Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярная физиология мембранного пищеварения и его регуляция

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярная физиология мембранного пищеварения и его регуляция"

,/КЬ

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ ИМ.И.П.ПАВЛОВА

на правах рукописи

ЕГОРОВА ВЕРА ВАСИЛЬЕВНА

удк 612.332

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ФИЗИОЛОГИЯ МЕМБРАННОГО ПИЩЕВАРЕНИЯ И ЕГО РЕГУЛЯЦИЯ

специальность - 03.00.13 - физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

ЛЕНИНГРАД 1990

Работа выполнена я лаборатории физиологии питания Института физиологии им.И.П.Павлова АН СССР

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Ы.Н.МАСЛОВА доктор биологических наук А.Я.ОЗОЛС доктор медицинских наук А.А.5ШАРЕГ0В

Ведущее учреждение - Ленинградский Государственный Университет.

Защита диссертации состоится " " 1990 г.

в часов на заседании специализированного совета по за-

щите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д 002. 36.01) при Институте физиологии им.И.П.Павлова АН СССР (199034, Ленинград, наб.Макарова, 6).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии им.И.П.Павлова АН СССР.

Автореферат разослан " " 1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

Н.Ы.ВАВИЛОВА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблем. Исследование мембранного пищеварения, осуществляющего промежуточные и заключительные стадии гидролиза пищевых веществ, продолжает оставаться одним из наиболее актуальных и важных направлений распития современной гастроэнтерологии. Мембранное пищеварение занимает особое положение в системе гидролитических и транспортных процессов с топкой киике, будучи акцепторнш по отнопению к полостному пшеварению и донорным по отношению к всасыванию. Открытие и изучение мембранного пищеварения (обзоры: Уголев, I960, 1961, 1963, 1967, 1972, 1985; Тимофеева, 1977; Иезуитова, 1979; Валенкевич, 1981; Смирнов, Уголев, 198I; Кулак, 1983; Щербаков, 1934; Уголев, Иезуитова, 1985; Мембранный гидролиз и транспорт, 1986; íSembra-ne Digestion. Hew Facts and Concepta , 1989 и др.) позволило приблизиться к пониманию базисных сторон работы пищеварительного аппарата высших животных и человека. Было показано, что мембранное пищеварение обеспечивает высокие скорости переваривания цутриентов в организме, которые невозможно воспроизвести в условиях m vitro , а также эффективное сопряжение пищеварительных и транспортных процессов. Оно осуществляется на внешней поверхности энтероцитов за счет ферментов двоякого происхождения: адсорбированных из полости кишки (преи.чущественно панкреатических) и собственно кишечных, .синтезированных в энтероците и встроенных в его апикальную мембрану.

В течение последних лет интенсивно изучается структура и функция ферментов мембран щеточной каймы энтероцитов, нефроци-тов и клеток некоторых других органов (обзоры: Kenny, Maroux, 1982; Brush border membrane, 1983; Уголев, 1985; Molecular and cellular baaia of digestión, 1986; Semenza, 1966; А1регз, 1987).

Эти исследования широко проводятся представителями различных наук - биохимиками, физиологами, морфологами и, в особенности, патологами. Разработка этой проблемы необходима не только для понимания процессов ассимиляции пици в нормальных условиях, ко и для интерпретации многих распространенных заболеваний. -Важнейшей стороной проводимых исследований является выяснение механизма мембранного пищеварения на молекулярном уровне.

В результате был достигнут значительный прогресс в определении молекулярной структуры кишечных и почечных гидролаз некоторых видов кивотных. В частности, была определена их амфифиль-ная структура (т.е. было показано, что они состоят из гидрофильной и гидрофобной субъединиц), молекулярная масса, число и молекулярная масса отдельных субъединиц, в ряде случаев - аминокислотная последовательность якорного участка, соединяющего ферменты с мембраной щеточкой каймы. В значительно меньшей степени изучена та сторона физиологии мембранного пищеварения, в задачу которой входит выяснение функций мембранных ферментов в целом, а также функций отдельных субъединиц, их взаимодействия и регуляции. Проблемам молекулярной физиологии мембранного пищеварения были посвящены усилия Лаборатории физиологии питания в течение целого ряда лет.

Цель и задачи исследования. Данная работа концентрируется на изучении молекулярной физиологии некоторых типичных гидролаз, осуществляющих мембранное пищеварение у кивотных различных видов, в том числе - далеко отстоящих друт от друга на эволюционной лестнице.

До настоящего времени считалось, что гидрофильная часть мембранных гидролаз выполняет каталитическую функцию, а гидрофобная, пронизывающая липопротеиновую мембрану и выходящая в ци-

топлазму, - якорную (обзор: Hören et al., 1985). Однако в работах Лаборатории физиологии питания, а также в работах проф. Х.Хашена, проф. Г.Ю.Хюгтера и их группы (Галле, ГДР) были получены факты, свидетельствувдие о существовании значительно более сложных взаимоотношений различных субъедшиц в олигомерной молекуле фермента. В настоящей работе эта проблема была подвергнута детальной проверке.

Для выяснения функциональной роли частей сложной молекулы амфипатичеекчх ферментов в работе были поставлены следующие задачи: I) выделить и очистить в детергентной (включающей гидрофильную и гидрофобную части) и протеазной (лишенной гидрофоб-i

ной части) формах некоторые гидролазы щеточной каймы энтероци-тов у различных видов животных; 2) сопоставить молекулярные и кинетические характеристики, а также регуляторные свойства этих ферментов в детергентной и протеазной формах, а также ферментов, находящихся в составе клеточных структур; 3) установить роль отдельных компонентов фермент-мембранных комплексов, в том числе гидрофобной части, в регуляции активности пищеварительных ферментов с целью проследить стабильность свойств гидрофобной и гидрофильной частей амфипатичееккх ферментов у животных, находящихся на разных уровнях эволюционного развития.

Теоретическая значимость и научная новизна. В работе подвергнуты существенному пересмотру взгляды на функции отдельных частей молекулы собственно кишечных ферментов энтероцитов. Исследования были проведены с использованием высокоочищенных ферментных препаратов. Полученные данные сопоставлялись со свойствами ферментов, находящихся в составе клеточных структур. Чтобы иметь возможность проследить стабильность свойств различных частей амфипатических ферментов, впервые было проведено комплексное сравнительно-физиологическое исследование ряда собственно

кишечных гидролаз у животных с различным трпом питания, а также находящихся на разных уровнях эволюционного развития. При анализе полученных в работе данных оказалось, уто гидрофильная часть фермента имеет не только каталитические центры, но и регуляторные, не одинаковые у разных видов животных. Принципиально новым является обнаружение полифункциональной природы гидрофобной части. При сопоставлении свойств детергентной и про-теазной форм ферментов тонкой кишки крыс, кроликов, собак, коров и кишечника форели впервые удалось показать помимо известной якорной, другие важные функции гидрофобной части. Было обнаружено, что гидрофобная часть влияет на кинетические характеристики ферментов, модифицируя их свойства в том же направлении, что и мембрана энтероцига. Эти данные позволили заключить, что гидрофобная часть участвует в поддержании оптимальной конформа-ции фермента и стабилизации его структуры. Важно подчеркнуть, что во многих случаях прослеживается, связь видовых различий во влиянии гидрофобного участка на кинетические характеристики ферментов с адаптивными процессами.

При исследовании влияния целого ряда модификаторов на активность детергентной и протеазной форм ферментов различных видов животных было показано, что гидрофобная часть выполняет ре-гуляторные функции. Установлено, что некоторые регуляторные свойства, обусловленные ее присутствием, являются видоспецифи-ческими, другие, напротив, характерны для всех изученных ферментов. Особенности регуляторных свойств мембранных ферментов в значительной мере определяют функциональную организацию и саморегуляцию естественного полисубстратного пищеварения у различных животных.

Впервые сопоставлялись регуляторные свойства гидролаз тон-

кой и толстой кишки в онтогенезе у ряда животных с разным типом питания. Обнаружены особенности регуляции жтивности ферментов в толстой кишке.

Данные об неидентичности регуляторных свойств мембранных ферментов вместе о предшествующими наблюдениями, полученными в Лаборатории физиологии питания, являются серьезным основанием для заключения о том, что регуляция на уровне активности -один из наиболее фундаментальных механизмов приспособления. По-видимому, ферменты разных видов животных могут различаться как по регуляторным свойствам, так и по свойствам гидрофобного участка. Такие якорные и регуляторные "изотипы" также следует рассматривать как один из способов приспособления к изменению условий функционирования.

Полученные данные позволяют заключить,- что амфипатический фермент, включенный в мембрану энтероцита, имеет три участка, подвергающихся регуляторным воздействиям: I) гидрофильную головку фермента, 2) внутримембранный гидрофобный пептид, 3) участок гидрофобной части, выступающий на цитоплазматическую сторону апикальной мембраны.

Практическое значение. Для понимания закономерностей ассимиляции пили у человека в норме и при различных формах патологии важное значение имеет углубленный анализ локализации регуляторных центров ферментных систем апикальной мембраны энте-роцитов, так как определение регуляторных свойств пищеварительных ферментов в ряде случаев позволяет проводить более раннюю диагностику некоторых форм патологии. В частности, в Московском областном научно-исследовательском клиническом институте им. М.Ф.Владимирского используется метод ранней диагностики энтерита и энтероколита по изменению регуляторных характеристик фер-

ментов, осуществляющих мембранное пищеварение, разработанный на основании исследований, проведенных в Лаборатории физиологии питания.

За работу "Вариабельность интегральных мембранных ферментов" была присуждена премия Университета им.Мартина Лютера (ГДР), а данные используются в лекционных курсах этого Университета.

Полученные в экспериментальном исследовании результаты использованы при разработке метода профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний молодняка крупного рогатого скота.

Полученные в работе данные использованы при написании глав в ряде монографий: А.М.Уголев: "Эволюция пищеварения и принципы эволюции функций. Элементы современного функционализма" (Л.: Наука, 1985); "Мембранный гидролиз и транспорт. Новые данные и гипотезы" (Л.: Наука, 1986); "Membrane Digestion. New Pacts end Concepts" (M.: mir, 1989); "Адаптационно-компенсаторные процессы на примере мембранного гидролиза и транспорта" (Л.: Наука, в печати).

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на 1-ом билатеральном советско-чехословацком симпозиуме "Пищеварительные ферменты" (Ужгород, 1976), Всесоюзном симпозиуме "Теоретические и прикладные аспекты мембранного пищеварения" (Рига, 1978); Всесоюзной конференции по экологической физиологии и биохимии рыб (Астрахань, 1979; Севастополь, 1982); ХП конгрессе биохимического общества ГДР (Галле, 1979); Всесоюзных совещаниях, посвященных памяти академика Л.А.Орбели (Ленинград, 1982, 1986); симпозиуме "Кишечное пищеварение" (Лейпциг, 1985); Х1У Всесоюзной конференции по физиологии пищеварения и всасывания (Терно-поль, 1985), семинарах Института питания АН ГДР (Потсдам, 1981)' и Института клинической биохимии Университета им.М.Лютера (Галле, ГДР, 1984, 1987); заседании Отдела физиологии висцеральных

систем Института физиологии им.И.П.Павлова АН СССР (Л., 1986); 7-й билатеральной (Бельгия - ГДР) медицинской неделе "Проблемы в гастроэнтерологии" (Брюссель, 1988).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав с описанием результатов экспериментов, общего заключения, выводов, указателя литературы, рисунков (47) и таблиц (30). По теме диссертации опубликовано 39 работ, из них 5 - главы в монографиях.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Опыты были поставлены на крысах Вистар, кроликах, колючих мышах (акомисах), телятах разного возраста. Определялась активность сахаразы (К& 3.2.1.48), мяльтазы (3.2.1.20), лактазы (К® 3.2.1.23), щелочной фосфатазы (К5 3.1.3.1) и аминопептидазы (КФ 3.4.II.2) в гомогенатах слизистой оболочки (у взрослых) или ткани (у однодневных) двенадцатиперстной, тощей, подвздошной и толстой кишки. Гомогенаты готовились на растворе Рингера (рН 7.4). Активность щелочной фосфатазы определялась по приросту п-нитрофенола с использованием 0.6 мМ раствора п-нитрофенилфос-фата натрия, аминопептидазы - по приросту -нафтиламина (Рагг et а1., 1968), сахаразы - мышьяково-молибденовым (Уголев, Иезу-итова, 1969), мальтазы и лактазы - глюкозооксидазным методом (ПаМ^т^в!;, 1964), белок ч по методу Лоури (Ьоигу et а1., 1951). ферментативная активность выражалась в микромолях образующихся продуктов гидролиза за I мин в расчете на грамм влажной массы ткани, а также в процентах к максимальной активности, принятой за 100. Данные обработаны статистически по методу Стьюдента и

Фишера.

Для исследования молекулярных характеристик некоторые из указанных ферментов были выделены из тонкой кишки крыс,, собак, кроликов, коров и форелей в детергентной и протеазной формах.

После забоя животных тонкую кишку немедленно извлекали из брюшной полости, промывали холодным раствором Рингера, после чего соскабливали слизистую, которую сразу же замораживали при температуре -70°С в специальных устройствах. Была объединена слизистая тонкой кишки 6 собак, 20 кроликов, 100 крыс, 4 коров, а также слизистая кишки 30 форелей. Очистка ферментных препаратов проводилась по методу Хюттера и др. (Hutter et al., 1982) с модификациями.

Для выделения протеазной формы ферментов использовали осадок, полученный после центрифугирования гомогената (разведение 1:5) при 105 000 g. Активность осадка после его инкубации с трипсином (40 мг/100 мл) и тритоном {!%) в течение 2 ч при 37°С. на 90% переходила в супернатант после центрифугирования (105 000 g , 90 мин). После обработки супернатанта Li2S04 ^ и центрифугирования при 12 000 g в течение 20 мин активность оставалась в супернатанте. Последующая хромотография диализирован-ного препарата на ДЕАЕ-сефадексе с линейно возрастающим градиентом KaCl (I М) и проведенная дважды хроматография на сефадексе G -200 приводила к обогащению ферментных препаратов.

Для получения детергентной формы ферментов ресуспензирован-ный осадок (после центрифугирования гомогената при 105 000 g) обрабатывали тритоном Х-100 (1%) в точение 16-18 ч при 4°С и слабом помешивании в присутствии ингибитора трипсина - контри-кала (500 ер/т). После центрифугирования (105 000 g) в течение 60 мин активность ферментов на 80-90% переходила в супернатант.

Избыток тритона удаляли путем осаждения (ш4)2304 с небольшой степенью насыщения (0.15). Осаждение аминопептидаэы проводили (Ш+)2304 (0.60), щелочной фосфатаэы - (¡Ш4)2304 ( 0.45).

После диализа ферментные'препараты наносили на колонки с сефарозой 4В. Вся процедура очистки аминопептидаэы проводилась С использованием трис-НС1-буфера (рН 7,0), для щелочной фосфа-тазы использовался тот же буфер, но с рН 8.5 и с добавлением Мг2+ (1 мМ) и гп2+ (0.1 мМ) (Со1Ъеаи, Магоих, 1978).

Для осаждения карбогидраз использовали не соли, а этанол (96°). В большинстве случаев детергентные формы ферментов были получены после удаления тритона Х-100 на заключительных стадиях, что приводило к их агрегированию. Для сравнения была получена неагрегированная детергентная форма аминопепти азы и щелочной фосфатазы кроликов (в присутствии тритона Х-100 до конца очистки).

Для характеристики ферментных препаратов определяли: константу Михаэлиса (Кга) и максимальную скорость гидролиза (V ); зависимость скорости реакции от рН и температуры (определение Еакт ); поведение ферментных препаратов при гель-электрофорезе; молекулярную массу (ММ).

Были изучены также регуляторные свойства различных форм

ферментов. В качестве модификаторов использовались вещества,

входящие в состав пищя и, каг было показано ранее (Уголев и др.,

1975), влияющие на активность некоторых кишечных гидролаз крыс

- трибутирин (0.4%), глицил-1 -лейцин (4.9 нМ), эквичолярная

смесь глицина и лейцина, фенилаланин (2 и 20 мМ); а такте ЭДГА

(I или 5 мМ) - ингибитор металлоферчентов; активатор аминопеп-2+

тидазы - (I мЮ; !ЗН-реагенты - гцутатион (I мМ), дитио-трейтол (I мМ) и цистеин (I мМ).

Молекулярные массы ферментов определялись посредством хроматографии на сефадексе G-200 или сефарозе 4В. В качестве калибровочных белков использовали цитохром С (Ш 12900), альбумин из человеческой сыворотки (ММ 69000), лейцинаминопелтидазу (ММ 326000). Для определения свободного объема колонки использовался синий декстран.

Электрофорез был выполнен в 7.5$ полиакриламидном геле (ПАГ). Использовался трис-глициновый буфер (0.025/0.02 М, pH 8.3), Rf вычислялся с использованием бромфенолового голубого в качестве свидетеля.

к ,у, Еакт , а также изменения.энтальпии и энтропии рассчитывались с использованием ЭВМ (М 4030) в Математическом центре Института физиологии им.И.П.Павлова АН СССР.

/

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Активность кишечных гидролаз в онтогенезе у различных животных

Важная роль мембранного пищеварения в ассимиляции нутриен-тов продемонстрирована для самых различных групп организмов от бактерий до человека (обзоры: Уголев, 1972, 1985; Кушак, 1983; Кузьмина, 1986; Мембранный гидролиз и транспорт, 1986). У млекопитающих некоторые из ферментов, осуществляющих мембранное пищеварение, обнаруживается уже в раннем онтогенезе (обзоры: Kol Дотику, 1969; Уголев и др., 1979; Henning, I98I, 1935, 1987). Однако, несмотря на многочисленные работм, посвященные изучению активности и свойств пищеварительных гидролаз, до сих пор не существует полной картины их видовых особенностей и распределения в различных отделах желудочно-кишечного тракта.

В работе исследовалась активность лаятаэы, сахаразы, маль-

тазы, щелочной фосфатазы, вминопептидазы в двенадцатиперстной, тощей, подвздошной и толстой кишке у различных животных в раннем постнатальном онтогенезе, в также - у взрослых и старых. Кроме того,,определялись регуляторные свойства лактазы и щелочной фосфатазы тонкой и толстой кишки у крыс и телят разного возраста, а также аминопептидазы - у взрослых собак. Выбор животных для исследования связан с тем, что они различаются по типу питания: крысы и акомисы - всеядные, а кролики и телята (коровы' - растительноядные. Хотя крысы и акомисы по типу питания относятся к одной группе, первые являются незрелорождающимися (Henning, 1985), а вторые - зрелорождащимися (Jones, 1984). Животные разных возрастов были использованы в связи с тем, что у млекопитающих в раннем онтогенезе основная пища - молоко и, следовательно, их пищевой рацион резко отличается от пищевого рациона взрослых животных. Следует отметить, что активность пищеварительных ферментов у акомисов определена впервые. "

В табл.1 представлены данные по распределению активности двух ферментов - щелочной фосфатазы и аминопептидаэы - в различных отделах кишечной трубки у однодневных и взрослых животных. Как можно видеть, активность пищеварительных ферментов и ее распределение по длине кишки у животных разных видов существенно различаются. Наиболее высокий уровень щелочной фосфатазы наблюдается у взрослых крыс и телят в двенадцатиперстной кишке, наименьший - у кроликов. У взрослых крыс, акомисов и телят наблюдается резкий проксимо-дистальный градиент распределения активности этого фермента вдоль килки, у кроликов - равномерное ее распределение.

Хорошо известно, что с возрастом уровень и распределение ферментативных активностей в различных отделах желудочно-кишеч-

Распределение активности ферментов вдоль кишки у взрослых (В) и новорожденных (Ш животных

Зерманты Щел.очн в я Фц,?. ..С-Ф А_ т а з а__А м и .н о п е п т и д а з а

___у ч а с т к и к и я к к___

Животные двенадцати-пердсная тощая подвздошная толстая двенадцати-пе£стная тощая подвздошная толстая

Крысы В 22.2-1.6 (100) 11.7-2,1 (52) 2.3*0.3 (10) 0.5*0.06 (2) 1.4*0.1 (40) 3.5*0.1 3.0*0.4 (100) (86) 1.1*0.1 (31)

п = 6 Н 14.1-2.2 (70) 16.3*2.2 20.2*2.7 (80) (100) 2.4*0.6 (12) 4.5*0.6 (70) 6.5*0.3 6.2*0.2 (100) (95) 1.3*0.1 (20)

Акомисы В 8.8*1.2 (100) 4.5*0.8 (51) 3.0*0.6 ■ (34) 0.7*0.2 (8) 6.7*1.4 (33) 20.3*3.3 16.9*3.3 (100) (84) 3.2*0.7 (1б5

И и 6 н 9.6*3.0 (100) 7.9*2.0 (82) 3.9*0.9 (41) 0.4*0.01 (4) 8.1*2.3 (48) 16.9*4.4 16.9*4.3 (100) (100) 3.5*1.0 (21)

Кролики в 1.4*0.5 (75) 1.8*0.6 (92) 1.9*0.4 (100) 1.0*0.3 (53) 4.6*1.1 (42) 8.4*2.0 10.8*2.6 (78) (100) 4.3*1.0 (40)

п» 4 н 2.7*0.04 (65) 4.2*1.1 {100) 1.9*0.2 (46) 0.2*0.04 (5) 3.0*0.4 (22) 6.9*2.1 13.7*2.0 (64) (1005 3.0*0.2 (22)

Телята в 18.6 (100) 7.8 (43) 1.8 (9) 'А б'!юо) 5,2 ч 4.9 (82) (79) 4.1 (66)

о« 2 н 12.1 (100) 8.3 (69) 4.5 (37) 0.8 (66) - - -

Примечание: ферментативная активность выражена в шмслях-мшТ^-г""-1, цифры в скобках -ферментативная активность в % от максимальной.

ного тракта существенно меняется (обзоры: Henning, 1985, 1987; Kretchraer, 1985; Molecular and cellular basis of digestion, 1986). У крыс при матурации организма можно наблюдать инверсию проксимо-дистпльного градиента распределения активности щелочной фосфатазы вдоль кишки. Если у однодневных крысят ее максимум приходится на подвздошную кишку, то у взрослых животных максимальная активность наблюдается в двенадцатиперстной кишке. Смещение максимума активности у крысят в дистальном направлении связано, по-видимому, с тем, что их пища обогащена жирами, которые снижают активность щелочной фосфатазы в тонкой кишке (Уголев, 1972). В опытах по влиянию различных диет на распределение ферментативной активности в тонкой кишке у крыс мы наблюдали, что при жировой диете снижается активность щелочной фосфатазы в проксимальных участках и увеличивается в дистальных.

Очень важно подчеркнуть, что в толстой кишке определяется значительная активность этого фермента {12% от максимальной). Мы предположили,что унезрелорождающихся млекопитающих толстая кишка в раннем онтогенезе может участвовать в пищеварительном процессе (Егорова, Уголев, 1985; Егорова я др., 1988).

В отличие от крыс, акомисы являются зрелорождающимися (Jonas, 1984). По-видимому, именно это является причиной того, что уровень и распределение активности щелочной фосфатазы в различных отделах кишки у однодневных и взрослых акомисов практически одинаковы.

У телят и кроликов эти характеристики с возрастом меняются также незначительно. Однако уровень активности у однодневных. ; кроликов в передних отделах кишки примерно в два раза выше, чем . у взрослых. Это, по-видимому, связано с изменением типа питания.'

При сопоставлении уровня и распределения активности амино-пептидазы здоль кипки у однодневных и взрослых животных разных

видов мы не обнаружили отоль больших различий, как в случае щелочной фосфатаэы. У всех исследованных видов ее распределение вдоль кишки с возрастом меняется мало. Обращает на себя внимание высокая пептидаэная активность толстой кишки не только у молодых, но и у взрослых животных; в частности, у взрослых собак она составляет около 40% от максимальной. Наибольшая активность этого фермента отмечается у акомисов, наименьшая - у крыс.

Полученные нами данные о распределении лактвзной активности в различных отделах желудочно-кишечного тракта- у крыс согласуются о данными многих авторов о ее репрессии в процессе онтогенеза (обзор: Нетипа, 1987). Лактаэная активность определяется уже у эмбрионов не 21-й день внутриутробного развития, составляя 70% от активности фермента у однодневных крысят. Наиболее высока активность лактазы у однодневных крысят в двенадцатиперстной и тощей кишке. Однако уже у б- и Ю-дневных крысят она несколько снижается. У взрослых крыс наблюдается резкое снижение лактазной активности. Ее активность в толстой кишка составляет у однодневных крысят 10% и более от максимальной активности в тонкой кишке, у взрослых она отсутствует.

Сахаразная активность в кишке эмбрионов очень низка, однако она составляет примерно 10$ от активности у взрослых крыс, в то же время у однодневных крысят ее практически нет. Известно, что сахаразная активность появляется в кишечнике крыс при переходе на дефинитивное питание (1)ое11, Кге1;сЬтег, 1964). Распределение сахарозной активности вдоль кишки носит равномерный характер. Максимальная ее активность наблюдается в тощей кишко, п толстой нише'у взрослых животных она практически отсутствует.

Ичльтвэная активность появляется уже у эмбрионов, составляя примерно 50$ ог уровня активности фермента у однодневных крысят.

У последних обнаружена достаточно высокая активность мальтаэы в толстой коте (около 20% от максимальной). У взрослых животных происходит увеличение мальтазной активности и изменение ее распределения вдоль тонкой кишки по сравнению с крысятами. В толстой кишке у взрослых крыс мальтаэы мало. У однодневных акомисов, как и у крысят, наиболее высокая лактазная активность наблюдается в двенадцатиперстной - тощей кишке, однако ее уровень у крысят выше. В толстой кишке лактазная активность у акомисов практически отсутствует. У взрослых животных она снижается в еще большей степени, чем у крыс.

Активность дефинитивных карбогидраэ у акомисов, как и у крыс, возрастает в процессе матурации организма, но в более ранние сроки. Так, у тринадцатидневных мыпат активность: мальтаэы и сахаразы достигает уровня, характерного для взрослых животных. У мышат, как и у крысят, значительная ферментативная активность наблюдается в толстой кишке, которая в отличие от крыс, сохраняется у взрослых акомисов (сахаразы - мальтаэы - 17% от максимальной).

Активность лактазы максимальна у однодневных крольчат. Ее снижение в ходе онтогенеза происходит более медленно, чем у крысят. У взрослых кроликов лактазная активность не обнаружена. В толстой кишке она практически отсутствует у кроликов всех возрастов.

Изменение активности сахаразы, типичного "дефинитивного" фермента, у кроликов очень напоминает характер изменения активности этого фермента в онтогенезе у крыс. Следует подчеркнуть, что уровень сахаразной активности у взрослых кроликов вше, чем у взрослых крыс. Она обнаруживается и в толстой кишке. Это вполне объяснимо, поскольку кролики являются всеядными. И доля саха-

ров в их корме еще вше, чем у крыс.

Как и у крысят, ыальтазная активность у крольчат появляется сразу после рождения. Уровень активности этого фермента в различных отделах тонкой кишки в 3-4 раза ниже у кроликов всех возрастов, чем у крыс.

Сахаразная активность у телят и взрослых коров практически отсутствует (Щербаков, 1984). Это связано с тем, что расщепление сахаридов у этих животных происходит в рубце. Как у всех млекопитающих, активность лактазы наиболее высока у новорожденных животных. Она снижается у телят в возрасте 20-25 дней почти в 5 раз. Активность фермента в толстой кишке в этом возрасте незначительна. У взрослых коров лактазная активность практически отсутствует. Уровень активности мальтазы гораздо ниже в кишечнике телят, чем рассмотренных ранее видов животных - крыс, акомисов и кроликов.

Регуляторные свойства кишечных гидролаэ в онтогенезе

Значительные видовые, возрастные, органные особенности были обнаружены в регуляторных свойствах щелочной фосфатазы.и лактазы в тонкой и толстой кишке у крыс и телят. Действительно, если у взрослых крыс трибутирин тормозит активность щелочной фосфатазы тонкой кишки (на 75.1+0.8%), то на ее активность в тонкой кишке телят трибутирин влияет мало (рис.1). В то же время он в одинаковой степени стимулирует активность лактазы в тонкой кишке (в Т.5-2 раза) как у крыс, так и у телят. В толстой кишке трибутирин не тормозит активность щелочной фосфатазы взрослых крыс и теллт. У крыс наблюдается примерно одинаковая стимуляция активности лактазы трибутирином и в тонкой, и в тол-

стой кишке. Отметим, что у телят ее уровень в тонкой кишке значительно выше, чем в толстой.

У телят мы не наблюдали возрастных различий в регулятор-ных свойствах ферментов, в то же время у крыс в тонкой кишке уровень торможения активности щелочной фосфатазы трибутирином с возрастом увеличивается, а в толстой кишке.торможение (на

28.9+7.5%) наблюдается только у однодневных крысят (рис.1). %

100

50

-А

—ЙЯ

КРЫСЫ

Рис.1. Влияние трибутирина на активность щелочной фосфатазы тонкой и толстой кишки у 1-дневных (I) и взрослых (2) крыс и телят.

По вертикали - активность в % к активности в отсутствии трибутирина, принятой за 100. Светлые столбики - тонкая кишка; заштрихованные столбики -толстая кишка.

I

Лактазная активность стимулируется трибутирином в тонкой кишке крыс рапного возраста примерно одинаково. В толстой кишке уровень ее стимуляции у взрослых крыс значительно (~в 3 раза) ниже, чем у крысят. Это связано, вероятно, с тем, что у молодых животных уровень активности ряда ферментов, в том числе лактазы и щелочной фосфатаэы, в толстой кишке значительно вше, чем у взрослых, и значительнее их роль в переваривании богатой жирами пищи.

Следовательно, в некоторых случаях смена типа питания, в частности при переходе от молочного питания к дефинитивному, сопровождается изменением как активности, гак и регуляторных свойств. По-видимому, в естественных условиях именно регуляция на уровне активности является одним из наиболее существенных механизмов в процессе адаптации организма к условиям функционирования. К сожалению, он не обсуждается даже в специальных монографиях (Обзор: Хочачка, Сомеро, 1908).

Видовые различия в уровне активности и регуляторных свойствах пищеварительных гидролаэ мы попытались объяснить на основании результатов исследования роли отдельных компонентов фермент-мембранных комплексов, в том числе гидрофобной части, в регуляции их активности. С этой целью сопоставлялись свойства ферментов, выделенных в детергентной и протеазной формах.

Характеристика детергентной и протеазной форм ферментов,

осуществляющих мембранное пищеварение в тонкой кишке крыс

При сопоставлении кинетических характеристик и регуляторных свойств детергентной (д-) и протеазной (п-) форм щелочной фосфатаэи, сахаразы и , ¡("-амилазы, выделенных из тонкой кишки крыс и частично очищенных, нам удалось обнаружить, что, помимо

якорной, и, возможно, транспортной, гидрофобная часть этих ферментов выполняет и другие важные функции.

Ка и У . Обнаружены различия в кинетических характеристиках между детергектной и протеазной формами ^-амилазы и саха-разы (табл.2). V дегергентной формы сахаразы вьпге, чем протеазной, Кщ - ниже, т.е. сродство фермента к субстрату вьте. Для д-формы ^-амилазы к^ также ниже, чем для п-формы. Активность детергентной формы при низких концентрациях субстрата вьше, а при высоких - ниже, чем для протеазной.

Таким образом, переход детергентной формы фермента в про-теазную, иными словами - удаление гидрофобной части фермента, приводит к изменению его кинетических характеристик. По-видимому, гидрофобный участок существенен рдк поддержания оптимальной конформации каталитической (гидрофильной) части фермента.

Ранее было показано (Уголев, Колтушкина, 1975), что комп-лексирование п-формы сахаразы с липосомами, т.е. связывание фермента с бислойной мембраной, приводит к снижению % и увеличению V . Для ^-амилазы в тех же условиях показано снижение Кщ при незначительном изменении V .

Следовательно, изменения кинетических характеристик аналогичны при связывании протеазной формы карбогидраз с гидрофобной частью и с фоефолипидным бислоем.

рН-зазисимопть. При исследовании рН-зависимости сахаразы было отмечено, что для п-формы зона высокой активности уже, чем, для д-формы. Ранее (Уголев, Колтушкина, 1975) при исследовании,' влияния комплексирования п-формы ряда карбогидраз (сахаразы, ■ ^-амилазы ч мзльтаз) с лецитиновыми липосомами на их рН-функ-ит такие было обнаружено, что для фермент-лецитиновьгх комплексов зона высокой активности гораздо шире, чем для изолированных

Кинетические характеристики различных форм сахаразы и ¿{-амилазы тонкой кишки у крыс

Фермент Детергентная форма Г.ротеазная форма

К,л (м1.1) V (ыМ/мин) Km (мМ) V (мМ/мин)

Сахароза 8.72 0.32+0.02 13.78 0.27+0.02

/-амилаза 4.85 0.89+0.14 14.4 1.09+0.41

ферментов, и связанные с фосфолипидами карбогидразы более устойчивы к кислотной и щелочной денатурации. Эти данные хорошо согласуются с наблюдениями других исследователей, показавших стабилизацию активности ферментов в присутствии лигандов и при сорбции ферментов на искусственных или естественных мембранах (Chuchrai, 1987).

Регуляторные свойства. В табл.3 представлены данные по влиянию модификаторов (трибутирина и фенилаланина) на активность детергентной и протеазной форм щелочной фосфагазы. Модификаторы вызывали достоверное (Р <( 0.05) торможение активности д-формы фермента. Ранее (Егорова, 1972) торможение активности щелочной фосфагазы этими модификаторами наблюдалось при исследовании го-могенатов слизистой оболочки тонкой кишки крыс, а также солюби-лизированного тритоном X-I0Û, но неочищенного фермента, т.е. в тех случаях, когда фермент сохранял свою амфипатическую структуру. Напротив, активность протеазной формы фермента достоверно не изменяется в присутствии трибутирина и 2 мМ фенилаланина. В присутствии 20 мМ фенилаланина уровень торможения активности протеазной формы фермента (27$) достоверно меньше, чем для детергентной (37%).

Активность щелочной фосфагазы (мкмаль-мтГ^.мг-* белка! тонкой кишки крыс в присутствии модификаторов (трибутирина и фенилаланина)

Форпа модифика- Трибутирин Эеьилаланин

фермента контроль) ¡Лм 20 Ш

Детергентная 1.04+0.09 0.75+0.06 0.34+0.01 0.64+0.07

Протеазная 1.24+0.02 1.26+0.09 1.17+0.03 0.99+0.06

Аналогичные результаты были получены при исследовании ре-гуляторных свойств /-амилазы. Так, торможение ^-амилазы го-могенатов слизистой оболочки тонкой кишки трибутирином составляло 50%, после солюбилизации тритоном Х-100 оно уменьшалось незначительно. В то же время для л-формы '¡('-амилазы характерно отсутствие модификаторного эффекта. Солюбилизация трипсином (без последующей очистки) также приводила к потере чувствительности ^-амилазы к трибугирину.

Таким образом, изучение регуляторных свойств щеточнокаем-ных гидролаэ показало, что модификаторы влияют на активность ферментов гомогената слизистой оболочки и солюбилизированных тритоном Х-100, а также на активность детергентной формы ферментов. Напротив, как солюбилизированный трипсином или папаи-ном фермент, так и протеазная форма фермента проявляют значительно меньшую чувствительность к действию модификаторов, а в ряде случаев полностью ее утрачивают. Следовательно, регулятор-ными свойствами обладает целый фермент, включающий гидрофильную и гидрофобную части. Удаление последний приводит к потере ферментом пегуляторных свойств.

Характеристика высокоочищенных детергентной и протеазной форм килечных ферментов млекопитающих и рыб

При исследовании частично очищенных препаратов детергентной и протеазной форм ряда ферментов тонкой кишки крыс нами продемонстрировано, что гидрофобный участок является важной частью в сложной структуре олигомерного фермента, выполняющей многие функции, а не только якорные. Б частности, он участвует в поддержании оптимальной конформации фермента, стабилизации его структуры и выполняет регуляторные функции. Естественно возникал вопрос, сохраняются ли эти функции у других видов животных и меняются ли они в процессе эволюции. Для решения этого вопроса были получены и подробно охарактеризованы высокоочищен-ные протеазная и детергентная формы аланинаминопептидазы и ще- ' лочной фосфатазы тонкой кишки млекопитающих с разным типом питания (собак, кроликов, коров) и кишки форели - представителя холоднокровных животных.

Как и при исследовании ферментов гонкой кишки крыс, для высокоочищенных кишечных ферментов у различных животных определялись Кщ иТ, зависимость активности от рН и температуры, Е0КТ , регуляторные свойства, а также поведение при электрофорезе в ПАГ, молекулярная масса, изменение энтальпии и энтропии. Некоторые из полученных результатов приведены в табл.4.

При определении ММ п-формы аминопептидазы было показано, что они идентичны (около 300 ООО) для всех исследованных животных от рыб до млекопитающих и близки к величинам, полученным другими исследователями (обзор: Кегшу, Магоих, 1982).

ММ п-формы щелочной фосфатазы собаки и коровы (ок. 160 ООО) также соответствуют данным литературы. ММ п-формы фермента форели значительно ниже, возможно, в данном случае была определена

ММ отдельных субъединиц.

В нашей работе очистка д-форм проводилась,в мягких условиях, т.е. в отсутствие детергента (тритона X-IOO1» на последних

стадиях. Были получены аномально высокие значений ММ, что сви-

( . "i

детельствовало об агрегации ферментов (табл.41. Агрегация не позволила такг.е оценить истинную степень очистки д-форм. Поэтому в специальной серии очистка ферментов кроликов в д-форме проводилась в присутствии тритона Х-100. Полученные неагрегиро-ванные детергентныэ формы имели ММ, близкие к ММ п-форм, что согласуется с данными литературы (Kenny, 1984}.

При сопоставлении различных свойств детергентной и проте-азной форм было показано, что влияние гидрофобной части фермента на гидрофильную является, по-видимому, общей закономерностью для этих двух ферментов у всех исследованных видов животных. Вместе с тем влияние гидрофобного домена варьирует как в отношении разноименных ферментов у одного вида животных, та* и в отношении одноименных ферментов у разных видов.

Кщ, V . Для аминопептидазы и щелочной фосфатазы всех исследованных животных наблюдалась кинетика Михаэлиса. Кинетические характеристики представлены в табл.4. Как можно видеть, эти характеристики различны для д- и п-форм обоих ферментов. При определении К,„ аминопептидазы наименьшие величины отмечались для п-формы по сравнению с д-формой, за исключением фермента коровы. Максимальная скорость реакции была выше для протеаэной формы у собак и кроликов. Отношение -jjj (мера эффективности превращения субстрата) было наибольшим для п-формы кролика и собаки. В случае форели и коровы эта величина была несколько выше для д-формы.

При сравнении д- и п-форм щелочной фосфатазы было обна-

Характеристики детергентной (д) и протеазной (п) форм аланинаминопептидазьг (ААЮ и щелочной фосфатазы (Щ5) тонкой кишки различных животных

Определяе- Собака Кролик Корова Форель

5ермент мый параметр Я п д п Д п Д п

ММ 2-3 млн 295000 2-3 млн (310000)х 280000 I млн 220000 I млн 310000

ААП Кш 0.05 0.021 0.017 ■о.он 0.030 0.060 0.100 0.035

У 942 1438 338 1082 26 18 1300 335

т/к^3 18.8 71.9 19.9 98.4 0.9 0.3 13 9.6

ММ 2-3 млн 160000 2-3 млн „ ,(120000)х 440000 2-3 млн 46000 90000 2-3 млн 46000

Кш 0.120 0.05 0.043 0.040 0.200 1.060 0.360 0.250

V 57 32 42 54 86 292 5.8 3.4

1П.103 470 640 980 1350 430 270 16 14

х) Цифры в скобках - для неагрегированной д-формы.

ружено следующее. У коровы Кт ниже для детергенгной формы фермента, у собаки и форели - для протеаэной, у кролика эти величины сравнимы. Наибольшая величина максимальной скорости наблюдалась для п-формы коровы. У остальных видов животных этот показатель для д-' и п-форм фермента различался незначительно. Отношение -Х- было наибольшим для п-формы кролика. У собак оно

к®

было танже выше для п-формы, у коров и форелей этот показатель для д- и п-форм различался незначительно.

рН-зависимости. При исследовании влияния рН на активнооть ферментов у различных видов животных мы не наблюдали значительных различий между д- и п-формами.

Неожиданным оказалось, что мембранносвязанная форма щелочной фосфатазы кроликов и собак характеризуется более уззой областью оптимальных значений рН, чем п- и д-формы, хотя наряду с понижением активнооти при рН 4-6 наблюдалось некоторое повышение резистентности в области щелочных значений рН. С другой стороны, для аминопептидазы собак было обнаружено существенное расширение зоны высокой активности для детергентной формы по сравнению с протеаэной. Кроме того, было показано, что в составе мембраны фермент характеризуется более высокой активностью в зоне физиологических значений рН, т.е. в интервале между 6.0 и 7.0. У кролика наблюдались сходные влияния мембраны и гидрофобной части на каталитическую активность этого фермента в зависимости от рН.

По-видимоцу, имеются существенные различия во влиянии мембраны и гидрофобной субъединицы на активность ферментов различных животных.

Еакт> Одна из очень интереоных проблем, имеющая большое биологическое значение, - это проблема температурных адаптации

/

ферментов. Обычно считается (ВгавИ:ив et а1., 1979, 1980), что адаптации к температуре достигаются за счет изменения состава фосфолипидного матрикса мембран, который варьирует от вида к виду. На графике Аррениуса для различных форм щелочной фосфа-тазы собаки для мембранной и детергентной форм наблюдался перегиб при температуре, соответствующей 42°С. В протеазной форме перегиба не было. На графике Аррениуса для аминопептидазы форели конформационный переход при температуре, соответствующей 37°С, также наблюдался в детергентной форме и отсутствовал в протеазной. Перегибы на кривых Аррениуса принято объяснять изменением энергии активации процесса и соответствующими кон-формационными переходами в молекуле фермента, которые зависят от текучести липидного матрикса мембран (Ъоагагй а1», 1985). Полученные данные свидетельствуют, по-видимому, о том, что конформационный переход определяется не только мембраной, но в ряде случаев и гидрофобной частью фермента; по-видимому, температурные адаптации достигаются не только под влиянием мембраны, но также зависят от свойств гидрофобного участка.

Регуляторные свойства. При исследовании регуляторных свойств ферментов с использованием высокоочищенных препаратов-детергентной и протеазной форм удалось показать существенные различия в действии модификаторов на активность щелочной фосфатазы (табл.5) и аминопептидазы (табл.6). Например, ЭДГА - общеизвестный ингибитор металлоферментов тормозит активность щелочной фосфатазы и не влияет в большинстве случаев на активность аминопептидазы.

Были обнаружены неожиданно большие видовые различия в действии ряда ферментов на активность этих ферментов. Так, ЭДГА тормозит активность аминопептидазы форели и не влияет на актив-

ность этого фермента у других животных. Многие различия э действиях эффекторов следует, по-видимоцу, объяснять неодинаковой природой их взаимодействия с молекулами ферментов у различных животных. Активирующий эффект иона на амииопептидаэу фо-

рели связан, вероятно, с его действием на активный центр фермента, так как в этом случае величины стимуляции для д- и п-

2+

форм одинаковы. С другой стороны, влияние Сона д-форму ами-нопептидазы собаки в 2 раза выпе, чем на п-форму. В этом случае возможен один из двух эффектов: либо гидрофобный участок модифицирует состояние активного центра таким образом, что увеличивается его сродство к эффектору, либо для д-формы эффекты, р.

вызываемые Со , суммируются.из его действия на активный центр и на гидрофобный участок.

В ряде случаев удалось показать различия в действии модификаторов на активность детергенгных форм ферментов у разных животных, которые исчезают в протеазной форме, т.е. после отсечения гидрофобного участка. Следовательно, эти различия скорее всего обусловлены присутствием гидрофобного участка. Так, три-бутирин значительно ингибирует активность детергентной формы щелочной фосфатазы кролика и не влияет на активность этой формы фермента коровы. В то же время регуляторнне свойства протеазной формы щелочной фосфатазы кролика и коровы практически не различаются. Различия в действии ЭИ-реагентов (глютатиона и дитиотрейола) на детергентную форцу аминопептидазы кролика и коровы весьма значительны. Они резко уменьшаются для протеаэных форм фермента у этих видов.

В табл.5 сопоставлены регуляторнне свойства д-формы щелочной фосфатазы кролика в различных формах: протеазной, мембранной, детергентной агрегированной и неагрегированной. Фенилала-

Влияние модификаторов на активность протеазной (п), детергентной (д) и мембранной (м) форм кишечной щелочной фосфатазы

^ Собака Кролик Корова Форель

п- Д- м- п- . д~ м- п- д- м- п- Д- м-

ЭДГА, 5 мМ 20х) 37 ZZ 18 23 __ (ЗЗ)** 21 22 24 23 - - 44

Трибутирин, 0.4% 98 92 96 105 64 (37) 23 101 101 86 104 90 76

L-фенилаланин, 2 мМ 82 99 90 98 92 77 98 99 98 94 85 106

L-фенилаланин, 20 мМ 33 42 47 59 55 57 63 60 66 50 65 108

Глицил-L -лейцин, 4.9 мМ 44 61 55 45 41 38 58 57 66 50 35 117

Глицил + лейцин, 4.9 мМ 72 83 94 84 72 74 85 82 90 79 80 95

. х) Эффекты выражены как активность в % к контролю (без модификатора), принято^ за 100.

хх) Цифры в скобках - для неагрегированной д-формы.

Влияние модификаторов на активность протеазной (п) и детергентной (д) форм кишечной аминопептидазы

Собака Кролик Корова Форель Модификатор -----------

п- д- п- д- п- д- п- д-

ЭДГА, X мМ 100х' 88 24 100 84 87 77 52

Со2+, I мМ 228 347 167 233 193 231 150 140

Глготатион, I кМ 52 85 98 70 92 138 91 98

Дитиотрейтсл, I мМ 76 103 61 84 86 227 103 106

Циотеин, I мМ 95 100 90 98 102 100 100 100

ь-фенилаланин, 2 мМ 88 87 90 66 57 63 69 69

Трибутирин, 0.4% 133 103 100 97 100 94 95 83

х) Эффекты выражены как активность в % к контролю (без модификаторов), принятому за -100.

нин и ЭДГА вызывают аналогичное действие но активность различных форм фермента. Вместе с тем, трибутирин тормозит активность неагрегированной д-формы в значительно большей степени, чем агрегированной. Эта величина близка к уровню тормокения трибути-рином активности мембранной щелочной фосфатазы кролика ( 10%). В отличие от д-формы, активность п-формы кишечной щелочной фосфатазы кролика не изменяется в присутствии трибутирина.

Таким образом, модификаторы, действующие на активный центр фермента или участки, близкие к нему (ЭДГА и фенилаланин), оказывают аналогичное действие на протеазные и детергентные как агрегированные, так и неагрегированные формы фермента. В то же время аллостерический ингибитор - трибутирин - оказывает влияние только на детергентные и мембранные Форш, что свидетельствует о локализации регуляторного центра этого модификатора в гидрофобном участке.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Известно, что наиболее быстро биохимическая адаптация происходит за счет изменения активности уже присутствующих в клетке ферментов (Хочачка, Сомеро, 1988). Регуляция пищеварительных процессов в естественных условиях наиболее быстро и эффективно осуществляется во многих случаях также путем изменения активности пищеварительных ферментов при изменении условий функционирования организма (Уголев, 1985; 1989; Уголев и др., 1986). В настоящей работе изменения активности пищеварительных ферментов наблюдались при изменении характера питания (например, при переходе от молочного питания к дефинитивному). Эти изменения были неоднозначными у животных разных видов, зрело- и незрелорождаицих-ся. Значительные видовые, онтогенетические^органные различия бы-

ли обнаружены также при исследовании регуляторных свойств пищеварительных, ферментов.

Результаты, полученные с использованием очищенных кишечных ферментов, впервые позволили продемонстрировать, что в регуляции их активности у различных видов животных вакцую роль играет гидрофобная часть, которая является структурой, но только выполняющей якорные функции, но и осуществляющей поддержание определенной конформации каталитически активной головки фермента.

Необходимо попытаться дать рациональные объяснения различиям каталитических свойств и регуляторных характеристик трех форм ферментов: мембранносвязанной, детергентной и протеазной. На рис.2 представлена схема строения кишечного фермента, на которой показаны различные участки, подвергающиеся регуляторным воздействиям. Если сравнить влияние различных модификаторов на активность мембранной, детергентной и протеазной форм ферментов можно обнаружить несколько разных типов взаимодействия. Например, глицил-1 -лейцин тормозит активность щелочной фосфата-эы тонкой киши у кроликов, собак и корон одинаково в мембранной, детергентной и протеазной формах (табл.5). По-видимому, воздействию подвергаются участки, расположенные в гидрофильной головке фермента, так как они сохраняются после солюбилизации фермента протеазами, т.е. после удаления гидрофобного участка. Естественно, эти участки имеются и в детергентной, и'в мембранной формах, где они не экранируются. В тех случаях, когда фермент обладает регуляторными свойствами, находясь в мембранной и детергентной формах, но теряет эти свойства при солюбилизации протеазами. Можно предположить, что регуляторные центры находятся в гидрофобной части фермента, которая присутствует в мембран-

ной и детергентной формах, но удалена в протеаэной. Примером такого воздействия может служить воздействие модификаторов, например, трибутирина на активность ^-амилазы и щелочной фосфа-тазы тонкой кишки крыс.

Рис.2. Схема трансмембранной регуляции мембранного фермента.

I - каталитическая (гидрофильная) часть фермента, 2 - гидрофобная часть, 3 - активный центр, 4 - регуляторные центры,расположенные в гидрофильной части, Б - обращенный в цитоплазьу клетки регуляторный центр, Ы - мембрана.

Наконец, существуют случаи, когда регуляторные свойства одинаковы в детергентной и протеазной формах ферментов, а в то ке время мембранная форма оказывается нечувствительной к воздействию этих модификаторов. Примером такого случая воздействия является влияние глицил-ь-лейцина на активность кишечной щелоч-

ной фосфатазы форели. Объяснить этот случай тем, что регулятор-ные участки расположены в гидрофильной голов!е феремнта или в гидрофобной суб-ъединице, невозможно, так как и гидрофильная, и гидрофобная части присутствуют в мембранной форме. Но поскольку уровень воздействия модификатора на активность фермента в детергентной й протеазной формах одинаков, а в мембранной он значительно ниже или отсутствует, следует предположить, что ре-гуляторные участки в мембранной форме каким-то образом экранированы и модификаторы не могут воздействовать на регуляторкые центры в мембранной форме фермента. Такой случай реален тогда, когда регуляторный участок фермента находится на гидрофильной субъединице, но расположен близко к мембране и за счет каких-то ковалентных или кальциевых взаимодействий каталитически активная головка фермента притянута к мембране. Таким образом регуляторный участок оказывается недоступным воздействию модификаторов.

■Частичное экранирование регуляторных центров наблюдалось при сравнении свойств агрегированной и неагрегированной детергентной формы щелочной фосфатазы кроликов (табл.5). Действительно, ЭДГА, взаимодействующая с активным центром фермента, в равной степени тормозит активность мембранной, протеазной, детергентной агрегированной и детергентной неагрегированной форм фермента. Точно также фенилаланин, который является модификатором гомостерического типа, одинаково влияет на активность этих форм фермента. Вместе с тем грибутирин не влияет на* активность протеазной формы фермента, а его влияние на активность неагрегированной детергентной формы фермента значительно выше, чем на активность агрегированной детергентной формы фермента. Вероятно, при агрегировании детергентной формы наблюдается эф-

фекг экранирования регуляторных участков.

Таким образом, полученные нами данные позволяют предположить, что в нативном ферменте имеются различные участки, подвергающиеся рсгуляторным воздействиям. При отом участки, находящиеся в гидрофильной головке фермента могут располагаться как вблизи активного центра, так и на периферии, ближе к поверхности мембраны. В естественных: условиях они могут в ряде случаев быть экранированы, т.е. подвергаться или не подвергаться рсгуляторным воздействиям при изменении условий функционирования фермента.

В целом полученные данные позволяют заключить, что при участии гидрофобного участка осуществляется не только связывание фермента с мембраной, но также стабилизация его структуры, оптимизация кинетических характеристик, регуляция активности. Последний этап работы позволил получить ряд доказательств в пользу того, что на сравнительно коротких этапах эволюции могут происходить изменения регуляторных свойств ферментов, в том числе и за счет изменений в их гидрофобных частях. Они согласуются с предположением А.М.Уголева (1985^ о том, что в процессе эволюции, а также приспособительной адаптации свойства мембран-носвязанных ферментов меняются при взаимодействии уже имеющихся гидрофильной (каталитически активной) и гидрофобной частей молекулы с другими компонентами мембраны и низкомолекулярными лигандами, а не формируются путем синтеза новых ферментных систем.

Полученные результаты важны для понимания не только физиологии мембранного пищеварения, но и некоторых сторон его патологии, в частности, для уточнения диагностики ряда заболеваний тонкой кишки.

ВЫВОДЫ

1. У животных разных видов, с разным типом питання, находящихся на разных уровнях эволюционного развития, изучена регуляция активности ряда гидролаз(карбогидразы, щелочная фосфата-за, аминопептидаза), осуществляющих мембранное пищеварение, с использованием различных препаратов из кишечной слизистой (го-могенаты слизистой оболочки: солюбйлизированные и очищенные в детергентной и протеазной формах ферменты). Аминопептидаза и щелочная фосфатаза у коров и форелей очищены впервые.

2. При сопоставлении мембранносвязанной, детергентной и протеазной форм ферментов ( у-амилаза, щелочная фосфатаза, ами-нопептидвза) установлено, что удаление гидрофобной части изменяет их физико-химические характеристики: сродство к субстрату, максимальную скорость реакции, зависимость активности от рН и температуры, энергию активации. Анализ этих результатов позволяет заключить, что гидрофобная часть фермента выполняет не только якорные функции, но и участвует в поддержании оптимальной конформации ч стабилизации структуры активного центра фер- ' мента, модифицируя его свойства в том же направлении, что и мембрана энтероцмта.

3. Обнаружены видовые различия во влиянии гидрофобной части фермента на кинетические уаректеристшш. Например, щелочная фосфатаза у форели по многим показателям' (Кп ,У , КМ и др.) отличается от одноименных ферментос у собак, кроликов и коров;' гидрофобная часть изменяет свойства этого фермента у форели '¡г меньшей степени, чем у млекопитающих.

4. При исследовании влияния целого ряда модификаторов с различным механизмом действия на активность детергентной и про-

теазной форм ферментов продемонстрировано, что во многих случаях гидрофобная часть выполняет регуляторные функции. Установ- -лено, что регуляторные свойства ферментов,обусловленные присутствием гидрофобной части, в одних случаях являются видоспецифи-ческими, в других, напротив, характерны для всех изученных ферментов у животных разных видов.

5. На основании полученных данных следует заключить, что регуляторные центры по их локализации в трансмембранном амфипа-тическом ферменте могут быть разделены на три группы: находящиеся в гидрофильной головке фермента (ближе или дальше по отношению к активному центру), во вцутримеибранном гидрофобном пептиде и в малом гидрофильном пептиде, обращенном в цитоплазму энтероцита.

6. При рассмотрении биологических аспектов регуляции показано: а) трибутирин тормозит активность щелочной фосфатаэы у кроликов и крыс на 70%, но не влияет на активность этого фермента у коров; б) при переходе от молочного питания к дефинитивному уровень торможения активности щелочной фосфатазы тонкой кишки у взрослых крыс примерно в три раза выше, чем у одно-," трех-, щести- и десятидневных крысят.

Таким образом, в условиях естественного полисубсгратно'го пищеварения регуляция на уровне"ферментативной активности играет важную роль в приспособлении разных видов живот: шх к особенностям питания.

7. У крысят в раннем постнатальном онтогенезе в толстой кишке обнаружена активность лактазы и щелочной фосфатазы (Солее 10%), мальтазы и аминопептидазы (до '¿0%). Различия в регулятор-ных свойствах одноименных ферментов толстой и тонкой кишки в разные сроки поегнатального развития заключаются в том, что уровень торможения активности щелочной фосфатазы и стимуляции ак-

тивности лактазы трибутирином в толстой кишке снижается при матурации организма, а в тонкой - возрастает (для щелочной фосфатазы) или не меняется (для лактазы).

8, При сопоставлении онтогенетического развития ферментных систем у зрело- (колючие мыши - акомисы) и незрелорождающих-ся (крысы, кролики) млекопитающих обнаружено, что матурация пищеварительных ферментов у первых происходит в более ранние сроки постнатального развития, чем у последних. Активность пищеварительных ферментов у акомисов определена впервые.

9. Анализ наших и литературных данных позволяет заключить, что свойства пищеварительных ферментов, приобретенные ими в процессе эволюции или адаптации к условиям функционирования, являются результатом взаимодействия гидрофильной и гидрофобной частей ферментной молекулы с компонентами мембраны и микросреды.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гозите И.К., Колтушкина Г.Г., Егорова В.В., Уголев A.M. Сравнительная кинетическая характеристика некоторых ферментов щеточной каймы, выделенных из состава мембран с помощью детергентов и протеаз П Пищевые ферменты: Сообщ.1 сов.-чех. симпоз. Ужгород. 1976. С.31-35.

2. Егорова В.В., Гозите И.К., Колтушкина Г.Г., Уголев A.M. Сравнительная характеристика некоторых ферментов щеточной каймы, выделенных из состава мембран с помощью детергентов и протеаз // Докл.АН СССР. 1977. Т.233, » 3. С.487-490.

3. Уголев A.M., Митюшова Н.М., Егорова В.В. Регуляторные- свойства пищеварительных ферментов в биологии многосубстратных пи-

щеварительных процессов // ЗЦурн.звол.биохим.физиол. 1977. Т.13, № 5. С.589-599.

4. Уголев А.М., Гозите И.К., Егорова В.В., Колтушкина Г.Г. Сравнительные характеристики каталитических и регуляторных свойств детергентной и трипсиновой форм некоторых ферментов микроворсинок энтероцитов. - Рига : Зинатне, 1978. С.137-140.

5. Уголев А.М., Паршков Е.М., Егорова В.В., Иезуитова H.H., Ми-гюшоза Н.М., Смирнова Л.55., Тимофеева Н.М,, Цветкова В.А. Распределение адсорбированных и собственно кишечных ферментов между клетками слизистой тонкой кишки и отделенным от нее апикальным гликокаликсом // Докл.АН СССР. 1978. Т.241. С.491-495.

6. Ugolev A.U., Uit;jushova Ii.LI., Egorova V.V., Gozite I.K., Kcl-tushkiaa G.G. Catalytic and. regulatory properties oi the Triton. and trypsin forma of the brush border hydrolases // Gut. 1979. V.20. P.737-742.

7. Егорова B.B., Митюшова H.M., Уголев A.M., Гозите И.К., Колтушкина Г.Г. Каталитические и регуляторные свойства тригоно-вой и'трипсиновой форм щеточнокаемннх гидролаз // Молекулярная генетика и биофизика, вып.4. 1979. С.50-57.

8. Ugolev А..Ы., Egorova V.V., lezuitova H.N., Uitjuahova U.U. Die regulatarischen Eigenschaften der Darnenzyme hoberer und niederer Tiere als Adaptationa'meohaniншиз der Verdauung und der Resorption // Die Bahrung. 1979. V.23, И 4. P.371-379.

9. Уголев A.M., Кузьмина B.B., Егорова B.B., Груздков A.A. Мембранные пищеварительные гидролазы энтероцитов у различных видов рыб. Свойства ферментов и фермент-мембранных комплексов в связи с температурными адаптациями организма,// йурн. общ.биологии. 1981. Т.42, № 6. С.883-895.

10. Кузьмина B.B., Егорова В.В., Уголев A.M., Никитина A.A., Гредин В.Г. Мембранные пищеварительные гидролазы энтероци-тов у различных видов рыб. Роль мембраны и энзимных белков

в формировании видовых адаптации И %рн.общ.биологии. 1981. Т.42, » 6. С.896-906.

11. Хюгтер Г., Егорова B.D., Никитина A.A., Вершинина Е.А., Кузнецов В.Л., Кузьмина В.В., Щербаков Г.Г., Уголев A.M. Роль гидрофобной части мембранно-связанных ферментов - аминопеп-тидазы и щелочной фосфатазы в их функционировании // Известия АН СССР. 1982. № I. С.56-69.

12. Ugolev A.M., Bgorova V.V., Kuzmlna V.V., Gryzdkov A.A. Comparative molecular charaoterization oí membrane digestion in fish and mammals // Comp.Biochera.Physiol. 1983. V.76 B. H 3. P.627-635.

•13. Hutter H.J., Egorova V.V,, Nikitina A.A. Charaoterization of hydrolases // Handbook of Experimental Pharmacology. Vol. 70/11. / Ed. 4.Z.Ceaky,Berlin, Heidelberg, Mew York, Tokyo, Springer Verlag, 1984. P.61-66.

14. Егорова B.B., Уголев А.Ы. Распределение некоторых ферментативных активностей вдоль кишечной трубки и гипотеза о пище-варительно-всасывательных функциях толстой кишки в раннем постнатальном развитии // Докл.АН СССР. 1985. Т.285, №. 3. С.721-724.

15. Egorova V.V., Nikitina A.A., Ugolev A.M., Hütter H.J. Comparative charaoterization od some enterooytio brush border enzymes in mammals and fish // Comp.Blochen.Physiol. 1985. V.80 В, H 4. P.871-888.

16. Уголев A.M., Егорова B.B., Иезуитова H.H. Основные типы пищеварения // Эволюция пищеварения и принципы эволюции функций. - Л.: Наука, 1985. C.77-I24.

17. Егорова B.B. Молекулярные механизмы адаптации // Руководство по физиологии. Физиология адаптационных процессов. -М.: Наука, 1986. C.444-45I.

18. Хюттер X., Егорова В.В., Никитина А:А. Физиология гидрофобного домена // Физиол.журн.СССР. 1986. Т.72, № 4. С.425-431.

19. Егорова В.В., Никитина A.A., Хюттер X. Сравнительная характеристика детергентных и протеазных форм некоторых собственно килечных гидролаз у различных животных )) Мембранный гидролиз и транспорт / Под ред. А.М.Уголева. - Л.: Наука, 1986. С.85-98.

20. Хюттер X., Егорова В.В., Никитина A.A. Регуляторные свойства некоторых ферментов, осуществляющих мембранное пищеварение в тонкой кишке Ц Мембранный гидролиз и транспорт / Под ред. А.М.Уголева. - Л.: Наука, 1986. C.98-I04.

21. Иезуитова H.H., Тимофеева Н.М., Егорова В.В., Никитина A.A. Гидролазы пищеварительных органов в онтогенезе // Физиол. нурн.СССР. 1986. Т.72, № 4. C.4I6-424.

22. Hütter Е., Ugolev А.Ы., Egorova V.V., Nikitina A.A. Alaain-amlnopeptidasen aus Darmschleimhaut von Hund, Kaninchen und Porelle. I. Charakterisierung der "Protease-Formen" U Bionied. Biochem. Acta. 1986. V.45, К 7. Р.845-353.

23. Hütter H., Ugolev A.M., Egorova V.V., Nikitina A.A. Alaain-aminopeptidasen aus Darmschleimhaut von Hund, Kaninchen und Porelle. II. Verhalten der "Detergenz-Formen" // Biomed. Biochem.Acta. 1986. 7.45, Я 7. P.855-863.

24. Хюттер X., Егорова B.B., Никитина A.A. Регуляторные свойства кишечной щелочной фосфатаэы }) Хронические болезни кишечника. Респ.сб.научных трудов. - М.; 1987. С.13-17.

25. HÜtter H., Ugolev A.I.!,, Egorova 7.V. The proteolytic capa-aity of tha large intestine of the dog // Abstracta 7th bilateral Medical Week "Problema in Gastroenterology", 1988. A. 28.

26. Егорова B.B., Шиндер Д.А., Уголев A.M. Реакция ферментов тонкой кишки на экзогенный гидрокортизон у крысят, перенесших стресс пренатально или в первый день жизни // Докл.АН СССР. 1988. Т.302, № 4. С.988-991.

27. Egorova V.V,, Ugolev А.И. Etymology of membrane digestion // Membrane digestion. Ней Facts and Concepta. - M.s MIR, 1989. P.117-160.

Приношу глубокую благодарность моему учителю академику АН СССР А.М.Уголеву за постоянное внимание, помощь и ценные советы при выполнении работы.

Ртп.ГГО. 29.01.90.Зак. 50.Î. 100.¡í-23021.Бесплатно.