировать транскрипцию гена через сложный многоступенчатый процесс, одним из этапов которого является метилирование ДНК. Ранее было показано, что метилирование ДНК лежит в основе регуляции экспрессии гена Oct3/4 мыши, и предполагается, что именно метилирование регуляторного района гена Oct3/4 является критическим при репрограммировании генома методом переноса ядер соматических клеток. На стадии бластоцисты в том же временном интервале, что и Oct3/4, экспрессируются так называемые ¿'¿■/-¿¿¡¿-ассоциированные гены. Следует отметить, что часть ¿^¿¡/^-ассоциированных генов может реактивироваться в клонированных эмбрионах мыши, а некоторые гены остаются в неактивном состоянии. Для анализа

Рисунок 10. Полуколичественный ОТ-ПЦР анализ генов NANOG, ОСТ4, DPPA3, DPPA5 в

недифференцированных (U), дифференцированных ЭСК человека (D) и в эмбриоидных тельцах (ЕВ) из ЭСК человека линий bESMOl и hESM02. GAPDH использован как внутренний контроль.

эпигенетического статуса были выбраны гены ОРРАЗ и йРРА5, которые, в отличие от Ос13/4, полностью реактивируются при переносе соматического ядра в ооцит мыши. Для анализа экспрессии генов Ос(3/4, Nanog, ОРРАЗ и ОРРА5 использовали РНК, выделенную из недифференцированных колоний ЭСК частично дифференцированных колоний и из эмбриоидных телец на 12 день дифференцировки. Мы проанализировали экспрессию генов Мта^, Ос/3/4, £>РРАЗи £>РРАЗпо мере дифференцировки ЭСК в ЭТ. Во всех проанализированных линия ЭСК экспрессия всех четырех генов снижалась на стадии дифференцировки в ЭТ (рис. 10). Основываясь на данных экспрессии, было решено определить изменения в статусе метилирования регуляторной области человеческого гена ОаЗ/4 и 5'-концевых областей генов ЛЬж®; ВРРАЗ и йРРА5

Рисунок 11. Карта 5'-концевых регионов генов КАТТОв (А), ОСТ4 (В), йРРАЗ (С), ОРРА5 (О). Экзоны показаны черным цветом, а направление транскрипции гена стрелкой. НраШМзр! сайты рестрикции показаны вертикальными линиями. Гнбридизационные пробы закрашены диагональной штриховкой. Буквы В, С, В1 н Н обозначают ограничивающие сайты рестрикции ВатШ, С{г91, В§1П и Шп<Ш1, соответственно.

(рис.11) в линиях ЭСК человека во время дифференцировки в эмбриоидные тельца. В качестве контроля была использована ДНК из терминально дифференцировнных клеток: лимфоцитов периферической крови, в которых исследуемые гены не экспрессируются. Статус метилирования ДНК анализировался с помощью Саузерн-блот гибридизации геномной ДНК, обработанной чувствительной к метилированию рестриктазой НраП и нечувствительной к метилированию МэрГ с пробами, с соответствующими 5'-концевым участкам исследуемых генов. Выбранный подход позволял проанализировать качественные изменения метилирования на большом участке генома (в нашем случае 8-12 т.п.н.), то есть анализируются все вероятные регушггорные области, которые попадают в исследуемый участок. Ранее, сравнительный анализ статуса метилирования и уровня ацетилирования в ЭСК и трофобластах мыши выявил строгую взаимосвязь между эпигенетическим статусом гена и его активностью. Однако, подобные эксперименты не проводились на клетках человека, поэтому был проанализирован статус метилирования 5'-области гена Ос/3/4 человека, соответствующей регуляторной области гена Ос{3/4 мыши. Гибридизационный анализ показал, что вся область между ограничивающими сайтами рестрикции размером около 10 т.п.н. и включающая промоторную область гена Ос13/4

не метилирована в недифференцированных ЭСК (рис. 12а). Во время дифференцировки в ЭТ, в которых экспрессия Oct3/4 все еще наблюдается, но уровень значительно снижен, исследуемая область гена частично метилирована во всех исследованных линиях ЭСК человека. На рисунке 12а приведены результаты, полученные для линии hESM02. Частичное метилирование в ЭТ можно объяснить тем, что ЭТ представляют собой гетерогенную популяцию клеток на разных стадиях дифференцировки, с разным уровнем экспрессии гена Oct3/4. Регуляторная область гена Nanog человека изучена недостаточна. Была показана функциональная значимость некоторых регуляторных

Рисунок 12. Анализ уровня метилирования промоторной области гена ОСТ4 и предполагаемой регуляторной области гена NANOG. (А) Саузерн-блот гибридизация ОСТ4 пробы с геномной ДНК из колоний ЭСК (ES), эмбриоидных телец (ЕВ) и из лимфоцитов переферической крови человека (HL), обработанной Cfr91 (С), Cfrtl и Hpall (+Н), Cfr91 и Mspl (+М). (В) Саузерн-блот гибридизация NANOG пробы с геномной ДНК из колоний ЭСК (ES), эмбриоидных телец (ЕВ) и из лимфоцитов переферической крови человека (HL), обработанной ВатШ (В), ВатШ и Hpall (+Н), ВатШ и Mspl (+М). Молекулярный вес гибридизационных

элементов 5' области гена Nanog мыши, которые содержат сайты связывания трансрипционных факторов Oct3/4 и Sox. Нами был проанализирован уровень метилирования 5'- области гена Nanog размером 12 т.п.н., куда могли попадать основные регуляторные элементы гена. Как видно из рисунка 12в, регуляторная область гена Nanog не метилирована в недифференцированных ЭСК и частично метилирована в ЭТ. Изменение статуса метилирования 5'-концевой области гена Nanog в процессе дифференцировки ЭСК в ЭТ происходит сходно с изменением статуса метилирования регуляторной области гена Oct3/4. Учитывая эпигенетическую инактивацию Oct3/4 и Nanog в соматических клетках, можно предположить, что при репрограммировании генома будет происходить неполная реактивация не только гена

4 [J

ES1 ЕВ! ш. га

'( -н -м г -н -м ! г -н -м' в .11 -м

-'Ж ' " п.» и.

w Ml

ЕВ!

' в .к -м1 к .к *м:

■ ■

Ос(3/4, но и Nanog. Регуляторные области генов DPPA3 и DPPA5 не изучены. Основываясь на данных экспрессии генов DPPA, было предположено, что регуляция их экспрессии осуществляется аналогично генам OctJ/4 и Nanog. Нами был проанализирован статус метилирования генов DPPA3 и DPPA5 в клетках линий hESMOl, hESM02, hESM03 и в лимфоцитах периферической крови человека. 5'-концевая область гена £>РРАЗ полностью метилирована в недифференцированных клетках линии hESM02 и частично метилирована в эмбриодных тельцах, а в недифференцированных клетках линии hESMOl и эмбриодных тельцах частично метилирована (рис. 13а). Схожие изменения в статусе метилирования наблюдаются и в 5'-концевой области гена DPPA5 во время дифференцировки ЭСК в эмбриоидные тельца. 5'-концевая область гена DPPA5 метилирована в недифференцированных клетках линии hESM02 и частично метилирована в эмбриодных тельцах, а в

л В

ES2 ЕВ2 HL ESI ЕВ1 ES2 ЕВ2 HL ESI ЕВ!

1в *н -м': 1 в -м"в *н *м1,в <н .м'ТТн *м! н* -н -м Ч» .н -м !hj -н -м и>.н •м' нГ.ТГ-м1

1.1 ЬЬ J, у, -У;

Яр Ф Щ щ ,

и ь* % J.

Ж 1 . Щ ' ' Ь щ % - s 5

| ■Ж

;...

Рисунок 13. Анализ уровня метилирования предполагаемых регуляторных 5'-концевых областей генов DPPA3 и DPPAS. (А) Саузери-блот гибридизация DPPA3 пробы с геномной ДНК аз колоний ЭСК (ES), эмбриоидных телец (ЕВ) н из лимфоцитов перефервческой кровв человека (HL), обработанной Bglll (В), BgUI и Hpall (+Н), BgUI и Mspl (+М). (В) Саузерн-блот гибридизация NANOG пробы с геномной ДНК из колоний ЭСК (ES), эмбриоидных телец (ЕВ) и из лимфоцитов переферической крови человека (HL), обработанной HindlU (НЗ), Hindlll н Hpall (+Н), HindUI и Mspl (+М). Молекулярный вес гибридизацнонных полос обозначен сбоку.

недифференцированных клетках линии hESMOl и эмбриодных тельцах частично

метилирована (рисЛЗв). Таким образом, было продемонстрировано, что полученные по

одному протоколу линии ЭСК отличаются статусом метилирования в области

аутосомных генов, не вовлеченных напрямую в поддержание плюрипотентности.

Разный статус метилирования генов DPPA3 u DPPA5 не влияет на их экспрессию в

ЭСК и на процесс дифференцировки в эмбриоидные тельца. В данном случае

метилирование не приводит к ингибированюо экспрессии генов. Эти данные

показывают, что экспрессия генов DPPA3 и DPPAS в ЭСК человека не зависит от

метилирования и потенциально возможна их реактивация после репрограммирования

генома. Экспрессия генов Ocl3/4 и Nanog зависит от статуса метилирования их

промоторной области и возможно поэтому они хуже реактивируются при соматическом переносе ядер.

Рисунок 14. Результаты дифференциального анализа метилирования 14000 CpG в ДНК клеток линий hESMOl и hESM03. Зеленым показаны неметилированные CpG. красным -метилированные.

Полногеномный анализ статуса метилирования 27000 CpG более 14000 генов (Methylation BeadChip, Illumina) в двух линиях ЭСК человека, позволил обнаружить различия в степени метилировании CpG в промоторах более 400 генов (рис.14). Одно из возможных объяснений разного эпигенетического статуса линий ЭСК человека, заключается в том, что внутренняя клеточная масса, из которой получали ЭСК, была взята с небольшой временной разницей, в то время, когда идет волна тотального метилирования генома de novo. На основании полученных данных можно предположить, что линии ЭСК человека могут использовать сходные принципы поддержания плюрипотентного состояния, но их эпигенетическое наследие может быть различным, и, соответственно, потенциал дифференцировки тоже может отличаться. Таким образом, для дальнейшего практического применения ЭСК человека, необходимо определять эпигенетический статус каждой линии. Дифференцировка ЭСК человека in vi/ro в специализировакние типы клеток. Нами были поставлены эксперименты по проверке способности ЭСК линий hESMOl и hESM04 к дифференцировке в клетки эритроидного ряда. Для этого колонии недифференцированных ЭСК высевали в субконфлюэнтности на фидер из стромальных клеток линии ОР9, известных своей способностью к поддержанию гемопоэза. После 2х дней культивирования, в ростовую среду добавляли ростовые факторы и добавки (SCF, ВМР-4, FLT-3L, эритропоэтин,УЕОР, IGF, дексаметазон) в различных концентрациях и сочетаниях и продолжали культивирование в течение трех-четырех недель. На рисунке 15а представлены эритробласт-подобные клетки, полученные в ходе разработки протокола дифференцировки. ЭСК человека.

Рисунок 15. Дифференцировка ЭСК человека в специализированные типы мезодермальныж клеток in vitro. А. Морфология эритроид-подобных клеток, дифференцированных из ЭСК. В - сокращающиеся кардиомиопиты, дифференцированные из ЭСК

ЭСК были также дифференцированы in vitro в другие производные мезодермального листка - фибробласты, миобласты (не показано), кардиомиоциты (рис.15 в) Дифференцировка чЭСК в компоненты сетчатки глаза. Культивирование ЭСК в высокой плотности в условиях, дающих преимущество для развития нейроэпителия (добавление noggin, EGF, bFGF), а затем добавление BMP,VEGF и сыворотки при культивировании около 90 дней приводило к образованию сложных трехмерных структур, нейроэпителиального происхождения. Как показал иммуногистохимический и ОТ-ПЦР анализ, в фокусах происходит формирование структурированных тканей, имеющих маркеры развивающегося глаза (рис. 16), в том числе пигментного эпителия сетчатки, фоторецепторов, и, возможно, зачатков хрусталика глаза (рис. 16 J, экспрессия кристаллинов А и В, характерных для хрусталика).

Рисунок 16. Дифференцировка ЭСК в компоненты сетчатки глаза. А - вид трехмерной структуры, напоминающей глаз, после месяца культивирования . В - Клетки пигментного эпителия, составляющие наружний слой структуры, изображенной на А. С, й- полутонкие срезы структур, изображенных па А, окраска метиленовым синим. Е-С иммуногистохимический анализ срезов. Н - полутонкий срез, пигментного эпителия. Видны гранулы меланина. I- электронная микрофотография пигментного эпителия. .1 -ОТ-ПЦР анализ РНК выделенной из фокусов, демонстрирующий экспрессию генов, характерных для развивающегося глаза

recoverin I

Разработка технологии дифференцировки и очистки эндотелиальных клеток из ЭСК для практического использования. Кроме дифференцировки ЭСК в желаемом направлении для практического использования специализированных клеток с целью терапии или скрининга субстанций необходимо иметь чистую популяцию специализированных клеток. Примесь низкодифференцированных клеток или клеток другой специализации может критически сказаться на их терапевтическом потенциале и может привести к нежелательным последствиям. В случае скрининга субстанций, примесные популяции клеток могут искажать действие вещества на тестируемый клеточный тип. Поэтому было решено разработать эффективную систему дифференцировки ЭСК человека в эндотелий сосудов и на этой модельной системе

a b

Рисунок 17.

Иммуногистохимический анализ эндотелия из ЭСК после 6 дней (Ь) 8 дней (с) и 12 дней (d) культивирования в среде для дифференцировки. а -сосудистоподобные структуры -светлое поле; b-экспрессия раннего эндотелиального маркера CD31 (красный); ядра окрашены DAPI (синий); с экспрессия позднего эндотелиального маркера vWF (красный), d - экспрессия эндотелиального маркера CD105 (красный), ядра окрашены DAPI (снний). Вторичные антитела Alexa Fluor 546 (b,c) и Alexa Fluor 488 (d). E - Анализ экспрессии CD31 с помощью проточной цитофлуориметрии, изотип-контроль (открытое поле), CD31 специфичные антитела (красное поле).

1 1

СОЭ1 Me» ">

отработать выделение чистой популяции эндотелиальных клеток. Разработанная методология должна быть унивесальна для различных линий ЭСК. Для разработки

технологии были использованы линии ЬЕБМО), ЬЕБМ02 и йЕвМОЗ. Эти линии, полученные в лаборатории ранее, проявляли характерную для данного типа клеток морфологию, экспрессировали соответствующие маркеры и имели нормальный кариотип. При переводе в суспензионную культуру ЭСК формировали ЭТ с характерной морфологией для данного типа структур. При иммуногистохимическом анализе ЭТ после 10-12 дней культивирования были обнаружены в небольшом

Рисунок 18. А- клетки эндотелия, полученные из ЭСК, через 24 часа после селекции (фотография в светлом поле), b - анализ чистоты популяции клеток после иммуномагнитной селекции с помощью проточной цитофлуориметрни. с -иммуногистохимический анализ эпдотелиальных клеток после проведения иммуномагнитной сепарации. Экспрессия CD31 (красный); ядра окрашены DAPI (синий), d -Тест на матригеле (Matrigel Assay), показывающий функциональность клеток, выделенных с помощью иммуномагнитной сепарации

количестве (не более 5%) эндотелиоцитоподобные клетки, экспрессирующие специфический маркер СШ1. Такой метод дифференцировки имел ряд недостатков. Во-первых, требовалось получение ЭТ, что требует времени и эффективность процесса не высока, во-вторых, неконтролируемая дифференцировка дает небольшой выход желаемых клеток. Было решено разработать метод дифференцировки ЭСК в эндотелий сосудов минуя стадию формирования ЭТ. Отсутствие в литературе данных по дифференцировке ЭСК человека в двумерной системе без формирования ЭТ в эндотелиальные клетки потребовало подбора условий и сред для дифференцировки. Мы использовали различный состав сред с различным сочетанием факторов роста, концентраций и типов сывороток, и остановились на наиболее эффективных условиях культивирования. Колонии недифференцированных ЭСК снимали с обработанного коллагеназой фидера и помещали на чашки Петри, покрытые коллагеном IV типа. В среде ОМЕМЛР12, содержащей 15% РВ8, ЬРОР (4 нг/мл), ЭСБ (20 нг/мл), УБвР (20 нг/мл),ЮР(20 нг/мл), гидрокортизон, гепарин, клетки на 5 день начинали приобретать морфологию дифференцированных производных. На 7ой день культивирования колонии содержали кластеры сосудоподобных структур. Разработанный протокол дифференцировки позволял получить культуру клеток, в которой доля эндотелиальных

клеток составляла до 50% (Рис.17). Иммуноцитохимический анализ показал, что большая часть клеток была положительна не только по ранним маркерам эндотелия, но и экспрессировала маркер позднего, зрелого эндотелия - фактор Вон Виллибрандта (vWF). Таким образом, нами была показана возможность высокоэффективного получения клеток эндотелия из ЭСК человека в двумерной системе минуя стадию формирования ЭТ.

Следующей задачей являлась разработка метода селекции предшественников эндотелия и эндотелиальных клеток из дифференцированных ЭСК человека. Был выбран метод иммуномагнитной сепарации MACS (magnetic activated cell sorting). Подобный метод позволяет с чистотой более 98% провести селекцию нужной популяции клеток по поверхностным маркерам. Для селекции эндотелия, полученного из ЭСК был использован поверхностный маркер CD31. После соответствующих промывок проводили сепарацию на колонках. Фракцию CD31-положительных клеток высевали на чашки, покрытые коллагеном, в среду для эндотелиальной дифференцировки. Из CD31 положительной фракции клеток отбирали аликвоты для оценки жизнеспособности после сепарации, оценки чистоты популяции (иммуногистохимический анализ) и для оценки функциональной способности выделенных клеток образовывать сосудистые структуры (Matrigel assay). Как видно из рисунка 18, клетки формировали характерную для эндотелия ячеистую сосудоподобную сеть. Иммуногистохимический анализ и данные проточной цитофлуометрии показали, что более 95% клеток после селекции были положительны по CD31. Анализ экспрессии генов, характерных для эндотелия, методом полуколичественного ОТ-ПЦР показал, что уровень экспрессии этих генов в клетках эндотелия из ЭСК сравним с уровнем их экспрессии в эндотелиальных клетках человека (HUVEC). Таким образом мы показали, что клетки эндотелия, дифференцированные из ЭСК человека, могут быть успешно очищены методом магнитной сепарации, при этом сохраняя жизнеспособность и функционально были идентичны нормальным клеткам эндотелия сосудов человека.

Дифференцировка ЭСК в специализированный тип клеток сопровождается изменением паттерна экспрессии генов и закрепляется на эпигенетическом уровне. Роль метилирования в регуляции экспрессии генов GATA-2, GATA-3 и eNOSпри дифференцировке ЭСК человека в эндотелий. Формирование эндотелия в эмбриогенезе и функционирование во взрослом организме сопровождается экспрессией целого ряда транскрипционных факторов. Ранее было показано, что транскрипционные факторы семейства GATA принимают непосредственное участие в реорганизации

внеклеточного окружения дифференцированных эндотелиальных клеток, регулируя экспрессию своих генов - мишеней. экспрессируется в различных типах тканей

и играет важную роль в образовании гематопоэтических предшественников. В процессе дифференцировки и в дифференцированных эндотелиальных клетках GATA-2 регулирует экспрессию таких генов, как eNOS, Эндотепин-J\ Flk-J, JCAM-2, Р-сепектин, РЕСАМ-1, Utrophin-B, vWF. GATA-3 экспрессируется во многих тканях мышиного эмбриона. Как GATA-1 и 2, GATA-3 принято относить к гематопоэтическим транскрипционным факторам. Роль GATA-3 в эндотелии мало изучена. GATA-3 принимает участие в позитивной регуляции экспрессии гена VCAM-J, a GATA-6 негативно регулирует тот же ген. Тем самым, образуется сложная сеть регуляции экспрессии, которая отражается на фенотипе клеток. Эти и другие транскрипционные факторы оказывают влияние на экспрессию генов, специфических для эндотелия. Одним из характерных эндотелиальных генов является eNOS. eNOS производит основную часть оксида азота в эндотелиальных клетках. eNOS экспрессируется на поздних стадия дифференцировки эндотелия и характеризует зрелый эндотелий. ОТ-ПЦР анализ ЭСК и полученного из него эндотелия сосудов показал, что в чистой

Рисунок 19. Полуколичественный ОТ-ПЦР анализ генов VE-кадхерин, GATA-2, Flkl, GAPDH, GATA-3, eNOS, CD31 н генов плюршгатентностн oct4 и nanog в недифференцированных ЭСК линии ESM03 (U), клетках эндотелия из ЭСК линии ESM03, полученных с помощью нммуномагнитнон сепарации (Е) и в клетках эндотелия из пупочной вены человека (Н).

популяции эндотелиальных клеток отсутсвует экспрессия генов, связанных с шпорипотентностью (Ос/3/4, Nanog), зато наблюдается экспрессия генов, характерных для эндотелия сосудов (рис. 19).

Таким образом, в дифференцированных производных работает генетическая программа, характерная для клеток эндотелия сосудов. Однако, по нашему мнению, кроме изменения генетической программы критерием «совершенной» дифференцировки должны также быть изменения в эпигенетическом статусе при переходе из дифференцированного состояния в шпорипотентное. Например, для eNOS была показана зависимость экспрессии от эпигенетического статуса его регуляторных областей в эндотелиальных и неэвдотелиальных клетках (Chan et al., 2004). Для транскрипционных факторов GATA-2 и GATA-3 такие исследования не проводились, поэтому было решено исследовать метилирование промоторных областей генов eNOS,

САГА-2 и йАТА-З во время тканеспецифической дифференцировки ЭСК человека в клетки функционального эндотелия, полученные по технологии описанной выше. Паттерн метилирования промоторных районов ОАТА-2, йАТА-3 и eAГOS был проанализирован в ЭСК человека а также в клетках эндотелия, полученных из ЭСК человека и в первичной культуре нормальных эндотелиальных клеток человека, выделенных из пупочной вены (НЦУЕС). С помощью бисульфитного секвенирования была проанализирована область, соответствующая селективному промотору гена йАГА-2, экспрессия с которого осуществляется в гематопоэтических клетках и гемангиобласте. В недифференцированных ЭСК человека уровень метилирования исследуемого района оказался высоким, доля метилированных СрО-динуклеотидов в

hESC

hËSC

* » н 1 ^ 11 ? п * « * - * *ч * * ■ * * " НЕС

lli.llll ■ .« . ■ - в la.I.

i i i • i î • ' ! ч < « ' « « < •'• •< ■ 1 » > г HUVEC

' tim " Ht -• î.»ï-ï«î? « CpG positron In GATA-2 promoter

hESC

llllllllil

ÎÎHSIÎ

НЕС

HUVEC

( » »

НЕС

МИИишмШЁКЯ

1 i t ! < i f ' s HUVEC

iliiiniiiliiiillliili

•»f*t

»*.« *

1 iLi^ii.

s о

2 :]

:!StHiïï»--4iiîlUi; CeG Dosiiion in GATA-3 Dromoîer

Рисунок 20. Результаты бисульфитного секвенирования промоторных областей генов САТА-2 (А),САТА-3 (В), еГИИ (С) ЬЕвС- ЭСК человека, НЕС-эндотелий полученный из ЭСК человека, НЦУЕС - эндотелий пупочной вены человека.

: < ; ' : i « : CpG position in «NOS pnomoter одном сайте варьировала от 50% до 80% (рис.20). В эндотелиальных клетках,

полученных из ЭСК человека, уровень метилирования был значительно ниже, доля

метилированных CpG-динуклеотидов в одном сайте метилирования варьировала от

10% до 30% (рис. 20). В HUVEC уровень метилирования был немного ниже, доля

метилированных CpG динуклеотидов в одном сайте метилирования варьировала от 0 до

20%. Таким образом, в недифференцированных ЭСК, которые не экспрессируют GATA-

2, селективный промотор транскрипционного фактора гиперметилирован, а в клетках

экспрессирующих GATA2 - гипометилирован. Из этого следует, что метилирование

селективного промотора GATA-2 в ЭСК человека может оказывать влияние на экспрессию этого транскрипционного фактора. Анализ транскрипции GATA-3 выявил низкий уровень экспрессии гена в недифференцированных ЭСК человека и высокий в клетках эндотелия из ЭСК и в HUVEC (рис. 20). Как и в случае GATA-2.\ у GATA-3 существует два промотора. Экспрессия с альтернативного промотора обнаруживалась только в тканях головного мозга, поэтому для изучения возможной эпигенетической регуляции гена GATA-3 нами была выбрана область основного промотора гена. В недифференцированных ЭСК человека исследуемая область была гиперметшшрована и уровень варьировал от 60% до 90% метилированных CpG-динуклеотидов. В эндотелии, полученном из ЭСК человека, уровень метилирования был низкий - от 10% до 30% метилированных CpG. В HUVEC наблюдался схожий уровень метилирования от 10% до 20% метилированных CpG. Таким образом, полученные нами данные говорят о том, что даже в случае гиперметилирования основного промотора гена GATA-3 наблюдается слабая экспрессия гена в недифференцированных ЭСК человека. Из этого следует, что метилирование основного промотора в недифференцированных ЭСК недостаточно для полного ингибировакия экспрессии GATA-3. Ранее было показано, что для некоторых промоторов ингибирование, опосредованное метилированием ДНК, эффективно лишь в контексте хроматина. Вторым возможным вариантом является работа альтернативного промотора гена GATA-3 в ЭСК человека. В рамках настоящей работы альтернативный промотор не исследовался. Тем не менее, опираясь на полученные нами данные по существенному увеличению экспрессии GATA-3 в дифференцированных клетках эндотелия, мы можем утвервдать, что гипометилирование промотора гена по мере дифференцировки ЭСК человека в клетки эндотелия, оказывает положительное влияние на транскрипцию гена GATA-3. По результатам ОТ-ПЦР ген eNOS экспрессируется в клетках эндотелия, полученных из ЭСК, и в HUVEC и не экспрессируется в недифференцированных ЭСК человека (рис. 20). По данным Chan и соавторов (Chan Y., 2004), наиболее существенным эпигенетическим модификациям в эндотелиаьных клетках подвергается регуляторный район гена eNOS ъ ближайшем к старту транскрипции районе, поэтому для бисульфитного секвенирования была использованы праймеры на значимую цепь на область с 13 по -297 нуклеотид относительно старта транскрипции. Доля метилированных CpG-динуклеотидов в каждом сайте метилирования варьировала в недифференцированных ЭСК от 70% до 90% (рис 19.). В эндотелиальных клетках, полученных из ЭСК человека доля метилированных CpG динуклеотидов в каждом сайте метилирования варьировала от 10% до 30% CpG динуклеотидов (рис. 20). В клетках HUVEC доля метилированных

CpG-динуклеотидов не превышала 10%. Исследуемая регуляторная область гена eNOS содержит сайты связывания конститутивных транскрипционных факторов Spl, Sp3, Ets-1, которые активны и в клетках эмбриона. Гиперметилирование этого участка в ЭСК человека скорее всего блокирует связывание этих факторов с промоторной областью гена, как это и было показано для гладкомышечных клеток стенки сосудов. Известно, что транскрипционный фактор GATA-2 участвует в регуляции экспрессии гена eNOS. В соответствии с нашими данными по мере дифференцировки ЭСК в клетки эндотелия наблюдается одновременное пшометилирование регуляторных районов генов GATA-2 и eNOS. Таким образом, происходит двойной негативный контроль экспрессии eNOS в недифференцированных клетках ЭСК человека, метилирование блокирует не только промоторный район самого гена, но и промоторный район транскрипционного фактора GATA-2, контролирующего экспрессию гена eNOS. Из полученных данных видно, что уровень метилирования промоторных районов сильно отличается в недифференцированных ЭСК и клетках эндотелия. Однако, также наблюдается разница (хотя и гораздо менее существенная), в уровне метилирования между клетками эндотелия из ЭСК и HUVEC. Объяснение возможно заключается в том, что клетки эндотелия из ЭСК были получены in vitro, и, несмотря на то, что по экспрессии основных эпдотелиальных маркеров и по образованию сосудоподобных структур они аналогичны первичным клеткам эндотелия, таким как HUVEC, они демонстрируют отличие на эпигенетическом уровне. Возможно, эти отличия возникли из-за гетерогенности самой эндотелиальной культуры, поскольку не ясно окончательно, к какому типу эндотелия относятся полученные клетки или они представляют смесь специализированных эндотелиальных клеток. Это предположение подтверждается данными Chan с соавторами, которыми показана разница в уровне метилирования регуляторной области гена eNOS в HUVEC и в HuDerMVEC (эндотелий микрососудов кожи человека), в то время как уровень экспрессии гена eNOS в обоих типах клеток сходен. Таким образом, разработанная нами технология дифференцировки и селекции ЭСК человека в эндотелий сосудов приводит не только к изменению паттерна экспрессии генов, но закрепляет генетические изменения на уровне эпигенома через деметилирование промоторных районов. Использование чЭСК для изучения эпигенетической регуляции иейрональной дифференцировки. Мы использовали разработанную нами модель дифференцировки ЭСК человека по нейрональному пути, чтобы проверить возможную роль новой некодирующей РНК anti-NOS2A, которая ингибирует нейроспецифическую индуцибельную NO-синтазу NOS2A.

Для этого мы сначала индуцировали нейрональную дифференцировку в двух линиях чЭСК ЬЕЙМО! и ЬЕ8М02 путем культивирования клеток в бессывороточной среде в

А В

Рисунок 21. Экспрессия гена N052.4 и его антагониста РНК апА-ВДОв при нейрональной днфференцировке ЭСК. А-нейросферы фазовый контраст, В-нейросферы, дифференцированные в нейроны (зеленый) и глню (красный), окраска антителами к >*8Е и СРАР, соответственно. С.О - соотношение между танскриптами гена N082» и апЙ-^082А РНК в недифференцированных ЭСК (С) и в нейросферах (О).

присутствии рекомбинантных факторов noggin и bFGF. Часть клеток образовывала розетки из нейрональных предшественников, которые, при переводе в суспензию, культивировались как нейросферы (рис. 21) и могли при дальнейшем культивировании дифференцироваться в нейроны и глию. Используя метод ОТ-ПЦР в реальном времени, мы обнаружили, что уровень экспрессии anti -N0S2A РНК в недифференцированных ЭСК в полтора раза превышает уровень экспрессии N0S2A (рис. 22). В то же время в нейросферах уровень экспрессии anti-NOS2A меньше уровня экспрессии N0S2A почти в 20 раз. Интересно, что экспрессия NOS2A имеет противоположную динамику (рис. 22) Из этих результатов мы можем заключить, что нейрональная дифференцировка ассоциирована со снижением экспрессии anti-NOS2A РНК и увеличением экспрессии NOS2A, что позволяет предположить роль anti NOS2A в негативной регуляции нейрональной дифференцировки ЭСК путем ингибирования NOS2A.

Рисунок 22. Экспрессия апй^082А РНК (А) и гена N0X20 (В) носит взаимно конкурирующий характер в ЭСК и нейросферах, полученных из ЭСК. На рисунке показаны результаты ПЦР в реальном времени.

NOS2A мРНК

выводы.

1. Создана коллекция и проведена подробная характеристика линий ЭСК человека, в том числе получены, поддерживаются и доступны для исследований линии ЭСК в кулмуральной среде с полностью охарактеризованными компонентами (потенциальные «терапевтические» линии ЭСК).

2. Впервые обнаружены эпигенетические различия в разных линиях ЭСК человека. Впервые показано, что экспрессия транскрипционного фактора Nanog в ходе дифференцировки ЭСК человека сопровождается изменением уровня метилирования его регуляторного района, а уровень метилирования регуляторных районов генов DPPA-3 и DPPA-5 различается между линиями ЭСК человека и не отражается на уровне экспрессии этих генов во время дифференцировки.

3. Доказано, что длительное культивирование ЭСК человека в стандартизованных условиях и хриоконсервация клеток не приводит к кариотилическим изменениям. Разработаны рекомендации по мониторингу кариотипа ЭСК человека в процессе культивирования.

4. Впервые продемонстрировано, что рецептор семейства ФНО CD30 является новым маркером плюрипотентных стволовых клеток, а не маркером трансформированных ЭСК человека.

5. Показана высокая диффузионная связь через щелевые контакты между плюрипотентными клетками в культурах ЭСК. Впервые продемонстрировано, что на ранних этапах детерминации, сопровождающихся потерей экспрессии Oct3/4, между недифференцированными и дифференцированными клетками в колонии ЭСК полностью нарушается диффузионная связь.

6. Разработан новый протокол дифференцировки ЭСК человека в функциональные клетки эндотелия. Показано влияние транскрипционного фактора НОХВ4 на дифференцировку эндотелия из ЭСК. Показана способность ЭСК к дифференцировке in vivo и in vitro, в том числе в кардиомиоциты, фибробласты, сетчатку глаза, клетки крови, нейроны и глию. С использованием протокола дифференцировки ЭСК человека по нейрональному пути обнаружено, что транскрипты anti-NOS2A и NOS2A изменяют свой профиль экспрессии при дифференцировке ЭСК в яейросферы.

7. Впервые показано, что повышение экспрессии генов транскрипционных факторов, участвующих в дифференцировке в эндотелий, GATA-2, GATA-3 и гена eNOS при дифференцировке ЭСК человека в клетки эндотелия сопровождается деметилированием регуляторных районов этих генов.

Список печатных работ, опубликованных по теме диссертации.

1. М.А. Lagarkova, A.V. Eremeev, A.V. Svetlakov, N.B. Rubtsov, S.L. Kiselev. Human embryonic stem cell lines isolation, cultivation, and characterization. // In Vitro Cellular and Developmental Biology-Animal. 2010. Springer. Special issue, pp. 232-238.

2. M.A. Lagarkova, M.V. Shutova, A.N. Bogomazova, E.M.Vassina, E.A.Glazov, P Zang., A.A Rizvanov., I.V. Chestkov., S.L. Kiselev. Induction of pluripotency in human endothelial cells resets epigenetic profile on genome scale // Cell Cycle. 2010 V9 (5). pp. 956-963.

3. Шаровская Ю.Ю., Лагарькова МЛ, Киселев С.Л., Чайлахян JI.M. Исследование диффузионной связи через щелевые контакты в эмбриональных стволовых клетках человека, // ДАН, 2009, т.427, № 3, спр 33-38.

4. Еремеев А.В, Светлаков А.В, Полстяной А.М, Богомазова А.Н, Фшгоненко Е.С, Шеина Ю.И. Киселев СЛ., Лагарькова М.А. Получение новой линии ЭСК человека в отсутствии фидера и сыворотки. //ДАН, 2009 т. 426, №. 2, стр. 270-272.

5. М.А. Lagarkova, P.Y. Volchkov, E.S. Philonenko, S.L. Kiselev. Efficient differentiation of hESCs into endothelial cells in vitro is secured by epigenetic changes. II Cell Cycle. 2008. Vol. 7, №18. pp. 2929-2935.

6. MA. Lagarkova, P. Y. Volchkov, E.S. Philonenko, K. Pfannkuche, M. A. Prokhorovich, T. Zabotina, J. Hescheler, S. L. Kiselev CD 30 is a marker of undifferentiated human embryonic stem cells rather than a biomarker of transformed hESCs. // Cell Cycle. 2008; Vol.

7. №22 pp. 3475-3480

7. S A. Korneev, E I. Komeeva, MA. Lagarkova, S L. Kiselev, G Critchley, M O'Shea Novel noncoding antisense RNA transcribed from human anti-NOS2A locus is differentially regulated during neuronal differentiation of embryonic stem cells. // RNA. 2008; 14 (10) 1232-1239.

8. Филоненко E.C., Камнев A.H., Зауторов В.Г., Шутова М.В., Цховребова Л.В., Богомазова А.Н., Киселев СЛ., Лагарькова МА. Особенности культивирования ЭСК человека в отсутствии фидера и сыворотки. // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2008, т. 3, стр 31-36.

9. МА. Лагарькова, И.А. Муфазалов, П.Ю. Волчков, СЛ. Киселев. Секретируемый транскрипционный фактор НОХВ4 стимулирует дифференцировку эндотелия из ЭСК человека. // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2007. №1. Стр. 56-59.

10. П.Ю. Волчков, МА. Лагарькова, М.А. Прохорович, СЛ. Киселев Двойной негативный контроль генов, контролирующих направленную дифференцировку ЭСК

человека в эндотелий. И Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2007. №2. стр. 34-39

11. М.А. Прохорович, МЛ Лагарькова, А.Г. Шилов, Т.В. Карамышева, СЛ. Киселев, Н.Б. Рубцов Культуры эмбриональных стволовых клеток человека серии HESM: хромосомные перестройки и стабильность кариотипа». // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2007, №3, стр.143-147.

12. Рубцов Н.Б., Прохорович М.А., Лагарькова М.А., Карамышева Т.В., Киселев С.Л. Цитогенетика стабильных линий эмбриональных стволовых клеток человека hESMOl-

04. // Медицинская Генетика, 2007, т. 6 №10 11-15

13.Филоненко Е.С., Волчков П.Ю., Муфазалов И. А, Киселев С.Л., Лагарькова М.А. Анализ протеинкиназ, преимущественно экспрессирующихся в линиях ЭСК человека в процессе дифференцировки. II Цитология, № 1 2007 стр.561-565

14. И.В. Высочин, A.A. Исаев, М.А. Лагарькова, Г.А. Космиади, С.П. Киселев. Выявление технологических и прогностических факторов, определяющих качество образцов стволовых клеток пуповинной крови. II Клеточная Трансплантология. 2007 №;1(1): стр 60-.62.

15. МЛ. Lagarkova, P.Y. Volchkov, A.V. Lyakisheva, E.S.Philonenko, S.L. Kiselev. Diverse epigenetic profile of novel human embryonic stem cell lines. // Cell Cycle. 2006. Vol.

5. №4. pp. 416-420.

16. Киселев CJL, Волчков П.Ю., Филоненко Е.С., Прохорович М.А., Муфазалов И.А., Лякишева A.B., Лагарькова МЛ. Молекулярная и клеточная биология линий ЭСК человека. // Молекулярная медицина. 2006. №2. Стр. 6-11.

17. Лагарькова М.А., Лякишева A.B., Филоненко Е.С., Волчков П.Ю., Рубцова К.В., Герасимов Ю.В., Чайлахян Р.К., Киселев СЛ. Характеристика мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, выделенных методом иммуномагнитной селекции. II Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2006. №141(1). Стр.112-116.

18. М.А. Прохорович, А.Г. Шилов, Н.Б. Рубцов, СЛ. Киселев, М.АЛагарькова. Метод быстрого и эффективного кариотипирования эмбриональных стволовых клеток человека. // Клеточные культуры. 2006, вып. 21 стр 55-58

19. Прыжкова М.В., Лагарькова М.А. Стволовые клетки: современные тенденции исследований. // Онтогенез. 2004, т. 35, № 6:473-475.

20. Бокерия Л.А., Георгиев Г.П„ Голухова Е.З., Еремеева М.В., Киселев СЛ., Лагарькова МЛ., Асланиди И.П. и др., Клеточные технологии для лечения сердечнососудистых заболеваний. // Вестник РАМН, 2004, 9:48-55

Патенты.

21. Патент на изобретение 2359030. Способ получения эндотелиальных клеток человека (варианты) Киселев C.JI., Лагарькова М.А. 2009 г. 22..Решение о выдаче патента РФ на изобретение по заявке №2008111708/13(01265) Способ получения эндотелиальных и фибробластподобных клеток из пупочного канатика. Приходько A.B., Исаев A.A., Киселев С.Л., Лагарькова М.А., Кошелева Н.В., Сабурина И.Н., Мелихова B.C. 2008г.

Избранные тезисы конференций

23. MA Лагарькова, М.В. Прыжкова, П. Волчков, С.Л. Киселев. Молекулярно-генетическая характеристика линий эмбрионально-стволовых клеток человека на ранних стадиях дифференцировки. // Международный симпозиум "Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия". Санкт-Петербург. 25 - 27 октября 2004.

24. Лагарькова MA., Волчков ШО., Филоненко Е.С., Медвинский А., Киселев СЛ. Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток в клетки эндотелия. П Всероссийская конференция «Фундаментальные науки - медицине» 4-8 сентября 2005. Новосибирск, стр. 37.

25. М.А. Прохорович, А.Г. Шилов, Е.С. Филоненко, MA. Лагарькова, С.Л. Киселев «Разработка быстрого метода кариотипирования эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) человека». // Конференция "Биология стволовых клеток: фундаментальные аспекты". Сборник материалов Конференции, Москва, 17-18 ноября 2005; стр. 23.

26. MA. Lagarkova, P.Y. Volchkov, A.V. Lyakisheva, E.S.Philonenko, S.L. Kiselev. Promoter regions divers methylation profile of pluripotency-relatcd genes in newly derived hESC lines. // XVI. Wilsede Meeting "Modem trends in human leukemia". June 18-22,2005. Wilsede, Germany, p. 78.

27. СЛ. Киселев, Лагарькова MA., Филоненко Е.С., Прохорович М.А., Волчков П.Ю. Молекулярная генетика линий эск человека и проблемы направленной дифференцировки. // VI Международная конференция по молекулярной генетике соматических клеток. 12-16 декабря 2005. Звенигород.

28. MA. Лагарькова, П.Ю. Волчков, Е.С. Филоненко, СЛ. Киселев. Проблемы направленной дифференцировки эмбриональных стволовых клеток. // Конференция "Биология стволовых клеток: фундаментальные аспекты" 17-18 ноября 2005. Москва, стр. 5.

29. MA. Лагарькова, М.А. Прохорович, А.Г. Шилов, СЛ. Киселев, С. М. Закиян «Создание коллекции линий эмбриональных стволовых клеток человека:

сравнительные характеристики клеточных линий» Всероссийский симпозиум «Биология клетки в культуре». Санкт-Петербург, 17-19 октября 2006. Цитология. 2006. Т. 48. №9. Стр. 776.

30. МЛ. Лагарькова, Волчков П.Ю., Филоненко Е.С., Медвинский А., Киселев С.Л. Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека в клетки эндотелия. // Всероссийский симпозиум "Биология клетки в культуре". Санкт-Петербург. 17-19 октября 2006

31. Kiselev S., Lagarkova М., Prokhorovich М., Volchkov P. Human embryonic stem cell lines: cultivation and differentiation. II I-st Congress of the German society for SC research.

2006. Cologne, Germany, p. 95.

32. Volchkov P.Y., Lagarkova M.A., Prokhorovich M.A., Kiselev S.L. Epigenetic control of human embryonic stem cells differentiation into endothelial cells. // Британско-российское совещание "Стволовые клетки: законодательство, исследования и инновации." Москва.

2007.р. 77

33. Lagarkova М., Volchkov P., Philonenko Е., Kiselev S. Epigenetic control of human embryonic stem cells differentiation into endothelial cells. II 5th ISSCR meeting. Australia, Cairns 17-20 June 2007, p.167.

34. M.A. Прохорович, T.B. Карамышева, M.A. Лагарькова, Н.Б. Рубцов «Структурная реорганизация хромосомы 18 и её положение в интерфазном ядре эмбриональной стволовой клетки человека» // Международная молодёжная научно-методическая конференция. Сборник материалов Конференции, стр. 150. Томск 9-12 мая 2007;

35. Т.В. Карамышева, М.А. Прохорович, М.А. Лагарькова, С.Л. Киселёв, Н.Б. Рубцов «Получение микродиссекционных хромосомо- и районоспецифичных зондов для анализа хромосомных перестроек в эмбриональных стволовых клетках человека». П съезд Общества клеточной биологии совместно с юбилейной конференцией, посвященной 50-летию Института цитологии РАН. Санкт-Петербург, 16-19 октября 2007. // Цитология. 2007. Т. 49. №9. Стр. 752.

36. Н.Б. Рубцов, Т.В. Карамышева, М.А. Прохорович, МЛ. Лагарькова, СЛ. Киселёв «Положение аномальных хромосом в интерфазных ядрах эмбриональных стволовых клеток человека». II съезд Общества клеточной биологии совместно с юбилейной конференцией, посвящённой 50-летию Института цитологии РАН. Санкт-Петербург, 16-19 октября 2007. // Цитология. 2007. Т. 49. №9. Стр. 789.

37. Lagarkova М., Philonenko Е., Volchkov P., Bogomazova A., Zautorov V., Kamnev А., Tskhovrebova L., Kiselev S. Human embryonic stem cells as a model to study early

differentiation events. // "Mechanisms of early differentiation". 1-5 September 2008, Barsinghausen, Germany, p.97.

38. T.B. Карамышева, M.A. Прохорович, M.A. Лагарькова, Н.Б. Рубцов «Современные методы молекулярно-цитогенетического анализа в диагностике онкологических заболеваний». II II Региональная конференции молодых учёных им. Н.В. Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии». Сборник материалов Конференции, стр. 32. Томск, 27 апреля 2007;

39. М.А. Прохорович, М.А. Лагарькова, Т.В. Карамышева, А.И. Железова, А.Г. Шилов, Н.Б. Рубцов, С.Л. Киселев «Особенности культивирования, дифференцировки и цитогенетические характеристики линий эмбриональных стволовых клеток человека, имеющих хромосомные аберрации» Всероссийский симпозиум «Биология клетки в культуре». Санкт-Петербург, 17-19 октября 2006. // Цитология. 2006. Т. 48. №9. Cip. 794;

40. MA Lagarkova, YuY Sharovskaya, S.L Kiselev and LM Chailakhyan. Changes in gap junctional intercellular communication during spontaneous differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotency cells. Il VI Congress of ISSCR, 2009, 7-12 July 2009, Barcelona. Spain p.176

Формат 60x90/16. Заказ 886. Тираж 100 экз.

Печать офсетная. Бумага для множительных аппаратов.

Отпечатано в ООО "ФЭД+", Москва, ул. Кедрова, д. 15, тел. 774-26-96

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Лагарькова, Мария Андреевна

СОДЕРЖАНИЕ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Лагарькова, Мария Андреевна

выводы.

1. Создана коллекция и проведена подробная характеристика линий ЭСК человека, в том числе получены, поддерживаются и доступны для исследований линии ЭСК в культуральной среде с полностью охарактеризованными компонентами (потенциальные «терапевтические» линии ЭСК).

2. Впервые обнаружены эпигенетические различия в разных линиях ЭСК человека Впервые показано, что экспрессия транскрипционного фактора Nanog в ходе дифференцировки ЭСК человека сопровождается изменением уровня метилирования его регуляторного района, а уровень метилирования регуляторных районов генов ОРРА-З и ОРРА-5 различается между линиями ЭСК человека и не отражается на уровне экспрессии этих генов во время дифференцировки,

3. Доказано, что длительное культивирование ЭСК человека в стандартизованных условиях и криоконсервация клеток не приводит к кариотипическим изменениям. Разработаны рекомендации по мониторингу кариотипа ЭСК человека в процессе культивирования.

4. Впервые продемонстрировано, что рецептор семейства ФНО СБЗО является новым маркером плюрипотентных стволовых клеток, а не маркером трансформированных ЭСК человека.

5. Показана высокая диффузионная связь через щелевые контакты между плюрипотентными клетками в культурах ЭСК. Впервые продемонстрировано, что на ранних этапах детерминации, сопровождающихся потерей экспрессии ОсХЗ/А, между недифференцированными и дифференцированными клетками в колонии ЭСК полностью нарушается диффузионная связь.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Лагарькова, Мария Андреевна, Москва

1. Гилберт СФ: Биология развития. Издательство «Мир», Москва (1993).

2. Лебедев ИН, Никитина ТВ, Суханова НН, Назаренко СА: Ранняя эмбриональная гибель: реальные масштабы мозаичных форм аномалий кариотипа. Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике. Вып. I стр. 49-57 (2001).

3. Agarwal S, Holton KL, Lanza R.Efficient differentiation of functional hepatocytes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 2008 May;26(5):l 117-27.

4. Albrecht, E.W., Stegeman, C.A., Heeringa, P., Henning, R.H., van Goor, H„ Protective role of endothelial nitric oxide synthase. J Pathol. 2003, 199, 8-17.

5. Amit M, Shariki C, Margulets V, Itskovitz-Eldor J: Feeder layer- and serum-free culture of human embryonic stem cells. Biol Reprod 70:837-845 (2004).

6. Aoi T, Yae K, Nakagawa M, Ichisaka T, Okita K, Takahashi K, Chiba T, Yamanaka S. Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells. Science. 2008 Aug l;321(5889):699-702.

7. Arney, K.L., Bao, S., Bannister, A.J., Kouzarides, T., Surani, M.A. Histone methylation defines epigenetic asymmetry in the mouse zygote. Int J Dev Biol. 2002, 46: 317320.

8. Asahara, T., Murohara, T., Sullivan, A., Silver, M., van der Zee, R., Li, T., Witzenbichler, B., Schatteman, G., Isner, J.M. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 1997, 275, 964-967.

9. Aubert, J., Dunstan, H., Chambers, I., and Smith, A. (2002). Functional gene screening in embryonic stem cells implicates Wnt antagonism in neural differentiation. Nat. Biotechnol. 20, 1240-1245.

10. Avilion, A.A., Nicolis, S.K., Pevny, L.H., Perez, L., Vivian, N., Lovell-Badge, R. Multipotent cell lineages in early mouse development depend on SOX2 function. Genes Dev. 2003, 17, 126-140.

11. Azuara V, Perry P, Sauer S, Spivakov M, Jorgensen HF, John RM, Gouti M, Casanova M,Warnes G, Merkenschlager M, Fisher AG. 2006. Chromatin signatures of pluripotent cell lines. Nat Cell Biol 8:532-538.

12. Baharvand, H., Jafary, H., Massumi, M., Ashtiani, S.K. Generation of insulin-secreting cells from human embryonic stem cells. Dev Growth Differ. 2006, 48: 323-332.

13. Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J.E., and Gottlieb, D.I. (1995). Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342-357.

14. Baker DE, Harrison NJ, Maltby E, Smith K, Moore HD, Shaw PJ, Heath PR, Holden H, Andrews PW: Adaptation to culture of human embryonic stem cells and oncogenesis in vivo. Nat Biotechnol 25:207-215 (2007).

15. Barski, A., Cuddapah, S., Cui, K.R., Roh, T.Y., Schones, D.E., Wang, Z.B., Wei, G., Chepelev, I., and Zhao, K.J. (2007). High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell 129, 823-837.

16. Beaujean, N., Hartshorne, G., Cavilla, J., Taylor, J., Gardner, J., Wilmut, I., Meehan, R., Young, L. Non-conservation of mammalian preimplantation methylation dynamics. Curr Biol. 2004, 14: 266-267.

17. Becskei, A., Seraphin, B. and Serrano, L. (2001). Positive feedback in eukaryotic gene networks: cell differentiation by graded to binary response conversion. EMBO J. 20, 25282535.

18. Beddington, R. S. and Robertson, E. J. (1989). An assessment of the developmental potential of embryonic stem cells in the midgestation mouse embryo. Development 105, 733-73

19. Belham C., Roig J., Caldwell J. A., Aoyama Y., Kemp B. E., Comb M. and Avruch J. 2003. A mitotic cascade of NIMA family kinases. Nerccl/Nek9 activates the Nek6 and Nek7 kinases. J. Biol. Chem. 278: 34897-34909.

20. Ben-Hur, T., Idelson, M., Khaner, H., Pera, M., Reinhartz, E., Itzik, A., and Reubinoff, B.E. (2004). Transplantation of human embryonic stem cell-derived neural progenitors improves behavioral deficit in Parkinsonian rats. Stem Cells 22, 1246-1255.

21. Bestor TH. The DNA methyltransferases of mammals. Hum Mol Genet. 2000 0ct;9(16):2395-402.

22. Bird, A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev. 2002, 16: 621.

23. Blum B, Benvenisty N. Clonal analysis of human embryonic stem cell differentiation into teratomas. Stem Cells. 2007 Aug;25(8): 1924-30.

24. Blume-Jensen P. and Hunter, T. 2001. Oncogenic kinase signalling. Nature. 411: 355365.

25. Boiani & Scholer, Regulatory networks in embryo-derived pluripotent stem cells, Nature V 6, P 872, 2005

26. Bortvin, A., Eggan, K., Skaletsky, H., Akutsu, H., Berry, D.L., Yanagimachi, R., Page, D.C., Jaenisch, R. Incomplete reactivation of Oct4-related genes in mouse embryos cloned from somatic nuclei. Development. 2003, 130: 1673-1680.

27. Bouwman, P., Gollner, H., Elsasser, H.P., Eckhoff, G., Karis, A., Grosveld, F., Philipsen, S., Suske, G. Transcription factor Sp3 is essential for post-natal survival and late tooth development. EMBO J. 2000, 19: 655-661.

28. Brandenberger R, Khrebtukova I, Thies RS, Miura T, Jingli C, Puri R, Vasicek T, Lebkowski J, Rao M: Mpss profiling of human embryonic stem cells. BMC Dev Biol 4:10 (2004).

29. Brenin D, Look J, Bader M, Hubner N, Levan G, and Iannaccone P. Rat embryonic stem cells: a progress report. Transplant Proc 29: 1761-1765, 1997

30. Brustle, O., Jones, K.N., Learish, R.D., Karram, K., Choudhary, K., Wiestler, O.D., Duncan, I.D., and McKay, R.D. (1999). Embryonic stem cell-derived glial precursors: a source of myelinating transplants. Science 285, 754-756.

31. Bruzzone R., White T.W., Paul D.L. Connections with connexins: the molecular basis of direct intercellular signaling. // Europ. J. Bio-chem. 1996. V. 238. P. 1-27.

32. Burch, J.B. Regulation of GATA gene expression during vertebrate development. Semin Cell Dev Biol. 2005, 16: 71-81.

33. Burdon, T., Stracey, C., Chambers, I., Nichols, J. & Smith, A. Suppression of SHP-2 and ERK signalling promotes selfrenewal of mouse embryonic stem cells. Dev. Biol. 210, 30-43 (1999)

34. Butler A. A., Yakar S., Gewolb I. H., Karas M., Okubo Y. and Leroith D. 1998. Insulin-like growth factor-I receptor signal transduction: at the interface between physiology and cell biology. Comp. Biochem. Physiol. B. Biochem. Mol. Biol. 121: 19-26.

35. Buzzard J., Gough N., Crook J. Karyotype of human ES cells during extended culture //Nat Biotechnol. 2004 Apr;22(4):381-2;

36. Caisander G, Park H, Frej K, Lindqvist J, Bergh C, Lundin K, Hanson C: Chromosomal integrity maintained in five human embryonic stem cell lines after prolonged in vitro culture. Chromosome Res. 14(2): 131-7 (2006).

37. Carpenter MK, Rosier ES, Fisk GJ, Brandenberger R, Ares X, Miura T, Lucero M, Rao MS: Properties of four human embryonic stem cell lines maintained in a feeder-free culture system. Dev Dyn 229:243-258 (2004).

38. Carter, M. G., Sharov, A. A., VanBuren, V., Dudekula, D. B., Carmack, C. E., Nelson, C. and Ko, M. S. (2005). Transcript copy number estimation using a mouse whole-genome oligonucleotide microarray. Genome Biol. 6, R61.

39. Cartwright P, McLean C, Sheppard A, Rivett D, Jones K, Dalton S. 2005. LIF/STAT3 controls ES cell self-renewal and pluripotency by a Myc-dependent mechanism.

40. Chadwick, K., Wang, L., Li, L., Menendez, P., Murdoch, B., Rouleau, A., and Bhatia, M. (2003). Cytokines and BMP-4 promote hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells. Blood 102, 906-915.

41. Chailakhyan L.M. Ligand-receptor and junction-mediated cell-cell interactions: comparison of the two principles // Differentiation. 1990. V. 45. № l.P. 1-6.

42. Chan, Y., Fish, J.E., D'Abreo, C. The cell-specific expression of endothelial nitric-oxide synthase: a role for DNA methylation. J Biol Chem. 2004, 279: 35087-35100.

43. Charron, F., Nemer, M. GATA transcription factors and cardiac development. Semin Cell Dev Biol. 1999, 10: 85-91.

44. Choi, K., Kennedy, M., Kazarov, A., Papadimitriou, J.C., and Keller, G. (1998). A common precursor for hematopoietic and endothelial cells. Development 125, 725-732.

45. Chung, Y.S., Zhang, W.J., Arentson, E., Kingsley, P.D., Palis, J., Choi, K. Lineage analysis of the hemangioblast as defined by FLK1 and SCL expression. Development. 2002, 129, 5511-5520.

46. Cowan CA, Klimanskaya I, McMahon J, Atienza J, Witmyer J, Zucker JP, Wang S, Morton CC, McMahon AP, Powers D, Melton DA: Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N Engl J Med 350:1353-1356 (2004).

47. Cowan, P.J., Tsang, D., Pedic, C.M. The human ICAM-2 promoter is endothelial cell-specific in vitro and in vivo and contains critical Spl and GATA binding sites. J Biol Chem. 1998, 273: 11737-11744.

48. Cumano, A., and Godin, I. (2007). Ontogeny of the hematopoietic system. Annu. Rev. Immunol. 25, 745-785.

49. Conley BJ, Trounson AO, Mollard R. Human embryonic stem cells form embryoid bodies containing visceral endoderm-like derivatives.Fetal Diagn Ther. 2004 May-Jun;19(3):218-23

50. D'Amour, K.A., Agulnick, A.D., Eliazer, S., Kelly, O.G., Kroon, E., and Baetge, E.E. (2005). Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nat. Biotechnol. 23, 1534-1541.

51. D'Achille P., Seymour J.F., Campbell L.J. Translocation (14; 18)(q32;q21) in acute lymphoblastic leukemia: a study of 12 cases and review of the literature.Cancer Genet Cytogenet. 2006 Nov;171(l):52-6.

52. Daheron, L., Opitz, S.L., Zaehres, H., Lensch, W.M., Andrews, P.W., Itskovitz-Eldor, J., Daley, G.Q. LIF/STAT3 signaling fails to maintain self-renewal of human embryonic stem cells. Stem Cells. 2004,22: 770-778.

53. De Santa, F., Totaro, M.G., Prosperini, E., Notarbartolo, S., Testa, G., and Natoli, G. (2007). The histone H3 lysine-27 demethylase Jmjd3 links inflammation to inhibition of poly comb-mediated gene silencing. Cell 130, 1083-1094.

54. Di Agostino S., Rossi P., Geremia R. and Sette C. 2002. The MAPK pathway triggers activation of Nek2 during chromosome condensation in mouse spermatocytes. Development. 129: 1715-1727.

55. Dodge, J.E., Kang, Y.K., Beppu, H., Lei, H., Li, E. Histone H3-K9 methyltransferase ESET is essential for early development. Mol Cell Biol. 2004,24: 2478-2486.

56. Doetschman T, Williams P, and Maeda N. Establishment of hamster blastocyst-derived embryonic stem (ES) cells. Dev Biol 127: 224-227, 1988

57. Dorfman, D.M., Wilson, D.B., Bruns, G.A., Orkin, S.H. Human transcription factor GATA-2. Evidence for regulation of preproendothelin-1 gene expression in endothelial cells. J Biol Chem. 1992, 267: 1279-1285.

58. Draper JS, Smith K, Gokhale P, Moore HD, Maltby E, Johnson J, Meisner L, Zwaka TP, Thomson JA, Andrews PW: Recurrent gain of chromosomes 17q and 12 in cultured human embryonic stem ceils. Nat Biotechnol 22:53-54 (2004).

59. Dravid G, Ye Z, Hammond H, et al. Defining the role of Wntfaetacatenin signaling in the survival, proliferation, and self-renewal of human embryonic stem cells. Stem Cells 2005; 23:1489-1501.

60. D'Souza, F.M., Sparks, R.L., Chen, H., Kadowitz, P.J., Jeter, J.R. Jr. Mechanism of eNOS gene transfer inhibition of vascular smooth muscle cell proliferation. Am J Physiol Cell Physiol. 2003,284: 191-199.

61. Dzierzak, E. (2005). The emergence of definitive hematopoietic stem cells in the mammal. Curr. Opin. Hematol. 12, 197-202.

62. Doetschman T, Williams P, and Maeda N. Establishment of hamster blastocyst-derived embryonic stem (ES) cells. Dev Biol 127:224-227, 1988

63. Doetschman TC, Eistetter H, Katz M, Schmidt W, Kemler R. The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium.J Embryol Exp Morphol. 1985 Jun;87:27-45.

64. Eivers E., McCarthy K., Glynn C., Nolan C.M., Byrnes L. 2004. Insulin-like growth factor (IGF) signalling is required for early dorso-anterior development of the zebrafish embryo. Int J Dev Biol. 48: 1131-40.

65. Evans MJ 1972, The isolation and properties of a clonal tissue culture strain of pluripotent mouse teratoma cells. J.Embryol. Exp. Morphol. 28:163-176

66. Evans MJ, Kaufman MH: Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature 292:154-156 (1981).

67. Fan, J.B., Chee, M.S., and Gunderson, K.L. (2006). Highly parallel genomic assays. Nat. Rev. Genet. 7, 632-644.

68. Fish, J.E., Marsden, P.A. Endothelial nitric oxide synthase: insight into cell-specific gene regulation in the vascular endothelium. Cell Mol Life Sci. 2006, 63: 144-162.

69. Fish, J.E., Matouk, C.C., Rachlis, A., Lin, S., Tai, S.C., D'Abreo, C., Marsden, P.A. The expression of endothelial nitric-oxide synthase is controlled by a cell-specific histone code. J Biol Chem. 2005, 280: 24824-24838.

70. Fujikawa T, Oh SH, Pi L, Hatch HM, Shupe T, Petersen BE. Teratoma formation leads to failure of treatment for type I diabetes using embryonic stem cell-derived insulin-producing cells.Am J Pathol. 2005 Jun; 166(6): 1781-91.

71. Fuks F, Burgers WA, Godin N, Kasai M, Kouzarides T. Dnmt3a binds deacetylases and is recruited by a sequence-specific repressor to silence transcription. EMBO J. 2001 May 15;20(10):2536-44.

72. Fuks F, Hurd PJ, Deplus R, Kouzarides T. The DNA methyltransferases associate with HP1 and the SUV39H1 histone methyltransferase. Nucleic Acids Res. 2003 May 1;31(9):2305-12.

73. Gadue, P., Huber, T.L., Nostro, M.C., Kattman, S., and Keller, G.M. (2005). Germ layer induction from embryonic stem cells. Exp. Hematol. 33, 955-964.

74. Galic, Z., Kitchen, S.G., Kacena, A., Subramanian, A., Burke, B., Cortado, R., and Zack, J.A. (2006). T lineage differentiation from human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 103, 11742-11747.

75. Garlanda, C., Dejana, E. Heterogeneity of endothelial cells. Specific markers. Arterioscler Thromb Vase Biol. 1997, 17, 1193-1202.

76. Geiman TM, Sankpal UT, Robertson AK, Zhao Y, Zhao Y, Robertson KD. DNMT3B interacts with hSNF2H chromatin remodeling enzyme, HDACs 1 and 2, and components of the histone methylation system. Biochem Biophys Res Commun. 2004 May 28;318(2):544-55.

77. George, K.M., Leonard, M.W., Roth, M.E. Embryonic expression and cloning of the murine GATA-3 gene. Development. 1994, 120: 2673-2686.

78. Gerami-Naini, B., Dovzhenko, O. V., Durning, M., Wegner, F. H., Thomson, J. A. and Golos, T. G. (2004). Trophoblast differentiation in embryoid bodies derived from human embryonic stem cells. Endocrinology 145, 1517-1524.

79. Gerecht-Nir, S., Ziskind, A., Cohen, S., Itskovitz-Eldor, J. Human embryonic stem cells as an in vitro model for human vascular development and the induction of vascular differentiation. Lab Invest. 2003, 83: 1811-1820.

80. German, Z., Chambliss, K.L., Pace, M.C., Arnet, U.A., Lowenstein, C.J., Shaul, P.W. Molecular basis of cell-specific endothelial nitric-oxide synthase expression in airway epithelium. J Biol Chem. 2000, 275: 8183-8189.

81. Gleiberman AS, Sharovskaya YuYu, Chailakhjan LM. Contact inhibition" of alpha-fetoprotein synthesis and junctional communication in adult mouse hepatocyte culture. Exp Cell Res. 1989 Sep;184(l):228-34.

82. Grass, J.A., Boyer, M.E., Pal, S., Wu, J., Weiss, M.J., Bresnick, E.H. GATA-1-dependent transcriptional repression of GATA-2 via disruption of positive autoregulation and domain-wide chromatin remodeling. Proc Natl Acad Sei USA. 2003, 100: 8811-8816.

83. Guenther, M.G., Levine, S.S., Boyer, L.A., Jaenisch, R., and Young, R.A. (2007). A chromatin landmark and transcription initiation at most promoters in human cells. Cell 130, 7788.

84. Guerette, B., Skuk, D., Celestin, F., Huard, C., Tardif, F., Asselin, I., Roy, B.,Goulet, M., Roy, R., Entman, M., et al. (1997). Prevention by anti-LFA-1 of acute myoblast death following transplantation. J. Immunol. 159, 2522-2531.

85. Guillot, P.V., Liu, L., Kuivenhoven, J.A., Guan, J., Rosenberg, R.D., Aird, W.C. Targeting of human eNOS promoter to the Hprt locus of mice leads to tissue-restricted transgene expression. Physiol Genomics. 2000, 2: 77-83.

86. Hanna, L.A., Foreman, R.K., Tarasenko, I.A., Kessler, D.S., Labosky, P.A. Requirement for Foxd3 in maintaining pluripotent cells of the early mouse embryo. Genes Dev. 2002, 16, 2650-2661.

87. Hardie G. and Hanks S. 1995. The Protein Kinase FactsBook: Protein-Serine Kinases. Academic Press. San Diego. CA. 418.

88. Harrison NJ, Baker D, Andrews PW: Culture adaptation of embryonic stem cells echoes germ cell malignancy. Int J Androl 30:275-281; (2007).

89. Hatano, S. Y., Tada, M., Kimura, H., Yamaguchi, S., Kono, T., Nakano, T., Suemori, H., Nakatsuji, N. and Tada, T. (2005). Pluripotential competence of cells associated with Nanog activity. Mech. Dev. 122, 67-79.

90. Heard E. (2004) Recent advances in X-chromosome inactivation Current Opinion in Cell Biology 2004, 16:247-255

91. Heng, B.C., Haider, H.Kh., Sim, E.K., Cao, T., Ng, S.C. Strategies for directing the differentiation of stem cells into the cardiomyogenic lineage in vitro. Cardiovasc Res. 2004, 62:

92. Herrler A, Krusche C.A., Beier H.M. 1998. Insulin and insulin-like growth factor-1 promote rabbit blastocyst development and prevent apoptosis. Biol Reprod. 59:1302-1310.

93. Hoffman LM, Hall L, Batten JL, Young H, Pardasani D, Baetge EE, Lawrence J, Carpenter MK: X-inactivation status varies in human embryonic stem cell lines. Stem Cells 23:1468-1478 (2005).

94. Hook SS, Lin JJ, Dutta A: Mechanisms to control rereplication and implications for cancer. Curr Opin Cell Biol 19:663-671 (2007).

95. Houghton F.D. Role of gap junctions during early embryo development. Reproduction. 2005. V. 129. P. 129-135.

96. Howlett SK, Reik W. Methylation levels of maternal and paternal genomes during preimplantation development. Development. 1991 Sep;l 13(1): 119-27.

97. Huber, T.L., Kouskoff, V., Fehling, H.J., Palis, J., and Keller, G. (2004).Haemangioblast commitment is initiated in the primitive streak of the mouse embryo. Nature 432, 625-630.

98. Huettner JE, Lu A, Qu Y, Wu Y, Kim M, McDonald JW. Gap junctions and connexon hemichannels in human embryonic stem cells. Stem Cells. 2006 Jul;24(7): 1654-67

99. Ivanova, N., Dobrin, R., Lu, R., Kotenko, I., Levorse, J., DeCoste, C., Schafer, X., Lun, Y. and Lemischka, I. R. (2006). Dissecting self-renewal in stem cells with RNA interference. Nature 442, 533-538.

100. Jackson-Grusby L, Beard C, Possemato R, Tudor M, Fambrough D, Csankovszki G, Dausman J, Lee P, Wilson C, Lander E, Jaenisch R.Loss of genomic methylation causes p53-dependent apoptosis and epigenetic deregulation. Nat Genet. 2001 Jan;27(l):31-9.

101. Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat Genet. 2003, 33: 245-254.

102. Jenuwein T, Allis CD Translating the histone code. Science. 2001 Aug l0;293(5532):1074-80.

103. Jeppesen P. Immunofluorescence in cytogenetic analysis: method and applications. Genet Mol Biol 2000; 23:1107-14.

104. Jiang, W., Shi, Y., Zhao, D., Chen, S., Yong, J., Zhang, J., Qing, T., Sun, X., Zhang, P., Ding, M., et al. (2007b). In vitro derivation of functional insulin-producing cells from human embryonic stem cells. Cell Res. 17, 333-344.

105. Jones J.I. and Clemmons D.R. 1995. Insulin-like growth factors and their binding proteins: biological actions. Endocr. Rev. 16: 3-34.

106. Jones, P.L., Veenstra, G.J., Wade, P.A., Vermaak, D., Kass, S.U., Landsberger, N., Strouboulis, J., Wolffe, A.P. Methylated DNA and MeCP2 recruit histone deacetylase to repress transcription. Nat Genet. 1998, 19: 187-191.

107. Josephson R, Sykes G, Liu Y, Ording C, Xu W, Zeng X, Shin S, Loring J, Maitra A, Rao MS, Auerbach JM: A molecular scheme for improved characterization of human embryonic stem cell lines. BMC Biol 4:28 (2006).

108. Kandli M., Feige E., Chen A., Kilfin G. and Motro B. 2000. Isolation and characterization of two evolutionarily conserved murine kinases (Nek6 and nek7) related to the fungal mitotic regulator, NIMA. Genomics 68: 187-196.

109. Kantaputra PN, Limwongse C, Tochareontanaphol C, Mutirangura A, Mevatee U, Praphanphoj V: Contiguous gene syndrome of holoprosencephaly and hypotrichosis simplex: Association with an ISpl 1.3 deletion. Am J Med Genet A 140:2598-2602 (2006).

110. Katsuyama, K., Shichiri, M., Marumo, F., Hirata, Y. NO inhibits cytokine-induced iNOS expression and NF-kappaB activation by interfering with phosphorylation and degradation of IkappaB-alpha. Arterioscler Thromb Vase Biol. 1998, 18: 1796-1802.

111. Kaufman, D.S., Hanson, E.T., Lewis, R.L., Auerbach, R., and Thomson, J.A. (2001). Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 10716-10721.

112. Kawasaki, H., Mizuseki, K., Nishikawa, S., Kaneko, S., Kuwana, Y., Nakanishi,S., Nishikawa, S.I., and Sasai, Y. (2000). Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron 28,31-40.

113. Keller, G. (2005). Embryonic stem cell differentiation: emergence of a new era in biology and medicine. Genes Dev. 19, 1129-1155.

114. Kennedy, M., D'Souza, S.L., Lynch-Kattman, M., Schwantz, S., and Keller, G.(2007). Development of the hemangioblast defines the onset of hematopoiesis in human ES cell differentiation cultures. Blood 109, 2679-2687.

115. Kikyo, N„ Wade, P.A., Guschin, D., Ge, H., Wolffe, A.P. Active remodeling of somatic nuclei in egg cytoplasm by the nucleosomal ATPase ISWI. Science. 2000, 289: 23602362.

116. Kim D, Gu Y, Ishii M, Fujimiya M, Qi M, Nakamura N, Yoshikawa T, Sumi S, Inoue K. In vivo functioning and transplantable mature pancreatic islet-like cell clusters differentiated from embryonic stem cell.Pancreas. 2003 Aug;27(2):e34-41

117. Kim, D.S., Kim, J.Y., Kang, M., Cho, M.S., and Kim, D.W. (2007). Stem cellbased cell therapy for spinal cord injury. Cell Transplant. 16, 117-123.

118. Kim, T.H., and Ren, B. (2006). Genome-wide analysis of protein-DNA interactions. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 7, 81-102

119. Kimura F., Florl A.R., Seifert H.H., Louhelainen J., Maas S., Knowles M.A., Schulz W.A. Destabilization of chromosome 9 in transitional cell carcinoma of the urinary bladder. Br J Cancer. 2001 Dec 14;85(12):1887-93

120. Kishimoto T. 2003. Distinct regulators for Plkl activation in starfish meiotic and early embryonic cycles. EMBO Journal. 22: 5633-5642.

121. Kleinsmith LJ, Pierce GB Jr. Multipotentiality of single embryonal carcinoma cells.Cancer Res. 1964 Oct;24:1544-51.

122. Klug, M.G., Soonpaa, M.H., and Field, L.J. (1995). DNA synthesis and multinucleation in embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Am. J. Physiol. 269, 19131921.

123. Kohda, T., Inoue, K., Ogonuki, N., Miki, H., Naruse, M., Kaneko-Ishino, T., Ogura, A., Ishino, F. Variation in gene expression and aberrantly regulated chromosome regions in cloned mice. Biol Reprod. 2005, 73: 1302-1311.

124. Korobko E.V., Smirnova E.V., Kiselev S.L, Georgiev G.P., Korobko I.V. 2000. Identification of a new alternative-splicing transcript of Rabaptin-5 interacting with protein kinase MAK-V. Dokl Biochem. 370: 1-3.

125. Korobko I.V., Korobko E.V., Kiselev S.L. 2000.The MAK-V protein kinase regulates endocytosis in mouse. Mol Gen Genet. 264: 411-418.

126. Kumar N.M., GilulaNJB The gap junction communication channel. Cell. 1996. V. 84. №3. P. 381-388.

127. Kyba, M., Perlingeiro, R.C., and Daley, G.Q. (2002). HoxB4 confers definitive lymphoid-myeloid engraftment potential on embryonic stem cell and yolk sac hematopoietic progenitors. Cell 109, 29-37.

128. Lacaud, G., Keller, G., Kouskoff, V. Tracking mesoderm formation and specification to the hemangioblast in vitro.Trends Cardiovasc Med. 2004, 14, 314-317.

129. Laflamme, M.A., Gold, J., Xu, C., Hassanipour, M., Rosler, E., Police, S., Muskheli, V., and Murry, C.E. (2005). Formation of human myocardium in the rat heart from human embryonic stem cells. Am. J. Pathol. 167, 663-671.

130. Lagarkova MA, Shutova MV, Bogomazova AN, Vassina EM, Glazov EA, Zhang P, Rizvanov AA, Chestkov IV, Kiselev SL Induction of pluripotency in human endothelial cells resets epigenetic profile on genome scale Cell Cycle. 2010 Mar 6;9(5).

131. Lee, M.G., Villa, R., Trojer, P., Norman, J., Yan, K.P., Reinberg, D., Di Croce, L.,and Shiekhattar, R. (2007). Demethylation of H3K27 regulates polycomb recruitment and H2A

132. Lees JG, Tuch BE. Conversion of embryonic stem cells into pancreatic beta-cell surrogates guided by ontogeny.Regen Med. 2006 May;l(3):327-36. Review.

133. Lei, H., Oh, S.P., Okano, M., Juttermann, R., Goss, K.A., Jaenisch, R., Li, E. De novo DNA cytosine methyltransferase activities in mouse embryonic stem cells. Development. 1996, 122:3195-31205.

134. Lepikhov, K., Walter, J. Differential dynamics of histone H3 methylation at positions K4 and K9 in the mouse zygote. BMC Dev Biol. 2004, 4: 12.

135. Lichter P., Cremer T., Borden J.,Manuelidis L., Ward D.C. 1988. Delineation of individual human chromosomes in metaphase and interphase cells by in situ supression hybridization using recombinant DNA libraries. Hum Genet. 80:224-234.

136. Lighten A.D., Moore G.E., Winston R.M., Hardy K. 1998. Routine addition of human insulin-like growth factor-1 ligand could benefit clinical invitro fertilization culture. Hum Reprod. 13:3144-3150.

137. Lin T.C., Yen J.M., Gong K.B., Hsu T.T., Chen L.R. 2003. IGF-1/1GFBP-1 increases blastocyst formation and total blastocyst cell number in mouse embryo culture and facilitates the establishment of a stem-cell line. BMC Cell Biol. 19:14-28.

138. Lindsley, R.C., Gill, J.G., Kyba, M., Murphy, T.L., and Murphy, K.M. (2006). Canonical Wnt signaling is required for development of embryonic stem cell derived mesoderm. Development 133, 3787-3796.

139. Liu J.P., Baker J., Perkins A.S., Robertson E.J. and Efstratiadis A. 1993. Micc carrying null mutations of the genes encoding insulin-like growth factor I (Igf-I) and type 1 IGF receptor (Igflr). Cell. 75: 59-72.

140. Lowry WE, Richter L, Yachechko R, Pyle AD, Tchieu J, Sridharan R, Clark AT, Plath K. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proc Natl Acad Sci USA. 2008 Feb 26;105(8):2883-8.

141. Ludwig TE, Levenstein ME, Jones JM, Berggren WT, Mitchen ER, Frane JL, Crandall LJ, Daigh CA, Conard KR, Piekarczyk MS, Lianas RA, Thomson JA: Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol 24:185-187 (2006).

142. Lugus, J.J., Chung, Y.S., Mills, J.C., Kim, S.I., Grass, J.A., Kyba, M., Doherty, J.M., Bresnick, E.H., Choi, K. GATA2 functions at multiple steps in hemangioblast development and differentiation. Development. 2007, 134: 393-405.

143. Lumelsky N, Blondel O, Laeng P, Velasco I, Ravin R, and McKay R. Differentiation of embryonic stem cells to insulin-secreting structures similar to pancreatic islets. Science 292: 1389-1394, 2001

144. Loebel DA, Watson CM, De Young RA, Tam PP. Lineage choice and differentiation in mouse embryos and embryonic stem cells.Dev Biol. 2003 Dec 1;264(1):1-14.

145. Maitra, A., Arking, D.E., Shivapurkar, N., Ikeda, M., Stastny, V., Kassauei, K., Sui, G., Cutler, D.J., Liu, Y., Brimble, S.N., et al. (2005). Genomic alterations in cultured human embryonic stem cells. Nat. Genet. 37, 1099-1103.

146. Manes, C., Menzel, P. Demethylation of CpG sites in DNA of early rabbit trophoblast. Nature. 1981, 293,: 589-590.

147. Martin G. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 1981 Dec;78(12):7634-8

148. Martin GR, Evans MJ. Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro.Proc Natl Acad Sci USA. 1975 Apr;72(4):1441-5.

149. Martin, M.J., Muotri, A., Gage, F., Varki, A., Human embryonic stem cells express an immunogenic nonhuman sialic acid. Nature Medicine 2005, 11: 228 232.

150. Matsuda, T., Nakamura, T., Nakao, K., Arai, T., Katsuki, M., Heike, T., and Yokota, T. (1999) EMBO J.

151. Mayer, W., Niveleau, A., Walter, J., Fundele, R., and Haaf, T. (2000). Demethylation of the zygotic paternal genome. Nature 403, 501-502

152. McDevitt, T.C., Laflamme, M.A., and Murry, C.E. (2005). Proliferation of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells is mediated via the IGF/PI 3-kinase/Akt signaling pathway. J. Mol. Cell. Cardiol. 39, 865-873.

153. Meshorer E, Yellajoshula D, George E, Scambler PJ, Brown DT, Misteli T. Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in pluripotent embryonic stem cells. Dev Cell. 2006 Jan;10(l):105-16.

154. Mesnil M Connexins and cancer. Biol. Cell. 2002. V. 94. № 7/8. P. 493-500.

155. Mikkelsen, T.S., Ku, M., Jaffe, D.B., Issac, B., Lieberman, E., Giannoukos, G., Alvarez, P., Brockman, W., Kim, T.K., Koche, R.P., et al. (2007). Genome-wide maps of chromatin state in pluripotent and lineage-committed cells. Nature 448, 553-560.

156. Mikkola M, Olsson C, Palgi J, Ustinov J, Palomaki T, Horelli-Kuitunen N, Knuutila S, Lundin K, Otonkoski T, Tuuri T: Distinct differentiation characteristics of individual human embryonic stem cell lines. BMC Dev Biol 6:40 (2006).

157. Miller S. L., DeMaria J. E., Freier D. O., Riegel A. M. and Clevenger C. V. 2005. Novel association of Vav2 and Nek3 modulates signaling through the human prolactin receptor. Mol. Endocrino. 19: 939-949.

158. Minoguchi S., Minoguchi M. and Yoshimura A. 2003. Differential control of the NIMA-related kinases, Nek6 and Nek7, by serum stimulation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 301: 899-906.

159. Mitalipova MM, Rao RR, Hoyer DM, Johnson JA, Meisner LF, Jones KL, Dalton S, Stice SL: Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol 23:1920 (2005).

160. Mitsui K, Tokuzawa Y, Itoh H, et al. The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells. Cell 2003; 113:631-642.

161. Monk M, Boubelik M, Lehnert S. Temporal and regional changes in DNA methylation in the embryonic, extraembryonic and germ cell lineages during mouse embryo development. Development. 1987

162. Moreira F, Paula-Lopes F.F., Hansen P.J., Badinga L., Thatcher W.W. 2002. Effects of growth hormone and insulin-like growth factor-1 on development of in vitro derived bovine embryos. Theriogenology. 57:895-907.

163. Murry CE, Keller G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 2008 Feb 22;132(4):661-80.

164. Musaro, A., McCullagh, K.J., Naya, F.J., Olson, E.N., Rosenthal, N. IGF-1 induces skeletal myocyte hypertrophy through calcineurin in association with GATA-2 and NF-ATcl. Nature. 1999,400: 581-585.

165. Nagy A, Rossant J, Nagy R, Abramow-Newerly W, Roder JC. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells.Proc Natl Acad SciUSA. 1993 Sep 15;90(18):8424-8.

166. Nakagawa M, Koyanagi M, Tanabe K, Takahashi K, Ichisaka T, Aoi T, Okita K, Mochiduki Y, TakizawaN, Yamanaka S.Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. Nat Biotechnol. 2008 Jan;26(l): 101-6.

167. Nakajima, F., Tokunaga, K., and Nakatsuji, N. (2007). Human leukocyte antigen matching estimations in a hypothetical bank of human embryonic stem cell lines in the Japanese population for use in cell transplantation therapy Stem Cells 25, 983-985

168. Nakano, T., Kodama, H., and Honjo, T. (1994). Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture. Science 265, 1098-1101.

169. Nan, X., Campoy, F.J., Bird, A. MeCP2 is a transcriptional repressor with abundant binding sites in genomic chromatin. Cell. 1997, 88: 471-481.

170. Nan, X., Ng, H.H., Johnson, C.A., Laherty, C.D., Turner, B.M., Eisenman, R.N., Bird, A. Transcriptional repression by the methyl-CpG-binding protein MeCP2 involves a histone deacetylase complex. Nature. 1998, 393: 386-389.

171. Narlikar GJ, Fan HY, Kingston RE. Cooperation between complexes that regulate chromatin structure and transcription. Cell. 2002 Feb 22;108(4):475-87

172. Ng, E.S., Davis, R.P., Azzola, L., Stanley, E.G., and Elefanty, A.G. (2005b). Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation.Blood 106, 1601-1603.

173. Ng, H.H., Zhang, Y., Hendrich, B., Johnson, C.A., Turner, B.M., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Reinberg, D., Bird, A. MBD2 is a transcriptional repressor belonging to the MeCPl histone deacetylase complex. Nat Genet. 1999, 23: 58-61.

174. Nichols, J., Chambers, I., Taga, T., Smith, A. Physiological rationale for responsiveness of mouse embryonic stem cells to gpl30 cytokines. Development. 2001, 128: 2333-2339.

175. Nichols, J., Zevnik, B., Anastassiadis, K., Niwa, H., Klewe-Nebenius, D., Chambers, I., Scholer, H. and Smith, A. (1998). Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4. Cell 95, 379-391.

176. Nistor, G.I., Totoiu, M.O., Haque, N., Carpenter, M.K., and Keirstead, H.S. (2005). Human embryonic stem cells differentiate into oligodendrocytes in high purity and myelinate after spinal cord transplantation. Glia 49, 385-396

177. Niwa H How is pluripotency determined and maintained? Development. 2007 Feb;134(4):635-46.

178. Okabe, S., Forsberg-Nitsson, K., Spiro, A.C., Segal, M., and McKay, R.D. (1996). Development of neuronal precursor cells and functional postmitotic neurons from embryonic stem cells in vitro. Mech. Dev. 59, 89-102.

179. Okano, M„ Bell, D.W., Haber, D.A., and Li, E. (1999). DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell 99, 247-257.

180. Okano, M., Xie, S., Li, E. Dnmt2 is not required for de novo and maintenance methylation of viral DNA in embryonic stem cells. Nucleic Acids Res. 1998, 26: 2536-2540.

181. Okano-Uchida T, Okumura E, Iwashita M, Yoshida H, Tachibana K, Kishimoto T Distinct regulators for Plkl activation in starfish meiotic and early embryonic cycles. EMBO J. 2003 Oct 15;22(20):5633-42.

182. Okita K, Ichisaka T, Yamanaka S. Generation of germlinecompetent induced pluripotent stem cells. Nature 2007 6 Jun; doi:10.1038/nature05934.

183. Pain B, Clark ME, Shen M, Nakazawa H, Sakurai M, Samarut J, and Etches RJ. Long-term in vitro culture and characterisation of avian embryonic stem cells with multiple morphogenetic potentialities. Development 122: 2339-2348, 1996

184. Pan G, Thomson JA. Nanog and transcriptional networks in embryonic stem cell pluripotency. Cell Res. 2007 Jan;17(l):42-9.

185. Pan, G., Li, J., Zhou, Y., Zheng, H., Pei, D. A negative feedback loop of transcription factors that controls stem cell pluripotency and self-renewal. FASEB J. 2006, 20: 1730-1732.

186. Pan, J., McEver, R.P. Characterization of the promoter for the human P-selectin gene. J Biol Chem. 1993,268: 22600-22608.

187. Pan, X., Minegishi, N., Harigae, H. Identification of human GATA-2 gene distal IS exon and its expression in hematopoietic stem cell fractions. Journal of biochemistry 2000, 127: 105-112.

188. Pata, I., Studer, M., van Doorninck, J.H. The transcription factor GATA3 is a downstream effector of Hoxbl specification in rhombomere 4. Development. 1999, 126: 55235531.

189. Peng, Y., Jahroudi, N. The NFY transcription factor inhibits von Willebrand factor promoter activation in non-endothelial cells through recruitment of histone deacetylases. J Biol Chem. 2003, 278: 8385-8394.

190. Pera E.M., Wessely О., LI S. Y. and De Robertis E.M. 2001. Neural and head induction by insulin-like growth factor signals. Dev. Cell. 1: 655-665.

191. Pera MF, Reubinoff B, Trounson A. Human embryonic stem cells. J Cell Sci. 2000 Jan; 113 ( Pt 1):5-10.

192. Perkins, K.J., Davies, K.E. Ets, Ap-1 and GATA factor families regulate the utrophin В promoter: potential regulatory mechanisms for endothelial-specific expression. FEBS Lett. 2003, 538: 168-172.

193. Perrier, A.L., Tabar, V., Barberi, Т., Rubio, M.E., Bruses, J., Topf, N., Harrison,N.L., and Studer, L. (2004). Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 12543-12548.

194. Prokhortchouk A, Hendrich B, Jorgensen H, Ruzov A, Wilm M, Georgiev G, Bird A, Prokhortchouk E. The pi20 catenin partner Kaiso is a DNA methylation-dependent transcriptional repressor. Genes Dev. 2001 Jul l;15(13):1613-8.

195. Qiu, C., Olivier, E.N., Velho, M., and Bouhassira, E.E. (2008). Globin switches in yolk-sac-like primitive and fetal-like definitive red blood cells produced from human embryonic stem cells. Blood 111, 2400-2408.

196. Rafii, S., Lyden, D. Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration. Nat Med. 2003, 9, 702-712.

197. Rajagopal J, Anderson WJ, Kume S, Martinez OI, and Melton DA. Insulin staining of ES cell progeny from insulin uptake. Science 299: 363, 2003

198. Reubinoff, В. E., Itsykson, P., Turetsky, Т., Pera, M. F., Reinhartz, E., Itzik, A. and Ben-Hur, T. Neural progenitors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 2001, 19, 1134-1140.

199. Reubinoff, B.E., Pera, M.F., Fong, C.Y., Trounson, A., and Bongso, A. (2000). Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat. Biotechnol. 18, 399-404.

200. Richard-Parpaillon L., Heligon C., Chesnel F., Boujard D. and Philpott A. 2002. The IGF pathway regulates head formation by inhibiting Wnt signalling in Xenopus. Dev. Biol. 244: 407-417.

201. Richards M, Tan S, Fong CY, Biswas A, Chan WK, Bongso A: Comparative evaluation of various human feeders for prolonged undifferentiated growth of human embryonic stem cells. Stem Cells 21:546-556 (2003).

202. Richards M, Tan SP, Tan JH, Chan WK and Bongso A: The transcriptome profile of human embryonic stem cells as defined by SAGE Stem Cells 22:51-64 (2004).

203. Rideout WM 3rd, Hochedlinger K, Kyba M, Daley GQ, Jaenisch R. Cell. 2002 Apr 5; 109( 1): 17-27.Correction of a genetic defect by nuclear transplantation and combined cell and gene therapy.

204. Rodda, D. J., Chew, J. L., Lim, L. H., Loh, Y. H., Wang, B., Ng, H. H. and Robson, P. (2005). Transcriptional regulation of nanog by OCT4 and SOX2. J. Biol. Chem. 280, 2473124737.

205. Rosier ES, Fisk GJ, Ares X, Irving J, Miura T, Rao MS and Carpenter MK: Long-term culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions Dev Dyn 229:259-274 (2005)

206. Rowland, B.D., Bernards, R., and Peeper, D.S. (2005). The KLF4 tumour suppressor is a transcriptional repressor of p53 that acts as a context-dependent oncogene. Nat. Cell Biol. 7, 1074-1082.

207. Royston, B.D., Royston, D., Pearson, J.D. Aprotinin inhibits platelet adhesion to endothelial cells. Blood Coagul Fibrinolysis. 1992, 3: 737-742.

208. Ruthenburg, A.J., Allis, C.D., and Wysocka, J. (2007). Methylation of lysine 4 on histone H3: intricacy of writing and reading a single epigenetie mark. Mol. Cell 25, 15-30.

209. Ruzov AS, Mertsalov IB, Meehan R, Kiselev SL, Buchman VL, Korobko IV. 2004. Cloning and developmental expression of MARK/Par-l/MELK-related protein kinase xMAK-V in Xenopus laevis. Dev Genes Evol. 214(3): 139-43.

210. Robertson E, Bradley A, Kuehn M, Evans M. Germ-line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector .Nature. 1986 Oct 2-8;323(6087):445-8.

211. Saez JC, Berthoud VM, Branes MC, Martinez AD, Beyer EC Plasma membrane channels formed by connexins: their regulation and functions. Physiol Rev. 2003 Oct;83(4): 1359-400

212. Sambrook, J., Fritsch E. F. and Maniatis T. 1989.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd. ed. New York. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1.21-1.53.

213. Samokhvalov IM, Samokhvalova N1, Nishikawa S. Cell tracing shows the contribution of the yolk sac to adult haematopoiesis. Nature. 2007 Apr 26;446(7139):1056-61.

214. Santos, F., Hendrich, B., Reik, W., Dean, W. Dynamic reprogramming of DNA methylation in the early mouse embryo.Dev Biol. 2002, 241: 172-182.

215. Santos, F., Peters, A.H., Otte, A.P., Reik, W., Dean, W. Dynamic chromatin modifications characterise the first cell cycle in mouse embryos. Dev Biol. 2005, 280: 225-236.

216. Santos, F., Zakhartchenko, V., Stojkovic, M., Peters, A., Jenuwein, T., Wolf, E., Reik, W., Dean, W. Epigenetic marking correlates with developmental potential in cloned bovine preimplantation embryos. Curr Biol. 2003, 13: 1116-1121.

217. Sarraf, S.A., Stancheva, I. Methyl-CpG binding protein MBD1 couples histone H3 methylation at lysine 9 by SETDB1 to DNA replication and chromatin assembly. Mol Cell. 2004, 15:595-605.

218. Schoonjans L, Albright GM, Li JL, Collen D, and Moreadith RW. Pluripotential rabbit embryonic stem (ES) cells are capable of forming overt coat color chimeras following injection into blastocysts. MolReprodDev 45: 439-443, 1996.

219. Schuldiner M, Yanuka O, Itskovitz-Eldor J, Melton DA, and Benvenisty N. From the cover: effects of eight growth factors on the differentiation of cells derived from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 97: 11307-11312, 2000

220. Schoonjans L, Albright GM, Li JL, Collen D, and Moreadith RW. Pluripotential rabbit embryonic stem (ES) cells are capable of forming overt coat color chimeras following injection into blastocysts. Mol Reprod Dev 45: 439-443, 1996.

221. Seifinejad A, Tabebordbar M, Baharvand H, Boyer LA, Hosseini Salekdeh G.Progress and Promise Towards Safe Induced Pluripotent Stem Cells for Therapy. Stem Cell Rev. 2010 Feb 24.

222. Shen, Y., Chow, J., Wang, Z., and Fan, G. (2006). Abnormal CpG island methylation occurs during in vitro differentiation of human embryonic stem cells.Hum. Mol. Genet. 15,2623-2635.

223. Shim, J.H., Kim, S.E., Woo, D.H., Kim, S.K., Oh, C.H., McKay, R., and Kim, J.H. (2007). Directed differentiation of human embryonic stem cells towards a pancreatic cell fate. Diabetologia 50, 1228-1238.

224. Shimizu, R., Yamamoto, M. Gene expression regulation and domain function of hematopoietic GATA factors. Semin Cell Dev Biol. 2005, 16: 129-136.

225. Shimozaki K, Namihira M, Nakashima K, Taga T. Stage- and site-specific DNA demethylation during neural cell development from embryonic stem cells. J Neurochem. 2005 Apr;93(2):432-9.

226. Siegfried, Z., Eden, S., Mendelsohn, M., Feng, X., Tsuberi, B.Z., Cedar, H. DNA methylation represses transcription in vivo. Nat Genet. 1999, 22: 203-206.

227. Singal, R., vanWert, J.M., Ferdinand, L. Jr. Methylation of alpha-type embryonic globin gene alpha pi represses transcription in primary erythroid cells. Blood. 2002, 100: 42174222.

228. Sohl G., Willecke K. An update on connexin genes and their nomenclature in mouse and man. Cell Commun. Adhes. 2003. V. 10. P. 173-180.

229. Solt.er D, Skreb N, Damjanov I. Extrauterine growth of mouse egg-cylinders results in malignant teratoma. Nature. 1970 Aug l;227(5257):503-4.

230. Spence, J.R., and Wells, J.M. (2007). Translational embryology: Using embryonic principles to generate pancreatic endocrine cells from embryonic stem cells. Dev. Dyn. 236, 3218-3227.

231. Stadtfeld M, Brennand K, Hochedlinger K Reprogramming of pancreatic beta cells into induced pluripotent stem cells.Curr Biol. 2008 Jun 24;18(12):890-4

232. Stadtfeld M, Nagaya M, Utikal J, Weir G, Hochedlinger K.Induced pluripotent stem cells generated without viral integration. Science. 2008 Nov 7;322(5903):945-949.

233. Stalker H.J., Ayme S., Delneste D., Scarpelli H., Vekemans M., Der Kaloustian V.M. Duplication of 9ql2-q33: a case report and implications for the dup(9q) syndrome. Am J Med Genet. 1993 Feb 15;45(4):456-9.

234. Stevens LC, Hummel KP. A description of spontaneous congenital testicular teratomas in strain 129 mice.J Natl Cancer Inst. 1957 May; 18(5):719-47.

235. Sukoyan MA, Vatolin SY, Golubitsa AN, Zhelezova AI, Semenova LA, Serov OL. Embryonic stem cells derived from morulae, inner cell mass, and blastocysts of mink: comparisons of their pluripotencies. Mol Reprod Dev. 1993 Oct;36(2): 148-58.

236. Sutton J, Costa R, Klug M, et al. Genesis, a winged helix transcriptional repressor with expression restricted to embryonic stem cells. J Biol Chem 1996;271:23126-23123.

237. Swigut,T.,andWysocka,J. (2007).H3K27demethylases,at long last.Cell 131,29-32.

238. Soria B, Roche E, Berna G, Leon-Quinto T, Reig JA, and Martin F. Insulin-secreting cells derived from embryonic stem cells normalize glycemia in streptozotocin-induced diabetic mice. Diabetes 49: 157-162, 2000.

239. Takahashi, K., and Yamanaka, S. (2006). Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126, 663-676.

240. Tamiolakis D, Papadopoulos N, Lambropoulou M, Venizelos J, Verettas D, Tsikouras P, Koutsougeras G, Papadopoulos H, Karpouzis A, Kouskoukis C. Ber-H2 (CD30) immunohistochemical staining of human fetal tissues. Int J Biol Sci. 2005b; 1(4): 135-40.

241. Tanaka K. and Nigg E. A. 1999. Cloning and characterization of the murine Nek3 protein kinase, a novel member of the NIMA family of putative cell cycle regulators. J. Biol. Chem. 274: 13491-13497.

242. Taylor, C.J., Bolton, E.M., Pocock, S., Sharpies, L.D., Pedersen, R.A., and Bradley, J.A. (2005). Lancet 366, 2019-2025)

243. Thomson JA, Itskovitzeldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ, Marshall VS, Jones JM: Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts Science 282:1145-1147 (1998).

244. Thomson JA, Kalishman J, Golos TG, Durning M, Harris CP, Becker RA, and Hearn JP. Isolation of a primate embryonic stem cell line. Proc Natl Acad Sci USA 92: 78447848, 1995

245. Tsai, F.Y., Orkin, S.H. Transcription factor GATA-2 is required for proliferation/survival of early hematopoietic cells and mast cell formation, but not for erythroid and myeloid terminal differentiation. Blood. 1997, 89: 3636-3643.

246. Turksen K, Troy TC. Human embryonic stem cells: isolation, maintenance, and differentiation. Methods Mol Biol. 2006;331:1-12.

247. Valiunas V, Polosina YY, Miller H, Potapova IA, Valiuniene L, Doronin S, Mathias RT, Robinson RB, Rosen MR, Cohen IS, Brink PR Connexin-specific cell-to-cell transfer of short interfering RNA by gap junctions. J Physiol. 2005 Oct 15;568(Pt 2):459-68

248. Villar, I.C., Francis, S., Webb, A., Hobbs, A.J., Ahluwalia, A. Novel aspects of endothelium-dependent regulation of vascular tone. Kidney Int. 2006, 70: 840-853.

249. Vodyanik, M.A., Bork, J.A., Thomson, J.A., and Slukvin, I.I. (2005). Human embryonic stem cell-derived CD34+ cells: efficient production in the coculture with OP9 stromal cells and analysis of lymphohematopoietic potential. Blood 105, 617-626.

250. Waddington, C.H. (1942). The epigenotype. Endeavour 1, 18-20.

251. Wade, P.A., Gegonne, A., Jones, P.L., Ballestar, E„ Aubry, F., Wolffe, A.P. Mi-2 complex, couples DNA methylation to chromatin remodelling and histone deacetylation. Nat Genet. 1999, 23: 62-66.

252. Wang Y., Wang F., Sun T., Barisic D,. Trostinskaia A., Wygle D., Puscheck E and Rappolee D.A. 2004. Entire mutagen activated protein kinase (MAPK) pathway is present in preimplantation mouse embryos. Developmental Dynamics. 231: 72-87.

253. Wang, H., Cao, R., Xia, L., Erdjument-Bromage, H., Borchers, C., Tempst, P., Zhang, Y. Purification and functional characterization of a histone H3-lysine 4-specific methyltransferase. Mol Cell. 2001, 8: 1207-1217.

254. Wang, Y., Medvid, R., Melton, C., Jaenisch, R„ and Blelloch, R. (2007). DGCR8 is essential for microRNA biogenesis and silencing of embryonic stem cell selfrenewal.Nat. Genet. 39, 380-385.

255. Wang, Y., Yates, F., Naveiras, O., Ernst, P., and Daley, G.Q. (2005b). Embryonic stem cell-derived hematopoietic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 19081-19086.

256. Warner A. Gap junctions in development—a perspective. Semin. Cell Biol. 1992. V. 3. № 1. P. 81-91.

257. Watanabe, D., Suetake, I., Tada, T., Tajima, S. Stage- and cell-specific expression of Dnmt3a and Dnmt3b during embryogenesis. Mech Dev. 2002, 118: 187-190.

258. Weaver BA, Cleveland DW: Aneuploidy: Instigator arid inhibitor of tumorigenesis. Cancer Res 67:10103-10105 (2007).

259. Weiss, M.J., Orkin, S.H. GATA transcription factors: key regulators of hematopoiesis. Exp Hematol. 1995, 23: 99-107.

260. Wernig, M., Meissner, A., Foreman, R., Brambrink, T., Ku, M., Hochedlinger,K., Bernstein, B.E., and Jaenisch, R. (2007). In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature 448, 318-324.

261. Wilks A.F. 1989. Two putative protein-tyrosine kinases identified by application of the polymerase chain reaction. Proc Natl Acad Sci USA. 86: 1603-1607.

262. Woll, P.S., Morris, J.K., Painschab, M.S., Marcus, R.K., Kohn, A.D., Biechele, T.L., Moon, R.T., and Kaufman, D.S. (2007). Wnt signaling promotes hematoendothelial cell development from human embryonic stem cells. Blood 111, 122-131.

263. Worsdorfer P., Maxeiner S., Markopoulos C. et al. // Stem. Cells. 2008. V. 26. № 2. P. 431-429.

264. Wu, Q., Chen, X., Zhang, J., Loh, Y. H„ Low, T. Y., Zhang, W., Sze, S. K., Lim, B. and Ng, H. H. (2006). Sall4 interacts with Nanog and co-occupies Nanog genomic sites in embryonic stem cells. J. Biol. Chem. 281, 24090-24094.

265. Xu, C., Police, S., Rao, N., and Carpenter, M.K. (2002). Characterization and enrichment of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells.Circ. Res. 91, 501— 508.

266. Xu, D., Wilson, T.J., Chan, D., De Luca, E., Zhou, J., Hertzog, P.J., Kola, I. Etsl is required for p53 transcriptional activity in UV-induced apoptosis in embryonic stem cells. EMBO J. 2002, 21: 4081-4093.

267. Xu, R.H., Peck, R.M., Li, D.S., Feng, X., Ludwig, T., and Thomson, J.A. (2005). Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nat. Methods 2,185-190.

268. Yamaguchi, T.P. (2001). Heads or tails: Wnts and anterior-posterior patterning. Curr. Biol. 11,713-724.

269. Yan, Y., Yang, D., Zarnowska, E.D., Du, Z., Werbel, B„ Valliere, C., Pearce, R.A., Thomson, J.A., and Zhang, S.C. (2005). Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells. Stem Cells 23, 781-790.

270. Ying, Q. L., Nichols, J., Chambers, I. & Smith, A. BMP induction of Id proteins suppresses differentiation and sustains embryonic stem cell self-renewal in collaboration with STAT3. Cell 115, 281-292 (2003).

271. Ying, Q.L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M„ and Smith, A. (2003). Conversion of embiyonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat. Biotechnol. 21, 183-186.

272. Yuan, H., Corbi, N., Basilico, C. and Dailey, L. (1995). Developmental-specific activity of the FGF-4 enhancer requires the synergistic action of Sox2 and Oct-3. Genes Dev. 9, 2635-2645.

273. Zeng X, Cai J, Chen J, Luo Y, You ZB, Fotter E, Wang Y, Harvey B, Miura T, Backman C, Chen GJ, Rao MS, Freed WJ: Dopaminergic differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cells 22:925-940 (2004).

274. Zhang, P., Li, J., Tan, Z., Wang, C., Liu, T., Chen, L., Yong, J., Jiang, W., Sun, X., Du, L., et al. (2008). Short-term BMP-4 treatment initiates mesoderm induction in human embryonic stem cells. Blood 111, 1933-1941.

275. Zhang, R., Min, W., Sessa, W.C. Functional analysis of the human endothelial nitric oxide synthase promoter. Spl and GATA factors are necessary for basal transcription in endothelial cells. J Biol Chem. 1995, 270: 15320-15326.

276. Zhang, S.C., Wernig, M., Duncan, I.D., Brustle, O., and Thomson, J.A. (2001). In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 1129-1133.

277. Zhao, C., Meng, A. Spl-like transcription factors are regulators of embryonic development in vertebrates. Dev Growth Differ. 2005, 47: 201-211.

278. Zhou, Y., Lim, K.C., Onodera, K. Rescue of the embryonic lethal hematopoietic defect reveals a critical role for GATA-2 in urogenital development. EMBO J. 1998, 17: 66896700.

279. Zhou, Y., Yamamoto, M., Engel, J.D. GATA2 is required for the generation of V2 interneurons. Development. 2000, 127: 3829-3838

280. Zindy, F., Eischen, C.M., Randle, D.H., Kamijo, T., Cleveland, J.L., Sherr, C.J., and Roussel, M.F. (1998). Myc signaling via the ARF tumor suppressor regulates p53-dependent apoptosis and immortalization. Genes Dev. 12, 2424-2433.

281. Zvetkova, I., Apedaile, A., Ramsahoye, B., Mermoud, J.E., Crompton, L.A., John, R., Feil, R., Brockdorff, N. Global hypomethylation of the genome in XX embryonic stem cells. Nat Genet. 2005, 37: 1274-1279.

Информация о работе

Лагарькова, Мария Андреевна
доктора биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.02.07

Диссертация

Молекулярная характеристика и генетические особенности плюрипотентных клеток человека и их производных - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы